KR20220117235A - 핵산의 순차 검출 방법 - Google Patents

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한 루
빙칭 장
리 왕
하이링 쭝
샤오-쥔 마
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어드밴스드 셀 다이어그노스틱스, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 샘플을 산 시약과 접촉시켜 결합된 핵산 검출 시스템을 제거하여, 동일한 검출 시스템이 상이한 표적 핵산을 검출하고 더 높은 수준의 다중화를 제공하기 위해 다시 사용되게 하는 복수의 표적 핵산의 다중 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 표적 핵산의 검출을 위한 산 시약 및 임의적으로 프로브를 함유하는 키트에 관한 것이다.

Description

핵산의 순차적 검출 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2019년 11월 20일 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/938,138호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 전체 내용은 참조로 본원에 완전히 포함된다.
본 발명은 일반적으로 핵산의 검출, 보다 구체적으로 핵산의 다중 검출에 관한 것이다.
RNA 제자리(in situ) 혼성화(ISH)는 세포 및 조직 맥락을 보존하면서, 순환 종양 세포(CTC)와 같은 세포, 또는 조직 절편 내에서 특이적 RNA 서열, 예를 들어, 메신저 RNA(mRNA), 긴 비-코딩 RNA(lncRNA), 및 마이크로RNA(miRNA)를 측정 및 국부화하는 데 널리 사용되는 분자 생물학 기술이다. 따라서 RNA ISH는 세포 및 조직 내에서 유전자 발현의 정량화 뿐만 아니라 공간-시간적 시각화를 제공한다. 이는 연구 및 진단에서 넓게 적용되고 있다(Hu 등, Biomark. Res. 2(1):1-13, doi: 10.1186/2050-7771-2-3 (2014); Ratan 등, Cureus 9(6):e1325. doi: 10.7759/cureus.1325 (2017); Weier 등, Expert Rev. Mol. Diagn. 2(2):109-119 (2002))). 형광 RNA ISH는 각각 RNA 표지화 및 검출을 위해 형광 염료 및 형광 현미경을 활용한다. 형광 RNA ISH는 전형적으로 4 내지 5 개 표적 서열의 제한된 다중화를 제공한다. 제한된 다중화 능력은 주로 형광 현미경의 광학 시스템에 의해 구별될 수 있는 소수의 스펙트럼으로 구별되는 형광 염료 때문이다. 더 높은 수준의 다중화는 복합 생물학적 시스템을 이해하기 위해 세포 및 조직 지도를 생성하는 것과 같은 분야, 특히 인간 건강 및 질환에서 매우 바람직하다.
일련의 라운드의 혼성화, 이미지화, 표지 제거 및 별개 표적에 대한 재혼성화를 활용하는 여러 접근법이 도입되었으며, 이론적으로 동일한 세포 또는 조직 절편에서 4 내지 5 개 표적의 배수의 이미지를 제공한다(Shah 등, Neuron 92(2):342-357 (2016); Codeluppi 등, Nature Methods 15(11):932-935 (2018); Kishi 등, Nat. Methods 16:533-544 (2019)). 그러나, 실제로, 이전에 기재된 순차적 형광 ISH(FISH) 방법은 혼성화 및 검출의 연속 라운드에서 핵산 검출 감도, 특히 RNA 검출 감도, 및 세포 형태의 실질적인 손실을 초래할 수 있다.
예를 들어, 효소 DNAse I은 표적 프로브 및 혼성화 연쇄 반응-기반 신호 증폭 시스템을 제거하는 데 통상적으로 사용된다(상기 Shah 등, 2016). 그러나, DNAse I 소화는 핵 아키텍처 뿐만 아니라 세포 형태를 손상시켜 후속 이미지 등록 및 분석 단계를 방해할 수 있다. 효소 엑소뉴클레아제 I은 또한 긴 DNA 연쇄체-기반 증폭 시스템을 제거하는 것으로 보고되었다(상기 Kishi 등, 2019). 그러나, 이 방법을 사용하면, 효소적 활성을 직접적으로 측정 및 제어할 수 없고, 절차는 상대적으로 많은 양의 효소, 더 높은 온도에서 더 긴 배양 시간, 고정 후 및 광범위한 세척 단계를 필요로 한다.
따라서, 다중 라운드의 혼성화를 달성하기 위해 RNA 무결성과 같은 세포 핵산 무결성, 및 형태에 또한 최소한으로 영향을 미치는 표적 프로브 및 신호 증폭 시스템의 제거를 위한 간단하고 신뢰할만하고 효과적인 방법론에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은 이 필요성을 충족시키고 관련 이점 또한 제공한다.
본 발명은 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계로, 상기 세포는 세포 내 제1 표적 핵산에 혼성화된 제1 프로브를 포함하고, 상기 산 시약은 제1 프로브와 제1 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴하는 것인, 단계; 및 세포로부터 제1 프로브를 제거하는 단계를 포함하는, 세포 내 핵산에 결합된 프로브를 제거하는 방법을 제공한다. 임의적으로, 단계를 반복하여 세포 내 핵산의 다중 검출의 순차적 라운드를 제공할 수 있다.
도 1은 다중 검정의 작업흐름도(RNAscope® HiPlex Assay Workflow)를 나타낸다. N 개 표적 서열은 표적 프로브에 혼성화되고(이중 Z 프로브로 도시됨), 신호는 RNAscope®과 같은 증폭 시스템을 통해 동시에 증폭된다. 도시된 구현예에서, 처음 4 개의 표적은 4 개의 비-스펙트럼 중첩 형광 염료-접합 올리고(표지 프로브)를 통해 검출되고 기존 형광 현미경 또는 스캐너를 사용하여 이미지화된다. 그런 다음 형광단을 표지 프로브에서 절단하고 다음 4 개의 표적을 동일한 방법을 사용하여 표지하고 이미지화한다. 4 개 표적 각각의 검출에 대한 L 라운드 후, 이미지 등록 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 이미지를 등록하여 단일-셀 해상도로 겹쳐진 이미지의 최종 합성물을 생성한다.
도 2a 및 2b는 표적 프로브를 제거하기 위해 산 시약을 사용하는 핵산 프로브의 순차적 혼성화의 개략도를 나타낸다. 도 2a는 순차적 혼성화를 위한 표적 핵산(들)에 결합된 프로브(들)의 산 처리 및 제거의 개략도를 나타낸다. N 개 표적 프로브는 예를 들어, 제자리 혼성화 검정에서 표적 핵산에 혼성화된다. 다이어그램은 표적 핵산에 혼성화된 표적 프로브의 임의적인 신호 증폭을 도시한다. 세포는 세포의 시각화를 용이하게 하기 위해 대조-염색될 수 있으며, 예를 들어, 핵은 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 사용하여 염색될 수 있다. 표적 프로브 및 대조-염색된 세포는 예를 들어, 이미지화에 의해 시각화되어, 표적 핵산을 검출하고 이미지화한다. RNAscope® 검정을 사용하는 경우, RNAscope® 이중 Z 프로브 및 신호는 RNAscope® 증폭 시스템을 통해 동시에 증폭된다. 산 처리 단계는 각각의 표적(들)에 결합된 표적 프로브(들)를 제거하기 위해 수행된다. N 개 표적 핵산의 하나 이상의 추가적인 세트는 1 개 이상의 라운드 동안 전체 N-플렉스 작업흐름을 반복함으로써 검출될 수 있다. 모든 표적이 검출된 후, 이미지 등록 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 이미지를 등록하여 단일 셀 해상도로 겹쳐진 이미지의 최종 합성물을 생성한다. 상기 방법으로 이용가능한 다중화의 총 수준은 라운드 당 N 개 표적(들) x K 라운드의 N-플렉싱이다. 일반적으로, N = 1 이상이고, 산 제거 단계가 포함되는 경우, K = 2 이상이다. 도 2a에 나타낸 도면에서, K = 1이면, 표적 프로브 혼성화 및 이미지화의 한 라운드만 수행해야 하므로 산 제거 단계는 필요하지 않다.
도 2b는 순차적 혼성화를 위한 표적 핵산에 결합된 프로브의 산 처리 및 제거의 개략도를 나타낸다. N 개 표적 프로브는 예를 들어, RNAscope® HiPlex 검정과 같은 제자리 혼성화 검정에서 표적 핵산에 혼성화된다. N 개 표적 프로브는 예를 들어, RNAscope® 이중 Z 프로브를 사용하여 표적 서열에 혼성화되고, 신호는 예를 들어, RNAscope® 증폭 시스템을 통해 동시에 증폭된다. 다이어그램은 표적 핵산에 혼성화된 표적 프로브의 임의적인 신호 증폭을 도시한다. 세포는 세포의 시각화를 용이하게 하기 위해 대조-염색될 수 있으며, 예를 들어, 핵은 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 사용하여 염색될 수 있다. N 개 표적 핵산은 표지화, 예를 들어, 형광 표지화, 이미지화 및 검출가능한 표지 절단, 예를 들어, 형광 표지 절단의 반복 라운드를 통해 검출된다. 다이어그램에서, N 개 표적 핵산은 N 개 표적 프로브에 혼성화되고 반복적으로 검출되어, N 개 표적의 서브세트(N 개 표적서브세트 1)가 표지화 및 검출되고, 표지가 표지된 핵산의 서브세트로부터 절단된 다음(L 라운드의 표지 프로브 혼성화, 여기서 L = 1), N 개 표적의 제2 서브세트(N 개 표적서브세트 2)가 표지화 및 검출되고, 표지가 표지된 핵산의 서브세트로부터 절단되는(L 라운드의 표지 프로브 혼성화, 여기서 L = 2) 등, N 개 표적 핵산이 모두 검출될 때까지 하도록 한다. 모든 N 개 표적 핵산이 표지화의 원하는 라운드 수에서 검출된 후(L = 표지화의 원하는 라운드), 혼성화된 N 개 표적 프로브(예컨대 ZZ 프로브-신호 생성 복합체)를 제거하기 위해 산 처리 단계가 수행된다. N 개 표적 핵산의 하나 이상의 추가적인 세트(예를 들어, N' 표적 핵산, N'' 표적 핵산 등)는 1 개 이상의 라운드 동안 전체 N-플렉스 작업흐름을 반복함으로써 검출될 수 있다. 모든 표적이 검출된 후, 이미지 등록 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 이미지를 등록하여 단일-셀 해상도로 겹쳐진 이미지의 최종 합성물을 생성한다. 상기 방법으로 이용가능한 다중화의 총 수준은 라운드 당 N 개 표적 핵산 x K 라운드의 N-플렉싱이다(여기서 "N-플렉싱"은 "N 개 표적 프로브 혼성화"에서 "프로브 및 증폭기의 산 제거"로의 흐름 또는, 최종 라운드에서, 마지막 "대조 염색 및 이미지화" 단계를 지칭한다. 일반적으로, N = 1 이상이고, 산 제거 단계가 포함되는 경우, K = 2 이상이다. 도 2b에 나타낸 도면에서, K = 1이면, 표지 프로브 혼성화, 이미지화 및 형광단 절단의 L 라운드만 수행해야 하므로 프로브 및 증폭기의 산 제거 단계는 필요하지 않다.
도 3a 및 3b는 표적 핵산 검출의 순차적 라운드를 위한 산 처리를 나타낸다. 도 3a는 산 처리가 신선하게 동결된 마우스 뇌에서 표적 프로브 및 증폭 복합체를 효과적으로 제거함을 나타낸다. 신선하게 동결된 절편으로 제조된 마우스 뇌에서 4 개의 고도로 발현된 양성 대조군 유전자인 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(Gapdh), 포스포글리세레이트 키나제 1(Pgk1), 기본 나선-루프-나선 패밀리 구성원 E22(Bhlhe22), 및 컴플렉신 2(Cplx2)의 검출이 제시된다. 4 개의 유전자에 대한 표적 프로브(ZZ 프로브)를 함께 혼성화하였고, 신호를 RNAscope® HiPlex 증폭 시스템을 사용하여 함께 증폭시켰다. 4 개의 유전자를 이들 4 개 표적 프로브에 할당된 신호 증폭 시스템에 상응하는 형광으로 표지된 프로브를 사용하여 반복 검출의 제1 라운드에서 검출하였다. Alexa 488, ATTO 550, ATTO 647N 및 Alexa 750 형광단을 각각 Gapdh, Pgk1, Bhlhe22 및 Cplx2를 검출하기 위해 사용하였고 핵을 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌)를 사용하여 청색으로 염색하였다(상단 패널). 신호 검출 후, 조직 절편을 실온(RT)에서 5 분 동안 산 용액(20% 아세트산, 6.4X SSC)으로 처리하였고, 산 처리를 2 회 이상 반복하였다. 그런 다음 절편을 표적 프로브의 첨가 없이 혼성화 및 증폭의 제2 라운드 동안 사용하였다. 산 처리 후 제2 라운드에서 신호는 거의 내지 전혀 검출되지 않았으며(하단 패널), 따라서 이는 이전에 혼성화된 표적 프로브 및 신호 증폭 구성요소의 완전한 제거를 입증한다.
도 3b는 산 처리가 신선하게 동결된 마우스 뇌의 세포 RNA 및 조직 형태에 최소한으로 영향을 미침을 나타낸다. 4 개의 양성 대조군 유전자(Gapdh, Pgk1, Bhlhe22 및 Cplx2)를 도 3a에 기재된 바와 같은 신선하게 동결된 절편으로 제조된 마우스 뇌에서 검출하였다(상단 패널). 신호 검출 후, 산 처리를 2 회 대신에 4 회 반복한 것을 제외하고, 절편을 도 3a에 기재된 바와 같은 산 용액으로 처리하였다. 그런 다음 처리된 절편을 혼성화 및 증폭의 제2 라운드에 사용하여 동일한 4 개의 유전자를 검출하였다. 혼성화의 제2 라운드에서 검출된 신호(하단 패널)를 혼성화의 제1 라운드에서 검출된 신호(상단 패널)와 비교하면, 2 개 라운드의 표적 프로브 혼성화 및 신호 증폭은 유사한 발현 패턴을 산출하였으며, 이는 반복된 산 처리로부터 RNA의 최소한의 손실을 나타낸다.
도 4는 2 개 라운드의 산 처리 및 순차적 혼성화 후 양호한 형태 및 신호 검출을 나타낸다. 도 4에서, 상단 패널은 도 2b에 요약된 작업흐름에 나타낸 바와 같이 본질적으로 수행된, 표적 프로브 혼성화의 제1 라운드(k = 1) 및 반복 검출의 제3(l = 3)에서 신선하게 동결된 마우스 뇌 절편에서 4 개의 양성 대조군 유전자인 RNA 폴리머라제 II 서브유닛 A(Polr2A), 펩티딜프롤릴 이소머라제 B(Ppib,), 유비퀴틴 C(Ubc), 및 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 1(Hprt1)의 검출을 나타낸다. 12 개 표적 프로브(RNAscope® HiPlex 12-플렉스 마우스 양성 대조군)를 RNAscope® Hiplex 검정을 사용하여 동시에 혼성화 및 증폭시켰다. 4 개의 유전자를 Alexa 488, ATTO 550, ATTO 647N 및 Alexa 750 형광단을 사용하여 제1 라운드에서 검출하였고, 이미지화 후 형광단을 절단하였다. 다음 4 개의 유전자를 동일한 4 개의 형광단을 사용하여 검출의 제2 라운드에서 검출하였고, 이미지화 후 형광단을 절단하였다. 반복 검출의 제3 라운드는 도 4, 상단 패널에 제시되어 있다. Alexa 488, ATTO 550, ATTO 647N 및 Alexa 750 형광단을 각각 Polr2a, Ppib, Ubc 및 Hprt1을 검출하기 위해 사용하였고, 핵을 DAPI를 사용하여 청색으로 염색하였다. 도 4에서, 하단 패널은 표적 프로브 혼성화 및 증폭의 제3 라운드(k = 3) 및 반복 검출의 제1 라운드(l = 1)에서 마우스 뇌의 선조체 영역에서 4 개의 상이한 저발현 표적, 5-하이드록시트립타민 수용체 7(Htr7), 프로토카드헤린 8(Pcdh8), 용질 운반체 패밀리 32 구성원 1(Slc32a1), 및 티로신 하이드록실라제(Th)의 검출을 나타낸다. 산 처리, 표적 혼성화 및 증폭 단계를 도 3a에 기재된 바와 같은 라운드 1 및 라운드 2 표적 혼성화 후 수행하였다. 표적 프로브 혼성화 및 증폭의 제2 라운드를 산 처리 후 수행하였다. 표적 프로브는 포함되지 않았고, 프로브 희석제를 대신 사용하였다. 표적 프로브 혼성화 및 증폭의 제3 라운드를 12 개의 상이한 표적 프로브를 사용하여 제2 산 처리 후 수행하였다. 12 개 표적 프로브 중 4 개를 하단 패널에 나타낸 바와 같이 검출의 제1 라운드에서 먼저 검출하였다.
도 5a-5c는 신호 생성 복합체(SGC)를 사용하여 핵산 표적을 검출하는 이전에 기재된 방법의 개략도를 나타낸다. PPA, 전-전증폭기(pre-pre-amplifier); PA, 전증폭기(pre-amplifier); AMP, 증폭기(amplifier); LP, 표지 프로브.
도 6a-6c는 표적 핵산의 직교 표지화의 개략도를 나타낸다. 도 6a는 RNAscope® 검정에 기반한 표적 핵산의 직교 표지화를 나타낸다. 도 6a는 각각의 신호 생성 복합체(SGC)에 따른 3 개의 예시적인 표적 핵산의 표지화를 나타낸다. 도 6a는 표적 핵산 1에 대한 표적 프로브 쌍 1(TP1a 및 TP1b)의 결합을 나타낸다. 전증폭기(PA1)는 표적 프로브 쌍(TP1a 및 TP1b)에 결합된 것으로 제시된다. 복수의 증폭기(AMP1)는 PA1에 결합된 것으로 제시된다. 복수의 표지 프로브(LP1)는 증폭기에 결합된 것으로 제시된다. 도 6a는 개별 표적 각각에 특이적인 SGC의 구성요소(표적 프로브, 전증폭기, 증폭기, 표지 프로브)를 갖는, 표적 2 및 3에 대한 유사한 배열을 나타낸다. 도 6b는 도 6a에 제시된 배열의 변형을 나타낸다. 도 6b는 각각의 신호 생성 복합체(SGC)에 따른 2 개의 예시적인 표적 핵산의 표지화를 나타낸다. 도 6b는 표적 핵산 1에 대한 표적 프로브 쌍 1(TP1a 및 TP1b)의 결합을 나타낸다. 전-전증폭기(PPA1)는 표적 프로브 쌍(TP1a 및 TP1b)에 결합된 것으로 제시된다. 복수의 전증폭기(PA1)는 PPA1에 결합된 것으로 제시된다. 복수의 증폭기(AMP1)는 PA1에 결합된 것으로 제시된다. 증폭기는 단순화를 위해 하나의 전증폭기에 결합된 것으로 제시되지만, 증폭기는 모든 전증폭기에 결합될 수 있는 것으로 이해된다. 복수의 표지 프로브(LP1)는 증폭기에 결합된 것으로 제시된다. 도 6b는 개별 표적 각각에 특이적인 SGC의 구성요소(표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기, 증폭기, 표지 프로브)를 갖는, 표적 2에 대한 유사한 배열을 나타낸다. 도 6c는 BasescopeTM 검정에 기반한 표적 핵산의 직교 표지화를 나타낸다. 도 6c는 각각의 신호 생성 복합체(SGC)에 따른 2 개의 예시적인 표적 핵산의 표지화를 나타낸다. 도 6c는 표적 핵산 1에 대한 표적 프로브 쌍 1(TP1a 및 TP1b)의 결합을 나타낸다. 전-전증폭기 쌍(PPA1a 및 PPA1b)은 각각의 표적 프로브 쌍(TP1a 및 TP1b)에 결합된 것으로 제시된다. 전증폭기(PA1)는 전-전증폭기 쌍(PPA1a 및 PPA1b)에 결합된 것으로 제시된다. 복수의 증폭기(AMP1)는 PA1에 결합된 것으로 제시된다. 증폭기는 단순화를 위해 하나의 전증폭기에 결합된 것으로 제시되지만, 증폭기는 모든 전증폭기에 결합될 수 있는 것으로 이해된다. 복수의 표지 프로브(LP1)는 증폭기에 결합된 것으로 제시된다. 도 6c는 개별 표적 각각에 특이적인 SGC의 구성요소(표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기, 증폭기, 표지 프로브)를 갖는, 표적 2에 대한 유사한 배열을 나타낸다.
본 발명은 예를 들어, 제자리 혼성화에 의한 핵산의 순차적 다중 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 동일한 샘플 내 및 동일한 세포 내에서 다중 표적 핵산의 검출을 허용한다.
본원에는 세포 핵산 또는 세포 형태에 거의 영향을 미치지 않고 올리고뉴클레오티드 프로브 및 분지형-DNA-유사 신호 증폭 시스템을 신속하고 효과적으로 제거할 수 있는 화학적 방법이 기재되어 있다. 이는 일반적으로 실온에서 단기간 동안 세포 또는 조직 샘플에 적용되는 산-함유 용액을 사용하여 달성되며 그 사이에 세척 단계는 거의 내지 전혀 없다. 본 발명의 방법은 이전에 기재된 핵산 검출 검정보다 샘플 내에서 심지어 동일한 세포 내에서도 더 많은 핵산의 검출을 달성하기 위해 더 높은 수준의 다중화를 수행하도록 핵산 검출을 허용한다.
핵산 검출의 한 가지 방법은 RNAscope®라고 하는 RNA ISH 기술을 활용하며, 때때로 "이중-Z" 또는 ZZ 프로브로 지칭되는 특별히 설계된 올리고뉴클레오티드 프로브를 분지형-DNA-유사 신호 증폭 시스템과 조합하여 사용하여 표준 명시야 현미경 하에 단일-분자 감도에서 1 킬로베이스만큼 작은 RNA를 확실히 검출한다(Anderson 등, J. Cell. Biochem. 117(10):2201-2208 (2016); Wang 등, J. Mol. Diagn. 14(1):22-29 (2012)). 이러한 프로브 설계는 각 쌍의 두 프로브가 의도된 표적에 결합될 때만 신호 증폭이 발생할 수 있기 때문에 신호 증폭의 특이성을 크게 개선한다. RNAscope® 기술은 형광 검출을 사용하여 동시에 최대 4 또는 5 개의 RNA 표적을 구별할 수 있다.
또 다른 최근에 기재된 핵산 검출 방법(2019년 2월 15일 출원된 미국 가출원 번호 제62/806,574호 참조)은 L 개(L=1, 2, 3, ...) 라운드의 I 개(I= 2, 3, 4, ...) 표적의 반복 형광 표지화 이어서 이미지화 및 형광단 절단으로 도 1에 예시된 표지 절단을 사용한다. 반복 검출 방법은 단일 라운드의 혼성화 및 증폭 단계로부터 L x I 개의 별개 표적 서열(N)의 동시 시각화를 제공한다. 도 1의 "N"은 검출될 표적의 총 수를 나타내고, 상기 기재된 "I"는 각 L 라운드에서 반복 당 표적의 수를 나타낸다. 일반적으로, 표지화의 각 반복 라운드에서 표적의 수(I)는 2 이상, 3 이상, 4 이상 등으로 본원에 개시된 바와 같이 단일 라운드에서 명확하게 표지 및 검출될 수 있는 최대 수일 것이다. 원한다면, 단일 표적 핵산(I=1)은 한 라운드에서 검출될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적의 수(I)는 각 라운드에서 상이할 수 있다. 예를 들어, 3 개 라운드의 검출에서, I가 각 개별 라운드에서 4, 4 및 1인 경우, 총 9 개의 표적이 검출될 것이다. 따라서, 표적의 수 N = 합계(i1, i2, i3... iL), 여기서 i1, i2, i3은 각 반복 라운드에서 검출된 표적의 수이며, 동일하거나 또는 상이할 수 있고, L은 총 라운드 수이다. 숫자 "i"가 각 라운드에서 동일한 경우, N = LxI.
반복 검출 단계를 수행하는 능력을 제공하기 위해, 형광 염료와 같은 표지는 절단가능, 예를 들어 화학적으로 절단가능하며, 제1 라운드에서와 동일한 표지를 사용하여 후속 라운드의 검출을 허용한다. 라운드 내에서, 통상의 형광 현미경을 사용하여 스펙트럼으로 분리될 수 있는 형광 염료 접합체가 활용된다. 그런 다음 형광 염료를 절단한다. 하나의 예시적인 절단제는 환원제 트리스(2-카르복시에틸) 포스핀(TCEP)이다. 형광 염료와 같은 검출가능한 표지의 절단 후, 표적 검출 및 이미지화의 후속 라운드가 수행된다. 검정 전략은 남아있는 표적과 연관된 기존 신호 증폭 복합체를 파괴할 수 있는 이전 라운드의 표지 프로브를 제거할 필요성을 없애고, 또한 최대화된 검출을 위해 조직 및 RNA 무결성을 보존한다.
RNAscope® 프로브와 마찬가지로, 각 표적 프로브는 표적 핵산의 특이적 서열에 결합하는 표적 결합 분절(표적 결합 부위)을 함유한다. 프로브는 또한 본원에 기재된 바와 같이, 신호 증폭 분자에 결합하는 "꼬리" 서열을 함유한다. 2 개의 프로브는 표적 핵산 서열의 인접한 부위에 한 쌍으로 결합한다. 두 프로브가 각각의 표적 부위에 결합하는 경우에만 신호 증폭 분자(예를 들어, 도 6a에서와 같은 전증폭기 또는 도 6b 및 6c에서와 같은 전-전증폭기)에 대한 완전한 결합 부위가 형성되어, 성공적인 신호 증폭 및 검출로 이어질 수 있다. 동일한 라운드에서 검출된 상이한 표적 서열에 대한 프로브는 상응하는 직교 증폭 분자에 대해 독립적이고 구별되는 결합 서열을 갖도록 설계된다. 이러한 서열은 이중 표적의 프로브 혼성화 및 신호 증폭을 동시에 달성하기 위해 적절한 알고리즘을 사용하여 신속하게 설계될 수 있다. 표적은 각 라운드 내에서 스펙트럼으로 구별되는 형광단과 같은 검출가능한 표지를 사용하여 다중 라운드에서 검출된다.
이 검출 전략은 RNAscope®라고 하는 RNA ISH 기술로 조정되었다. 결과는 단일 셀 해상도에서 동시에 다중 표적 핵산 서열의 특이적이고 증폭된 검출을 제공하는 RNAscope® HiPlex로 지칭된 검정이다. 이는 모든 표적 서열의 동시 표적 혼성화 및 증폭, 이어서 연속 라운드에서 일반적으로 3 내지 5 개 핵산 표적의 반복 검출에 의해 달성된다. 이 검정에서 검출될 수 있는 표적 서열의 수는 사용된 직교 RNAscope® 신호 증폭 시스템의 수에 의해 제한된다.
본원에는 검출 시스템, 예를 들어, RNAscope® 신호 증폭 시스템, 및 공통 스펙트럼 프로파일을 갖는 형광 염료를 사용하여 단일 셀 해상도에서 반복 방식으로 2 개 이상의 표적 핵산 서열의 특이적 검출을 제공하는 검정 및 검출 전략이 기재되어 있다. 추가적인 직교 RNAscope® 신호 증폭 시스템에 대한 필요성 없이 다중화 수준을 증가시키는 한 가지 방식은 모든 표적이 검출 및 이미지화된 후 표적 프로브 및 연관된 신호 증폭 시스템을 완전히 제거하는 것이다. 그런 다음 동일한 검출 시스템이 표적 프로브 혼성화 및 신호 증폭의 후속 라운드에 다시 사용될 수 있다.
