CN114945681A - 用于连续核酸检测的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过使样品与酸试剂接触以去除结合的核酸检测系统来对多个靶核酸进行多路复用检测的方法，从而允许再次使用相同的检测系统来检测不同的靶核酸并提供更高水平的多路复用。本发明还涉及含有酸试剂和任选的用于检测靶核酸的探针的试剂盒。

Description

用于连续核酸检测的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年11月20日提交的美国临时专利申请号62/938,138的优先权，所述申请的全部内容完全以引用的方式并入本文。
背景技术
本发明总体上涉及核酸的检测，并且更具体地涉及核酸的多路复用检测。
RNA原位杂交(ISH)是广泛用于测量和定位细胞如循环肿瘤细胞(CTC)或组织切片内的特定RNA序列(例如信使RNA(mRNA)、长非编码RNA(lncRNA)和微RNA(miRNA))，同时保留细胞和组织背景的分子生物学技术。因此，RNA ISH提供了细胞和组织内基因表达的时空可视化以及定量。它在研究和诊断中具有广泛的应用(Hu等人,Biomark.Res.2(1):1-13,doi:10.1186/2050-7771-2-3(2014)；Ratan等人,Cureus 9(6):e1325.doi:10.7759/cureus.1325(2017)；Weier等人,Expert Rev.Mol.Diagn.2(2):109-119(2002)))。荧光RNAISH分别利用荧光染料和荧光显微镜进行RNA标记和检测。荧光RNA ISH通常提供四至五个靶序列的有限多路复用。有限的多路复用能力主要是由于可由荧光显微镜的光学系统区分的少量光谱上不同的荧光染料。在如产生细胞和组织图以理解复杂生物系统的领域中，特别是在人类健康和疾病中，高度期望更高水平的多路复用。
已经引入了几种利用连续轮次的杂交、成像、标记去除和与不同靶标的重新杂交的方法，这在理论上提供了对同一细胞或组织切片中的四至五的倍数个靶标的成像(Shah等人,Neuron 92(2):342-357(2016)；Codeluppi等人,Nature Methods 15(11):932–935(2018)；Kishi等人,Nat.Methods 16:533–544(2019))。然而，在实践中，先前描述的连续荧光ISH(FISH)方法可能导致连续轮次的杂交和检测中的核酸检测敏感性(特别是RNA检测敏感性)以和细胞形态的大量损失。
例如，酶DNA酶I通常用于去除靶探针和基于杂交链式反应的信号放大系统(Shah等人，同上，2016)。然而，DNA酶I消化会破坏核结构以及细胞形态，并因此阻碍后续的图像配准和分析步骤。酶外切核酸酶I也被报道可剥离基于长DNA多联体的放大系统(Kishi等人，同上，2019)。然而，使用这种方法，不能直接测量和控制酶活性，并且此过程需要相对大量的酶、在较高温度下较长的孵育时间、后固定和大量的洗涤步骤。
因此，需要简单、可靠且有效的方法来去除靶探针和信号放大系统，这些方法对细胞核酸完整性(如RNA完整性)和形态的影响也最小，以实现多个轮次的杂交。本发明满足了这种需要并且也提供了相关的优点。
发明内容
本发明提供了一种用于去除细胞中与核酸结合的探针的方法，所述方法包括使所述细胞与酸试剂接触，其中所述细胞包含与细胞中的第一靶核酸杂交的第一探针，并且其中所述酸试剂破坏所述第一探针与所述第一靶核酸之间的杂交；以及从所述细胞中去除所述第一探针。任选地，可以重复这些步骤以提供细胞中连续轮次的核酸多路复用检测。
附图说明
图1显示了多路复用测定的工作流程(
Figure BDA0003741356720000021
HiPlex测定工作流程)的示意图。N个靶序列与靶探针(描述为双Z探针)杂交，并同时通过放大系统如
Figure BDA0003741356720000031
来放大信号。在所描绘的实施方案中，前四个靶标通过四个非光谱重叠荧光染料缀合寡的核苷酸(标记探针)进行检测，并使用常规荧光显微镜或扫描仪进行成像。然后从标记探针上切下荧光团，并且接下来的四个靶标使用相同的方法进行标记和成像。在对四个靶标各检测L个轮次后，使用图像配准软件算法对图像进行配准，以创建具有单细胞分辨率的叠加图像的最终复合。
图2A和2B显示了使用酸试剂去除靶探针的核酸探针连续杂交的示意图。图2A显示了酸处理和去除与靶核酸结合的探针以进行连续杂交的示意图。N个靶探针与靶核酸杂交，例如在原位杂交测定中。此图描绘了与靶核酸杂交的靶探针的任选的信号放大。可以对细胞进行复染以促进细胞的可视化，例如，可以用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行染色。例如，通过成像使靶探针和复染的细胞可视化，从而检测并成像靶核酸。在使用
Figure BDA0003741356720000032
测定的情况下，
Figure BDA0003741356720000033
双Z探针和信号通过
Figure BDA0003741356720000034
放大系统同时放大。进行酸处理步骤以去除与相应靶标结合的靶探针。可以通过将整个N重(N-plex)工作流程重复一个或多个轮次来检测一组或多组另外的N个靶核酸。检测所有靶标后，使用图像配准软件算法对图像进行配准，以创建具有单细胞分辨率的叠加图像的最终复合。此方法可用的多路复用总水平为每轮次N个靶标×K个轮次的N重复用(N-plexing)。一般来说，N＝1或更多，并且当包括酸去除步骤时，K＝2或更多。在图2A所示的描绘中，如果K＝1，则不需要酸去除步骤，因为只需要进行一个轮次的靶探针杂交和成像。
图2B显示了酸处理和去除与靶核酸结合的探针以进行连续杂交的示意图。N个靶探针与靶核酸杂交，例如在原位杂交测定(如
Figure BDA0003741356720000035
HiPlex测定)中。N个靶探针与靶序列杂交(例如,使用
Figure BDA0003741356720000036
双Z探针)，并且同时例如通过
Figure BDA0003741356720000037
放大系统来放大信号。此图描绘了与靶核酸杂交的靶探针的任选的信号放大。可以对细胞进行复染以促进细胞的可视化，例如，可以用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行染色。N个靶核酸通过迭代轮次的标记(例如荧光标记)、成像和可检测标记的切割(例如荧光标记的切割)来检测。图中，N个靶核酸与N个靶探针杂交并迭代检测，使得N个靶标的一个亚组(N个靶标亚组1)被标记和检测，并且从标记的核酸的亚组行切割标记(L个轮次的标记探针杂交，其中L＝1)，然后N个靶标的第二个亚组(N个靶标亚组2)被标记和检测，并且从标记的核酸的亚组上切割标记(L个轮次的标记探针杂交，其中L＝2)，以此类推，直到检测到所有N个靶核酸。所有N个靶核酸以所需轮数的标记(L＝所需的标记轮次)进行检测后，进行酸处理步骤以去除杂交的N个靶探针(如ZZ探针-信号产生复合物)。可以通过将整个N重工作流程重复一个或多个轮次来检测一组或多组另外的N个靶核酸(例如，N'靶核酸、N”靶核酸等)。检测所有靶标后，使用图像配准软件算法对图像进行配准，以创建具有单细胞分辨率的叠加图像的最终复合。此方法可用的多路复用的总水平是每轮次的N个靶核酸×K个轮次的N重复用(其中“N重复用”是指从“N个靶探针杂交”到“探针和扩增子的酸去除”的流程或者到最终轮次的最后的“复染和成像”步骤。一般来说，N＝1或更多，并且当包括酸去除步骤时，K＝2或更多。在图2B所示的描绘中，如果K＝1，则不需要探针和扩增子的酸去除步骤，因为只需要进行L个轮次的标记探针杂交、成像和荧光团切割。
图3A和3B显示了用于连续轮次的靶核酸检测的酸处理。图3A显示了酸处理有效去除新鲜冷冻小鼠脑中的靶探针和放大复合物。显示在制备为新鲜冷冻切片的小鼠脑中检测四种高表达的阳性对照基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)、磷酸甘油酸激酶1(Pgk1)、碱性螺旋-环-螺旋家族成员E22(Bhlhe22)和络合蛋白(complexin)2(Cplx2)。针对四种基因的靶探针(ZZ探针)一起进行杂交，并使用
Figure BDA0003741356720000041
HiPlex放大系统一起放大信号。在第一轮次的迭代检测中使用荧光标记的探针检测这四种基因，这些探针对应于分配给这四种靶探针的信号放大系统。Alexa 488、ATTO 550、ATTO 647N和Alexa 750荧光团分别用于检测Gapdh、Pgk1、Bhlhe22和Cplx2，并且用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)将细胞核染成蓝色(上图)。信号检测后，将组织切片在室温(RT)下用酸溶液(20％乙酸，6.4X SSC)处理5分钟，并且再重复两次酸处理。然后将切片用于第二轮次的杂交和放大，无需添加靶探针。在酸处理后的第二轮次中几乎没有检测到信号(下图)，因此这表明完全去除了先前杂交的靶探针和信号放大组分。
