CN113166799A

CN113166799A - 用于依次检测靶标的方法和组合物

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Publication number: CN113166799A
Application number: CN201980076748.0A
Authority: CN
Inventors: A·M·穆罕默德; M·马内斯; M·J·舍默尔; M·N·博布罗; M·J·纳坦
Original assignee: Ultivue Inc
Current assignee: Ultivue Inc
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2021-07-23
Also published as: WO2020123961A2; US20200190583A1; AU2019397157A1; JP2022513739A; WO2020123961A3; EP3894584A2; CA3117944A1; US20230313297A1; KR20210104030A; US11674178B2

Abstract

本文提供了用于检测多个靶标的组合物、试剂盒和方法。提供了一种探针组组合物，其包含一个或多个第一探针和一个或多个第二探针。每个所述第一探针包含与相应靶标特异性结合配偶体的核酸条形码互补的核酸序列、第一标签和用于第一裂解剂的裂解位点，其中所述第一裂解剂能够释放所述第一标签。每个所述第二探针包含与相应靶标特异性结合配偶体的核酸条形码互补的核酸序列、第二标签、使所述第二标签不可检测的淬灭部分和用于所述第一裂解剂的裂解位点。所述第一裂解剂能够释放所述淬灭部分，从而使得所述第二标签可检测。

Description

用于依次检测靶标的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年12月14日提交的美国临时申请号62/780,038的优先权益，所述申请的内容出于任何目的以引用的方式整体并入本文。

序列表

本申请连同序列表一起以电子格式提交。序列表以文件形式提供，所述文件标题为“2019-12-11_01168-0019-00PCT_SEQ_List_ST25.txt”，创建于2019年12月11日，大小为8,192字节。电子格式的序列表中的信息以引用的方式整体并入本文。

引言

本申请总体上涉及分析物(例如靶标)的检测领域，并且具体地涉及用于检测多个靶标的组合物、试剂盒和方法。

近年来，用于检查组织样品中的生物相关分子(称为生物标记物)的方法已得到改进。检测逐渐增加数量的生物标记物的能力允许对组织结构进行更复杂的表征，从而使临床医生可以通过检查组织样品来更好地了解并预测个体的健康状况。而先前的方法包括一次检查一个生物标记物，多重免疫组织化学(IHC)允许对单个组织样品中的多个生物标记物进行空间分析。IHC包括使抗体结合至生物标记物、将荧光标记物附接至抗体(其中每个生物标记物通过不同颜色的荧光标记物识别)以及使用荧光显微镜对样品成像。

DNA交换成像是用于对组织样品中的生物标记物进行多重检测的成熟方法，其采用了多轮组织处理。首先，将DNA条形码化抗体施用于样品，并使其与相应靶标结合。接下来，将“成像链(imager strand)”施用于样品；这与靶标之一的DNA条形码结合。将盖玻片置于样品上，并且然后使用荧光显微镜检测成像链。接下来，移除盖玻片；处理样品以移除成像链，并且将第二成像链施用于样品；其结合至到第二DNA条形码。然后检测第二成像链。再次移除盖玻片，并处理样品，以移除第二成像链，以准备第三轮。可以重复此过程以检测逐渐增加数量的生物标记物。

因此，DNA交换成像需要在每轮检测前施用新的成像链。施用一些通过多轮检测有效起作用的成像链将减少完成分析所需要的操作量(并且因此减少时间)。如果可以避免移除盖玻片，则将进一步减少此种操作。

发明内容

根据说明书，提供了用于依次检测样品中的靶标的方法和组合物。

因此，提供了根据本文描述的方法和组合物的以下实施方案。

实施方案1.一种用于检测多个靶标分子的方法，所述方法包括：

(a)使样品与两个或更多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体包含核酸条形码；并且对不同的靶标分子具有特异性；

(b)使所述样品与一个或多个探针组接触，其中探针组中的每个探针对不同的靶标特异性结合配偶体具有特异性，并且其中每个探针组包含：

第一探针，其包含：

与相应靶标特异性结合配偶体的核酸条形码互补的核酸序列；

第一标签；和

用于第一裂解剂的裂解位点，其中所述第一裂解剂能够释放所述第一标签，和

第二探针，其包含：

第二标签；

淬灭部分，其中所述淬灭部分使得所述第二标签不可检测；和

用于所述第一裂解剂的裂解位点，其中所述第一裂解剂能够释放所述淬灭部分，由此使得所述第二标签可检测；并且任选地包含用于第二裂解剂的裂解位点，其中所述第二裂解剂能够释放所述第二标签；

(c)检测与所述一个或多个探针组中每一个的所述第一探针的标签相对应的信号；

(d)使所述样品与第一裂解剂接触，从而释放在所述一个或多个探针组中每一个中所述第一探针的所述标签；并且释放所述一个或多个探针组中每一个中所述第二探针的淬灭部分，从而活化与所述第二标签相对应的信号，以及

(e)检测与所述一个或多个探针组中每一个的所述第二探针的所述标签相对应的信号。

实施方案2.如实施方案1所述的方法，其中所述探针组中的一个或多个还包含第三探针，并且所述方法还包括：

(f)在步骤(b)中，使所述样品与所述第三探针接触，所述第三探针包含：

第三标签；和

淬灭部分，其中所述淬灭部分使得所述第三标签不可检测；和

用于所述第二裂解剂的裂解位点，其中所述第二裂解剂能够释放所述淬灭部分，由此使得所述第三标签可检测；

并且任选地包含用于能够释放所述第三标签的不同裂解剂的不同裂解位点；和

(g)在步骤(e)之后，使所述样品与第二裂解剂接触，从而释放所述一个或多个探针组中每一个中所述第二探针的所述标签；并且释放一个或多个探针组中所述第三探针的所述淬灭部分，从而活化与所述第三标签相对应的信号；以及

(h)检测与一个或多个探针组的所述第三探针的所述标签相对应的信号。

实施方案3.如实施方案2所述的方法，其中所述探针组中的一个或多个还包含后续探针，并且所述方法还包括：

(i)在步骤(b)中，使所述样品与一个或多个探针组中所含有的后续探针接触，其中所述后续探针包含：

后续标签；和

淬灭部分，其中所述淬灭部分使得所述后续标签

不可检测；和

用于后续裂解剂的裂解位点，其中所述后续裂解剂能够释放淬灭部分，由此使得后续标签可检测；并任选地包含用于能够从样品中的探针释放活化标签的不同裂解剂的不同裂解位点；

(j)使所述样品与后续裂解剂接触，从而释放每个探针组中所述探针的活化标签；并释放每个探针组中所述后续探针的所述淬灭部分，从而活化与每个探针组中所述后续探针的所述标签相对应的信号；以及

(k)检测与每个探针组的所述后续探针的所述标签相对应的信号；以及

(l)任选地重复步骤(i)至(k)。

实施方案4.如实施方案1所述的方法，其中探针组的第一可检测标签和第二可检测标签是相同的。

实施方案5.如实施方案1所述的方法，其中探针组的第一可检测标签和第二可检测标签是不同的。

实施方案6.如实施方案2所述的方法，其中探针组的第一可检测标签、第二可检测标签和第三可检测标签中的两个或更多个是相同的。

实施方案7.如实施方案2所述的方法，其中探针组的第一可检测标签、第二可检测标签和第三可检测标签中的两个或更多个是不同的。

实施方案8.如实施方案3所述的方法，其中第一标签、第二标签、第三标签和后续标签中的两个或更多个是相同的。

实施方案9.如实施方案3所述的方法，其中第一标签、第二标签、第三标签和后续标签中的两个或更多个是不同的。

实施方案10.如实施方案1所述的方法，其还包括在使样品与第一裂解剂接触后和/或在使样品与第二裂解剂接触后洗涤样品。

实施方案11.如实施方案1所述的方法，其中在使样品与第一裂解剂接触后和/或在使样品与第二裂解剂接触后不洗涤样品。

实施方案12.如实施方案11所述的方法，其中不移除盖玻片。

实施方案13.如实施方案1所述的方法，还包括增加靶标特异性结合配偶体上的核酸条形码的数量，其中相应探针的多个拷贝结合至核酸条形码的多个拷贝。

实施方案14.如实施方案13所述的方法，其中使用滚环扩增、引物交换反应、杂交链反应或DNA分支来增加核酸条形码的数量。

实施方案15.如实施方案14所述的方法，其中在使靶标特异性结合配偶体与样品接触之前增加核酸条形码的数量。

实施方案16.如实施方案14所述的方法，其中当靶标特异性结合配偶体结合至其靶标分子时，核酸条形码的数量增加。

实施方案17.如实施方案1所述的方法，其中第一探针的释放的标签包含核苷酸序列。

实施方案18.如实施方案17所述的方法，其还包括使样品与背景降低剂接触，所述背景降低剂包含与释放的第一探针的释放的标签的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中背景降低剂与释放的第一探针的释放的标签的结合淬灭了标签的信号。

实施方案19.如实施方案2所述的方法，其中第二探针的释放的标签包含核苷酸序列。

实施方案20.如实施方案19所述的方法，其还包括使样品与背景降低剂接触，所述背景降低剂包含与第二探针的释放的标签的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中背景降低剂与释放的第二探针的标签的结合淬灭了标签的信号。

实施方案21.如实施方案3所述的方法，其中释放的探针的活化标签包含核苷酸序列。

实施方案22.如实施方案16所述的方法，其还包括使样品与背景降低剂接触，所述背景降低剂包含与探针的释放的标签的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中背景降低剂与释放的探针的释放的标签的结合淬灭了标签的信号。

实施方案23.一种探针组组合物，其包含：

一个或多个第一探针，每个第一探针包含：

第一标签；和

一个或多个第二探针，每个第二探针包含：

第二标签；

淬灭部分，其中所述淬灭部分使得所述第二标签

不可检测；和

用于所述第一裂解剂的裂解位点，其中所述第一裂解剂能够释放所述淬灭部分，由此使得所述第二标签可检测；

并且任选地包含用于能够释放所述第二标签的不同裂解剂的不同裂解位点。

实施方案24.如实施方案23所述的组合物，其还包含：

一个或多个第三探针，每个第三探针包含：

第三标签；

用于第二裂解剂的裂解位点，其中所述第二裂解剂能够释放所述淬灭部分，由此使得所述第三标签可检测；

并且任选地包含用于能够释放所述第三标签的不同裂解剂的不同裂解位点，

其中所述第二探针还包含用于所述第二裂解剂的裂解位点。

实施方案25.如实施方案24所述的组合物，其还包含：

后续探针，其包含：

后续标签；

用于所述后续标签的淬灭部分，其中所述淬灭部分使得所述后续标签不可检测；以及

裂解位点，其中裂解剂能够释放所述淬灭部分，由此使得所述后续标签可检测；

并且任选地包含不同裂解位点，其中不同裂解剂能够释放所述后续标签，

其中所述探针组中的另一个探针包含用于释放所述后续探针的所述淬灭部分的相同裂解剂的裂解位点。

实施方案26.如实施方案23所述的组合物，其中一个或多个第一探针具有相同的标签。

实施方案27.如实施方案23所述的组合物，其中一个或多个第一探针有不同的标签。

实施方案28.如实施方案23所述的组合物，其中所述裂解位点是电磁裂解位点；化学裂解位点；或机械裂解位点。

实施方案29.如实施方案28所述的组合物，其中电磁裂解位点是光裂解位点。

实施方案30.如实施方案29所述的组合物，其中所述光裂解位点是紫外光(UV)裂解位点。

实施方案31.如实施方案23所述的组合物，其中第一标签或第二标签是荧光标签。

实施方案32.如实施方案23所述的组合物，其还包含：背景降低剂，所述背景降低剂包含与存在于裂解位点和第一标签之间的第一探针的一部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

实施方案33.如实施方案32所述的组合物，其还包含：背景降低剂，所述背景降低剂包含与存在于裂解位点和第二标签之间的第二探针的一部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

实施方案34.如实施方案33所述的组合物，其还包含：背景降低剂，所述背景降低剂包含与存在于裂解位点和后续标签之间的后续探针的一部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

实施方案35.一种试剂盒，其包括：

如实施方案23所述的探针组组合物；

背景降低剂；

盖玻片；

一个或多个靶标特异性结合配偶体；

一种或多种缓冲液；

一种或多种用于增加靶标特异性结合配偶体的核酸条形码数量的试剂；

一种或多种裂解剂；

核复染剂；和

使用说明。

实施方案36.如实施方案35所述的试剂盒，其中所述背景降低剂连接至固相。

实施方案37.如实施方案36所述的试剂盒，其中所述固相选自盖玻片、颗粒和载玻片。

实施方案38.如实施方案35所述的试剂盒，其中所述背景降低剂是在液相中。

实施方案39.一种背景降低剂，其包含与如实施方案23所述的组合物的第一探针的释放的标签互补的核苷酸序列和淬灭材料。

实施方案40.一种背景降低剂，其包含与如实施方案24所述的组合物的第二探针的释放的标签互补的核苷酸序列和淬灭材料。

实施方案41.一种背景降低剂，其包含与如实施方案25所述的组合物的探针的释放的活化标签互补的核苷酸序列和淬灭材料。

实施方案42.一种用于检测多个靶标分子的方法，所述方法包括：

第一探针，其包含：

第一标签；和

用于第一裂解剂的裂解位点，其中所述第一裂解剂能够抑制所述第一标签，和

第二探针，其包含：

第二标签；

用于所述第一裂解剂的裂解位点，其中所述第一裂解剂能够释放或抑制所述淬灭部分，由此使得所述第二标签可检测；

并且任选地包含裂解位点，其中第二裂解剂能够释放或抑制所述第二标签；

(d)使所述样品与第一裂解剂接触，从而抑制在所述一个或多个探针组中每一个中所述第一探针的所述标签；并释放或抑制所述一个或多个探针组中每一个中所述第二探针的所述淬灭部分，从而活化与所述第二标签相对应的信号；以及

