CN104892541A - 一种用于γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

一种用于γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针及其制备方法与应用。一种化合物的结构式为式Ⅰ，其制备方法如下：1)在有机溶剂Ⅰ中，将Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯中加入缩合剂活化，然后再加入甲酚紫醋酸盐反应，得到中间产物；2)在有机溶剂Ⅱ中，将所述中间产物与脱保护试剂混合，反应即得。本发明化合物应用于制备γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针和/或在γ-谷氨酰转肽酶检测和γ-谷氨酰转肽酶成像中。一种γ-谷氨酰转肽酶检测试剂盒，它包括γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针和溶剂；所述γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针为所述化合物；其应用于γ-谷氨酰转肽酶检测及生物样品分析中。本发明具有操作简便，成本低，快速，灵敏等优点，易于推广和应用。

Description

一种用于γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种用于γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针及其制备方法与应用，具体涉及一种用于γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针及其制备方法和一种γ-谷氨酰转肽酶检测试剂盒，属于分子检测和分子成像领域。
背景技术
γ-谷氨酰转肽酶是谷氨酰循环中的关键酶，可特异性催化γ-谷氨酰基的转移反应，在多种生理学过程中都发挥着至关重要的作用。在临床上，γ-谷氨酰转肽酶是诊断肝胆疾病的重要指标，被广泛应用于肝病及其它脏器疾病的诊断和预后检测。另外，γ-谷氨酰转肽酶在宫颈癌、卵巢癌、肝癌等癌症中均出现高表达，是一种重要的癌症标志物。由此可见，γ-谷氨酰转肽酶的检测具有非常重要的意义。目前商品化的用来检测γ-谷氨酰转肽酶的试剂盒有基于比色法的ELISA试剂盒以及基于香豆素的荧光检测试剂盒，这些试剂盒存在灵敏度低或分析波长短等弊端。因此，发展一种新型的高灵敏性的检测γ-谷氨酰转肽酶的长波长荧光探针具有非常大的应用价值。
甲酚紫具有高的量子产率和良好的稳定性而被广泛应用于生物分析中，而基于甲酚紫的检测γ-谷氨酰转肽酶的高灵敏度荧光探针尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针及其制备方法，还提供了一种γ-谷氨酰转肽酶检测试剂盒，本发明用于γ-谷氨酰转肽酶检测，操作简便、成本低、检测灵敏。
本发明提供的化合物，其结构式为式Ⅰ。
本发明还提供了上述化合物式Ⅰ的制备方法，该制备方法是先将甲酚紫与Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯反应生成酰胺类化合物，然后进一步水解得到上述化合物式Ⅰ；包括如下步骤：1)在有机溶剂Ⅰ中，将Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯中加入缩合剂活化，然后再加入甲酚紫醋酸盐反应，得到中间产物；
2)在有机溶剂Ⅱ中，将所述中间产物与脱保护试剂混合，反应即得到所述式Ⅰ所示化合物。
上述的方法，步骤1)中，所述有机溶剂Ⅰ为二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或甲醇；
所述缩合剂为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(简称HATU)和/或N,N-二异丙基乙胺；
所述活化的温度可为0～40℃，具体可为25℃，所述活化的时间可为20～200min，具体可为30min；