图3B显示了酸处理对新鲜冷冻小鼠脑的细胞RNA和组织形态的影响最小。在制备为新鲜冷冻切片的小鼠脑中检测到四种阳性对照基因(Gapdh、Pgk1、Bhlhe22和Cplx2)，如图3A(上图)中所述。信号检测后，如图3A所述用酸溶液处理切片，不同的是酸处理重复四次而不是两次。然后将处理过的切片用于第二轮次的杂交和放大以检测相同的四个基因。将第二轮次的杂交(下图)中检测到的信号与第一轮次的杂交(上图)中检测到的信号进行比较，两个轮次的靶探针杂交和信号放大产生了相似的表达模式，这表明重复酸处理的RNA损失最小。
图4显示了两个轮次的酸处理和连续杂交后良好的形态和信号检测。在图4中，上图显示在第一轮次(k＝1)的靶探针杂交和第三轮次的迭代检测(l＝3)中，在新鲜冷冻小鼠脑切片中检测四种阳性对照基因RNA聚合酶II亚基A(Polr2A)、肽基脯氨酰异构酶B(Ppib)、泛素C(Ubc)和次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(Hprt1)，基本上如在图2B中概述的工作流程所示进行。使用
Figure BDA0003741356720000051
Hiplex测定同时杂交和放大十二个靶探针(
Figure BDA0003741356720000052
HiPlex12重小鼠阳性对照)。使用Alexa 488、ATTO 550、ATTO 647N和Alexa 750荧光团在第一轮次中检测四个基因，并在成像后将荧光团切割下来。使用相同的四个荧光团在第二轮次的检测中检测接下来的四个基因，并在成像后将荧光团切割下来。第三轮次的迭代检测如图4上图所示。Alexa 488、ATTO 550、ATTO 647N和Alexa 750荧光团分别用于检测Polr2a、Ppib、Ubc和Hprt1，并用DAPI将细胞核染成蓝色。在图4中，下图显示在第三轮次的(k＝3)靶探针杂交和放大以及第一轮次的迭代检测(l＝1)中，在小鼠脑的纹状体区域中检测四种不同的低表达靶标5-羟色胺受体7(Htr7)、原钙粘蛋白8(Pcdh8)、溶质载体家族32成员1(Slc32a1)和酪氨酸羟化酶(Th)。如图3A中所述，在第1轮次和第2轮次靶标杂交之后进行酸处理、靶标杂交和放大步骤。酸处理后进行第二轮次的靶探针杂交和放大。不包括靶探针，而是使用探针稀释剂。在第二次酸处理后使用12个不同的靶探针进行第三轮次的靶探针杂交和放大。如下图所示，在第一轮次的检测中首先检测到12个靶探针中的四个。
图5A-5C显示了使用信号产生复合物(SGC)来检测核酸靶的前述方法的示意图。PPA，前置前置扩增子；PA，前置扩增子；AMP，扩增子；LP，标记探针。
图6A-6C显示了靶核酸的正交标记的示意图。图6A显示了基于
Figure BDA0003741356720000061
测定的靶核酸的正交标记。图6A显示了用相应的信号产生复合物(SGC)来标记三个示例性靶核酸。图6A显示了靶探针对1(TP1a和TP1b)与靶核酸1的结合。显示了前置扩增子(PA1)与靶探针对(TP1a和TP1b)结合。显示了多个扩增子(AMP1)与PA1结合。显示了多个标记探针(LP1)与扩增子结合。图6A显示了靶标2和3的类似配置，其中SGC的组分(靶探针、前置扩增子、扩增子、标记探针)对于相应靶标中的每个都是特定的。图6B显示了对图6A中所示配置的修改。图6B显示了用相应的信号产生复合物(SGC)来标记两个示例性靶核酸。图6B显示了靶探针对1(TP1a和TP1b)与靶核酸1的结合。显示了前置前置扩增子(PPA1)与靶探针对(TP1a和TP1b)结合。显示了多个前置扩增子(PA1)与PPA1结合。显示了多个扩增子(AMP1)与PA1结合。为了简单起见，显示了扩增子与一个前置扩增子结合，但是应理解，扩增子可以结合所有前置扩增子。显示了多个标记探针(LP1)与扩增子结合。图6B显示了靶标2的类似配置，其中SGC的组分(靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子、扩增子、标记探针)对于相应靶标中的每个是特定的。图6C显示了基于BasescopeTM测定的靶核酸的正交标记。图6C显示了用相应的信号产生复合物(SGC)来标记两个示例性靶核酸。图6C显示了靶探针对1(TP1a和TP1b)与靶核酸1的结合。显示了一对前置前置扩增子(PPA1a和PPA1b)与相应的靶探针对(TP1a和TP1b)结合。显示了前置扩增子(PA1)与前置前置扩增子对(PPA1a和PPA1b)结合。显示了多个扩增子(AMP1)与PA1结合。为了简单起见，显示了扩增子与一个前置扩增子结合，但是应理解，扩增子可以结合所有前置扩增子。显示了多个标记探针(LP1)与扩增子结合。图6C显示了靶标2的类似配置，其中SGC的组分(靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子、扩增子、标记探针)对于相应靶标中的每个都是特定的。
具体实施方式
本发明涉及用于连续多路复用分析核酸的方法，例如，通过原位杂交。本发明的方法允许检测同一样品内和同一细胞内的多个靶核酸。
本文描述了一种化学方法，所述方法可以快速且有效地去除寡核苷酸探针和分支DNA样信号放大系统，而对细胞核酸或细胞形态几乎没有影响。这是通过使用含酸的溶液来实现的，所述溶液通常在室温下并在很短的时间内施用于细胞或组织样品，其间几乎没有洗涤步骤。本发明的方法允许以更高水平的多路复用进行核酸检测，以实现与先前描述的核酸检测测定相比检测样品内甚至同一细胞内更多的核酸。
一种核酸检测方法利用称为
Figure BDA0003741356720000071
的RNA ISH技术，所述技术使用特别设计的寡核苷酸探针(有时称为“双Z”或ZZ探针)与分支DNA样信号放大系统的组合，从而在标准亮视野显微镜检查下以单分子敏感性可靠地检测小至1千碱基的RNA(Anderson等人,J.Cell.Biochem.117(10):2201–2208(2016)；Wang等人,J.Mol.Diagn.14(1):22-29(2012))。这样的探针设计极大地提高了信号放大的特异性，因为只有当每对中的两个探针都与其预期靶标结合时，信号放大才可以发生。
Figure BDA0003741356720000072
技术可以使用荧光检测同时区分多达四个或五个RNA靶标。
另一种最近描述的核酸检测方法(参见2019年2月15日提交的美国临时申请号62/806,574)使用L(L＝1、2、3...)个轮次的迭代荧光标记I(I＝2、3、4...)个靶标，随后是成像和切割标记，如图1所示的荧光团切割。迭代检测方法提供了来自单个轮次的杂交和放大步骤的L×I个不同靶序列(N)的同时可视化。图1中的“N”表示要检测的靶标总数，并且上面所述的“I”表示在L个轮次中的每个中每迭代的靶标数。一般来说，每个迭代轮次的标记中的靶标(I)数目将是2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个，并且以此类推直到达到如本文所公开的可以在单个轮次中被明确标记和检测的数目。如果需要，一个轮次可以检测单个靶核酸(I＝1)。在一些实施方案中，靶标的数目I在每个轮次中都可以不同。例如，在三个轮次的检测中，其中每个轮次的I分别为4、4和1，总共将检测9个靶标。因此，靶标数N＝求和(i1,i2,i3...iL)，其中i1、i2、i3为每个迭代轮次中检测的靶标数，它们可以相同或不同，并且L为轮次总数。数字“i”在每个轮次中相同的情况下，N＝L×I。
为了提供进行迭代检测步骤的能力，标记如荧光染料是可切割的(例如化学可切割的)，从而允许使用与第一轮次相同的标记进行后续轮次的检测。在一个轮次内，利用了可以使用常规荧光显微镜光谱分离的荧光染料缀合物。然后将荧光染料切割下来。一种示例性切割剂是还原剂三(2-羧乙基)膦(TCEP)。在可检测标记(如荧光染料)切割后，进行后续轮次的靶标检测和成像。此测定策略消除了从前一轮次剥离可能破坏与剩余靶标相关的现有信号放大复合物的标记探针的需要，并且还保持组织和RNA的完整性以实现最大化检测。
与
Figure BDA0003741356720000081