본 발명은 세포 내 핵산 서열의 고도로 민감하고 특이적인 검출을 허용하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 연구 및 진단에서 수많은 실질적 적용을 갖는다(Hu 등, Biomark. Res. 2(1):1-13, doi: 10.1186/2050-7771-2-3 (2014); Ratan 등, Cureus 9(6):e1325. doi: 10.7759/cureus.1325 (2017); Weier 등, Expert Rev. Mol. Diagn. 2(2):109-119 (2002)). 본 발명의 방법은 예를 들어, 신경계 및 종양 미세환경과 같은 고도로 복잡한 조직에서 공간적 조직 맵핑, 알려진 세포 유형 및 신규 세포 유형 식별, 세포 상태 식별, 병든 세포 및 조직에서 변경된 유전자 발현 검출, 특이적 세포 유형에서 변경된 유전자 발현 국부화, 종양 이질성 분석, 암 진단 및 예후 또는 다른 질환 상태에 대한 바이오마커 검출, 동반 진단에 대한 바이오마커 검출, 및 병원체(예를 들어, 박테리아, 바이러스, 진균, 미생물 기생충)의 검출 및 식별에 사용될 수 있다
본 발명은 RNAscope® 기술(상기 Wang 등, 2012)의 핵심에서 프로브 설계 원리 및 분지형-DNA-유사 신호 증폭을 동일한 세포 및/또는 조직 절편에서 다중 핵산 표적(반복 방식으로 검출된 하나 초과의 표적 핵산)의 고도로 민감하고 특이적인 서열 검출로 확장한다. 동일한 반복 검정 설계 전략은 짧은 서열을 검출하기 위해 적용될 수 있는 BasescopeTM 신호 증폭 시스템(Baker 등, Nat. Commun. 8(1):1998, doi: 10.1038/s41467-017-02295-5 (2017))과 함께 사용될 수 있다. 방법은 또한 다중 표적의 DNA 검출에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 혼성화 연쇄 반응(HCR)과 같은 당업계에 알려진 다른 신호 증폭 방법에 적용될 수 있다(Choi 등, Development 145(12), pii: dev165753, doi: 10.1242/dev.165753 (2018)). HCR의 최신 버전(HCR v3.0)은 RNAscope®(상기 Choi 등, 2018)와 유사한 쌍을 이루는 프로브 설계를 이용한다. 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 다른 신호 증폭 시스템은 롤링 서클 증폭(Larsson 등, Nature Methods 7(5):395-397 (2010); clampFISH(Rouhanifard 등, BioRxiv, 222794(doi.org/10.1101/222794) (2018); 및 SABER(상기 Kishi 등, 2019)을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법은 단일 세포 및/또는 조직 절편에서 다중 유전자 표적을 표지하는 데 사용될 수 있다. 조직 미세환경의 공간적 맥락에서 많은 수의 바이오마커를 검출하기 위해 형광-기반 검출 뿐만 아니라 이미지화 질량 세포측정(Schulz 등, Cell Syst. 6(1):25-36 (2018)) 둘 다와 함께 사용될 수 있다. 방법은 연구 및 진단 적용에 사용될 수 있다.
산 처리를 사용하는 본 발명의 방법은 다양한 표적 프로브, 및 사용되는 경우 임의적으로 증폭 시스템을 제거하고, 다중화 수준을 증가시키기 위한 혼성화의 순차적 라운드를 제공하기 위해 보편적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 혼성화 연쇄 반응(상기 Choi 등, 2018), 롤링 서클 증폭(상기 Larsson 등, 2010), clampFISH(상기 Rouhanifard 등, 2018) 및 SABER(상기 Kishi 등, 2019)과 같은 올리고뉴클레오티드-기반 신호 증폭 방법에 적용가능하다.
본 발명의 방법은 단일 세포/조직 절편에서 검출될 유전자 표적의 수를 추가로 증가시키기 위해 RNAscope® HiPlex 검정과 조합하여 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 기존 프로브 및 증폭기를 제거하기 위한 순차적 혼성화를 필요로 하는 임의의 다른 DNA 올리고뉴클레오티드-기반 ISH 검출과 함께 사용될 수 있다. 방법은 예를 들어, 조직 미세환경의 공간적 맥락에서 많은 수의 바이오마커를 형광으로 검출하는 데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, RNAscope® HiPlex 검정은 K 라운드의 표적 프로브 혼성화 및 신호 증폭 및 각 이미지화 라운드 동안 I 개의 스펙트럼으로 구별되는 형광단으로의 반복 검출을 사용하여 N(예를 들어, 12) 개 표적의 하나 이상의 세트를 검출하는 데 사용된다(도 2b 참조). 도 2b에 도시된 구현예에서, K 개의 순차적 라운드(외부 루프)는 N 개 표적의 하나 이상의 세트를 검출하는 데 사용되고, L 개의 반복 라운드(내부 루프)는 각 K 라운드에서 N 개 표적의 서브세트를 검출하는 데 사용된다. 처음 N 개 표적을 검출한 후, 표적 프로브 및 신호 증폭 시스템은 아세트산과 같은 산, 및 염의 혼합물을 함유하는 산 용액을 사용하여 조직/세포로부터 제거된다. 산 처리는 신뢰할만하고 빠르고 고도로 효과적이며 세포 RNA 및 조직 형태를 최소한으로 손상시킨다(실시예 I 및 도 3a 및 3b 참조). 그런 다음 산 처리된 조직 샘플은 예를 들어, RNAscope® HiPlex 검정을 사용하여 표적 프로브의 신규 세트로 표지될 준비가 된다. 과정은 동일한 세포 또는 조직에서 총 N x K 개 표적을 검출하기 위해 K 회 반복될 수 있다. 실시예 II 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 표적의 2 개 세트는 신선하게 동결된 마우스 뇌 조직의 산 처리 후 순차적 라운드에서 검출되었다.
도 1, 5 및 6에서, 표적 프로브는 예를 들어, 미국 특허 번호 제7,709,198호, 미국 공개 제2008/0038725호 및 제2009/0081688호, 및 WO 2007/001986 및 WO 2007/002006에 기재된 바와 같이, "Z" 배열로 도시되어 있다. 도 1, 5 및 6에 제시된 Z 배열은 표적 프로브의 전증폭기(도 5a 및 6a) 또는 전-전증폭기(도 5b, 5c, 6b 및 6c) 결합 부위에 대한 표적 결합 부위 5'를 갖는다. 도 1, 5 및 6에 도시된 바와 같은 이러한 배열은 단지 예시이고, 배향은 반대일 수 있으며, 즉, 표적 결합 부위가 전증폭기 또는 전-전증폭기 결합 부위에 대한 3'일 수 있음이 이해된다. 표적 프로브 쌍은 독립적으로 어느 한 배향일 수 있으며, 즉, 표적 프로브 쌍의 하나의 구성원이 전증폭기 또는 전-전증폭기 결합 부위에 대한 표적 결합 부위 5' 또는 3'을 가질 수 있고, 전증폭기 또는 전-전증폭기에 대한 결합 부위 5' 또는 3'을 갖는 제2 프로브와 쌍을 이룰 수 있음이 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "표지 프로브"는 표적 분자에 직접적으로 또는 간접적으로, 일반적으로 간접적으로 결합하고, 표적이 검출되도록 하는 독립체(entity)를 지칭한다. 표지 프로브(또는 "LP")는 검출가능한 신호를 직접적으로 또는 간접적으로 제공하는 하나 이상의 표지를 포함하는 전형적으로 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드인 핵산 결합 부분을 함유한다. 표지는 폴리뉴클레오티드에 공유적으로 부착될 수 있거나, 또는 폴리뉴클레오티드는 표지에 결합하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 비오티닐화 폴리뉴클레오티드는 스트렙타비딘-회합 표지에 결합할 수 있다. 표지 프로브는 예를 들어, 표적 핵산에 직접적으로 혼성화할 수 있다. 일반적으로, 표지 프로브는 표적 핵산에 차례로 혼성화되는 핵산 또는 표적 핵산에 혼성화되는 하나 이상의 다른 핵산에 혼성화할 수 있다. 따라서, 표지 프로브는 폴리뉴클레오티드 서열, 특히 표적 핵산의 일부에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 표지 프로브는 본원에 기재된 바와 같이 증폭기, 전증폭기, 전-전증폭기, 신호 생성 복합체(SGC) 등에서 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로 본 발명의 구현예에서, 표지 프로브는 증폭기에 결합한다. 본원에 사용된 바와 같이, 효소 표지를 포함하는 표지 프로브는 올리고뉴클레오티드와 같은 핵산 결합 부분 및 핵산 결합 부분에 커플링된 효소를 포함하는 표지 프로브를 지칭한다. 본원에 개시된 바와 같이, 핵산 결합 부분에 효소의 커플링은 공유적이거나 또는 비오틴/아비딘과 같은 높은 친화성 결합 상호작용 또는 다른 유사한 높은 친화성 결합 분자를 통해서일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "표적 프로브"는 표적 핵산에 혼성화하고 표지 프로브 또는 신호 생성 복합체(SGC) 구성요소, 예를 들어, 증폭기, 전증폭기 또는 전-전증폭기를 해당 표적 핵산에 포획 또는 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드이다. 표적 프로브는 표지 프로브에 직접적으로 혼성화할 수 있거나, 또는 표지 프로브에 차례로 혼성화하는 하나 이상의 핵산에 혼성화할 수 있으며; 예를 들어, 표적 프로브는 SGC의 증폭기, 전증폭기 또는 전-전증폭기에 혼성화할 수 있다. 따라서 표적 프로브는 표적 핵산의 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 제1 폴리뉴클레오티드 서열 및 표지 프로브의 폴리뉴클레오티드 서열에 상보적인 제2 폴리뉴클레오티드 서열, 증폭기, 전증폭기, 전-전증폭기 등을 포함한다. 일반적으로 본 발명의 구현예에서, 표적 프로브는 도 5a 및 6a에서와 같이 전증폭기, 또는 도 5b, 5c, 6b 및 6c에서와 같이 전-전증폭기에 결합한다. 표적 프로브는 일반적으로 상보적 서열이 상응하는 표적 핵산, 표지 프로브, 증폭기, 전증폭기 또는 전-전증폭기와 혼성화하는 데 이용가능하도록 단일 가닥이다. 본 발명의 구현예에서, 표적 프로브는 한 쌍으로 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이, "증폭기"는 다중 표지 프로브에 혼성화할 수 있는 분자, 전형적으로 폴리뉴클레오티드이다. 전형적으로, 증폭기는 여러 동일한 표지 프로브에 혼성화한다. 증폭기는 또한 표적 핵산, 한 쌍의 표적 프로브의 적어도 하나의 표적 프로브, 한 쌍의 표적 프로브의 두 표적 프로브, 또는 증폭기, 전증폭기 또는 전-전증폭기와 같은 표적 프로브에 결합된 핵산에 혼성화할 수 있다. 예를 들어, 증폭기는 적어도 하나의 표적 프로브 및 복수의 표지 프로브, 또는 전증폭기 및 복수의 표지 프로브에 혼성화할 수 있다. 일반적으로 본 발명의 구현예에서, 증폭기는 전증폭기에 혼성화할 수 있다. 증폭기는 예를 들어, 선형, 갈래형, 빗형, 또는 분지형 핵산일 수 있다. 모든 폴리뉴클레오티드에 대해 본원에 기재된 바와 같이, 증폭기는 변형된 뉴클레오티드 및/또는 비표준 뉴클레오티드간 연결 뿐만 아니라 표준 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 및/또는 포스포디에스테르 결합을 포함할 수 있다. 적합한 증폭기는 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,635,352호, 제5,124,246호, 제5,710,264호, 제5,849,481호, 및 제7,709,198호 및 미국 공개 제2008/0038725호 및 제2009/0081688호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 참조로 포함된다. 일반적으로 본 발명의 구현예에서, 증폭기는 전증폭기 및 표지 프로브에 결합한다(도 5 및 6 참조).
본원에 사용된 바와 같이, "전증폭기"는 하나 이상의 표적 프로브와 하나 이상의 증폭기 사이의 중간 결합 구성요소로서 작용하는 분자, 전형적으로 폴리뉴클레오티드이다. 전형적으로, 전증폭기는 하나 이상의 표적 프로브 및 복수의 증폭기에 동시에 혼성화한다. 예시적인 전증폭기는 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,635,352호, 제5,681,697호 및 제7,709,198호 및 미국 공개 제2008/0038725호, 제2009/0081688호 및 제2017/0101672호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 참조로 포함된다. 일반적으로 본 발명의 구현예에서, 전증폭기는 표적 프로브 쌍의 두 구성원(도 5a 및 6a 참조), 표적 프로브 쌍에 결합할 수 있는 전-전증폭기(도 5b 및 6b), 또는 표적 프로브 쌍에 결합할 수 있는 한 쌍의 전-전증폭기의 두 구성원(도 5c 및 6c 참조)에 결합한다. 전증폭기는 또한 증폭기에 결합한다(도 5 및 6 참조).
본원에 사용된 바와 같이, "전-전증폭기"는 하나 이상의 표적 프로브와 하나 이상의 전증폭기 사이의 중간 결합 구성요소로서 작용하는 분자, 전형적으로 폴리뉴클레오티드이다. 전형적으로, 전-전증폭기는 하나 이상의 표적 프로브 및 복수의 전증폭기에 동시에 혼성화한다. 예시적인 전-전증폭기는 예를 들어, 제2017/0101672호에 기재되어 있으며, 이는 참조로 포함된다. 일반적으로 본 발명의 구현예에서, 전-전증폭기는 표적 프로브 쌍(도 5b 및 6b 참조) 또는 표적 프로브 쌍의 구성원(도 5c 및 6c 참조) 및 전증폭기에 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "복수"는 2 이상을 의미하는 것으로 이해된다. 따라서, 복수는 예를 들어, 2 이상, 3 이상, 4 이상, 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 21 이상, 22 이상, 23 이상, 24 이상, 25 이상, 26 이상, 27 이상, 28 이상, 29 이상, 30 이상, 31 이상, 32 이상, 33 이상, 34 이상, 35 이상, 36 이상, 37 이상, 38 이상, 39 이상, 40 이상, 41 이상, 42 이상, 43 이상, 44 이상, 45 이상, 46 이상, 47 이상, 48 이상, 49 이상, 50 이상, 55 이상, 60 이상, 65 이상, 70 이상, 75 이상, 80 이상, 85 이상, 90 이상, 95 이상, 100 이상, 110 이상, 120 이상, 130 이상, 140 이상, 150 이상, 160 이상, 170 이상, 180 이상, 190 이상, 200 이상, 300 이상, 400 이상, 500 이상, 600 이상, 700 이상, 800 이상, 900 이상, 또는 1000 이상, 또는 특정 용도를 위해 원하는 경우 심지어 더 큰 수를 지칭할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명은 표적 핵산의 다중 검출에 관한 것이며, 여기서 방법은 이전에 기재된 제자리 혼성화 방법보다 더 많은 수의 표적 핵산의 검출을 제공한다. 방법은 프로브의 산 제거 이어서 표적 프로브 혼성화 및 검출의 반복된 라운드(들)에 의한 추가 다중화와 조합하여, 검출의 반복 라운드에서 다중 표적 핵산을 분명하게 검출하기 위해 직교 증폭 시스템을 이용할 수 있다.
도 2a는 순차적 혼성화를 위해 표적 핵산(들)에 결합된 프로브(들)의 산 처리 및 제거를 사용한 본 발명의 구현예의 개략도를 나타낸다. N 개 표적 프로브는 예를 들어, 제자리 혼성화 검정에서 표적 핵산에 혼성화된다. 다이어그램은 표적 핵산에 혼성화된 표적 프로브의 임의적인 신호 증폭을 도시한다. 세포는 세포의 시각화를 용이하게 하기 위해 대조-염색될 수 있으며, 예를 들어, 핵은 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 사용하여 염색될 수 있다. 표적 프로브 및 대조-염색된 세포는 예를 들어, 이미지화에 의해 시각화되어, 표적 핵산을 검출 및 이미지화한다. RNAscope® 검정을 사용하는 경우, RNAscope® 이중 Z 프로브 및 신호는 RNAscope® 증폭 시스템을 통해 동시에 증폭된다. 산 처리 단계는 각각의 표적(들)에 결합된 표적 프로브(들)를 제거하기 위해 수행된다. N 개 표적 핵산의 하나 이상의 추가적인 세트는 1 개 이상의 라운드 동안 전체 N-플렉스 작업흐름을 반복함으로써 검출될 수 있다. 모든 표적이 검출된 후, 이미지 등록 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 이미지를 등록하여 단일 셀 해상도로 겹쳐진 이미지의 최종 합성물을 생성한다. 상기 방법으로 이용가능한 다중화의 총 수준은 라운드 당 N 개 표적(들) x K 라운드의 N-플렉싱이다. 일반적으로, N = 1 이상이고, 산 제거 단계가 포함되는 경우, K = 2 이상이다. 도 2a에 나타낸 도면에서, K = 1이면, 표적 프로브 혼성화 및 이미지화의 한 라운드만 수행해야 하므로 산 제거 단계는 필요하지 않다.
일 구현예에서, 본 발명은 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 내 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 방법을 제공하며, 여기서 세포는 세포 내 제1 표적 핵산에 혼성화된 제1 프로브를 포함하며, 여기서 산 시약은 제1 프로브와 제1 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴한다.
일 구현예에서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계는 1 회 이상 반복된다. 일 구현예에서, 방법은 세포로부터 제1 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 방법은 세포를 제2 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제2 프로브는 세포 내 제2 표적 핵산에 혼성화하며, 여기서 제2 표적 핵산은 제1 표적 핵산과 동일하거나 또는 상이하다. 일 구현예에서, 방법은 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 산 시약은 제2 프로브와 제2 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴한다. 일 구현예에서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계는 1 회 이상 반복된다. 일 구현예에서, 방법은 세포로부터 제2 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포 내 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 방법을 제공하며, 여기서 세포는 세포 내 하나 이상의 제1 표적 핵산에 혼성화된 하나 이상의 제1 프로브를 포함하며, 여기서 산 시약은 하나 이상의 제1 프로브와 하나 이상의 제1 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴한다.
일 구현예에서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계는 1 회 이상 반복된다. 일 구현예에서, 방법은 세포로부터 하나 이상의 제1 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일 구현예에서, 세포는 2 개 이상의 제1 표적 핵산에 혼성화된 2 개 이상의 제1 프로브를 포함한다. 일 구현예에서, 제1 표적 핵산은 각각 제1 프로브에 대한 혼성화에 의해 표지되고, 여기서 각 제1 표적 핵산 상의 표지는 제1 프로브에 혼성화된 다른 제1 표적 핵산(들) 상의 표지와 구별가능하다.
일 구현예에서, 방법은 세포를 하나 이상의 제2 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 하나 이상의 제2 프로브는 세포 내 하나 이상의 제2 표적 핵산에 혼성화하며, 여기서 하나 이상의 제2 표적 핵산은 하나 이상의 제1 표적 핵산과 동일하거나 또는 상이하다. 일 구현예에서, 세포는 2 개 이상의 제2 표적 핵산에 혼성화된 2 개 이상의 제2 프로브를 포함한다. 일 구현예에서, 제2 표적 핵산은 각각 제2 프로브에 대한 혼성화에 의해 표지되고, 여기서 각 제2 표적 핵산 상의 표지는 제2 프로브에 혼성화된 다른 제2 표적 핵산(들) 상의 표지와 구별가능하다.
일 구현예에서, 방법은 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 산 시약은 제2 프로브와 하나 이상의 제2 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴한다. 일 구현예에서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계는 1 회 이상 반복된다. 일 구현예에서, 방법은 세포로부터 제2 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명은 산 시약이 세포를 포함하는 샘플에 적용될 수 있다는 발견에 기반하며, 여기서 세포는 핵산을 검출하는 데 사용되는 프로브와 같은 하나 이상의 프로브에 혼성화되는 핵산을 함유하여, 산 시약이 핵산과 프로브 사이의 혼성화 파괴를 유발하도록 한다. 이전에는 산 시약이 세포 내 핵산의 무결성 및 세포의 형태를 여전히 보존하면서 세포 내에서 표적 핵산에 결합된 프로브를 제거하는 데 사용될 수 있고 세포 내 핵산의 혼성화 및 검출의 반복된 라운드를 허용할 수 있음이 인식되지 않았다. 핵산의 무결성은 검출가능한 프로브에 혼성화함으로써 검출되는 핵산의 능력을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "산 시약"은 산, 및 임의적으로 핵산 프로브와 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 효과적이어서, 표적 핵산에 결합된 프로브 사이, 및 사용되는 경우 세포 내 신호 증폭기 분자 사이의 결합을 파괴하여, 프로브 뿐만 아니라 사용되는 경우 임의의 사전-구축된 신호 증폭 복합체를 세포로부터 제거되게 하는 염을 함유하는 용액이며, 여기서 세포를 산 시약으로 처리하는 것은 표적 핵산에 대한 프로브의 혼성화의 1 개 이상의 추가적인 라운드가 세포에 적용될 수 있도록 세포의 형태 및 세포 내에서 핵산의 무결성을 보존한다. 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 산 시약을 포함하는 조성물을 제공한다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하기 위해 산 시약을 사용하여, 동일한 검출 시스템이 검출의 순차적 라운드에서 사용하게 함으로써 표적 핵산의 다중 검출을 제공한다. 본원에 기재된 바와 같이, 핵산에 결합된 프로브는 일반적으로 핵산인 적어도 일부의 구성요소를 가지며, 이에 의해 당업계에 잘 알려진 바와 같은 핵산 혼성화 방식으로 표적 핵산에 대한 프로브의 결합을 제공하는 프로브를 지칭한다. 표적 핵산에 대한 프로브의 결합을 파괴하기 위해 산 시약을 사용하는 본 발명의 방법은 혼성화 방식에 의해 표적 핵산에 결합된 임의의 프로브에 적용될 수 있음이 이해된다. 산 시약이 프로브와 표적 핵산 사이의 결합을 파괴하기 위해 사용될 수 있는 경우, 표적 핵산에 결합된 프로브는 표적 핵산에 직접적으로 결합된 단일 핵산인 프로브일 수 있거나 또는 다중 핵산 구성요소의 복합체인 프로브일 수 있음이 추가로 이해된다. 따라서, 본 발명의 산 시약에 의해 파괴되는 표적 핵산에 대한 프로브의 결합은 표적 핵산에 직접적으로 결합된 프로브 및/또는 표적 핵산에 결합된 프로브 복합체의 임의의 구성요소의 파괴될 수 있다. 다중 핵산 구성요소의 복합체인 프로브의 예는 본원에 개시된 바와 같은 신호 생성 복합체(SGC), 뿐만 아니라 표적 핵산을 검출하는 데 사용될 수 있는 임의의 유형의 프로브 및 프로브 시스템을 포함한다(예를 들어, 혼성화 연쇄 반응(HCR)(Choi 등, Development 145(12), pii: dev165753, doi: 10.1242/dev.165753 (2018); 롤링 서클 증폭(Larsson 등, Nature Methods 7(5):395-397 (2010); clampFISH(Rouhanifard 등, BioRxiv, 222794(doi.org/10.1101/222794) (2018); 및 SABER(Kishi 등, Nat. Methods 16:533-544 (2019)). 따라서, 표적 핵산에 대한 프로브의 결합을 파괴하기 위해 산 시약을 사용하는 본 발명의 방법은 표적 핵산에 결합된 임의의 원하는 프로브 또는 프로브 시스템을 파괴하는 데 사용될 수 있다. 산 처리 후, 동일한 프로브 또는 프로브 시스템은 동일하거나 또는 상이한 표적 핵산을 검출하는 데 다시 사용될 수 있다.
본 발명의 산 시약은 산을 포함한다. 산 시약에 사용하기에 적합한 예시적인 산은 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말산, 타르타르산, 시트르산 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 산 시약은 일반적으로 약 5-40% 산의 산 농도를 포함한다. 일 구현예에서, 산 시약은 20-30% 산을 포함한다. 예를 들어, 산 시약은 5-40% 산, 예를 들어, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22,%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% 또는 40% 산(% vol/vol)을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 산 시약은 5-40% 아세트산, 예를 들어, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22,%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% 또는 40% 아세트산(% vol/vol), 또는 그 사이의 농도를 포함한다.
임의적으로, 산 시약은 또한 염을 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 산 시약은 산 이외에, 구연산나트륨염분(SSC)을 포함하며, 여기서 20X SSC는 pH 7.0에서 3.0 M NaCl 및 0.3 M 시트르산나트륨에 상응한다(Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999) 참조). 일 구현예에서, 산 시약은 1X SSC 내지 13X SSC를 포함한다. 예를 들어, 산 시약은, 1X, 1.1X, 1.2X, 1.3X, 1.4X, 1.5X, 1.6X, 1.7X, 1.8X, 1.9X, 2X, 2.1X, 2.2X, 2.3X, 2.4X, 2.5X, 2.6X, 2.7X, 2.8X, 2.9X, 3X, 3.1X, 3.2X, 3.3X, 3.4X, 3.5X, 3.6X, 3.7X, 3.8X, 3.9X, 4X, 4.1X, 4.2X, 4.3X, 4.4X, 4.5X, 4.6X, 4.7X, 4.8X, 4.9X, 5X, 5.1X, 5.2X, 5.3X, 5.4X, 5.5X, 5.6X, 5.7X, 5.8X, 5.9X, 6X, 6.1X, 6.2X, 6.3X, 6.4X, 6.5X, 6.6X, 6.7X, 6.8X, 6.9X, 7X, 7.1X, 7.2X, 7.3X, 7.4X, 7.5X, 7.6X, 7.7X, 7.8X, 7.9X, 8X, 8.1X, 8.2X, 8.3X, 8.4X, 8.5X, 8.6X, 8.7X, 8.8X, 8.9X, 9X, 9.1X, 9.2X, 9.3X, 9.4X, 9.5X, 9.6X, 9.7X, 9.8X, 9.9X, 10X, 10.1X, 10.2X, 10.3X, 10.4X, 10.5X, 10.6X, 10.7X, 10.8X, 10.9X, 11X, 11.1X, 11.2X, 11.3X, 11.4X, 11.5X, 11.6X, 11.7X, 11.8X, 11.9X, 12X, 12.1X, 12.2X, 12.3X, 12.4X, 12.5X, 12.6X, 12.7X, 12.8X, 12.9X, 13X 등, 또는 그 사이의 농도에서 SSC를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 산 시약은 산 이외에, 염화나트륨, 인산나트륨, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)(SSPE)을 포함하며, 여기서 20X SSPE는 3.0 M 염화나트륨, 0.2 M 인산수소나트륨(NaH2PO4), 0.02 M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), pH 7.4에 상응한다(Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001) 참조). 일 구현예에서, 산 시약은 1X SSPE 내지 13X SSPE를 포함한다. 예를 들어, 산 시약은 1X, 1.1X, 1.2X, 1.3X, 1.4X, 1.5X, 1.6X, 1.7X, 1.8X, 1.9X, 2X, 2.1X, 2.2X, 2.3X, 2.4X, 2.5X, 2.6X, 2.7X, 2.8X, 2.9X, 3X, 3.1X, 3.2X, 3.3X, 3.4X, 3.5X, 3.6X, 3.7X, 3.8X, 3.9X, 4X, 4.1X, 4.2X, 4.3X, 4.4X, 4.5X, 4.6X, 4.7X, 4.8X, 4.9X, 5X, 5.1X, 5.2X, 5.3X, 5.4X, 5.5X, 5.6X, 5.7X, 5.8X, 5.9X, 6X, 6.1X, 6.2X, 6.3X, 6.4X, 6.5X, 6.6X, 6.7X, 6.8X, 6.9X, 7X, 7.1X, 7.2X, 7.3X, 7.4X, 7.5X, 7.6X, 7.7X, 7.8X, 7.9X, 8X, 8.1X, 8.2X, 8.3X, 8.4X, 8.5X, 8.6X, 8.7X, 8.8X, 8.9X, 9X, 9.1X, 9.2X, 9.3X, 9.4X, 9.5X, 9.6X, 9.7X, 9.8X, 9.9X, 10X, 10.1X, 10.2X, 10.3X, 10.4X, 10.5X, 10.6X, 10.7X, 10.8X, 10.9X, 11X, 11.1X, 11.2X, 11.3X, 11.4X, 11.5X, 11.6X, 11.7X, 11.8X, 11.9X, 12X, 12.1X, 12.2X, 12.3X, 12.4X, 12.5X, 12.6X, 12.7X, 12.8X, 12.9X, 13X 등, 또는 그 사이의 농도에서 SSPE를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 산 시약은 산 이외에, pH 7.8, 또는 임의적으로 7-8의 pH 범위에서 10-500　mM 인산나트륨을 포함한다. 예를 들어, 산 시약은 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, 210 mM, 220 mM, 230 mM, 240 mM, 250 mM, 260 mM, 270 mM, 280 mM, 290 mM, 300 mM, 310 mM, 320 mM, 330 mM, 340 mM, 350 mM, 360 mM, 370 mM, 380 mM, 390 mM, 400 mM, 410 mM, 420 mM, 430 mM, 440 mM, 450 mM, 460 mM, 470 mM, 480 mM, 490 mM, 500 mM 등, 또는 그 사이의 농도에서 인산나트륨을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 산 시약은 산 이외에, 10 mM 내지 6 M 염화나트륨(NaCl)을 포함한다. 예를 들어, 산 시약은 10 mM, 50 mM, 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM, 550 mM, 600 mM, 650 mM, 700 mM, 750 mM, 800 mM, 850 mM, 900 mM, 950 mM, 1 M, 1.1 M, 1.2 M, 1.3 M 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.7 M, 1.8 M, 1.9 M, 2 M, 2.1 M, 2.2 M, 2.3 M, 2.4 M, 2.5 M, 2.6 M, 2.7 M, 2.8 M, 2.9 M, 3 M, 3.1 M, 3.2 M, 3.3 M, 3.4 M, 3.5 M, 3.6 M, 3.7 M, 3.8 M, 3.9 M, 4 M, 4.1 M, 4.2 M, 4.3 M, 4.4 M, 4.5 M, 4.6 M, 4.7 M, 4.8 M, 4.9 M, 5 M, 5.1 M, 5.2 M, 5.3 M, 5.4 M, 5.5 M, 5.6 M, 5.7 M, 5.8 M, 5.9 M, 6 M 등, 또는 그 사이의 농도에서 염화나트륨을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 산 시약은 5-40% 산 및 1X-12.8X SSC를 포함한다. 산 시약은 본원에 개시된 산 및 SSC의 농도의 임의의 조합과 독립적으로 5-40% 산 및 1X-12.8X SSC를 포함할 수 있음이 이해된다. 일부 구현예에서, 산 시약은 본원에 개시된 바와 같이 20-30% 산 및 3.2X-12.8X SSC를 포함하거나, 또는 그 사이의 산 및 SSC의 증분을 독립적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 산은 아세트산이다. 일부 구현예에서, 산은 포름산이다. 일부 구현예에서, 산 시약은 20% 산 및 3.2X SSC를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 산 시약은 20% 산 및 6.4X SSC를 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 산 시약은 20% 산 및 12.8X SSC를 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 산 시약은 30% 산 및 3.2X SSC를 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 산 시약은 30% 산 및 6.4X SSC를 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 산 시약은 30% 산 및 12.8X SSC를 포함한다. 특정 구현예에서, 산 시약은 20% 아세트산 및 3.2X SSC를 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 산 시약은 20% 아세트산 및 6.4X SSC를 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 산 시약은 20% 아세트산 및 12.8X SSC를 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 산 시약은 30% 아세트산 및 3.2X SSC를 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 산 시약은 30% 아세트산 및 6.4X SSC를 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 산 시약은 30% 아세트산 및 12.8X SSC를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포 내 표적 핵에 혼성화된 프로브 사이의 혼성화 파괴에 효과적이도록 세포에 산 시약을 적용하는 것과 관련한 본 발명의 방법은 실온에서 수행된다. 다른 구현예에서, 산 시약은 실온 바로 아래 또는 위의 온도에서 세포에 적용될 수 있다. 따라서, 세포 내 표적 핵산에 혼성화된 프로브 사이의 파괴에 효과적이도록 세포에 산 시약을 적용하는 본 발명의 방법은 예를 들어, 약 4℃ 내지 약 40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 방법은 4℃, 5℃, 6℃, 7℃, 8℃, 9℃, 10℃, 11℃, 12℃, 13℃, 14℃, 15℃, 16℃, 17℃, 18℃, 19℃, 20℃, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃, 또는 40℃의 온도, 또는 그 사이의 증분에서 수행될 수 있다.