加入所述甲酚紫醋酸盐反应的温度可为0～40℃，具体可为25℃，时间可为1～10h，具体可为2.5h；
所述Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯、所述缩合剂与所述甲酚紫醋酸盐的摩尔比可为1：1～4：1～4，具体可为1：1：1；
步骤2)中，所述有机溶剂Ⅱ为二氯甲烷、四氢呋喃、甲醇或乙腈；
所述脱保护试剂为三氟乙酸、甲酸、乙酸或氯化氢，优选三氟乙酸；
所述脱保护试剂与中间产物的摩尔比为大于10。
所述反应的温度可为0～40℃，具体可为25℃，时间可为3～24h，具体可为7h。
本发明中，步骤1)结束之后还包括对所述中间产物分离纯化的步骤，具体可为过滤，收集沉淀，然后将沉淀进行减压蒸馏除去溶剂，然后柱层析，得到所述中将产物；
步骤2)结束之后还包括将所述式Ⅰ所示化合物分离提纯的步骤，具体可为先将所述有机溶剂Ⅱ除去，然后依次用乙醚和二氯甲烷萃取，即得到所述式Ⅰ所示化合物。
本发明式Ⅰ所述化合物应用于制备用于γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针中，该荧光探针荧光激发波长为585nm和发射波长为615nm。
本发明式Ⅰ所述化合物还应用于γ-谷氨酰转肽酶检测和γ-谷氨酰转肽酶成像中。
本发明还提供了一种γ-谷氨酰转肽酶检测试剂盒，它包括γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针和溶剂组成的荧光探针储备液；
所述γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针为权利要求1所述化合物。
上述的试剂盒中，所述γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针的摩尔浓度可为0.01～10mM，具体可为0.25mM；
所述溶剂为水、甲醇和二甲基亚砜中至少一种。
本发明还提供了上述的试剂盒对γ-谷氨酰转肽酶的检测方法，包括如下步骤：1)制作标准曲线：以585nm为激发波长，测定一系列不同浓度的γ-谷氨酰转肽酶标准反应液在发射波长为615nm处的荧光强度，记为F；并测定试剂空白在发射波长为615nm处的荧光强度，记为F0，以γ-谷氨酰转肽酶的浓度C为横坐标，荧光强度变化值ΔF为纵坐标，绘制标准曲线；
其中，ΔF＝F-F0；所述一系列不同浓度的γ-谷氨酰转肽酶标准反应液由所述γ-谷氨酰转肽酶试剂盒中的荧光探针储备液、γ-谷氨酰转肽酶的标准储备溶液和缓冲液混匀组成；
2)检测待测样品中γ-谷氨酰转肽酶的含量：将上述步骤1)中所述γ-谷氨酰转肽酶标准储备溶液替换为待测样品，按照上述步骤1)所述方法检测所述待测样品在发射波长为615nm处的荧光强度，记为F'，同时测定试剂空白在发射波长为615nm处的荧光强度，记为F0'，将(F'-F0')带入上述步骤1)所得标准曲线，即得到所述待测样品中γ-谷氨酰转肽酶的含量。
上述的检测方法，所述一系列不同浓度的γ-谷氨酰转肽酶标准反应液中，所述γ-谷氨酰转肽酶的浓度可为1～50U/L，具体浓度依次可为1、5、10、25、40和50U/L；
所述缓冲液为pH在6～9之间磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐为Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种，所述磷酸盐的浓度为0.01～0.5M，优选为0.01M；
所述一系列不同浓度的γ-谷氨酰转肽酶标准反应液的体积均为2mL；
所述一系列不同浓度的γ-谷氨酰转肽酶标准反应液中，所述荧光探针储备液的摩尔浓度可为0.01～10mM，具体可为250μM，体积均为80μL；
所述γ-谷氨酰转肽酶的标准储备溶液由所述γ-谷氨酰转肽酶溶于水中配成，其浓度为50000U/L。
本发明进一步提供了上述的试剂盒在γ-谷氨酰转肽酶检测及生物样品分析中的应用。
上述的应用，所述生物样品为血清或细胞，本发明可对血清或细胞中γ-谷氨酰转肽酶进行定量分析；
所述试剂盒在使用时，所述γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针的测试浓度可为100nM-20μM，具体可为10μM。