探针一样，每个靶探针都含有与靶核酸中的特定序列结合的靶结合区段(靶结合位点)。如本文所述，探针还含有与信号放大分子结合的“尾”序列。两个探针成对与靶核酸序列中的相邻位点结合。只有当两个探针都与它们相应的靶位点结合时，才能形成信号放大分子的完整结合位点(例如，如图6A中的前置扩增子或如图6B和6C中的前置前置扩增子)，从而导致成功的信号放大和检测。针对在同一轮次中检测到的不同靶序列的探针被设计成具有针对对应正交放大分子的独立且不同的结合序列。可以使用适当的算法容易地设计此类序列，以实现多个靶标的平行探针杂交和信号放大。使用可检测标记(如荧光团)在多个轮次中检测靶标，这些可检测标记在每个轮次中光谱不同。
这种检测策略被适用于称为
Figure BDA0003741356720000091
的RNA ISH技术。结果是一种称为
Figure BDA0003741356720000092
HiPlex的测定，它以单细胞分辨率同时提供多个靶核酸序列的特异性的和放大的检测。这是通过所有靶标序列的同时靶标杂交和放大，随后在连续轮次中迭代检测通常三至五个核酸靶来实现的。在此测定中可以检测到的靶序列的数目受到使用的正交
Figure BDA0003741356720000093
信号放大系统数目的限制。
本文描述了测定和检测策略，其使用检测系统(例如
Figure BDA0003741356720000094
信号放大系统)和具有共同光谱特征的荧光染料以单细胞分辨率以迭代方式提供两个或更多个靶核酸序列的特异性检测。在不需要额外的正交
Figure BDA0003741356720000095
信号放大系统的情况下，一种增加多路复用水平的方法是在所有靶标被检测和成像后完全去除靶探针和它们相关的信号放大系统。然后可以再次将相同检测系统用于后续轮次的靶探针杂交和信号放大。
本发明涉及允许对细胞中的核酸序列进行高敏感性和特异性检测的方法。本发明的方法在研究和诊断中有许多实际应用(Hu等人,Biomark.Res.2(1):1-13,doi:10.1186/2050-7771-2-3(2014)；Ratan等人,Cureus 9(6):e1325.doi:10.7759/cureus.1325(2017)；Weier等人,Expert Rev.Mol.Diagn.2(2):109-119(2002))。本发明的方法可用于，例如，在高度复杂的组织如神经系统和肿瘤微环境中绘制空间组织图、鉴定已知细胞类型和新细胞类型、鉴定细胞状态、检测患病细胞和组织中改变的基因表达、定位特定细胞类型中改变的基因表达、分析肿瘤异质性、检测用于癌症诊断和预后或其他疾病状况的生物标志物、检测用于伴随诊断的生物标志物，以及检测和鉴定病原体(例如，细菌、病毒、真菌、微生物寄生生物)。
本发明将作为
Figure BDA0003741356720000103
技术(Wang等人，同上，2012)核心的探针设计原理和分支DNA样信号放大扩展到多个核酸靶在同一细胞和/或组织切片中的高敏感性和特异性序列检测(大于以迭代方式检测的一个靶核酸)。相同的迭代测定设计策略可以与BasescopeTM信号放大系统一起使用(Baker等人,Nat.Commun.8(1):1998,doi:10.1038/s41467-017-02295-5(2017))，后者可用于检测短序列。所述方法还可以应用于多个靶标的DNA检测。本发明的方法还可以应用于本领域已知的其他信号放大方法，如杂交链式反应(HCR)(Choi等人,Development 145(12),pii:dev165753,doi:10.1242/dev.165753(2018))。最新版本的HCR(HCR v3.0)采用与
Figure BDA0003741356720000101
类似的配对探针设计(Choi等人，同上，2018)。可以应用本发明方法的其他信号放大系统包括但不限于滚环放大(Larsson等人,Nature Methods 7(5):395–397(2010))；clampFISH(Rouhanifard等人,BioRxiv,222794(doi.org/10.1101/222794)(2018))；和SABER(Kishi等人，同上，2019)。
本发明的方法可用于标记单个细胞和/或组织切片中的多个基因靶标。它可以与基于荧光的检测以及成像质量细胞计数法一起使用(Schulz等人,Cell Syst.6(1):25-36(2018))，用于在组织微环境的空间背景中检测大量生物标志物。所述方法可用于研究和诊断应用。
使用酸处理的本发明的方法，可以普遍用于去除各种靶探针和任选的放大系统(如果使用)，并且提供连续轮次的杂交以增加多路复用的水平。本发明的方法适用于基于寡核苷酸的信号放大方法，如杂交链式反应(Choi等人，同上，2018)、滚环放大(Larsson等人，同上，2010)、clampFISH(Rouhanifard等人，同上，2018)和SABER(Kishi等人，同上，2019)。
本发明的方法可以与
Figure BDA0003741356720000102
HiPlex测定组合使用，以进一步增加在单个细胞/组织切片中待检测的基因靶标的数目。本发明的方法还可以与任何其他需要连续杂交以去除现有探针和扩增子的基于DNA寡核苷酸的ISH检测一起使用。例如，所述方法可用于荧光检测组织微环境的空间背景中的大量生物标志物。
在一个实施方案中，使用
Figure BDA0003741356720000111
HiPlex测定，使用K个轮次的靶探针杂交和信号放大以及迭代检测来检测一组或多组N(例如，12)个靶标，其中在每个成像轮次中有I个光谱不同的荧光团(参见图2B)。在图2B描绘的实施方案中，使用K个连续轮次(外环路)检测一组或多组N个靶标，并且使用L个迭代轮次(内环路)检测每K个轮次中N个靶标的亚组。在检测前N个靶标后，使用含有酸(如乙酸)和盐的混合物的酸溶液从组织/细胞中去除靶探针和信号放大系统。酸处理可靠、快速、高效并且对细胞RNA和组织形态的损害最小(参见实施例I和图3A和3B)。然后，酸处理的组织样品准备好用一组新的靶探针进行标记，例如，使用
Figure BDA0003741356720000112
HiPlex测定。此过程可以重复K次，以检测同一细胞或组织中总共N×K个靶标。如实施例II和图4所示，在对新鲜冷冻小鼠脑组织进行酸处理后，在连续轮次中检测两组靶标。
在图1、5和6中，靶探针被描绘成“Z”配置，如例如在美国专利号7,709,198、美国公开2008/0038725和2009/0081688，以及WO 2007/001986和WO 2007/002006中所述。如图1、5和6所示的Z配置具有靶结合位点，其是靶探针的前置扩增子(图5A和6A)或前置前置扩增子(图5B、5C、6B和6C)结合位点的5'。应理解，如图1、5和6所描绘的这种配置仅是示例性的，并且方向可以相反，即靶结合位点可以是前置扩增子或前置前置扩增子结合位点的3'。应理解，靶探针对可以独立地在任一方向，即靶探针对的一个成员的靶结合位点可以是前置扩增子或前置前置扩增子结合位点的5'或3'，并且可以与具有前置扩增子或前置前置扩增子的5'或3'的结合位点的第二探针配对。
如本文所用，术语“标记探针”是指直接或间接，通常间接地结合靶分子并允许靶被检测的实体。标记探针(或“LP”)含有通常为单链多核苷酸或寡核苷酸的核酸结合部分，其包含一个或多个直接或间接提供可检测信号的标记。标记可以与多核苷酸共价连接，或者多核苷酸可以被配置成与标记结合。例如，生物素化的多核苷酸可以结合与链霉亲和素结合的标记。标记探针可例如与靶核酸直接杂交。通常，标记探针可与核酸杂交，该核酸又与靶核酸杂交或与一种或多种与靶核酸杂交的其他核酸杂交。因此，标记探针可包含与靶核酸的多核苷酸序列，特别是一部分互补的多核苷酸序列。或者，标记探针可包含至少一个与本文所述的扩增子、前置扩增子、前置前置扩增子、信号产生复合物(SGC)等中的多核苷酸序列互补的多核苷酸序列。通常，在本发明的实施方案中，标记探针与扩增子结合。如本文所用，包含酶标记的标记探针是指包含核酸结合部分如寡核苷酸和与核酸结合部分偶联的酶的标记探针。如本文所公开的，酶与核酸结合部分的偶联可以是共价的或通过高亲和力结合相互作用，如生物素/抗生物素蛋白或其他类似的高亲和力结合分子。
如本文所用，“靶探针”是能够与靶核酸杂交并捕获或结合标记探针或信号产生复合物(SGC)组分的多核苷酸，例如针对所述靶核酸的扩增子、前置扩增子或前置前置扩增子。靶探针可与标记探针直接杂交，或其可与一个或多个核酸杂交，所述核酸又与标记探针杂交；例如，靶探针可与SGC中的扩增子，前置扩增子或前置前置扩增子杂交。因此，靶探针包括与靶核酸的多核苷酸序列互补的第一多核苷酸序列和与标记探针、扩增子、前置扩增子、前置前置扩增子等的多核苷酸序列互补的第二多核苷酸序列。通常，在本发明的实施方案中，靶探针与前置扩增子结合，如图5A和6A所示，或与前置前置扩增子结合，如图5B、5C、6B和6C所示。靶探针通常是单链的，使得互补序列可用于与对应的靶核酸、标记探针、扩增子、前置扩增子或前置前置扩增子杂交。在本发明的实施方案中，靶探针成对提供。
