CN101484002A - 使用单个纳米新月形表面增强拉曼散射探针检测蛋白酶和蛋白酶活性 - Google Patents

使用单个纳米新月形表面增强拉曼散射探针检测蛋白酶和蛋白酶活性 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用单个的肽缀合纳米新月体表面增强拉曼散射(SERS)探针以至少纳摩的灵敏度进行蛋白酶的体外检测。所述探针能够以极小的体积和低浓度下检测蛋白水解活性。在某些实施方式中，所述探针包括用于检测活性蛋白酶的指示物，其中所述指示物包括附接于肽的纳米新月体，其中所述肽包括蛋白酶的识别位点和附接于所述肽的拉曼标记。

Description

使用单个纳米新月形表面增强拉曼散射探针检测蛋白酶和蛋白酶活性
相关申请的交叉引用
本专利申请要求2006年5月3日提交的USSN 60/797,525的优先权，其全部内容为各种目的在此通过引用纳入。
联邦政府资助的研究和开发下完成的发明的权利的声明
本项工作受到DARPA，NIH基金R1CA95393，UCSF前列腺癌SPORE奖金(NIH基金P50 CA89520)和P01 CA72006的支持。本项工作部分是在美国能源部的赞助下在加州大学/劳伦斯伯克利国家实验室根据DE-AC02-05CH11231号合同进行的。美国政府在本发明中具有一定的权利。
技术领域
本发明涉及利用纳米探针检测蛋白酶的表面增强拉曼散射(SERS)领域。具体来说，本发明涉及在前列腺癌的诊断应用中前列腺特异性抗原(PSA)和有蛋白水解活性的PSA的检测。
背景技术
前列腺癌是欧洲和北美的男性中最常见的癌症(Crawford(2003)Urology62：3-12；Gronberg等人92003 Lancet 361：859-864；Pienta等人(2006)Urology48：676-683)。前列腺癌的临床诊断方式之一是测量前列腺特异性抗原(PSA或hK3)的血浆蛋白浓度，该抗原是通常从前列腺内腔上皮细胞分泌的大的激肽释放酶(hK)蛋白酶家族中的一员(回顾参见，例如，Yousef和Diamandis(2001)Endocr.Rev.，22：184-204；Denmeade和Isaacs(2002)Nat.Rev.Cancer2：389-396；Denmeade和Isaacs(2004)BJU Int 93 Suppl 1：10-15)。与其它激肽释放酶家族成员不同，PSA是类胰凝乳蛋白酶丝氨酸蛋白酶(Robert等人(1997)Biochemistry 36：3811-3819)。在前列腺癌中，借助于蛋白水解活性，PSA与对抗细胞外基质的组织改造有关，对肿瘤入侵或发展的关键控制机制有作用。其它蛋白酶也在癌症中具有相似的作用。
始于二十世纪八十年代的血浆PSA筛查的引入已经极大地改善了前列腺癌的诊断、分期和处置(Denmeade和Isaacs(2002)Nat.Rev.Cancer2：389-396)；然而，血浆PSA浓度的测量并没有将前列腺癌病人与良性前列腺增生病人区分开，导致高的错误阳性率，需要更昂贵的活检，并且甚至进行不必要的外科程序(Denmeade和Isaacs(2004)BJU Int 93 Suppl 1：10-15；Robert等人(1997)Biochemistry 36：3811-3819)。提高PSA的临床价值以进行前列腺癌早期检测的努力包括对PSA的各种分子异构物的表征(Mikolajczyk等人(2004)Clin.Chem.，50：1017-1025；Mikolajczyk和Rittenhouse(2003)Keio J.Med.52：86-91；Mikolajczyk等人(2004)Clin.Biochem.37：519-528)。在那些各种异构物当中，PSA的有蛋白水解活性的亚群被接受作为是比血清PSA浓度更有效的肿瘤标志物和恶性预测物(Wu等人(2004)Prostate 58：354-353；Wu等人(2004)Clin.Chem.，50：125-129)。通过常规的免疫染色方法对PSA存在的简单检测不能揭示PSA的蛋白水解活性；因此，开发新的方法以区分蛋白水解活性异构物是非常重要的。已经证实精液携带有大量的有蛋白水解活性的PSA并且是用于蛋白酶活性测定的PSA生物资源(Brillard-Bourdet等人(2002)Eur.J.Biochem.，269：390-395；Rehault等人(2002)Biochim.Biophys.Acta 1596：55-62)。有蛋白水解活性的PSA在精液中的浓度为10-150μM(Rehault等人(2002)Biochim.Biophys.Acta 1596：55-62)，而其在血浆中的浓度则低得多，从健康个体中小于0.1nM到有前列腺疾病的病人中高于1nM(Rittenhouse等人(1998)Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.，35：275-368)。然而，测量精液中或来自细针抽吸的活组织检查样品中PSA的蛋白水解活性的测定仍没有被广泛接受，这是由于蛋白水解活性的快速衰减，以及从年老病人可获得的精液量或活组织检查样品的量有限。
现有检测方法的灵敏度达到了PSA蛋白质的亚纳摩浓度(Acevedo等人(2002)Clin.Chim.Acta 317：55-63；Charrier等人(1999)Electrophoresis 20：1075-1081；Bjartell等人ProstateCancer P D2：140-147)(大部分通过抗体对PSA的结合亲和力确定)，并且需要相对大的样品体积(毫升)。然而，酶的化验并不享有相同的灵敏度增强。
发明内容
在某些实施方式中，本发明展示了使用单一的至少具有纳摩灵敏度的肽结合纳米新月体表面增强拉曼散射(SERS)指示物(探针)的蛋白酶体外检测。该指示物能够以极小的体积检测蛋白水解活性。在某些实施方式中，检测体积小于约80飞升(femtoliter)，优选小于约50飞升，更优选小于约40或30飞升，且进一步更优选小于约20或15飞升。在某些实施方式中，使用高度聚焦的激发源允许检测体积仅为约10飞升。在各种实施方式中，纳摩样品的实际蛋白酶分子数小于约40个分子，优选小于约40个分子，更优选小于约30、20、或10个，且在某些实施方式中接近于单分子水平。与其它癌生物标志物检测测定相比，本发明的生物结合的纳米新月体允许检测飞升体积中蛋白水解活性蛋白酶分子的纳摩浓度，特别是对于单一癌细胞水平的癌症筛查来说，这是关键的。
小体积性能的主要优点和应用之一是其可用于在单一细胞水平下检测癌细胞的蛋白酶例如前列腺特异性抗原(PSA)的活性。小体积的要求和灵敏度水平能够在捕获的循环前列腺癌细胞中检测PSA活性用于指示转移，这对于常规技术来说是不可行的。在精液中，PSA浓度为10-150μM，其中约三分之二的PSA有酶活性。用纳米新月体PSA探针(纳摩范围)实现的灵敏度水平对基于精液的测定是足够的，因此，这里描述的纳米新月体SERS平台可用于临床应用。
在某些实施方式中，底物是纳米新月体表面增强拉曼散射(SERS)探针。表面增强拉曼散射(SERS)探针由缀合到纳米新月体芯和壳的肽组成，其中该探针的特征在于连接到拉曼活性标记的可以由蛋白酶特异性剪切的序列(例如，蛋白酶识别位点)。因此，该肽缀合的纳米新月体可用作特定的筛查工具以提供生物性样品中一种或多种蛋白酶的存在、浓度和蛋白水解活性的信息，所述蛋白酶包括但不限于各种癌症的生物标志物，例如前列腺特异性抗原(PSA)。
在一个实施方式中，该纳米新月体包括芯和壳，具有缀合或粘连到该纳米新月体表面的肽。该肽包括被待检测的相应蛋白酶特异识别和剪切的底物。
在某些实施方式中，对蛋白酶有特异性的其它肽底物可用于纳米探针。可能存在这样的情况，具有较好的动力学性质的底物肽可以用于加快检测过程。在一个实施方式中，对PSA具有较好特异性的其它肽也可用于更精确地检测PSA。
在各种实施方式中，不仅测量蛋白质的存在，实时反应监测还提供有关蛋白酶活性的信息。不同的拉曼标记分子都可以使用并成功地用于实施例中，从而证明了可以通过多重化肽缀合纳米新月体进行两种或更多种类型的癌症相关(或其它)的蛋白酶的检测。在某些实施方式中，芯可包括磁性材料以允许独立纳米颗粒的空间访问。
在某些实施方式中，在特异性上彼此正交或有少量重叠的不同的肽底物可以用于检测相应的蛋白酶。肽库可以缀合到纳米新月体探针并以随机阵列或有序微阵列的形式在空间上分开。肽纳米新月体杂化探针的多重化阵列可以用于同时检测多种蛋白酶。
也可通过激光或磁场操作纳米新月体以以高的空间精确度编址(Liu等人(2006)Nat Mater 5：27-32)，使得它们能够多重化为高密度阵列(具有亚微升体积)。另外，磁场或激光可操作性允许在期望位置进行生物传感(Liu等人(2005)Adv.Mater.17：2683-2688)，有利于在细胞内获得原位测量。
在某些实施方式中，本发明提供用于检测活性蛋白酶的指示物(探针)。该指示物通常包括附接于肽(底物)的纳米新月体，其中该肽包括蛋白酶的识别位点。在某些实施方式中，该指示物进一步包括附接于该肽的拉曼标签。合适的拉曼标签包括但不限于荧光团、生色团、量子点、荧光微球、生物素等。在某些实施方式中，该拉曼标签包括罗丹明、荧光素、或外源化学分子。在某些实施方式中，该拉曼标签包括选自下列的部分：TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、NBC(7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑)、德克萨斯红染料、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲苯基坚牢紫、甲苯基蓝紫、亮甲苯基蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、洋地黄毒苷、5-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素、5-羧基-2’，4’，5’，7’-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、6-羧基-X-罗丹明、甲亚胺、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、氨基吖啶、和氰化物(CN)、硫醇(SH)、氯(Cl)、溴(Br)、甲基、磷(P)、硫(S)、SN、Al、Cd、Eu、和Te。该拉曼标签可直接或通过接头(linker)附接于肽。类似的，肽可直接或通过接头附接于纳米新月体。在某些实施方式中，该纳米新月体包括壳而没有芯。在某些实施方式中，该纳米新月体包括芯和壳。在各种实施方式中，该芯包括提供恒定拉曼光谱的材料(例如，塑料(如聚苯乙烯)、二氧化硅或其它III族、IV族、或V族材料、右旋糖苷、磁性材料等)。