本发明制备出了基于甲酚紫的长波长的荧光探针(式Ⅰ)，该探针可选择性地被γ-谷氨酰转肽酶水解从而实现对该酶的测定；而且，本发明探针(式Ⅰ)制备的试剂盒能用于血清及细胞中γ-谷氨酰转肽酶的检测。
本发明具有以下优点：
1、本发明荧光探针是橙色的固体，在溶液中呈浅黄色，与γ-谷氨酰转肽酶反应后，肉眼即可观察到溶液变为明显的粉紫色。
2、本发明具有长的荧光激发波长(585nm)和发射波长(615nm)
3、本发明对γ-谷氨酰转肽酶的响应呈线性关系，可以用于该酶的定量测定。
4、本发明应用时显色反应仅在γ-谷氨酰转肽酶存在的条件下发生，其它常见的无机盐、氨基酸、水解酶等均不产生干扰。
5、本发明化合物溶解性好，其用有机溶剂配成的母液试剂盒可直接用于缓冲体系中γ-谷氨酰转肽酶的检测。
6、灵敏度高，选择性好，可用于血清中γ-谷氨酰转肽酶的定量分析。
7、本发明具备好的生物相容性，可用于细胞或细胞中γ-谷氨酰转肽酶的检测；因此，该探针是一种优良的可广泛用于γ-谷氨酰转肽酶检测的分析试剂。
8、本发明具有操作简便，成本低，快速，灵敏等优点，易于推广和应用。
附图说明
图1为本发明式I所示化合物的化学反应方程式与合成路线。
图2为本发明试剂盒对γ-谷氨酰转肽酶的紫外可见吸收及颜色响应图，其中图2a为式Ⅰ所示化合物(10μM)的吸收光谱，图2b为式Ⅰ所示化合物(10μM)与γ-谷氨酰转肽酶(50U/L)反应后的吸收光谱。
图3为本发明试剂盒对不同浓度γ-谷氨酰转肽酶的荧光响应图，图3中γ-谷氨酰转肽酶的浓度从下到上依次为0,1,5,10,20,25,30,40,50,75和100U/L。
图4为本发明试剂盒的荧光增量对γ-谷氨酰转肽酶浓度的工作曲线。
图5为本发明试剂盒分别用于NIH-3T3和HepG2细胞的共聚焦成像图。
图6为本发明试剂盒分别用于正常培养的HepG2细胞以及预先与抑制剂孵育过的HepG2细胞的共聚焦成像图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针(式Ⅰ)的制备
按照图1所示的化学反应流程图进行制备。
步骤1)：将151mg Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯(0.5mmol)溶于5mL二氯甲烷中，加入190mg HATU(0.5mmol)及200μL N,N-二异丙基乙胺混合，继续搅拌30分钟后，加入160mg甲酚紫醋酸盐(0.5mmol)，25℃下继续反应2.5小时，过滤，滤液减压蒸干，得到的粗产品。用柱层析分离(硅胶G，200-300目)提纯得到中间产物，中间产物为橙色固体。
结构确证结果如下：1H NMR(400MHz,298K,DMSO-d6):δ10.45(s,1H),8.59(d,1H,J＝7.2Hz),8.14(d,1H,J＝6.8Hz),7.88(m,4H),7.48(m,1H),7.19(d,1H,J＝8.0Hz),6.40(s,1H),3.90(m,1H),2.07(m,4H),1.42(s,9H),1.40(s,9H).ESI-MS(m/z):547.3,C30H35N4O6 +。
步骤2)：将53mg中间产物溶于6mL二氯甲烷中，逐滴滴入2mL三氟乙酸。室温下反应7小时后，减压蒸干，得到的粗产品用乙醚和二氯甲烷各洗三次，得到最终产物(式Ⅰ)，产品为橙色固体。
结构确证结果如下：1H NMR(600MHz,298K,CF3COOD):δ9.13(s,1H),8.61(m,2H),8.32(d,1H,J＝6.6Hz),8.07(s,1H),7.96(s,1H),7.81(s,1H),7.35(s,1H),4.85(1H),3.04(m,2H),2.58(m,2H).13C NMR(600MHz,298K,CF3COOD):δ179.2,174.6,172.5,155.1,145.9,145.3,141.6,135.0,133.6,132.8,132.5,130.9,126.0,125.5,122.1,106.8,100.7,53.6,33.2,24.5.ESI-MS(m/z)391.4,C21H19N4O4 +.