如本文所用，“扩增子”是能够与多个标记探针杂交的分子，通常是多核苷酸。通常，扩增子与多个相同的标记探针杂交。扩增子还可与靶核酸杂交，与一对靶探针中的至少一个靶探针杂交，与一对靶探针中的两个靶探针杂交，或与结合靶探针的核酸杂交，如扩增子、前置扩增子或前置前置扩增子。例如，扩增子可与至少一个靶探针和多个标记探针杂交，或与前置扩增子和多个标记探针杂交。通常，在本发明的实施方案中，扩增子可以与前置扩增子杂交。扩增子可以是例如线性、叉状、梳状或分支核酸。如本文对所有多核苷酸所述，扩增子可包括修饰的核苷酸和/或非标准核苷酸间连接以及标准脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸和/或磷酸二酯键。例如，在美国专利号5,635,352、5,124,246、5,710,264、5,849,481和7,709,198以及美国公开2008/0038725和2009/0081688中描述了合适的扩增子，所述专利各自以引用的方式并入。通常在本发明的实施方案中，扩增子与前置扩增子和标记探针结合(参见图5和6)。
如本文所用，“前置扩增子”是用作一个或多个靶探针与一个或多个扩增子之间的中间结合组分的分子，通常是多核苷酸。通常，前置扩增子同时与一个或多个靶探针和多个扩增子杂交。例如在美国专利号5,635,352、5,681,697和7,709,198以及美国公开2008/0038725、2009/0081688和2017/0101672中描述了示例性前置扩增子，所述专利各自以引用的方式并入。通常，在本发明的实施方案中，前置扩增子与靶探针对的两个成员结合(参见图5A和6A)、与可结合到靶探针对的前置前置扩增子结合(参见图5B和6B)，或与可结合到靶探针对的前置前置扩增子对的两个成员结合(参见图5C和6C)。前置扩增子也与扩增子结合(参见图5和6)。
如本文所用，“前置前置扩增子”是用作一个或多个靶探针与一个或多个前置扩增子之间的中间结合组分的分子，通常是多核苷酸。通常，前置前置扩增子同时与一个或多个靶探针和多个前置扩增子杂交。例如，在2017/0101672中描述了示例性前置前置扩增子，所述专利以引用的方式并入本文。通常，在本发明的实施方案中，前置前置扩增子与靶探针对结合(参见图5B和6B)或与靶探针对的成员结合(参见图5C和6C)并且与前置扩增子结合。
如本文所用，术语“多个”应理解为意指两个或更多个。因此，多个可以指例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个、6个或更多个、7个或更多个、8个或更多个、9个或更多个、10个或更多个、11个或更多个、12个或更多个、13个或更多个、14个或更多个、15个或更多个、16个或更多个、17个或更多个、18个或更多个、19个或更多个、20个或更多个、21个或更多个、22个或更多个、23个或更多个、24个或更多个、25个或更多个、26个或更多个、27个或更多个、28个或更多个、29个或更多个、30个或更多个、31个或更多个、32个或更多个、33个或更多个、34个或更多个、35个或更多个、36个或更多个、37个或更多个、38个或更多个、39个或更多个、40个或更多个、41个或更多个、42个或更多个、43个或更多个、44个或更多个、45个或更多个、46个或更多个、47个或更多个、48个或更多个、49个或更多个、50个或更多个、55个或更多个、60个或更多个、65个或更多个、70个或更多个、75个或更多个、80个或更多个、85个或更多个、90个或更多个、95个或更多个、100个或更多个、110个或更多个、120个或更多个、130个或更多个、140个或更多个、150个或更多个、160个或更多个、170个或更多个、180个或更多个、190个或更多个、200个或更多个、300个或更多个、400个或更多个、500个或更多个、600个或更多个、700个或更多个、800个或更多个、900个或更多个，或1000个或更多个，或甚至更大的数目，如果需要用于特定用途。
如本文所述，本发明涉及靶核酸的多路复用检测，其中与先前所述的原位杂交方法相比，所述方法提供更高数目的靶核酸的检测。所述方法可以使用在迭代轮次的检测中清楚地检测多个靶核酸的正交放大系统，与通过探针的酸去除、随后是重复轮次的靶探针杂交和检测而进行的进一步多路复用的组合。
图2A显示了使用酸处理和去除与靶核酸结合的探针以进行连续杂交的本发明的实施方案的示意图。N个靶探针与靶核酸杂交，例如在原位杂交测定中。此图描绘了与靶核酸杂交的靶探针的任选的信号放大。可以对细胞进行复染以促进细胞的可视化，例如，可以用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行染色。例如，通过成像使靶探针和复染的细胞可视化，从而检测并成像靶核酸。在使用
Figure BDA0003741356720000151
测定的情况下，
Figure BDA0003741356720000152
双Z探针和信号通过
Figure BDA0003741356720000153
放大系统同时放大。进行酸处理步骤以去除与相应靶标结合的靶探针。可以通过将整个N重工作流程重复一个或多个轮次来检测一组或多组另外的N个靶核酸。检测所有靶标后，使用图像配准软件算法对图像进行配准，以创建具有单细胞分辨率的叠加图像的最终复合。此方法可用的多路复用总水平为每轮次N个靶标×K个轮次的N重复用。一般来说，N＝1或更多，并且当包括酸去除步骤时，K＝2或更多。在图2A所示的描绘中，如果K＝1，则不需要酸去除步骤，因为只需要进行一个轮次的靶探针杂交和成像。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于破坏与细胞中的核酸结合的探针的结合的方法，所述方法包括使细胞与酸试剂接触，其中细胞包含与细胞中的第一靶核酸杂交的第一探针，其中酸试剂破坏第一探针与第一靶核酸之间的杂交。
在一个实施方案中，使细胞与酸试剂接触重复一次或多次。在一个实施方案中，所述方法还包括从细胞中去除第一探针。
在一个实施方案中，所述方法还包括使细胞与第二探针接触的步骤，其中第二探针与细胞中的第二靶核酸杂交，其中第二靶核酸与第一靶核酸相同或不同。在一个实施方案中，所述方法还包括使细胞与酸试剂接触的步骤，其中酸试剂破坏第二探针与第二靶核酸之间的杂交。在一个实施方案中，使细胞与酸试剂接触重复一次或多次。在一个实施方案中，所述方法还包括从细胞中去除第二探针的步骤。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于破坏与细胞中的核酸结合的探针的结合的方法，所述方法包括使细胞与酸试剂接触，其中细胞包含与细胞中的一个或多个第一靶核酸杂交的一个或多个第一探针，其中酸试剂破坏一个或多个第一探针与一个或多个第一靶核酸之间的杂交。
在一个实施方案中，使细胞与酸试剂接触重复一次或多次。在一个实施方案中，所述方法还包括从细胞中去除一个或多个第一探针。在一个实施方案中，细胞包含与两个或更多个第一靶核酸杂交的两个或更多个第一探针。在一个实施方案中，第一靶核酸中的每个通过与第一探针杂交而被标记，并且其中每个第一靶核酸上的标记与和第一探针杂交的其他第一靶核酸上的标记是可区分的。
在一个实施方案中，所述方法还包括使细胞与一个或多个第二探针接触的步骤，其中一个或多个第二探针与细胞中的一个或多个第二靶核酸杂交，其中一个或多个第二靶核酸与一个或多个第一靶核酸相同或不同。在一个实施方案中，细胞包含与两个或更多个第二靶核酸杂交的两个或更多个第二探针。在一个实施方案中，第二靶核酸中的每个通过与第二探针杂交而被标记，并且其中每个第二靶核酸上的标记与和第二探针杂交的其他第二靶核酸上的标记是可区分的。
在一个实施方案中，所述方法还包括使细胞与酸试剂接触的步骤，其中酸试剂破坏第二探针与一个或多个第二靶核酸之间的杂交。在一个实施方案中，使细胞与酸试剂接触重复一次或多次。在一个实施方案中，所述方法还包括从细胞中去除第二探针的步骤。
本发明基于酸试剂可以应用于包含细胞的样品的发现，其中细胞含有与一个或多个探针(如用于检测核酸的探针)杂交的核酸，使得酸试剂造成核酸与探针之间的杂交被破坏。以前没有认识到，酸试剂可用于去除与细胞内的靶核酸结合的探针，同时仍保持细胞中核酸的完整性和细胞的形态，并且允许重复轮次的细胞中核酸的杂交和检测。核酸的完整性是指核酸通过与可检测探针杂交而被检测的能力。如本文所用，“酸试剂”是含有酸和任选的盐的溶液，如果在细胞中使用，其使得核酸探针与靶核酸之间的杂交被破坏，从而破坏探针与靶核酸之间的结合，以及信号扩增子分子之间的结合，从而允许将探针以及任何预先构建的信号放大复合物(如果使用)从细胞中去除，其中用酸试剂处理细胞保持了细胞的形态和细胞内核酸的完整性，使得一个或多个额外轮次的探针与靶核酸的杂交可以应用于细胞。本发明提供了一种组合物，其包含如本文所公开的本发明的酸试剂。