세포 내 표적 핵에 혼성화된 프로브 사이의 혼성화 파괴에 효과적이도록 세포에 산 시약을 적용하는 것과 관련한 본 발명의 방법에서, 방법은 일정 기간 동안 수행되고, 임의적으로 반복된다. 산 시약은 일반적으로 1-30 분, 또는 그 이상 동안 세포와 접촉된다. 예를 들어, 산 시약은 1 분, 2 분, 3 분, 4 분, 5 분, 6 분, 7 분, 8 분, 9 분, 10 분, 11 분, 12 분, 13 분, 14 분, 15 분, 16 분, 17 분, 18 분, 19 분, 20 분, 21 분, 22 분, 23 분, 24 분, 25 분, 26 분, 27 분, 28 분, 29 분, 30 분, 또는 그 이상 등, 또는 그 사이의 증분 동안 세포와 접촉된다. 일부 구현예에서, 산 시약 처리는 1 내지 10 회 반복된다. 예를 들어, 산 시약 처리는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 11 회 수행된다(즉, 최대 10 회 반복된다). 또 다른 예에서, 산 시약 처리는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 회 수행된다(즉, 최대 5 회 반복된다). 일부 구현예에서, 산 시약은 산 시약을 제거하거나(예를 들어, 세포로부터 산 시약을 흡입함으로써) 또는 세포를 세척(예를 들어, 산 시약의 적용 사이에 세포를 세척)하지 않으면서 세포와 순차적으로 접촉된다. 임의적으로, 산 시약은 예를 들어, 세포로부터 산 시약을 흡입하거나 또는 세포를 적합한 완충액으로 세척함으로써 세포와의 접촉으로부터 제거될 수 있다. 적합한 세척 완충액은 제자리 혼성화 검정에서 일상적으로 사용되는 완충액을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
세포 내 표적 핵산에 결합된 프로브의 제거를 위한 조건은 본원에 개시된 바와 같이, 산 시약의 구성요소 및 구성요소의 농도, 산 시약과 세포의 배양 시간, 및 배양이 반복되는 횟수에 따라 용이하게 결정될 수 있음이 이해된다. 세포로부터 프로브 제거의 효과는 잔류 프로브가 검출될 수 있는지를 보기 위해 표적 핵산을 검출하는 데 사용되는 동일한 방법을 사용하여 세포를 분석함으로써 용이하게 결정될 수 있다(실시예 I 및 II 참조). 잔류 프로브가 여전히 존재하는 경우, 산 시약 처리는 이전에 검출된 프로브가 더 이상 검출되지 않거나 또는 표지화의 후속 라운드에서 동일한 표지로 표적 핵산의 검출가능한 표지화를 허용하기에 충분히 낮은 수준에서 검출될 때까지만 반복되어야 한다. 유사하게, 핵산의 후속 검출을 허용하기 위해 세포 형태 및 세포 내 핵산의 무결성을 보존하면서 세포를 산 시약으로 처리할 수 있는 횟수는 주어진 산 시약 및 주어진 조건 세트 하에 세포의 반복된 산 시약 처리를 수행하고, 예를 들어, 세포 내 양성 대조군 핵산을 검출하는 능력을 결정하거나 또는 세포가 산 시약으로 1 회 이상 처리된 후 유사한 세포 형태가 세포에서 검출될 수 있는지를 결정함으로써 표적 핵산이 여전히 검출될 수 있는지 여부를 결정함으로써 용이하게 결정될 수 있다(실시예 I 및 II 참조). 일단 배양 시간 및 주어진 산 시약을 적용하는 반복 횟수의 조건 세트가 결정되면, 조건은 다른 세포 샘플에 적용될 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 산 시약 및 조건의 범위를 테스트하였고 표적 핵산 검출의 신규 라운드가 적용될 수 있도록 프로브와 세포 형태 및 핵산 무결성이 보존된 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴하는 데 효과적인 것으로 나타났다(실시예 III 참조).
일부 구현예에서, 단일 표적 핵산은 각 라운드에서 검출된다. 이러한 경우, 샘플은 다중 표적 핵산에 대한 복수의 표적 프로브 세트와 접촉되기 보다는, 샘플은 표적 핵산에 특이적으로 혼성화할 수 있는 표적 프로브 세트와 접촉되다. 다른 구현예에서, 다중 표적은 본원에 개시된 바와 같이 단일 라운드에서 검출된다.
따라서, 본 발명은 다중 핵산 표적의 고유한 표지화 및 표적 핵산의 더 높은 다중 검출을 달성하기 위해 표적 핵산 서브세트의 반복 검출의 사용, 이어서 표적 핵산의 더 높은 다중 검출을 달성하기 위해 결합된 프로브를 제거하기 위한 산 시약 처리에 관한 것이다. 반복 라운드에서 표적 핵산의 다중 검출을 위한 본 발명의 방법의 효과는 실시예에 기재된 바와 같이 본원에 입증되었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 일 구현예에서 본 발명의 방법은 다중 표적 핵산에 대한 표적 프로브 및 표적 핵산의 검출을 위한 증폭 시스템의 동시 혼성화를 이용한다. 그러나, 모든 표적 핵산을 한번에 검출하기 보다, 표적 핵산의 표지화 및 검출은 반복 라운드에서 수행되며, 여기서 표적 프로브가 결합하는 표적 핵산 서브세트만이 제1 라운드에서 검출된다. 이는 제1 라운드에서 표적 1-4의 검출로서 도 1에 개략적으로 도시된다. 제1 라운드에서 표적 핵산에 결합된 검출가능한 표지(도 1의 표적 1-4)의 이미지화 후, 절단가능한 표지를 이용함으로써 표지가 샘플로부터 제거된다(도 1의 "형광단 절단"). 일단 제1 라운드에서 표적 핵산에 결합된 표지가 절단되면, 일반적으로 표적 핵산의 상이한 서브세트를 검출하는 제2 그룹의 표지를 첨가함으로써 검출의 제2 라운드가 적용된다(도 1에서 표적 5-8로 도시됨). 표적 핵산으로부터 표지의 제1 라운드를 절단함으로써, 동일한 검출가능한 표지(도 1에서 형광단으로 도시됨)가 제1 라운드에서와 같이 제2 라운드에서 사용될 수 있다. 표적 핵산에 결합된 표지를 절단하고 표적 핵산의 신규 서브세트를 검출하기 위해 표지를 첨가하는 이러한 주기는 이전에 기재된 방법보다 동일한 샘플 및 동일한 세포에서 더 많은 핵산 표적의 검출을 허용한다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, 도 1에 도시된 방법의 신규 라운드가 반복될 수 있도록 표적 프로브 및 증폭 시스템(예를 들어, SGC)을 제거하기 위한 샘플의 산 처리에 의해 다중화의 추가 층(들)이 달성될 수 있다.
도 2b는 순차적 혼성화를 위해 표적 핵산에 결합된 프로브의 산 처리 및 제거의 개략도를 나타낸다. N 개 표적 프로브는 예를 들어, RNAscope® HiPlex 검정과 같은 제자리 혼성화 검정에서 표적 핵산에 혼성화된다. N 개 표적 프로브는 표적 서열에 혼성화되고(예를 들어, RNAscope® 이중 Z 프로브), 신호는 동시에 증폭된다(예를 들어, RNAscope® 증폭 시스템 사용). 도 2b의 다이어그램은 표적 핵산에 혼성화된 표적 프로브의 임의적인 신호 증폭을 도시한다. 세포는 세포의 시각화를 용이하게 하기 위해 대조-염색될 수 있으며, 예를 들어, 핵은 4',6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)을 사용하여 염색될 수 있다. N 개 표적 핵산은 표지화, 예를 들어, 형광 표지화, 이미지화 및 검출가능한 표지 절단, 예를 들어, 형광 표지 절단의 반복 라운드를 통해 검출된다. 다이어그램에서, N 개 표적 핵산은 N 개 표적 프로브에 혼성화되고 반복적으로 검출되어, N 개 표적의 서브세트(N 개 표적서브세트 1)가 표지화 및 검출되고, 표지가 표지된 핵산의 서브세트로부터 절단된(L 라운드의 표지 프로브 혼성화, 여기서 L = 1) 다음, N 개 표적의 제2 서브세트(N 개 표적서브세트 2)가 표지화 및 검출되고, 표지가 표지된 핵산의 서브세트로부터 절단되는(L 라운드의 표지 프로브 혼성화, 여기서 L=2) 등, N 개 표적 핵산이 모두 검출될 때까지 하도록 한다. 모든 N 개 표적 핵산이 표지화의 원하는 라운드 수에서 검출된 후(L = 표지화의 원하는 라운드), 혼성화된 N 개 표적 프로브를 제거(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 신호 생성 복합체(SGC)의 제거)하기 위해 산 처리 단계가 수행된다. N 개 표적 핵산의 하나 이상의 추가적인 세트(예를 들어, N' 표적 핵산, N'' 표적 핵산 등)는 1 개 이상의 라운드 동안 전체 N-플렉스 작업흐름을 반복함으로써 검출될 수 있다. 모든 표적이 검출된 후, 이미지 등록 소프트웨어 알고리즘을 사용하여 이미지를 등록하여 단일-셀 해상도로 겹쳐진 이미지의 최종 합성물을 생성한다. 상기 방법으로 이용가능한 다중화의 총 수준은 라운드 당 N 개 표적 핵산 x K 라운드의 N-플렉싱이다(여기서 "N-플렉싱"은 "N 개 표적 프로브 혼성화"에서 "프로브 및 증폭기의 산 제거"로의 흐름 또는, 최종 라운드에서, 마지막 "대조 염색 및 이미지화" 단계를 지칭한다. 일반적으로, N = 1 이상이고, 산 제거 단계가 포함되는 경우, K = 2 이상이다. 도 2b에 나타낸 도면에서, K = 1이면, 표지 프로브 혼성화, 이미지화 및 형광단 절단의 L 라운드만 수행해야 하므로 프로브 및 증폭기의 산 제거 단계는 필요하지 않다. 또한, N 개 표적 핵산의 최종 검출 라운드에서, 추가적인 N 개 표적 핵산이 검출되지 않은 경우(즉, K = N최종, 여기서 "N"은 K 라운드의 총 수임), 산 처리 단계가 필요하지 않음이 이해된다. 따라서, 도 2b에 제시된 개략도에서, 모든 원하는 표적 핵산이 검출 및 이미지화된 후, 추가 표지 절단 단계 및/또는 산 처리 단계에 대한 필요성 없이, 표적 핵산의 분석을 위해 이미지 등록이 수행된다.
일반적으로, 표적 핵산의 다중 검출을 위해 별개의 구별가능한 표지를 사용하는 경우, 동시에 구별될 수 있는 별개의 표지의 수를 제한한다. 예를 들어, 형광 표지의 경우, 다중 표지를 동시에 검출하기 위해, 형광 현미경이 형광단을 동시에 구별할 수 있도록 형광단으로부터 다중 방출의 스펙트럼 분리가 있어야 한다. 형광단으로부터 방출의 스펙트럼 분리에 대한 필요성은 동시에 시각화될 수 있는 형관단의 수를 제한한다. 본 발명은 표지를 반복적으로 검출함으로써 이 제한을 피하여, 동일한 형광단이 표적 핵산을 검출하기 위해 순차적 라운드에서 사용될 수 있도록 한다.
본 발명의 방법에 사용될 수 있는 검출 시스템의 직교 특성은 도 6에 도시되어 있다. 도 6a는 본원에서 신호 생성 복합체(SGC)로도 지칭되는 3 개의 예시적인 표적 핵산 및 각각의 직교 검출 시스템을 갖는 하나의 구현예를 나타낸다. 도 6a에 도시된 바와 같이, 표적 핵산 각각은 특이적 표적 프로브 쌍(TP1a 및 TP1b, TP2a 및 TP2b, TP3a 및 TP3b)에 혼성화되며, 차례로 각각의 특이적 전증폭기(PA1, PA2, PA3)에 혼성화되며, 차례로 각각의 특이적 복수의 증폭기(AMP1, AMP2, AMP3)에 혼성화되며, 차례로 각각의 특이적 복수의 표지 프로브(LP1, LP2, LP3)에 혼성화된다. 도 6b는 2 개의 예시적인 표적 핵산 및 각각의 직교 검출 시스템을 갖는 또 다른 구현예를 나타낸다. 도 6b에 도시된 바와 같이, 표적 핵산 각각은 특이적 표적 프로브 쌍(TP1a 및 TP1b, TP2a 및 TP2b)에 혼성화되며, 차례로 각각의 특이적 전-전증폭기(PPA1, PPA2)에 혼성화되며, 차례로 각각의 특이적 복수의 전증폭기(PA1, PA2)에 혼성화되며, 차례로 각각의 특이적 복수의 증폭기(AMP1, AMP2)에 혼성화되며, 차례로 각각의 특이적 복수의 표지 프로브(LP1, LP2)에 혼성화된다. 도 6c는 2 개의 예시적인 표적 핵산 및 각각의 직교 검출 시스템을 갖는 또 다른 구현예를 나타낸다. 도 6c에 도시된 바와 같이, 표적 핵산 각각은 특이적 표적 프로브 쌍(TP1a 및 TP1b, TP2a 및 TP2b)에 혼성화되며, 차례로 각각의 특이적 전-전증폭기 쌍(PPA1a 및 PPA1b, PPA2a 및 PPA2b)에 혼성화되며, 차례로 각각의 특이적 전증폭기(PA1 및 PA2)에 둘 다 혼성화되며, 차례로 각각의 특이적 증폭기(AMP1 및 AMP2)에 혼성화되며, 차례로 각각의 특이적 표지 프로브(LP1 및 LP2)에 혼성화된다. 단순화를 위해, 복수의 증폭기가 전증폭기 중 하나에 결합되는 것으로 도시되지만, 증폭기는 전증폭기 각각에 결합할 수 있음이 이해된다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 각 핵산 표적은 구성요소의 결합이 하나의 특이적 복합체에 대한 결합을 제공하지만 또 다른 복합체에 결합하지 않는 고유한 결합 부위에 의해 매개되는 특이적 검출 시스템을 갖는다. 특이적 표적 핵산에 대한 SGC의 구성요소의 혼성화를 위한 이러한 고유한 결합 부위는 결합 부위(핵산 서열)를 당업계에 잘 알려져 있고 본원에 기재된 바와 같이 원하는 특이성을 제공하도록 설계하여 달성될 수 있다. 각 표적이 고유하게 표지되는 이 직교 검출 시스템은 동일한 샘플에서 다중 표적 핵산의 검출을 허용한다.
본원에 기재된 바와 같은 일부 구현예에서, 방법은 다중 표적 핵산이 동일한 샘플 및 심지어 동일한 세포에서도 분석될 수 있도록 표적 핵산을 고유하게 표지하기 위해 직교 증폭 시스템을 활용한다. 본 발명은 각 표적 핵산이 고유하게 식별될 수 있도록 특정 표적 핵산에 특이적인 신호 생성 복합체(SGC)의 구축을 활용한다. 일 구현예에서, 샘플은 표적 핵산에 특이적으로 혼성화할 수 있는 표적 프로브 쌍을 포함하는 표적 프로브 세트와 접촉된다. 샘플은 또한 각 표적 프로브 세트에 특이적인 전증폭기를 포함하고 관련 표적 핵산에 혼성화되는 표적 프로브 쌍에 혼성화할 수 있는 전증폭기 세트와 접촉된다. 이러한 구현예는 도 6a에 개략적으로 예시되어 있다. 샘플은 또한 증폭기와 접촉되며, 여기서 증폭기는 표적 핵산에 특이적인 표적 프로브 쌍에 특이적인 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 서브세트를 포함한다. 따라서, 각 표적 핵산은 표적 핵산 사이의 구별을 제공하는 SGC, 표적 프로브 쌍(들), 전증폭기, 및 증폭기의 고유한 구성요소의 어셈블리를 갖는다. 추가적인 구현예에서, 전-전증폭기는 표적 프로브 쌍과 전증폭기 사이의 추가적인 증폭 층으로서 표적 프로브 쌍에 결합할 수 있다(도 5b 및 6b 참조).
또 다른 구현예에서, 샘플은 표적 핵산에 특이적으로 혼성화할 수 있는 표적 프로브 쌍을 포함하는 표적 프로브 세트와 접촉된다. 샘플은 또한 각 표적 프로브 세트에 특이적인 전-전증폭기 쌍을 포함하고 관련 표적 핵산에 혼성화되는 표적 프로브 쌍에 혼성화할 수 있는 전-전증폭기 세트와 접촉된다. 이러한 구현예는 도 6c에 개략적으로 예시되어 있다. 샘플은 또한 표적에 특이적인 표적 프로브 쌍에 특이적인 전-전증폭기의 두 쌍에 특이적으로 결합할 수 있는 전증폭기를 포함하는 전증폭기 세트와 접촉된다. 샘플은 또한 증폭기와 접촉되며, 여기서 증폭기는 표적 핵산에 특이적인 표적 프로브 쌍에 특이적인 전-전증폭기 쌍에 특이적인 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 서브세트를 포함한다. 따라서, 각 표적 핵산은 표적 핵산 사이의 구별을 제공하는 SGC, 표적 프로브 쌍, 전-전증폭기, 전증폭기, 및 증폭기의 고유한 구성요소의 어셈블리를 갖는다.
표적 핵산을 검출하기 위해, 표지 프로브 세트가 샘플과 접촉된다. 샘플을 모든 표적 핵산을 검출할 수 있는 표지 프로브와 접촉시키는 대신, 샘플은 표적 핵산의 서브세트를 검출할 수 있는 표지 프로브 세트와 접촉된다. 따라서 모든 표적 핵산을 한번에 검출하기 보다는, 표적 핵산은 검출의 반복 라운드에서 검출된다. 한 라운드 내에서, 각각의 표적 핵산에 특이적인 표지 프로브는 서로 구별가능하여, 적용된 표지 프로브의 제1 라운드와 연관된 모든 표적 핵산이 동시에 검출될 수 있도록 한다.
단일 라운드에서 동시에 검출될 수 있는 표적 핵산의 수는 표지 프로브에서 사용되는 표지의 유형 및 이러한 표지가 구별될 수 있는 방법에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 형광 표지를 사용하는 경우, 단일 라운드에 사용된 형광단은 구별가능할 수 있어야 하므로, 형광단의 방출의 스펙트럼 분리가 있어야 한다. 동시에 구별될 수 있는 형광단의 수는 검출 시스템 및 중첩 방출된 형광단을 구별하는 데 사용될 수 있는 필터 및/또는 소프트웨어의 이용가능성에 따라 최대 10 개이며, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 구별될 수 있다면 스펙트럼 분리를 갖는 것으로 간주된다. 다중 형광 표지를 검출하기 위한 이미지화 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Vectra Polaris, Perkin Elmer, 매사추세츠주 월섬 소재).
일 구현예에서, 본 발명의 방법은 라운드 당 하나 이상의 표적 핵산의 검출에 적용되며, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개, 또는 그 이상의 표적 핵산이 각 라운드에서 검출된다. 본원에 개시된 바와 같이, 당업자는 샘플 내 표적 핵산의 원하는 수의 검출을 허용하기 위해 적합한 별개의 표지 및 적합한 검출 라운드 수를 선택할 수 있다.
후속 라운드에서 검출의 제1 라운드에 사용된 표지의 구별가능한 특성의 이점을 취하기 위해, 일부 구현예에서 표지 프로브 상의 표지는 절단가능하다. 따라서, 일단 표적 핵산 서브세트의 검출의 제1 라운드가 수행되면, 표적 핵산에 부착된 표지는 표적 핵산의 제1 서브세트로부터 표지를 제거하기 위해 절단된다. 표지 프로브에 대한 표지의 예시적인 절단가능한 접합체가 본원에 기재되어 있다. 일단 표지가 절단되면, 샘플을 일반적으로 제1 라운드에서 검출된 것과 상이한 표적 핵산에 특이적인 표지 프로브의 제2 세트와 접촉시킴으로써 검출의 제2 라운드가 수행된다. 제1 라운드의 표지가 각각의 표적 핵산으로부터 절단되었기 때문에, 동일한 구별가능한 표지가 이제 검출의 제2 라운드의 표지 프로브에 사용될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 결합된 프로브 및 증폭 시스템(예를 들어, SGC)을 제거하기 위한 샘플의 산 처리에 의해 추가 다중화가 달성될 수 있어서 상기 단계가 상이한 표적 핵산 세트를 검출하기 위해 반복될 수 있도록 한다. 동일한 표지가 표적 핵산 서브세트 검출의 반복 라운드에 사용될 수 있지만, 동일한 라운드에서 사용되는 표지가 구별가능하는 한, 동일한 표지가 검출의 순차적 라운드에 사용될 필요가 없음이 이해된다.
일단 표적 핵산 서브세트 검출의 제2 라운드가 수행되면, 임의적으로 하나 이상의 추가적인 라운드의 절단, 표지화 및 검출이 샘플에 적용될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산의 제2 서브세트의 검출 후, 표지는 표적 핵산의 제2 서브세트 상에 어셈블리된 SGC로부터 절단될 수 있고 표지화 및 검출의 제3 라운드는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 구별되는 표적 핵산의 제3 서브세트를 검출하기 위해 수행될 수 있다. 표적 핵산 검출의 이러한 반복 라운드는 원하는 수의 검출 반복을 사용하여 원하는 수의 다중 표적 핵산을 검출하기 위해 수행될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 추가 다중화는 결합된 프로브 및 증폭 시스템(예를 들어, SGC)을 제거하기 위한 샘플의 산 처리에 의해 달성될 수 있어서 상기 단계가 원하는 수의 표적 핵산을 검출하기 위해 동일하거나 또는 상이한 표적 핵산 세트를 검출하도록 반복될 수 있도록 한다. 검출의 최종 반복 라운드에서, 검출의 추가 라운드가 수행되지 않기 때문에, 표지 프로브가 절단가능한 표지를 포함할 필요가 없음이 이해된다. 따라서, 검출의 최종 반복 라운드에서, 절단가능한 표지를 포함하는 표지 프로브를 사용하는 것은 임의적이며, 즉, 표지 프로브는 절단가능한 표지를 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 일반적으로 상이한 표적 핵산이 각 라운드에서 검출되도록 검출 라운드가 수행된다. 그러나, 검출의 후속 라운드는 이전 라운드의 모든 핵산까지 포함하는 이전 라운드와 중첩하는 하나 이상의 표적 핵산(들)의 검출을 포함할 수 있어서, 동일한 표적 핵산 또는 중첩 표적 핵산이 하나 이상의 순차적 라운드에서 검출되도록 함이 이해된다. 순차적 라운드에서 동일한 표적 핵산 또는 중첩 표적 핵산의 이러한 검출은 동일한 표적 핵산이 미리 결정된 서열 색상의 각 라운드에서 검출된 경우 각 표적 핵산에 대한 시간적 바코드를 생성하는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 예를 들어, 순차적 바코드 형광 제자리 혼성화(seqFISH)로 이전에 기재되었다(Shah 등, Neuron 92(2):342-357 (2016) 참조). 따라서, 세포 내 표적 핵산에 결합된 프로브를 제거하기 위해 산 시약을 사용하는 본 발명의 방법은 seqFISH와 같은 방법을 적용하여 더 높은 수준의 다중화를 위한 바코드를 생성하기 위해 다중 라운드의 혼성화를 수행하는 효율적인 방법을 제공할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 세포 내 복수의 표적 핵산의 다중 검출 방법을 제공한다: (A) 복수의 표적 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 하나 이상의 표적 핵산에 특이적인 프로브 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표적 핵산에 대한 프로브는 다음을 포함하는 것인, 단계: (a) 표적 프로브 세트로, 상기 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브의 하나 이상의 쌍을 포함하는 것; (b) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기는 표적 프로브의 쌍에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (c) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기는 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; 및 (d) 표지 프로브 세트로, 상기 표지 프로브 세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하는 것; (B) 각각의 표적 핵산에 결합된 검출가능한 표지를 검출하는 단계; 및 (C) 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계(도 2a 및 6a 참조).
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 세포 내 복수의 표적 핵산의 다중 검출 방법을 제공한다: (A) 복수의 표적 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 하나 이상의 표적 핵산에 특이적인 프로브 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표적 핵산에 대한 프로브는 다음을 포함하는 것인, 단계: (a) 표적 프로브 세트로, 상기 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브의 하나 이상의 쌍을 포함하는 것; (b) 전-전증폭기 세트로, 상기 전-전증폭기 세트는 하나 이상의 전-전증폭기를 포함하며, 상기 각 전-전증폭기는 표적 프로브의 하나 이상의 쌍에 대한 결합 부위를 포함하는 것; (c) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기는 전-전증폭기에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (d) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기는 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; 및 (e) 표지 프로브 세트로, 상기 표지 프로브 세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하는 것; (B) 각각의 표적 핵산에 결합된 검출가능한 표지를 검출하는 단계; 및 (C) 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계(예를 들어, 도 2a 및 6b 참조).
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 세포 내 복수의 표적 핵산의 다중 검출 방법을 제공한다: (A) 복수의 표적 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플 하나 이상의 표적 핵산에 특이적인 프로브 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표적 핵산에 대한 프로브는 다음을 포함하는 것인, 단계: (a) 표적 프로브 세트로, 상기 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브의 하나 이상의 쌍을 포함하는 것; (b) 전-전증폭기 세트로, 상기 전-전증폭기 세트는 전-전증폭기의 하나 이상의 쌍을 포함하며, 상기 전-전증폭기 쌍의 각 전-전증폭기는 표적 프로브 쌍의 표적 프로브 중 하나에 대한 결합 부위를 포함하는 것; (c) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기는 전-전증폭기 쌍에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (d) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기는 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; 및 (e) 표지 프로브 세트로, 상기 표지 프로브 세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하는 것; (B) 각각의 표적 핵산에 결합된 검출가능한 표지를 검출하는 단계; 및 (C) 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계(예를 들어, 도 2a 및 6c 참조).