由上述谱图数据，可确认本实施例制备得到的化合物的结构如下：
实施例2、γ-谷氨酰转肽酶检测试剂盒的制备
称取3.9mg荧光探针(式I)，溶于40mL甲醇，配成荧光探针储备液(又称母液，250μM)，即得到γ-谷氨酰转肽酶检测试剂盒。
本发明试剂盒检测γ-谷氨酰转肽酶具体按照以下步骤进行：
1)制作标准曲线：
以585nm为激发波长，测定浓度分别为1、5、10、25、40和50U/L的γ-谷氨酰转肽酶标准反应液各2mL，在发射波长为615nm处的荧光强度，记为F；并测定试剂空白在发射波长为615nm处的荧光强度，记为F0，以γ-谷氨酰转肽酶的浓度C为横坐标，荧光强度变化值ΔF为纵坐标，绘制标准曲线；
其中，ΔF＝F-F0；上述一系列不同浓度的γ-谷氨酰转肽酶标准反应液各由250μM的γ-谷氨酰转肽酶试剂盒中的荧光探针储备液80μL、γ-谷氨酰转肽酶的标准储备溶液(溶剂为水，浓度为50000U/L)和缓冲液混匀而得，所述缓冲液为pH在6～9之间0.01MNa2HPO4缓冲液；
2)检测待测样品中γ-谷氨酰转肽酶的含量：
将上述步骤1)中γ-谷氨酰转肽酶标准储备溶液替换为待测样品，按照上述步骤1)所述方法检测所述待测样品在发射波长为615nm处的荧光强度，记为F'，同时测定试剂空白在发射波长为615nm处的荧光强度，记为F0'，将所述F'-F0'带入所述步骤1)所得标准曲线，即可得到待测样品中γ-谷氨酰转肽酶的含量。
光谱性质的检测：将200μL的上述母液滴加到一定量的0.01M磷酸盐缓冲溶液中，然后加入不同量的γ-谷氨酰转肽酶溶液，再用0.01M的磷酸盐缓冲溶液定容到5mL。37℃反应45分钟后，测量其荧光发射光谱。荧光发射光谱测定时以585nm激发；激发和发射狭缝宽度均为10nm；电压400V。如图2所示为本发明试剂盒对γ-谷氨酰转肽酶的紫外可见吸收及颜色响应图。图2a为式Ⅰ所示化合物(10μM)的吸收光谱，b为式Ⅰ所示化合物(10μM)与γ-谷氨酰转肽酶(50U/L)反应后的吸收光谱。
如图3所示为本发明试剂盒对γ-谷氨酰转肽酶的荧光响应图，γ-谷氨酰转肽酶浓度范围为0-100U/L。图3中γ-谷氨酰转肽酶的浓度从下到上依次为0,1,5,10,20,25,30,40,50,75和100U/L。
如图4所示为本发明试剂盒对γ-谷氨酰转肽酶浓度的工作曲线，γ-谷氨酰转肽酶浓度范围为0-50U/L。
以上实验说明本试剂盒具有如下特点：
1、由图2可知，探针在溶液中呈现浅黄色，但随着γ-谷氨酰转肽酶的加入，溶液变为粉紫色，在615nm处产生荧光；
2、由图3可知，荧光强度随γ-谷氨酰转肽酶浓度的增加而增强；
3、由图4可知，使用10μM的荧光探针时，荧光增量与γ-谷氨酰转肽酶的浓度在1～50U/L范围内呈线性关系，可用于γ-谷氨酰转肽酶的定量测定。
实施例3、γ-谷氨酰转肽酶检测试剂盒的应用
一、检测人血清中γ-谷氨酰转肽酶的含量
首先按照实施例2中光谱性质的检测制作标准曲线，然后将独立的未经稀释的人血清样本，稀释10倍后按照上述方法进行测试，将测试结果代入标准曲线计算出稀释10倍的血清中γ-谷氨酰转肽酶的量，进而换算得到原血清样本中γ-谷氨酰转肽酶的量。同时，用Sigma公司的γ-谷氨酰转肽酶荧光分析试剂盒测定血清中该酶的含量，结果如下表1所示。对比两种方法所得结果，二者在90％的置信区间内不存在显著性差异，说明本专利试剂盒可以准确测定血清中的γ-谷氨酰转肽酶。
表1.血清中γ-谷氨酰转肽酶的测定
二、检测细胞中的γ-谷氨酰转肽酶
1)在37℃和5％CO2条件下，用含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/mL青霉素、100μg/mL的链霉素的DMEM培养基培养细胞(培养的细胞为小鼠成纤维细胞NIH-3T3和人肝癌细胞HepG2)。细胞使用之前用DMEM清洗。
2)在细胞中加入1mL DMEM，再加入荧光探针(10μM)孵育1h后进行共聚焦荧光成像，激发波长为559nm，收集波段为570-670nm。
如图5所示为本发明试剂盒分别用于小鼠成纤维细胞NIH-3T3(γ-谷氨酰转肽酶低表达)和人肝癌细胞HepG2(γ-谷氨酰转肽酶高表达)的共聚焦成像图。如图6所示为本发明试剂盒用于预先与γ-谷氨酰转肽酶抑制剂6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(DON)孵育过的HepG2细胞的共聚焦成像图。由上述结果表明本发明试剂盒可以测定细胞中的γ-谷氨酰转肽酶。
最后应说明的是：上述实施例仅举出以式Ⅰ为荧光试剂，反应体系中含探针为10μM，缓冲溶液为0.01M磷酸盐且反应时间为45min的情况。其余荧光试剂浓度和反应时间的结果不一一列出，然而并非用于限定本发明。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，应当可以作出各种修改与变更。

