CN113106147B - 外切酶iii驱动的三维dna纳米机器及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种外切酶III驱动的三维DNA纳米机器及其应用，所述三维DNA纳米机器，包括信号探针@纳米金结构和检测探针，信号探针中包含信号探针序列和荧光分子，检测探针中包含半胱天冬酶的识别位点和DNA触发链，DNA触发链与信号探针序列互补；检测探针在半胱天冬酶存在下裂解释放出包含DNA触发链的结构，该结构中的DNA触发链与信号探针杂交形成双链DNA，双链DNA可被外切酶III识别并消化，释放出信号探针中的荧光分子，DNA触发链随即恢复单链并继续与其他信号探针杂交，从而实现荧光分子的循环释放。本发明可实现对多种半胱天冬酶活性的的同时检测，且检测灵敏度高，而且还可用于对半胱天冬酶抑制剂的筛选。

Description

外切酶III驱动的三维DNA纳米机器及其应用

技术领域

本申请涉及生物分析技术领域，具体涉及外切酶III驱动的三维DNA纳米机器及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本申请的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种表现形式，可以在不引发任何炎症的情况下导致细胞死亡，半胱天冬酶在细胞凋亡过程中起着关键的调控作用。半胱天冬酶是一种通过裂解一系列下游蛋白最终导致细胞解体的蛋白酶，其活性异常涉及许多人类疾病，比如阿尔茨海默病、贫血、自身免疫性疾病和癌症。

在凋亡相关的半胱天冬酶中，根据其在凋亡级联信号传递过程中所扮演的角色可分为启动子半胱天冬酶和效应子半胱天冬酶。启动子半胱天冬酶负责裂解效应子半胱天冬酶的前体启动凋亡级联反应，而效应子半胱天冬酶可在激活后执行相关下游蛋白的裂解，破坏具有结构功能和调控功能的细胞蛋白，完成细胞凋亡过程。作为启动子的半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9是细胞凋亡信号转导的重要组成部分，因为他们能够激活半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-6和半胱天冬酶-7等效应子半胱天冬酶。细胞凋亡共有外源性通路和内源性通路两种调节方式，在细胞凋亡的外源性通路中，死亡受体可特异性激活半胱天冬酶-8；而在细胞凋亡的内源性通路中，线粒体膜电位的改变会引发细胞色素C的富集，进而激活半胱天冬酶-9。因此，同时测定半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9的活性对于临床诊断和生物学研究都具有重要意义。

检测半胱天冬酶的常规方法包括酶联免疫吸附法、蛋白印迹法、流式细胞术和质谱等方法，可用于研究其在凋亡机制中的作用。然而这些方法大多存在步骤繁琐、耗时长、实验前需要样品预处理等问题，因此并不适合快速检测。近几年来，基于电化学检测、比色检测和荧光检测等技术的新方法逐渐发展起来，可用于在体内和体外检测半胱天冬酶，在这些方法中，大部分都是基于抗体识别或多肽裂解的原理。基于抗体的免疫印迹法可以在同一样品中同时比较不同的半胱天冬酶，但需要高质量的抗体。多肽和抗体相比具有易获取、成本低、结构简单、化学性质稳定等显著优势，但由于背景荧光干扰以及可能的光谱重叠等问题，这类基于多肽裂解的检测方法的灵敏度受到限制。因此，开发新型的生物传感器来灵敏地检测半光天冬蛋白酶活性仍具有非常大的挑战。

发明内容

半胱天冬酶是细胞凋亡的主要执行者，启动子半胱天冬酶是细胞凋亡信号转导的重要组成部分，可在凋亡的外源性通路和内源性通路中激活效应子半胱天冬酶。同时检测多种启动子半胱天冬酶对于细胞凋亡机制的研究和疾病治疗至关重要。然而，现有的检测方法存在操作繁琐、背景信号高、灵敏度较差等局限性。为了改善现有技术的不足，本发明提供了一种外切酶III驱动的三维DNA纳米机器，及包含该三维DNA纳米机器的试剂盒，以及将其用于同时检测多种(至少2种)半胱天冬酶中的应用及具体检测时的方法。本发明的方法将外切酶III驱动的三维DNA纳米机器与单分子检测技术相结合，检测背景低、检测灵敏度高、操作简单，恒温条件即可，且适用范围广泛。

具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的技术方案。

在本发明的第一方面，本发明提供了一种外切酶III驱动的三维DNA纳米机器，其包括信号探针@纳米金结构和检测探针；信号探针中包含信号探针序列和荧光分子，检测探针中包含半胱天冬酶(caspase)的识别序列和DNA触发链，DNA触发链与信号探针序列互补；

检测探针在半胱天冬酶存在下裂解释放出包含DNA触发链的结构，该结构中的DNA触发链与信号探针杂交形成双链DNA，双链DNA可被外切酶III识别并消化，释放出信号探针中的荧光分子，DNA触发链随即恢复单链并继续与其他信号探针杂交，以此实现外切酶III对纳米金表面信号探针的循环切割，从而循环释放出荧光分子。

本发明的外切酶III驱动的三维DNA纳米机器可用于多种半胱天冬酶的同时检测，以及用于筛选半胱天冬酶的抑制剂。

基于本发明的上述设计，本发明的外切酶III驱动的三维DNA纳米机器中，信号探针和检测探针可以包含多种，比如2种，则可用于同时检测两种半胱天冬酶，比如在本发明的一些实施方式中，所述信号探针包括信号探针1和信号探针2，所述检测探针包含检测探针1和检测探针2。

在本发明的一些实施方式中，比如外切酶III驱动的三维DNA纳米机器用于同时检测半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9时，检测探针1中可以包含半胱天冬酶-8的识别位点Ile-Glu-Thr-Asp(IETD)和DNA触发链1，检测探针2中可以包含半胱天冬酶-9的识别位点Leu-Glu-His-Asp(LEHD)和DNA触发链2；