일 구현예에서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계는 1 회 이상 반복된다. 일 구현예에서, 방법은 단계 (A) 및 (B)를 반복하거나 또는 단계 (A), (B) 및 (C)를 1 회 이상 반복하는 것을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 복수의 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다: (A) 복수의 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 복수의 표적 프로브 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 각 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브 쌍을 포함하는 것인, 단계; (B) 샘플을 전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전증폭기는 각 표적 프로브 세트에 특이적인 전증폭기를 포함하며, 상기 각 전증폭기는 표적 프로브 세트 중 하나의 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계; (C) 샘플을 증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 증폭기 세트는 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 각 서브세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 표적 프로브 세트에 특이적인 전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계; (D) 샘플을 표지 프로브의 제1 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 중 하나에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; (E) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제1 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제1 서브세트를 검출하는 단계; (F) 표적 핵산의 제1 서브세트에 결합된 표지 프로브의 제1 세트로부터 표지를 절단하는 단계; (G) 샘플을 표지 프로브의 제2 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 임의적으로 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; (H) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제2 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제2 서브세트를 검출하는 단계로, 상기 복수의 표적 핵산을 검출하는 것인, 단계; 및 (I) 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계(예를 들어, 도 2b 및 6a 참조, 여기서 L=2이고, 여기서 표지는 SGC로부터 절단됨).
이러한 방법의 일 구현예에서, 방법은 단계 (I) 전에 다음을 포함한다: (J) 표적 핵산의 제2 세트에 결합된 표지 프로브의 제2 세트로부터 표지를 절단하는 단계; (K) 샘플을 표지 프로브의 제3 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 임의적으로 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; 및 (L) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제3 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제3 서브세트를 검출하는 단계(예를 들어, 도 2b 및 6a 참조, 여기서 L=3이고, 여기서 표지는 SGC로부터 절단됨).
일 구현예에서, 방법은 단계 (J) 내지 (L)을 1 회 이상 반복하는 것을 포함한다(예를 들어, 도 2b 및 6a 참조, 여기서 L=4+이고, 여기서 표지는 SGC로부터 절단됨).
임의적으로, 본 발명의 방법에서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계는 1 회 이상 반복된다.
일 구현예에서, 방법은 단계 (A) 내지 (I) 또는 단계 (A) 내지 (H), (J) 내지 (L) 및 (I)를 1 회 이상 반복하는 것을 추가로 포함한다(예를 들어, 도 2b 및 6a 참조, 여기서 K=2+이고, 여기서 표지는 SGC로부터 절단됨). 이러한 방법의 일 구현예에서, 방법은 단계 (A) 내지 (H) 또는 단계 (A) 내지 (H) 및 (J) 내지 (L)을 반복하는 것을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 복수의 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다: (A) 복수의 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 복수의 표적 프로브 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 각 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브 쌍을 포함하는 것인, 단계; (B) 샘플을 전-전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전-전증폭기 세트는 복수의 전-전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전-전증폭기는 각 표적 프로브 세트에 특이적인 전-전증폭기를 포함하며, 상기 각 전-전증폭기는 표적 프로브 세트 중 하나의 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 전증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계; (C) 샘플을 전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전증폭기 세트는 각 전-전증폭기에 특이적인 전증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 전증폭기의 각 서브세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기의 서브세트의 전증폭기는 표적 프로브 세트에 특이적인 전-전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계; (D) 샘플을 증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 증폭기 세트는 전증폭기의 각 서브세트에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 각 서브세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 전증폭기의 서브세트 중 하나의 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계; (E) 샘플을 표지 프로브의 제1 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; (F) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제1 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제1 서브세트를 검출하는 단계; (G) 표적 핵산의 제1 서브세트에 결합된 표지 프로브의 제1 세트로부터 표지를 절단하는 단계; (H) 샘플을 표지 프로브의 제2 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 임의적으로 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; (I) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제2 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제2 서브세트를 검출하는 단계로, 상기 복수의 표적 핵산을 검출하는 것인, 단계; 및 (J) 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계(예를 들어, 도 2b 및 6b 참조, 여기서 L=2이고, 여기서 표지는 SGC로부터 절단됨).
일 구현예에서, 방법은 단계 (J) 전에 다음을 포함한다: (K) 표적 핵산의 제2 세트에 결합된 표지 프로브의 제2 세트로부터 표지를 절단하는 단계; (L) 샘플을 표지 프로브의 제3 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 임의적으로 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; 및 (M) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제3 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제3 서브세트를 검출하는 단계(예를 들어, 도 2b 및 6b 참조, 여기서 L=3이고, 여기서 표지는 SGC로부터 절단됨).
일 구현예에서, 방법은 단계 (K) 내지 (M)을 1 회 이상 반복하는 것을 포함한다(예를 들어, 도 2b 및 6b 참조, 여기서 L=4+이고, 여기서 표지는 SGC로부터 절단됨).
일 구현예에서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계는 1 회 이상 반복된다.
일 구현예에서, 방법은 단계 (A) 내지 (J) 또는 단계 (A) 내지 (I), (K) 내지 (M) 및 (J)를 1 회 이상 반복하는 것을 추가로 포함한다(예를 들어, 도 2b 및 6b 참조, 여기서 K=2+이고, 여기서 표지는 SGC로부터 절단됨). 이러한 방법의 일 구현예에서, 방법은 단계 (A) 내지 (I) 또는 단계 (A) 내지 (I) 및 (K) 내지 (M)을 반복하는 것을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 복수의 핵산을 검출하는 방법을 제공한다: (A) 복수의 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 복수의 표적 프로브 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 각 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브 쌍을 포함하는 것인, 단계; (B) 샘플을 전-전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전-전증폭기 세트는 전-전증폭기의 복수의 쌍을 포함하고, 상기 전-전증폭기 세트는 표적 프로브 세트의 표적 프로브 쌍 각각에 특이적인 전-전증폭기 쌍을 포함하고, 상기 전-전증폭기 쌍의 각 전-전증폭기는 표적 프로브 세트의 표적 프로브 쌍의 표적 프로브 중 하나에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 전-전증폭기는 전증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계; (C) 샘플을 전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전증폭기는 전-전증폭기의 각 쌍에 특이적인 전증폭기를 포함하며, 상기 각 전증폭기는 전-전증폭기 세트의 전-전증폭기 쌍 중 하나에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계; (D) 샘플을 증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 증폭기 세트는 전-전증폭기의 각 쌍에 특이적인 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 전-전증폭기 쌍에 특이적인 전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계; (E) 샘플을 표지 프로브의 제1 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; (F) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제1 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제1 서브세트를 검출하는 단계; (G) 표적 핵산의 제1 서브세트에 결합된 표지 프로브의 제1 세트로부터 표지를 절단하는 단계; (H) 샘플을 표지 프로브의 제2 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 임의적으로 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; (I) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제2 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제2 서브세트를 검출하는 단계로, 상기 복수의 표적 핵산을 검출하는 것인, 단계; 및 (J) 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계(예를 들어, 도 2b 및 6c 참조, 여기서 L=2이고, 여기서 표지는 SGC로부터 절단됨).
일 구현예에서, 방법은 단계 (J) 전에 다음을 포함한다: (K) 표적 핵산의 제2 세트에 결합된 표지 프로브의 제2 세트로부터 표지를 절단하는 단계; (L) 샘플을 표지 프로브의 제3 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 임의적으로 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; 및 (M) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제3 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제3 서브세트를 검출하는 단계(예를 들어, 도 2b 및 6c 참조, 여기서 L=3이고, 여기서 표지는 SGC로부터 절단됨).
일 구현예에서, 방법은 단계 (K) 내지 (M)을 1 회 이상 반복하는 것을 포함한다(예를 들어, 도 2b 및 6c 참조, 여기서 L=4이고, 여기서 표지는 SGC로부터 절단됨).
일 구현예에서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계는 1 회 이상 반복된다.
일 구현예에서, 방법은 단계 (A) 내지 (J) 또는 단계 (A) 내지 (I), (K) 내지 (M) 및 (J)를 1 회 이상 반복하는 것을 추가로 포함한다(예를 들어, 도 2b 및 6c 참조, 여기서 K=2+이고, 여기서 표지는 SGC로부터 절단됨). 이러한 방법의 일 구현예에서, 방법은 단계 (A) 내지 (I) 또는 단계 (A) 내지 (I) 및 (K) 내지 (M)을 반복하는 것을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 복수의 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다: (A) 복수의 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 복수의 표적 프로브 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 각 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브 쌍을 포함하는 것인, 단계; (B) 샘플을 전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전증폭기는 각 표적 프로브 세트에 특이적인 전증폭기를 포함하며, 상기 각 전증폭기는 표적 프로브 세트 중 하나의 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계; (C) 샘플을 증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 증폭기 세트는 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 각 서브세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 표적 프로브 세트에 특이적인 전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계; (D) 샘플을 표지 프로브의 제1 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; (E) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제1 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제1 서브세트를 검출하는 단계; (F) 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 표적 프로브, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮은 온도에서 샘플을 배양하여, 표적 핵산의 제1 서브세트에 결합된 표지 프로브의 제1 세트로부터 표지를 제거하는 단계; (G) 샘플을 표지 프로브의 제2 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 임의적으로 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; (H) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제2 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제2 서브세트를 검출하는 단계로, 상기 복수의 표적 핵산을 검출하는 것인, 단계; 및 (I) 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계(예를 들어, 도 2b 및 6a 참조, 여기서 L=2이고, 여기서, SGC로부터 표지를 절단하기보다, 표지 프로브는 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 SGC의 다른 구성요소 사이의 용융 온도보다 낮은 온도를 사용하여 SGC로부터 제거됨).
일 구현예에서 방법은 단계 (I) 전에 다음을 포함한다: (J) 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 표적 프로브, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮은 온도에서 샘플을 배양하여, 표적 핵산의 제2 세트에 결합된 표지 프로브의 제2 세트로부터 표지를 제거하는 단계; (K) 샘플을 표지 프로브의 제3 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 임의적으로 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; 및 (L) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제3 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제3 서브세트를 검출하는 단계(예를 들어, 도 2b 및 6a 참조, 여기서 L=3이고, 여기서, SGC로부터 표지를 절단하기보다, 표지 프로브는 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 SGC의 다른 구성요소 사이의 용융 온도보다 낮은 온도를 사용하여 SGC로부터 제거됨).
일 구현예에서 방법은 단계 (J) 내지 (L)을 1 회 이상 반복하는 것을 포함한다(예를 들어, 도 2b 및 6a 참조, 여기서 L=4+이고, 여기서, SGC로부터 표지를 절단하기보다, 표지 프로브는 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 SGC의 다른 구성요소 사이의 용융 온도보다 낮은 온도를 사용하여 SGC로부터 제거됨).
일 구현예에서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계는 1 회 이상 반복된다.
일 구현예에서, 방법은 단계 (A) 내지 (I) 또는 단계 (A) 내지 (H), (J) 내지 (L) 및 (I)를 1 회 이상 반복하는 것을 추가로 포함한다(예를 들어, 도 2b 및 6a 참조, 여기서 K=2+이고, 여기서, SGC로부터 표지를 절단하기보다, 표지 프로브는 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 SGC의 다른 구성요소 사이의 용융 온도보다 낮은 온도를 사용하여 SGC로부터 제거됨). 이러한 방법의 일 구현예에서, 방법은 단계 (A) 내지 (H) 또는 단계 (A) 내지 (H) 및 (J) 내지 (L)을 반복하는 것을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 복수의 표적 핵산을 검출하는 방법을 제공한다: (A) 복수의 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 복수의 표적 프로브 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 각 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브 쌍을 포함하는 것인, 단계; (B) 샘플을 전-전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전-전증폭기 세트는 복수의 전-전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전-전증폭기는 각 표적 프로브 세트에 특이적인 전-전증폭기를 포함하며, 상기 각 전-전증폭기는 표적 프로브 세트 중 하나의 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 전증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계; (C) 샘플을 전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전증폭기 세트는 각 전-전증폭기에 특이적인 전증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 전증폭기의 각 서브세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기의 서브세트의 전증폭기는 표적 프로브 세트에 특이적인 전-전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계; (D) 샘플을 증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 증폭기 세트는 전증폭기의 각 서브세트에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 각 서브세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 전증폭기의 서브세트 중 하나의 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계; (E) 샘플을 표지 프로브의 제1 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; (F) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제1 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제1 서브세트를 검출하는 단계; (G) 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮은 온도에서 샘플을 배양하여, 표적 핵산의 제1 서브세트에 결합된 표지 프로브의 제1 세트로부터 표지를 제거하는 단계; (H) 샘플을 표지 프로브의 제2 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 임의적으로 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; (I) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제2 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제2 서브세트를 검출하는 단계로, 상기 복수의 표적 핵산을 검출하는 것인, 단계; 및 (J) 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계(예를 들어, 도 2b 및 6b 참조, 여기서 L=2이고, 여기서, SGC로부터 표지를 절단하기보다, 표지 프로브는 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 SGC의 다른 구성요소 사이의 용융 온도보다 낮은 온도를 사용하여 SGC로부터 제거됨).
일 구현예에서, 방법은 단계 (J) 전에 다음을 포함한다: (K) 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮은 온도에서 샘플을 배양하여, 표적 핵산의 제2 세트에 결합된 표지 프로브의 제2 세트로부터 표지를 제거하는 단계; (L) 샘플을 표지 프로브의 제3 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 임의적으로 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; 및 (M) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제3 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제3 서브세트를 검출하는 단계(예를 들어, 도 2b 및 6b 참조, 여기서 L=3이고, 여기서, SGC로부터 표지를 절단하기보다, 표지 프로브는 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 SGC의 다른 구성요소 사이의 용융 온도보다 낮은 온도를 사용하여 SGC로부터 제거됨).
일 구현예에서, 방법은 단계 (K) 내지 (M)을 1 회 이상 반복하는 것을 포함한다(예를 들어, 도 2b 및 6b 참조, 여기서 L=4+이고, 여기서, SGC로부터 표지를 절단하기보다, 표지 프로브는 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 SGC의 다른 구성요소 사이의 용융 온도보다 낮은 온도를 사용하여 SGC로부터 제거됨).
일 구현예에서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계는 1 회 이상 반복된다.
일 구현예에서, 방법은 단계 (A) 내지 (J) 또는 단계 (A) 내지 (I), (K) 내지 (M) 및 (J)를 1 회 이상 반복하는 것을 추가로 포함한다(예를 들어, 도 2b 및 6b 참조, 여기서 K=2+이고, 여기서, SGC로부터 표지를 절단하기보다, 표지 프로브는 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 SGC의 다른 구성요소 사이의 용융 온도보다 낮은 온도를 사용하여 SGC로부터 제거됨). 이러한 방법의 구현예 중 하나에서, 방법은 단계 (A) 내지 (I) 또는 단계 (A) 내지 (I) 및 (K) 내지 (M)을 반복하는 것을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는 복수의 핵산을 검출하는 방법을 제공한다: (A) 복수의 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 복수의 표적 프로브 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 각 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브 쌍을 포함하는 것인, 단계; (B) 샘플을 전-전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전-전증폭기 세트는 전-전증폭기의 복수의 쌍을 포함하고, 상기 전-전증폭기 세트는 표적 프로브 세트의 표적 프로브 쌍 중 하나에 특이적인 전-전증폭기 쌍을 포함하고, 상기 전-전증폭기 쌍의 각 전-전증폭기는 표적 프로브 세트의 표적 프로브 쌍의 표적 프로브 중 하나에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 전-전증폭기는 전증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계; (C) 샘플을 전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전증폭기는 전-전증폭기의 각 쌍에 특이적인 전증폭기를 포함하며, 상기 각 전증폭기는 전-전증폭기 세트의 전-전증폭기 쌍 중 하나에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계; (D) 샘플을 증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 증폭기 세트는 전-전증폭기의 각 쌍에 특이적인 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 전-전증폭기 쌍에 특이적인 전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계; (E) 샘플을 표지 프로브의 제1 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; (F) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제1 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제1 서브세트를 검출하는 단계; (G) 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮은 온도에서 샘플을 배양하여, 표적 핵산의 제1 서브세트에 결합된 표지 프로브의 제1 세트로부터 표지를 제거하는 단계; (H) 샘플을 표지 프로브의 제2 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 임의적으로 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; (I) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제2 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제2 서브세트를 검출하는 단계로, 상기 복수의 표적 핵산을 검출하는 것인, 단계; 및 (J) 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계(예를 들어, 도 2b 및 6c 참조, 여기서 L=2이고, 여기서, SGC로부터 표지를 절단하기보다, 표지 프로브는 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 SGC의 다른 구성요소 사이의 용융 온도보다 낮은 온도를 사용하여 SGC로부터 제거됨).
일 구현예에서, 방법은 단계 (J) 전에 다음을 포함한다: (K) 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮은 온도에서 샘플을 배양하여, 표적 핵산의 제2 세트에 결합된 표지 프로브의 제2 세트로부터 표지를 제거하는 단계; (L) 샘플을 표지 프로브의 제3 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 임의적으로 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; 및 (M) 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제3 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제3 서브세트를 검출하는 단계(예를 들어, 도 2b 및 6c 참조, 여기서 L=3이고, 여기서, SGC로부터 표지를 절단하기보다, 표지 프로브는 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 SGC의 다른 구성요소 사이의 용융 온도보다 낮은 온도를 사용하여 SGC로부터 제거됨).
일 구현예에서, 방법은 단계 (K) 내지 (M)을 1 회 이상 반복하는 것을 포함한다(예를 들어, 도 2b 및 6c 참조, 여기서 L=4+이고, 여기서, SGC로부터 표지를 절단하기보다, 표지 프로브는 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 SGC의 다른 구성요소 사이의 용융 온도보다 낮은 온도를 사용하여 SGC로부터 제거됨).
일 구현예에서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계는 1 회 이상 반복된다.
일 구현예에서, 방법은 단계 (A) 내지 (J) 또는 단계 (A) 내지 (I), (K) 내지 (M) 및 (J)를 1 회 이상 반복하는 것을 추가로 포함한다(예를 들어, 도 2b 및 6c 참조, 여기서 K=2+이고, 여기서, SGC로부터 표지를 절단하기보다, 표지 프로브는 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 SGC의 다른 구성요소 사이의 용융 온도보다 낮은 온도를 사용하여 SGC로부터 제거됨). 이러한 방법의 일 구현예에서, 방법은 단계 (A) 내지 (I) 또는 단계 (A) 내지 (I) 및 (K) 내지 (M)을 반복하는 것을 추가로 포함한다.
표적 프로브 세트를 사용하는 본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 각 표적 프로브 세트는 동일한 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브의 2 개 이상의 쌍을 포함한다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 산 시약은 5-40% 또는 20-30% 산, 또는 본원에 개시된 바와 같은 다른 농도를 포함한다. 일 구현예에서, 산은 아세트산, 포름산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말산, 타르타르산, 및 시트르산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 산 시약은 염을 포함한다. 일 구현예에서, 산 시약은 SSC를 포함한다. 일 구현예에서, 산 시약은 1X 내지 13X SSC 또는 3.2X 내지 12.8X SSC를 포함한다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 표적 핵산은 독립적으로 DNA 또는 RNA이다. 일 구현예에서, RNA인 표적 핵산은 메신저 RNA(mRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 미토콘드리아 RNA, 및 비-코딩 RNA로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 샘플은 조직 시료이거나 또는 조직 시료로부터 유래된다. 본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플이거나 또는 혈액 샘플로부터 유래된다. 본 발명의 방법의 일부 구현예에서, 샘플은 세포학적 샘플이거나 또는 세포학적 샘플로부터 유래된다.
본 발명의 방법은 표적 핵산의 다중 검출에 적용된다. 본원에 개시된 바와 같이, 본 발명의 방법은 표적 핵산의 서브세트 검출의 반복 라운드로 수행된다. 또한 본원에 개시된 바와 같이, 한 라운드에서 검출될 수 있는 표적 핵산의 수는 사용되는 표지 프로브의 유형 및 동시에 검출될 때 상이한 표적 핵산에 특이적인 표지 프로브를 구별하는 능력에 따라 달라진다. 더 높은 수준의 다중화는 검출 및 산 처리의 반복 라운드에 의해 달성된다. 예를 들어, 도 1에 도시된 예시적인 구현예에서, 한 라운드의 표지화 및 검출은 4 개 표적 핵산의 검출을 제공하고, 표지화 및 검출의 제2 라운드는 8 개 표적 핵산의 검출을 제공하고, 표지화 및 검출의 제3 라운드는 12 개 표적 핵산의 검출을 제공한다. 산 처리 단계를 포함하면 표적 핵산의 추가적인 세트, 이 구체적 예에서 최대 12 개의 추가적인 표적 핵산이 동일한 샘플에서 총 24 개 표적 핵산에 대해 검출될 수 있다. 당업자는 본 발명의 검정에서 검출하기 위한 원하는 표적 핵산 수를 용이하게 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 2 개 라운드의 표지화 및 검출이 본 발명의 방법에 사용된다. 일부 구현예에서, 3 개 라운드의 표지화 및 검출이 사용된다. 일부 구현예에서, 각 표적 핵산을 고유하게 표지 및 검출하는 데 이용가능한 충분한 수의 SGC가 있고 SGC가 표적 핵산을 검출하기 위한 검정 조건 동안 표적 핵산에 충분히 결합된 채로 유지되는 한 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개 라운드 또는 그 이상의 표지화 및 검출이 사용될 수 있다. 당업자는 본 발명의 방법에 적용될 수 있는 표지화 및 검출의 라운드 수를 용이하게 결정할 수 있으며, 여기서 표적 핵산이 각 라운드에서 검출될 수 있다.
후속 라운드의 검출이 샘플에 적용됨에 따라, 표적 핵산의 후속적으로 수득된 검출은 모든 검출된 표적 핵산의 발현이 동일한 샘플 및 심지어 동일한 세포에서도 결정될 수 있도록 이전에 검출된 라운드(들)의 표적 핵산 검출로 등록될 수 있다(도 1, 2a 및 2b 참조). 표적 핵산 검출 라운드의 등록은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 상이한 라운드에서 검출된 표적 핵산 이미지를 겹쳐서 달성될 수 있다. 다중 이미지를 정렬 및 겹치기 위한 이러한 등록 알고리즘, 예를 들어, 크기 불변 특징 변환(Scale-Invariant Feature Transform)(SIFT) 알고리즘은 당업계에 잘 알려져 있다(Lowe "Distinctive Image Features from Scale-Invariant Keypoints", Internat. J. Computer Vision 60(2): 91-110 (2004)). 근본적으로, 이들 알고리즘은 입력 이미지와 참조 이미지를 비교하여 이동 및 회전을 설명하는 변환 행렬을 생성한다. 이 작업을 자동으로 수행할 수 있는 도구는 예를 들어, ImageJ(imagej.net/Registration)에 존재한다(Schneider 등, Nature Methods 9(7):671-675 (2012); Schindelin 등, Mol. Reprod. Dev. 82(7-8):518-529 (2015)).
추가적인 다중화는 동일한 SGC 어셈블리를 활용하지만 상이한 표적 핵산에 대한 상이한 표적 프로브 세트에 의해 달성될 수 있다. 이러한 경우, 표적 핵산의 서브세트 표지화의 반복 라운드에서 검출된 SGC 복합체를 갖는 표적 핵산의 초기 세트를 검출한 후, SGC 복합체는 표적 핵산에 대한 SGC의 혼성화를 변성시키는 적절한 조건을 사용하여 표적 핵산으로부터 제거될 수 있다. 일단 SGC 복합체가 샘플로부터 제거되면, 동일한 전증폭기/증폭기/표지 프로브 또는 전-전증폭기/전증폭기/증폭기/표지 프로브는 SGC 검출의 제1 라운드에서 검출된 것과 상이한 표적 핵산 세트에 특이적이도록 설계된 표적 프로브 세트와 사용될 수 있다. 이 방식으로, 추가적인 표적 핵산의 검출이 달성될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 추가 다중화는 결합된 표적 프로브 및 SGC를 제거하기 위해 샘플을 산 처리한 다음 임의적으로 동일한 SGC를 재사용하지만, 상이한 표적 핵산을 표적화하여, 후속 라운드에서 상이한 표적 핵산을 표지함으로써 달성될 수 있다.
여전히 또 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 이중 가닥 핵산 및 단일 가닥 핵산의 동시 검출, 예를 들어, 동일한 샘플에서 DNA 및 RNA의 검출에 적용될 수 있다. 이러한 경우, 프로브는 RNA와 같은 단일 가닥 핵산(예를 들어, 미국 특허 번호 제7,709,198호, 미국 공개 제2008/0038725호 및 제2009/0081688호, 및 제2017/0101672호 참조) 및 이중 가닥 핵산을 검출하도록 설계될 수 있어서 DNA 및 RNA와 같은 이중 가닥 핵산 및 단일 가닥 핵산이 둘 다 동일한 샘플에서 검출될 수 있도록 한다.
일부 구현예에서, 표적 핵산에 특이적인 각 표적 프로브 세트는 동일한 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브의 2 개 이상의 쌍을 포함한다. 이러한 경우, 표적 핵산에 특이적인 표적 프로브 세트에서 표적 프로브 쌍은 표적 핵산의 상이한 비-중첩 서열에 결합한다. 동일한 표적 핵산에 특이적으로 혼성화할 수 있는 표적 프로브의 2 개 이상의 쌍을 갖는 표적 프로브 세트가 사용되는 경우, 표적 프로브 쌍에 결합하는 분자, 즉 전증폭기(도 5a 및 6a 참조), 또는 전-전증폭기(도 5b, 5c, 6b 및 6c 참조) 중 어느 하나는 일반적으로 동일한 표적 프로브 세트에서 표적 프로브 쌍에 대해 동일하다. 따라서, 동일한 표적 핵산에 결합하는 표적 프로브 쌍은 표적 프로브 쌍에 결합하는 SGC의 분자, 즉, 전증폭기 또는 전-전증폭기에 대한 동일한 결합 부위를 포함하도록 설계될 수 있다. 표적 핵산을 검출하기 위한 다중 표적 프로브 쌍의 사용은 동일한 표적 핵산 상의 다중 SGC의 어셈블리와 연관된 높은 신호를 제공한다. 일부 구현예에서, 동일한 표적 핵산에 대한 결합에 사용되는 표적 프로브 쌍의 수는 표적 당 1-10, 1-20, 1-30, 1-40, 1-50, 1-60, 1-70, 1-80, 1-90, 1-100, 1-110, 1-120, 1-130, 1-140, 1-150, 1-160, 1-170, 1-180, 1-190, 또는 1-200 개 쌍의 범위, 또는 더 많은 수의 쌍, 또는 그 사이의 임의의 정수 쌍, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200 개 등이다.
본 발명의 방법은 원하는 표적 핵산의 검출을 달성하기 위해 활용될 수 있다. 일 구현예에서, 표적 핵산은 복수의 표적 프로브 쌍으로 검출된다. 이러한 경우, 표적 프로브 쌍은 표적 핵산 상에 다중 SGC의 어셈블리를 허용하기 위해 표적 핵산의 하나 초과의 영역에 결합하도록 설계된다. 하나의 표적 프로브 쌍의 표적 결합 부위는 복수의 표적 프로브 쌍이 동일한 표적 핵산에 결합하도록 사용되는 경우 또 다른 표적 프로브 쌍의 표적 결합 부위와 중첩되지 않음이 이해된다.