实施方案43.如实施方案42所述的方法，其中一个或多个探针组还包含第三探针，其包含：

(f)在步骤(b)中，使所述样品与一个或多个探针组中所含有的第三探针接触，其中所述第三探针包含：

第三标签；

用于第二裂解剂的裂解位点，其中所述第二裂解剂能够释放或抑制所述淬灭部分，由此使得所述第三标签可检测；

任选地包含不同的裂解位点，其中不同的裂解剂能够释放或抑制一个或多个探针组的所述第三标签；以及

(g)在步骤(e)之后，使所述样品与第二裂解剂接触，从而抑制所述一个或多个探针组中每一个中所述第二探针的所述标签；并且释放或抑制一个或多个探针组中所述第三探针的所述淬灭部分，从而活化与所述第三标签相对应的信号；以及

(h)检测与所述第三标签相对应的信号。

实施方案44.如实施方案43所述的方法，其中探针组中的一个或多个还包含后续探针，其包含：

后续标签；和

淬灭部分，其中淬灭部分使得后续标签不可检测；以及

裂解位点，其中后续裂解剂能够释放或抑制所述淬灭部分，由此使得所述后续标签可检测；

并且任选地包含不同的裂解位点，其中不同的裂解剂能够抑制来自所述样品中的探针的活化标签；

(j)使所述样品与后续裂解剂接触，从而抑制每个探针组中所述探针的活化标签；并释放每个探针组中所述后续探针的所述淬灭部分，从而活化与所述后续标签相对应的信号；以及

(k)检测与所述后续标签相对应的信号；以及

(l)任选地重复步骤(i)至(k)。

附图说明

图1A-1D示意性地描绘了本公开的示例性探针组，其含有第一探针(图1A)；第二探针(图1B)；第三探针(图1C)；和第四探针(图1D)。

图2A-2E提供了本文公开的实施方案的示意图。图2A示意性地描绘了与九种靶标特异性结合配偶体(描绘为抗体-DNA缀合物)结合的三个示例性探针组(探针组A、B和C)。探针组A定向至靶标1、4和7。探针组B定向至靶标2、5和8。探针组C定向至靶标3、6和9。示例性探针组被设计用于三轮检测：第一轮-靶标1、2和3；第2轮靶标4、5和6；以及第3轮-靶标7、8和9。

图2B示意性地描绘了根据本公开的一个实施方案的与固定在显微镜载玻片上的制备的组织样品结合的探针组。图2C、2D和2E分别示意性地描绘了第一轮、第二轮和第三轮检测。

图3A-3C示意性地描绘了本文所述的方法的示例性实施方案，其中图1中所描绘的探针组的第一探针、第二探针和第三探针结合至具有多个与同源探针结合的核酸条形码重复的靶标特异性结合配偶体(分别为图3A、3B和3C)。

图4A-D示意性地描绘了可用于本公开的各种实施方案中的四个示例性裂解模式。图4A描绘了使用紫外(UV)光作为光可裂解键的裂解剂。图4B描绘了使用三(2-羧基乙基)膦(TCEP)作为二硫键的裂解剂。图4C描绘了使用限制酶作为特定核苷酸序列的裂解剂。图4D描绘了使用尿嘧啶-DNA糖基化酶作为含有尿嘧啶-糖苷键的核酸发夹的裂解剂。

图5A-5D示意性地描绘了本公开的示例性实施方案，其中在应用探针组的三个探针之后，使用三轮检测来检测三个靶标；并且然后将新探针应用于样品并执行后续检测。

图6A-6B示出了在第一轮检测四个靶标(6A)和第二轮检测四个不同靶标(6B)之后，根据本公开的实施方案处理的组织样品的荧光显微镜图像。

图7A-7B示出了在使用本公开的一个实施方案的组织样品中淬灭探针的第一轮检测(7A)和在用裂解剂处理后未淬灭探针的第二轮检测的成像。

图8A-8D示出了本公开的示例性探针的片段。

图9示意性地描绘了示例性非选择性背景降低剂。

图10示意性地描绘了选择性背景降低剂的示例性实施方案。

图11A-11C示出了背景降低剂的设计的示意图和使用背景降低剂进行多轮检测的图像。图11A示意性地描绘了背景降低剂、相应第一探针(探针设计A)和第二探针(探针设计B)的设计的实施方案。图11B-11C示出了根据本公开的使用图11A的设计进行两轮检测的图像：第一轮检测(图11B)，其中同时检测到CD8、PD1、PDL1和CD68；和第二轮检测(图11C)，其中同时检测到CD3、CD4、FoxP3和细胞角蛋白。

图12A-12D示出了检测组织中的靶标的图像。所述图示出了在背景降低剂不存在(图12A/12B)或存在(图12C/12D)下在未进行盖玻片移除的情况下的图像。

图13A-13B示出了示例性探针组的示意图以及使用那些探针组由反应生成的图像。具体地，图13A示意性地描绘了含有四个成员的示例性探针组，其被设计用于使用三种不同的裂解剂(TCEP、UV光裂解；和尿嘧啶-DNA-糖基化酶)进行四轮检测。图13B示出了根据图13A所示的探针组实施方案使用四个探针组的十六个检测到的靶标分子的图像。

具体实施方式

本文描述了用于多重检测靶标分子(或“靶标”)的探针组、使用它们的相关方法和试剂盒以及相关背景降低剂。在一个实施方案中，所述方法可用于通过单一预先施用靶标结合配偶体和标签探针来检测多个靶标分子，随后依次检测探针亚群。在各种实施方案中，可以实施多重方法而无需在初始施加探针后直接进入样品，例如无需移除封闭组织样品的盖玻片。

尽管详细解释了本发明的实施方案，但是应当理解，也考虑其他实施方案。因此，并不意图将本发明的范围局限于以下描述所提及或附图所示出的部件的构造和布置的细节。本发明可用于其他实施方案并且能够以各种方式实践或执行。而且，在描述实施方案时，为了清楚起见，将诉诸特定术语。

还必须指出的是，除非上下文另有明确规定，如本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指示物。例如，对片或部分的提及还意图包括制造多个片或部分。对含有“一个”组成的片的提及意图除所命名成分以外还包括其他成分。

而且，在描述实施方案时，为了清楚起见，将诉诸术语。预期每个术语考虑本领域技术人员所理解的最广泛的含义，并且包括以类似方式操作以实现类似目的的所有技术等同物。

范围在本文中可表示为从“约”或“大约”一个特定值和/或至“约”或“大约”另一个特定值。当表示此范围时，另一个实施方案包括从所述一个特定值和/或至所述另一个特定值。

“包含(comprising)”或“含有(containing)”或“包括(including)”意指在组合物或制品或方法中至少存在命名的化合物、元素、颗粒或方法步骤，但不排除存在其他化合物、材料、颗粒、方法步骤，即使其他此类化合物、材料、颗粒、方法步骤具有与所命名的那些相同的功能。

还应理解，提及一个或多个方法步骤并不排除在明确鉴定的那些步骤之间存在另外的方法步骤或中间方法步骤。类似地，还应理解，在织物或系统中提及一个或多个组分并不排除在明确鉴定的那些组分之间存在其他组分或中间组分。

用于使用荧光显微镜多重检测组织样品中的靶标的方法已描述于例如美国专利号9,944,972中，并且是可商购获得的。InSituPlex多重检测技术(Ultivue，Inc.)用于如下所示地检测多个靶标。首先，将四个靶标的DNA条形码化抗体的集合施用于样品，其中每个抗体的DNA条形码都是不同的。使DNA条形码扩增后，施用结合至条形码的荧光标记探针。荧光标签是光谱上不同的，并且所有标签都可以同时成像。可以通过移除探针并施用与第二组条形码化抗体互补的另一个探针集合来检查另外的靶标。因此，在设计来使用此方法检查九个靶标的测定中，使用者可以对前三个靶标成像，然后通过移除探针并施用下一轮三个探针来执行交换。然后将对靶标四至六成像，并再次执行交换。然后对靶标七至九成像。

相比之下，本文描述的方法采用可以同时施用于样品并且无需交换步骤即依次检测的探针组。图1A-1D(分别描绘探针A、B、C和D)示意性地描绘了本公开的示例性探针组。尽管可能有各种变化，但是此图示出了本公开的基本实施。在此实施方案中，每种探针(A、B、C和D)对于不同的靶标具有特异性，并且各自含有相同的标签。探针B、C和D含有能够淬灭标签的相同的淬灭部分。探针A和B含有共同的裂解位点(C₁)，其允许同时释放探针A的标签并去淬灭探针B的标签。探针B和C含有共同的裂解位点(C₂)，其同样允许同时释放探针B的标签并去淬灭探针C的标签。探针C和D含有共同的裂解位点(C₃)，其允许同时释放探针C的标签并去淬灭探针D的标签。探针D任选地含有裂解位点(C₄)，其允许释放探针D的标签并任选地去淬灭后续探针的标签。

图2A示意性地描绘了根据本公开的结合至靶标特异性结合配偶体(TSBP)的三个示例性探针组。在此实施方案中，使用三轮检测来检测九个不同的靶标，每一轮中使用探针组A、B和C的成员。TSBP被描绘为具有核酸片段的抗体，每个片段均具有与不同探针结合的不同条形码。每个探针组的探针都被描绘为结合至其匹配的TSBP。特定探针组中的探针含有共同标签(参见图2A图例)。在此实施方案中，每个不同的探针组具有不同的标签和相应淬灭部分。图2B示意性地描绘了当结合至载玻片上的组织样品的靶标时图2A的示例性探针结合的TSBP。

图2C示意性地描绘了第1轮检测，其中在此实施方案中，检测每个探针组的第一探针的标签(靶标1、2和3)。可检测探针被描绘为黑色探针/TSBP/靶标复合物；不可检测探针被描绘为灰色探针/TSBP/靶标复合物。

图2D示意性地描绘了第2轮检测，在此之前施用裂解剂，从而释放每个探针组的第一探针的标签并释放每个探针组的第二探针的淬灭部分。释放淬灭部分使得每个探针组的第二探针的标签可检测，并且释放第一探针的标签从TSBP/靶标复合物移除其信号。因此，每个探针组的现在可检测的第二探针(靶标4、5和6)被描绘为黑色探针/TSBP/靶标复合物。

图2E示意性地描绘了第3轮检测，在此之前施用第二裂解剂，从而释放每个探针组的第二探针的标签并释放每个探针组的第三探针的淬灭部分。因此，每个探针组的现在可检测的第三探针(靶标7、8和9)描绘为黑色探针/TSPB/靶标复合物。在最后一轮检测中使用的探针中可存在或不存在标签裂解位点，因为使用者可能期望或不期望移除最后检测到的信号。

图3A-3C示意性地描绘了本文所描绘的方法的示例性实施方案，其中探针组的第一探针、第二探针和第三探针结合至TSBP，其中每个TSBP含有多个相同的与同源探针结合的核酸条形码重复。多个探针与每个TSBP的结合是用于扩增探针的可检测信号的示例性方法。

图4A-4D示意性地描绘了可用于本公开的多个实施方案中的四个示例性裂解模式。在图4A中，在使用UV作为光可裂解键的裂解剂时，活化探针的结合至TSPB/靶标的淬灭的标签。在图4B中，当将三(2-羧基乙基1)膦(TCEP)用作二硫键的裂解剂时，活化淬灭的标签。在图4C中，当将限制酶用作特定核苷酸序列的裂解剂时，活化淬灭的标签。在图4D中，当将尿嘧啶-DNA糖基化酶用作水解尿嘧啶-糖苷(UA)键的裂解剂时，活化淬灭的标签，使DNA双链体不稳定。

图5A-5B示意性地描绘了所描述的方法的示例性实施方案，其显示串行探针组可用来检测增加数量的靶标。图解描绘在第A轮中检测第一靶标(图5A)；用TCEP处理样品以释放第一标签并去淬灭第二标签；在第B轮中检测第二标签(图5B)；然后用UV光处理样品以释放第二标签并去淬灭第三标签；在第C轮中检测第三靶标(图5C)；然后用尿嘧啶DNA糖基化酶处理样品以释放第三标签；将另一个探针组添加到样品中，并在第D轮中检测第四靶标(图5D)；使用者使用任何选择的裂解模式继续进行一轮或多轮检测，以检测其他靶标。其他类型的探针也可以与本文所述的探针组一起用于检测另外的靶标。

因此，本发明提供用于检测多个靶标的组合物、试剂盒和方法。本文提供了探针组组合物。所述组合物包含一个或多个第一探针，每个第一探针含有与相应靶标特异性结合配偶体的核酸条形码互补的核酸序列；第一标签；和用于第一裂解剂的裂解位点，其中第一裂解剂能够释放第一标签，以及一个或多个第二探针，每个第二探针含有与相应靶标特异性结合配偶体的核酸条形码互补的核酸序列；第二标签；淬灭部分，其中所述淬灭部分使第二标签不可检测；以及用于所述第一裂解剂的裂解位点，其中所述第一裂解剂能够释放所述淬灭部分，由此使得所述第二标签可检测；并且任选地包含用于能够释放所述第二标签的不同裂解剂的不同裂解位点。