DNA触发链1与信号探针1序列互补，DNA触发链2与信号探针2序列互补。

以及，DNA触发链的3’末端还设计有免于被外切酶III消化(切割)的保护序列区。比如，在本发明的一些实施方式中，为了使DNA触发链能够抵抗外切酶III的切割实现“行走”，在其3’末端还设计了一段由5个连续T碱基组成的单链序列区。

荧光分子的选择并不局限，只要能够实现对所检测的多种半胱天冬酶的区分即可。比如，在本发明的一些实施方式中，所述荧光分子为Cy5分子和Texas Red分子，其分别被包含在信号探针1和信号探针2上。

在本发明的一些实施方式中，信号探针@纳米金结构由信号探针与纳米金溶液混合得到，信号探针通过Au-S键连接在纳米金上。

在本发明的一些实施方式中，作为优选，检测探针可组装在由链霉亲和素包覆的磁珠上构成探针-磁珠结构。引入磁珠结构的优势在于，可通过磁分离快速去除未被裂解的检测探针，从而降低背景信号。

比如，在本发明的一些实施方式中，本发明所述信号探针和检测探针包含2种，其中，检测探针为多肽-DNA结构，其中多肽的氨基端修饰在DNA序列的5’末端上(探针结构中羧基和氨基的结构仅用于示意多肽的氨基端和羧基端)，检测探针1的结构为：生物素-(COOH)-Lys-Ser-His-Ser-His-Gly-Asp-Thr-Glu-Ile-Cys-(NH₂)-TTT TTC ACT TGA GGCTAA CAC TTT TT，其中，多肽部分蛋白质序列为(氨基端至羧基端)：Cys-Ile-Glu-Thr-Asp-Gly-His-Ser-His-Ser-Lys-生物素(SEQ ID No.1)，DNA部分核酸序列为(5’-3’)：TTT TTCACT TGA GGC TAA CAC TTT TT(SEQ ID No.2)；检测探针2的结构为：生物素-(COOH)-Lys-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Asp-His-Glu-Leu-Cys-(NH₂)-TTT TTC ACA ATC GGA CTA TCG TTTTT，其中，多肽部分蛋白质序列为(氨基端至羧基端)：Cys-Leu-Glu-His-Asp-Gly-Gly-Arg-Gly-Arg-Lys-生物素(SEQ ID No.3)，DNA部分核酸序列为(5’-3’)：TTT TTC ACA ATC GGACTA TCG TTT TT(SEQ ID No.4)。

在这些实施方式中，检测探针1和2在半胱天冬酶的作用下裂解，释放含有DNA触发链1和含有DNA触发链2的裂解探针1和裂解探针2，半胱天冬酶-8能特异性识别IETD序列Ile-Glu-Thr-Asp并水解位于天冬氨酸残基后的肽键，得到裂解探针1；半胱天冬酶-9能特异性识别LEHD序列Leu-Glu-His-Asp并水解位于天冬氨酸残基后的肽键，得到裂解探针2，由于裂解探针由检测探针裂解后获得，因此，裂解探针的多肽部分仍然以其氨基端修饰连接在DNA序列的5’端，以下裂解探针的结构按照DNA序列的5’-3’顺序给出。裂解探针1的结构为：Asp-Thr-Glu-Ile-Cys-TTT TTC ACT TGA GGC TAA CAC TTT TT，其中，裂解探针多肽部分的蛋白质序列为(氨基端至羧基端)：Cys-Ile-Glu-Thr-Asp(SEQ ID No.5)，裂解探针DNA部分的核酸序列为(5’-3’)：TTT TTC ACT TGA GGC TAA CAC TTT TT(SEQ ID No.6)；裂解探针2的结构为：Asp-His-Glu-Leu-Cys-TTT TTC ACA ATC GGA CTA TCG TTT TT，其中，裂解探针多肽部分的蛋白质序列为(氨基端至羧基端)：Cys-Leu-Glu-His-Asp(SEQ IDNo.7)，裂解探针DNA部分的核酸序列为(5’-3’)：TTT TTC ACA ATC GGA CTA TCG TTT TT(SEQ ID No.8)。

在这些实施方式中，信号探针1的序列为(5’-3’)：SH-TTT TTT TTT TGT GTT AGCCTC AAG TG-Cy5(SEQ ID No.9)；信号探针2的序列为(5’-3’)：SH-TTT TTT TTT TCG ATAGTC CGA TTG TG-Texas Red(SEQ ID No.10)。

裂解探针1和裂解探针2上含有可以分别与信号探针1和信号探针2杂交的序列(DNA触发链1和DNA触发链2)，形成具有5’突出末端的双链DNA，可被外切酶III识别并消化；外切酶III从信号探针1和2的3’末端逐步催化移除单核苷酸将导致信号探针1中的Cy5荧光分子、信号探针2中的Texas Red荧光分子释放出来，而裂解探针1和裂解探针2因在3’末端具有由重复的T序列组成的单链区而不被外切酶III消化。随着外切酶III对信号探针1和信号探针2的消化，DNA触发链1和DNA触发链2的一部分序列恢复单链并可与附近的另一个信号探针1或信号探针2进行杂交，这样，DNA触发链1和DNA触发链2就可以沿着纳米金的表面“行走”，信号探针1和信号探针2中的荧光分子也被逐步释放出来并恢复荧光发光，利用单分子检测对恢复荧光的荧光分子进行计数就可对半胱天冬酶进行定量。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种检测试剂盒，其包含上述第一方面中所述的外切酶III驱动的三维DNA纳米机器和外切酶III。

在本发明的实施方式中，所述试剂盒中还可以包含反应体系溶液，比如包括裂解检测探针的体系溶液和外切酶III消化双链DNA释放荧光分子的体系溶液。在本发明的一些实施方式中，所述反应体系溶液为缓冲溶液，比如裂解检测探针的反应体系溶液为1×磷酸盐缓冲溶液，消化双链DNA释放荧光分子的体系溶液为包括1×Cutsmart缓冲液，其中含有醋酸钾、三羟基氨甲烷-醋酸、醋酸镁和BSA，比如，在一个实施例中，1×Cutsmart缓冲液pH为7.9，其中含有500毫摩尔每升的醋酸钾、200毫摩尔每升的三羟基氨甲烷-醋酸、100毫摩尔每升的醋酸镁和1000微克每毫升的BSA。