在某些实施方式中，该纳米新月体包括选自下列的金属：Ga、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo，和它们的氧化物、和/或合金、和/或混合物、和/或氮化物、和/或烧结的基质。在某些实施方式中，该纳米新月体具有约20-约800nm的外径。在某些实施方式中，该纳米新月体具有约10nm到约500nm的内径。在某些实施方式中，该纳米新月体通过内径r、和外径R、以及内径r和外径R限定的圆的圆心距来表征，其中r为约10nm到约500nm；R为约20nm到约800nm；且d为约5nm到约300nm。在某些实施方式中，该纳米新月体通过内径r、和外径R、以及内径r和外径R限定的圆的圆心距来表征，其中r为约25nm到约500nm；R为约20nm到约800nm；且d为约5nm到约200nm。在各种实施方式中，该肽包括选自下列的蛋白酶的识别位点：丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、和谷氨酸蛋白酶。在某些实施方式中，该肽包括细胞凋亡路途径中蛋白酶(例如，胱天氨酸蛋白酶)的识别位点。在某些实施方式中，该肽包括选自下列胱天氨酸蛋白酶的识别位点：胱天氨酸蛋白酶-8、胱天氨酸蛋白酶-9、胱天氨酸蛋白酶-3、胱天氨酸蛋白酶-6、和胱天氨酸蛋白酶-7。在某些实施方式中，该肽包括凝血酶的识别位点。在某些实施方式中，该肽包括丝氨酸蛋白酶的识别位点。在某些实施方式中，该肽包括PSA识别位点(例如，HSSKLQ(SEQ IDNO：1))。在各种实施方式中，该肽的长度为2个氨基酸到10、20、或30个氨基酸。在某些实施方式中，该肽通过硫醇基团附接于纳米新月体。在某些实施方式中，两种不同的底物(例如，肽)附接于该纳米新月体。在某些实施方式中，多于两种不同的肽附接于该纳米新月体。在某些实施方式中，该指示物为拉曼活性底物的组分。
在某些实施方式中，本发明提供检测活性核酸酶的指示物。这些指示物基本上与上述蛋白酶指示物相同，除了用核酸(例如，双链或单链核酸)替代肽(底物)。在某些实施方式中，该核酸包括一个或多个核酸识别/剪切位点(例如，限制位点)。
在某些实施方式中，附接于该纳米新月体的底物(例如，肽、核酸、糖、碳水化合物等)可以包括一个或多个结合位点(而不是剪切位点)用于检测例如同源结合配偶体(例如，受体、核酸结合蛋白、配体等)。
还提供检测或量化样品中至少一种蛋白酶的存在、量或活性的方法。该方法包括使样品与包括附接于肽的纳米新月体的指示物接触，所述肽包括蛋白酶(例如，如上所述的蛋白酶)的识别位点；和监测检测的表面拉曼散射光谱的光谱特征中的差别，该差别是样品中蛋白酶的存在、量或活性的指示。在各种实施方式中，样品包括选自下列的材料：全血、血级分、淋巴、脑脊液、口腔液(oral fluid)、粘液、尿、粪便、支气管灌洗液(lavage)、腹水液、精液、骨髓抽出物、胸膜流出物、尿、和肿瘤细胞或组织。在各种实施方式中，该指示物还包括附接于肽的拉曼标签。合适的拉曼标签包括但不限于荧光团、生色团、量子点、荧光微球、生物素等。在某些实施方式中，该拉曼标签包括罗丹明、荧光素、或外源化学分子。在某些实施方式中，该拉曼标签包括选自下列的部分：TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、NBC(7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑)、德克萨斯红染料、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲苯基坚牢紫、甲苯基蓝紫、亮甲苯基蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、洋地黄毒苷、5-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素、5-羧基-2’，4’，5’，7’-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、6-羧基-X-罗丹明、甲亚胺、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、氨基吖啶、和氰化物(CN)、硫醇(SH)、氯(Cl)、溴(Br)、甲基、磷(P)、硫(S)、SN、Al、Cd、Eu、和Te。该拉曼标签可以直接或通过接头附接于肽。类似的，肽可以直接或通过接头附接于纳米新月体。在某些实施方式中，该纳米新月体包括壳而没有芯。在某些实施方式中，该纳米新月体包括芯和壳。在各种实施方式中，该芯包括提供恒定拉曼光谱的材料(例如，塑料(例如，聚苯乙烯)、二氧化硅或其它III族、IV族、或V族材料、右旋糖苷、磁性材料等)。在某些实施方式中，该纳米新月体包括选自下列的金属：Ga、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo，和它们的氧化物、和/或合金、和/或混合物、和/或氮化物、和/或烧结的基质。在某些实施方式中，该纳米新月体具有约20-约800nm的外径。在某些实施方式中，该纳米新月体具有约10nm到约500nm的内径。在某些实施方式中，该纳米新月体通过内径r、和外径R、以及内径r和外径R限定的圆的圆心距来表征，其中r为约10nm到约500nm；R为约20nm到约800nm；且d为约5nm到约300nm。在某些实施方式中，该纳米新月体通过内径r、和外径R、以及内径r和外径R限定的圆的圆心距来表征，其中r为约25nm到约500nm；R为约20nm到约800nm；且d为约5nm到约200nm。在各种实施方式中，该肽包括选自下列的蛋白酶的识别位点：丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、和谷氨酸蛋白酶。在某些实施方式中，该肽包括在细胞凋亡路途径中蛋白酶(例如，胱天氨酸蛋白酶)的识别位点。在某些实施方式中，该肽包括选自下列胱天氨酸蛋白酶的识别位点：胱天氨酸蛋白酶-8、胱天氨酸蛋白酶-9、胱天氨酸蛋白酶-3、胱天氨酸蛋白酶-6、和胱天氨酸蛋白酶-7。在某些实施方式中该肽包括凝血酶的识别位点。在某些实施方式中，该肽包括丝氨酸蛋白酶的识别位点。在某些实施方式中，该肽包括PSA识别位点(例如，HSSKLQ，SEQ ID NO：1)。在各种实施方式中，该肽的长度为2个氨基酸到10、20、或30个氨基酸。在某些实施方式中，该肽通过硫醇基团附接于纳米新月体。在某些实施方式中，两种不同的底物(例如，肽)附接于该纳米新月体。在某些实施方式中，多于两种不同的肽附接于该纳米新月体。在某些实施方式中，该指示物为拉曼活性底物的组分。
还提供用于检测两种或更多种活性蛋白酶的存在或活性的库。该库通常包括多种蛋白酶指示物，该指示物包括附接于例如如上所述的肽的纳米新月体，其中该肽包括蛋白酶的识别位点；其中不同的纳米新月体附接了不同的肽使得不同的纳米新月体检测不同的蛋白酶。在各种实施方式中，该库进行空间编址使得对不同蛋白酶有特异性的蛋白酶指示物定位于底物上的不同位置。在各种实施方式中，该库任进行光学编址使得对不同蛋白酶有特异性的蛋白酶指示物产生不同的信号。在某些实施方式中，该库包括至少3种或更多、优选至少10种或更多、更优选至少20、40、80、或100或更多的不同的蛋白酶指示物。在某些实施方式中，该纳米新月体包括磁性芯且指示物的空间隔离通过磁场提供。在某些实施方式中，该指示物以离子方式或化学方式耦联和/或吸附到底物。
还提供检测活性蛋白酶的试剂盒。该试剂盒通常包括含有附接于肽(例如，本文描述的)的纳米新月体的容器，其中该肽包括所述蛋白酶的识别位点。在某些实施方式中，该试剂盒还包括附接于所述肽的拉曼标签。在某些实施方式中，该试剂盒还包括教导指示物的使用的指导材料，该指示物使用表面增强拉曼散射(SERS)用于检测活性蛋白酶的存在、浓度或活性。
在某些实施方式中，本发明提供用于检测核酸酶的指示物。该指示物包括附接于单链或双链寡核苷酸的纳米新月体(例如，本文描述的)，其中该寡核苷酸包括所述核酸酶的识别位点。在某些实施方式中，该指示物还包括附接于该寡核苷酸的拉曼标签。
还提供检测分析物的存在或量的方法。该方法典型地包括：使指示物与包含分析物的样品接触，该指示物包括附接于底物的纳米新月体，该底物在拉曼标记的部分的存在下特异性地或优先地被分析物结合，该拉曼标记的部分与分析物为结合到该底物而竞争；和检测该指示物的拉曼光谱，其中通过拉曼标签部分从底物的解离产生的拉曼光谱中的变化提供了样品中分析物的存在或量的测量。在某些实施方式中，该底物是肽或核酸。
在某些实施方式中，附接于纳米新月体的肽不是抗体或抗体片段。
定义
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在这里可互换地使用以表示氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中的一种或多种氨基酸残基是相应的自然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，并且该术语也适用于自然存在的氨基酸聚合物。
术语“活性蛋白酶”是指处于以下形式的蛋白酶，即当该蛋白酶在支持该蛋白酶活性的条件下与底物接触时，能够剪切(水解)该蛋白酶的底物中的肽键的形式。
术语“纳米新月体”是指纳米颗粒，其横截面的轮廓类似具有锐边的新月。
这里使用的“分析物”是利用本发明在测试样品中待检测的物质。该分析物可以是任何物质，例如，这样的酶，存在对该酶来说特异性结合成员如底物，或这样的酶，可以为该酶制备特异性结合成员，并且该分析物在测定中可以与一种或多种特异性结合成员结合。术语“分析物”还包括任意的酶、抗原物质、半抗原、抗体、以及它们的组合。该分析物可以包括但不限于蛋白质、肽、氨基酸、碳水化合物、荷尔蒙、类固醇、维生素、包括为治疗目的而给药的那些以及为不正当目的而给药的那些在内的药物、细菌、病毒、和任意上述物质的代谢物或抗体。
这里使用的“辐射”是电磁辐射形式的能量，该能量当应用到测试混合物时，引起由其中的拉曼活性标签产生的拉曼光谱，并且引起金属表面通过拉曼活性标签支持表面增强的拉曼光散射，所述拉曼标签变得与微粒表面有关。
“拉曼标签”、“拉曼标记”、或“拉曼活性标签”是当用合适波长的辐射照射时产生可检测的拉曼光谱的物质，该拉曼光谱区别于存在的其它组分的拉曼光谱。用于拉曼活性标签的其它术语可以包括染料和指示分子。
这里使用的“特异性结合成员”是特异性结合对的成员，该特异性结合对即两个不同的分子，其中一个分子通过化学或物理方式特异性地结合到第二个分子。除了抗原和抗体特异性结合对之外，其它特异性结合对包括生物素和抗生素蛋白、碳水化合物和外源凝集素、互补核苷酸序列(包括检测目标核酸序列的DNA杂化测定中使用的探针和捕获的核酸序列)、互补肽序列、效应物和受体分子、辅酶因子和酶、酶抑制剂和酶等。而且，特异性结合对可以包括为原始特异性结合成员的类似物的成员。例如，可以使用分析物的衍生物或片段，即，分析物-类似物，只要其具有至少一个与分析物相同的表位。免疫反应性特异性结合成员包括抗原、半抗原、抗体、和包括通过重组DNA方法或肽合成形成的那些的它们的络合物。