在一些实施方案中，探针组还可包含一个或多个第三探针，每个第三探针包含：与相应靶标特异性结合配偶体的核酸条形码互补的核酸序列；第三标签；淬灭部分，其中所述淬灭部分使第三标签不可检测；以及用于第二裂解剂的裂解位点，其中第二裂解剂能够释放淬灭部分，由此使第三标签可检测；并且任选地包含用于能够释放第三标签的不同裂解剂的不同裂解位点，其中第二标签还包含用于第二裂解剂的裂解位点。

在一些实施方案中，探针组可以被扩展以包含后续探针，其包含：与相应靶标特异性结合配偶体的核酸条形码互补的核酸序列；后续标签；后续标签的淬灭部分，其中所述淬灭部分使后续标签不可检测；以及裂解位点，其中裂解剂能够释放淬灭部分，由此使得后续标签可检测；并且任选地包含不同的裂解位点，其中不同的裂解剂能够释放后续标签，其中探针组中的另一探针包含用于释放后续探针的淬灭部分的相同裂解剂的裂解位点。

术语“第一探针”意指以下探针：含有至少(1)与相应靶标特异性结合配偶体的核酸条形码互补的核酸序列；(2)第一标签；以及(3)用于第一裂解剂的裂解位点，其中第一裂解剂能够释放第一标签。第一探针还可含有一个或多个另外的淬灭部分、一个或多个其他标签以及一个或多个在方法步骤中部署或未部署的其他裂解位点。在特定方法中仍未部署的元件(例如，当所述方法中没有应用光裂解剂时，存在光裂解位点)可用于替代性方法中，从而在设计测定流程时给予使用者灵活性。探针可以对于相同裂解剂具有多于一个裂解位点，或者对于不干扰后续步骤的不同裂解剂，具有不同裂解位点。此类冗余对于例如较弱裂解剂可用于创建更短的释放的探针片段或可用于其他目的。类似地，第二探针、第三探针和后续探针可以含有任何数量的淬灭部分、标签和/或裂解位点。因此，在一些实施方案中，探针组的一些探针可以含有一个或多个标签、淬灭部分或未部署的裂解位点。在一些实施方案中，探针的裂解产物可含有多于一个标签、淬灭部分和/或未部署的裂解位点。可以预见的是，探针的裂解可以释放出多于一个裂解产物。在需要时，第一探针可以含有淬灭部分，使得裂解剂与样品接触，之后检测第一探针的标签。

在需要时，可以设计两个或更多个探针以使用荧光共振能量转移(FRET)产生可反映两个或更多个靶标之间的物理距离的临近信号。在此实施方式的一个实施方案中，当探针紧密结合至靶标时，探针含有能够通过在另一探针上所含有的标签(例如，淬灭剂)淬灭的标签(例如，荧光基团)。因此，如本文所述，可以在一轮或多轮检测中检测供体或受体标签的FRET信号。

图8A-8D描绘了本公开所涵盖的示例性探针的片段。图8A-8C示出了含有二硫键裂解位点和末端标签的示例性第一探针片段。核苷酸的数量或由其他化学方法赋予的物理距离可以根据使用者的选择而变化。在图8B中，“T”是胸腺嘧啶碱基。图8D示出了示例性第二探针片段，其含有在标签与淬灭部分之间的二硫裂解位点。

可以期望在检测下一个待检测探针的标签之前降低从探针释放的标签的信号。出于此目的，可以采用背景降低剂。如本文所用，术语“背景降低剂”意指结合至探针的释放的标签并降低标签的信号的材料，否则所述标签可能会产生不需要的信号或背景信号。背景降低剂可通过一种或多种机制来降低信号，所述机制包括直接或间接淬灭标签；将标签重定位至所选成像区域以外；或者两种机制。背景降低剂可以非选择性地或选择性地结合至释放的标签。

在一个实施方案中，非选择性背景降低剂是碳纳米颗粒碳纳米材料，其包括宏观、细观和纳米级材料，包括单晶碳、碳片、玻璃碳、炭黑、碳糊、活性炭、石墨烯、碳纳米管、氧化石墨烯和碳点。颗粒的示例性粒度范围包括小于20nm的一个尺寸。氧化石墨烯颗粒除了石墨碳之外还具有羟基和羧基。虽然羧基赋予对水性溶液中的溶解度有利的离子性，但颗粒上的高电荷度也促进了表面吸附。因此，有用的碳纳米颗粒可以表现出相对于羧基的高羟基度。氧化石墨烯已用于例如减少组织显微镜法中的不需要的荧光(参见例如Li,R.,Georgiades,P.,Cox,H.等人Quenched Stochastic Optical Reconstruction Microscopy(qSTORM)with Graphene Oxide.Sci Rep 8,16928(2018)doi:10.1038/s41598-018-35297-4)。如图9所描绘的，释放的标签可结合至氧化石墨烯，所述氧化石墨烯可以在溶液中或附接至固体支持物(例如盖玻片、载玻片或颗粒)，并且随后来自释放的标签的信号受到抑制或淬灭。

在一个实施方案中，选择性背景降低剂特异性结合至在释放的标签中所含有的核苷酸序列。在一个实施方案中，当背景降低剂的淬灭剂与标签接近时，此种选择性背景降低剂结合至释放的标签，从而导致标签淬灭。例如，这在不移除盖玻片的情况下进行裂解(诸如本文所述的UV光裂解实施方案)时是有用的。

因此，在一个实施方案中，核酸选择性背景降低剂是包含以下的分子或复合物：(i)与在包含标签的探针片段中所含有的核苷酸序列互补的核苷酸序列，所述标签在通过裂解剂裂解后从探针释放；(ii)能够淬灭标签的信号的淬灭剂；以及任选地(iii)裂解位点，由此背景降低剂本身被活化或可用于与探针片段相互作用(例如，在笼锁背景降低剂的情况下)或从固体支持物释放(例如，在从盖玻片、显微镜载玻片、珠等上释放的情况下)。

在一些实施方案中，背景降低剂连接至固体支持物，诸如样品罩(例如，盖玻片、载玻片、毛细管)或附件(例如，珠、颗粒)。当使用固体支持物时，背景降低剂可以保持与支持物缔合，并且因此将释放的标签吸引到支持物上。可替代地，背景降低剂可以通过裂解剂从支持物中释放，所述裂解剂可与用于释放其配偶体释放的标签的裂解剂相同，或者可以是不同的裂解剂。图10示出了背景降低剂，其最初附接于支持物，并且随后从支持物裂解并结合至释放的标签(例如，图10，a)；并且背景降低剂在与释放的标签结合时仍附接于支持物(例如，图10，b)。

背景降低剂可以具有多种结构。在一个实施方案中，背景降低剂包含环化核酸。环化核酸可包含裂解位点，由此裂解使得背景降低剂可用于与其配偶体释放的标签相互作用(例如，图10，c)。在一个实施方案中，背景降低剂包含核酸发夹结构(例如，图10，d)。在一些实施方案中，背景降低剂包含含有一个或多个裂解位点的核酸发夹结构，由此裂解使得背景降低剂可用于与其配偶体释放的标签相互作用(例如，图10，e、f、g)。

在一个实施方案中，背景降低剂包含裂解位点，由此裂解使得所述背景降低剂活化或可用于与其配偶体释放的标签相互作用。在本文下文中描述裂解位点和裂解剂；多个此类裂解位点和裂解剂中的任一个都适用于背景降低剂中。在一些实施方案中，背景降低剂包含阻断与配偶体释放的标签的相互作用的笼锁分子，直到使用裂解剂来使阻断剂解笼锁(uncage)，从而使得所述背景降低剂与其配偶体释放的标签相互作用(例如，图10，h)。

背景降低剂与其配偶体释放的标签之间的相互作用可以是非共价的或共价的。示例性非共价相互作用包括互补或部分互补的核酸之间的结合。示例性共价相互作用包括互补或部分互补的核酸之间的交联(例如，图10，i；3-氰基乙烯基咔唑核苷光交联剂(CNVK))。因此，背景降低剂可能够与释放的标签交联。当对释放的标签使用亲和力相对较低的结合位点，诸如在所采用的测定条件下瞬时结合的核酸序列时，这可以是有用的。

本文所述的任何裂解剂都可以用作背景降低剂。在特定实施方案中，背景降低剂可以被光裂解剂活化。如以下实施例7中所述，当在荧光显微镜方法中使用光裂解剂时，样品可以使用成像系统用光裂解波长(例如，385nm)的光处理，而无需从用于获取第一轮(或后续)图像的载物台中移除。可替代地，样品可以从成像系统中移出；在外部用光裂解剂处理；并且然后返回到成像系统(或其他检测模式)进行下一轮检测。如本公开中其他地方所描述的，可以使用熟知的方法来比对来自不同轮次的图像。

含有背景降低剂的组合物可以任何形式提供，诸如干燥形式、在相容液体中溶解的形式、在胶体混合物中的形式以及与其他组分一起使用(例如为了方便特定工作流)的形式。这样，背景降低剂可以是背景降低封固剂的组分。

背景降低封固剂是设置于组织与盖玻片之间的流体，其包含对一个或多个标签具有选择性的一个或多个淬灭剂。流体可含有以下一个或多个或其组合：盐、缓冲液、硬化剂、防褪色剂和染色试剂(例如，核复染剂)。市售的可用作添加背景降低剂的基料的封固试剂的实例包括Prolong Gold Anti-Fade Mountant(ThermoFisher)；和Vectashield(VectaLaboratories)。可用作增加亲和力的基料和/或淬灭材料的常见试剂的实例包括用于生物样品的各种缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)和基于三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)的缓冲液。

本公开提供了用于多重检测多个靶标分子的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括一个或多个如本文所述的探针组以及一个或多个其他组分。每个探针组包含一个或多个第一探针和一个或多个第二探针。任选地，可以包含一个或多个第三探针；第四探针、第五探针；第六个探针，或更多探针。一个或多个其他试剂盒组分可包括一个或多个使用说明；一个或多个背景降低剂；一种或多种裂解剂；一个或多个靶标特异性结合配偶体；一种或多种缓冲液；一种或多种用于增加靶标特异性结合配偶体的核酸条形码数量的试剂；核复染剂；背景降低剂封固剂；载玻片；板；对照样品；软件；以及其他组分。

本公开提供了用于检测多个靶标分子的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：(a)使样品与两个或更多个靶标特异性结合配偶体接触，其中每个靶标特异性结合配偶体包含核酸条形码；并且对不同的靶标分子具有特异性；(b)使样品与一个或多个探针组接触，其中探针组中的每个探针对不同的靶标特异性结合配偶体具有特异性，并且其中每个探针组包含第一探针，所述第一探针包含与相应靶标特异性结合配偶体的核酸条形码互补的核酸序列；第一标签；和用于第一裂解剂的裂解位点，其中所述第一裂解剂能够释放所述第一标签，以及第二探针，所述第二探针包含与相应靶标特异性结合配偶体的核酸条形码互补的核酸序列；第二标签；淬灭部分，其中所述淬灭部分使第二标签不可检测；和用于第一裂解剂的裂解位点，其中所述第一裂解剂能够释放所述淬灭部分，由此使得所述第二标签可检测；任选地包含用于第二裂解剂的裂解位点，其中第二裂解剂能够释放第二标签；(c)检测与每个探针组的第一探针的标签相对应的信号；(d)使样品与第一裂解剂接触，从而释放每个探针组中的第一探针的标签；并释放每个探针组中第二探针的淬灭部分，由此活化与每个探针组中的第二探针的第二标签相对应的信号；以及(e)检测与每个探针组的第二探针的标签相对应的信号。

在一些实施方案中，探针组中的一个或多个还包含第三探针，并且本文所述的方法包括在步骤(b)中使样品与第三探针接触，所述第三探针含有与相应靶标特异性结合配偶体的核酸条形码互补的核酸序列；第三标签；和淬灭部分，其中淬灭部分使第三标签不可检测；以及用于第二裂解剂的裂解位点，其中第二裂解剂能够释放淬灭部分，由此使第三标签可检测；并且任选地包含用于能够释放一个或多个探针组的第三标签的不同裂解剂的不同裂解位点；并且所述方法还包括在步骤(e)之后使样品与第二裂解剂接触，从而释放在一个或多个探针组中每一个中第二探针的标签；并释放一个或多个探针组中的第三探针的淬灭部分，从而活化与一个或多个第三探针的标签相对应的信号；以及检测与所述一个或多个第三探针的标签相对应的信号。

在一个实施方案中，本文描述的方法包括使用含有后续探针的探针组中的一个或多个。所述方法包括(i)在步骤(b)中，使样品与一个或多个探针组中所含有的后续探针接触，其中所述后续探针包含：与相应靶标特异性结合配偶体的核酸条形码互补的核酸序列；后续标签；和淬灭部分，其中淬灭部分使得后续标签不可检测；以及用于后续裂解剂的裂解位点，其中后续裂解剂能够释放淬灭部分，由此使得后续标签可检测；并且任选地包含不同裂解位点，其中不同裂解剂能够从样品中的探针释放活化标签；(j)使样品与后续裂解剂接触，从而释放每个探针组中探针的活化标签；并释放每个探针组中后续探针的淬灭部分，从而活化与每个探针组中后续探针的标签相对应的信号；以及(k)检测与每个探针组的后续探针的标签相对应的信号；以及(l)任选地重复步骤(i)至(k)。