본 발명의 구현예에서, 본 발명의 방법에 의해 검출된 표적 핵산은 메신저 RNA(mRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 미토콘드리아 RNA, 비-코딩 RNA 등을 포함한 RNA, 또는 DNA 등을 포함하나 이에 제한되지 않는, 세포 샘플에 존재하는 임의의 핵산일 수 있다. 특정 구현예에서, 핵산은 RNA이다. 핵산의 다중 검출을 위한 본 발명의 방법에서, 표적 핵산은 독립적으로 DNA 또는 RNA일 수 있음이 이해된다. 다시 말해서, 검출될 표적 핵산은 동일한 유형의 핵산일 수 있지만 반드시 그런 것은 아니다. 따라서, 본 발명의 검정에서 검출될 표적 핵산은 DNA 및 RNA일 수 있다. 표적 핵산이 RNA인 경우, 표적 핵산은 메신저 RNA(mRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 미토콘드리아 RNA, 및 비-코딩 RNA로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있음이 이해된다. 따라서, 표적 핵산은 독립적으로 DNA 또는 임의의 유형의 RNA일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법은 일반적으로 표적 핵산의 제자리 검출에 관한 것이다. 핵산의 제자리 검출을 위한 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, US 2008/0038725; US 2009/0081688; Hicks 등, J. Mol. Histol. 35:595-601 (2004) 참조). 본원에 사용된 바와 같이, "제자리 혼성화" 또는 "ISH"는 샘플, 특히 조직 또는 세포(제자리)의 일부 또는 절편에서 DNA 또는 RNA와 같은 특이적 핵산에 결합하고 국부화하기 위해 프로브와 같은 직접적으로 또는 간접적으로 표지된 상보적 DNA 또는 RNA 가닥을 사용하는 혼성화 유형을 지칭한다. 프로브 유형은 이중 가닥 DNA(dsDNA), 단일 가닥 DNA(ssDNA), 단일 가닥 우대 RNA(sscRNA), 메신저 RNA(mRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 리보솜 RNA, 미토콘드리아 RNA, 및/또는 합성 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 용어 "형광 제자리 혼성화" 또는 "FISH"는 형광 표지를 활용하는 ISH의 유형을 지칭한다. 용어 "발색 제자리 혼성화" 또는 "CISH"는 발색 표지가 있는 ISH의 유형을 지칭한다. ISH, FISH 및 CISH 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Stoler, Clinics in Laboratory Medicine 10(1):215-236 (1990); In situ hybridization. A practical approach, Wilkinson, ed., IRL Press, Oxford (1992); Schwarzacher and Heslop-Harrison, Practical in situ hybridization, BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford (2000) 참조).
제자리 혼성화 또는 유세포 분석을 포함하나 이에 제한되지 않는, 세포 내 핵산 표적의 제자리 검출을 위한 본 발명의 방법의 경우, 세포는 표적 프로브의 혼성화 전에 임의적으로 고정 및/또는 투과된다. 세포를 고정 및 투과화하는 것은 세포 내 핵산 표적을 유지하는 것을 용이하게 하고 표적 프로브, 표지 프로브, 증폭기, 전증폭기, 전-전증폭기 등이 세포에 들어가서 표적 핵산 분자에 도달하게 할 수 있다. 세포는 핵산 표적에 포획되지 않은 물질을 제거하기 위해 임의적으로 세척된다. 세포는 임의의 다양한 단계 후, 예를 들어, 결합되지 않은 표적 프로브를 제거하기 위해 핵산 표적에 표적 프로브의 혼성화 후, 표적 프로브에 전-전증폭기, 전증폭기, 증폭기, 및/또는 표지 프로브의 혼성화 후 등 세척될 수 있다. 핵산의 제자리 검출을 위해 세포를 고정 및 투과화하는 방법, 뿐만 아니라 표적 핵산을 혼성화, 세척 및 검출하는 방법이 또한 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, US 2008/0038725; US 2009/0081688; Hicks 등, J. Mol. Histol. 35:595-601 (2004); Stoler, Clinics in Laboratory Medicine 10(1):215-236 (1990); In situ hybridization. A practical approach, Wilkinson, ed., IRL Press, Oxford (1992); Schwarzacher and Heslop-Harrison, Practical in situ hybridization, BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford (2000); Shapiro, Practical Flow Cytometry 3rd ed., Wiley-Liss, New York(1995); Ormerod, Flow Cytometry, 2nd ed., Springer (1999) 참조). 예시적인 고정화제는 알데히드(포름알데히드, 글루타르알데히드 등), 아세톤, 알코올(메탄올, 에탄올 등)을 포함하나 이제 제한되지 않는다. 예시적인 투과화제는 알코올(메탄올, 에탄올 등), 산(빙초산 등), 세제(Triton, NP-40, TweenTM 20 등), 사포닌, 디기토닌, LeucopermTM(BioRad, 캘리포니아주 에르쿨레스 소재), 및 효소(예를 들어, 리소자임, 리파제, 프로테아제 및 펩티다제)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 투과화는 또한 조직 슬라이스와 같은 기계적 파괴에 의해 발생할 수 있다.
이중 가닥 핵산의 제자리 검출을 위해, 일반적으로 샘플은 표적 이중 가닥 핵산의 가닥에 대한 혼성화에 의해 결합하는 표적 프로브에 대한 접근성을 제공하기 위해 샘플 내에서 이중 가닥 핵산을 변성시키도록 처리된다. 이중 가닥 핵산을 변성시키기 위한 조건은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 염기(NaOH), 포름아미드, 디메틸 술폭시드 등을 사용한 열 및 화학적 변성을 포함한다(Wang 등, Environ. Health Toxicol. 29:e2014007(doi: 10.5620/eht.2014.29.e2014007) 2014; Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999) 참조). 예를 들어, DNA와 같은 이중 가닥 핵산을 변성시키기 위해 NaOH, LiOH 또는 KOH, 또는 다른 높은 pH 완충액(pH >11)이 사용될 수 있다. 게다가, 열 및 화학적 변성 방법은 조합하여 사용될 수 있다.
이러한 제자리 검출 방법은 유리 슬라이드 상에 고정화된 조직 시료, 혈액 샘플로부터 단리된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 같은 현탁액 중 단일 세포 등에 사용될 수 있다. 조직 시료는 예를 들어, 조직 생검 샘플을 포함한다. 혈액 샘플은 예를 들어, 진단 목적으로 취한 혈액 샘플을 포함한다. 혈액 샘플의 경우, 혈액은 혈액 도말에서와 같이 직접적으로 분석될 수 있거나, 또는 혈액은 예를 들어, 적혈구 용해, PBMC 또는 백혈구 단리, 표적 세포 단리 등으로 처리될 수 있어서, 본 발명의 방법에 의해 분석된 샘플 내 세포가 혈액 샘플에 있거나 또는 혈액 샘플로부터 유래되도록 한다. 유사하게, 조직 시료는 처리될 수 있으며, 예를 들어, 조직 시료를 다지고 물리적으로 또는 효소적으로 처리하여 조직을 개별 세포 또는 세포 클러스터로 파괴한다. 추가적으로, 세포학적 샘플은 원하는 경우 세포를 단리하거나 또는 세포 클러스터를 파괴하도록 처리될 수 있다. 따라서, 조직, 혈액 및 세포학적 샘플은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 수득되고 처리될 수 있다. 본 발명의 방법은 병리를 나타내는 바이오마커인 핵산 표적의 존재 또는 부재에 기반하여 병리학적 세포의 존재 또는 부재를 식별하는 진단 적용에 사용될 수 있다.
임의의 수의 적합한 샘플이 본 발명의 방법을 사용하여 표적 핵산을 검출하는 데 사용될 수 있음이 당업자에 의해 이해된다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 샘플은 일반적으로 생물학적 샘플 또는 조직 샘플일 것이다. 개체 또는 생검, 부검 또는 법의학적 물질과 같은 생물학적 물질의 일부 다른 공급원으로부터 수집된 생물학적 조직 또는 유체 기원의 샘플을 포함한 이러한 샘플은 생물학적 대상체로부터 수득될 수 있다. 생물학적 샘플은 또한 전암성 또는 암 세포 또는 조직을 함유하거나 또는 함유하는 것으로 의심되는 생물학적 대상체의 영역으로부터의 샘플, 예를 들어, 미세 바늘 흡입물, 혈액 샘플 또는 세포학적 시료를 포함한 조직 생검을 포함한다. 이러한 샘플은 포유동물과 같은 유기체로부터 단리된 기관, 조직, 조직 분획 및/또는 세포일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 생물학적 샘플은 1차 세포 배양물, 세포주, 조직, 기관, 소기관, 생물학적 유체 등을 포함한 세포 배양물을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 추가적인 생물학적 샘플은 피부 샘플, 미세 바늘 흡입물, 세포학적 샘플, 대변을 포함한 조직 생검, 혈액 및/또는 혈청 샘플을 포함한 체액, 타액, 정액 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 이러한 샘플은 의학적 또는 수의학적 진단 목적으로 사용될 수 있다. 샘플은 또한 다른 공급원, 예를 들어, 음식, 토양, 물체의 표면 등, 및 표적 핵산의 검출이 바람직한 다른 물질로부터 수득될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 개체 또는 다른 공급원으로부터 수득된 생물학적 샘플로부터의 하나 이상의 병원체, 예컨대 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충과 같은 단세포 유기체 등의 검출에 사용될 수 있다.
본 발명의 방법으로 분석하기 위한 세포학적 샘플의 수집은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Dey, "Cytology Sample Procurement, Fixation and Processing" in Basic and Advanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology pp. 121-132, Springer, Singapore (2018); 2004년 3월 2일 ASC 집행 위원회에서 채택된 "Non-Gynecological Cytology Practice Guideline" American Society of Cytopathology 참조). 조직 생검 및 세포학 샘플을 포함한 자궁경부 조직의 분석을 위한 샘플 처리 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Cecil Textbook of Medicine, Bennett and Plum, eds., 20th ed., WB Saunders, Philadelphia (1996); Colposcopy and Treatment of Cervical Intraepithelial Neoplasia: A Beginner's Manual, Sellors and Sankaranarayanan, eds., International Agency for Research on Cancer, Lyon, France (2003); Kalaf and Cooper, J. Clin. Pathol. 60:449-455 (2007); Brown and Trimble, Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol. 26:233-242 (2012); Waxman 등, Obstet. Gynecol. 120:1465-1471 (2012); 2000년 11월 10일 미국 세포병리학회(ASC) 집행 위원회에 의해 승인된 Cervical Cytology Practice Guidelines TOC 참조)). 일 구현예에서, 세포학적 샘플은 자궁경부 샘플, 예를 들어, 팹(pap) 도말이다. 일 구현예에서, 샘플은 미세 바늘 흡입물이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 샘플은 조직 시료이거나 또는 조직 시료로부터 유래된다. 본 발명의 다른 특정 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플이거나 또는 혈액 샘플로부터 유래된다. 본 발명의 여전히 또 다른 특정 구현예에서, 샘플은 세포학적 샘플이거나 또는 세포학적 샘플로부터 유래된다.
본 발명은 표적 핵산을 검출가능한 표지로 표지하기 위해 표적 핵산 사이에 복합체를 구축하는 것에 기반한다. 이러한 복합체는 때때로 신호 생성 복합체(SGC; 예를 들어, US 20170101672 참조)로 지칭된다. 이러한 복합체, 또는 SGC는 표적 핵산에 다수의 표지의 부착을 허용하는 분자 층을 구축함으로써 달성된다.
본 발명의 방법은 신호 생성 복합체(SGC)를 이용할 수 있으며, 여기서 SGC는 단일 분자보다 다중 분자를 포함한다. 이러한 SGC는 특히 검출가능한 신호를 증폭하는 데 유용하여, 표적 핵산의 더 높은 감도 검출을 제공한다. 신호를 증폭하기 위한 이러한 방법은 예를 들어, 미국 특허 번호 제5,635,352호, 제5,124,246호, 제5,710,264호, 제5,849,481호, 및 제7,709,198호, 및 미국 공개 제2008/0038725호 및 제2009/0081688호, 뿐만 아니라 WO 2007/001986 및 WO 2012/054795에 기재되어 있으며, 이들 각각은 참조로 본원에 포함된다. SGC의 생성은 RNAscope® 검정의 원리이다(미국 특허 번호 제7,709,198호, 제8,658,361호 및 제9,315,854호, 미국 공개 제2008/0038725호, 제2009/0081688호 및 제2016/0201117호, 뿐만 아니라 WO 2007/001986 및 WO 2012/054795를 참조하며, 이들 각각은 참조로 본원에 포함된다).
기본 신호 생성 복합체(SGC)는 도 5a에 예시되어 있다(또한 US 2009/0081688을 참조하며, 이는 참조로 본원에 포함된다). "Z'"의 쌍으로서 도 5에 도시된 표적 프로브 쌍은 "표적"으로 표지된 상보적 분자 서열에 혼성화한다. 각 표적 프로브는 안정하게 결합하기 위해 표적 프로브 쌍의 두 구성원에 동시에 혼성화해야 하는 전증폭기 분자(PA, 녹색으로 예시됨)에 상보적인 추가적인 서열을 함유한다. 전증폭기 분자는 다음 2 개의 도메인으로 구성된다: 각 표적 프로브에 혼성화하는 영역을 갖는 하나의 도메인, 및 일련의 뉴클레오티드 서열 반복부를 함유하는 하나의 도메인, 각각은 증폭기 분자(Amp, 검정색으로 예시됨) 상의 서열에 상보적이다. 이 서열의 다중 반복부의 존재는 다중 증폭기 분자가 하나의 전증폭기에 혼성화하게 하여, 전반적인 신호 증폭을 증가시킨다. 각 증폭기 분자는 2 개의 도메인으로 구성되며, 하나의 도메인은 전증폭기에 혼성화하는 영역을 갖고, 하나의 도메인은 일련의 뉴클레오티드 서열 반복부를 함유하며, 각각은 표지 프로브(LP, 노란색으로 예시됨) 상의 서열에 상보적이어서, 다중 표지 프로브를 각 증폭기 분자에 혼성화하게 하여, 총 신호 증폭을 추가로 증가시킨다. 각 표지 프로브는 2 개의 구성요소를 함유한다. 하나의 구성요소는 표지 프로브를 혼성화하게 하는 증폭기 분자 상의 반복 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열로 구성된다. 이 뉴클레오티드 서열은 직접 시각화를 위한 형광 또는 발색 표지, 직접적으로 검출가능한 금속 동위원소, 또는 본원에 기재된 바와 같이, 형광, 발색, 또는 다른 검출가능한 신호를 생성하기 위해 화학적 반응을 용이하게 할 수 있는 효소 또는 다른 화합물을 포함하여, 임의의 신호-생성 독립체일 수 있는 제2 구성요소에 연결된다. 도 5a에서, 표지 프로브는 핵산 구성요소를 나타내는 선, 및 신호-생성 구성요소를 나타내는 별로 도시된다. 전체적으로, 표적 프로브에서 표지 프로브까지의 어셈블리는 신호 생성 복합체(SGC)로서 지칭된다.
도 5b는 전-전증폭기 분자(PPA, 빨간색으로 제시됨)의 경우, 증폭 분자 층을 첨가함으로써 확대된 SGC를 예시한다. PPA는 하나의 도메인의 표적 프로브 및 또 다른 도메인의 다중 전증폭기(PA) 둘 다에 결합한다.
도 5c는 전증폭기 수준에서 협동 혼성화를 사용하는 상이한 SGC 구조를 예시한다(US 2017/0101672를 참조하며, 이는 참조로 본원에 포함된다). 도 5a 및 5b에서 형성된 SGC와 유사하게, 표적 프로브 쌍은 표적 분자 서열에 혼성화한다. 각 표적 프로브는 고유한 전-전증폭기 분자(PPA-1, 보라색으로 예시됨; PPA-2, 빨간색으로 예시됨)에 상보적인 추가적인 서열을 함유한다. 2 개의 독립적인 분자의 사용은 협동 혼성화가 필요할 수 있는 기반을 설정한다. 각 전-전증폭기 분자는, 하나의 도메인이 표적 프로브 중 하나에 혼성화하는 영역을 갖고, 다른 도메인이 일련의 뉴클레오티드 서열 반복부를 함유하며, 각각이 전증폭기 분자(PA, 녹색으로 예시됨) 내의 서열에 상보적인 두 서열을 함유하는 것인 2 개의 도메인, 뿐만 아니라 PPA-PA 결합 효율을 용이하게 하는 스페이서 서열로 구성된다. 성장하는 SGC에 안정하게 부착하기 위해, 각 PA는 두 PPA 분자에 동시에 혼성화해야 한다. 각 전증폭기 분자는 2 개의 도메인으로 구성되는 데, 하나의 도메인은 혼성화하도록 두 전-전증폭기에 상보적인 서열을 함유하고, 다른 도메인은 증폭기 분자(AMP, 검정색으로 예시됨) 상의 서열에 각각 상보적인 일련의 뉴클레오티드 서열 반복부를 함유한다. 증폭기 혼성화 서열의 다중 반복부는 다중 증폭기 분자를 각 전증폭기에 혼성화하게 하여, 신호 증폭을 추가로 증가시킨다. 예시의 단순성을 위해, 증폭기 분자는 하나의 전증폭기 분자에 혼성화하는 것으로 제시되지만, 증폭기는 각 전증폭기에 결합할 수 있음이 이해된다. 각 증폭기 분자는 표지 프로브(LP, 노란색으로 예시됨) 내의 서열에 상보적인 일련의 뉴클레오티드 서열 반복부를 함유하여, 여러 표지 프로브가 각 증폭기 분자에 혼성화하게 한다. 각 표지 프로브는 신호 검출을 제공하는 신호-생성 요소를 함유한다.
상기 기재된 바와 같이, 도 5a, 5b, 6a 또는 6b에 도시된 바와 같은 배열, 도 5c 및 6c에 도시된 바와 같은 배열을 사용하든, SGC의 구성요소는 SGC를 구축하기 위해 두 표적 프로브의 결합이 요구되도록 설계된다. 도 5a, 5b, 6a 또는 6b의 배열의 경우, 전증폭기(또는 도 5b 및 6b의 전-전증폭기)는 안정한 결합이 발생하기 위해 표적 프로브 쌍의 두 구성원에 결합해야 한다. 이는 전증폭기(또는 전-전증폭기)에 대한 두 표적 프로브의 결합이 전증폭기(또는 전-전증폭기)에 대한 단일 표적 프로브의 결합보다 높은 용융 온도(Tm)를 갖도록 표적 프로브와 전증폭기(또는 전-전증폭기) 사이의 결합 부위를 설계하고, 단일 표적 프로브의 결합이 검정 조건 하에 불안정한 경우 달성된다. 이 설계는 이전에 예를 들어, 미국 특허 번호 제7,709,198호, 미국 공개 제2008/0038725호 및 제2009/0081688호, WO 2007/001986 WO 2007/002006, 상기 Wang 등, 2012, 상기 Anderson 등, 2016)에 기재되었다. SGC 구성요소를 이 방식으로 배열함으로써, SGC의 어셈블리는 두 표적 프로브가 표적 핵산 및 전증폭기에 결합된 경우 달성되며, 이에 의해 SGC의 어셈블리가 거짓 양성으로서 최소화되므로 배경 노이즈를 줄인다.
도 5c 및 6c의 배열의 경우, 표적 프로브 쌍의 두 구성원이 표적 핵산에 결합된 경우에만 SGC가 형성되어야 하는 요건은 전증폭기가 두 전-전증폭기에 결합되어야 하며, 차례로 표적 프로브 쌍의 두 구성원에 각각 결합되도록 요구함으로써 달성된다. 이 요건은 전증폭기에 대한 두 전-전증폭기의 결합 사이의 용융 온도(Tm)가 전-전증폭기 단독의 용융 온도보다 높도록 전-전증폭기와 전증폭기 사이의 결합 부위를 설계하고, 전증폭기에 대한 전-전증폭기 중 하나의 결합이 검정 조건 하에 불안정한 경우 달성된다. 이 설계는 이전에 예를 들어, US 20170101672, WO 2017/066211 및 상기 Baker 등, 2017)에 기재되었다. 전증폭기가 두 전-전증폭기에 결합되어 있지 않는 한, 증폭기 및 표지 프로브는 표적 핵산에 결합된 SGC 내로 어셈블리할 수 없으며, 이에 의해 SGC의 어셈블리가 거짓 양성으로서 최소화되므로 배경 노이즈를 줄인다.
본원에 개시된 바와 같이, 방법은 세포 내 표적 핵산의 존재를 검출하기 위해 표적 핵산에 결합된 신호-생성 복합체(SGC)를 구축하는 것에 기반할 수 있다. SGC를 구축하기 위한 구성요소는 일반적으로 핵산 혼성화 반응이 SGC의 구성요소를 표적 핵산에 결합하는 데 사용되게 하는 핵산을 포함한다. 적절한 영역을 선택하고 표적 핵산에 결합하는 특이적이고 선택적인 시약, 특히 표적 핵산에 특이적으로 및 선택적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 프로브, 또는 SGC의 다른 구성요소를 설계하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다(Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001); Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1999) 참조). 표적 프로브는 프로브가 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하도록 설계된다. 원하는 특이성은 표적 핵산 영역의 적절한 선택 뿐만 아니라 올리고뉴클레오티드 또는 프로브와 같은 결합제의 적절한 길이를 사용하여 달성될 수 있고, 이러한 선택 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 따라서, 당업자는 또 다른 표적 핵산에 비해 하나의 특정 표적 핵산을 표적하거나, 또는 SGC의 구성요소에 대한 결합을 제공하는 데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 프로브와 같은 적절한 시약을 용이하게 이해하고 용이하게 결정할 수 있다. 유사한 특이성은 SGC가 특이적 표적에 결합되어 있도록 표적-특이적 SGC의 주어진 구성요소(예를 들어, 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기, 증폭기, 표지 프로브)가 각각의 구성요소에 결합하도록 고유한 서열의 적절한 선택을 사용함으로써 표적-특이적 SGC에 대해 달성될 수 있다(도 6 참조).
본원에 기재된 바와 같이, 본 발명의 구현예는 표적 프로브 쌍의 사용을 포함한다. 표적 프로브 쌍이 동일한 전증폭기(도 5a 및 6a) 또는 전-전증폭기(도 5b 및 6b)에 결합하는 경우, 때때로 "Z" 배열로 지칭되는 프로브 배열이 사용될 수 있다. 감도를 증가시키고 배경을 감소시키기 위한 이러한 배열 및 이의 이점은 예를 들어, 미국 특허 번호 제7,709,198호, 미국 공개 제2008/0038725호 및 제2009/0081688호, 및 WO 2007/001986 및 WO 2007/002006에 기재되어 있으며, 이들 각각은 참조로 본원에 포함된다. 미국 특허 번호 제7,709,198호 및 미국 공개 제2008/0038725호 및 제2009/0081688호는 길이, 배향, 혼성화 조건 등을 포함한 표적 프로브 쌍과 같은 표적 프로브의 특성을 선택하기 위한 세부사항을 추가적으로 기재한다. 당업자는 본원 및, 예를 들어, 미국 특허 번호 제7,709,198호, 미국 공개 제2008/0038725호 및 제2009/0081688호, 및 WO 2007/001986 및 WO 2007/002006의 교시에 기반한 적합한 배열을 용이하게 식별할 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 표적 프로브 쌍에서 표적 프로브의 표적 결합 부위는 임의의 원하는 배향 및 조합일 수 있다. 예를 들어, 표적 프로브 쌍의 하나의 구성원의 표적 결합 부위는 전증폭기 또는 전-전증폭기 결합 부위에 대한 5' 또는 3'일 수 있고, 상기 쌍의 다른 구성원은 독립적으로 전증폭기 또는 전-전증폭기 결합 부위에 대한 표적 결합 부위 5' 또는 3'으로 배향될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 표적 핵산의 존재를 검출하는 데 사용되는 SGC는 SGC의 하나 이상의 구성요소의 협동 혼성화에 기반한다(US 20170101672 및 WO 2017/066211을 참조하며, 이들 각각은 참조로 본원에 포함된다). 이러한 협동 혼성화는 본원에서 또한 BaseScopeTM으로 지칭된다. 협동 혼성화 효과에서, SGC의 2 개구성요소 사이의 결합은 2 개 결합 부위에 의해 매개되고, 동시에 2 개 부위 결합의 용융 온도는 1 개 부위 단독 결합의 용융 온도보다 높다(US 20170101672 및 WO 2017/066211 참조). 협동 혼성화 효과는 US 20170101672 및 WO 2017/066211에 기재된 바와 같은 표적 프로브 세트 배열에 의해 향상될 수 있다.
본 발명의 방법, 및 관련 조성물은 핵산 표적의 제자리 검출에서 특이성을 증가시키고 배경을 줄이기 위해 협동 혼성화를 활용할 수 있으며, 여기서 복잡한 물리화학적 환경 및 압도적인 수의 비-표적 분자의 존재가 높은 노이즈를 생성할 수 있다. 이러한 협동 혼성화 방법을 사용하면, SGC가 표적 핵산에 결합된 경우에만 표지 프로브의 결합이 발생한다. US 20170101672 및 WO 2017/066211에 기재되고 이의 도 1에 예시된 바와 같이, 방법은 SGC의 하나 이상의 구성요소에서 협동 혼성화의 구성원을 증가시킴으로써 원하는 신호 대 노이즈 비를 제공하도록 용이하게 변형될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 협동 혼성화는 SGC의 다양한 구성요소에 적용될 수 있다. 예를 들어, SGC의 구성요소 사이의 결합은 본원에 기재된 바와 같이 안정한 반응일 수 있거나, 또는 결합은 또한 본원에 기재된 바와 같이 협동 혼성화를 필요로 하도록 구성될 수 있다. 이러한 경우, 협동 혼성화를 위해 의도된 결합 구성요소는 구성요소가 또 다른 구성요소에 결합하는 2 개 분절을 함유하도록 설계된다.
따라서, 표적 핵산을 검출하는 방법은 표적 핵산에 특이적으로 결합된 SGC를 제공하는 검출 시스템에서 구성요소 중 임의의 하나 또는 전부 사이의 결합 반응을 위해 협동 혼성화를 활용할 수 있다. 협동 혼성화를 적용하는 구성요소의 수, 및 구성요소는 원하는 검정 조건, 검정되는 샘플의 유형, 원하는 검정 감도 등에 기반하여 선택될 수 있다. 협동 혼성화 결합 반응의 임의의 하나 또는 조합은 검정의 감도 및 특이성을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 구현예에서, 협동 혼성화는 전-전증폭기와 전증폭기 사이, 전증폭기와 증폭기 사이, 증폭기와 표지 프로브 사이, 또는 이의 조합일 수 있다(예를 들어, US 20170101672 및 WO 2017/066211 참조).
본원에 개시된 바와 같이, 구성요소는 일반적으로 서로 직접적으로 결합된다. 핵산 함유 구성요소의 경우, 결합 반응은 일반적으로 혼성화에 의한 것이다. 혼성화 반응의 경우, 구성요소 사이의 결합은 직접적이다. 원하는 경우, 중개 구성요소는 하나의 구성요소의 또 다른 구성요소에 대한 결합이 간접적이도록 포함될 수 있으며, 예를 들어, 중개 구성요소는 2 개의 다른 구성요소를 가교하는 상보적 결합 부위를 함유한다.
본원에 기재된 바와 같이, 다양한 구성요소의 배열은 원하는 안정 또는 협동 혼성화 결합 반응을 제공하도록 선택될 수 있다(예를 들어, US 20170101672 참조). 결합 반응이 협동 혼성화에 대한 것과 같은 안정하거나 또는 불안정한 반응으로 본원에 예시될지라도, 임의의 결합 반응은, 표적 핵산이 검출되는 한, 원하는 경우 변형될 수 있음이 이해된다. 배열은 사용될 검정 및 혼성화 조건에 따라 변경 및 선택될 수 있음이 추가로 이해된다. 일반적으로, 결합 반응이 안정하기를 원하는 경우, 구성요소 사이의 상보적 핵산 서열의 분절은 일반적으로 10 내지 50 개 뉴클레오티드, 또는 그 초과, 예를 들어, 16 내지 30 개 뉴클레오티드, 예컨대 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50 개 뉴클레오티드, 또는 그 초과의 범위 내에 있다. 협동 혼성화 결합 반응이 이용되는 경우와 같이, 결합 반응이 상대적으로 불안정하기를 원하는 경우, 구성요소 사이의 상보적 핵산 서열의 분절은 일반적으로 5 내지 18 개 뉴클레오티드, 예를 들어, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18 개 뉴클레오티드의 범위 내에 있다. 뉴클레오티드 길이는 검정에 이용되는 서열(예를 들어, GC 함량) 및 조건에 따라 안정하거나 또는 불안정한 혼성화를 위해 다소 더 짧거나 또는 더 길 수 있음이 이해된다. 본원에 개시된 바와 같이, 잠금 핵산(LNA) 또는 가교 핵산(BNA)과 같은 변형된 뉴클레오티드는 변형된 염기에서 결합 강도를 증가시키는 데 사용되어, 결합 분절의 길이를 감소시킬 수 있음이 추가로 이해된다. 따라서, 다른 핵산 분절에 상보적인 핵산 분절의 길이와 관련하여, 본원에 기재된 길이는 원하는 경우 추가로 감소될 수 있음이 이해된다. 당업자는 핵산 구성요소 사이의 원하는 상호작용을 달성하기 위해 길이, 변형된 뉴클레오티드의 존재 등을 포함한 적절한 프로브 설계를 용이하게 결정할 수 있다.