在本发明的第三方面，本发明提供了上述第一方面中所述的外切酶III驱动的三维DNA纳米机器或上述第二方面中所述的检测试剂盒在半胱天冬酶检测中的应用，优选可用于多种半胱天冬酶及其活性的同时检测。

在本发明的第四方面，本发明提供了上述第一方面中所述的外切酶III驱动的三维DNA纳米机器或上述第二方面中所述的检测试剂盒在半胱天冬酶抑制剂筛选中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述半胱天冬酶为半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9。本发明所述的外切酶III驱动的三维DNA纳米机器或包含该三维DNA纳米机器的检测试剂盒可实现对这两种酶的活性的同时检测。

在本发明的第五方面，本发明提供了一种检测半胱天冬酶及其活性的方法，其采用上述第一方面中所述的外切酶III驱动的三维DNA纳米机器或上述第二方面中所述的检测试剂盒。

在本发明的一些实施方式中，所述检测半胱天冬酶及其活性的方法包括：将检测探针置于检测样品中孵育，检测探针在半胱天冬酶存在下会发生裂解，将裂解产物置于含有外切酶III的体系中孵育，裂解产物优选经磁分离后取上清液置于含有外切酶III的体系中孵育，在该体系中，外切酶III驱动荧光分子的循环释放，检测荧光信号确认半胱天冬酶的存在；以及，可进一步地，对最终的反应产物进行单分子检测，定量荧光分子从而实现对半胱天冬酶的定量。

与集成检测相比，单分子检测具有灵敏度高、简单快速、样品消耗少等明显优势，本发明的外切酶III驱动的三维DNA纳米机器特别适宜于单分子检测。

在本发明的第六方面，本发明提供了一种筛选半胱天冬酶抑制剂的方法，其采用上述第一方面中所述的外切酶III驱动的三维DNA纳米机器或上述第二方面中所述的检测试剂盒。

在本发明的一些实施方式中，所述筛选半胱天冬酶抑制剂的方法包括：将待筛选试剂置于已知半胱天冬酶活性的样品溶液中孵育，以将检测探针置于该混合溶液中孵育，检测探针在半胱天冬酶存在下会发生裂解，将裂解产物置于含有外切酶III的体系中孵育，裂解产物优选经磁分离后取上清液置于含有外切酶III的体系中孵育，在该体系中，外切酶III驱动荧光分子的循环释放，对最终的反应产物进行单分子检测，定量荧光分子从而实现对半胱天冬酶的定量，根据半胱天冬酶的活性的降低程度实现对半胱天冬酶抑制剂的筛选。

通过上述技术手段，可实现以下有益效果：

本发明首次将外切酶III驱动的三维DNA纳米机器与单分子检测技术结合起来用于多种半胱天冬酶的同时检测。本发明以启动子半胱天冬酶半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9为模型，构建了一种基于外切酶III驱动的三维DNA纳米机器单分子纳米传感器，用于高灵敏同时检测半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9及其活性。在本发明中，两种多肽-DNA检测探针通过生物素和链霉亲和素之间的特异性相互作用结合在磁珠上，两种信号探针分别通过Au-S键连接在纳米金上形成信号探针@纳米金纳米结构。在半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9存在的情况下，检测探针中的肽链可被相应的半胱天冬酶裂解，从而释放出两种可以作为“行走DNA”的DNA触发链；在外切酶III的驱动下，DNA触发链在纳米金的表面上“行走”并释放出大量的Cy5荧光分子和Texas Red荧光分子；通过单分子检测技术对Cy5荧光分子和Texas Red荧光分子进行计数就可实现对半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9的灵敏检测，其中Cy5的荧光信号指示半胱天冬酶-8的存在，Texas Red的荧光信号指示半胱天冬酶-9的存在。通过引入磁分离技术降低了背景信号，通过引入单分子检测技术进一步提高了检测灵敏度。本技术方案所构建的纳米传感器灵敏度高，检测半胱天冬酶-8的检测限为2.08×10^-6单位每微升，检测半胱天冬酶-9的检测限为1.71×10^-6单位每微升，并可用于在单细胞水平上测定多种细胞的内源性半胱天冬酶活性，还可用于半胱天冬酶抑制剂的同时筛选。

具体地，本发明具有以下优势：

1.检测背景低，检测灵敏度高。

本方案具有超高的灵敏度，半胱天冬酶-8的检出限为2.08×10^-6单位每微升(约7.51皮摩尔每升)，线性范围为2.50×10^-6单位每微升～2.50×10^-3单位每微升，即使在单细胞水平上也能定量检测出内源性半胱天冬酶-8的活性。该纳米传感器的灵敏度比共轭聚合物荧光法(0.2单位每毫升)高96倍，比已报道的荧光法(3.3纳摩尔每升)高439倍。半胱天冬酶-9的检出限为1.71×10^-6单位每微升(约92.37皮摩尔每升)，线性动态范围为2.50×10^-6单位每微升～2.50×10^-3单位每微升，即使在单细胞水平上也能定量检测出内源性半胱天冬酶-9的活性。该纳米传感器的灵敏度比基于上转换纳米粒子的FRET法(0.068单位每毫升)高40倍，比基于金纳米粒子聚多巴胺(纳米金/PDA)的电化学免疫传感器(0.06微摩尔每升)高650倍。

该方法提高了灵敏度有以下几个原因：(1)通过多肽-DNA检测探针将半胱天冬酶的酶切信号高效转换为了DNA信号，(2)外切酶III引发的三维DNA纳米机步行器高效放大了荧光信号，(3)单分子检测的高信噪比。