术语“测试混合物”是指用于应用本发明以检测测试样品中分析物的测试样品和其它物质的混合物。这些物质的实例包括：特异性结合成员、辅助结合成员、分析物-类似物、拉曼活性标签、缓冲液、稀释剂、和具有能够引起表面增强拉曼光谱的表面的颗粒、以及其它。
这里使用的术语“测试样品”是指含有待利用本发明进行检测和测定的分析物的样品。该测试样品除了所述分析物之外还可以含有其它组分，可以具有液体或固体的物理性质，并且可以为任意尺寸或体积，包括例如，流动液体的流。该测试样品除了分析物之外还可以含有任意的物质，只要其它物质不干扰与特异性结合成员的特异性结合或不干扰分析物或分析物-类似物。测试样品的实例包括但不限于血清、血浆、唾液、精液、尿、其它体液、组织和细胞样品(例如，肿瘤样品、器官样品等)和环境样品例如地下水或废水、土壤提取物和杀虫剂残留物。
附图说明
图1A、1B、1C说明用于PSA检测的肽缀合纳米新月体、制造过程、和检测。图1A：制造过程。纳米级Au层蒸镀在聚苯乙烯纳米颗粒上以形成TEM图像中所示的Au纳米新月体，其中该新月体顶端显示出较小的密度。肽用特异性PSA底物序列HSSKLQ(SEQ ID NO：1)合成并分别用拉曼标记分子、生物素或R19(未显示)，和用于两个版本的标记肽的半胱氨酸终止。肽通过Au-S键缀合到纳米新月体的Au表面。图1B：PSA检测方案。在蛋白水解反应之前，肽缀合纳米新月体的SERS谱含有拉曼标记分子、聚苯乙烯纳米颗粒、和肽的特征峰；在PSA的消化反应之后，肽在Q之后被剪切。含有拉曼标记分子的剪切片段从纳米新月体表面扩散开，而其它片段保留在纳米新月体的表面上。肽的SERS谱变得不同并且得自拉曼标记分子的特征峰消失。图1C：(1)通过纳米新月体的模拟局部电场振幅增强。纳米新月体的顶端区域具有100倍的电磁增强因子。(2)纳米新月体上的极性电场能量分布。几乎100％的能量集中在占纳米新月体总面积～1/6的顶端区域附近。
图2A、2B和2C说明具有锐边的金纳米新月体。图2A：纳米新月体SERS底物的概图。金表面可用生物分子接头功能化以识别特定生物分子。纳米新月体的锐边可增强拉曼散射强度使得可以检测其上的生物分子。图2B：纳米新月体的几何图。具有锐边的金纳米新月集合了纳米环和纳米顶端的几何特征。图2C：两种纳米新月体的透射电子显微镜图像。显示的纳米新月体均有300nm的内径、100nm的底部厚度，但具有不同的取向。比例尺为100nm。
图3说明纳米新月体的制造过程。(a)将单层的球形聚苯乙烯胶体浇铸在光刻胶涂布的玻璃基底上。(b)通过电子束蒸镀将金层涂布在聚苯乙烯胶体的表面上。在沉积期间样品以相对于金靶一定的角度保持旋转。纳米新月体的形状除了取决于聚苯乙烯球的尺寸之外还取决于沉积角度。(c)将涂布金的聚苯乙烯球从该基底剥离。(d)金纳米新月体的扫描电镜照片。胶体颗粒的溶解将该纳米新月体释放到悬液中。然后收集该纳米新月并放置在底物上。为方便在SEM中展示，显示的纳米新月体没有和在我们的光学实验中使用的纳米新月体一样在水中进行稀释。比例尺为200nm。
图4说明纳米新月体的几何结构，其中如两个部分重叠的圆所示，r是内径、R是外径、且d是圆心距。
图5说明SERS显微光谱学系统和纳米新月体的可视化。肽缀合纳米新月体悬浮在封闭的透明微室中的反应缓冲液中。该纳米新月体可使用暗场照明从斜角可视化，如插图中所示的亮点。激发激光通过显微物镜聚焦在纳米新月体上。SERS信号通过相同的物镜收集并通过分光计分析。
图6A和6B显示分别用生物素(图6A)和作为拉曼标记分子的R19(图6B)进行PSA消化前后的肽缀合纳米新月体的典型SERS光谱。
图7A、7B、7C和7D显示在PSA消化反应中时间分辨SERS光谱。图7A：以作为拉曼标记分子的生物素通过420nM PSA进行的肽消化中的SERS光谱。图7B：以作为拉曼标记分子的R19通过420nM PSA进行的肽消化中的SERS光谱。图7C：以作为拉曼标记分子的R19在抑制剂存在下通过420nM PSA进行的肽消化中的SERS光谱。图7D：以作为拉曼标记分子的R19通过420nM粒酶B进行的肽消化中的SERS光谱。
图8A和8B显示PSA消化反应中与时间有关的拉曼峰强度。图8A：分别以0M(缓冲溶液)、4.2nM、42nM和420nM的PSA进行的消化反应中生物素在525cm-1下的拉曼峰强度。图8B：分别以420nM PSA、具有抑制剂的420nM PSA、和420nM的粒酶B进行的消化反应中R19在1183cm-1下的拉曼峰强度。
具体实施方式
在各种实施方式中，本发明涉及新的指示物，其提供对样品中一种或多种蛋白酶的存在和/或量和/或活性的测量。在某些实施方式中，该指示物包括一种或多种附接于用于一种或多种蛋白酶分子的底物(例如，多肽)的纳米新月体结构，参见例如图1A。该指示物可任选地进一步包括一种或多种附接于底物的拉曼标记。该指示物起到对拉曼散射检测体系来说非常灵敏的探针(例如，表面增强拉曼散射(SERS)探针)的作用。
在某些实施方式中，本发明涉及使用肽缀合纳米新月体表面增强拉曼散射(SERS)探针进行蛋白水解活性生物分子的体外、原位、或在某些情况下的体内的检测。这里描述的探针可以至少实现纳摩的灵敏度，从而能够以极低的浓度(例如，一或几个分子)和/或以极小的体积(例如，飞升体积)检测蛋白水解(或其它生物学的)活性。在各种实施方式中，指示物的纳米级尺度和指示物高的局部电磁场增强(图1C)能够在其表面上进行生物分子反应的高灵敏度光学检测。
在某些优选的实施方式中，该指示物包括纳米新月体表面增强拉曼散射(SERS)探针。该表面增强拉曼散射(SERS)探针可以包括缀合到纳米新月体结构(例如，纳米新月体芯和壳)的肽，其中该肽含有蛋白酶识别和剪切的特定氨基酸序列(蛋白酶识别位点)。在各种实施方式中，该肽附接于拉曼标记上。该肽通过“目标”蛋白酶的剪切提供了拉曼光谱中容易检测的强烈变化。因此，该肽缀合纳米新月体可以用作特定筛选工具以提供一种或多种蛋白酶例如癌症的生物标志物如生物样品中的前列腺特异抗原(PSA)的存在、浓度和蛋白水解活性的信息。
纳米新月体组合物和制造
本发明的指示物通常包括一种或多种耦联到生物分子(优选肽)的纳米新月体。在某些实施方式中，该纳米新月体可以包括芯和壳。当存在时，该芯可以由具有基本上恒定拉曼光谱的塑料(例如，聚苯乙烯)、二氧化硅或其它矿物质、或其它III族、IV族、或V族材料、右旋糖酐、磁性材料、或任意其它材料组成。
该纳米新月体“月球”结构具有允许局部电磁场增强的纳米顶端和纳米环两个特征(图2A)。在横截面图中，纳米新月体的形状类似具有尖锐顶端的新月形纳米月球，因此纳米新月体的锐边具有尖锐顶端的旋转类似物并且其将该SERS“热位点”从顶端扩展至环线(即，一组纳米顶端)，如图2B所示。从俯视图看，纳米新月体的形状类似尖锐度比之前展示的纳米环(Aizpurua等人(2003)Phys.Rev.Lett.90：057401)高的纳米环，所以纳米新月体的圆形锐边可以具有较强的场发射或“天线”效应。
在各种实施方式中，该金纳米新月体具有如图2C所示的亚10nm的锐边。
在某些实施方式中，该纳米新月体可通过如图4所示的几何结构表征，其中如两个部分重叠的圆所示，r是内径、R是外径、且d是圆心距。在各种实施方式中，R是约20nm到约800nm，优选约40nm到约600nm，更优选约50nm到约500或400nm，且最优选从约100nm到约200nm或300nm。在各种实施方式中，r是约10nm到约500nm，优选约20nm到约400nm，更优选约50nm到约300nm，且最优选约100nm到约200nm。在各种实施方式中，d是约10到约400nm，优选约20nm到约200nm或300nm，更优选约30nm、40nm或50nm到约100或150nm。
该纳米新月体壳可以由金属(例如，金、银、钨、铂、钛、铁、锰等，或它们的氧化物或合金)、半导体材料、多层金属、金属氧化物、合金、聚合物、碳纳米材料等组成。在某些实施方式中，该纳米新月体壳包括下列的一种或多种：钨、钽、和铌、Ga、Au、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo，和它们的氧化物、合金、混合物、和/或氮化物。
在各种实施方式中，该芯的直径为约30nm到约500nm，优选约50nm到约200nm、300nm、或400nm，更优选约50nm到约100nm或150nm，且该壳是优选3nm到约80nm，更优选约5nm到约50nm，且进一步更优选约8nm到约20或30nm，且最优选约10nm到约20nm或约25nm。通过选择不同的芯尺寸和壳厚度，可以调节等离子体共振波长和表面增强因子以与各种应用相配。
图1A示意地展示了本发明的纳米新月体指示物的一个实施方式并且提供了其电子显微照片。在某些实施方式中，该纳米新月体优选通过在旋转纳米颗粒(例如，聚苯乙烯纳米颗粒模板)上将纳米新月体材料(例如，银、金等)成角度的沉积而制造，如Lu等人(2005)Nano Lett 5，119-124描述，其通过引用纳入本申请。制造过程示意性地展示在图3中。如图3所示，该方法包括将单层的球形芯材料(例如，聚苯乙烯胶体)浇注在涂布有光刻胶的基底(例如，玻璃基底)上。该纳米新月体壳材料(例如，金、银等)通过电子束蒸镀涂布在所述芯的表面上。该样品在沉积期间在相对于所述金(或其它材料)靶某个角度下保持旋转。该纳米新月的形状除了取决于所述芯结构(例如，聚苯乙烯球)的尺寸之外还取决于沉积的角度。该涂布的纳米新月体可使用合适的溶剂(例如，丙酮)从该基底剥离。该芯可以任选地通过使用合适的溶剂(例如，甲苯)从该纳米新月体移除。然后可以收集该纳米新月体并置于基底上。
在一个展示性的实施方式中，该纳米新月体包括100nm的聚苯乙烯芯和10～20nm的金新月体壳。该纳米级Au层蒸镀在聚苯乙烯纳米颗粒上以形成图1C中TEM图像中所示的Au纳米新月体，其中该新月体顶部显示较小的密度。在某些实施方式中，该纳米颗粒芯不被移除并起到SERS检测中内部对照(internal control)的作用。
该制造过程是展示性的而不是限制性的。使用这里提供的教导，本领域的技术人员将认识到本实验方案和其它纳米新月体制造方法的各种变型。
蛋白酶底物
这里描述的纳米新月体指示物可以利用多肽序列，该序列包括任意期望检测的蛋白酶的一个或多个识别位点。蛋白酶(蛋白水解活性)不仅需要用于维持正常的细胞功能，而且对于各种人类疾病的发病机理也是重要的。寄生虫病(例如血吸虫病和疟疾)、真菌(例如人白色念珠菌(C.ablicans))和病毒感染(例如HIV、疱疹和肝炎)，以及癌症、炎症、呼吸性疾病、心脏血管疾病和神经变性疾病，包括阿尔海默症，需要蛋白水解活性用于发展。因此蛋白酶的存在、量或活性的检测作为疾病的存在或可能性的诊断/预测标志物是有用的。另外，蛋白酶活性(或其抑制)的检测对于处理大量病理的蛋白酶抑制剂疗法的筛查是有用的。