Claims (11)

1.一种化合物，其结构式为式Ⅰ。
2.权利要求1所述化合物式Ⅰ的制备方法，包括如下步骤：1)在有机溶剂Ⅰ中，将Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯中加入缩合剂活化，然后再加入甲酚紫醋酸盐反应，得到中间产物；
2)在有机溶剂Ⅱ中，将所述中间产物与脱保护试剂混合，反应即得到所述式Ⅰ所示化合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述有机溶剂Ⅰ为二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃或甲醇；
所述缩合剂为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯和/或N,N-二异丙基乙胺；
所述活化的温度为0～40℃，所述活化的时间为20～200min；
加入所述甲酚紫醋酸盐反应的温度为0～40℃，时间为1～10h；
所述Boc-L-谷氨酸-1-叔丁酯、所述缩合剂与所述甲酚紫醋酸盐的摩尔比为1：1～4：1～4；
步骤2)中，所述有机溶剂Ⅱ为二氯甲烷、四氢呋喃、甲醇或乙腈；
所述脱保护试剂为三氟乙酸、甲酸、乙酸或氯化氢；
所述脱保护试剂与中间产物的摩尔比为大于10。
所述反应的温度为0～40℃，时间为3～24h。
4.权利要求1所述化合物在制备用于γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针中的应用。
5.权利要求1所述化合物在γ-谷氨酰转肽酶检测和γ-谷氨酰转肽酶成像中的应用。
6.一种γ-谷氨酰转肽酶检测试剂盒，它包括γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针和溶剂组成的荧光探针储备液；
所述γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针为权利要求1所述化合物。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中，所述γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针的摩尔浓度为0.01～10mM；
所述溶剂为水、甲醇和二甲基亚砜中至少一种。
8.权利要求6或7所述的试剂盒对γ-谷氨酰转肽酶的检测方法，包括如下步骤：1)制作标准曲线：以585nm为激发波长，测定一系列不同浓度的γ-谷氨酰转肽酶标准反应液在发射波长为615nm处的荧光强度，记为F；并测定试剂空白在发射波长为615nm处的荧光强度，记为F0，以γ-谷氨酰转肽酶的浓度C为横坐标，荧光强度变化值ΔF为纵坐标，绘制标准曲线；
其中，ΔF＝F-F0；所述一系列不同浓度的γ-谷氨酰转肽酶标准反应液由所述γ-谷氨酰转肽酶试剂盒中的荧光探针储备液、γ-谷氨酰转肽酶的标准储备溶液和缓冲液混匀组成；
2)检测待测样品中γ-谷氨酰转肽酶的含量：将上述步骤1)中所述γ-谷氨酰转肽酶标准储备溶液替换为待测样品，按照上述步骤1)所述方法检测所述待测样品在发射波长为615nm处的荧光强度，记为F'，同时测定试剂空白在发射波长为615nm处的荧光强度，记为F0'，将(F'-F0')带入上述步骤1)所得标准曲线，即得到所述待测样品中γ-谷氨酰转肽酶的含量。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：所述一系列不同浓度的γ-谷氨酰转肽酶标准反应液中，所述γ-谷氨酰转肽酶的浓度为1～50U/L；
所述缓冲液为pH在6～9之间磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐为Na2HPO4、NaH2PO4和KH2PO4中的至少一种，所述磷酸盐的浓度为0.01～0.5M；
所述一系列不同浓度的γ-谷氨酰转肽酶标准反应液的体积均为2mL；
所述一系列不同浓度的γ-谷氨酰转肽酶标准反应液中，所述荧光探针储备液的摩尔浓度为0.01～10mM，体积均为80μL；
所述γ-谷氨酰转肽酶的标准储备溶液由所述γ-谷氨酰转肽酶溶于水中配成，其浓度为50000U/L。
10.权利要求6或7所述的试剂盒在γ-谷氨酰转肽酶检测及生物样品分析中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述生物样品为血清或细胞；
所述试剂盒在使用时，所述γ-谷氨酰转肽酶检测的荧光探针的测试浓度为100nM-20μM。
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