2.适用范围广。

通过改变检测探针内多肽链的序列，仅使用外切酶III这一种常见的工具酶就能实现多种蛋白酶的同时检测。本技术方案所构建的纳米传感器还可用于酶动力学分析、抑制剂的同时筛选，此外，本方案能在单细胞水平上高灵敏地检测多种细胞内源性半胱天冬酶的活性。

3.操作简单，恒温反应条件。

本技术方案可以在37摄氏度的恒温条件下完成，不需要昂贵的温度循环装置，节省了检测成本；两种检测探针可同时组装在磁珠表面，大大简化了实验步骤，便于实现多种半胱天冬酶的同时检测。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：

图1：半胱天冬酶裂解多肽-DNA检测探针的原理示意图。

图2：基于外切酶III驱动的三维DNA纳米机器的单分子纳米传感器用于半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9同时检测的原理示意图。

图3：(A)对半胱天冬酶-8切割检测探针产物的非变性凝胶电泳分析。泳道1：商业合成的裂解产物裂解探针1；泳道2：检测探针1；泳道3：检测探针1+0.025单位每微升的半胱天冬酶-8；泳道4：检测探针1+0.025单位每微升的半胱天冬酶-9。(B)对半胱天冬酶-9切割检测探针产物的非变性凝胶电泳分析。泳道1：商业合成的裂解产物裂解探针2；泳道2：检测探针2；泳道3：检测探针2+0.025单位每微升的半胱天冬酶-8；泳道4：检测探针2+0.025单位每微升的半胱天冬酶-9。(C)在存在0.025单位每微升的半胱天冬酶-8和不存在半胱天冬酶-8时的Cy5荧光光谱测定。(D)在存在0.025单位每微升的半胱天冬酶-9和不存在半胱天冬酶-9时的Texas Red荧光光谱测定。外切酶III的用量为0.5个单位。

图4：(A)在2.50×10^-6单位每微升到0.05单位每微升范围内，随着半胱天冬酶-8浓度的增加，Cy5荧光分子数目的变化。(B)在2.50×10^-6单位每微升到2.50×10^-3单位每微升范围内，Cy5荧光分子的数目与半胱天冬酶-8浓度的对数呈现线性关系。(C)在2.50×10^-6单位每微升到0.05单位每微升范围内，随着半胱天冬酶-9浓度的增加，Texas Red荧光分子数目的变化。(D)在2.50×10^-6单位每微升到2.50×10^-3单位每微升范围内，Texas Red荧光分子的数目与半胱天冬酶-9浓度的对数呈现线性关系。外切酶III的用量为0.5个单位，误差棒表示三次重复实验的标准偏差。

图5：不同酶存在时的荧光分子数目情况。从左至右依次为0.025单位每微升的半胱天冬酶-8+0.025单位每微升半胱天冬酶-9、0.025单位每微升的半胱天冬酶-8、0.025单位每微升的半胱天冬酶-9、0.025单位每微升的半胱天冬酶-3、0.025单位每微升的Dnmt1、0.025单位每微升的hAAG和无酶存在时所对应的Cy5荧光分子数和Texas Red荧光分子数。外切酶III的用量为0.5个单位，误差棒表示三次重复实验的标准偏差。

图6：不同抑制剂对半胱天冬酶活性的抑制效果。(A)不同浓度的Z-IETD-FMK对半胱天冬酶-8相对活性的影响。(B)不同浓度的Ac-LEHD-CMK对半胱天冬酶-9相对活性的影响。(C)不同浓度的Q-VD-OPh对半胱天冬酶-8相对活性的影响。(D)不同浓度的Q-VD-OPh对半胱天冬酶-9相对活性的影响。半胱天冬酶-8的用量是0.025单位每微升，半胱天冬酶-9的用量是0.025单位每微升，外切酶III的用量为0.5个单位，误差棒表示三次重复实验的标准偏差。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

DNA纳米机器由于其良好的运动能力、方向性和可编程性，在生物传感、货物运送和生物计算等领域得到了广泛的应用，这为其在生物传感器中的应用以提高检测灵敏度提供了新的思路。传统的DNA纳米机器是沿着一维轨道或二维平面移动的，其表面积和装载能力有限。本发明构建了一种外切酶III驱动的三维DNA纳米机器，其具有较大的比表面积和较高的DNA负载能力，能够极大地提高DNA的局部浓度，缩短反应时间，提高单位时间内的信号增益，在本发明中作为信号转导和扩增工具。

本发明所述的外切酶III驱动的三维DNA纳米机器，其包括信号探针@纳米金结构(信号探针通过Au-S键连接在纳米金上)和检测探针；信号探针中包含信号探针序列和荧光分子，检测探针中包含半胱天冬酶的识别位点和DNA触发链，DNA触发链与信号探针序列互补；

检测探针在半胱天冬酶存在下裂解释放出包含DNA触发链的结构，该结构中的DNA触发链与信号探针杂交形成双链DNA，双链DNA可被外切酶III识别并消化，释放出信号探针中的荧光分子，DNA触发链随即恢复单链并继续与其他信号探针杂交，以此实现外切酶III对纳米金表面信号探针的循环切割，从而循环释放出荧光分子。

本发明的外切酶III驱动的三维DNA纳米机器可用于多种半胱天冬酶的同时检测，以及用于筛选半胱天冬酶的抑制剂。

作为示例，本发明所述信号探针可以包括信号探针1和信号探针2，相应地，所述检测探针包含检测探针1和检测探针2；

比如，在将上述外切酶III驱动的三维DNA纳米机器用于同时检测半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9时，则可以设计检测探针1中包含半胱天冬酶-8的识别位点Ile-Glu-Thr-Asp(IETD)和DNA触发链1，检测探针2中包含半胱天冬酶-9的识别位点Leu-Glu-His-Asp(LEHD)和DNA触发链2；

DNA触发链1与信号探针1序列互补，DNA触发链2与信号探针2序列互补。以及，DNA触发链的3’末端还设计有免于被外切酶III消化(切割)的保护序列区。比如，在本发明的一些实施方式中，为了使DNA触发链能够抵抗外切酶III的切割实现“行走”，在其3’末端还设计了一段由5个连续T碱基组成的单链序列区。