如本文所述，本发明的方法通过使用酸试剂破坏与靶核酸结合的探针的结合来提供靶核酸的多路复用检测，从而允许在连续轮次的检测中使用相同的检测系统。如本文所述，与核酸结合的探针通常是指具有至少一些作为核酸的组分的探针，从而通过核酸杂交提供探针与靶核酸的结合，如本领域所熟知的。应理解，使用酸试剂破坏探针与靶核酸的结合的本发明的方法可以应用于通过杂交与靶核酸结合的任何探针。还应理解，与靶核酸结合的探针(为此酸试剂可用于破坏探针与靶核酸之间的结合)可以是作为与靶核酸直接结合的单个核酸的探针或者可以是作为多种核酸组分的复合物的探针。因此，被本发明的酸试剂破坏的探针与靶核酸的结合可以是直接与靶核酸结合的探针和/或与靶核酸结合的探针复合物的任何组分的破坏。作为多种核酸组分的复合物的探针的实例包括如本文所公开的信号产生复合物(SGC)，以及可用于检测靶核酸(例如，杂交链式反应(HCR)(Choi等人,Development 145(12),pii:dev165753,doi:10.1242/dev.165753(2018)；滚环放大(Larsson等人,Nature Methods 7(5):395–397(2010)；clampFISH(Rouhanifard等人,BioRxiv,222794(doi.org/10.1101/222794)(2018)；和SABER(Kishi等人,Nat.Methods16:533–544(2019))的其他类型的探针和探针系统。因此，使用酸试剂破坏探针与靶核酸的结合的本发明的方法可用于破坏与靶核酸结合的任何所需的探针或探针系统。酸处理后，可以再次使用相同的探针或探针系统来检测相同或不同的靶核酸。
本发明的酸试剂包含酸。适用于酸试剂的示例性酸包括但不限于甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸等。酸试剂通常包含约5％-40％浓度的酸。在一个实施方案中，酸试剂包含20％-30％的酸。例如，酸试剂可以包含5％-40％的酸，例如，5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22,％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％或40％的酸(％体积/体积)。在一个特定实施方案中，酸试剂包含5％-40％的乙酸，例如，5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22,％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％或40％的乙酸(％体积/体积)，或介于之间的浓度的乙酸。
任选地，酸试剂也可以包含盐。在一个实施方案中，除了酸之外，酸试剂还包含柠檬酸钠盐水(SSC)，其中20X SSC对应于pH 7.0的3.0M NaCl和0.3M柠檬酸钠(参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Ed.,Cold Spring HarborLaboratory,New York(2001)；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999))。在一个实施方案中，酸试剂包含1X SSC至13X SSC。例如，酸试剂可以包含1X、1.1X、1.2X、1.3X、1.4X、1.5X、1.6X、1.7X、1.8X、1.9X、2X、2.1X、2.2X、2.3X、2.4X、2.5X、2.6X、2.7X、2.8X、2.9X、3X、3.1X、3.2X、3.3X、3.4X、3.5X、3.6X、3.7X、3.8X、3.9X、4X、4.1X、4.2X、4.3X、4.4X、4.5X、4.6X、4.7X、4.8X、4.9X、5X、5.1X、5.2X、5.3X、5.4X、5.5X、5.6X、5.7X、5.8X、5.9X、6X、6.1X、6.2X、6.3X、6.4X、6.5X、6.6X、6.7X、6.8X、6.9X、7X、7.1X、7.2X、7.3X、7.4X、7.5X、7.6X、7.7X、7.8X、7.9X、8X、8.1X、8.2X、8.3X、8.4X、8.5X、8.6X、8.7X、8.8X、8.9X、9X、9.1X、9.2X、9.3X、9.4X、9.5X、9.6X、9.7X、9.8X、9.9X、10X、10.1X、10.2X、10.3X、10.4X、10.5X、10.6X、10.7X、10.8X、10.9X、11X、11.1X、11.2X、11.3X、11.4X、11.5X、11.6X、11.7X、11.8X、11.9X、12X、12.1X、12.2X、12.3X、12.4X、12.5X、12.6X、12.7X、12.8X、12.9X、13X等，或介于之间的浓度的SSC。
在另一个实施方案中，除了酸之外，酸性试剂还包含氯化钠、磷酸钠、乙二胺四乙酸(EDTA)(SSPE)，其中20X SSPE对应于pH 7.4的3.0M氯化钠、0.2M磷酸氢钠(NaH2PO4)、0.02M乙二胺四乙酸(EDTA)(参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,Third Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001))。在一个实施方案中，酸试剂包含1X SSPE至13X SSPE。例如，酸试剂可以包含1X、1.1X、1.2X、1.3X、1.4X、1.5X、1.6X、1.7X、1.8X、1.9X、2X、2.1X、2.2X、2.3X、2.4X、2.5X、2.6X、2.7X、2.8X、2.9X、3X、3.1X、3.2X、3.3X、3.4X、3.5X、3.6X、3.7X、3.8X、3.9X、4X、4.1X、4.2X、4.3X、4.4X、4.5X、4.6X、4.7X、4.8X、4.9X、5X、5.1X、5.2X、5.3X、5.4X、5.5X、5.6X、5.7X、5.8X、5.9X、6X、6.1X、6.2X、6.3X、6.4X、6.5X、6.6X、6.7X、6.8X、6.9X、7X、7.1X、7.2X、7.3X、7.4X、7.5X、7.6X、7.7X、7.8X、7.9X、8X、8.1X、8.2X、8.3X、8.4X、8.5X、8.6X、8.7X、8.8X、8.9X、9X、9.1X、9.2X、9.3X、9.4X、9.5X、9.6X、9.7X、9.8X、9.9X、10X、10.1X、10.2X、10.3X、10.4X、10.5X、10.6X、10.7X、10.8X、10.9X、11X、11.1X、11.2X、11.3X、11.4X、11.5X、11.6X、11.7X、11.8X、11.9X、12X、12.1X、12.2X、12.3X、12.4X、12.5X、12.6X、12.7X、12.8X、12.9X、13X等，或介于之间的浓度的SSPE。
在另一个实施方案中，除了酸之外，酸试剂还包含10-500mM磷酸钠，pH为7.8，或任选地在7-8的pH范围内。例如，酸试剂可以包含10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、210mM、220mM、230mM、240mM、250mM、260mM、270mM、280mM、290mM、300mM、310mM、320mM、330mM、340mM、350mM、360mM、370mM、380mM、390mM、400mM、410mM、420mM、430mM、440mM、450mM、460mM、470mM、480mM、490mM、500mM等，或介于之间的浓度的磷酸钠。
在另一个实施方案中，除了酸之外，酸试剂还包含10mM至6M氯化钠(NaCl)。例如，酸试剂可以包含10mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM、450mM、500mM、550mM、600mM、650mM、700mM、750mM、800mM、850mM、900mM、950mM、1M、1.1M、1.2M、1.3M1.4M、1.5M、1.6M、1.7M、1.8M、1.9M、2M、2.1M、2.2M、2.3M、2.4M、2.5M、2.6M、2.7M、2.8M、2.9M、3M、3.1M、3.2M、3.3M、3.4M、3.5M、3.6M、3.7M、3.8M、3.9M、4M、4.1M、4.2M、4.3M、4.4M、4.5M、4.6M、4.7M、4.8M、4.9M、5M、5.1M、5.2M、5.3M、5.4M、5.5M、5.6M、5.7M、5.8M、5.9M、6M等，或介于之间的浓度的氯化钠。