所述方法还包括在步骤(b)中使样品与两个或更多个探针组接触，在此每个探针组还包含后续探针，所述后续探针包含：与相应靶标特异性结合配偶体的核酸条形码互补的核酸序列；后续标签；和淬灭部分，其中所述淬灭部分使得后续标签不可检测；以及裂解位点，其中后续裂解剂能够释放淬灭部分，由此使得后续标签可检测；并且任选地包含不同裂解位点，其中不同裂解剂能够从样品中的探针释放活化标签；(j)在步骤(h)之后使样品与后续裂解剂接触，从而释放每个探针组中的探针的活化标签；并释放每个探针组中的后续标签的淬灭部分，从而活化与每个探针组中的后续探针的标签相对应的信号；以及(k)检测与每个探针组的后续探针的标签相对应的信号；以及(l)任选地重复步骤(i)至(k)。

在各种实施方案中，第一可检测标签和第二可检测标签可以是相同的；第一可检测标签、第二可检测标签和第三可检测标签可以是相同的；并且第一可检测标签、第二可检测标签、第三可检测标签和后续可检测标签可以是相同的。因为探针组中的第一可检测标签、第二可检测标签、第三可检测标签和后续可检测标签在第一轮检测、第二轮检测、第三轮检测和后续几轮检测中被检测，标签无需不同(但可以不同)。然而，当在第一轮检测、第二轮检测、第三轮检测和后续一轮检测中检测时，一个探针组的第一可检测标签、第二可检测标签、第三可检测标签和后续可检测标签与不同探针组的那些标签不同。

当在荧光检测模式下使用多个探针组时，使用同一检测通道检测所有第一探针会很方便。例如，当所有标签都是FITC样时，可以在单个检测通道中进行检测。如下文更详细描述的那样，不必所有探针都含有其相同的可检测标签，以便在同一检测通道中对其进行检测，因为在同一检测通道中可检测到多种荧光染料。可以使用在一轮检测中的超过一个检测通道中的检测以及超过一个检测模式。

在各种实施方案中，所述方法还包括增加TSBP中所含有的核酸条形码的数量，其中相应探针的多个拷贝结合至所述核酸条形码的多个拷贝。可以使用诸如PCR、滚环扩增、引物交换反应(PER)、HCR、分支扩增或两种或更多种方法的组合的方法来增加条形码的数量。所述方法可以在将靶标特异性结合配偶体添加至样品之前或在使靶标特异性结合配偶体与样品接触之后执行。

在一些实施方案中，靶标可以是多肽或核酸。因此，靶标特异性结合配偶体可以含有识别多肽、核酸或其他靶标的靶标结合功能。

在一些实施方案中，裂解位点可以是化学裂解位点；机械裂解位点；电磁裂解位点，诸如光裂解位点；或酶裂解点。

在一些实施方案中，所述标签是荧光标签。如下文所述，可以使用常规方法同时选择多个荧光标签。

在所述方法的各种实施方案中，可以在与裂解剂接触后洗涤样品。当释放的标签保留足够的信号以产生不需要的背景信号时，这很有用。

在一些实施方案中，在与裂解剂接触后不洗涤样品。在对被盖玻片覆盖的组织样品执行所述方法时，当希望不移除盖玻片时，这是有用的。

在一些实施方案中，第一探针的释放的标签包含核苷酸序列。在此类实施方案中，方法还可包括使样品与背景降低剂接触，所述背景降低剂包含与释放的第一探针的释放的标签的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中背景降低剂与释放的第一探针的释放的标签的结合淬灭了释放的第一标签的信号。

类似地，在一些实施方案中，第二探针的释放的标签包含核苷酸序列。在此类实施方案中，方法还可包括使样品与背景降低剂接触，所述背景降低剂包含与第二探针的释放的标签的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中背景降低剂与释放的第二探针的标签的结合淬灭了释放的第二标签的信号。

同样，在一些实施方案中，释放的探针的活化标签包含核苷酸序列。在此类实施方案中，方法还可包括使样品与背景降低剂接触，所述背景降低剂包含与探针的释放的标签的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中背景降低剂与释放的探针的释放的标签的结合淬灭了所述标签的信号。

本文所述的方法和组合物可用于检测多种类型的靶标。靶标的示例性类型包括大分子，诸如蛋白质、碳水化合物、脂质和核酸(例如DNA、RNA、短干扰核酸(siNA)和短干扰RNA(siRNA))；和小分子，诸如初级代谢产物、次级代谢产物和天然产物。靶标可以是天然存在的，因为它存在于没有人为干预而存在于自然界中的生物体或病毒中，或者可以是合成的。所述方法和组合物可用于检测存在靶标特异性结合配偶体的任何靶标。

因此，在一些实施方案中，靶标是蛋白质。蛋白质靶标的实例包括细胞质、核、膜和非细胞蛋白质，诸如结构蛋白(例如肌动蛋白、波形蛋白、肌营养不良蛋白、角蛋白)；细胞外基质蛋白(例如弹性蛋白、纤连蛋白)；细胞受体(例如表皮生长因子受体、神经生长因子受体、雌激素受体)；离子通道(例如GABA受体、烟碱乙酰胆碱受体)；激素(例如胰岛素、催产素、雄激素)；DNA结合蛋白(例如P53、组蛋白)；免疫系统蛋白(例如CD3、CD4、CD8、CD20、CH11c、CD25、CD45RO、CD68、CD163、颗粒酶B、FoxP3、LAG3、MCHII、PD1和PDL-1)；以及任何其他任何感兴趣的蛋白质。

在一些实施方案中，靶标是核酸分子。核酸分子靶标的实例包括DNA和RNA。以下实施例5描述了检测miRNA靶标的实施方案。

如本文所用，“靶标特异性结合配偶体”意指(1)选择性地结合靶标和(2)选择性地结合探针的分子(或分子复合物)。这样，靶标特异性结合配偶体形成包含靶标和探针二者的分子复合物。靶标特异性结合配偶体对靶标具有亲和力，使得它基本上不在此种非特异性结合会干扰所需的实验结果的程度(例如通过产生不需要的背景信号)与样品中的其他分子结合。

靶标结合功能和探针结合功能可以包含在一个分子或两个或更多个非共价结合分子内。例如，以下实施例1描述了靶标特异性结合配偶体，其含有提供靶标结合功能的抗体部分和提供探针结合功能的核酸条形码部分。包含抗体部分和核酸部分的多种靶标特异性结合配偶体描述于例如美国专利号9,944,972中。

可以例如通过抗体、抗体片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)2、单重链、双抗体等)、适体、多肽、肽(例如配体)、核酸或小分子(例如，感兴趣的酶的自杀底物)来赋予靶标特异性结合配偶体的靶标结合功能。通常将基于靶标的特征来选择靶标结合功能。例如，当靶标是蛋白质时，抗体通常可以提供所需的选择性靶标结合功能。

类似地，靶标特异性结合配偶体的探针结合功能将与所用的探针匹配。例如，当探针含有核酸序列时，互补核酸序列可以提供所需的探针结合功能。然而，探针结合功能可以由多种配偶体赋予，所述配偶体包括抗体、抗体片段(例如，Fab、Fab’、F(ab’)2、单重链、双抗体等)、适体、多肽、肽(例如，配体)、核酸、小分子(例如，感兴趣的酶的自杀底物)等。

靶标特异性结合配偶体的核酸部分(无论是赋予靶标特异性结合功能还是探针特异性结合功能)以及背景降低剂的核酸部分可以含有DNA、RNA、核酸类似物(例如，含有改变的磷酸骨架、改变的戊糖和/或改变的核碱基的核酸，诸如含有2’-O-甲基核糖核酸、2’-氟核糖核酸、肽核酸、吗啉代和锁定核酸、乙二醇核酸和苏糖核酸的核酸)或其组合。核酸部分可以是双链、单链或其组合。

如本文中通常所用，术语“核酸”意指任何长度的核苷酸的聚合形式，诸如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。例如，核酸可以是DNA、RNA或经过逆转录的RNA的DNA产物。核酸的非限制性实例包括基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的一个或多个基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组核酸、分支核酸、质粒、载体、具有任何序列的分离的DNA、具有任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。核酸的其他实例包括但不限于cDNA、适体和肽核酸(“PNA”)。核酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物(嘌呤和嘧啶的“类似”形式是本领域中熟知的)。如果存在的话，可以在组装聚合物之前或之后对核苷酸结构赋予修饰。根据应用，核酸可以是单链、双链、部分单链或部分双链的DNA或RNA。

如本文所用，术语“核酸条形码”意指包含在靶标特异性结合配偶体内的单链核酸片段，所述核酸片段选择性地结合至其同源探针内的互补序列。条形码中核苷酸的数量将足以允许在选择的反应条件下与探针特异性互补结合。本领域技术人员可以设计或凭经验确定适用于在选择的温度、盐浓度和其他反应条件下使用的条形码和匹配的互补序列。用于设计核酸分子的软件资源包括例如www.nupack.org；Vienna RNA secondary structureserver(参见，例如Vienna RNA secondary structure server Hofacker,Nucleic AcidsResearch,第31卷,第13期,2003年7月1日,第3429–3431页；Abdulkadir Elmas,GuidoH.Jajamovich,Xiaodong Wang,和Michael S.Samoilov.Nucleic Acid Therapeutics,第23卷第2期2013年4月4日。因此，条形码可以是例如长约5至20个核苷酸、长约8至15个核苷酸以及长约10至14个核苷酸。

每个核酸条形码含有已知序列，从而允许通过其条形码来不同地鉴定在特定测定中使用的每个靶标特异性结合配偶体。图2A示出了通过条形码结合至探针上的互补区域的九个不同的靶标特异性结合配偶体。每个条形码是不同的，从而允许使用九个不同的探针来鉴定每个靶标特异性结合配偶体。示例性条形码和相应互补序列示出于下表1中。

表1

可用于本文所述的方法中的探针可以含有一个或多个核酸条形码，所述核酸条形码当与样品接触时可以存在于探针上，或者当与样品接触时可以通过扩增产生。图3A-3C描绘了与具有多个条形码的靶标特异性结合配偶体结合的探针组。可以使用多种核酸扩增方法来增加靶标特异性结合配偶体中所含有的核酸条形码的数量。示例性方法包括聚合酶链反应(PCR)(参见例如McPherson MJ,SG Moller,RBeynon和C Howe 2000PCR:Basics fromBackground to Bench.Heidelberg:Springer-Verlag)；滚环扩增(RCA)(参见例如Ali MM等人Rolling circle amplification:A versatile tool for chemical biology,materials science and medicine.Chemical Society Reviews.2014；43(10):3324-3341)；引物交换反应(PER)(参见例如WO2017/143006A1；Kishi等人Nat Chem.,10(2):155-164)；基于DNA脚趾的链置换(参见例如Schweller等人PMCID:PMC3517005)；杂交链反应(HCR)(参见例如Dirks等人,2014,PMID:15492210,24712299)；基于DNA发夹的树突聚化反应(参见例如Yin等人,2008,PMID 18202654)；以及任何其他方法。甚至可以组合使用多种类型的扩增。例如，Gusev等人报告了将滚环扩增和基于HRP的信号扩增组合(Gusev,Y等人.Am.J.Pathology,第159,1卷(2001):63-9.doi:10.1016/S0002-9440(10)61674-4)。已例如在US 2018/0164308A1中描述了用于含有DNA条形码的靶标特异性结合配偶体的扩增方法，所述专利以引用的方式并入本文。因此，扩增的核酸条形码可以多种结构形式(包括线性和分支形式)存在，并且可以在靶标特异性结合配偶体内或在与靶标特异性结合配偶体结合的一个或多个分子中，如US 2018/0164308A1中所述。

在一个实施方案中，通过RCA使用环状DNA模板来扩增核酸条形码。模板结合至靶标特异性结合配偶体的核酸序列；添加聚合酶；并创建核酸条形码的串联重复。在一个实施方案中，通过PER扩增核酸条形码，所述PER使用链置换聚合酶等温产生具有使用者规定序列的单链DNA。如Kishi等人Nat Chem.,10(2):155–164所述，PER过程通过设计引物开始。在此，引物将含有核酸条形码序列或其部分。利用催化性DNA发夹介质，然后PER将具有独立的使用者指定序列的新引物添加到现有引物。然后，新延伸的引物可以触发下一步延伸，从而形成可编程的PER级联，以沿着规定路径自主生长新生的DNA链，以产生使用者规定序列。

靶标特异性结合配偶体的核酸条形码可以在与样品接触之前或与样品接触时扩增。当与样品接触地执行扩增时，通常在扩增后施用探针。在一些实施方案中，条形码的数量大于一个；大于两个；大于五个；大于10；大于20；大于50；大于100。

标签的检测

多种检测方式可以应用于所描述的方法。标签可以例如通过光信号、电磁信号(在整个电磁频谱上)、原子/分子质量(例如通过质谱可检测)、有形质量(例如通过原子力显微镜可检测)、电信号(例如电流或电压)、机械信号(例如声音、压力或其他信号)以及其他方法来检测。特定检测方法包括光谱、荧光光谱、拉曼光谱、质谱、离子迁移谱、次级离子质谱(SIMS)、俄歇电子能谱、X射线光电子能谱(XPS)、表面等离子体共振以及无数其他检测方法。因此，选择的检测类型将取决于一个或多个所用的标签。样品的类型和测定形式也将影响检测模式的选择。以下实施例描述了检测模式的使用，包括荧光显微镜(可以直接或重构的方式产生图像)；酶标仪中的荧光光谱仪；以及流式细胞术装置中的荧光光谱仪。能够检测由选择的标签产生的信号的任何装置或仪器都可以用于本文所述的方法中。