상보적 서열을 포함하는 2 개 핵산 서열 사이의 결합 부위를 설계하는 데 있어서, 상보적 서열은 임의적으로 용융 온도 차이(dTm)를 최대화하도록 설계될 수 있다. 이는 당업계에 알려진 용융 온도 계산 알고리즘을 사용함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, SantaLucia, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:1460-1465 (1998) 참조). 게다가, 잠금 핵산(LNA) 또는 가교 핵산(BNA)과 같은 인공 변형된 염기 및 자연 발생 2'-O-메틸 RNA는 상보적 쌍 사이의 결합 강도를 향상시키는 것으로 알려져 있다(Petersen and Wengel, Trends Biotechnol. 21:74-81 (2003); Majlessi 등, Nucl. Acids Res. 26:2224-2229 (1998)). 이러한 변형된 염기는 원하는 바와 같이 SGC의 구성요소 사이의 결합 부위 내로 전략적으로 도입될 수 있다.
하나의 접근법은 변형된 뉴클레오티드(LNA, BNA 또는 2'-O-메틸 RNA)를 활용하는 것이다. 각 변형된 염기는 용융 온도를 증가시킬 수 있기 때문에, 2 개 핵산 서열(즉, 상보적 서열) 사이의 결합 영역의 길이는 실질적으로 단출될 수 있다. 변형된 염기의 이의 보체에 대한 결합 강도는 더 강하고, 용융 온도 차이(dTm)는 증가된다. 또한 또 다른 구현예는 혼성화될 핵산 구성요소의 상보적 서열 또는 2 개의 핵산 구성요소 사이에서 3 개의 변형된 염기(예를 들어, 3 개의 LNA, BNA 또는 2'-O-메틸 RNA 염기, 또는 2 또는 3 개의 상이한 변형된 염기의 조합), 예를 들어 신호 생성 복합체(SGC)를 사용하는 것이다. 이러한 구성요소는 예를 들어, 전-전증폭기, 전증폭기, 증폭기, 표지 프로브, 또는 표적 프로브 쌍일 수 있다.
LNA 또는 BNA와 같은 변형된 염기는 SGC의 선택된 구성요소의 분절, 특히 핵산 구성요소 사이의 결합을 매개하는 것들에 사용될 수 있으며, 이는 상보적 염기에 대한 염기의 결합 강도를 증가시켜, 상보적 분절의 길이를 감소시킨다(예를 들어, Petersen and Wengel, Trends Biotechnol. 21:74-81 (2003); 미국 특허 번호 제7,399,845호 참조). 인위적으로 확장된 유전 정보 시스템(AEGIS; Yang 등, Nucl. Acids Res. 34(21): 6095-6101 (2006))과 같은 자연 4-글자 알파벳을 확장하는 인공 염기는 SGC의 상호작용 구성요소 중에서 결합 부위로 혼입될 수 있다. 이들 인공 염기는 상호작용 구성요소의 특이성을 증가시킬 수 있으며, 차례로 더 낮은 엄격성 혼성화 반응을 허용하여 더 높은 신호를 산출할 수 있다.
표적 프로브 쌍과 관련하여, 표적 프로브 쌍은 표적 핵산의 바로 인접한 분절 또는 표적 프로브 쌍의 표적 프로브 결합 부위 사이의 하나 내지 다수의 염기를 갖는 분절 상에 결합하도록 설계될 수 있다. 일반적으로, 표적 프로브 쌍은 일반적으로 표적 핵산 상의 결합 부위 사이에 0 내지 500 개 염기, 예를 들어, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 또는 500 개 염기, 또는 그 사이의 임의의 정수 길이가 있도록 표적 핵산에 결합하도록 설계된다. 특정 구현예에서, 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위는 0 내지 100 개, 0 내지 200 개, 또는 0 내지 300 개 염기, 또는 그 사이의 임의의 정수 길이이다. 하나 초과의 표적 프로브 쌍이 RNA 또는 단일 가닥 DNA인 동일한 표적 핵산에 결합하기 위해 표적 프로브 세트에서 사용되는 경우, 및 표적 프로브 쌍 사이의 결합 부위에 갭이 있는 경우, 상이한 표적 프로브 쌍의 결합 부위는 중첩되지 않음이 이해된다. DNA와 같은 이중 가닥 핵산을 검출하는 경우, 표적 프로브 쌍이 이중 가닥 표적 핵산의 각각의 결합 부위에 동시에 결합할 수 있는 한, 상이한 표적 프로브 쌍 사이에 일부 중첩이 발생할 수 있다.
SGC는 또한 복수의 표지 프로브(LP)를 포함한다. 각 LP는 검출가능한 분절을 포함한다. 검출가능한 구성요소는 LP에 직접적으로 부착될 수 있거나, 또는 LP는 검출가능한 구성요소, 즉, 표지를 포함하는 또 다른 핵산에 혼성화할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "표지"는 분자의 검출을 용이하게 하는 모이어티이다. 본 발명의 맥락에서 통상적인 표지는 형광성, 발광성, 광-산란성, 및/또는 비색성 표지를 포함한다. 적합한 표지는 효소, 및 형광 및 발색 모이어티, 뿐만 아니라 방사성 핵종, 기질, 보조인자, 억제제, 화학발광 모이어티, 자기 입자, 희토류 금속, 금속 동위원소 등을 포함한다. 본 발명의 특정 구현예에서, 표지는 효소이다. 예시적인 효소 표지는 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 알칼리성 포스파타제(AP), β-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제 등, 뿐만 아니라 다양한 프로테아제를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 다른 표지는 형광단, 디니트로페닐(DNP) 등을 포함하나 이제 제한되지 않는다. 표지는 예를 들어, Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996), 및 미국 특허 번호 제3,817,837호; 제3,850,752호; 제3,939,350호; 제3,996,345호; 제4,277,437호; 제4,275,149호; 및 제4,366,241호에 기재된 바와 같이, 당업자에게 잘 알려져 있다. 많은 표지가 상업적으로 입수가능하고 검출가능한 효소/기질 조합(Pierce, 일리노이주 록퍼드 소재; Santa Cruz Biotechnology, 텍사스주 댈러스 소재; Life Technologies, 캘리포니아주 칼즈배드 소재)을 포함하여 본 발명의 방법 및 검정에 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서, 효소는 본원에 기재된 바와 같이 검출가능한 신호를 생성하기 위해 발색 또는 형광체 기질을 활용할 수 있다. 예시적인 표지가 본원에 기재되어 있다.
효소적 활성 또는 비-효소 표지가 각각 검출될 수 있는 한 임의의 수의 효소 또는 비-효소 표지가 활용될 수 있다. 이에 의해 효소는 표적 핵산을 검출하는 데 활용될 수 있는 검출가능한 신호를 생성한다. 특히 유용한 검출가능한 신호는 발색 또는 형광체 신호이다. 따라서, 표지로서 사용하기에 특히 유용한 효소는 발색 또는 형광체 기질이 이용가능한 것들을 포함한다. 이러한 발색 또는 형광체 기질은 효소적 반응에 의해 용이하게 검출가능한 발색 또는 형광 생성물로 전환될 수 있으며, 이는 현미경 검사 또는 분광학을 사용하여 용이하게 검출 및/또는 정량화될 수 있다. 서양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 이러한 효소는 당업자에게 잘 알려져 있다(Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) 참조). 잘 알려진 발색 또는 형광체 기질을 갖는 다른 효소는 다양한 펩티다제를 포함하며, 여기서 발색 또는 형광체 펩티드 기질은 단백질분해 절단 반응을 검출하는 데 활용될 수 있다. α- 및 β-갈락토시다제, β-글루쿠로니다제, 6-포스포-β-D-갈락토시드 6-포스포갈락토하이드롤라제, β-글루코시다제, α-글루코시다제, 아밀라제, 뉴라미니다제, 에스테라제, 리파제 등의 사용을 포함하나 이에 제한되지 않는 발색 및 형광체 기질의 사용은 또한 박테리아 진단에서 잘 알려져 있고(Manafi 등, Microbiol. Rev. 55:335-348 (1991)), 알려진 발색 또는 형광체 기질이 있는 이러한 효소가 본 발명의 방법에 사용하기 위해 용이하게 채택될 수 있다.
검출가능한 신호를 생성하기 위한 다양한 발색 또는 형광체 기질은 당업자에게 잘 알려져 있고 상업적으로 입수가능하다. 검출가능한 신호를 생성하는 데 활용될 수 있는 예시적인 기질은 서양고추냉이 퍼옥시다제의 경우 3,3'-디아미노벤지딘(DAB), 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB), 클로로나프톨(4-CN)(4-클로로-1-나프톨), 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)(ABTS), o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(OPD), 및 3-아미노-9-에틸카르바졸(AEC); 알칼리성 포스파타제의 경우 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-1-포스페이트(BCIP), 니트로블루 테트라졸륨(NBT), Fast Red(Fast Red TR/AS-MX), 및 p-니트로페닐 포스페이트(PNPP); β-갈락토시다제의 경우 1-메틸-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드 및 2-메톡시-4-(2-니트로비닐)페닐 β-D-갈락토피라노시드; β-글루코시다제의 경우 2-메톡시-4-(2-니트로비닐)페닐 β-D-글루코피라노시드 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 형광체 기질은 알칼리성 포스파타제의 경우 4-(트리플루오로메틸)움벨리페릴 포스페이트; 포스파타제의 경우 4-메틸움벨리페릴 포스페이트 비스 (2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올), 4-메틸움벨리페릴 포스페이트 비스(사이클로헥실암모늄) 및 4-메틸움벨리페릴 포스페이트; 서양고추냉이 퍼옥시다제의 경우 QuantaBluTM 및 QuantaRedTM; β-갈락토시다제의 경우 4-메틸움벨리페릴 β-D-갈락토피라노시드, 플루오레세인 디(β-D-갈락토피라노시드) 및 나프토플루오레세인 디-(β-D-갈락토피라노시드); 3-아세틸움벨리페릴 β-D-글루코피라노시드 및 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코피라노시드; 및 α-갈락토시다제의 경우 4-메틸움벨리페릴-α-D-갈락토피라노시드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 검출가능한 신호를 생성하기 위한 예시적인 효소 및 기질은 또한 예를 들어, 미국 공개 제2012/0100540호에 기재되어 있다. 발색 또는 형광체 기질을 포함한 다양한 검출가능한 효소 기질은 잘 알려져 있고 상업적으로 입수가능하다(Pierce, 일리노이주 록퍼드 소재; Santa Cruz Biotechnology, 텍사스주 댈러스 소재; Invitrogen, 캘리포니아주 칼즈배드 소재; 42 Life Science; Biocare). 일반적으로, 기질은 표적 핵산의 부위에 침착되는 침전물을 형성하는 생성물로 전환된다. 다른 예시적인 기질은 HRP-Green(42 Life Science), Biocare(캘리포니아주 콩코드 소재; biocare.net/products/detection/chromogens)의 Betazoid DAB, Cardassian DAB, Romulin AEC, Bajoran Purple, Vina Green, Deep Space Black™, Warp Red™, Vulcan Fast Red 및 Ferangi Blue를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
검출가능한 표지로서 적합한 예시적인 희토류 금속 및 금속 동위원소는 란탄족 (III) 동위원소 예컨대 141Pr, 142Nd, 143Nd, 144Nd, 145Nd, 146Nd, 147Sm, 148Nd, 149Sm, 150Nd, 151Eu, 152Sm, 153Eu, 154Sm, 155Gd, 156Gd, 158Gd, 159Tb, 160Gd, 161Dy, 162Dy, 163Dy, 164Dy, 165Ho, 166Er, 167Er, 168Er, 169Tm, 170Er, 171Yb, 172Yb, 173Yb, 174Yb, 175Lu, 및 176Yb를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 금속 동위원소는 예를 들어, 비행 시간 질량 분석법(TOF-MS)(예를 들어, Fluidigm Helios and Hyperion systems, fluidigm.com/systems; 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재)을 사용하여 검출될 수 있다.
비오틴-아비딘(또는 비오틴-스트렙타비딘)은 2 개의 분자가 서로 월등하게 높은 친화성을 갖고 하나의 아비딘/스트렙타비딘 분자가 4 개의 비오틴 분자에 결합할 수 있다는 점에 기반한 잘 알려진 신호 증폭 시스템이다. 항체는 면역조직화학 및 ISH에서 신호 증폭을 위해 널리 사용된다. 티라미드 신호 증폭(TSA)은 퍼옥시다제 활성에 의한 다수의 합텐화된 티라미드 분자의 침착에 기반한다. 티라민은 페놀계 화합물이다. 소량의 과산화수소의 존재 하에, 고정화 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)는 표지된 기질을 수명이 짧고 극도로 반응성인 중간체로 전환한다. 그런 다음 활성화된 기질 분자는 퍼옥시다제 결합 부위의 부위에서 또는 근처에서 티로신과 같은 단백질의 전자-풍부 모이어티와 매우 빠르게 반응하고 이에 공유적으로 결합한다. 이 방식으로, 티라미드에 접합된 많은 합텐 분자는 제자리에서 혼성화 부위에 도입될 수 있다. 후속적으로, 침착된 티라미드-합텐 분자는 직접적으로 또는 간접적으로 시각화될 수 있다. 이러한 검출 시스템은 예를 들어, 미국 공개 제2012/0100540호에 보다 상세하게 기재되어 있다.
본원에 기재된 구현예는 적절한 발색 또는 형광체 기질을 사용하여 검출가능한 신호를 생성하기 위해 효소를 활용한다. 대안적으로, 표지 프로브는 표지 프로브의 핵산 부분에 직접적으로 커플링된 검출가능한 표지를 가질 수 있음이 이해된다. 발색 또는 형광 표지를 포함하나 이에 제한되지 않는 예시적인 검출가능한 표지가 당업자에게 잘 알려져 있다(Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) 참조). 표지로서 유용한 예시적인 형광단은 로다민 유도체, 예를 들어, 테트라메틸로다민, 로다민 B, 로다민 6G, 술포로다민 B, Texas Red(술포로다민 101), 로다민 110, 및 이의 유도체 예컨대 테트라메틸로다민-5-(또는 6), 리싸민 로다민 B 등; 7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸(NBD); 플루오레세인 및 이의 유도체; 나프탈렌 예컨대 덴실 (5-디메틸아미노나프탈렌-1-술포닐); 쿠마린 유도체 예컨대 7-아미노-4-메틸쿠마린-3-아세트산(AMCA), 7-디에틸아미노-3-[(4'-(요오도아세틸)아미노)페닐]-4-메틸쿠마린(DCIA), 알렉사 플루오르 염료(Molecular Probes) 등; 4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센(BODIPYTM) 및 이의 유도체(Molecular Probes; 오레곤주 유진 소재); 8-메톡시피렌-1,3,6-트리술폰산을 포함한 피렌 및 술폰화 피렌 예컨대 Cascade BlueTM 및 이의 유도체 등; 피리딜옥사졸 유도체 및 다폭실 유도체(Molecular Probes); Lucifer Yellow(3,6-디술포네이트-4-아미노-나프탈리미드) 및 이의 유도체; CyDyeTM 형광 염료(Amersham/GE Healthcare Life Sciences; 뉴저지주 피스카타웨이 소재); ATTO 390, DyLight 395XL, ATTO 425, ATTO 465, ATTO 488, ATTO 490LS, ATTO 495, ATTO 514, ATTO 520, ATTO 532, ATTO Rho6G, ATTO 542, ATTO 550, ATTO 565, ATTO Rho3B, ATTO Rho11, ATTO Rho12, ATTO Thio12, ATTO Rho101, ATTO 590, ATTO 594, ATTO Rho13, ATTO 610, ATTO 620, ATTO Rho14, ATTO 633, ATTO 643, ATTO 647, ATTO 647N, ATTO 655, ATTO Oxa12, ATTO 665, ATTO 680, ATTO 700, ATTO 725, ATTO 740, Cyan 500 NHS-Ester(ATTO-TECH, 독일 지겐 소재) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예시적인 발색단은 페놀프탈레인, 말라카이트 그린, 니트로방향족 예컨대 니트로페닐, 디아조 염료, 다브실 (4-디메틸아미노아조벤젠-4'-술포닐) 등을 포함하나 이제 제한되지 않는다.
본원에 개시된 바와 같이, 방법은 다중 표적 핵산의 동시 검출을 활용할 수 있다. 표지로서 형광단을 사용하는 경우, 다중 표적 핵산의 검출에 사용될 형광단은 각각의 형광단이 구별가능하도록 선택되고 표적 핵산의 동시 검출의 경우 형광 현미경에서 동시에 검출될 수 있다. 이러한 형광단은 표적 핵산의 별개의 표지화가 동시에 검출될 수 있도록 방출의 스펙트럼 분리를 갖도록 선택된다. 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합한 구별가능한 형광단을 선택하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Johnson and Spence, "Molecular Probes Handbook, a Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, 11th ed., Life Technologies (2010) 참조).
현미경 검사, 세포측정법(예를 들어, 질량 세포측정, 비행 시간에 의한 세포측정법(CyTOF), 유세포 분석) 또는 분광학과 같은 잘 알려진 방법이 각각의 표적 핵산과 연관된 발색, 형광, 또는 금속 건출가능한 신호를 시각화하는 데 활용될 수 있다. 일반적으로, 상이한 표지가 동일한 검정에 사용되는 경우, 단일 유형의 기기가 동일한 샘플에서 핵산 표적의 검출을 위해 사용될 수 있도록 발색 기질 또는 형광체 기질, 또는 발색 또는 형광 표지, 또는 희토류 금속 동위원소 중 어느 하나가 특정 검정에 활용될 것이다.
본원에 개시된 바와 같이, 표지 프로브는 표지가 임의적으로 절단가능하도록 설계될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 절단가능한 표지는 예를 들어, 표적 핵산의 표지화 및 검출의 후속 라운드에서 동일한 표지를 사용하기 위해 표지가 SGC로부터 제거될 수 있도록 표지 프로브에 부착 또는 접합된 표지를 지칭한다. 일반적으로, 표지는 절단가능한 화학적 링커에 의해 표지 프로브에 접합된다. 표지가 절단가능하도록 표지를 표지 프로브에 접합하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다(예를 들어, Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996); Daniel 등, BioTechniques 24(3):484-489 (1998) 참조). 표지화 올리고뉴클레오티드의 한 가지 특정 시스템은 FastTagTM 시스템이다(상기 Daniel 등, 1998; Vector Laboratories, 캘리포니아주 벌링게임 소재). 다양한 절단가능한 모이어티는 표지가 표지 프로브로부터 절단될 수 있도록 링커에 포함될 수 있다. 이러한 절단가능한 모이어티는 화학적으로, 광 화학적으로 또는 효소적으로 절단될 수 있는 기를 포함한다. 절단가능한 화학적 링커는 절단가능한 화학적 모이어티, 예컨대 환원에 의해 절단될 수 있는 디술피드, 페리오데이트에 의해 절단될 수 있는 글리콜 또는 디올, 디티오나이트에 의해 절단될 수 있는 디아조 결합, 하이드록실아민에 의해 절단될 수 있는 에스테르, 염기에 의해 절단될 수 있는 술폰 등을 포함할 수 있다(상기 Hermanson, 1996 참조). 하나의 특히 유용한 절단가능한 링커는 디술피드 결합을 함유하는 링커이며, 이는 디술피드 결합을 환원시킴으로써 절단될 수 있다. 다른 구현예에서, 링커는 효소에 의해 절단 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 링커는 단백질분해 절단 부위를 함유할 수 있다. 일반적으로, 이러한 절단 부위는 서열-특이적 프로테아제에 대한 것이다. 이러한 프로테아제는 인간 리노바이러스 3C 프로테아제(절단 부위 LEVLFQ/GP), 엔테로키나제(절단 부위 DDDDK/), 인자 Xa(절단 부위 IEGR/), 담배 식각 바이러스 프로테아제(절단 부위 ENLYFQ/G), 및 트롬빈(절단 부위 LVPR/GS)을 포함하나 이에 제한되지 않는다(예를 들어, Oxford Genetics, 영국 옥스퍼드 소재 참조). 또 다른 절단가능한 모이어티는 우라실-DNA 글리코실라제(UNG)에 의해 절단될 수 있는 예를 들어, 우라실-DNA(DNA 함유 우라실)일 수 있다(예를 들어, Sidorenko 등, FEBS Lett. 582(3):410-404 (2008) 참조).
본 발명은 일부 구현예에서 표적 핵산에 결합된 표지가 표적 핵산으로부터 제거될 수 있도록 절단가능한 표지를 사용하는 것에 관한 것이다. 절단가능한 표지는 화학작용제와 같은 제제 또는 빛을 적용하여, 표지를 절단하고 이를 표지 프로브로부터 방출함으로써 제거될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 화학적 절단에 유용한 절단제는 환원제, 페리오데이트, 디티오나이트, 하이드록실아민, 염기 등을 포함하나 이제 제한되지 않는다(상기 Hermanson, 1996 참조). 디술피드 결합을 함유하는 링커를 절단하기 위한 한 가지 유용한 방법은 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)의 사용이다(Moffitt 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 113:11046-11051 (2016) 참조). 일 구현예에서, TCEP는 표지 프로브로부터 표지를 절단하기 위한 제제로서 사용된다.
또 다른 구현예에서, 절단가능한 표지를 사용하는 대신, 표지 프로브-증폭기 결합 서열의 Tm보다 높은 온도에서 표적 핵산에 부착된 SGC를 노출시킴으로써, SGC에 결합된 표지 프로브는 선택적으로 제거되거나 또는 세척될 수 있다. SGC에서 표지 프로브와 증폭기 사이의 결합을 파괴하는 적합한 온도 및 조건을 선택함으로써, SGC에서 증폭기에 결합된 표지 프로브를 제거하는 것과 같이 SGC의 구성요소를 선택적으로 제거하는 방법이 당업계에 잘 알려져 있고 본원에 개시되어 있다. SGC로부터 표지 프로브의 선택적 제거를 사용하는 경우, SGC의 구성요소는 표지 프로브-증폭기 상호작용 이외에 SGC의 다른 구성요소의 상호작용이 증폭기에 대한 표지 프로브 결합이 파괴되는 조건 동안 안정하게 유지되도록 설계된다. 절단가능한 표지를 포함하는 표지 프로브의 사용과 유사하게, 검출의 최종 반복 라운드에서, 검출의 추가 라운드가 이루어지지 않으므로 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도가 표적 프로브, 전-전증폭기(사용되는 경우), 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮을 필요가 없음이 이해된다. 따라서, 검출의 최종 반복 라운드에서, 표지 프로브 및 표지가 검출의 최종 반복 라운드에서 SGC에 결합된 채 유지되도록, 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도가 표적 프로브, 전-전증폭기(사용되는 경우), 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮은 것이 임의적이다.
본원에 기재된 발명은 일반적으로 샘플 내 다중 표적 핵산의 검출에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 추가적으로 샘플, 특히 표적 핵산과 동일한 세포에서 다중 표적 핵산 및 임의적으로 다른 분자를 검출하는 데 적용될 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 다중 표적 핵산을 검출하는 것 이외에, 세포에서 발현되는 단백질은 또한 표적 핵산을 검출하기 위해 본원에 기재된 바와 유사한 근거를 사용하여 동시에 검출될 수 있다. 이 경우, 다중 표적 핵산 검출의 1 개 이상의 라운드에서, 임의적으로 세포에서 발현되는 하나 이상의 단백질은 예를 들어, 단백질을 검출하기 위한 검출가능한 표지를 사용함으로써 검출될 수 있다. 단백질이 표적 핵산 검출의 초기 라운드에서 검출되는 경우, 단백질은 표적 핵산을 검출하는 데 사용되는 것과 유사한 절단가능한 표지로 검출될 수 있다. 단백질이 검출의 마지막 라운드에서 검출되는 경우, 표지는 절단가능할 필요가 없다. 세포에서 단백질의 검출은 예를 들어, 표적 핵산의 검출을 위해 본원에 기재된 것들을 포함하여, 임의의 잘 알려진 검출 시스템을 사용하여 단백질-특이적 항체의 결합을 검출함으로써 당업자에게 잘 알려져 있다. 동일한 세포에서 표적 핵산 및 단백질의 검출이 기재되었다(또한 Schulz 등, Cell Syst. 6(1):25-36 (2018) 참조).
표적 핵산이 검출되는 한, 본 발명은 임의의 원하는 순서로 수행될 수 있음이 이해된다. 따라서, 본 발명의 방법에서, 세포를 SGC의 어셈블리를 위한 임의의 구성요소와 접촉시키는 단계는 임의의 원하는 순서로 수행될 수 있거나, 순차적으로 수행될 수 있거나, 또는 동시에 수행될 수 있거나, 또는 표적 핵산이 검출되는 한, 일부 단계는 순차적으로 수행될 수 있는 반면 원하는 경우 다른 단계는 동시에 수행될 수 있다. 본원에 개시된 구현예는 다양한 배열, 구성요소 크기, 검정 조건, 검정 감도 등을 활용하기 위해 원하는 경우 본원에 개시된 다른 구현예와 독립적으로 조합될 수 있음이 추가로 이해된다.
본 발명은 표적 핵산의 검출을 제공하는 임의의 형식으로 수행될 수 있음이 이해된다. 본 발명의 구현은 일반적으로 제자리 혼성화를 사용하여 본원에 기재되었지만, 본 발명은 당업계에 잘 알려진 바와 같이 다른 형식으로 표적 핵산의 검출, 특히 세포 내 표적 핵산의 검출을 위해 수행될 수 있음이 이해된다. 세포 내 표적 핵산을 검출하는 데 사용될 수 있는 한 가지 방법은 당업계에 잘 알려진 바와 같은 유세포 분석이다(예를 들어, Shapiro, Practical Flow Cytometry 3rd ed., Wiley-Liss, New York (1995); Ormerod, Flow Cytometry, 2nd ed., Springer (1999) 참조). 따라서 본 발명의 방법, 샘플 및 키트는 제자리 혼성화 검정 형식 또는 유세포 분석과 같은 또 다른 형식으로 사용될 수 있다. 제자리 혼성화를 포함한 핵산 검출 방법을 유세포 분석에 적용하는 것은 이전에 기재되었다(예를 들어, Hanley 등, PLoS One, 8(2):e57002. doi: 10.1371/journal.pone.0057002 (2013); Baxter 등, Nature Protocols 12(10):2029-2049 (2017) 참조).
일부 경우, 검정 단계의 수를 줄이는 것, 예를 들어, 혼성화 및 세척 단계의 수를 줄이는 것이 바람직할 수 있다. 검정 단계의 수를 줄이는 한 가지 방식은 세포와 접촉시키기 전에 SGC의 일부 또는 모든 구성요소를 사전-어셈블리하는 것이다. 이러한 사전-어셈블리는 표적 핵산과 접촉시키기 전에 SGC의 일부 또는 모든 구성요소를 함께 혼성화함으로써 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 개시된 바와 같은 산 시약을 포함하는 키트를 제공한다. 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치고 세포 형태학 및 핵산 무결성을 보존한다. 본 발명의 키트의 구성요소는 임의적으로 용기 내에 있을 수 있고, 임의적으로 키트를 사용하는 지침이 제공될 수 있다. 지침은 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 단계를 기재할 수 있다. 임의적으로, 키트는 본원에 기재된 바와 같이, SGC의 하나 이상의 구성요소를 포함할 수 있으며, 여기서 키트는 표적 핵산을 포함하지 않는다. 이러한 키트는 본원에 개시된 바와 같이, 전증폭기(PA), 증폭기(AMP) 및 표지 프로브(LP), 및 임의적으로 전-전증폭기(PPA)를 포함할 수 있다. 임의적으로 키트는 특정 표적 핵산, 또는 복수의 표적 핵산에 대한 표적 프로프(TP)를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 핵산 표적에 특이적인 하나 이상의 프로브, 및 본원에 개시된 바와 같은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 지침을 포함하는 키트를 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명은 세포 내 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 방법에 사용하기 위한 산 시약을 포함하는 키트를 제공하며, 상기 방법은 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 세포는 세포 내 제1 표적 핵산에 혼성화된 제1 프로브를 포함하며, 상기 산 시약은 제1 프로브와 제1 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴한다.
이러한 키트의 일 구현예에서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계는 1 회 이상 반복된다.
이러한 키트의 일 구현예에서, 방법은 세포로부터 제1 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 키트의 일 구현예에서, 방법은 세포를 제2 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제2 프로브는 세포 내 제2 표적 핵산에 혼성화하며, 상기 제2 표적 핵산은 제1 표적 핵산과 동일하거나 또는 상이하다. 이러한 키트의 일 구현예에서, 방법은 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 상기 산 시약은 제2 프로브와 제2 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴한다. 일 구현예에서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계는 1 회 이상 반복된다. 이러한 키트의 일 구현예에서, 방법은 세포로부터 제2 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 세포 내 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 방법에 사용하기 위한 산 시약을 포함하는 키트를 제공하며, 상기 방법은 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 포함하며, 상기 세포는 세포 내 하나 이상의 제1 표적 핵산에 혼성화된 하나 이상의 제1 프로브를 포함하며, 상기 산 시약은 하나 이상의 제1 프로브와 하나 이상의 제1 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴한다.