可以根据本发明检测和/或量化的“蛋白酶”典型地是使位于多肽链中氨基酸对之间肽键水解的酶，也称作内切蛋白酶。蛋白酶典型地通过参照酶的催化中心中的亲核体而定义。最常见的亲核体来自丝氨酸、天冬氨酸、和半胱氨酸的侧链，产生蛋白酶家族，例如丝氨酸蛋白酶(Paetzel等人(1997)Trends Biochem.Sci.22；28-31)、天冬氨酰蛋白酶(Spinelli等人(1991)Biochemie 73：1391-1396)、和半胱氨酸蛋白酶(Altschuh等人(1994)Prot.Eng.7：769-75，1994)。金属蛋白酶通常在催化位点含有锌催化金属(Klimpel等人(1994)Mol.Microbiol.13：1093-1100)。这些蛋白酶家族各成员的展示性实例提供在表1中。
表1.展示性蛋白酶和蛋白酶识别位点(*是指被水解的肽键)。
 
蛋白酶家族 蛋白酶 蛋白酶识别位点 SEQ IDNO
丝氨酸 凝血因子Xa Ile-Gly-Gly-Arg* 2
丝氨酸 胰岛素 Lys*、Arg*
丝氨酸 胰凝乳蛋白酶 高的pH下Tyr*、Phe*、Leu*、Ile*、Val*、Trp*、和His*
丝氨酸 凝血酶 Arg*
丝氨酸 PSA 3
丝氨酸和半胱氨酸变体 花生斑多病毒Nla蛋白酶 Glul-Xaa-Xaa-Tyr-Gln*(Ser/Gly) 4
半胱氨酸 木瓜蛋白酶 Arg*、Lys*、Phe*
半胱氨酸 菠萝蛋白酶 Lys*、Ala*、Try*、Gly*
半胱氨酸 组织蛋白酶B Arg*Arg、Phe*Arg 56
半胱氨酸 组织蛋白酶L Phe*Arg 6
天冬氨酰 HIV蛋白酶 Phe*Pro 7
天冬氨酰 酿酒酵母天冬酶2(S.cerevisiae yapsin 2) Lys*、Arg*
天冬氨酰 组织蛋白酶D Phe*PhePhe*LysLeu*PheLeu*Tyr 891011
金属 嗜热菌蛋白酶 *Tyr、*Phe、*Leu、*Ile、*Val、*Trp、和*His
金属 肽基赖氨酸金属内肽酶 Xaa*Lys 12
金属 肽基天冬氨酸金属内肽酶 Xaa*AspXaa*GluXaa*Cys 131415
金属 嗜热链球菌细胞蛋白酶(coccolysin) *Leu、*Phe、*Tyr、*Ala
金属 自溶酶 Leu-Trp-Met*Arg-Phe-Ala 16
金属 明胶酶A(MMP-2) Pro-Gln-Gly*Ile-Ala-Gly-Gln 17
金属 人体中性粒细胞胶原酶(MMP-8) Gly-Leu-Ser-Ser-Asn-Pro*Ile-Gln-Pro 18
“蛋白酶识别位点”是通过肽键连接的氨基酸的连续序列，其含有通过特定蛋白酶水解的肽键连接的氨基酸对。任选地，蛋白酶识别位点可以包括在待水解的肽键的任一侧上的一种或多种氨基酸，该氨基酸也结合有蛋白酶的催化位点(Schecter和Berger，(1967)Biochem.Biophys Res.Commun.27：157-62)，或者在蛋白酶底物上的识别位点和剪切位点可为通过一个或多个(例如，2-4个)氨基酸分开的两个不同的位点。
蛋白酶识别位点中氨基酸的特异性序列典型地取决于该蛋白酶的催化机理，其通过该蛋白酶活性位点处官能团的性质限定。例如，胰岛素水解通过赖氨酸或精氨酸残基赋予羰基官能的肽键，而于多肽链的长度或氨基酸序列无关。然而，凝血因子Xa识别特异性序列Ile-Glu-Gly-Arg(SEQ ID NO：19)并使Arg的C端侧上的肽键水解。
因此，在各种实施方式中，蛋白酶识别位点可以包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、或10或更多个氨基酸。任选的，额外的氨基酸可以存在于识别位点的N端和/或C端。根据本发明的蛋白酶识别位点还可以为已知蛋白酶的识别位点的变体，只要其通过蛋白酶识别/剪切。
各种优选的蛋白酶识别位点包括，但不限于下列酶的识别位点：来自丝氨酸蛋白酶家族的蛋白酶、或金属蛋白酶、或来自半胱氨酸蛋白酶家族的蛋白酶、和/或来自天冬氨酸蛋白酶家族的蛋白酶、和/或来自谷氨酸蛋白酶家族的蛋白酶。在某些实施方式中，优选的丝氨酸蛋白的识别位点包括但不限于下列酶的识别位点：类胰凝乳蛋白酶、和/或类枯草杆菌蛋白酶、和/或α/β水解酶、和/或信号肽酶。在某些实施方式中，优选的金属蛋白酶识别位点包括但不限于金属羧基肽酶或金属肽内酶的识别位点。
蛋白酶识别位点对本领域技术人员来说是熟知的。对于基本上每个已知的蛋白酶已经确定了其识别位点。因此，例如，胱天蛋白酶的识别位点(肽底物)由Earnshaw等人在(1999)Annu.Rev.Biochem.，68：383-424中描述，该文献通过引用纳入本文(也见表2)。
表2.胱天蛋白酶的展示性肽底物(*是指被水解的肽键)
 
名称 肽底物 SEQ ID NO
胱天蛋白酶1(ICE) YEVD*XWEHD*X 2021
胱天蛋白酶2(Ich-IL) VDVAD*XDEHD*X 2223
胱天蛋白酶3(CPP32，A popain) DMQD*XDEVD*X 2425
胱天蛋白酶4(IcerelII Tx，Ich-2) LEVD*X(W/L)EHD*X 2627
胱天蛋白酶5(ICErelIII，Ty) (W/L)EHD*X 28
胱天蛋白酶6(Mch2) VEID*NVEHD*X 2930
胱天蛋白酶7(Mch3，CMH-1，ICE-LAP3) DEVD*X 31
胱天蛋白酶8 IETD*XLED*X 3233
胱天蛋白酶9 LEHD*X 34
胱天蛋白酶10 IEAD*X 35
在一个检测PSA的展示性实施方式中，肽设计引入具有丝氨酸残基的PSA-特异性肽的活性位点的氨基酸序列和可以通过PSA识别的侧翼序列。因此，例如，在一个实施方式中，肽含有已经显示对蛋白水解活性PSA具有非常高的特异性的序列HSSKLQ-LAAAC(SEQ ID NO：36)(参见，例如，Denmeade，等人(1997)Cancer Res 57：4924-4930)。已经显示出在小鼠模型的体内HSSKLQ-L(SEQ ID NO：37)由PSA剪切但不由任何其它的蛋白酶剪切(Denmeade，等人(2003)J.Natl.Cancer Inst.95：990-1000)。因此，在另一实施方式中，可产生多种肽，各自具有随机或已知的序列部分，只要各自引入HSSKLQ-LAAAC(SEQ ID NO：36)或HSSKLQ-L(SEQ ID NO：37)的特异性序列。
在一个展示性实施方式中，PSA消化位点在肽HSSKLQ-LAAAC(SEQ IDNO：36)中谷氨酸(Q)和亮氨酸(L)残基之间。该肽消化成2个片段，HSSKLQ(SEQ ID NO：1)和LAAAC(SEQ ID NO：38)。该肽优选地附接于纳米新月体表面，使得该肽不受PSA酶的空间位阻，从而可最优地处理。预期的是，位于底物肽序列HSSKLQ-LAAAC(SEQ ID NO：36)和半胱氨酸(C)残基之间的额外间隔区可改善PSA底物肽HSSKLQ(SEQ ID NO：1)在表面上的存在从而提高检测灵敏度。但是这样做拉曼标记分子的距离可能更远离纳米新月体的表面，导致较低的拉曼强度水平。然而，类线圈的短肽结构导致末梢的拉曼标记分子与纳米新月体表面接触的可能性大。
在某些实施方式中，肽包含至少一个蛋白酶识别位点。在各种实施方式中，肽可以包含两个、三个或更多个蛋白酶识别位点。所述位点可以是用于相同的蛋白酶的并具有都被该蛋白酶识别的不同的基序。在某些实施方式中，所述位点可以是相同的。在某些实施方式中，肽可以包括多个识别位点，各自用于不同的蛋白酶，从而允许检测或量化多种蛋白酶中任意一种的存在或活性。
通常，肽具有足够的长度以引入期望的蛋白酶识别位点。在某些实施方式中，肽比蛋白酶识别位点长并含有额外的氨基酸残基，例如，作为间隔区和/或有助于通过蛋白酶的识别。通常，肽的长度为约2、3、4、5、6、8、或10个氨基酸中的任一种情况至约20、30、50、80、或100个氨基酸中的任一种情况。在某些实施方式中，底物肽是长度为约3-12、或约4-12、或约6-12、或约8-12、或约10-12个氨基酸残基的寡肽。然而，在某些实施方式中，肽可以短至4个氨基酸残基，和长至100个氨基酸。
拉曼标记
在各种实施方式中，可以将一种或多种拉曼标签(拉曼标记)附接于附接到纳米新月体上的底物(例如，多肽)。这种拉曼标记的存在可以增强由肽的剪切产生的拉曼信号的变化。
现有技术(例如，美国专利5,306,403；6,002,471；6,174,677，这些通过引用纳入本文)中已知多种拉曼标签并且可以使用任何这些已知的拉曼标签。标签通常具有特征性的(例如，独特的)并高可视化的/可检测的光学信号。标记分子的非限制性实例包括TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、NBC(7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑)、德克萨斯红染料、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲苯基坚牢紫、甲苯基蓝紫、亮甲苯基蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、洋地黄毒苷、5-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素、5-羧基-2’，4’，5’，7’-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、6-羧基-X-罗丹明、甲亚胺、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、氨基吖啶、和氰化物(CN)、硫醇(SH)、氯(Cl)、溴(Br)、甲基、磷(P)、硫(S)、SN、Al、Cd、Eu、Te、和含有这种部分的化合物。在某些实施方式中，可以使用碳纳米管、量子点(参见，例如，Evident Technologies，Troy N.Y.；Invitrogen/Molecular Probes，etc.)、或微球(例如，荧光微球(参见，例如，得自Invitrogen/Molecular Probes的
Figure A200780024900D00241
))作为拉曼标记。
多种拉曼标签是可商购的(例如，得自Invitrogen/Molecular Probes)并且经常提供为附接于接头上的和/或衍生有一种或多种官能团的，以促进与其它部分的耦联。
底物与纳米新月体的耦联
肽(蛋白酶底物)和/或存在的拉曼标签可以用本领域技术人员已知的多种方法中任一种彼此耦联。肽(或其它底物)可以例如通过底物(肽)和/或纳米新月体上的反应性基团直接耦联到新月体。或者肽(或其它底物)可以通过接头附接于新月体。
类似的，当存在时，拉曼标签可以直接地(例如，通过官能团)或也通过接头附接于肽(或其它底物)。
例如，在某些实施方式中，依靠形成共价键的金-硫醇反应，利用肽的羧基端处的半胱氨酸基团，将底物肽粘连到金纳米新月体壳的表面上以将肽附接于金表面。在各种实施方式中，纳米新月体(例如，金)表面和/或底物(例如，蛋白酶底物)可以衍生有，例如，胺、羧基、烷基、链烯基、羟基、或其它官能团使得肽(或其它底物)可以直接地连接到纳米新月体表面和/或拉曼标签或通过接头耦联。在另一实施方式中，纳米颗粒可涂覆有，例如，具有胺、羧基、或其它官能团的二氧化硅壳以附接于肽(或其它底物)。