标签

假定可以将多种检测方式与本文所述的探针组一起使用，则使用者可以选择适于所选择的检测方式的多种标签。如本文所用，术语“标签”意指生成足以被配置为读取可检测部分的装置或仪器记录到的信号的可检测部分。术语“标签”包括当与探针缔合的酶与底物接触并将底物转化为可检测部分时生成的可检测部分，所述可检测部分生成足以被配置为读取可检测部分的装置或仪器记录的信号。示例性标签包括显色标签、光学标签、荧光标签、化学发光标签、磁性标签、等离子体标签、基于质量的标签、电化学标签以及由辣根过氧化物酶作用的酚类底物(例如酪胺和酪氨酸)。因此，具有多种化学结构的标签可用于所述方法和组合物中。如本文所用，术语“释放的标签”意指含有标签的探针部分，其已被裂解剂裂解。因此，含有标签的部分与其母体分子或复合物部分或完全解离。

在一些实施方案中，释放的标签含有能够与含有互补核苷酸序列的背景降低剂结合的核苷酸序列。

在一个实施方案中，使用荧光标签。荧光标签的一般类别包括有机染料、生物荧光团、量子点和包含碳点的纳米颗粒。特定荧光染料包括荧光素、若丹明、花青染料、ALEXA染料、DYLIGHT染料和ATTO染料。本文的实施例描述了在单轮检测中四种光谱不同的荧光标签的使用。在一轮检测中可以使用超过四个光谱重叠的荧光团。已知使用软件来辅助检测具有重叠信号的荧光团(参见例如US6,750,964)。各种荧光染料和滤波器是可商购获得的，允许使用任何可行数量的荧光标签来执行本文所述的方法。如本文所述，在一个实施方案中，可以使用单个荧光标签、两个荧光标签、三个荧光标签、四个荧光标签、五个荧光标签、六个荧光标签、七个荧光标签、八个荧光标签以及超过八个的荧光标签来执行所述方法。图1A-1D描绘了因为每一轮检测都是独立的而可以采用的使用单个荧光标签的探针组。图2A描绘了三个探针组，其中第一探针组(A)的所有探针均具有相同的标签；第二探针组(B)的所有探针均具有相同的标签；并且第三组探针(C)的所有探针均具有相同的标签。因此，在一个实施方案中，第一可检测标签和第二可检测标签(以及任选地第三可检测标签和/或后续可检测标签)是相同的。在另一个实施方案中，第一可检测标签和第二可检测标签(以及任选地第三可检测标签和/或后续可检测标签)是不同的。

通常，当使用多于一个荧光标签时，在与光谱的不同区域相对应的不同检测通道中检测到信号。下表2示出四个检测通道和代表性主要荧光团。需要时，可以设计探针组以用于在特定检测通道中检测。因此，可以设计探针组的集合以用于在不同检测通道中检测，使得在第一检测通道中检测所有第一探针；在第二检测通道中检测所有第二探针；并且当存在时，在第三检测通道中检测所有第三探针。对于后续探针也是如此。在此实施方案中，探针组内的标签可以是相同的，或者可以是不同的，但是可以在同一检测通道中检测到。然而，探针组不必以这种方式彼此比对。因为所述方法可以采用多种标签，在需要时，每轮检测可以采用不同的检测通道或检测方式。当设计如本文所述的探针时，使用不同的方式可以扩大使用者可用的标签数量。

表2

示例性显色标签包括二氨基联苯胺(DAB)、氯化硝基四氮唑蓝(NBT)、5-溴4-氯-3-吲哚磷酸酯(BCIP)和5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷(X-Gal)。标签可以是通过散射(弹性或非弹性散射)起作用的部分，诸如纳米粒子和表面增强拉曼光谱(SERS)报告分子(例如，4-巯基苯甲酸、2,7-巯基-4-甲基香豆素)。标签也可以是化学发光/电化学发光发射体，诸如钌配合物和荧光素酶。

检测的结果

通过使用本文所述的探针组检测标签所产生的数据输出可用于确定样品中靶标分子的存在、不存在和/或位置。特定数据输出将取决于检测方法。例如，当如以下实施例中所述使用荧光显微镜方法时，用于比对荧光显微镜图像的软件是熟知的，并且可购自商业和公共资源(例如，HALO软件(Indica Labs)、ZEN软件(Zeiss)、ImageJ:(imagej.nih.gov/ij/download.html))。

本文所述的方法包括检测“样品”中的靶标。如本文所用，术语“样品”意指包含或疑似包含靶标的任何天然或人造生物流体、细胞、组织或其小部分或其他材料。样品可以源自原核生物或真核生物，并且因此可以包括来自例如动物、植物或真菌的细胞。因此，样品包括从一个或多个个体获得的试样，或者可以从此种试样中获得。

例如，样品可以是通过活检获得的组织切片或者是置于或适于组织培养的细胞。示例性样品包括生物试样，诸如脸颊拭子、羊水、皮肤活检物、器官活检物、肿瘤活检物、血液、尿液、唾液、精液、痰、脑脊髓液、眼泪、粘液等。需要时，可以将样品进一步分级成含有特定细胞类型的小部分。例如，可以将血液样品分级成血清或含有特定类型血细胞的小部分。需要时，样品可以是来自个体的样品的组合，诸如组织和流体的组合。样品可以是或可以含有包含或疑似包含靶标的实验室制剂。

当在本文所述的方法中使用时，测定组分(诸如样品、靶标特异性结合配偶体、背景降低剂或其他元素)可以附接至表面。示例性表面包括载玻片、板、珠、管和毛细管。实施例1和6-8描述了使用附接至载玻片的组织样品的实施例。实施例2描述了附接至测定板的靶标特异性结合配偶体的示例性使用。实施例3描述了附接至珠的靶标特异性结合配偶体的示例性使用。

在分析前，可以处理样品以保留靶标的完整性。此类方法包括使用适当的缓冲剂和/或抑制剂，包括核酸酶、蛋白酶和磷酸酶抑制剂，从而保存样品中的分子或使其变化最小化。用于保存组织样品的方法是熟知的，并且包括固定剂。所选择的特定保存方法将取决于组织或细胞样品以及选择的靶标特异性结合配偶体的分子属性。

如本文所用，关于本文所述的探针的术语“裂解位点”意指探针内易于受其相应裂解剂的作用影响的结构。使裂解剂与其相应裂解位点接触后，一个或多个键被裂解。如本文所用，“裂解”化学键涵盖以下一种或多种：破坏、异构化和/修饰共价键或非共价键。因此，在某些情况下，裂解位点的裂解导致产生探针的含有标签的部分(“释放的标签”)。在其他情况下，裂解可能导致键修饰或异构化，这改变标签特征，从而基本上不再检测到所述标签(其被“抑制”)。因此，裂解位点的分子特征取决于其相应裂解剂。裂解位点可以选自例如化学裂解位点、机械裂解位点、电磁裂解位点、酶裂解点。

因此，多种裂解剂可用于本文所述的方法和组合物中。裂解剂可以是化学剂、酶剂、电磁剂(例如UV光、可见光、红外光、近红外光、X射线、微波、无线电波、伽马射线)、机械力(包括声力(acoustic force))或例如通过破坏、异构化和/或化学修饰键而抑制或释放探针片段的任何其他剂。标签裂解(导致释放或抑制)的目的是将信号降低到不干扰后续标签的检测的水平或者另外使用者可接受的水平。例如，当使用荧光标签时，荧光团的裂解键可破坏其荧光或改变基本上检测到其荧光的波长。

可以裂解的示例性化学键是二硫键(被还原剂诸如二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦裂解)、酯(被羟胺裂解)、邻二醇(被偏高碘酸钠裂解)、砜(在碱性条件下裂解)、光可裂解键(被光裂解)以及可以使用酶诸如蛋白酶、水解酶、核酸酶、尿嘧啶DNA糖基化酶和DNA糖基化酶-裂解酶核酸内切酶VIII(例如USER(尿嘧啶特异性切除试剂)(New England Biolabs)来裂解的键。用作特定酶的底物的非天然核苷酸、氨基酸或其他化合物可用于裂解位点。例如，8-氧桥鸟嘌呤可以被DNA糖基化酶OGG1裂解。例如，1’,2’-脱氧核糖、无碱基间隔基(dSpacer)、无嘌呤/无嘧啶、四氢呋喃或无碱基呋喃可以被核酸内切酶VIII裂解位点裂解。

在一个实施方案中，电磁裂解位点是光裂解位点，其被存在特定光谱范围的光裂解。多种光可裂解部分可用于本文所述的探针中。多种化学键易受光裂解影响(参见例如Olejnik等人,Nucleic Acids Res.1999Dec 1；27(23):4626-31；和Leriche等人Bioorganic&Medicinal Chemistry，第20(2)卷，第571-582页(2012).)。熟知的光可裂解部分包括邻硝基苄基(ONB)酯、α-硫代苯乙酮部分和7-氨基香豆素部分。参见例如CRCHandbook of Organic Photochemistry and Photobiology,第2版,第69章。可以掺入寡核苷酸中的示例性光可裂解部分可通过Biosynthesis,Inc.,Lewisville,TX；IntegratedDNA Technologies,Coralville,IA和其他公司商购获得。

多种酶可裂解部分可用于本文所述的探针中。多种酶可以破坏核酸分子内的共价键。例如，糖基化酶可以从核苷酸的糖部分移除碱基；核酸内切酶、核酸外切酶、DNA酶和脱氧核糖核酸酶可以裂解核酸分子的磷酸二酯键，并且可以使酶工程化以用于裂解在本文所述的探针内的裂解位点。

能够特异性移除参与核苷酸碱基配对的碱基的糖基化酶可以降低两条链之间的相互作用强度。例如，脱氧尿苷(dU)可以在裂解位点取代脱氧胸苷(dT)；dU将与dA配对并且此对将被尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG，可商购获得自New England Biolabs，目录号M0280S)裂解。此反应将在裂解位点产生一个或多个无碱基位点。此类无碱基位点可进一步被核酸内切酶VIII或另一方法裂解。这促进了残余结合对解离。因此，UDG或UDG与核酸内切酶VIII的组合可用于执行本文所述的方法。这些酶的混合物可商购获得自(例如New EnglandBiolabs，商标USER，目录号M5505S)。

可用于所述探针中的UDG裂解位点将含有多个dU核苷酸，其范围为1至5dU、1至10dU、1至15dU以及1至20dU。当使用UDG和核酸内切酶VIII时，dU的放置方式可以使得在移除dU后，残余物变短(例如，小于或等于约9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸)，使得它们自发且相对快速地解离。当使用UDG(即，没有核酸内切酶VIII)时，移除dU单元可能使链不稳定，从而足以使标签与淬灭部分分离。

可用于本文所述的方法中的具有位点特异性活性的核酸内切酶包括限制性核酸内切酶、锌指核酸酶、转录活化因子样效应子核酸酶(TALEN)和脱氧核酶。

RNA指导的核酸内切酶可用于本文所述的方法中。例如，Cas9(CRISPR相关蛋白9)是RNA指导的核酸内切酶，可以特异性裂解工程化裂解位点。一条链可以例如使用切口核酸内切酶来裂解。例如，Cas9切口酶是Cas9酶，其已被工程化成仅包含一个活性裂解位点，从而产生单链切口，同时保留了Cas9的高特异性。

多种蛋白质裂解化学方法可用于本文所述的方法中，包括蛋白质修饰化学方法。一些方法修饰天然氨基酸，而其他方面需要在修饰之前对氨基酸序列进行遗传操纵。实例包括：Yu,Y.等人Chemoselective peptide modification via photocatalytictryptophanβ-position conjugation.J.Am.Chem.Soc.140,6797–6800(2018)；Willwacher,J.,Raj,R.,Mohammed,S.和Davis,B.G.Selective metal-site-guidedarylation of proteins.J.Am.Chem.Soc.138,8678–8681(2016)；Krall,N.,da Cruz,F.P.,Boutureira,O.和Bernardes,G.J.L.Site-selective protein-modificationchemistry for basic biology and drug development.Nat.Chem.8,103–113(2016)。

在一个实施方案中，合适的裂解剂能够破坏探针内的共价键，以释放片段(其中所述片段可以含有例如标签、淬灭部分或其他不需要的片段)。裂解剂和裂解方式的实例如上文所述在图4A-4D中示出。可以使用不同类型的裂解剂和不同类型的裂解位点的一种或多种组合。例如，在一个探针组中，一个或多个探针含有用于释放标签的裂解位点(图4B)；并且一个或多个探针含有用于去淬灭标签的裂解位点(图4D)。一个或多个探针可以同时含有用于释放标签的裂解位点和用于去淬灭标签的裂解位点。在一个实施方案中，裂解剂能够释放一个(或多个)标签并去淬灭不同的一个(或多个)标签。需要时，可以在使用单一裂解剂的任何步骤中使用裂解剂的组合。