이러한 키트의 일 구현예에서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계는 1 회 이상 반복된다.
이러한 키트의 일 구현예에서, 방법은 세포로부터 하나 이상의 제1 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 키트의, 일 구현예에서, 세포는 2 개 이상의 제1 표적 핵산에 혼성화된 2 개 이상의 제1 프로브를 포함한다. 이러한 키트의 일 구현예에서, 제1 표적 핵산 각각은 제1 프로브에 대한 혼성화에 의해 표지되고, 상기 각 제1 표적 핵산 상의 표지는 제1 프로브에 혼성화된 다른 제1 표적 핵산(들) 상의 표지와 구별가능하다.
이러한 키트의 일 구현예에서, 방법은 세포를 하나 이상의 제2 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 상기 하나 이상의 제2 프로브는 세포 내 하나 이상의 제2 표적 핵산에 혼성화하며, 상기 하나 이상의 제2 표적 핵산은 하나 이상의 제1 표적 핵산과 동일하거나 또는 상이하다. 일 구현예에서, 세포는 2 개 이상의 제2 표적 핵산에 혼성화된 2 개 이상의 제2 프로브를 포함한다.
이러한 키트의 일 구현예에서, 제2 표적 핵산 각각은 제2 프로브에 대한 혼성화에 의해 표지되고, 상기 각 제2 표적 핵산 상의 표지는 제2 프로브에 혼성화된 다른 제2 표적 핵산(들) 상의 표지와 구별가능하다. 이러한 키트의 일 구현예에서, 방법은 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하며, 상기 산 시약은 제2 프로브와 하나 이상의 제2 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴한다. 일 구현예에서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계는 1 회 이상 반복된다. 일 구현예에서, 이러한 방법은 세포로부터 제2 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 표적 핵산의 제자리 검출을 위한 키트를 제공한다: (A) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기는 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (B) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기는 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (C) 표지 프로브 세트로, 상기 표지 프로브 세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하는 것; 및 (D) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 것(예를 들어, 도 2a 및 6a 참조). 일 구현예에서, 키트는 표적 프로브 세트를 포함하며, 상기 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브의 하나 이상의 쌍을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 표적 핵산의 제자리 검출을 위한 키트를 제공한다: (A) 전-전증폭기 세트로, 상기 전-전증폭기 세트는 하나 이상의 전-전증폭기를 포함하며, 상기 각 전-전증폭기는 표적 프로브의 하나 이상의 쌍에 대한 결합 부위를 포함하는 것; (B) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기는 전-전증폭기에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (C) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기는 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (D) 표지 프로브 세트로, 상기 표지 프로브 세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하는 것; 및 (E) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 것(예를 들어, 도 2a 및 6b 참조). 일 구현예에서, 키트는 표적 프로브 세트를 포함하며, 상기 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브의 하나 이상의 쌍을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 표적 핵산의 제자리 검출을 위한 키트를 제공한다: (A) 전-전증폭기 세트로, 상기 전-전증폭기 세트는 전-전증폭기의 하나 이상의 쌍을 포함하며, 상기 전-전증폭기 쌍의 각 전-전증폭기는 표적 프로브 쌍의 표적 프로브 중 하나에 대한 결합 부위를 포함하는 것; (B) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기는 전-전증폭기 쌍에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (C) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기는 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (D) 표지 프로브 세트로, 상기 표지 프로브 세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하는 것; 및 (E) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 것(예를 들어, 도 2a 및 6c 참조). 일 구현예에서, 키트는 표적 프로브 세트를 포함하며, 상기 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브의 하나 이상의 쌍을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 표적 핵산의 제자리 검출을 위한 키트를 제공한다: (A) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전증폭기는 하나 이상의 표적 프로브 세트 각각에 특이적인 전증폭기를 포함하며, 상기 각 전증폭기는 표적 프로브 세트 중 하나의 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (B) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 각 서브세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 표적 프로브 세트에 특이적인 전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (C) 표지 프로브의 제1 세트로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것; (D) 표지 프로브의 제2 세트로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것; 및 (E) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 것(예를 들어, 도 2b 및 6a 참조).
일 구현예에서, 키트는 표지 프로브의 제3 세트를 추가로 포함하되, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제3 서브제트를 특이적으로 표지할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 표적 핵산의 제자리 검출을 위한 키트를 제공한다: (A) 전-전증폭기 세트로, 상기 전-전증폭기 세트는 복수의 전-전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전-전증폭기는 하나 이상의 표적 프로브 세트의 각각에 특이적인 전-전증폭기를 포함하며, 상기 각 전-전증폭기는 표적 프로브 세트 중 하나의 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 전증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (B) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 각 전-전증폭기에 특이적인 전증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 전증폭기의 각 서브세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기의 서브세트의 전증폭기는 표적 프로브 세트에 특이적인 전-전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (C) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 전증폭기의 각 서브세트에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 각 서브세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 전증폭기의 서브세트 중 하나의 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (D) 표지 프로브의 제1 세트로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것; (E) 표지 프로브의 제2 세트로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것; (F) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 것(예를 들어, 도 2b 및 6b 참조).
일 구현예에서, 키트는 표지 프로브의 제3 세트를 추가로 포함하되, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 표적 핵산의 제자리 검출을 위한 키트를 제공한다: (A) 전-전증폭기 세트로, 상기 전-전증폭기 세트는 전-전증폭기의 복수의 쌍을 포함하며, 상기 전-전증폭기 세트는 하나 이상의 표적 프로브 세트의 표적 프로브 쌍의 각 표적 프로브에 특이적인 전-전증폭기 쌍을 포함하고, 상기 전-전증폭기 쌍의 각 전-전증폭기는 표적 프로브 세트의 표적 프로브 쌍의 표적 프로브 중 하나에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 전-전증폭기는 전증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (B) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전증폭기는 전-전증폭기의 각 쌍에 특이적인 전증폭기를 포함하며, 상기 각 전증폭기는 전-전증폭기 세트의 전-전증폭기 쌍 중 하나에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (C) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 전-전증폭기의 각 쌍에 특이적인 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 전-전증폭기 쌍에 특이적인 전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (D) 표지 프로브의 제1 세트로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것; (E) 표지 프로브의 제2 세트로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것; 및 (F) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 산 시약(도 2b 및 6c 참조).
일 구현예에서, 키트는 표지 프로브의 제3 세트를 추가로 포함하되, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있다.
일 구현예에서, 절단가능한 표지를 포함하는 본 발명의 키트는 표지 프로브로부터 절단가능한 표지를 절단하기 위한 절단제를 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 표적 핵산의 제자리 검출을 위한 키트를 제공한다: (A) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전증폭기는 하나 이상의 표적 프로브 세트 각각에 특이적인 전증폭기를 포함하며, 상기 각 전증폭기는 표적 프로브 세트 중 하나의 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (B) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 각 서브세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 표적 프로브 세트에 특이적인 전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (C) 표지 프로브의 제1 세트로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것; (D) 표지 프로브의 제2 세트로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것; 및 (E) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 것(예를 들어, 도 2b 및 6a 참조).
일 구현예에서, 키트는 표지 프로브의 제3 세트를 포함하며, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 표적 핵산의 제자리 검출을 위한 키트를 제공한다: (A) 전-전증폭기 세트로, 상기 전-전증폭기 세트는 전-전증폭기의 복수의 쌍을 포함하며, 상기 전-전증폭기 세트는 하나 이상의 표적 프로브 세트의 표적 프로브 쌍 각각에 특이적인 전-전증폭기 쌍을 포함하며, 상기 전-전증폭기 쌍의 각 전-전증폭기는 표적 프로브 세트의 표적 프로브 쌍의 표적 프로브 중 하나에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 전-전증폭기는 전증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (B) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전증폭기는 전-전증폭기의 각 쌍에 특이적인 전증폭기를 포함하며, 상기 각 전증폭기는 전-전증폭기 세트의 전-전증폭기 쌍 중 하나에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (C) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 전-전증폭기의 각 쌍에 특이적인 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 전-전증폭기 쌍에 특이적인 전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (D) 표지 프로브의 제1 세트로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것; (E) 표지 프로브의 제2 세트로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것; 및 (F) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 것(예를 들어, 도 2b 및 6c 참조).
일 구현예에서, 키트는 표지 프로브의 제3 세트를 추가로 포함하되, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 표적 핵산의 제자리 검출을 위한 키트를 제공한다: (A) 전-전증폭기 세트로, 상기 전-전증폭기 세트는 복수의 전-전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전-전증폭기는 하나 이상의 표적 프로브 세트 각각에 특이적인 전-전증폭기를 포함하며, 상기 각 전-전증폭기는 표적 프로브 세트 중 하나의 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 전증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (B) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 각 전-전증폭기에 특이적인 전증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 전증폭기의 각 서브세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기의 서브세트의 전증폭기는 표적 프로브 세트에 특이적인 전-전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (C) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 전증폭기의 각 서브세트에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 각 서브세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 전증폭기의 서브세트 중 하나의 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; (D) 표지 프로브의 제1 세트로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하며, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것; (E) 표지 프로브의 제2 세트로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것; 및 (F) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 것(예를 들어, 도 2b 및 6b 참조).
일 구현예에서, 키트는 표지 프로브의 제3 세트를 추가로 포함하되, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있다.
표적 프로브 세트를 포함하는 본 발명의 키트의 일부 구현예에서, 키트는 하나 이상의 표적 프로브 세트를 포함하며, 상기 각 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브 쌍을 포함한다. 일 구현예에서, 각 표적 프로브 세트는 동일한 표적 핵산에 특이적으로 혼성화할 수 있는 표적 프로브의 2 개 이상의 쌍을 포함한다.
본 발명의 키트의 일부 구현예에서, 키트는 세포를 고정 및/또는 투과하는 적어도 하나의 시약을 포함한다.
본 발명의 키트의 일부 구현예에서, 산 시약은 5-40% 또는 20-30% 산, 또는 본원에 개시된 다른 농도를 포함한다. 일 구현예에서, 산은 아세트산, 포름산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말산, 타르타르산, 및 시트르산으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 키트의 일부 구현예에서, 산 시약은 염을 포함한다. 일 구현예에서, 산 시약은 SSC를 포함한다. 일 구현예에서, 산 시약은 1X 내지 13X SSC 또는 3.2X 내지 12.8X SSC를 포함한다.
본 발명은 또한 세포 또는 복수의 세포를 포함하는 샘플을 제공하며, 여기서 산 시약은 세포에 적용되고 세포 상에 존재한다. 세포는 임의적으로 고정될 수 있다. 세포는 임의적으로 투과될 수 있다. 세포를 고정 및/또는 투과하는 것은 특히 제자리 혼성화 검정에 적용가능하다. 임의적으로, 세포는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 프로브 배열에 결합된 하나 이상의 표적 핵산을 포함한다.
본 발명은 세포 또는 복수의 세포를 포함하는 슬라이드를 추가적으로 제공하며, 여기서 산 시약은 슬라이드 상의 세포에 적용되고 슬라이드 상의 세포 상에 존재한다. 임의적으로, 세포 또는 세포들은 슬라이드에 고정된다. 임의적으로, 세포 또는 세포들은 투과된다. 특정 구현예에서, 슬라이드 상의 세포는 제자리 검정을 위해 고정 및/또는 투과된다. 임의적으로, 슬라이드 상의 세포는 본원에 개시된 바와 같은 임의의 프로브 배열에 결합된 하나 이상의 표적 핵산을 포함할 수 있다.
본 발명의 다양한 구현예의 활성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 변형이 또한 본원에 제공된 본 발명의 정의 내에 제공되는 것으로 이해된다. 따라서,하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 의도되지만 제한하려는 것은 아니다.
실시예 I
산 처리는 표적 핵산에 혼성화된 프로브를 효과적으로 제거하고 세포 RNA 및 조직 형태에 최소한으로 영향을 미친다
이 실시예는 세포 내 표적 핵산에 혼성화된 프로브의 효과적인 제거 및 세포 RNA 및 조직 형태의 보존을 설명한다.
도 3a 및 3b는 표적 핵산 검출의 순차적 라운드를 위한 산 처리를 나타낸다. 도 3a는 산 처리가 신선하게 동결된 마우스 뇌에서 표적 프로브 및 증폭 복합체를 효과적으로 제거하였음을 나타낸다. 신선하게 동결된 절편으로 제조된 마우스 뇌에서 4 개의 고도로 발현된 양성 대조군 유전자, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(Gapdh), 포스포글리세레이트 키나제 1(Pgk1), 기본 나선-루프-나선 패밀리 구성원 E22(Bhlhe22), 및 컴플렉신 2(Cplx2)의 검출이 제시되어 있다. 4 개의 유전자에 대한 표적 프로브(ZZ 프로브)를 함께 혼성화하였고, 신호를 RNAscope® HiPlex 증폭 시스템을 사용하여 함께 증폭시켰다. 4 개의 유전자를 이러한 4 개의 표적 프로브에 할당된 신호 증폭 시스템에 상응하는 형광으로 표지된 프로브를 사용하여 반복 검출의 제1 라운드에서 검출하였다. Alexa 488, ATTO 550, ATTO 647N 및 Alexa 750 형광단을 각각 Gapdh, Pgk1, Bhlhe22 및 Cplx2를 검출하는 데 사용하였다. 핵을 DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐인돌)를 사용하여 청색으로 염색하였다(상단 패널). 신호 검출 후, 조직 절편을 실온(RT)에서 5 분 동안 산 용액(20% 아세트산, 6.4X SSC)으로 처리하였고, 산 처리를 2 회 이상 반복하였다. 그런 다음 절편을 표적 프로브의 첨가 없이 혼성화 및 증폭의 제2 라운드에 사용하였다. 산 처리 후 제2 라운드에서 신호가 거의 내지 전혀 검출되지 않았으며(하단 패널), 따라서 이전에 혼성화된 표적 프로브 및 신호 증폭 구성요소의 완전한 제거를 입증한다.
도 3b는 산 처리가 신선하게 동결된 마우스 뇌의 세포 RNA 및 조직 형태에 최소한으로 영향을 미쳤음을 나타낸다. 4 개의 양성 대조군 유전자(Gapdh, Pgk1, Bhlhe22 및 Cplx2)를 도 3a에 기재된 바와 같은 신선하게 동결된 절편으로 제조된 마우스 뇌에서 검출하였다(상단 패널). 신호 검출 후, 산 처리를 2 회 대신에 4 회 반복한 것을 제외하고, 절편을 도 3a에 기재된 바와 같은 산 용액으로 처리하였다. 그런 다음 동일한 4 개의 유전자를 검출하기 위해 처리된 절편을 혼성화 및 증폭의 제2 라운드에 사용하였다. 혼성화의 제2 라운드에서 검출된 신호(하단 패널)를 혼성화의 제1 라운드에서 검출된 신호(상단 패널)와 비교하면, 2 개 라운드의 표적 프로브 혼성화 및 신호 증폭은 유사한 발현 패턴을 산출하였으며, 이는 산 처리로부터 RNA의 최소 손실을 나타낸다.
이들 결과는 세포를 산 시약으로 처리하는 것이 세포 내 표적 핵산에 혼성화된 프로브의 제거 및 세포 RNA 및 조직 형태 보존에 효과적임을 입증한다.
실시예 II
다중 라운드의 산 처리 및 순차적 라운드의 프로브 혼성화는 세포 형태 및 검출가능한 핵산을 보존한다
이 실시예는 다중 라운드의 산 처리가 표적 핵산에 결합된 프로브를 제거하기 위해 세포에 적용될 수 있고, 표적 핵산이 산 처리 후 검출될 수 있음을 설명한다.
실험은 도 2b에 나타낸 바와 같이 본질적으로 수행하였다. 도 2b에 나타낸 바와 같이, 'K" 및 "L"로 도시된 2 개 "라운드"가 있으며, 여기서 K는 순차적 라운드의 N 개 표적 프로브 혼성화를 지칭하고, L은 각 K 라운드 내에서 표지 프로브 혼성화의 반복 라운드를 지칭한다. 이 실험에서, 3 개 순차적 라운드의 표적 프로브 혼성화를 수행하였고, 각 순차적 라운드 내에서, 3 개 반복 라운드의 표지 프로브 혼성화 및 이미지화를 수행하였다. 이 실험에서 입증 목적을 위해, 12 개의 표적 프로브를 각 "K" 라운드에 사용하였다: 라운드 K=1 경우, RNA 폴리머라제 II 서브유닛 A(Polr2A), 펩티딜프롤릴 이소머라제 B(Ppib), 유비퀴틴 C(Ubc), 하이포크산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 1(Hprt1), 액틴 베타(ActB), 튜불린 베타 3 클래스 III(Tubb3), 가교 통합자 1(Bin1), 락테이트 데하이드로게나제 A(Ldha), 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제(Gapdh), 포스포글리세레이트 키나제 1(Pgk1), 기본 나선-루프-나선 패밀리 구성원 E22(Bhlhe22), 및 컴플렉신 2(Cplx2); 라운드 K=3 경우, 5-하이드록시트립타민 수용체 7(Htr7), 프로토카드헤린 8(Pcdh8), 용질 운반체 패밀리 32 구성원 1(Slc32a1), 티로신 하이드록실라제(Th), 시냅토포린(Synpr), 크리스탈린 뮤(Crym), 울프라민 ER 막관통 당단백질(Wfs1), 칼빈딘 1(Calb1), (Drd1a), 도파민 수용체 D1(Drd2), 칸나비노이드 수용체 1(Cnr1), 포크헤드 박스 P1(Foxp1).
12 개 표적 프로브의 각각의 그룹을 순차적 라운드 1 및 3에서 각각 혼성화하였고, 12 개의 "모조" 표적 프로브 또는 블랭크 프로브 완충액을 제2 순차적 라운드에 사용하였다. 순차적 라운드(K 라운드)의 표적 프로브 혼성화 사이에 산 처리를 수행하였다. 도 4에서, 이미지의 상부 패널은 제1 순차적 라운드(K=1) 내에서 제3 반복 검출 라운드(L=3)에 상응한다. 도 4에서, 이미지의 하부 패널은 표적 프로브 혼성화의 제3 순차적 라운드(K=3) 내에서 반복 검출의 제1 라운드(L=1)로부터의 것이었다.
도 4는 2 개 라운드의 산 처리 및 순차적 혼성화 후 양호한 형태 및 신호 검출을 나타낸다. 도 4에서, 상단 패널은 도 2b에 요약된 작업흐름에 제시된 바와 같이 본질적으로 수행된, 표적 프로브 혼성화의 제1 라운드(K = 1) 및 반복 검출의 제3 라운드(L = 3)에서 신선하게 동결된 마우스 뇌 절편 내의 4 개의 양성 대조군 유전자, Polr2A, Ppib, Ubc 및 Hprt1의 검출을 나타낸다. Alexa 488, ATTO 550, ATTO 647N 및 Alexa 750 형광단을 각각 Polr2a, Ppib, Ubc 및 Hprt1을 검출하는 데 사용하였고, 핵을 DAPI를 사용하여 청색으로 염색하였다. 도 4에서, 하단 패널은 표적 프로브 혼성화 및 증폭의 제3 라운드(K = 3) 및 반복 검출의 제1 라운드(L = 1)에서 마우스 뇌의 선조체 영역 내에서 4 개의 상이한 저발현 표적, Htr7, Pcdh8, Slc32a 및 Th의 검출을 나타낸다. 도 3a에 기재된 바와 같은 라운드 1 및 라운드 2 표적 혼성화 후 산 처리, 표적 혼성화 및 증폭 단계를 수행하였다.
이들 결과는 다중 라운드의 산 처리가 표적 핵산에 결합된 프로브를 제거하기 위해 세포에 적용될 수 있음을 입증한다. 결과는 또한 표적 핵산이 산 처리 후 검출될 수 있음을 입증한다.
실시예 III
예시적인 산 처리 시약 및 조건
이 실시예는 다양한 산 처리 시약 및 조건을 테스트하는 실험을 설명한다.
최적화된 산 처리 조건을 조사하기 위한 일련의 실험에서, 신선하게 동결된 마우스 뇌 또는 포르말린 고정된 파라핀-포매 HeLa 세포를 RNAscope® HiPlex 프로토콜(Advanced Cell Diagnostics; 캘리포니아주 뉴어크 소재)에 따라 다양한 양성 대조군 유전자에 대해 염색하였다. 이미지화 후, 슬라이드를 다양한 조건에서 아세트산으로 처리하여 결합된 표적 프로브 및 신호 생성 복합체를 제거하였다. 산 처리 후, 이전 라운드로부터 잔류 결합된 표적 프로브의 임의의 신호를 검출하기 위해 임의의 표적 프로브를 첨가하지 않고 RNAscope® HiPlex 신호 증폭 단계를 수행하였다. 슬라이드를 이미지화하고 시각적으로 평가하였다. 결과는 표 1에 제시되어 있다.
표 1. 산 처리 실험 요약.
Figure pct00001
이들 결과는 세포 내 표적 핵산에 결합된 프로브를 제거하기 위해 다양한 산 시약이 사용될 수 있음을 입증한다.
본 출원 전반에 걸쳐 다양한 간행물이 참조되었다. 이들 간행물의 개시내용은 그 전문이 본 발명이 속하는 기술 상태를 보다 완전하게 기재하기 위해 본 출원에 참조로 포함된다. 본 발명은 상기 제공된 실시예를 참조하여 기재되었지만, 본 발명의 취지를 벗어나지 않고 다양한 변형이 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.

Claims (116)

  1. 세포 내 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 방법으로서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 세포는 세포 내 제1 표적 핵산에 혼성화된 제1 프로브를 포함하며, 상기 산 시약은 제1 프로브와 제1 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴하는 것인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 1 회 이상 반복하는 것인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포로부터 제1 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세포를 제2 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하되, 상기 제2 프로브는 세포 내 제2 표적 핵산에 혼성화하며, 상기 제2 표적 핵산은 제1 표적 핵산과 동일하거나 또는 상이한 것인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하되, 상기 산 시약은 제2 프로브와 제2 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴하는 것인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 1 회 이상 반복하는 것인, 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 상기 세포로부터 제2 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 세포 내 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 방법으로서, 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 세포는 세포 내 하나 이상의 제1 표적 핵산에 혼성화된 하나 이상의 제1 프로브를 포함하며, 상기 산 시약은 하나 이상의 제1 프로브와 하나 이상의 제1 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴하는 것인, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 1 회 이상 반복하는 것인, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 세포로부터 하나 이상의 제1 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 세포가 2 개 이상의 제1 표적 핵산에 혼성화된 2 개 이상의 제1 프로브를 포함하는 것인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 표적 핵산 각각이 제1 프로브에 대한 혼성화에 의해 표지되고, 상기 각 제1 표적 핵산 상의 표지가 제1 프로브에 혼성화된 다른 제1 표지 핵산(들) 상의 표지로부터 구별가능한 것인, 방법.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 하나 이상의 제2 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하되, 상기 하나 이상의 제2 프로브는 세포 내 하나 이상의 제2 표적 핵산에 혼성화하며, 상기 하나 이상의 제2 표적 핵산은 하나 이상의 제1 표적 핵산과 동일하거나 또는 상이한 것인, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 세포가 2 개 이상의 제2 표적 핵산에 혼성화된 2 개 이상의 제2 프로브를 포함하는 것인, 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제2 표적 핵산 각각이 제2 프로브에 대한 혼성화에 의해 표지되고, 상기 각 제2 표적 핵산 상의 표지가 제2 프로브에 혼성화된 다른 제2 표적 핵산(들) 상의 표지로부터 구별가능한 것인, 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하되, 상기 산 시약은 제2 프로브와 하나 이상의 제2 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴하는 것인, 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 1 회 이상 반복하는 것인, 방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 세포로부터 제2 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  19. 세포 내 복수의 표적 핵산의 다중 검출 방법으로서,
    (A) 복수의 표적 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 하나 이상의 표적 핵산에 특이적인 프로브 세트와 접촉시키는 단계로서, 상기 표적 핵산에 대한 프로브는 다음을 포함하는 것인, 단계:
    (a) 표적 프로브 세트로, 상기 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브의 하나 이상의 쌍을 포함하는 것;
    (b) 전증폭기(pre-amplifier) 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기는 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (c) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기는 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; 및
    (d) 표지 프로브 세트로, 상기 표지 프로브 세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하는 것;
    (B) 각각의 표적 핵산에 결합된 검출가능한 표지를 검출하는 단계; 및
    (C) 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 세포 내 복수의 표적 핵산의 다중 검출 방법으로서,
    (A) 복수의 표적 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 하나 이상의 표적 핵산에 특이적인 프로브 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표적 핵산에 대한 프로브는 다음을 포함하는 것인, 단계:
    (a) 표적 프로브 세트로, 상기 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브의 하나 이상의 쌍을 포함하는 것;
    (b) 전-전증폭기 세트로, 상기 전-전증폭기 세트는 하나 이상의 전-전증폭기를 포함하며, 상기 각 전-전증폭기는 표적 프로브의 하나 이상의 쌍에 대한 결합 부위를 포함하는 것;
    (c) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기는 전-전증폭기에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (d) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기는 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; 및
    (e) 표지 프로브 세트로, 상기 표지 프로브 세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하는 것;
    (B) 각각의 표적 핵산에 결합된 검출가능한 표지를 검출하는 단계; 및
    (C) 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 세포 내 복수의 표적 핵산의 다중 검출 방법으로서,
    (A) 복수의 표적 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 하나 이상의 표적 핵산에 특이적인 프로브 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표적 핵산에 대한 프로브는 다음을 포함하는 것인, 단계:
    (a) 표적 프로브 세트로, 상기 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브의 하나 이상의 쌍을 포함하는 것;
    (b) 전-전증폭기 세트로, 상기 전-전증폭기 세트는 전-전증폭기의 하나 이상의 쌍을 포함하며, 상기 전-전증폭기 쌍의 각 전-전증폭기는 표적 프로브 쌍의 표적 프로브 중 하나에 대한 결합 부위를 포함하는 것;
    (c) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기는 전-전증폭기 쌍에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (d) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기는 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것; 및
    (e) 표지 프로브 세트로, 상기 표지 프로브 세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하는 것;
    (B) 각각의 표적 핵산에 결합된 검출가능한 표지를 검출하는 단계; 및
    (C) 상기 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 1 회 이상 반복하는 것인, 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (A) 및 (B)를 반복하거나 또는 단계 (A), (B) 및 (C)를 1 회 이상 반복하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  24. 복수의 표적 핵산의 검출 방법으로서,
    (A) 복수의 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 복수의 표적 프로브 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 각 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브 쌍을 포함하는 것인, 단계;
    (B) 상기 샘플을 전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전증폭기는 각 표적 프로브 세트에 특이적인 전증폭기를 포함하며, 상기 각 전증폭기는 표적 프로브 세트 중 하나의 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계;
    (C) 상기 샘플을 증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 증폭기 세트는 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 각 서브세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 표적 프로브 세트에 특이적인 전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계;
    (D) 상기 샘플을 표지 프로브의 제1 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계;
    (E) 상기 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제1 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제1 서브세트를 검출하는, 단계;
    (F) 상기 표적 핵산의 제1 서브세트에 결합된 표지 프로브의 제1 세트로부터 표지를 절단하는 단계;
    (G) 상기 샘플을 표지 프로브의 제2 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 임의적으로 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계;
    (H) 상기 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제2 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제2 서브세트를 검출하는 단계로, 상기 복수의 표적 핵산을 검출하는 것인, 단계; 및
    (I) 상기 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 방법이 단계 (I) 전에 다음을 포함하는 것인, 방법:
    (J) 표적 핵산의 제2 세트에 결합된 표지 프로브의 제2 세트로부터 표지를 절단하는 단계;
    (K) 상기 샘플을 표지 프로브의 제3 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 임의적으로 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; 및
    (L) 상기 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제3 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제3 서브세트를 검출하는 단계.