合适的接头包括但不限于含有两个或更多个反应性位点的异双功能团分子或同双功能性分子，该反应性位点均可与分别的结合配偶体(即拉曼标记、肽(或其它底物)、纳米新月体表面或其上的官能团等)形成共价键。适合用于连接这种部分的接头是本领域技术人员熟知的。例如，蛋白质分子可容易地通过多种接头中的任一种连接，该多种接头包括但不限于肽接头、直链或带支链的碳链接头、或通过杂环碳接头连接。异双功能团交联剂例如N-乙基马来酰亚胺的活性酯已经被广泛用于将蛋白质连接到其它部分(参见，例如，Lerner等人(1981)Proc.Nat.Acad.Sci.(USA)，78：3403-3407；Kitagawa等人(1976)J.Biochem.，79：223-236；Birch和Lennox(1995)单克隆抗体：原理和应用(Monoclonal Antibodies：Principles and Applications)中的第四章，Wiley-Liss，N.Y.等)。
在某些实施方式中，可利用生物素/抗生素蛋白的相互作用将纳米新月体和/或拉曼标签与肽(或其它底物)结合。在某些实施方式中，可以将例如具有不耐光保护基团的生物素或抗生素蛋白附接于纳米新月体上。在承载有相应抗生素蛋白或链霉抗生素蛋白、或生物素的期望部分的存在下照射纳米新月体，导致该部分与纳米新月体耦联。
对于一种或多种部分(例如，纳米新月体，肽(或其它底物，和/或拉曼标签))承载反应性基团或衍生以承载反应性基团来说，可容易提供多种耦联方法。因此，例如，游离氨基进行酰化反应，所述酰化反应具有本领域技术人员熟知的多种羧基活化接头扩展(linker extension)。接头扩展可以在该阶段进行以产生末端活化基团例如活性酯、异氰酸酯、马来酰亚胺等。例如，肽或氨基衍生的纳米新月体与双羧酸如对苯二甲酸的同双功能性N-羟基琥珀酰亚胺酯的一端的反应将产生可用于缀合到胺的稳定的N-羟基琥珀酰亚胺酯封端的接头加合物。接头扩展还可以用异双功能性试剂例如马来酰亚胺链烷酸N-羟基琥珀酰亚胺酯完成以产生末端马来酰亚胺基团用于后续的与硫醇基团的缀合。氨基封端的接头可以用异双功能性硫醇化试剂扩展，该硫醇化试剂进行反应以在一端形成酰胺键并在另一端形成游离的或受保护的硫醇。现有技术中熟知的这种硫醇化试剂的一些实例有2-亚氨基四氢噻吩(2-iminothiolane)(2-IT)、琥珀酰亚氨基乙酰基硫代丙酸酯(SATP)和琥珀酰亚氨基-2-硫代吡啶基二硫代丙酸酯(SPDP)。然后在去保护之后可获得初期硫醇基团，与马来酰亚胺基部分或溴乙酰化部分形成硫醇醚或直接与金表面相互作用。在各种实施方式中，例如通过在酸的存在下与碱金属亚硝酸盐反应，氨基例如氨基封端的接头的氨基可以转化为重氮基团，因此该物质转化为重氮盐，然后，该重氮盐与合适的亲核部分(例如，但不限于肽的酪氨酸残基等)有反应性。用于向这种重氮盐转化的合适氨基封端的接头的实例包括但不限于芳族胺(苯胺)，并且还可包括上述的氨基己酸酯和类似的物质。这种苯胺可容易地通过在如上所述的可获得的羟基和N保护的氨基酸之间的耦联反应中代入相应氨基酸而获得，其中氨基由芳族胺(即苯胺)组成，其中胺作为例如N-乙酰基或N-三氟乙酰基而合适地被保护，然后使用本领域已知的方法进行去保护。对有机合成领域的技术人员来说也暗示了其它合适的变成重氮盐的胺前体。
异双功能性接头的其它有利类型是混合的活性酯/酰氯，例如琥珀酰亚氨基-氧羰基-丁酰氯。该接头的反应性较强的酰氯端先使例如肽上的氨基或羟基酰化以直接提供N-羟基琥珀酰亚氨基酯接头加成物。
本发明中有用的另一种末端活化基团是醛基。醛基可以通过以下方式产生：使游离羟基(例如在肽或衍生纳米新月体上的)与烷基酸或芳基酸耦联而产生，该烷基酸或芳基酸在ω位(末端)取代有屏蔽的醛基如乙缩醛基，例如1，3-二氧杂环戊-2-基或1，3-二氧杂环己-2-基部分，随后使用本领域熟知的方法进行该基团的去屏蔽。在各种实施方式中，在ω位取代有保护的羟基(例如，乙酸基部分)的烷基或芳基羧酸可以用于耦联反应中，随后在合适的溶剂，优选二氯甲烷中用如重铬酸吡啶鎓盐的试剂进行羟基的去保护和轻度氧化，从而提供相应的醛。产生醛封端的物质的其它方法对本领域的技术人员来说是明显的。
在某些实施方式中，相同或不同的多个肽缀合到相同或不同的纳米新月体的表面。在多种实施方式中，约5-500，更优选约10-约400，进一步更优选约20、30、或40-约200、250、或300，且最优选约50-约150个底物分子(例如肽)附接于纳米新月体。在一个实施方式中，约100个肽利用Au与肽上硫醇基团的直接反应缀合到纳米新月体。
在各种实施方式中，底物，例如可以通过蛋白水解活性蛋白酶特异性剪切的肽，缀合或粘连到纳米新月体的表面上。在优选实施方式中，底物肽是长度约10-12个氨基酸残基的寡肽。然而，在多种实施方式中，肽可以短至4个氨基酸残基，和长至100个氨基酸。在各种实施方式中，肽包括通过相应的蛋白酶特异性识别和剪切的底物。肽可以合成以及商业化地获得，或者肽可以根据实施例1中描述的方法制备。在某些实施方式中，在肽的氨基末端，拉曼活性分子例如生物素(图1A)或罗丹明6G(R19)(图1A)优选地通过短的聚乙二醇或氨基戊酸接头接枝。
上述耦联方法是展示性的而不是限制性的。利用本文提供的教导，本领域的技术人员将认识到将底物耦联到纳米新月体的，以及任选地将拉曼标签耦联到底物的各种方法。
拉曼指示物的检测
在拉曼光谱中有潜在用途的多种检测单元在现有技术中是已知的且可使用任意已知的拉曼检测单元。拉曼检测单元的一个非限制性实例公开于美国专利6,002,471中。在该实例中，激发束通过Nd:YAG激光器在532nm(纳米)波长下产生或者通过Ti：蓝宝石激光器在365nm波长下产生。可使用脉冲激光束或连续激光束。激发束穿过共焦光学系统(confocal optics)和显微镜物镜，并且可聚焦在含有附着的生物分子靶的基底上。拉曼发射光靶可以通过显微镜物镜和共焦光学系统聚集，耦联到用于光谱分离的单色器。该共焦光学系统可以包括二向色滤光片、阻挡滤光片、共焦孔、透镜、和用于减少背景信号的镜片的组合。还可以使用标准全场光学系统作为共焦光学系统。
拉曼发射信号可以通过拉曼检测器检测。该检测器可以包括与用于信号计数和数字化的计算机接口连接的的雪崩光电二极管。其中对靶阵列进行分析，光学检测系统可设计为检测拉曼信号和将拉曼信号定位于芯片或网格上的特定位置。例如，发射光可引导至CCD(电荷耦合器件)照相机或其它能够在检测区域内同时测量来自多个像素或多组像素的光发射的检测器。
拉曼检测单元的其它实例公开于，例如，美国专利5,306,403，包括SpexModel 1403双光栅分光光度计，其配有以单光子计数模式操作的砷化镓光电倍增管(RCA Model C31034或Burle Industries Model C3103402)。激发源是得自SpectraPhysics的514.5nm线的氩离子激光器Model 166，和647.1nm线的氪离子激光器(Innova 70，Coherent)。
各种激发源包括但不限于337nm下的氮激光器(Laser Science Inc.)和325nm下的氦-镉激光器(Liconox)(美国专利6,174,677)。该激发束可以用带通滤光片(Corion)进行光谱纯化并可使用6倍物镜(Newport，Model L6X)聚焦在基底140上。该物镜可用于通过使用全息分束器(Kaiser Optical Systems，Inc.，Model HB 647-26N18)激发指示物和聚集拉曼信号，以产生对于激发束和发射拉曼信号来说的直角几何结构。可以使用全息陷波滤波器(KaiserOptical Systems，Inc.)以减少瑞利散射辐射。其它拉曼检测器包括但不限于配备有红色增强的强化电荷耦合器件(RE-ICCD)检测系统的ISA HR-320摄谱仪(Princeton Instruments)。可使用其它类型的检测器，例如电荷注入器件、光导二极管阵列或光电晶体管阵列。
使用如图5所示的包括具有拉曼分光计的显微镜系统的一种典型实验系统配置以从单个纳米新月体获得拉曼散射光谱。在一个实施方式中，该系统由配备有数字照相机和具有摄谱仪CCD照相机的单色仪的倒置显微镜例如Carl Zeiss Axiovert 200(Carl Zeiss，德国)、激光源和光学透镜组成。在各种实施方式中，激光波长可以在可见光区和近红外区。在一个优选的实施方式中，使用785nm的半导体激光器作为拉曼散射的激发源，并且激光束通过40X物镜聚焦在纳米新月体上。785nm或其它近红外光源可以确保由样品中生物组织的吸收较少和较低的荧光背景。然而，对于某些应用，较低的波长激发光可能是更有利的，且甚至UV光激发可以用于应用。激发功率也可通过光度计测量以确保在某些实施方式中～0.5到1.0mW的输出。拉曼散射光可以通过相同的光路穿过长通滤波器聚集并通过分光计分析。
在各种实施方式中，确定生物样品中蛋白酶的存在、和/或浓度、和/或活性。生物样品可以包括基本上任意期望测定的生物材料。这种生物材料包括但不限于生物流体例如血液和血液组分、淋巴、脑脊液、精液、尿、口腔液等、组织样品、细胞样品、组织或器官活检或抽出物、组织学标本等。
在各种实施方式中，优选在封闭的透明微室中，肽缀合的纳米新月体用怀疑含有蛋白酶分子的样品培养。该微室安置在具有用于纳米颗粒可视化的暗场照明的倒置拉曼显微镜的热板(例如，在37℃下的)上。该纳米新月体利用暗场照明从倾斜的角度可视化，如插图中的亮点所示。激发激光通过显微镜物镜聚焦在纳米新月体上。SERS信号用相同的物镜聚集并通过分光计分析。插图显示聚焦在单个纳米新月体上的～0.8mW的激发激光斑。
消化反应的实时检测可以在30分钟内发生。然而，在某些实施方式中，培养可以短至1-5分钟和长达24小时，或者，如果应用需要较长的培养时间则更长。在初始离心分级之后，粗细胞溶解产物、尿样品、精液、脑脊液、血液、或其它样品材料中的可溶物可以直接用探针培养。探针的浓度不是关键的，因为每次仅检测一个或几个探针。为了特异性地抑制缀合肽的蛋白酶介导的蛋白水解，可以在加入蛋白酶之前引入蛋白酶抑制剂。例如，在相同的实验条件下，加入抑制剂之后抑制了超过90％的通过PSA进行的肽消化。
蛋白酶的存在、浓度和活性的一个检测方案如图1B所示。在该方法中，将肽缀合SERS探针提供给溶液或样品。在蛋白水解反应之前，肽缀合的纳米新月体的SERS光谱含有拉曼标记分子、聚苯乙烯纳米颗粒、和肽的特征峰。通过蛋白酶进行的消化反应应该在预定的剪切位点剪切肽。例如，在通过PSA进行的消化反应期间，在Q和L残基之间剪切肽HSSKLQ-L(SEQ IDNO：37)，这里用点划线表示。人工肽的SERS光谱在用蛋白酶的剪切之后改变，因为含有拉曼标记分子的剪切片段从纳米新月体表面上扩散离开，同时其它片段保留在纳米新月体表面上。具有拉曼活性标记的分子部分的特征SERS峰消失，这是由于在肽消化之后标记分子从纳米新月体表面扩散错位到溶液中；因此溶液中有蛋白水解活性的PSA的存在和浓度可以通过监测肽缀合的纳米新月体的SERS光谱进行探测。然后，附接肽的拉曼散射信号通过纳米新月体放大且通过如上所述的含有拉曼分光计的显微镜系统检测，以从单个纳米新月体获得拉曼散射光谱。优选将拉曼散射分光计连接到计算机，从而能够控制分光计并且能够获得光谱，并且可观察光谱图。