根据本文所述的方法的特定步骤中所用的探针和裂解剂的性质，所述方法可包括在使样品与裂解剂接触后洗涤样品。此步骤可用于从释放的标签中移除不需要的信号；可用于移除在先前步骤中使用的裂解剂。在一个实施方案中，不需要洗涤。例如，当释放的标签的信号不干扰使用者的实验目的时(诸如当通过裂解剂处理后抑制标签时)则不需要清洗；或释放的标签扩散的方式或其他方面不会产生明显的背景。因此，在某些实方案中，当对盖玻片或其他外壳下面的样品执行所述方法时，在执行所述方法的一个或多个步骤时，不必移除或以其他方式干扰外壳。如下文所述，当在不直接接近样品的情况下，例如在不移除盖玻片的情况下执行方法时，可以采用背景降低剂。

如本文所用，术语“淬灭部分”意指探针的任何物理或化学特征，其起作用来淬灭探针的一个或多个标签。当与不存在淬灭基团的信号相比信号得到降低时，由标签产生的信号被淬灭了至少10％，例如至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％以及完全淬灭。使标签不可检测的信号水平取决于方法。因此，术语“不可检测的”意指使用者对于所采用的方法可接受的信号水平。例如，不可检测的信号会产生允许检测所需信号而不会产生干扰的信背比。

当标签是荧光团时，淬灭部分在附接至荧光团或邻近荧光团时减少了来自荧光团的发射。任何多个荧光淬灭部分可用于本文所述的方法中。示例性淬灭部分包括但不限于Dabacyl、Cy50、Iowa Black、OXL570、BHQ-I、BHQ-2、BHQ-3和基于Si-rhodamine的淬灭剂。标签-淬灭剂对是已熟知的。示例性荧光团和光谱相容性淬灭剂包括香豆素和Dabacyl、ALEXAFluor 488和BHQ-1、Cy3和Iowa Black RQ、TAMRA和OXL570以及IRDye 680和BHQ-3。

淬灭部分相对于标签的位置将取决于所选择组分的特定物理和化学特征。对于核酸探针，淬灭部分可以附接在例如探针的核苷酸末端上、在内部、在分支核苷酸片段上或其他位置上，只要淬灭部分与标签足够接近。例如，淬灭部分可以附接在探针的3’核苷酸的磷酸部分上。

探针可以含有使标签和淬灭剂保持紧密接近以实现淬灭的三级结构。在用裂解剂处理后，此种探针将经历构象变化，从而将标签和淬灭部分分开以使标签去淬灭。例如，可以通过用尿嘧啶-DNA糖基化酶处理来使核酸发夹不稳定，从而增加荧光团和淬灭部分之间的距离，从而使来自荧光团的信号去淬灭。对于多肽探针，可以将多种三级结构工程化成多肽，以获得在标签与淬灭部分之间的所需距离(参见例如Chen等人,Can.J.Chem.93:389–398(2015))。

图2A示出三个示例性探针组，其中所有第二探针(B)均含有相同的淬灭部分；并且所有第三探针(C)均含有相同的淬灭部分。这代表了以下概念：标签与淬灭部分配对，所述淬灭部分有效地起作用来使标签不可检测。

可以使用标准分子生物学和化学方法制备本文所述的探针和靶标特异性结合配偶体，以设计含有两个功能位点的分子或将两个或更多个分子连接在一起以获得所需功能。在Wang等人.Nano Lett.,17,6131-6139(2017)中描述了一种用于制备靶标特异性结合配偶体的方法，所述配偶体是具有共价附接的核酸链的抗体。所述程序包括将硫醇修饰的DNA寡核苷酸与抗体上的赖氨酸残基交联，如Agasti等人,Chem Sci,8,4,3080-3091(2017)。简言之，将250uM 5’硫醇修饰的DNA寡核苷酸(整合DNA技术)通过100mM DTT活化2小时，并然后使用NAP5柱(GE Healthcare Life Sciences,17-0853-02)纯化，以移除过量的DTT。使用100KDa Amicon Ultra Filters(EMD Millipore,UFC510096)将以PBS配制的抗体浓缩至2mg/ml并使其与马来酰亚胺-PEG2-琥珀酰亚胺酯交联剂(Sigma 746223)反应2小时。然后使用0.5ml 7kDA Zeba脱盐柱(LifeTechnologies,89883)纯化抗体，以移除过量的交联剂。将活化的DNA寡核苷酸与抗体(11:1DN A:抗体比率)一起在4℃下孵育过夜。将最终缀合的抗体用Amicon Ultra过滤器用PBS/BSA(100ug/ml)洗涤四次，以移除未反应的DNA寡核苷酸。替代性方法是采用ThermoFisher(S10467)的SiteClick试剂盒。

技术人员将理解，上文描述的附图和下文描述的实施例仅用于说明目的。附图或实施例均不意图以任何方式限制所公开的教导的范围。

实施例

提供以下实施例以说明某些公开的实施方案，并且不应被解释为以任何方式限制本公开的范围。

实施例1

此实施例显示出使用基于三(2-羧基乙基)膦(TCEP)的裂解模式在单个福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)扁桃体载玻片上对八个不同靶标进行的检测。

首先将人类扁桃体组织载玻片(Amsbio LLC,Cambridge,MA)在60℃下烘烤30分钟，并且然后在GEMINI自动化载玻片染色机(ThermoFisher)中脱蜡。然后将载玻片在PBS中洗涤三次，之后用Ultivue抗体稀释溶液(UltiMapper^TMI/O试剂盒,Ultivue,Cambridge,MA)在室温下封闭15min。将与不同DNA条形码缀合的八个不同抗体(对CD45RO、PD1、CD3、细胞角蛋白、CD8、CD68、PD-L1和Ki67具有选择性)一起添加到组织载玻片，并在室温下孵育1h(关于示例性核酸条形码，参见表1)。然后将载玻片在PBS中洗涤三次，接着将其与Ultivue预扩增混合物(UltiMapper^TMI/O试剂盒)一起在室温下孵育25min。然后将载玻片在PBS中洗涤三次；将Ultivue扩增溶液(UltiMapper^TMI/O试剂盒)添加到载玻片，并在30℃下在杂交炉(SLIDE MOAT,Boekel,Feasterville,PA)中孵育90min。然后将载玻片在PBS中洗涤三次，接着将其与Ultivue核复染剂(UltiMapper^TMI/O试剂盒)在黑暗环境中在室温下孵育15min。然后将载玻片在PBS中洗涤三次。将在Ultivue探针缓冲液(UltiMapper^TMI/O试剂盒)中稀释的含有所有八个荧光探针(如图1A-1B所示的探针组设计)的混合物添加到载玻片并将其在黑暗环境中在室温下孵育25min。然后将载玻片在PBS中洗涤三次，固定在PBS中并盖上盖玻片。

然后在PerkinElmer Polaris显微镜上以20x放大倍数采集第1轮的整个组织荧光图像。在采集第1轮图像之后，将载玻片去盖玻片，并在室温下与约10摩尔当量的TCEP一起孵育15分钟。将载玻片在PBS中洗涤三次，固定在PBS中并盖上盖玻片。然后以20x放大倍数采集第2轮的整个组织荧光图像。

图6A-6B示出的结果表明，在两轮检测中使用基于TCEP的裂解模式在单个FFPE扁桃体载玻片上检测到八个独特的蛋白质靶标(图6A和6B；每轮四个靶标)，而在各轮检测之间未添加探针。CD45RO、PD1、CD3和细胞角蛋白的探针在条形码识别结构域与对应荧光染料之间具有二硫键裂解位点。CD8、CD68、PDL1和Ki67的探针在对应荧光染料与淬灭部分之间具有二硫键裂解位点(参见，例如示意图4B)。

选择荧光染料以在以下四个不同的检测通道中检测：FITC、TRITC、Cy5和Cy7(参见表2)。在第1轮检测中观察到CD45RO、PD1、CD3和细胞角蛋白靶标的特异性信号(图6A)。在第1轮检测中未观察到CD8、CD68、PDL1和Ki67靶标的可检测信号(图6A)，因为荧光信号最初被淬灭部分抑制。TCEP后处理有利于同时释放荧光染料并去淬灭特异性信号，在第2轮检测中观察到CD8、CD68、PDL1和Ki67靶标的特异性信号(图6B)。在第2轮检测中未观察到CD45RO、PD1、CD3和细胞角蛋白靶标的可检测信号。

因此，本文所述的探针组可用于在两轮检测中检测八个靶标。

实施例2

此实施例描述了使用基于TCEP的裂解模式在基于板的测定中对八个独特靶标进行的检测。

在环境温度下，用人IFNα、IL-6、TNFα、IFNγ、IFNβ、IFNλ、IL-1a和IL-4的捕获抗体的混合物(Abcam)以10mM磷酸盐缓冲盐水pH 7.2(PBS)中的5μg/ml总抗体浓度涂覆NuncMaxiSorp(ThermoFisher)微板孔2h。抽吸所述孔并用含有2％牛血清白蛋白的PBS封闭，在环境温度下过夜。抽吸所述孔并在37℃下添加样品和标准品2h。用含有0.05％Tween-20的PBS(PBST)洗涤孔。在环境温度下将八个靶标特异性结合配偶体的混合物添加到每个孔中1小时，所述混合物是与独特DNA条形码缀合的人IFNα、IL-6、TNFα、IFNγ、IFNβ、IFNλ、IL-1a和IL-4的抗体(关于示例性核酸条形码，参见表1)。将孔用PBST洗涤，接着将其与Ultivue预扩增混合物(UltiMapper^TMI/O试剂盒)一起在环境温度下孵育25min。将孔用PBST洗涤，并且如WO2018/107054中所述扩增DNA条形码，所述专利以引用的方式并入本文。将孔用PBST洗涤，并且添加在Ultivue探针缓冲液(UltiMapper^TMI/O试剂盒)中稀释的含有所有八个与DNA条形码互补的荧光探针的混合物(人IFNα、IL-6、TNFα、IFNγ作为图1A中的第一探针(A)；IFNβ、IFNλ、IL-1a和IL-4作为与图1B中的第二探针(B)类似但没有第二裂解位点(C₂)的探针)并在黑暗环境中环境温度下孵育25min。将孔用PBST洗涤，并在Synergy H1微板读数器(BioTek)上执行第一轮荧光检测(人IFNα、IL-6、TNFα、IFNγ)。

在荧光检测第一轮信号之后，添加TCEP并在环境温度下孵育15min，移除第一轮信号并暴露第二轮信号。将孔用PBST洗涤，并执行第二轮荧光检测(IFNβ、IFNλ、IL-1a和IL-4)。

采用含有标准浓度的分析物的对照，因为在需要时，可以确定靶标分子的浓度。结果提供了每个样品中靶标的存在或不存在或浓度的8重分析。

实施例3

此实施例描述了使用基于TCEP的裂解模式在基于珠的免疫测定中对八个独特靶标进行的检测。

根据制造商的说明，将每个靶标的捕获抗体固定在Dynabeads(M-270环氧树脂，直径为2.8μm)(ThermoFisher)上。基本上如实施例2中所述，将珠封闭并将其与靶标特异性结合配偶体和探针组一起孵育。在流式细胞仪上执行第一轮信号的荧光检测，接着执行TCEP孵育和第二轮信号的检测。

实施例4

此实施例描述了使用具有尿嘧啶DNA糖基化酶裂解剂的探针对靶标进行的检测。

此实施例显示出如图7A-7B右图所描绘的探针的使用。基本上如实施例1中所描述地制备样品，但仅是对于单个靶标CD3。将样品与CD3的靶标特异性结合配偶体和含有独特核酸条形码、荧光标签和相应淬灭部分的探针一起孵育(图7A-7B，右图)。

使样品成像以检测荧光标签。图7A显示未检测到信号，这表明标签已淬灭。然后用尿嘧啶DNA糖基化酶(New England Biolabs；0.1个单位/ul尿嘧啶DNA糖基化酶，在1x CutSmart缓冲液中，在37℃下在组织样品上孵育15min(参见www.neb.com/products/b7204-cutsmart-buffer#Product％20Information)处理样品并再成像。图7B显示标签被去淬灭，从而活化了来自标签的信号。

实施例5

此实施例描述了使用基于TCEP的裂解模式对三个miRNA靶标进行的检测。

miRNA靶标的靶标特异性结合配偶体包含识别特定miRNA的DNA序列。例如，对miR-146a具有选择性的DNA序列为5′-AACCCATGGAATTCAGTTCTCA-3′(SEQ ID NO:25)；对miR-15a具有选择性的DNA为5′-CACAAACCATTATGTGCTGCTA-3′(SEQ ID NO:26)；并且对MiR-155具有选择性的DNA序列为5′CCCCTATCACGATTAGCATTAA-3′(SEQ ID NO:27)。这些序列被掺入到靶标特异性结合配偶体中，所述配偶体含有每个靶标的独特条形码(参见例如表1)。可以设计相应探针以含有与条形码(表1)互补的序列，以及具有起作用来允许依次检测的功能的标签、淬灭剂和裂解位点组合物(参见例如图1A-1D)。

将石蜡切片在65℃下烘烤1h，并在二甲苯中脱蜡(2x10分钟)，在乙醇溶液(100％、90％、80％、70％)以及在DEPC处理的水和PBS洗涤中再水化。将切片与蛋白酶K(20ug/mL)在37℃下孵育10min，用PBS洗涤并用4％多聚甲醛固定10min。然后将其用PBS、100mM甘氨酸、PBS和2X SSC(由20X稀释，ThermoFisher)洗涤。然后将所述切片在50％去离子甲酰胺、2xSSC、1x Denhardt’s、0.02％SDS、酵母tRNA(0.5mg/mL)以及鲑鱼精子DNA(0.5mg/mL)的溶液中在50℃下预杂交2h。