在一些实施方案中，酸试剂包含5％-40％的酸和1X-12.8X SSC。应理解，酸试剂可以包含5％-40％的酸和1X-12.8X SSC，独立地呈本文公开的酸和SSC的浓度的任一组合。在一些实施方案中，酸试剂包含20％-30％的酸和3.2X-12.8X SSC，或在之间独立地递增的酸和SSC，如本文所公开的。在一些实施方案中，酸为乙酸。在一些实施方案中，酸为甲酸。在一些实施方案中，酸试剂包含20％的酸和3.2X SSC。在另一个实施方案中，酸试剂包含20％的酸和6.4X SSC。在另一个特定实施方案中，酸试剂包含20％的酸和12.8X SSC。在另一个特定实施方案中，酸试剂包含30％的酸和3.2X SSC。在另一个特定实施方案中，酸试剂包含30％的酸和6.4X SSC。在另一个特定实施方案中，酸试剂包含30％的酸和12.8X SSC。在一个特定实施方案中，酸试剂包含20％的乙酸和3.2X SSC。在另一个特定实施方案中，酸试剂包含20％的乙酸和6.4X SSC。在另一个特定实施方案中，酸试剂包含20％的乙酸和12.8XSSC。在另一个特定实施方案中，酸试剂包含30％的乙酸和3.2X SSC。在另一个特定实施方案中，酸试剂包含30％的乙酸和6.4X SSC。在另一个特定实施方案中，酸试剂包含30％的乙酸和12.8X SSC。
在一些实施方案中，本发明的方法涉及将酸试剂应用于细胞以使得与细胞中的靶核酸杂交的探针之间的杂交被破坏，所述方法在室温下进行。在其他实施方案中，酸试剂可以在略低于或高于室温的温度下应用于细胞。因此，本发明的方法用于将酸试剂应用于细胞以使得与细胞中的靶核酸杂交的探针之间的杂交被破坏，所述方法可以例如在约4℃至约40℃的温度下进行。例如，所述方法可以在4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃或之间递增的温度下进行。
在本发明的涉及将酸试剂应用于细胞以使得与细胞中的靶核酸杂交的探针之间的杂交被破坏的方法中，所述方法进行一段时间，并且任选地重复。酸试剂通常与细胞接触1-30分钟或更长时间。例如，酸试剂与细胞接触1min、2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min、21min、22min、23min、24min、25min、26min、27min、28min、29min、30min或更长时间等，或之间递增的时间。在一些实施方案中，酸试剂处理重复1至10次。例如，酸试剂处理进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11次(即重复至多10次)。在另一个实施例中，酸试剂处理进行1、2、3、4、5或6次(即重复至多5次)。在一些实施方案中，酸试剂连续地与细胞接触，而不去除酸试剂(例如，通过从细胞中吸出酸试剂)或洗涤细胞(例如，在应用酸试剂之间洗涤细胞)。任选地，可以从与细胞的接触中去除酸试剂，例如通过从细胞中吸出酸试剂或用合适的缓冲液洗涤细胞。合适的洗涤缓冲液包括但不限于常规用于原位杂交测定的缓冲液。
应理解，去除与细胞中的靶核酸结合的探针的条件可以很容易地根据如本文所公开的酸试剂的组分和组分浓度、酸试剂与细胞的孵育时间以及孵育重复的次数来确定。从细胞中去除探针的有效性可以很容易地通过使用与用于检测靶核酸相同的方法分析细胞以观察是否可以检测到残留探针来确定(参见实施例I和II)。如果残留探针仍然存在，则只需重复酸试剂处理，直到不再检测到先前检测到的探针，或检测到的水平低到足够允许在后续轮次的标记中用相同的标记对靶核酸进行可检测的标记。类似地，细胞用酸试剂处理(同时保持细胞形态和细胞中核酸的完整性以允许后续的核酸检测)的次数，可以很容易地通过以下来确定：用给定的酸试剂和在给定的一组条件下对细胞进行重复酸处理，以及确定靶核酸是否仍可以被检测到(例如，通过确定检测细胞中阳性对照核酸的能力或确定细胞用酸试剂处理一次或多次后，在细胞中可以检测到类似的细胞形态)(参见实施例I和II)。一旦确定了一组孵育时间和应用给定酸试剂的重复次数的条件，就可以将这些条件应用于其他细胞样品。如本文所公开的，测试了一系列酸试剂和条件，并显示它们有效破坏探针与靶核酸之间的杂交，从而保持细胞形态和核酸完整性，使得可以应用新一轮次的靶核酸检测(参见实施例III)。
在一些实施方案中，每个轮次检测单个靶核酸。在这种情况下，不是使样品与针对多个靶核酸的多个靶探针组接触，而是使样品与可以与靶核酸特异性杂交的靶探针组接触。在其他实施方案中，如本文所公开的，在单个轮次中检测多个靶标。
因此，本发明涉及使用多个核酸靶的独特标记和靶核酸亚组的迭代检测以实现靶核酸的更高的多路复用检测，随后是酸试剂处理去除结合的探针以实现靶核酸的更高的多路复用检测。如实施例中所述，本发明的方法在迭代轮次中对靶核酸的多路复用检测的有效性已在本文中得到证实。
如图1所示，在一个实施方案中，本发明的方法使用多个靶核酸与靶探针的同时杂交和用于检测靶核酸的放大系统。然而，不是一次检测所有靶核酸，而是靶核酸的标记和检测是在迭代轮次中进行的，其中在第一轮次中仅检测与靶探针结合的靶核酸的亚组。这在图1中示意性地描绘为第一轮次中靶标1至4的检测。在对第一轮次中与靶核酸(图1中的靶标1至4)结合的可检测标记成像后，通过使用可切割标记从样品中去除标记(图1中的“荧光团切割”)。一旦第一轮次中与靶核酸结合的标记被切割，则通过添加第二组标记来应用第二轮次的检测，其通常检测不同的靶核酸亚组(在图1中描绘为靶标5至8)。通过从靶核酸切割第一轮次的标记，可以在第二轮次中使用与第一轮次中相同的可检测标记(在图1中描绘为荧光团)。这种切割与靶核酸结合的标记并添加检测新的靶核酸亚组的标记的循环允许在相同样品和相同细胞中检测比先前描述的方法更多的核酸标。如图2B所示，可以通过对样品进行酸处理以去除靶探针和放大系统(例如，SGC)来实现多路复用的其他层，使得可以重复新一轮次的图1中描绘的方法。
图2B显示了酸处理和去除与靶核酸结合的探针以进行连续杂交的示意图。N个靶探针与靶核酸杂交，例如在原位杂交测定(如
Figure BDA0003741356720000233
HiPlex测定)中。N个靶探针与靶序列杂交(例如，
Figure BDA0003741356720000231
双Z探针)，并且同时放大信号(例如使用
Figure BDA0003741356720000232
放大系统)。图2B中的图描绘了与靶核酸杂交的靶探针的任选的信号放大。可以对细胞进行复染以促进细胞的可视化，例如，可以用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)对细胞核进行染色。N个靶核酸通过迭代轮次的标记(例如荧光标记)、成像和可检测标记的切割(例如荧光标记的切割)来检测。图中，N个靶核酸与N个靶探针杂交并迭代检测，使得N个靶标的一个亚组(N个靶标亚组1)被标记和检测，并且从标记的核酸的亚组上切割标记(L个轮次的标记探针杂交，其中L＝1)，然后N个靶标的第二个亚组(N个靶标亚组2)被标记和检测，并且从标记的核酸的亚组上切割标记(L个轮次的标记探针杂交，其中L＝2)，以此类推，直到检测到所有N个靶核酸。所有N个靶核酸以所需轮数的标记(L＝所需的标记轮次)进行检测后，进行酸处理步骤以去除杂交的N个靶探针(例如，去除信号产生复合物(SGC)，如本文所述)。可以通过将整个N重工作流程重复一个或多个轮次来检测一组或多组另外的N个靶核酸(例如，N'靶核酸、N”靶核酸等)。检测所有靶标后，使用图像配准软件算法对图像进行配准，以创建具有单细胞分辨率的叠加图像的最终复合。此方法可用的多路复用的总水平是每轮次的N个靶核酸×K个轮次的N重复用(其中“N重复用”是指从“N个靶探针杂交”到“探针和扩增子的酸去除”的流程或者到最终轮次的最后的“复染和成像”步骤。一般来说，N＝1或更多，并且当包括酸去除步骤时，K＝2或更多。在图2B所示的描绘中，如果K＝1，则不需要探针和扩增子的酸去除步骤，因为只需要进行L个轮次的标记探针杂交、成像和荧光团切割。此外，应理解，在最终轮次检测N个靶核酸时，在没有检测到额外的N个靶核酸(即，K＝N最终，其中“N”是K个轮次的总数)的情况下，不需要酸处理步骤。因此，在图2B所示的示意图中，在检测到所有所需的靶核酸并成像后，进行图像配准以分析靶核酸，无需进一步的标记切割步骤和/或酸处理步骤。
通常，当使用不同的和可区分的标记用于靶核酸的多路复用检测时，对可并行区分的不同标记的数目存在限制。例如，在荧光标记的情况下，为了同时检测多个标记，应该对荧光团的发射进行光谱分离，以便荧光显微镜可以并行区分荧光团。需要对荧光团的发射进行分离光谱，这限制了可以同时可视化的荧光团的数目。本发明通过迭代地检测标记，使得相同的荧光团可以用于检测靶核酸的连续轮次，来避免这种限制。