消化反应动力学可通过时间分辨的SERS光谱采集进行监测。例如，光谱图中见到的来自拉曼标记分子的峰，例如，图6A中来自生物素的525cm-1处的峰和图6B中来自R19的1183cm-1处的峰，这些峰在消化反应完成之后几乎完全消失(图6A和B)。如图6A中时滞SERS光谱所示，用525cm-1处的生物素峰的消失监测的各纳米新月体上肽的消化，在420nM的PSA浓度下花费～30分钟。对于具有R19作为拉曼标记分子的肽，在通过420nM的PSA消化之后也可以观察到1183cm-1处R19峰的消失(图6B)。因此，肽的消化可以通过拉曼标记分子的释放和其拉曼峰的消失而确认。实时监测的时间分辨率(temporal resolution)可以为约几秒且反应通常持续10～20分钟。光谱检测可以用普通的光谱多色计(spectral polychrometer)和致冷CCD照相机进行。拉曼峰的监测波数为400cm-1-2000cm-1。
在某些实施方式中，消化反应中纳米新月体SERS探针中的拉曼活性标记的拉曼峰的时滞强度分别用蛋白酶、具有抑制剂的蛋白酶、和阴性对照物获得。所有的峰强度值归一化至内部对照峰(例如，测量聚苯乙烯芯的峰强度为1003cm-1)和阳性或阴性对照物的波数处的初始峰强度。阴性对照物可以为纳米新月体-肽混杂物，其中该肽不是感兴趣的蛋白酶的底物并且不被所研究的蛋白酶剪切。结果应该表明，通过拉曼活性标记的峰强度的逐渐消失，肽通过PSA有效地和特异性地剪切。
纳米新月体颗粒起到纳米信号放大器的作用并且检测到的拉曼信号来自粘连在纳米新月体颗粒表面上的所有肽。在某些实施方式中，每个纳米新月体最多附接100个肽分子，可能没有完全利用具有最高SERS信号的纳米新月体表面，并且仅有小百分比的肽附接于在电磁场中提供最大增强的区域(图1C)。数值模拟(图1C)表明局部电场的振幅可以增强近20dB(100倍)，特别在锐边周围。由于电场振幅和拉曼增强因子之间的四次方关系，肽拉曼信号可通过纳米新月体放大108倍。
而且，由于平均有几十到几百个肽用于对各纳米新月体的缀合反应，来自标记分子的特征拉曼峰的消失不是骤然的。由于大部分增强的区域集中在占纳米新月体总面积的～1/6的顶端区域周围，即使假设缀合效率为100％，在该高的增强区域中贡献于拉曼散射信号的实际分子数也小于20个。
在某些实施方式中，作为对于各种蛋白酶(例如PSA)浓度的PSA消化时间的函数，用于阳性对照物的拉曼峰的强度在检测样品中蛋白酶(例如PSA)的存在或活性之前获得。具有用于PSA缀合物的阳性对照生物素和R19拉曼标记分子的肽缀合的纳米新月体的典型SERS光谱分别如图6A和6B所示。通过对比肽消化实验前和肽消化实验2小时后的SERS光谱，得自纳米新月体芯的拉曼峰(例如，聚苯乙烯芯，例如1003cm-1)保持恒定，并因此还可以起到内部对照物的作用。消化速率与PSA浓度有关，且对于1nM浓度PSA活性通常(生物素信号强度降低～50％，未显示数据)在30分钟内观察到。某些来自在消化之后保留在纳米新月体表面上的部分氨基酸链的拉曼峰可能仍在光谱中出现，虽然峰位置有轻微的变化并且由于肽剪切时可能的构象变化而使峰强度降低。
在某些实施方式中，实施阴性对照物以显示肽是通过样品中存在的蛋白酶特异性地剪切的。实施例1使用其它丝氨酸蛋白酶例如粒酶B(其可以起到阴性对照物的作用)显示了缀合肽对PSA的特异性。图7C和7D显示了具有R19标记分子的PSA缀合纳米新月体在分别用PSA抑制剂和丝氨酸蛋白酶粒酶B的两组对照实验中的时滞SERS光谱，其中粒酶B具有与PSA的正交底物特异性。在用420nM粒酶B进行的肽消化的对照实验中，反应速率没有显示出与抑制剂处理的反应有统计上的显著差异。还预期粒酶B无能力剪切肽，因为PSA已经显示是HSSKLQ-LAAAC(SEQ ID NO：36)序列在体内唯一的蛋白酶。
在各种实施方式中，肽缀合纳米新月体可以用作特异性筛查工具以提供在临床环境(clinical setting)中从病人获得的生物样品中的蛋白酶癌症生物标志物例如PSA和其它物质的浓度和蛋白水解活性的信息。
预计这里描述的指示物的一种应用是将纳米新月体颗粒结合到可以自动化和促进样品传输和洗涤过程的微流体设备中。该纳米新月体颗粒还可以实时传输或固定在该设备中。
其它应用包括将纳米新月体颗粒引入到活的细胞或组织中，使得可以在细胞或组织中实时测量蛋白酶活性。
这些实例旨在展示且是非限制性的。利用这里提供的教导，本领域技术人员将获得其它用途和测定。
其它指示物
虽然上述讨论涉及纳米新月体-肽缀合物(指示物)的使用以检测活性蛋白酶，将认识到相同的方法可以用于检测其它水解性生物分子的存在。因此，例如，肽蛋白酶底物可以用单链或双链核酸(RNA或DNA)替代，并且该指示物可以检测和/或量化活性核酸酶的存在。在这种情况下，核酸底物通常包括用于核酸酶(例如，限制性内切酶)的一个或多个的识别位点。该核酸酶识别位点的长度通常在约3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp或10bp至约15bp、20bp、25bp或30bp的范围内。在各种实施方式中，核酸长度的范围可以在约3bp到约200bp，优选约4bp到约100bp，更优选约6、8、10、16、或20bp到约80、60、40、或30bp。
本发明的指示物也不仅限于检测水解/蛋白水解活性。指示物还可以用于检测和/或量化结合相互作用(例如，蛋白质/蛋白质相互作用、蛋白质/DNA相互作用、抗体/抗原相互作用、受体/配体相互作用等)。
因此，例如，可提供耦联到一种或多种纳米新月体的蛋白质、和/或糖、和/或复合碳水化合物、和/或脂质、和/或核酸“底物”。当该底物被识别并通过同源结合配偶体结合时，拉曼光谱将改变并检测到相互作用。
因此，例如，可以提供附接于纳米新月体的核酸底物，其中该核酸包括一个或多个用于例如DNA结合蛋白质的识别位点。通过DNA结合蛋白质进行的核酸结合改变了拉曼光谱从而产生了可检测的信号。在某些实施方式中，该底物还承载有上述一种或多种拉曼标签。虽然拉曼标签可能不在简单的结合相互作用中被切断，但由结合部分引起的增加的空间位阻降低了拉曼标签与纳米新月体的缔合，从而显著地改变了拉曼光谱。
其它实施方式利用“竞争”测定形式用于结合测定。在这种测定中，分析物与承载拉曼标签的类似部分为附接了纳米新月体的底物上的结合位点竞争。有拉曼标记的部分从其在底物上的结合位置被待测定的样品中的靶分析物替代，提供了拉曼光谱中可检测的变化，这是样品中存在的分析物量的量度。
这些测定旨在展示且是非限制性的。利用这里提供的教导，本领域技术人员将获得其它测定形式。
试剂盒
在另一实施方式中，本发明提供用于实施这里描述的方法的试剂盒。该试剂盒通常包括含有这里描述的纳米新月体的容器。该试剂盒还可以含有一种或多种底物(例如，蛋白酶底物、核酸底物等)。该底物可以在单独的容器中提供用于后续与纳米新月体的缀合，或者它们可作为纳米新月体缀合物提供。该试剂盒还可以包括一种或多种拉曼标签。该标签可以单独提供或作为底物纳米新月体缀合物的组分提供。
在各种实施方式中，该试剂盒任选地包括一种或多种这里描述的对照试剂(例如，缀合到不能剪切的底物的纳米新月体)。
在各种实施方式中，该试剂盒任选地包括用于收集和/或处理生物样品的装置(例如，注射器、药签等)和/或试剂(例如，稀释剂和/或缓冲液)。
另外，该试剂盒任选地包括对实施这里描述方法提供指导(即协议)的标签性和/或说明材料。在某些实施方式中，该说明材料描述了使用一种或多种本发明的指示物检测和/或量化蛋白酶的存在或活性。在各种实施方式中，该说明材料教导了使用指示物和SERS检测方案以检测核酸水解和水解反应。可以检测各种酶例如核酸酶和水解酶的存在、浓度和活性。
虽然该说明材料通常包括书面的或打印的材料，但它们不限于此。本发明预期能够存储这种说明并将它们与最终用户沟通的任意介质。这种介质包括但不限于电子存储介质(例如，磁盘、录像带(tape)、盒式磁带、芯片)、光学介质(例如，CD ROM)等。这种介质可包括提供这种说明材料的英特网网站的地址。
实施例
提供下列实施例以展示，但不限于要求保护的本发明。
实施例1
用于蛋白酶的光学检测的肽-纳米新月体混杂SERS探针
蛋白酶的实时原位检测对于早期癌症筛查和细胞信号传导研究是关键的。然而，在小体积(例如，低于1nL)下用荧光或放射探针是难以实现这种检测的。在该实施例中，我们展示了将人工标记分子结合到纳米新月体颗粒肽的混杂光学探针的用途。我们使用PSA(一种最显著的前列腺癌标志物)和病人精液和血清中存在的丝氨酸蛋白酶进行概念验证(proof-of-concept)研究。来自标记分子的拉曼光谱信号通过纳米新月体增强并且该信号在接近于单个蛋白水解活性PSA分子的水平下以飞升反应体积作为肽剪切的指示物而监测。该肽的高的反应特异性和监测的拉曼信号也最小化了其它丝氨酸蛋白酶的错误检测和背景拉曼信号，这导致高保真度和高信噪比的可以容易地引入到纳米/微流体设备中的癌症纳米探针。
这里，我们介绍一种PSA蛋白水解活性的光学分光检测方法，该方法基于PSA特异性底物肽(Robert等人(1997)Biochemistry 36：3811-3819；Wu等人(2004)Clin.Chem.，50：125-129；Brillard-Bourdet等人(2002)Eur.J.Biochem.，269：390-395；Rehault等人(2002)Biochim.Biophys.Acta 1596：55-62；Malm等人(2000)prostate 45：132-139)缀合的新月体形状拉曼纳米探针，该方法可用在结合到微流体中或细胞内引入的微小的样品体积(飞升)上，并且可用于实时光学监测PSA蛋白水解反应。该纳米新月体可以起到单独的表面增强拉曼散射(SERS)底物的作用(Lu等人(2005)Nano Lett.5：119-124)。拉曼是一种具有丰富的原子水平信息而无需荧光团进行标签的用于探测生物化学组成的分光检测方法(Raman(1928)Nature 121：619-619)，然而拉曼信号强度(散射横截面)比荧光低得多。已经开发了各种SERS底物将底物表面上化学和生物分子检测中弱的拉曼散射信号增强了几个数量级(Lu等人(2005)Nano Lett.5：119-124；Lu等人(2005)Nano Lett.5：119-124；Lu等人(2005)Nano Lett.5：5-9；Haes等人(2005)J.Am.Chem.Soc.127：2264-2271；Jackson和Halas(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，101：17930-17935；Nie和Emory 91997 Science 275：1102-1106；Liu和Lee(2005)Appl.Phys.Lett.87：074101)。