以及，所述荧光分子为Cy5分子和Texas Red分子，其分别被包含在信号探针1和信号探针2上。当然也可以采用其他荧光分子，荧光分子的选择以能够实现对所检测的不同的半胱天冬酶进行区分即可。

以及，作为一种优选的方式，检测探针可组装在由链霉亲和素包覆的磁珠上构成探针-磁珠结构。引入磁珠结构的优势在于，可通过磁分离快速去除未被裂解的检测探针，从而降低背景信号。

以下，作为示例，本发明具体构建了同时检测半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9的外切酶III驱动的三维DNA纳米机器及检测过程，并说明了本发明的原理及验证了技术方案的可行性、灵敏度和专一性等特性。

实施例1外切酶III驱动的三维DNA纳米机器的构建

检测探针为多肽-DNA检测探针，其包括两种，检测探针1的多肽链上含有半胱天冬酶-8的识别位点Ile-Glu-Thr-Asp(IETD)，其DNA部分可与信号探针1互补；检测探针2的多肽链上则含有半胱天冬酶-9的识别位点Leu-Glu-His-Asp(LEHD)，其DNA部分可与信号探针2互补。

本发明示例实施例中涉及的序列信息如表1所示：

表1

注：检测探针中目标的识别位点加粗表示。检测探针为多肽-DNA结构，其中多肽的氨基端修饰在DNA序列的5’末端上(探针结构中羧基和氨基的结构仅用于示意蛋白质序列的氨基端和羧基端)，因此，表1中的蛋白质序列均以羧基端至氨基端顺序示出。

用检测探针组装磁珠：取100微升链霉亲和素包覆的磁珠于600微升离心管中，用1×磷酸盐缓冲溶液洗涤3次，再用50微升的1×磷酸盐缓冲溶液(PBS)重悬，然后加入10微升的10微摩尔每升的检测探针溶液，在室温下通过混匀仪混合30分钟，通过生物素和链霉亲和素之间的相互作用将检测探针组装到磁珠上；得到的混合物使用1×磷酸盐缓冲溶液洗涤5次并分别通过磁分离除去未结合的检测探针；最后用50微升的1×磷酸盐缓冲溶液将组装好的检测探针-磁珠纳米结构重悬于600微升离心管中。

用信号探针组装纳米金形成信号探针@纳米金的纳米结构：将未做任何处理的信号探针溶液(100微摩尔每升，20微升)和纳米金溶液(直径10纳米，1毫升)混合均匀。然后将混合液放入温度设定为零下20摄氏度的实验室冷冻柜中静置2小时以上以保证混合液完全冷冻为固体；然后将在室温下缓慢解冻的该混合液置于温度设置为4摄氏度的离心机中以14000转每秒的速度离心30分钟；洗涤并离心3次以去除未结合的信号探针后使用40微升超纯水进行重悬，置于4摄氏度保存待用。制得的信号探针@纳米金溶液使用紫外分光光度计测量其中的核酸含量并计算信号探针@纳米金纳米结构中信号探针的数量，测得的信号探针1的浓度为28.25±0.29微摩尔每升，信号探针2浓度为28.33±0.23微摩尔每升，因此每个纳米金上组装的信号探针的数目经计算为120±1个。

下述实验将采用本实施例构建的三维DNA纳米机器。

实施例2半胱天冬酶活性检测及半胱天冬酶在活性抑制下的检测

1、半胱天冬酶活性检测：半胱天冬酶活性检测的步骤包括两步，分别为半胱天冬酶对检测探针的裂解和外切酶III驱动的三维DNA纳米机器导致的荧光分子的循环释放。半胱天冬酶对检测探针的裂解在20微升的反应体系中进行，反应体系包含11.5微升的1×磷酸盐缓冲溶液、8微升的检测探针-磁珠和0.5个单位的半胱天冬酶-8或/和半胱天冬酶-9，在37摄氏度的温度下孵育1个小时。经过磁分离后，取含有裂解产物的上清液进行下一步反应。第二步外切酶III驱动的三维DNA步行器的反应体系为20微升，其中包含1×Cutsmart缓冲液(500毫摩尔每升的醋酸钾，200毫摩尔每升的三羟基氨甲烷-醋酸，100毫摩尔每升的醋酸镁，1000微克每毫升的BSA，pH7.9)，上步反应的上清液，0.71微升的信号探针1@纳米金或0.36微升的信号探针2@纳米金，以及0.5个单位的外切酶III，将以上混合物在200微升的离心管中混匀后置于37摄氏度孵育1小时。

凝胶电泳：室温下，使用110伏的恒定电压，在1倍工作浓度的TBE缓冲液(含9毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、9毫摩尔每升的硼酸和0.2毫摩尔每升pH＝7.9的乙二胺四乙酸)中通过12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9的酶切产物。电泳时间为60分钟。凝胶电泳中使用的染料为SYBR Gold，通过伯乐ChemiDoc MP成像系统对胶图进行拍摄分析。

单分子检测：半胱天冬酶-8的最终反应产物用成像缓冲液(含1毫克每毫升的葡萄糖氧化酶、0.4％的D-葡萄糖、0.04％毫克每毫升的过氧化氢酶、50微克每毫升的牛血清蛋白、67毫摩尔每升的甘氨酸-氢氧化钾、1毫克每毫升的水溶性维生素E、2.5毫克每毫升的氯化镁，pH9.4)稀释200倍，半胱天冬酶-9的最终反应产物用成像缓冲液稀释500倍；用移液枪取10微升稀释溶液滴到载玻片上使用全内反射荧光显微镜进行单分子成像，Cy5荧光分子和Texas Red荧光分子分别使用640纳米的激光器和561纳米的激光器进行激发，信号由100×的奥林巴斯油镜进行收集，并由安道尔Ixon DU897 EMCCD以500毫秒的曝光时间进行成像，利用Image J软件选择600像素×600像素的图像区域分别对Cy5荧光分子和Texas Red荧光分子进行计数。