将探针在3’端制备DNA条形码。使这些探针在50℃下在50％去离子甲酰胺、2xSSC、1x Denhardt’s、10％硫酸葡聚糖、酵母tRNA(0.5mg/mL)和鲑鱼精子DNA的溶液中杂交过夜。将所述切片在37℃下用2X SSC洗涤，在50℃下用2X SCC洗涤，在37℃下用1X SSC洗涤，在50℃下用1X SCC洗涤，在37℃下用1X SSC中的0.02％SDS洗涤，在50℃下用1X SSC洗涤，并且在环境温度下用PBST洗涤。将切片用PBST洗涤，接着将其与Ultivue预扩增混合物在环境温度下孵育25min。将切片用PBST洗涤，并添加Ultivue扩增溶液并将其在30℃下孵育90min。

添加与DNA条形码互补的含有所有荧光探针(一些探针制备为图1A中的第一探针(A)，并且其他探针制备为图1B中的第二探针(B)，但没有第二裂解位点(C₂))的混合物并且将其在环境温度下在黑暗环境中孵育25min。第一轮荧光检测；TCEP孵育；以及第二轮荧光检测基本上如实施例1中所描述地执行。

实施例6

此实施例描述了使用光裂解方法在不移除盖玻片的情况下在单个福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)扁桃体载玻片上对八个独特靶标进行的检测。

首先将人类扁桃体组织载玻片(Amsbio LLC,Cambridge,MA)在60℃下烘烤30min，并且然后在Leica BONDRx自动染色机上处理。使用4步脱蜡方案使用脱蜡溶液(AR9222,Leica Biosystems)使载玻片脱石蜡并且通过在100℃下将表位回收溶液2(AR9640,LeicaBiosystems)孵育20分钟来回收抗原。然后将载玻片用Leica洗涤溶液(AR9590,LeicaBiosystems)洗涤三次，之后用Ultivue抗体稀释溶液(UltiMapper^TMI/O试剂盒,Ultivue,Cambridge,MA)在室温下封闭15min。

将与独特DNA条形码缀合的八种不同抗体(CD8、PD1、PDL1、CD68、CD3、CD4、FoxP3和细胞角蛋白)一起添加到组织载玻片，并在室温下孵育1h。然后将载玻片用Leica洗涤液洗涤三次，接着将其与Ultivue预扩增混合物(UltiMapper^TMI/O试剂盒)一起在室温下孵育25min。然后将载玻片用Leica洗涤液洗涤两次，接着将载玻片与Leica洗涤液一起在35℃下孵育5min。然后将Ultivue扩增溶液(UltiMapper^TMI/O试剂盒)添加至载玻片，并在室温下孵育90min。然后将载玻片用Leica洗涤液洗涤三次，接着将其与Ultivue核复染剂(UltiMapper^TMI/O试剂盒)一起在室温下孵育15min。然后将载玻片用Leica洗涤溶液洗涤三次。

使用两个探针组，每个探针组四个探针。将含有在Ultivue探针缓冲液(UltiMapper^TMI/O试剂盒)中稀释的所有八个荧光探针的混合物(0.5至2μM)添加至载玻片，并在室温下孵育25min。CD8、PD1、PDL1和CD68的探针(图11A中的探针设计A)在其条形码互补区与对应荧光染料之间含有UV裂解位点。在裂解后释放的探针部分含有与存在于封固剂中的背景降低剂互补的区域，所述背景降低剂在成像前施用于样品。CD3、CD4、FoxP3和细胞角蛋白的探针(图11A中的探针设计B)在对应荧光染料与淬灭剂之间含有UV活化的裂解位点。然后将载玻片在Leica洗涤溶液中洗涤三次，固定在含有与每个第一探针(关于背景降低剂设计，参见图11A，这表明所述背景降低剂含有两个裂解位点)相对应的可活化背景降低剂(100-800nM)的封固剂中并盖上UV透明盖玻片。

然后在Zeiss AxioScan Z1显微镜上以20x放大倍数采集第1轮的荧光图像。在采集第1轮图像后，然后使用Colibri7 385nm LED(10x物镜和5s曝光)扫描整个组织，以光裂解第一探针上的裂解位点和相应背景降低剂。然后立即以20x放大倍数采集第2轮的荧光图像。

图11B-11C示出了来自八个独特蛋白质靶标的荧光信号。在第1轮检测中观察到CD8、PD1、PDL1和CD68靶标的特异性信号(图11B)。在第1轮检测中未观察到CD3、CD4、FoxP3和细胞角蛋白靶标的可检测信号(图11C)，因为荧光信号最初被淬灭部分抑制。使用UV光作为裂解剂有助于同时释放探针设计A的荧光染料(图11A)并去淬灭探针设计B(图11A)。在第2轮检测中观察到CD3、CD4、FoxP3和细胞角蛋白靶标的特异性信号(图11C)。在第2轮检测中未观察到CD8、PD1、PDL1和CD68靶标的可检测的特异性信号。此外，在第2轮检测中从释放的荧光染料中未观察到可检测的荧光信号。

实施例7

此实施例显示出在光裂解之后以及在不移除盖玻片的情况下，使用背景降低剂来降低从第A轮探针释放的探针标签的荧光信号。

首先将两个人扁桃体组织载玻片(Amsbio LLC,Cambridge,MA)在60℃下烘烤30min，并且然后在Leica BondRx自动染色机上处理。使用4步脱蜡方案使用脱蜡溶液(AR9222,Leica Biosystems)使载玻片脱石蜡并且通过在100℃下将表位回收溶液2(AR9640,Leica Biosystems)孵育20分钟来回收抗原。然后将载玻片用Leica洗涤溶液(AR9590,Leica Biosystems)洗涤三次，之后用Ultivue抗体稀释溶液(UltiMapper^TMI/O试剂盒,Ultivue,Cambridge,MA)在室温下封闭15min。将与DNA条形码缀合的CD3抗体添加到组织载玻片，并在室温下孵育1h。然后将载玻片用Leica洗涤液洗涤三次，接着将其与Ultivue预扩增混合物(UltiMapper^TMI/O试剂盒)一起在室温下孵育25min。然后将载玻片用Leica洗涤液洗涤两次，接着将载玻片与Leica洗涤液一起在35℃下孵育5min。然后将Ultivue扩增溶液(UltiMapper^TMI/O试剂盒)添加至载玻片，并在室温下孵育90min。然后将载玻片用Leica洗涤液洗涤三次，接着将其与Ultivue核复染剂(UltiMapper^TMI/O试剂盒)一起在室温下孵育15min。然后将载玻片用Leica洗涤溶液洗涤三次。将在Ultivue探针缓冲液(UltiMapper^TMI/O试剂盒)中稀释的荧光探针(如图12A、12C所示的探针设计)添加至载玻片，并在室温下孵育25min。然后将载玻片在Leica洗涤溶液中洗涤三次。然后将一个组织载玻片固定在1x TAE Mg2+缓冲液中，而将另一个载玻片固定在1x TAE Mg2+缓冲液中含有背景降低剂的封固剂中。将两个组织载玻片盖上UV透明盖玻片。

然后在Zeiss AxioScan Z1显微镜上以20x放大倍数采集第1轮的整个组织荧光图像。在采集第1轮图像后，然后使用Colibri7 385nm LED(10x物镜和5s曝光)扫描整个组织，以光裂解第一探针上的裂解位点。然后在光裂解后立即以20x放大倍数采集整个组织的荧光图像。

在光裂解之前，对于两个载玻片都观察到CD3的特异性信号(图12A和12C)。当比较裂解前两个载玻片之间的信号时，对于在光可活化背景降低剂存在下固定的载玻片未观察到可检测的初始淬灭。在不移除盖玻片即进行裂解之后，对于在封固剂中不存在背景降低剂(关于背景降低剂设计，参见图12C)的载玻片(图12B)观察到残余的扩散的荧光信号。在不移除盖玻片即进行裂解之后，对于在封固剂中具有背景降低剂的载玻片(参见图12D)观察到最小至没有可检测的的残余的荧光信号。

实施例8

此实施例描述了使用三个探针组和三个不同的裂解剂在单个福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)扁桃体载玻片上对十六个独特靶标进行的检测。

将与独特DNA条形码缀合的十六种不同抗体(CD8、CD68、PDL1、Ki67、CD45RO、PD1、CD3、细胞角蛋白、CD11c、颗粒酶B、FoxP3、Lag3、CD20、CD163、CD4和MHCII)一起添加至组织载玻片并在室温下孵育1h。然后将载玻片用Leica洗涤液洗涤三次，接着将其与Ultivue预扩增混合物(UltiMapper^TMI/O试剂盒)一起在室温下孵育25min。然后将载玻片用Leica洗涤液洗涤两次，接着将载玻片与Leica洗涤液一起在35℃下孵育5min。然后将Ultivue扩增溶液(UltiMapper^TMI/O试剂盒)添加至载玻片，并在室温下孵育90min。然后将载玻片用Leica洗涤液洗涤三次，接着将其与Ultivue核复染剂(UltiMapper^TMI/O试剂盒)一起在室温下孵育15min。然后将载玻片用Leica洗涤溶液洗涤三次。将含有在Ultivue探针缓冲液(UltiMapper^TMI/O试剂盒)中稀释的所有16个荧光探针的混合物添加至载玻片，并在室温下孵育25min。

CD8、CD68、PDL1和Ki67的探针在探针结合结构域与对应荧光染料之间具有二硫键裂解位点(图13A，探针设计1)。CD45RO、PD1、CD3和细胞角蛋白的探针在探针结合结构域与对应荧光染料之间具有UV裂解位点，并且在荧光染料与相应淬灭剂之间具有二硫键裂解位点(图13A，探针设计2)。

CD11c、颗粒酶B、FoxP3和LAG3的探针在探针结合结构域中具有尿嘧啶碱基，并在荧光染料和相应淬灭剂之间具有UV裂解位点(图13A，探针设计3)。CD20、CD163、CD4和MHCII的探针具有发夹结构，所述发夹结构由荧光染料与相应淬灭剂之间的尿苷-腺嘌呤碱基对组成(图13A，探针设计4)。

然后将载玻片在PBS中洗涤三次，固定在Prolong Gold Antifade Mountant(P36930，Thermo Fisher)中并盖上盖玻片。然后在Zeiss AxioScan Z1显微镜上以20x放大倍数采集第1轮的荧光图像。在采集第1轮图像后，将载玻片去除盖玻片并将其与TCEP一起孵育15分钟。然后将载玻片在PBS中洗涤三次，固定在Prolong Gold Antifade Mountant中，并盖上UV透明盖玻片。然后在Zeiss AxioScan Z1显微镜上以20x放大倍数采集第2轮的荧光图像。在采集第2轮图像之后，然后使用Colibri7 385nm LED(10x物镜和5s曝光)扫描整个组织以影响光裂解。然后将载玻片去除盖玻片并用PBS洗涤三次，固定在Prolong GoldAntifade Mountant中并盖上盖玻片。然后在Zeiss AxioScan Z1显微镜上以20x放大倍数采集第3轮的整个组织荧光图像。在采集第3轮图像后，将载玻片去除盖玻片，并将其与UDG酶一起在37℃下孵育10分钟。然后将载玻片在PBS中洗涤三次，固定在Prolong GoldAntifade Mountant中并盖上盖玻片。然后在Zeiss AxioScan Z1显微镜上以20x放大倍数采集第4轮的荧光图像。

图13B示出了在四轮检测(在各轮检测之间未添加探针)中使用三种不同的裂解方法(TCEP、UV和UDG酶)在单个FFPE扁桃体载玻片上对十六个不同的蛋白质靶标进行的检测。在第1轮检测(图13B，第1轮)中观察到的CD8、CD68、PDL1和Ki67(图13A，探针设计1)靶标的特异性信号，并从具有其他探针设计的其他靶标中未观察到可检测的信号。在TCEP化学处理后在第2轮检测(图13B，第2轮)中观察到CD45RO、PD1、CD3和细胞角蛋白(图13A，探针设计2)靶标的特异性信号，并且从具有其他探针设计的其他靶标中未观察到可检测的信号。在UV光裂解后在第3轮检测(图13B，第3轮)中观察到CD11c、颗粒酶B、FoxP3和LAG3(图13A，探针设计3)靶标的特异性信号，并且从具有其他探针设计的其他靶标中未观察到可检测信号。在UDG酶处理后在第4轮检测(图13B，第4轮)中观察到的CD20、CD163、CD4和MHCII(图13A，探针设计4)靶标的特异性信号，并且从具有其他探针设计的其他靶标中未观察到可检测的信号。