在图6中描绘了可用于本发明方法的检测系统的正交性质。图6A显示了一个实施方案，其使用三个示例性靶核酸和相应的正交检测系统，所述系统在本文中也称为信号产生复合物(SGC)。如图6A所示，靶核酸中的每个与特异性靶探针对(TP1a和TP1b、TP2a和TP2b、TP3a和TP3b)杂交，所述特异性靶探针对继而与相应的特异性前置扩增子(PA1、PA2、PA3)杂交，所述特异性前置扩增子继而与相应的特异性多个扩增子(AMP1、AMP2、AMP3)杂交，所述特异性多个扩增子继而与相应的特异性多个标记探针(LP1、LP2、LP3)杂交。图6B显示了另一个实施方案，其使用两个示例性靶核酸和相应的正交检测系统。如图6B所示，靶核酸中的每个与特异性靶探针对(TP1a和TP1b、TP2a和TP2b)杂交，所述特异性靶探针对继而与相应的特异性前置前置扩增子(PPA1、PPA2)杂交，所述特异性前置前置扩增子继而与相应的特异性多个前置扩增子(PA1、PA2)杂交，所述特异性多个前置扩增子继而与相应的特异性多个扩增子(AMP1、AMP2)杂交，所述特异性多个扩增子继而与相应的特异性多个标记探针(LP1、LP2)杂交。图6C显示了另一个实施方案，其使用两个示例性靶核酸和相应的正交检测系统。如图6C所示，靶核酸中的每个与特异性靶探针对(TP1a和TP1b、TP2a和TP2b)杂交，所述特异性靶探针对继而与相应的特异性前置前置扩增子对(PPA1a和PPA1b、PPA2a和PPA2b)杂交，所述特异性前置前置扩增子对继而均与相应的特异性前置扩增子(PA1和PA2)杂交，所述特异性前置扩增子继而与相应的特异性扩增子(AMP1和AMP2)杂交，所述特异性扩增子继而与相应的特异性标记探针(LP1和LP2)杂交。为简单起见，描绘了多个扩增子与前置扩增子中的一个结合，但应了解，扩增子可与前置扩增子中的每个结合。如图6所示，每个核酸靶具有特异性检测系统，其组分的结合由独特的结合位点介导，所述独特结合位点提供与一种特异性复合物的结合而不提供与另一种特异性复合物的结合。用于SGC组分与特定靶核酸杂交的这种独特结合位点可以通过设计结合位点(核酸序列)以提供所需的特异性来实现，如本领域所熟知的和本文所描述的。这种其中每个靶被独特标记的正交检测系统允许检测同一样品中的多个靶核酸。
在本文所述的一些实施方案中，所述方法利用正交放大系统来独特地标记靶核酸，使得可以在同一样品中甚至在同一细胞中分析多个靶核酸。本发明利用对特定靶核酸具有特异性的信号产生复合物(SGC)的构建，使得每个靶核酸可以被独特地鉴定。在一个实施方案中，使样品与包含可与靶核酸特异性杂交的一对靶探针的靶探针组接触。还使样品与一组前置扩增子接触，所述前置扩增子组包括对每个靶探针组具有特异性的前置扩增子并且可与和相应靶核酸杂交的靶探针对杂交。这种实施方案在图6A中示意性地示出。还使样品与扩增子接触，其中扩增子包括对每个前置扩增子具有特异性的扩增子亚组，所述前置扩增子对靶探针对具有特异性，所述靶探针对对靶核酸具有特异性。因此，每个靶核酸具有提供靶核酸之间区别的SGC的独特组分、靶探针对、前置扩增子和扩增子的组装。在另外的实施方案中，前置前置扩增子可以作为靶探针对与前置扩增子之间的额外放大层与靶探针对结合(参见图5B和6B)。
在另一个实施方案中，使样品与包含可与靶核酸特异性杂交的一对靶探针的靶探针组接触。还使样品与一组前置前置扩增子接触，所述前置前置扩增子组包括对每个靶探针组具有特异性的一对前置前置扩增子并且可与和相应靶核酸杂交的靶探针对杂交。这种实施方案在图6C中示意性地示出。还使样品与一组前置扩增子接触，所述前置扩增子组包括可与两对前置前置扩增子特异性结合的前置扩增子，所述前置前置扩增子对靶探针对具有特异性，所述靶探针对对靶标具有特异性。还使样品与扩增子接触，其中扩增子包括对每个前置扩增子具有特异性的扩增子亚组，所述前置扩增子对一对前置前置扩增子具有特异性，所述前置前置扩增子对对靶探针对具有特异性，所述靶探针对对靶核酸具有特异性。因此，每个靶核酸具有提供靶核酸之间区别的SGC的独特组分、靶探针对、前置前置扩增子、前置扩增子和扩增子的组装。
为了检测靶核酸，使标记探针组与样品接触。不是使样品与可检测所有靶核酸的标记探针接触，而是使样品与一组可检测靶核酸亚组的标记探针接触。因此，不是一次检测所有靶核酸，而是在迭代轮次的检测中检测靶核酸。在一个轮次中，对相应靶核酸具有特异性的标记探针是彼此可区分的，使得与第一轮次的应用的标记探针相关的所有靶核酸可被并行检测到。
在单个轮次中可以并行检测的靶核酸的数目将取决于标记探针中使用的标记类型和区分此类标记的方式。例如，在使用荧光标记的情况下，在单个轮次中使用的荧光团需要是可区分的，因此应该对荧光团的发射进行光谱分离。根据检测系统和可用于区分具有重叠发射的荧光团的滤波器和/或软件的可用性，可并行区分的荧光团的数目高达10个，如果它们可被区分，则认为它们具有光谱分离，这是本领域熟知的。用于检测多个荧光标记的成像系统是本领域熟知的(例如，Vectra Polaris、Perkin Elmer、Waltham MA)。
在一个实施方案中，本发明的方法用于每轮次检测一个或多个靶核酸，例如在每个轮次中检测1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个靶核酸。如本文所公开，本领域技术人员可以选择合适的不同标记和合适的检测轮数以允许检测样品中所需数目的靶核酸。
为了在后续轮次中利用第一轮次的检测中使用的标记的可区分特征，在一些实施方案中，标记探针上的标记是可切割的。因此，一旦对靶核酸亚组进行了第一轮次的检测，连接到靶核酸的标记就被切割以从第一靶核酸亚组中去除标记。本文描述了标记与标记探针的示例性可切割缀合物。一旦标记被切割，通过使样品与第二标记探针组接触进行第二轮次的检测，所述第二标记探针组通常对与第一轮次中检测的不同的靶核酸具有特异性。因为第一轮次的标记已从相应的靶核酸上切割下来，现在可以在第二轮次的检测的标记探针中使用相同的可区分标记。如本文所述，可以通过对样品进行酸处理以去除结合的探针和放大系统(例如，SGC)来实现进一步的多路复用，使得上述步骤可以重复，以检测不同的靶核酸组。应理解，虽然相同的标记可以用于迭代轮次的靶核酸亚组检测，但并不要求在连续轮次的检测中使用相同的标记，只要在同一轮次中使用的标记是可区分的即可。
一旦对靶核酸亚组进行了第二轮次的检测，就任选地可以对样品应用一个或多个额外轮次的切割、标记和检测。例如，在检测第二靶核酸亚组后，可以从组装在第二靶核酸亚组上的SGC上切割标记，并且可以进行第三轮次的标记和检测以检测与第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。可以进行此类迭代轮次的靶核酸检测，以使用所需次数的迭代检测来检测所需数目的多个靶核酸。如本文所述，可以通过对样品进行酸处理以去除结合的探针和放大系统(例如，SGC)来实现进一步的多路复用，使得上述步骤可以重复，以检测相同或不同的一组靶核酸，从而检测所需数目的靶核酸。应理解，在最终迭代轮次的检测中，标记探针不需要包含可切割的标记，因为不需要进行进一步轮次的检测。因此，在最终迭代轮次的检测中，任选使用包含可切割标记的标记探针，即标记探针可以包含或不包含可切割标记。通常进行多个轮次的检测，使得在每个轮此中检测不同的靶核酸。然而，应理解，后续轮次的检测可以包括检测一个或多个与之前轮次重叠的靶核酸，包括多达前一轮次中的所有核酸，使得在一个或多个连续轮次中检测相同靶核酸或重叠靶核酸。当在每个轮次中以预定的颜色顺序检测相同的靶核酸时，在连续轮次中对相同靶核酸或重叠靶核酸的这种检测可用于对每个靶核酸产生时间条形码。先前已描述此类方法，例如，连续条形码荧光原位杂交(seqFISH)(参见Shah等人，Neuron 92(2):342-357(2016))。因此，使用酸试剂去除与细胞中的靶核酸结合的探针的本发明的方法可以应用于如seqFISH的方法，以提供高效的方法来进行多个轮次的杂交以产生用于更高水平的多路复用的条形码。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于细胞中多个靶核酸的多路复用检测的方法，所述方法包括(A)使含有包含多个靶核酸的细胞的样品与对一个或多个靶核酸具有特异性的一组探针接触，其中针对靶核酸的探针包括：(a)一组靶探针，其中靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对或多对靶探针；(b)一组前置扩增子，其中前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子包含针对靶探针对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(c)一组扩增子，其中扩增子组包含多个扩增子，其中扩增子包含针对前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；和(d)一组标记探针，其中标记探针组的标记探针各自包含标记和针对扩增子的结合位点；(B)检测与相应靶核酸结合的可检测标记；和(C)使样品和酸试剂接触，从而破坏与靶核酸结合的探针的结合(参见图2A和6A)。