2、半胱天冬酶活性抑制实验：为了评估不同的抑制剂对半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9活性的影响，使用苄氧羰基-异亮氨酸-谷氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-氟甲基酮(Z-IETD-FMK，抑制半胱天冬酶-8的活性)、乙酰基-亮氨酸-谷氨酸-组氨酸-天冬氨酸-氯甲基酮(Ac-LEHD-CMK，抑制半胱天冬酶-9的活性)和广谱半胱天冬酶抑制剂喹啉-缬氨酸-天冬氨酸-二呋喃苯氧甲基酮(Q-VD-OPh)进行了抑制剂效果实验。具体来讲，将不同浓度的抑制剂分别与0.025单位每微升的半胱天冬酶-8或半胱天冬酶-9在室温下分别孵育15分钟后加入8微升连接了检测探针的磁珠，并用1×磷酸盐缓冲溶液调整反应体积至20微升；后续的实验过程与半胱天冬酶活性检测相同。

本发明的实验原理：用于半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9检测的多肽-DNA检测探针在多肽链的末端修饰有生物素，因此检测探针可以通过生物素和链霉亲和素之间的特异性相互作用组装到磁珠上；检测探针1的多肽链上含有半胱天冬酶-8的识别位点Ile-Glu-Thr-Asp(IETD)，其DNA部分可与信号探针1互补；检测探针2的多肽链上则含有半胱天冬酶-9的识别位点Leu-Glu-His-Asp(LEHD)，其DNA部分可与信号探针2互补。而不同的信号探针则通过金-硫键连接到纳米金上，形成外切酶III驱动的DNA纳米机器的三维“行走”支架。如图1左图所示，在半胱天冬酶-8存在的情况下，它能特异性识别IETD序列并水解位于天冬氨酸残基后的肽键，将DNA触发链1释放到反应溶液中；如图1右图所示，在半胱天冬酶-9存在的情况下，它能特异性识别LEHD序列并水解位于天冬氨酸残基后的肽键，将DNA触发链2释放到反应溶液中。未被裂解的检测探针通过磁分离去除，留存下来的DNA触发链可作为“行走DNA”在信号探针@纳米金的表面“行走”，从而实现外切酶III对纳米金表面信号探针的循环切割，从信号探针@纳米金中释放出大量的Cy5分子或Texas Red分子(图2)。具体而言，DNA触发链1与信号探针1的杂交会形成具有5’突出末端的双链DNA，可被外切酶III识别并消化；外切酶III从信号探针1的3’末端逐步催化移除单核苷酸将导致信号探针1中的Cy5荧光分子从纳米金的表面释放出来，而DNA触发链1因在3’末端具有由重复的T序列组成的单链区而不被外切酶III消化。随着外切酶III对信号探针1的消化，DNA触发链1的一部分序列恢复单链并可与附近的另一个信号探针1进行杂交，这样，DNA触发链1就可以沿着纳米金的表面“行走”，信号探针1中的Cy5分子也被逐步释放出来并恢复荧光发光，利用单分子检测对恢复荧光的Cy5分子进行计数就可对半胱天冬酶-8进行定量。类似地，DNA触发链2与信号探针2的杂交会形成具有5’突出末端的双链DNA，可被外切酶III识别并消化；外切酶III对信号探针2的消化导致大量的Texas Red分子被释放出来并恢复荧光发光，利用单分子检测对恢复荧光的Texas Red分子进行计数就可对半胱天冬酶-9进行定量。由于每个纳米金颗粒上大约有120个信号探针，高密度的支架DNA提高了DNA触发链沿着三维轨道运动的速度，放大了荧光信号。相反，在没有半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9存在的情况下，检测探针保持完整，没有DNA触发链释放到反应溶液中，因此不会发生外切酶III对信号探针的循环切割，既不能检测到Cy5的荧光信号也不能检测到Texas Red的荧光信号。

原理的可行性验证：半胱天冬酶对检测探针的消化切割是本技术方案的关键步骤，因此本发明使用12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分别验证了半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9对检测探针1和检测探针2的切割。在半胱天冬酶-8的检测中，如图3A所示，在没有半胱天冬酶-8存在时，只观察到一条与完整的检测探针1相同的清晰条带(图3A，泳道2)，这说明在没有半胱天冬酶-8的情况下，检测探针1未发生断裂；当存在半胱天冬酶-8时，观察到一条分子量更小的条带(图3A，泳道3)，它与商业合成的半胱天冬酶-8裂解产物裂解探针1的条带(图3A，泳道1)相同，这表明检测探针1可以被半胱天冬酶-8切割；而当只存在半胱天冬酶-9时，观察到一条与完整的检测探针1(图3A，泳道2)相同的条带(图3A，泳道4)，这说明在存在半胱天冬酶-9时，检测探针1也不会发生断裂。在半胱天冬酶-9的检测中，如图3B所示，在没有半胱天冬酶-9存在时，只观察到一条与完整的检测探针2相同的清晰条带(图3B，泳道2)，这说明在没有半胱天冬酶-9的情况下，检测探针2未发生断裂；而当只存在半胱天冬酶-8时，观察到一条与完整的检测探针2(图3B，泳道2)相同的条带(图3B，泳道3)，这说明在存在半胱天冬酶-8时，检测探针2也不会发生断裂；当存在半胱天冬酶-9时，观察到一条分子量更小的条带(图3B，泳道4)，它与商业合成的半胱天冬酶-9裂解产物裂解探针2的条带(图3B，泳道1)相同，这表明检测探针2可以被半胱天冬酶-9切割。