纳米新月体由100nm的聚苯乙烯芯和10～20nm的金新月体壳组成。图1A显示该纳米新月体的示意图和透射电子显微照片。该纳米新月体通过在旋转的聚苯乙烯纳米颗粒模版上成角度的Au沉积而制造(Lu等人(2005)Nano Lett.5：119-124)。制造细节如前所述(同前)。在该实施例中，不移除聚苯乙烯纳米颗粒芯，并且其起到SERS检测中内部对照物的作用。然后我们将可以通过有蛋白水解活性的PSA特异性地剪切的底物肽粘连在Au纳米新月体的表面上。该肽含有HSSKLQ序列(SEQ ID NO：37)，该序列已经显示出对有蛋白水解活性的PSA具有非常高的特异性(Denmeade等人(1997)Cancer Res 57，4924-4930)。在小鼠体内模型中，已经显示出HSSKLQ(SEQ IDNO：37)只通过PSA剪切而不通过任何其它蛋白酶剪切(Denmeade等人(2003)J.Natl.Cancer Inst.95：990-1000)。肽的羧基末端处的半胱氨酸基团用于将肽附接于Au表面，依靠Au-硫醇反应以形成共价键。在肽的氨基末端，将拉曼活性分子例如生物素(图1A)或罗丹明6G(R19)(图1B)通过短的聚乙二醇或氨基戊酸接头接枝。检测方案如图1B所示。人工肽的SERS光谱在通过PSA剪切后改变，并且具有生物素或R19标记的分子部分的特征SERS峰由于在肽消化后标记分子从纳米新月体表面的扩散位移进入溶液中而消失；因此，溶液中有蛋白水解活性的PSA的存在和浓度可以通过监测肽缀合纳米新月体的SERS光谱进行探测。附接的肽的拉曼散射信号通过纳米新月体放大。我们的数字模拟(图1C)表明局部电场的振幅可以增强到接近于20dB(100倍)，特别在锐边周围。由于电场振幅和拉曼增强因子之间的四次方关系，肽拉曼信号可通过纳米新月体放大108倍。
图5显示实验系统配置。将肽缀合纳米新月体和PSA分子在密闭的透明微室中培养。该微室安置在具有用于纳米颗粒可视化的暗场照明的倒置拉曼显微镜上的37℃的热板上。插入图显示聚焦在单个纳米新月体上的～0.8mW的激发激光斑。
具有生物素和R19拉曼标记分子的肽缀合纳米新月体的典型SERS光谱分别如图6A和图6B所示。通过对比肽消化实验前和实验2小时后的SERS光谱，来自聚苯乙烯芯的拉曼峰(例如1003cm-1)保持恒定，其起到内部对照物的作用。一些拉曼峰来自在消化之后保留在纳米新月体表面上的部分氨基酸链，并且它们仍出现在光谱中，但峰位置已轻微变化并且峰强度降低，这是由于肽剪切时可能的构象变化。来自拉曼标记分子的那些峰，例如图6A中来自生物素的525cm-1处的峰和图6B来自R19的1183cm-1处的峰，在完成消化反应之后几乎完全消失(图6A和B)。
消化反应动力学可以通过实时分辨的SERS光谱采集进行监测。由于在缀合反应中对于各纳米新月体平均使用～100个肽，来自标记分子的特征拉曼峰的消失不是骤然的。由于大部分增强场集中在占纳米新月体总面积的～1/6的顶端区域周围，即使假设缀合效率为100％，在该高的增强区域中贡献于拉曼散射信号的实际分子数量小于20(图1C)。如图6A中时滞SERS光谱所示，通过在525cm-1处的生物素峰的消失所监测的各纳米新月体上肽的消化，在420nM的PSA浓度下花费～30分钟。对于具有作为拉曼标记分子的R19的肽，在420nM的PSA进行消化之后也可观察到1183cm-1处R19峰的消失(图6B)。
为了特异性地抑制缀合肽的PSA介导的蛋白水解，在加入420nM PSA之前引入蛋白酶抑制剂。我们还使用其它丝氨酸蛋白酶例如粒酶B(其在这里起到阴性对照物的作用)测试缀合肽对PSA的特异性。图7C和7D显示了具有R19标记分子的纳米新月体在上述两组分别用PSA抑制剂和丝氨酸蛋白酶粒酶B的对照实验中的时滞SERS光谱，其中粒酶B具有与PSA的正交底物特异性。在相同的实验条件下，加入抑制剂之后通过PSA进行的肽消化被抑制了超过90％。在用420nM粒酶B进行的肽消化的对照实验中，反应速率没有显示出与抑制剂处理反应在统计上的显著差异。还预期粒酶B无法剪切肽，因为PSA已经显示是对于HSSKLQ(SEQ ID NO：1)序列来说在体内唯一的蛋白酶(Denmeade等人(2003)J.Natl.Cancer Inst.95：990-1000)。
消化速率与PSA浓度有关，并且我们观察了在30分钟内对于1nM浓度的(生物素信号强度降低～50％，未显示数据)PSA的活性。由于每个纳米新月体最多附接100个肽分子，可能没有完全利用具有最高SERS信号的纳米新月体表面，并且仅有小的百分比的肽附接于在电磁场中提供最大增强的区域(图1C)。图8A显示对于0M(缓冲溶液)、4.2nM、42nM和420nM的PSA浓度，作为PSA消化时间函数的525cm-1处生物素拉曼峰的强度。图8B分别显示与420nM PSA、具有抑制剂的420nM PSA、和420nM粒酶B的消化反应中1183cm-1处R19拉曼峰的时滞强度。所有的峰强度值归一化到1003cm-1处的内部对照物峰和525或1183cm-1处的初始峰强度。结果表明肽有效地和特异性地通过PSA剪切，因此该肽缀合纳米新月体可以用作特异筛选查工具以提供癌症生物标志物PSA的浓度和蛋白水解活性的信息。
总而言之，我们已经展示了使用具有至少纳摩灵敏度的单个肽缀合纳米新月体SERS探针进行蛋白水解活性PSA的体外检测。由于我们使用高度聚焦的激光束作为我们的激发源，检测体积仅为约10飞升。纳摩样品的实际PSA分子数目接近于单分子水平。与其它癌症生物标志物检测测定相比，我们的生物缀合纳米新月体允许以飞升体积检测中蛋白水解活性PSA分子的纳摩浓度，这对于单个癌细胞水平的癌症筛查是关键的。小体积的要求和灵敏度水平使其可检测用于转移的指示的捕获的循环前列腺癌细胞中PSA活性，而这对于常规技术是不可行的。在精液中，PSA浓度为10-150μM，其中大约三分之二的PSA有酶活性(Malm等人(2000)Prostate 45：132-139)。
用纳米新月体PSA探针(纳摩范围)实现的灵敏度水平足以进行基于精液的测定，因此这里的纳米新月体SERS平台可以具有潜在的临床应用。在当前阶段设计中，PSA消化位点在谷氨酸(Q)和亮氨酸(L)残基之间，并且非常接近Au表面，因此PSA肽可以受PSA酶的空间位阻并且不是最佳可接近的。我们预想到，在底物肽序列HSSKLQ(SEQ ID NO：1)和半胱氨酸残基之间合成额外的隔离体，我们可以改善PSA底物肽HSSKLQ(SEQ ID NO：1)在表面上的存在，从而提高检测灵敏度。实时反应监测不仅只测量蛋白质的存在，还提供PSA活性的关键信息。
这里成功利用了两种不同拉曼标记分子，表明多重化肽缀合纳米新月体以检测两种或多种癌症相关的蛋白酶的潜力。该芯可以由磁性材料制成以允许单独纳米颗粒进行空间编址(Liu等人(2005)Adv.Mater.17：2683-2688)。该纳米新月体也可以通过激光操作以在高的精确性下进行空间编址(Liu等人(2006)Nat Mater 5：27-32)，由此其可作为高密度阵(具有亚微升体积)多重化。微米阵列或纳米阵列形式中多种蛋白酶的额外空间多重化是可能的。而且，磁的或激光的可操作性允许在期望的位置进行生物传感(Liu等人(2005)Adv.Mater.17：2683-2688)，这对于获得细胞内原位测量是有利的。
材料和方法
PSA的制备
PSA购自CalBiochem(San Diego，CA)。固定在Au纳米新月体上的底物肽的剪切在50mM Tris-HCl、pH8.0、100mM NaCl和0.1mM EDTA的缓冲液中进行，并且该反应在37℃下实时监测。PSA抑制剂从CalBiochem获得并根据制造商的说明加入反应溶液中，使得最终反应溶液含有5μMAEBSF、4.2nM抑肽酶、200nM弹性酶抑制剂和10nM的GGACK。
肽合成
生物素-Ttds-HSSKLQLAAAC-NH 2 (1)(SEQ ID NO：36).
将200mg(0.140mmol)的Rink Amide AM聚苯乙烯树脂(负载0.69mmol/g)加入6mL的烧结注射器并用DMF(4mL)溶胀。除去芴基甲氧羰基(Fmoc)保护基团[用DMF(2mL)中20％的哌啶处理25分钟]，并过滤该树脂并用DMF洗涤(3×3mL)。为加载α-氨基酸残基，该树脂经受反复循环的耦联条件，随后进行洗涤(3×3mL的DMF)和Fmoc去保护[用DMF(2mL)中20％的哌啶处理25分钟]，并再次洗涤(3×3mL的DMF)。用于将α-氨基酸耦联到该树脂的条件如下：在适当保护的酸[Fmoc-Cyl(Trt，三苯甲基)-OH(375mg)、Fmoc-Ala-OH(199mg)、Fmoc-Leu-OH(226mg)、Fmoc-Gln(Trt)-OH(391mg)、Fmoc-Lys(Boc，叔丁氧羰基)-OH(300mg)、Fmoc-Ser(O-t-Bu)-OH(245mg)、或Fmoc-His(Trt)-OH(397mg)]的0.4M溶液(0.640mmol)中处理该树脂，所述溶液已通过与DIC(100μL，0.640mmol)和HOBt(98mg，0.64mmol)在DMF(1.5mL)中一起温浴10分钟而预活化。每次耦联允许进行4小时。在最终α-氨基酸残基的耦联和去保护之后，通过使树脂在Fmoc-Ttds-OH(303mg，0.560mmol)的0.4M溶液中进行处理来加入Ttds接头，所述溶液已通过与DIC(88μL，0.56mmol)和HOBt(86mg，0.56mmol)在DMF(1.2mL)中一起培养10分钟而预活化。该耦联允许进行过夜。该树脂用DMF(3×3mL)洗涤，除去Fmoc保护基团，并且再次用DMF(3×3mL)洗涤该树脂。通过将生物素(137mg，0.560mmol)、PyBOP(281mg，0.540mmol)、和i-Pr2NEt(94μL，0.54mmol)在无水DMF(1.5mL)中的浆料加入到该树脂而引入生物素基团。在过夜搅拌该树脂之后，该树脂用DMF(1×4mL)中的20％哌啶、DMF(3×4mL)、THF(3×4mL)、MeOH(3×4mL)、THF(3×4mL)、和CH2Cl2(3×4mL)充分地洗涤。通过用94:2:2:2的TFA/三异丙基硅烷/水/乙二硫醇(3mL)培养1小时底物从树脂剪切，使用预备的C18反相HPLC(CH3CN/H2O-0.1％ TFA，5-60％进行50分钟，8mL/min，210/220/254nm检测100分钟，tR＝31.8分钟)纯化，并冻干。纯度通过HPLC-MS分析(CH3CN/H2O-0.1％ TFA，5-95％进行14分钟，0.4mL/min，220nm检测22分钟，tR＝6.5分钟)来检查。MS(ESI)，对于C71H121N19O22S2来说计算的m/z：1655.8。实测值：m/z 828.2(M+2H)2+。
R19-Ava-HSSKLQLAAAC-NH 2 (2)(SEQ ID NO：36).