实施例9.另外的实施方案

以下编号项目提供了本文所述的实施方案的另外的支持和描述。

项目1.一种用于检测多个靶标分子的方法，所述方法包括：

第一探针，其包含：

第一标签；和

第二探针，其包含：

第二标签；

淬灭部分，其中所述淬灭部分使得所述第二标签

不可检测；和

(d)使所述样品与第一裂解剂接触，从而

释放在所述一个或多个探针组中每一个中所述第一探针的所述标签；并且

释放在所述一个或多个探针组中每一个中所述第二探针的所述淬灭部分，从而活化与所述第二标签相对应的信号，以及

项目2.如项目1所述的方法，其中所述探针组中的一个或多个还包含第三探针，并且所述方法还包括：

第三标签；和

淬灭部分，其中所述淬灭部分使得所述第三标签

不可检测；和

项目3.如项目2所述的方法，其中所述探针组中的一个或多个还包含后续探针，并且所述方法还包括：

后续标签；和

淬灭部分，其中所述淬灭部分使得所述后续标签

不可检测；和

用于后续裂解剂的裂解位点，其中所述后续裂解剂能够释放所述淬灭部分，由此使得所述后续标签可检测；

并且任选地包含用于能够从所述样品中的探针释放活化标签的不同裂解剂的不同裂解位点；

(l)任选地重复步骤(i)至(k)。

项目4.如项目1-3中任一项所述的方法，其中探针组的所述第一可检测标签和所述第二可检测标签是相同的。

项目5.如项目1-3中任一项所述的方法，其中探针组的所述第一可检测标签和所述第二可检测标签是不同的。

项目6.如项目2-5中任一项所述的方法，其中探针组的所述第一可检测标签、所述第二可检测标签和所述第三可检测标签中的两个或更多个是相同的。

项目7.如项目2-5中任一项所述的方法，其中探针组的所述第一可检测标签、所述第二可检测标签和所述第三可检测标签中的两个或更多个是不同的。

项目8.如项目3-7中任一项所述的方法，其中所述第一标签、所述第二标签、所述第三标签和所述后续标签中的两个或更多个是相同的。

项目9.如项目3-7中任一项所述的方法，其中所述第一标签、所述第二标签、所述第三标签和所述后续标签中的两个或更多个是不同的。

项目10.如项目1-9中任一项所述的方法，其还包括在使所述样品与所述第一裂解剂接触后和/或使所述样品与所述第二裂解剂接触后洗涤所述样品。

项目11.如项目1-9中任一项所述的方法，其中在使所述样品与所述第一裂解剂接触后和/或使所述样品与所述第二裂解剂接触后不洗涤所述样品。

项目12.如项目11所述的方法，其中不移除盖玻片。

项目13.如项目1-12中任一项所述的方法，其还包括增加靶标特异性结合配偶体上的核酸条形码的数量，其中相应探针的多个拷贝与所述核酸条形码的多个拷贝结合。

项目14.如项目13所述的方法，其中使用滚环扩增、引物交换反应、杂交链反应或DNA分支来增加核酸条形码的数量。

项目15.如项目14所述的方法，其中在使所述靶标特异性结合配偶体与所述样品接触之前，增加核酸条形码的数量。

项目16.如项目14所述的方法，其中在使所述靶标特异性结合配偶体与其靶标分子结合时，增加核酸条形码的数量。

项目17.如项目1-16中任一项所述的方法，其中第一探针的所述释放的标签包含核苷酸序列。

项目18.如项目17所述的方法，其还包括使所述样品与背景降低剂接触，所述背景降低剂包含与所述释放的第一探针的所述释放的标签的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中所述背景降低剂与所述释放的第一探针的所述释放的标签的结合淬灭了所述标签的信号。

项目19.如项目2-18中任一项所述的方法，其中第二探针的所述释放的标签包含核苷酸序列。

项目20.如项目19所述的方法，其还包括使所述样品与背景降低剂接触，所述背景降低剂包含与所述第二探针的所述释放的标签的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中所述背景降低剂与所述释放的第二探针的所述标签的结合淬灭了所述标签的信号。

项目21.如项目3-20中任一项所述的方法，其中释放的探针的活化标签包含核苷酸序列。

项目22.如项目1-21中任一项所述的方法，其还包括使所述样品与背景降低剂接触，所述背景降低剂包含与所述探针的所述释放的标签的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中所述背景降低剂与所述释放的探针的所述释放的标签的结合淬灭所述标签的信号。

项目23.一种探针组组合物，其包含：

一个或多个第一探针，每个第一探针包含：

第一标签；和

一个或多个第二探针，每个第二探针包含：

第二标签；

淬灭部分，其中所述淬灭部分使得所述第二标签

不可检测；和

项目24.如项目23所述的组合物，其还包含：

一个或多个第三探针，每个第三探针包含：

第三标签；

其中所述第二探针还包含用于所述第二裂解剂的裂解位点。

项目25.如项目24所述的组合物，其还包含：

后续探针，其包含：

后续标签；

项目26.如项目23-25中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个第一探针具有相同的标签。

项目27.如项目23-25中任一项所述的组合物，其中所述一个或多个第一探针具有不同的标签。

项目28.如项目23-27中任一项所述的组合物，其中所述裂解位点是电磁裂解位点；化学裂解位点；或机械裂解位点。

项目29.如项目28所述的组合物，其中所述电磁裂解位点是光裂解位点。

项目30.如项目29所述的组合物，其中所述光裂解位点是紫外光(UV)裂解位点。

项目31.如项目23-30中任一项所述的组合物，其中所述第一标签或第二标签是荧光标签。

项目32.如项目23-31中任一项所述的组合物，其还包含：背景降低剂，所述背景降低剂包含与存在于所述裂解位点和所述第一标签之间的第一探针的一部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

项目33.如项目23-32中任一项所述的组合物，其还包含：背景降低剂，所述背景降低剂包含与存在于所述裂解位点和所述第二标签之间的第二探针的一部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

项目34.如项目25-33中任一项所述的组合物，其还包含：背景降低剂，所述背景降低剂包含与存在于所述裂解位点和所述后续标签之间的后续探针的一部分的核苷酸序列互补的核苷酸序列。

项目35.一种试剂盒，其包括：

如项目23-34中任一项所述的探针组组合物；

背景降低剂；

盖玻片；

一个或多个靶标特异性结合配偶体；

一种或多种缓冲液；

一种或多种用于增加靶标特异性结合配偶体的核酸条形码的数量的试剂；

一种或多种裂解剂；

核复染剂；以及

使用说明。

项目36.如项目35所述的试剂盒，其中所述背景降低剂连接至固相。

项目37.如项目36所述的试剂盒，其中所述固相选自盖玻片、颗粒和载玻片。

项目38.如项目35所述的试剂盒，其中所述背景降低剂是在液相中。

项目39.一种背景降低剂，其包含与如项目23-31中任一项所述的组合物的第一探针的释放的标签互补的核苷酸序列和淬灭材料。

项目40.一种背景降低剂，其包含与如项目24-31中任一项所述的组合物的第二探针的释放的标签互补的核苷酸序列和淬灭材料。

项目41.一种背景降低剂，其包含与如项目25-31中任一项所述的组合物的探针的释放的活化标签互补的核苷酸序列和淬灭材料。

项目42.一种用于检测多个靶标分子的方法，所述方法包括：

第一探针，其包含：

第一标签；和

第二探针，其包含：

第二标签；

淬灭部分，其中所述淬灭部分使得所述第二标签

不可检测；和

项目43.如项目42所述的方法，其中所述探针组中的一个或多个还包含第三探针，其包含：

第三标签；

淬灭部分，其中所述淬灭部分使得所述第三标签

不可检测；和

(h)检测与所述第三标签相对应的信号。

项目44.如项目43所述的方法，其中所述探针组中的一个或多个还包含后续探针，其包含：

后续标签；和

淬灭部分，其中所述淬灭部分使得所述后续标签

不可检测；和

(k)检测与所述后续标签相对应的信号；以及

(l)任选地重复步骤(i)至(k)。

序列表

<110> 乌尔蒂维尤股份有限公司(ULTIVUE, INC.)

<120> 用于依次检测靶标的方法和组合物

<130> 01168-0019-00PCT

<150> US 62/780,038

<151> 2018-12-14

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 示例性核酸条形码序列

<400> 1

acggaaccaa ca 12

<210> 2

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 示例性核酸条形码序列

<400> 2

acggaatgag gc 12

<210> 3

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 示例性核酸条形码序列

<400> 3

acttgctgac ga 12

<210> 4

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 示例性核酸条形码序列

<400> 4

tcacgtcagc at 12

<210> 5

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 示例性核酸条形码序列

<400> 5

ttgacgatgg ca 12

<210> 6

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 示例性核酸条形码序列

<400> 6

gggaagtagg gc 12

<210> 7

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 示例性核酸条形码序列

<400> 7

cccaaaacgt cg 12

<210> 8

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 示例性核酸条形码序列

<400> 8

tcgctgtcat ga 12

<210> 9

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 示例性核酸条形码序列

<400> 9

agcaattcgg gt 12

<210> 10

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 示例性核酸条形码序列

<400> 10

cgggttaagg gt 12

<210> 11

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 示例性核酸条形码序列

<400> 11

gcgttgggat ga 12

<210> 12

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 示例性核酸条形码序列

<400> 12

agcgaggaaa gt 12

<210> 13

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 与SEQ ID NO: 1互补的序列

<400> 13

tgttggttcc gt 12

<210> 14

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 与SEQ ID NO: 2互补的序列

<400> 14

gcctcattcc gt 12

<210> 15

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 与SEQ ID NO: 3互补的序列

<400> 15

tcgtcagcaa gt 12

<210> 16

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 与SEQ ID NO: 4互补的序列

<400> 16

atgctgacgt ga 12

<210> 17

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 与SEQ ID NO: 5互补的序列

<400> 17

tgccatcgtc aa 12

<210> 18

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 与SEQ ID NO: 6互补的序列

<400> 18

gccctacttc cc 12

<210> 19

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 与SEQ ID NO: 7互补的序列

<400> 19

cgacgttttg gg 12

<210> 20

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 与SEQ ID NO: 8互补的序列

<400> 20

tcatgacagc ga 12

<210> 21

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 与SEQ ID NO: 9互补的序列

<400> 21

acccgaattg ct 12

<210> 22

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 与SEQ ID NO: 10互补的序列

<400> 22

acccttaacc cg 12

<210> 23

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 与SEQ ID NO: 11互补的序列

<400> 23

tcatcccaac gc 12

<210> 24

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 与SEQ ID NO: 12互补的序列

<400> 24

actttcctcg ct 12

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 对miR-146a具有选择性的序列

<400> 25

aacccatgga attcagttct ca 22

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 对miR-15a具有选择性的序列

<400> 26

cacaaaccat tatgtgctgc ta 22

<210> 27

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<223> 对MiR-155具有选择性的序列

<400> 27

cccctatcac gattagcatt aa 22

Claims

1.一种用于检测多个靶标分子的方法，所述方法包括：

第一探针，其包含：

第一标签；和

第二探针，其包含：

第二标签；淬灭部分，其中所述淬灭部分使得所述第二标签不可检测；和

(d)使所述样品与第一裂解剂接触，从而

2.如权利要求1所述的方法，其中所述探针组中的一个或多个还包含第三探针，并且所述方法还包括：

第三标签；和

淬灭部分，其中所述淬灭部分使得所述第三标签

不可检测；和

3.如权利要求2所述的方法，其中所述探针组中的一个或多个还包含后续探针，并且所述方法还包括：

后续标签；和

淬灭部分，其中所述淬灭部分使得所述后续标签

不可检测；和

(l)任选地重复步骤(i)至(k)。

4.如权利要求1所述的方法，其中探针组的所述第一可检测标签和所述第二可检测标签是相同的。

5.如权利要求1所述的方法，其中探针组的所述第一可检测标签和所述第二可检测标签是不同的。

6.如权利要求2所述的方法，其中探针组的所述第一可检测标签、所述第二可检测标签和所述第三可检测标签中的两个或更多个是相同的。

7.如权利要求2所述的方法，其中探针组的所述第一可检测标签、所述第二可检测标签和所述第三可检测标签中的两个或更多个是不同的。

8.如权利要求3所述的方法，其中所述第一标签、所述第二标签、所述第三标签和所述后续标签中的两个或更多个是相同的。

9.如权利要求3所述的方法，其中所述第一标签、所述第二标签、所述第三标签和所述后续标签中的两个或更多个是不同的。

10.如权利要求1所述的方法，其还包括在使所述样品与所述第一裂解剂接触后和/或使所述样品与所述第二裂解剂接触后洗涤所述样品。

11.如权利要求1所述的方法，其中在使所述样品与所述第一裂解剂接触后和/或使所述样品与所述第二裂解剂接触后不洗涤所述样品。

12.如权利要求11所述的方法，其中不移除盖玻片。

13.如权利要求1所述的方法，其还包括增加靶标特异性结合配偶体上的核酸条形码的数量，其中相应探针的多个拷贝与所述核酸条形码的多个拷贝结合。

14.如权利要求13所述的方法，其中使用滚环扩增、引物交换反应、杂交链反应或DNA分支来增加核酸条形码的数量。

15.如权利要求1所述的方法，其中第一探针的所述释放的标签包含核苷酸序列。

16.如权利要求15所述的方法，其还包括使所述样品与背景降低剂接触，所述背景降低剂包含与所述释放的第一探针的所述释放的标签的核苷酸序列互补的核苷酸序列，其中所述背景降低剂与所述释放的第一探针的所述释放的标签的结合淬灭了所述标签的信号。

17.一种探针组组合物，其包含：

一个或多个第一探针，每个第一探针包含：

第一标签；和

一个或多个第二探针，每个第二探针包含：

第二标签；

18.一种试剂盒，其包括：

如权利要求17所述的探针组组合物；

背景降低剂；

盖玻片；

一个或多个靶标特异性结合配偶体；

一种或多种缓冲液；

一种或多种裂解剂；

核复染剂；以及

使用说明。

19.一种背景降低剂，其包含与如权利要求17所述的组合物的第一探针的释放的标签互补的核苷酸序列和淬灭材料。

20.一种用于检测多个靶标分子的方法，所述方法包括：

第一探针，其包含：

第一标签；和

第二探针，其包含：

第二标签；