此后，本发明采用荧光光谱测量的方式验证了整个技术方案的可行性(图3C、图3D)。在半胱天冬酶-8存在时，可以观察到明显的Cy5荧光信号，在670纳米处观察到特征发射峰；相反，在没有半胱天冬酶-8存在的对照组中，只检测到微弱的Cy5荧光信号。类似地，在半胱天冬酶-9存在时，可以观察到明显的Texas Red荧光信号，在619纳米处观察到特征发射峰；相反，在没有半胱天冬酶-9存在的对照组中，只检测到微弱的Texas Red荧光信号。这些结果表明，本技术方案切实可行，可用于半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9活性的同时定量检测。

灵敏度实验：本发明通过测量荧光分子的数目随半胱天冬酶浓度的变化评估了本技术方案的检测灵敏度。如图4A所示，Cy5荧光分子的数目随着半胱天冬酶-8浓度的增加而增多；此外，荧光分子数与半胱天冬酶-8浓度的对数在2.50×10^-6到2.50×10^-3单位每微升的范围内呈现线性相关(图4B)，线性回归方程为N＝510.06+89.12log₁₀ C，线性相关系数(R²)为0.9990，其中，N表示Cy5荧光分子的数目，C表示半胱天冬酶-8的浓度。经过计算，检测限为2.08×10^-6单位每微升(约7.51皮摩尔每升)，本技术方案的灵敏度比基于共轭聚合物的荧光方法(0.2单位每毫升)高出96倍，比已报道的其他荧光方法(3.3纳摩尔每升)高出439倍。

如图4C所示Texas Red荧光分子的数目随着半胱天冬酶-9浓度的增加而增多；此外，荧光分子数与半胱天冬酶-9浓度的对数在2.50×10^-6单位每微升到2.50×10^-3单位每微升的范围内呈现线性相关(图4D)，线性回归方程为N＝451.37+71.46log₁₀ C，N表示TexasRed的荧光分子的数目，C表示半胱天冬酶-9的浓度，且线性相关系数(R²)是0.9997。经过计算，检测限为1.71×10^-6单位每微升(约92.37皮摩尔每升)。本技术方案的灵敏度比基于上转换纳米颗粒的FRET法(0.068单位每毫升)高出40倍，比基于金纳米颗粒聚多巴胺(纳米金/PDA)的电化学免疫传感器(0.06微摩尔每升)高出650倍。本技术方案中，灵敏度的提高主要得益于以下几个原因：(1)通过对肽-DNA检测探针的切割可将半胱天冬酶的活性信号高效地转化为DNA信号；(2)外切酶III驱动的三维DNA纳米机器有效放大了荧光信号；(3)单分子检测具有极高的信噪比。

特异性实验：为了研究本发明构建的三维DNA纳米机器及其使用方法的选择性，本发明以半胱天冬酶-3、DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶1(Dnmt1)和人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)作为阴性对照进行了相关实验。如图5所示，在半胱天冬酶-3、DNA(胞嘧啶-5)-甲基转移酶1或人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶存在的情况下，既没有观察到Cy5单分子荧光信号，也没有观察到Texas Red单分子荧光信号，这与只使用反应缓冲液的对照组结果是一致的；相反，在半胱天冬酶-8存在的情况下，只观察到较强的Cy5单分子荧光信号；在半胱天冬酶-9存在的情况下，仅观察到较强的Texas Red单分子荧光信号；在半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9同时存在的情况下，同时观察到较强的Cy5单分子荧光信号和Texas Red单分子荧光信号。这些结果表明，本发明的技术方案对半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9具有良好的选择性。

半胱天冬酶活性抑制实验：如图6所示，本发明以苄氧羰基-异亮氨酸-谷氨酸-苏氨酸-天冬氨酸-氟甲基酮(Z-IETD-FMK，抑制半胱天冬酶-8的活性)、乙酰基-亮氨酸-谷氨酸-组氨酸-天冬氨酸-氯甲基酮(Ac-LEHD-CMK，抑制半胱天冬酶-9的活性)和广谱半胱天冬酶抑制剂喹啉-缬氨酸-天冬氨酸-二呋喃苯氧甲基酮(Q-VD-OPh)为模型抑制剂，测试了本发明在半胱天冬酶活性抑制测定方面的能力。如图6A所示，从0微摩尔每升到20微摩尔每升，半胱天冬酶-8的相对活性随着Z-IETD-FMK浓度的增加而降低，使半胱天冬酶-8的活性降低50％(IC₅₀)所需的抑制剂浓度经过计算为1.95微摩尔每升，与基于滚环扩增的荧光方法的结果(0.9656微摩尔每升)一致。如图6B所示，从0微摩尔每升到300纳摩尔每升，半胱天冬酶-9的相对活性随着Ac-LEHD-CMK浓度的增加而降低，测定的IC₅₀为72.80纳摩尔每升，与药品厂家所提供的数据(约70纳摩尔每升)一致。如图6C和6D所示，随着Q-VD-OPh浓度的增加，半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9的相对活性均降低，半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9的IC₅₀分别计算为0.28微摩尔每升和0.31微摩尔每升。上述结果表明，本发明技术方案可用于半胱天冬酶抑制剂的筛选，在药物开发和疾病治疗方面具有很大的潜力。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东师范大学

<120> 外切酶III驱动的三维DNA纳米机器及其应用

<130> 202111926

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Cys Ile Glu Thr Asp Gly His Ser His Ser Lys

1 5 10

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tttttcactt gaggctaaca cttttt 26

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Cys Leu Glu His Asp Gly Gly Arg Gly Arg Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tttttcacaa tcggactatc gttttt 26

<210> 5

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Cys Ile Glu Thr Asp

1 5

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tttttcactt gaggctaaca cttttt 26

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Cys Leu Glu His Asp

1 5

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tttttcacaa tcggactatc gttttt 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tttttttttt gtgttagcct caagtg 26

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tttttttttt cgatagtccg attgtg 26

Claims (5)

1.一种外切酶III驱动的三维DNA纳米机器在制备半胱天冬酶抑制剂筛选的检测试剂盒中的应用；

所述外切酶III驱动的三维DNA纳米机器，其包括信号探针@纳米金结构和检测探针；信号探针中包含信号探针序列和荧光分子，检测探针中包含半胱天冬酶的识别位点和DNA触发链，DNA触发链与信号探针序列互补；信号探针@纳米金结构由信号探针与纳米金溶液混合得到，信号探针通过Au-S键连接在纳米金上；检测探针可组装在由链霉亲和素包覆的磁珠上构成探针-磁珠结构；