  26. 제25항에 있어서, 단계 (J) 내지 (L)을 1 회 이상 반복하는 것을 포함하는, 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 1 회 이상 반복하는 것인, 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (A) 내지 (I) 또는 단계 (A) 내지 (H), (J) 내지 (L) 및 (I)를 1 회 이상 반복하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 단계 (A) 내지 (H) 또는 단계 (A) 내지 (H) 및 (J) 내지 (L)을 반복하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  30. 복수의 표적 핵산의 검출 방법으로서,
    (A) 복수의 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 복수의 표적 프로브 세트와 접촉시키는 단계로, 각 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브 쌍을 포함하는 것인, 단계;
    (B) 상기 샘플을 전-전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전-전증폭기 세트는 복수의 전-전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전-전증폭기는 각 표적 프로브 세트에 특이적인 전-전증폭기를 포함하며, 상기 각 전-전증폭기는 표적 프로브 세트 중 하나의 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 전증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계;
    (C) 상기 샘플을 전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전증폭기 세트는 각 전-전증폭기에 특이적인 전증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 전증폭기의 각 서브세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기의 서브세트의 전증폭기는 표적 프로브 세트에 특이적인 전-전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계;
    (D) 상기 샘플을 증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 증폭기 세트는 전증폭기의 각 서브세트에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 각 서브세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 전증폭기의 서브세트 중 하나의 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계;
    (E) 상기 샘플을 표지 프로브의 제1 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계;
    (F) 상기 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제1 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제1 서브세트를 검출하는 단계;
    (G) 상기 표적 핵산의 제1 서브세트에 결합된 표지 프로브의 제1 세트로부터 표지를 절단하는 단계;
    (H) 샘플을 표지 프로브의 제2 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 임의적으로 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계;
    (I) 상기 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제2 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제2 서브세트를 검출하는 단계로, 상기 복수의 표적 핵산을 검출하는 것인, 단계; 및
    (J) 상기 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계를 포함하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 방법이 단계 (J) 전에 다음을 포함하는 것인, 방법:
    (K) 상기 표적 핵산의 제2 세트에 결합된 표지 프로브의 제2 세트로부터 표지를 절단하는 단계;
    (L) 상기 샘플을 표지 프로브의 제3 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 임의적으로 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; 및
    (M) 상기 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제3 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제3 서브세트를 검출하는 단계.
  32. 제31항에 있어서, 단계 (K) 내지 (M)을 1 회 이상 반복하는 것을 포함하는, 방법.
  33. 제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 1 회 이상 반복하는 것인, 방법.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (A) 내지 (J) 또는 단계 (A) 내지 (I), (K) 내지 (M) 및 (J)를 1 회 이상 반복하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 단계 (A) 내지 (I) 또는 단계 (A) 내지 (I) 및 (K) 내지 (M)을 반복하는 것을 추가로 포함하는,방법.
  36. 복수의 핵산의 검출 방법으로서,
    (A) 복수의 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 복수의 표적 프로브 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 각 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브 쌍을 포함하는 것인, 단계;
    (B) 상기 샘플을 전-전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전-전증폭기 세트는 전-전증폭기의 복수의 쌍을 포함하고, 상기 전-전증폭기 세트는 표적 프로브 세트의 표적 프로브 쌍 각각에 특이적인 전-전증폭기 쌍을 포함하고, 상기 전-전증폭기 쌍의 각 전-전증폭기는 표적 프로브 세트의 표적 프로브 쌍의 표적 프로브 중 하나에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 전-전증폭기는 전증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계;
    (C) 상기 샘플을 전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전증폭기는 전-전증폭기의 각 쌍에 특이적인 전증폭기를 포함하며, 상기 각 전증폭기는 전-전증폭기 세트의 전-전증폭기 쌍 중 하나에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계;
    (D) 상기 샘플을 증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 증폭기 세트는 전-전증폭기의 각 쌍에 특이적인 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 전-전증폭기 쌍에 특이적인 전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계;
    (E) 상기 샘플을 표지 프로브의 제1 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계;
    (F) 상기 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제1 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제1 서브세트를 검출하는 단계;
    (G) 상기 표적 핵산의 제1 서브세트에 결합된 표지 프로브의 제1 세트로부터 표지를 절단하는 단계;
    (H) 상기 샘플을 표지 프로브의 제2 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 임의적으로 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계;
    (I) 상기 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제2 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제2 서브세트를 검출하는 단계로, 상기 복수의 표적 핵산을 검출하는 것인, 단계; 및
    (J) 상기 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 상기 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계를 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 방법이 단계 (J) 전에 다음을 포함하는 것인, 방법:
    (K) 상기 표적 핵산의 제2 세트에 결합된 표지 프로브의 제2 세트로부터 표지를 절단하는 단계;
    (L) 상기 샘플을 표지 프로브의 제3 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 임의적으로 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; 및
    (M) 상기 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제3 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제3 서브세트를 검출하는 단계.
  38. 제37항에 있어서, 단계 (K) 내지 (M)을 1 회 이상 반복하는 것을 포함하는, 방법.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 1 회 이상 반복하는 것인, 방법.
  40. 제36항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (A) 내지 (J) 또는 단계 (A) 내지 (I), (K) 내지 (M) 및 (J)를 1 회 이상 반복하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  41. 제40항에 있어서, 단계 (A) 내지 (I) 또는 단계 (A) 내지 (I) 및 (K) 내지 (M)을 반복하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  42. 복수의 표적 핵산의 검출 방법으로서,
    (A) 복수의 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 복수의 표적 프로브 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 각 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브 쌍을 포함하는 것인, 단계;
    (B) 상기 샘플을 전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전증폭기는 각 표적 프로브 세트에 특이적인 전증폭기를 포함하며, 상기 각 전증폭기는 표적 프로브 세트 중 하나의 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계;
    (C) 상기 샘플을 증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 증폭기 세트는 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 각 서브세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 표적 프로브 세트에 특이적인 전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계;
    (D) 상기 샘플을 표지 프로브의 제1 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계;
    (E) 상기 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제1 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제1 서브세트를 검출하는 단계;
    (F) 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고, 표적 프로브, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮은 온도에서 샘플을 배양하여, 표적 핵산의 제1 서브세트에 결합된 표지 프로브의 제1 세트로부터 표지를 제거하는 단계;
    (G) 상기 샘플을 표지 프로브의 제2 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 임의적으로 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계;
    (H) 상기 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제2 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제2 서브세트를 검출하는 단계로, 상기 복수의 표적 핵산을 검출하는 것인, 단계; 및
    (I) 상기 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계를 포함하는, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 방법이 단계 (I) 전에 다음을 포함하는 것인, 방법:
    (J) 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고, 표적 프로브, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮은 온도에서 샘플을 배양하여, 표적 핵산의 제2 세트에 결합된 표지 프로브의 제2 세트로부터 표지를 제거하는 단계;
    (K) 상기 샘플을 표지 프로브의 제3 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 임의적으로 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; 및
    (L) 상기 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제3 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제3 서브세트를 검출하는 단계.
  44. 제43항에 있어서, 단계 (J) 내지 (L)을 1 회 이상 반복하는 것을 포함하는, 방법.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 1 회 이상 반복하는 것인, 방법.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (A) 내지 (I) 또는 단계 (A) 내지 (H), (J) 내지 (L) 및 (I)를 1 회 이상 반복하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  47. 제46항에 있어서, 단계 (A) 내지 (H) 또는 단계 (A) 내지 (H) 및 (J) 내지 (L)을 반복하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  48. 복수의 표적 핵산의 검출 방법으로서,
    (A) 복수의 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 복수의 표적 프로브 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 각 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브 쌍을 포함하는 것인, 단계;
    (B) 상기 샘플을 전-전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전-전증폭기 세트는 복수의 전-전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전-전증폭기는 각 표적 프로브 세트에 특이적인 전-전증폭기를 포함하며, 상기 각 전-전증폭기는 표적 프로브 세트 중 하나의 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 전증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계;
    (C) 상기 샘플을 전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전증폭기 세트는 각 전-전증폭기에 특이적인 전증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 전증폭기의 각 서브세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기의 서브세트의 전증폭기는 표적 프로브 세트에 특이적인 전-전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계;
    (D) 상기 샘플을 증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 증폭기 세트는 전증폭기의 각 서브세트에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 각 서브세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 전증폭기의 서브세트 중 하나의 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계;
    (E) 상기 샘플을 표지 프로브의 제1 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계;
    (F) 상기 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제1 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제1 서브세트를 검출하는 단계;
    (G) 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮은 온도에서 샘플을 배양하여, 표적 핵산의 제1 서브세트에 결합된 표지 프로브의 제1 세트로부터 표지를 제거하는 단계;
    (H) 상기 샘플을 표지 프로브의 제2 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 임의적으로 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계;
    (I) 상기 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제2 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제2 서브세트를 검출하는 단계로, 상기 복수의 표적 핵산을 검출하는 것인, 단계; 및
    (J) 상기 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계를 포함하는, 방법.
  49. 제48항에 있어서, 상기 방법이 단계 (J) 전에 다음을 포함하는 것인, 방법:
    (K) 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮은 온도에서 샘플을 배양하여, 표적 핵산의 제2 세트에 결합된 표지 프로브의 제2 세트로부터 표지를 제거하는 단계;
    (L) 상기 샘플을 표지 프로브의 제3 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 임의적으로 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; 및
    (M) 상기 표적 핵산에 결합된 표적 핵산의 제3 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제3 서브세트를 검출하는 단계.
  50. 제49항에 있어서, 단계 (K) 내지 (M)을 1 회 이상 반복하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 1 회 이상 반복하는 것인, 방법.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (A) 내지 (J) 또는 단계 (A) 내지 (I), (K) 내지 (M) 및 (J)를 1 회 이상 반복하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 단계 (A) 내지 (I) 또는 단계 (A) 내지 (I) 및 (K) 내지 (M)을 반복하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  54. 복수의 핵산의 검출 방법으로서,
    (A) 복수의 핵산을 포함하는 세포를 포함하는 샘플을 복수의 표적 프로브 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 각 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브 쌍을 포함하는 것인, 단계;
    (B) 상기 샘플을 전-전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전-전증폭기 세트는 전-전증폭기의 복수의 쌍을 포함하고, 상기 전-전증폭기 세트는 표적 프로브 세트의 표적 프로브 쌍 각각에 특이적인 전-전증폭기 쌍을 포함하고, 상기 전-전증폭기 쌍의 각 전-전증폭기는 표적 프로브 세트의 표적 프로브 쌍의 표적 프로브 중 하나에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 전-전증폭기는 전증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계;
    (C) 상기 샘플을 전증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전증폭기는 전-전증폭기의 각 쌍에 특이적인 전증폭기를 포함하며, 상기 각 전증폭기는 전-전증폭기 세트의 전-전증폭기 쌍 중 하나에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계;
    (D) 상기 샘플을 증폭기 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 증폭기 세트는 전-전증폭기의 각 쌍에 특이적인 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 전-전증폭기 쌍에 특이적인 전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것인, 단계;
    (E) 상기 샘플을 표지 프로브의 제1 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계;
    (F) 상기 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제1 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제1 서브세트를 검출하는 단계;
    (G) 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮은 온도에서 샘플을 배양하여, 표적 핵산의 제1 서브세트에 결합된 표지 프로브의 제1 세트로부터 표지를 제거하는 단계;
    (H) 상기 샘플을 표지 프로브의 제2 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 임의적으로 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계;
    (I) 상기 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제2 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제2 서브세트를 검출하는 단계로, 상기 복수의 표적 핵산을 검출하는 것인, 단계; 및
    (J) 상기 샘플을 산 시약과 접촉시켜, 표적 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 단계를 포함하는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 방법이 단계 (J) 전에 다음을 포함하는 것인, 방법:
    (K) 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도보다 높고, 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮은 온도에서 샘플을 배양하여, 표적 핵산의 제2 세트에 결합된 표지 프로브의 제2 세트로부터 표지를 제거하는 단계;
    (L) 상기 샘플을 표지 프로브의 제3 세트와 접촉시키는 단계로, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 임의적으로 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 복수의 표적 프로브 세트에 혼성화된 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지하는 것인, 단계; 및
    (M) 상기 표적 핵산에 결합된 표지 프로브의 제3 세트의 표지 프로브를 검출하여, 표적 핵산의 제3 서브세트를 검출하는 단계.
  56. 제55항에 있어서, 단계 (K) 내지 (M)을 1 회 이상 반복하는 것을 포함하는, 방법.
  57. 제54항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 1 회 이상 반복하는 것인, 방법.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (A) 내지 (J) 또는 단계 (A) 내지 (I), (K) 내지 (M) 및 (J)를 1 회 이상 반복하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 단계 (A) 내지 (I) 또는 단계 (A) 내지 (I) 및 (K) 내지 (M)을 반복하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  60. 제24항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 각 표적 프로브 세트가 동일한 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브의 2 개 이상의 쌍을 포함하는 것인, 방법.
  61. 제1항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산 시약이 5-40% 또는 20-30% 산을 포함하는 것인, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 산이 아세트산, 포름산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말산, 타르타르산, 및 시트르산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  63. 제1항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산 시약이 염을 포함하는 것인, 방법
  64. 제63항에 있어서, 상기 산 시약이 SSC를 포함하는 것인, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 산 시약이 1X 내지 13X SSC 또는 3.2X 내지 12.8X SSC를 포함하는 것인, 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 핵산이 독립적으로 DNA 또는 RNA인, 방법.
  67. 제66항에 있어서, RNA인 상기 표적 핵산이 메신저 RNA(mRNA), 마이크로 RNA(miRNA), 리보솜 RNA(rRNA), 미토콘드리아 RNA, 및 비-코딩 RNA로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는 것인, 방법.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 조직 시료이거나 또는 조직 시료로부터 유래되는 것인, 방법.
  69. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 혈액 샘플이거나 또는 혈액 샘플로부터 유래되는 것인, 방법.
  70. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 세포학적 샘플이거나 또는 세포학적 샘플로부터 유래되는 것인, 방법.
  71. 제1항 내지 제70항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 하나 이상의 핵산 표적에 특이적인 하나 이상의 프로브, 및 지침을 포함하는 키트.
  72. 세포 내 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 방법에 사용하기 위한 산 시약을 포함하는 키트로서, 상기 방법은 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 세포는 세포 내 제1 표적 핵산에 혼성화된 제1 프로브를 포함하며, 상기 산 시약은 제1 프로브와 제1 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴하는 것인, 키트.
  73. 제72항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계가 1 회 이상 반복되는 것인, 키트.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 상기 세포로부터 제1 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 키트.
  75. 제74항에 있어서, 상기 세포를 제2 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하되, 상기 제2 프로브는 세포 내 제2 표적 핵산에 혼성화하며, 상기 제2 표적 핵산은 제1 표적 핵산과 동일하거나 또는 상이한 것인, 키트.
  76. 제75항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하되, 상기 산 시약은 제2 프로브와 제2 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴하는 것인, 키트.
  77. 제76항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계가 1 회 이상 반복되는 것인, 키트.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 세포로부터 제2 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 키트.
  79. 세포 내 핵산에 결합된 프로브의 결합을 파괴하는 방법에 사용하기 위한 산 시약을 포함하는 키트로서, 상기 방법은 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 세포는 세포 내 하나 이상의 제1 표적 핵산에 혼성화된 하나 이상의 제1 프로브를 포함하며, 상기 산 시약은 하나 이상의 제1 프로브와 하나 이상의 제1 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴하는 것인, 키트.
  80. 제79항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계가 1 회 이상 반복되는 것인, 키트.
  81. 제79항 또는 제80항에 있어서, 상기 세포로부터 하나 이상의 제1 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 키트.
  82. 제79항 또는 제80항에 있어서, 상기 세포가 2 개 이상의 제1 표적 핵산에 혼성화된 2 개 이상의 제1 프로브를 포함하는 것인, 키트.
  83. 제82항에 있어서, 상기 제1 표적 핵산 각각이 제1 프로브에 대한 혼성화에 의해 표지되고, 상기 각 제1 표적 핵산 상의 표지가 제1 프로브에 혼성화된 다른 제1 표적 핵산(들) 상의 표지로부터 구별가능한 것인, 키트.
  84. 제79항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 하나 이상의 제2 프로브와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하되, 상기 하나 이상의 제2 프로브는 세포 내 하나 이상의 제2 표적 핵산에 혼성화하며, 상기 하나 이상의 제2 표적 핵산은 하나 이상의 제1 표적 핵산과 동일하거나 또는 상이한 것인, 키트.
  85. 제84항에 있어서, 상기 세포가 2 개 이상의 제2 표적 핵산에 혼성화된 2 개 이상의 제2 프로브를 포함하는 것인, 키트.
  86. 제85항에 있어서, 상기 제2 표적 핵산 각각이 제2 프로브에 대한 혼성화에 의해 표지되고, 상기 각 제2 표적 핵산 상의 표지가 제2 프로브에 혼성화된 다른 제2 표적 핵산(들) 상의 표지로부터 구별가능한 것인, 키트.
  87. 제84항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계를 추가로 포함하되, 상기 산 시약은 제2 프로브와 하나 이상의 제2 표적 핵산 사이의 혼성화를 파괴하는 것인, 키트.
  88. 제87항에 있어서, 상기 세포를 산 시약과 접촉시키는 단계가 1 회 이상 반복되는 것인, 키트.
  89. 제87항 또는 제88항에 있어서, 상기 세포로부터 제2 프로브를 제거하는 단계를 추가로 포함하는, 키트.
  90. 표적 핵산의 제자리(in situ) 검출을 위한 키트로서,
    (A) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기는 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (B) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기는 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (C) 표지 프로브 세트로, 상기 표지 프로브 세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하는 것; 및
    (D) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 것 포함하는, 키트.
  91. 제90항에 있어서, 상기 키트가 표적 프로브 세트를 포함하되, 상기 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브의 하나 이상의 쌍을 포함하는 것인, 키트.
  92. 표적 핵산의 제자리 검출을 위한 키트로서,
    (A) 전-전증폭기 세트로, 상기 전-전증폭기 세트는 하나 이상의 전-전증폭기를 포함하며, 상기 각 전-전증폭기는 표적 프로브의 하나 이상의 쌍에 대한 결합 부위를 포함하는 것;
    (B) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기는 전-전증폭기에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (C) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기는 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (D) 표지 프로브 세트로, 상기 표지 프로브 세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하는 것; 및
    (E) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 것을 포함하는, 키트.
  93. 제92항에 있어서, 상기 키트가 표적 프로브 세트를 포함하되, 상기 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브의 하나 이상의 쌍을 포함하는 것인, 키트.
  94. 표적 핵산의 제자리 검출을 위한 키트로서,
    (A) 전-전증폭기 세트로, 상기 전-전증폭기 세트는 전-전증폭기의 하나 이상의 쌍을 포함하며, 상기 전-전증폭기 쌍의 각 전-전증폭기는 표적 프로브 쌍의 표적 프로브 중 하나에 대한 결합 부위를 포함하는 것;
    (B) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기는 전-전증폭기 쌍에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (C) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기는 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (D) 표지 프로브 세트로, 상기 표지 프로브 세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하는 것; 및
    (E) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 것을 포함하는, 키트.
  95. 제94항에 있어서, 상기 키트가 표적 프로브 세트를 포함하되, 상기 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브의 하나 이상의 쌍을 포함하는 것인, 키트.
  96. 표적 핵산의 제자리 검출을 위한 키트로서,
    (A) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전증폭기는 하나 이상의 표적 프로브 세트 각각에 특이적인 전증폭기를 포함하며, 상기 각 전증폭기는 표적 프로브 세트 중 하나의 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (B) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 각 서브세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 표적 프로브 세트에 특이적인 전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (C) 표지 프로브의 제1 세트로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것;
    (D) 표지 프로브의 제2 세트로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것; 및
    (E) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 것을 포함하는, 키트.
  97. 제96항에 있어서, 표지 프로브의 제3 세트를 추가로 포함하되, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것인, 키트.
  98. 표적 핵산의 제자리 검출을 위한 키트로서,
    (A) 전-전증폭기 세트로, 상기 전-전증폭기 세트는 복수의 전-전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전-전증폭기는 하나 이상의 표적 프로브 세트 각각에 특이적인 전-전증폭기를 포함하며, 상기 각 전-전증폭기는 표적 프로브 세트 중 하나의 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 전증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (B) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 각 전-전증폭기에 특이적인 전증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 전증폭기의 각 서브세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기의 서브세트의 전증폭기는 표적 프로브 세트에 특이적인 전-전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (C) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 전증폭기의 각 서브세트에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 각 서브세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 전증폭기의 서브세트 중 하나의 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (D) 표지 프로브의 제1 세트로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것;
    (E) 표지 프로브의 제2 세트로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브이고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것;
    (F) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 것을 포함하는, 키트.
  99. 제98항에 있어서, 표지 프로브의 제3 세트를 추가로 포함하되, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것인, 키트.
  100. 표적 핵산의 제자리 검출을 위한 키트로서,
    (A) 전-전증폭기 세트로, 상기 전-전증폭기 세트는 전-전증폭기의 복수의 쌍을 포함하고, 상기 전-전증폭기 세트는 하나 이상의 표적 프로브 세트의 표적 프로브 쌍의 각 표적 프로브에 특이적인 전-전증폭기 쌍을 포함하고, 상기 전-전증폭기 쌍의 각 전-전증폭기는 표적 프로브 세트의 표적 프로브 쌍의 표적 프로브 중 하나에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 전-전증폭기는 전증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (B) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전증폭기는 전-전증폭기의 각 쌍에 특이적인 전증폭기를 포함하며, 상기 각 전증폭기는 전-전증폭기 세트의 전-전증폭기 쌍 중 하나에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (C) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 전-전증폭기의 각 쌍에 특이적인 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 전-전증폭기 쌍에 특이적인 전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (D) 표지 프로브의 제1 세트로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것;
    (E) 표지 프로브의 제2 세트로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것; 및
    (F) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 것을 포함하는, 키트.
  101. 제100항에 있어서, 표지 프로브의 제3 세트를 추가로 포함하되, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것인, 키트.
  102. 제96항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트가 표지 프로브로부터 절단가능한 표지를 절단하기 위한 절단제를 포함하는 것인, 키트.
  103. 표적 핵산의 제자리 검출을 위한 키트로서,
    (A) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전증폭기는 하나 이상의 표적 프로브 세트 각각에 특이적인 전증폭기를 포함하며, 상기 각 전증폭기는 표적 프로브 세트 중 하나의 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (B) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 각 서브세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 표적 프로브 세트에 특이적인 전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (C) 표지 프로브의 제1 세트로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것;
    (D) 표지 프로브의 제2 세트로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것; 및
    (E) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 것을 포함하는, 키트.
  104. 제103항에 있어서, 표지 프로브의 제3 세트를 추가로 포함하되, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것인, 키트.
  105. 표적 핵산의 제자리 검출을 위한 키트로서,
    (A) 전-전증폭기 세트로, 상기 전-전증폭기 세트는 전-전증폭기의 복수의 쌍을 포함하고, 상기 전-전증폭기 세트는 하나 이상의 표적 프로브 세트의 표적 프로브 쌍 각각에 특이적인 전-전증폭기 쌍을 포함하고, 상기 전-전증폭기 쌍의 각 전-전증폭기는 표적 프로브 세트의 표적 프로브 쌍의 표적 프로브의 하나에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 전-전증폭기는 전증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (B) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전증폭기는 전-전증폭기의 각 쌍에 특이적인 전증폭기를 포함하며, 상기 각 전증폭기는 전-전증폭기 세트의 전-전증폭기 쌍 중 하나에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (C) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 전-전증폭기의 각 쌍에 특이적인 각 전증폭기에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 전-전증폭기 쌍에 특이적인 전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (D) 표지 프로브의 제1 세트로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것;
    (E) 표지 프로브의 제2 세트로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지는 절단가능하고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것; 및
    (F) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 것을 포함하는, 키트.
  106. 제105항에 있어서, 표지 프로브의 제3 세트를 추가로 포함하되, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것인, 키트.
  107. 표적 핵산의 제자리 검출을 위한 키트로서,
    (A) 전-전증폭기 세트로, 상기 전-전증폭기 세트는 복수의 전-전증폭기를 포함하며, 상기 복수의 전-전증폭기는 하나 이상의 표적 프로브 세트 각각에 특이적인 전-전증폭기를 포함하며, 상기 각 전-전증폭기는 표적 프로브 세트 중 하나의 표적 프로브 쌍에 대한 결합 부위 및 전증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (B) 전증폭기 세트로, 상기 전증폭기 세트는 각 전-전증폭기에 특이적인 전증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 전증폭기의 각 서브세트는 복수의 전증폭기를 포함하며, 상기 전증폭기의 서브세트의 전증폭기는 표적 프로브 세트에 특이적인 전-전증폭기 중 하나에 대한 결합 부위 및 증폭기에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (C) 증폭기 세트로, 상기 증폭기 세트는 전증폭기의 각 서브세트에 특이적인 증폭기의 복수의 서브세트를 포함하며, 상기 증폭기의 각 서브세트는 복수의 증폭기를 포함하며, 상기 증폭기의 서브세트의 증폭기는 전증폭기의 서브세트 중 하나의 전증폭기에 대한 결합 부위 및 표지 프로브에 대한 복수의 결합 부위를 포함하는 것;
    (D) 표지 프로브의 제1 세트로, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표지 프로브의 복수의 제1 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하며, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각에서 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제1 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제1 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제1 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것;
    (E) 표지 프로브의 제2 세트로, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표지 프로브의 복수의 제2 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제2 서브세트는 표지 프로브의 제1 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제2 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제2 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제2 세트는 표적 핵산의 제1 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제2 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것; 및
    (F) 산 시약으로, 상기 산 시약은 표적 프로브와 각각의 표적 핵산 사이의 혼성화 파괴에 영향을 미치는 것을 포함하는, 키트.
  108. 제107항에 있어서, 표지 프로브의 제3 세트를 추가로 포함하되, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표지 프로브의 복수의 제3 서브세트를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 제3 서브세트는 표지 프로브의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 증폭기의 서브세트의 증폭기에 특이적이고, 상기 표지 프로브의 각 서브세트는 복수의 표지 프로브를 포함하고, 상기 표지 프로브의 서브세트 각각의 표지 프로브는 표지 및 증폭기의 서브세트 중 하나의 증폭기에 대한 결합 부위를 포함하고, 상기 표지 프로브의 각 제3 서브세트에서 표지는 표지 프로브의 제3 서브세트 사이를 구별가능하고 상기 표지 프로브와 증폭기 사이의 용융 온도는 표적 프로브, 전-전증폭기, 전증폭기 및 증폭기 사이의 용융 온도보다 낮고, 상기 표지 프로브의 제3 세트는 표적 핵산의 제1 및 제2 서브세트와 상이한 표적 핵산의 제3 서브세트를 특이적으로 표지할 수 있는 것인, 키트.
  109. 제96항 내지 제108항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트가 하나 이상의 표적 프로브 세트를 포함하며, 상기 각 표적 프로브 세트는 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하는 표적 프로브 쌍을 포함하는 것인, 키트.
  110. 제109항에 있어서, 상기 각 표적 프로브 세트가 동일한 표적 핵산에 특이적으로 혼성화할 수 있는 표적 프로브의 2 개 이상의 쌍을 포함하는 것인, 키트.
  111. 제96항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키트가 세포를 고정 및/또는 투과하기 위한 적어도 하나의 시약을 포함하는 것인, 키트.
  112. 제71항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산 시약이 5-40% 또는 20-30% 산을 포함하는 것인, 키트.
  113. 제112항에 있어서, 상기 산이 아세트산, 포름산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말산, 타르타르산, 및 시트르산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 키트.
  114. 제71항 내지 제113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 산 시약이 염을 포함하는 것인, 키트.
  115. 제114항에 있어서, 상기 산 시약이 SSC를 포함하는 것인, 키트.
  116. 제115항에 있어서, 상기 산 시약이 1X 내지 13X SSC 또는 3.2X 내지 12.8X SSC를 포함하는 것인, 키트.
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WO2020168162A1 (en) * 2019-02-15 2020-08-20 Bio-Techne Corporation Methods for multiplex detection of nucleic acids by in situ hybridization
WO2024124041A1 (en) * 2022-12-07 2024-06-13 Advanced Cell Diagnostics, Inc. Multiplexed detection of nucleic acid targets

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2500439T4 (da) * 2005-06-20 2017-11-13 Advanced Cell Diagnostics Inc Kits og produkter til detektering af nukleinsyrer i individuelle celler og til identifikation af sjældne celler fra store heterogene cellepopulationer
US20130023433A1 (en) * 2009-09-28 2013-01-24 Yuling Luo Methods of detecting nucleic acid sequences with high specificity
WO2017196527A1 (en) * 2016-05-10 2017-11-16 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Consecutive hybridization for multiplexed analysis of biological samples
US11352660B2 (en) * 2016-10-04 2022-06-07 Howard Hughes Medical Institute Materials and methods for serial multiplexed detection of RNA in cells and tissues
EP4339956A3 (en) * 2016-11-08 2024-06-19 President and Fellows of Harvard College Multiplexed imaging using merfish, expansion microscopy, and related technologies
WO2020168162A1 (en) * 2019-02-15 2020-08-20 Bio-Techne Corporation Methods for multiplex detection of nucleic acids by in situ hybridization

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