将401mg(0.277mmol)的Rink Amide AM聚苯乙烯树脂(负载0.69mmol/g)加入12mL的烧结注射器并用N-甲基吡咯烷酮(NMP)(4mL)溶胀。通过用1:2:2哌啶/NMP/CH2Cl2溶液(3mL)处理30分钟而除去Fmoc保护基团，和过滤该树脂并用NMP(3×3mL)和CH2Cl2(3×3mL)洗涤。为加载α-氨基酸残基，该树脂经受反复循环的耦联条件(方法A或方法B)，随后进行洗涤(5×3mLNMP，5×3mL CH2Cl2)，Fmoc去保护[用1:2:2哌啶/NMP/CH2Cl2溶液(3mL)处理30分钟]，并用NMP(5×3mL)和CH2Cl2(5×3mL)再次洗涤。第一种α-氨基酸残基通过将预先形成的Fmoc-Cys(Trt)-OH(1.17g，2.00mmol)、PyBOP(1.04g，2.00mmol)、和HOBt(270mg，2.00mmol)在1:1的NMP/CH2Cl2(2mL)中的溶液加入到该树脂上而加载，并将所得浆料在机械腕摇摆器(wrist-action shaker)上搅拌5分钟，随后加入i-Pr2EtN(0.55mL，4.0mmol)。该反应允许进行5小时。然后将该树脂过滤、洗涤(5×3mL NMP，5×3mL CH2Cl2)、并在高真空下干燥。确定Cys的加载为0.60mmol/g(78％的产率)。连续的耦联通过方法A或方法B实现。方法A由以下步骤组成：加入预先形成的Fmoc-保护的氨基酸[Fmoc-Cyl(Trt)-OH(1.17g，2.00mmol)、Fmoc-Ala-OH(622mg，2.00mmol)、Fmoc-Leu-OH(707mg，2.00mmol)、Fmoc-Gln(Trt)-OH(1.22g，2.00mmol)、Fmoc-Ser(tBu)-OH(767mg，2.00mmol)、和Fmoc-His(Trt)-OH(1.24g，2.00mmol)]、PyBOP(1.04g，2.00mmol)、和HOBt(270mg，2.00mmol)在NMP/CH2Cl2(1:1，2mL)中的溶液，随后加入i-Pr2EtN(0.55mL，4.0mmol)。该反应允许进行至少4小时。方法B由下列步骤组成：使该树脂在适当保护的酸[Fmoc-Lys(Boc)-OH(375mg)]的0.4M溶液中处理，该溶液已通过与DIC(130μL，0.84mmol)和HOBt(108mg，0.800mmol)在DMF(1.2mL)中一起温浴10分钟而预活化。耦联允许进行4小时。在各次耦联之后，过滤树脂并洗涤(NMP：5×3mL，CH2Cl2：5×3mL)，随后除去Fmoc保护基团。在最终α-氨基酸残基的耦联和去保护之后，接头通过使树脂在Fmoc-S-Ava-OH(272mg，0.800mmol)的0.4M溶液中处理而加入氨基戊酸接头，所述溶液已通过与DIC(120μL，0.80mmol)和HOBt(108mg，0.800mmol)在NMP(1mL)中一起温浴10分钟而预活化。耦联允许进行过夜。过滤该树脂并洗涤(NMP：5×3mL，CH2Cl2：5×3mL)，除去Fmoc保护基团，且再次洗涤树脂。罗丹明基团通过加入罗丹明19的0.4M溶液掺入，所述溶液已与DIC(130μL，0.84mmol)和HOBt(108mg，0.800mmol)在NMP(2mL)中一起温浴10分钟而预活化。该反应允许进行6小时，再次重复耦联步骤并该反应允许进行过夜。通过用TFA/三异丙基硅烷/H2O/乙二硫醇的94:2:2:2的溶液(3mL)培养2小时而从树脂剪切底物，使用预备的C18反相HPLC(CH3CN/H2O-0.1％ TFA，5-95％进行50分钟，20mL/min，220/254/280nm检测100分钟，tR＝24.3min)纯化，并冻干。MS(MALDI)，对于C78H116N19O17S来说计算的m/z：1622.85。实测值：m/z 1623.90。
SERS光谱
使用具有拉曼分光计的显微系统从单个纳米新月体采集拉曼散射光谱。该系统由Carl Zeiss Axiovert 200倒置显微镜(Carl Zeiss，德国)组成，该显微镜配置有数码照相机和具有1024×265像素的致冷摄谱CCD照相机(RoperScientific，NJ)的300mm焦距的单色仪(Acton Research，MA)。我们的实验中使用785nm半导体激光器作为拉曼散射的激发源，并且激光束通过40X物镜聚焦在纳米新月体上。激发功率通过光度计(Newport，CA)测量为～0.8mW。然后，拉曼散射光通过穿过长通滤光片的相同光路聚集并通过分光计分析。
应理解，本文描述的实施例和实施方式仅用于展示性目的，并且根据它们的各种调整和改变将启示本领域技术人员并包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的范围内。为了各种目的，将本文引用的所有出版物、专利、和专利申请的全部内容通过引用纳入本申请，并且各文件也是通过引用以相同的程度特定地和单独地纳入。

Claims (56)

1.一种用于检测活性蛋白酶的指示物，所述指示物包括：
附接于肽的纳米新月体，其中所述肽包括所述蛋白酶的识别位点。
2.权利要求1的指示物，其中所示指示物进一步包括附接于所述肽的拉曼标签。
3.权利要求2的指示物，其中所述拉曼标签选自荧光团、生色团、量子点、荧光微球、和生物素。
4.权利要求2的指示物，其中所述拉曼标签包括罗丹明、荧光素、或外源化学分子。
5.权利要求2的指示物，其中所述拉曼标签包括选自下列的部分：TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、NBC(7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑)、德克萨斯红染料、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲苯基坚牢紫、甲苯基蓝紫、亮甲苯基蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、生物素、洋地黄毒苷、5-羧基-4’，5’-二氯-2’，7’-二甲氧基荧光素、5-羧基-2’，4’，5’，7’-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基氨基酞菁、6-羧基-X-罗丹明、甲亚胺、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、氨基吖啶、和氰化物(CN)、硫醇(SH)、氯(Cl)、溴(Br)、甲基、磷(P)、硫(S)、SN、Al、Cd、Eu、和Te。
6.权利要求2的指示物，其中所述拉曼标签直接附接于所述肽。
7.权利要求2的指示物，其中所述拉曼标签通过接头附接于所述肽。
8.权利要求1-7中任一项的指示物，其中所述纳米新月体包括壳而没有芯。
9.权利要求1-7中任一项的指示物，其中所述纳米新月体包括芯和壳。
10.权利要求9的指示物，其中所述芯包括提供恒定拉曼光谱的材料。
11.权利要求10的指示物，其中所述芯包括选自下列的材料：塑料、二氧化硅或其它III族、IV族、或V族材料、右旋糖苷、和磁性材料。
12.权利要求11的指示物，其中所述芯包括聚苯乙烯。
13.权利要求9的指示物，其中所述纳米新月体包括选自下列的金属：Ga、Au、Ag、Cu、Al、Ta、Ti、Ru、Ir、Pt、Pd、Os、Mn、Hf、Zr、V、Nb、La、Y、Gd、Sr、Ba、Cs、Cr、Co、Ni、Zn、Ga、In、Cd、Rh、Re、W、Mo，和它们的氧化物、合金、混合物、和/或氮化物。
14.权利要求9的指示物，其中所述纳米新月体具有约20-约800nm的外径。
15.权利要求9的指示物，其中所述纳米新月体具有约10nm-约500nm的内径。
16.权利要求9的指示物，其中所述纳米新月体通过内径r、和外径R、以及所述内径r和所述外径R限定的所述圆的圆心之间的圆心到圆心的距离来表征，其中：
r为约10nm到约500nm；
R为约20nm到约800nm；且
d为约5nm到约300nm。
17.权利要求9的指示物，其中所述纳米新月体通过内径r、和外径R、以及所述内径r和所述外径R限定的所述圆的圆心之间的圆心到圆心的距离来表征，其中：
r为约25nm到约500nm；
R为约20nm到约800nm；且
d为约5nm到约200nm。
18.权利要求9的指示物，其中所述肽包括蛋白酶的识别位点，所述蛋白酶选自：丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、和谷氨酸蛋白酶。
19.权利要求9的指示物，其中所述肽包括细胞凋亡路途径中蛋白酶的识别位点。
20.权利要求19的指示物，其中所述肽包括胱天蛋白酶的识别位点。
21.权利要求19的指示物，其中所述肽包括胱天蛋白酶的识别位点，所述胱天蛋白酶选自：胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6、和胱天蛋白酶-7。
22.权利要求18的指示物，其中所述肽包括凝血酶的识别位点。
23.权利要求18的指示物，其中所述肽包括丝氨酸蛋白酶的识别位点。
24.权利要求23的指示物，其中所述肽包括PSA识别位点。
25.权利要求23的指示物，其中所述肽包括包含氨基酸序列HSSKLQ(SEQ ID NO：1)的识别位点。
26.权利要求9的指示物，其中所述肽的长度为2个氨基酸到30个氨基酸。
27.权利要求26的指示物，其中所述肽的长度为2个氨基酸到10个氨基酸。
28.权利要求9的指示物，其中所述肽直接地附接于所述纳米新月体。
29.权利要求9的指示物，其中所述肽通过接头附接于所述纳米新月体。
30.权利要求9的指示物，其中所述肽通过硫醇基团附接于所述纳米新月体。
31.权利要求2的指示物，其中两种不同的肽附接于所述纳米新月体。
32.权利要求2的指示物，其中多于两种的不同的肽附接于所述纳米新月体。
33.权利要求1的部分，其中所述指示物是拉曼活性底物的组分。
34.一种检测或量化样品中至少一种蛋白酶的存在、量、或活性的方法，所述方法包括：
使所述样品与包括附接于肽的纳米新月体的指示物接触，其中所述肽包括所述蛋白酶的识别位点；和
监测检测的表面拉曼散射光谱的光谱特征中的差别，所述差别是存在于该样品中的蛋白酶的存在、量或活性的指示物。
35.权利要求34的方法，其中所述指示物进一步包括附接于所述肽的拉曼标签。
36.权利要求34或35中任一项的方法，其中所述监测包括监测表面增强拉曼散射(SERS)。
37.权利要求34或35中任一项的方法，其中所述样品包括选自下列样品的材料，所述下列样品选自：全血、血浆、血清、滑液、脑脊液、支气管灌洗液、腹水液、精液、骨髓抽出物、胸膜流出物、尿、和肿瘤细胞或组织。
38.权利要求34或35中任一项的方法，其中所述肽包括蛋白酶的识别位点，所述蛋白酶是癌症存在或发展的标志物。
39.权利要求38的方法，其中所述肽包括PSA的识别位点。
40.权利要求38的方法，其中所述肽包括包含氨基酸序列HSSKLQ(SEQ ID NO：1)的识别位点。
41.权利要求34的方法，其中所述样品包括选自下列的材料：全血、血级分、淋巴、脑脊液、口腔液、粘液、尿、粪便、和精液。
42.用于检测两种或更多种活性蛋白酶的存在或活性的库，所述库包括：
多种蛋白酶指示物，所述指示物包括附接于肽的纳米新月体，其中所述肽包括所述蛋白酶的识别位点；其中不同的纳米新月体附接于不同的肽使不同的纳米新月体检测不同的蛋白酶。
43.权利要求42的库，其中所述库进行空间编址使得对不同蛋白酶有特异性的蛋白酶指示物定位于底物上的不同位置。
44.权利要求42的库，其中所述库进行光学编址使得对不同蛋白酶有特异性的蛋白酶指示物产生不同的信号。
45.权利要求42或43中任一项的库，其中所述库包括至少3种或更多种不同的蛋白酶指示物。
46.权利要求42或43中任一项的库，其中所述库包括至少10种或更多不同的蛋白酶指示物。
47.权利要求42或43中任一项的库，其中所述纳米新月体包括磁性芯，并且指示物的空间隔离通过磁场提供。
48.权利要求42或43中任一项的库，其中所述指示物以离子方式或化学方式耦联到底物。
49.权利要求42或43中任一项的库，其中所述指示物吸附到底物上。
50.用于检测活性蛋白酶的试剂盒，所述指示物包括：
含有附接于肽的纳米新月体的容器，其中所述肽包括所述蛋白酶的识别位点。
51.权利要求50的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括附接于所述肽的拉曼标签。
52.权利要求50的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括说明材料，所述说明材料教导所述指示物用于利用表面增强拉曼散射(SERS)检测活性蛋白酶的存在、浓度或活性的用途。
53.用于检测核酸酶的指示物，所述指示物包括：
附接于单链或双链寡核苷酸的纳米新月体，其中所述寡核苷酸包括所述核酸酶的识别位点。
54.权利要求1的指示物，其中所述指示物进一步包括附接于所述寡核苷酸的拉曼标签。
55.一种用于检测分析物的存在或量的方法，所述方法包括：
使包含所述分析物的样品与指示物接触，所述指示物包括附接于底物的纳米新月体，所述底物在拉曼标记的部分的存在下特异性地或优先地被所述分析物结合，所述拉曼标记的部分与所述分析物为结合到所述底物而竞争；和
检测所述指示物的拉曼光谱，其中通过所述拉曼标记的部分从所述底物的解离而产生的拉曼光谱的变化提供所述样品中所述分析物的存在或量的测量。
56.权利要求55的方法，其中所述底物是肽或核酸。
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