检测探针在半胱天冬酶存在下裂解释放出包含DNA触发链的结构，该结构中的DNA触发链与信号探针杂交形成双链DNA，双链DNA可被外切酶III识别并消化，释放出信号探针中的荧光分子，DNA触发链随即恢复单链并继续与其他信号探针杂交，以此实现外切酶III对纳米金表面信号探针的循环切割，从而循环释放出荧光分子；

所述半胱天冬酶为半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9；

所述信号探针包括信号探针1和信号探针2，所述检测探针包含检测探针1和检测探针2；

其中，检测探针1中包含半胱天冬酶-8的识别位点Ile-Glu-Thr-Asp和DNA触发链1，检测探针2中包含半胱天冬酶-9的识别位点Leu-Glu-His-Asp和DNA触发链2；

DNA触发链1与信号探针1序列互补，DNA触发链2与信号探针2序列互补；DNA触发链1和DNA触发链2的3’末端包含免于被外切酶III消化的保护序列区；

所述荧光分子为Cy5分子和Texas Red分子，其分别被包含在信号探针1和信号探针2上；

所述检测探针1的结构为：生物素-(COOH)-Lys-Ser-His-Ser-His-Gly-Asp-Thr-Glu-Ile-Cys-(NH2)-TTT TTC ACT TGA GGC TAA CAC TTT TT，其中，多肽部分蛋白质序列为(氨基端至羧基端)：Cys-Ile-Glu-Thr-Asp-Gly-His-Ser-His-Ser-Lys-生物素（SEQ ID No.1），DNA部分核酸序列为（5’-3’）：TTT TTC ACT TGA GGC TAA CAC TTT TT（SEQ ID No. 2）；检测探针2的结构为：生物素-(COOH)-Lys-Arg-Gly-Arg-Gly-Gly-Asp-His-Glu-Leu-Cys-(NH2)-TTT TTC ACA ATC GGA CTA TCG TTT TT，其中，多肽部分蛋白质序列为(氨基端至羧基端)：Cys-Leu-Glu-His-Asp-Gly-Gly-Arg-Gly-Arg-Lys-生物素（SEQ ID No. 3），DNA部分核酸序列为（5’-3’）：TTT TTC ACA ATC GGA CTA TCG TTT TT（SEQ ID No. 4）；

所述信号探针1的序列为（5’-3’）：SH-TTT TTT TTT TGT GTT AGC CTC AAG TG-Cy5（SEQ ID No. 9）；信号探针2的序列为（5’-3’）：SH-TTT TTT TTT TCG ATA GTC CGA TTGTG-Texas Red（SEQ ID No. 10）。

2.一种检测半胱天冬酶及其活性的方法，其采用权利要求1所述的检测试剂盒，所述方法不以疾病的诊断和治疗为目的；

半胱天冬酶活性检测的步骤包括两步，分别为半胱天冬酶对检测探针的裂解和外切酶III驱动的三维DNA纳米机器导致的荧光分子的循环释放；

半胱天冬酶对检测探针的裂解在20微升的反应体系中进行，反应体系包含11.5微升的1×磷酸盐缓冲溶液、8微升的检测探针-磁珠和0.5个单位的半胱天冬酶-8或/和半胱天冬酶-9，在37摄氏度的温度下孵育1个小时；经过磁分离后，取含有裂解产物的上清液进行下一步反应；第二步外切酶III驱动的三维DNA步行器的反应体系为20微升，其中包含1×Cutsmart缓冲液，上步反应的上清液，0.71微升的信号探针1@纳米金或0.36微升的信号探针2@纳米金，以及0.5个单位的外切酶III，将以上混合物在200微升的离心管中混匀后置于37摄氏度孵育1小时；

室温下，使用110伏的恒定电压，在1倍工作浓度的TBE缓冲液中通过12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分析半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9的酶切产物；电泳时间为60分钟；凝胶电泳中使用的染料为SYBR Gold，通过伯乐ChemiDoc MP成像系统对胶图进行拍摄分析；

半胱天冬酶-8的最终反应产物用成像缓冲液稀释200倍，半胱天冬酶-9的最终反应产物用成像缓冲液稀释500倍；用移液枪取10微升稀释溶液滴到载玻片上使用全内反射荧光显微镜进行单分子成像，Cy5荧光分子和Texas Red荧光分子分别使用640纳米的激光器和561纳米的激光器进行激发，信号由100×的奥林巴斯油镜进行收集，并由安道尔IxonDU897 EMCCD以500毫秒的曝光时间进行成像，利用Image J软件选择600像素×600像素的图像区域分别对Cy5荧光分子和Texas Red荧光分子进行计数。

3.如权利要求2所述的检测半胱天冬酶及其活性的方法，其特征在于，所述1×Cutsmart缓冲液为500毫摩尔每升的醋酸钾，200毫摩尔每升的三羟基氨甲烷-醋酸，100毫摩尔每升的醋酸镁，1000微克每毫升的BSA，pH7.9。

4.如权利要求2所述的检测半胱天冬酶及其活性的方法，其特征在于，所述1倍工作浓度的TBE缓冲液含9毫摩尔每升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、9毫摩尔每升的硼酸和0.2毫摩尔每升pH=7.9的乙二胺四乙酸。

5.如权利要求2所述的检测半胱天冬酶及其活性的方法，其特征在于，所述成像缓冲液含1毫克每毫升的葡萄糖氧化酶、0.4%的D-葡萄糖、0.04%毫克每毫升的过氧化氢酶、50微克每毫升的牛血清蛋白、67毫摩尔每升的甘氨酸-氢氧化钾、1毫克每毫升的水溶性维生素E、2.5毫克每毫升的氯化镁，pH9.4。

Images