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于细胞中多个靶核酸的多路复用检测的方法，所述方法包括(A)使含有包含多个靶核酸的细胞的样品与对一个或多个靶核酸具有特异性的一组探针接触，其中针对靶核酸的探针包括：(a)一组靶探针，其中靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对或多对靶探针；(b)一组前置前置扩增子，其中前置前置扩增子组包含一个或多个前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含针对一对或多对靶探针的结合位点；(c)一组前置扩增子，其中前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子包含针对前置前置扩增子的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(d)一组扩增子，其中扩增子组包含多个扩增子，其中扩增子包含针对前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；和(e)一组标记探针，其中标记探针组的标记探针各自包含标记和针对扩增子的结合位点；(B)检测与相应靶核酸结合的可检测标记；和(C)使样品与酸试剂接触，从而破坏与靶核酸结合的探针的结合(参见例如图2A和6B)。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于细胞中多个靶核酸的多路复用检测的方法，所述方法包括(A)使含有包含多个靶核酸的细胞的样品与对一个或多个靶核酸具有特异性的一组探针接触，其中针对靶核酸的探针包括：(a)一组靶探针，其中靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对或多对靶探针；(b)一组前置前置扩增子，其中前置前置扩增子组包含一对或多对前置前置扩增子，其中前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含针对靶探针对的靶探针中的一个的结合位点；(c)一组前置扩增子，其中前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子包含针对前置前置扩增子对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(d)一组扩增子，其中扩增子组包含多个扩增子，其中扩增子包含针对前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；和(e)一组标记探针，其中标记探针组的标记探针各自包含标记和针对扩增子的结合位点；(B)检测与相应靶核酸结合的可检测标记；和(C)使样品与酸试剂接触，从而破坏与靶核酸结合的探针的结合(参见例如图2A和6C)。
在一个实施方案中，使细胞与酸试剂接触重复一次或多次。在一个实施方案中，所述方法还包括重复步骤(A)和(B)或重复步骤(A)、(B)和(C)一次或多次。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测多个靶核酸的方法，所述方法包括(A)使含有包含多个靶核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对靶探针；(B)使样品与一组前置扩增子接触，其中前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中多个前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含针对靶探针组中的一组的靶探针对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(C)使样品与一组扩增子接触，其中扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含针对对靶探针组具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；(D)使样品与第一标记探针组接触，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组中的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记是可切割的，并且其中第一标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；(E)检测与靶核酸结合的第一标记探针组的标记探针，从而检测第一靶核酸亚组；(F)从与第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组上切割标记；(G)使样品与第二标记探针组接触，其中第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第二标记探针亚组与第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记任选地是可切割的，并且其中第二标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的与第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；(H)检测与靶核酸结合的第二标记探针组的标记探针，从而检测第二靶核酸亚组，其中检测了多个靶核酸；和(I)使样品与酸试剂接触，从而破坏与靶核酸结合的探针的结合(参见例如图2B和6A，其中L＝2，并且其中从SGC上切割标记)。
在这种方法的一个实施方案中，所述方法在步骤(I)之前包括：(J)从与第二靶核酸组结合的第二标记探针组上切割标记；(K)使样品与第三标记探针组接触，其中第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第三标记探针亚组与第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记是任选地可切割的，并且其中第三标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的与第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组；和(L)检测与靶核酸结合的第三标记探针组的标记探针，从而检测第三靶核酸亚组(参见例如图2B和6A，其中L＝3，并且其中从SGC上切割标记)。
在一个实施方案中，所述方法包括重复步骤(J)至(L)一次或多次(参见例如图2B和6A，其中L＝4+，并且其中从SGC上切割标记)。
任选地，在本发明的方法中，使细胞与酸试剂接触重复一次或多次。
在一个实施方案中，所述方法还包括重复步骤(A)至(I)或步骤(A)至(H)、(J)至(L)和(I)一次或多次(参见例如图2B和6A，其中K＝2+，并且其中从SGC上切割标记)。在这种方法的一个实施方案中，所述方法还包括重复步骤(A)至(H)或步骤(A)至(H)和(J)至(L)。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测多个靶核酸的方法，所述方法包括(A)使含有包含多个靶核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对靶探针；(B)使样品与一组前置前置扩增子接触，其中前置前置扩增子组包含多个前置前置扩增子，其中多个前置前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含针对靶探针组中的一组的靶探针对的结合位点和针对前置扩增子的多个结合位点；(C)使样品与一组前置扩增子接触，其中前置扩增子组包含对每个前置前置扩增子具有特异性的多个前置扩增子亚组，其中每个前置扩增子亚组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子亚组的前置扩增子包含针对对靶探针组具有特异性的前置前置扩增子中的一个的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(D)使样品与一组扩增子接触，其中扩增子组包含对每个前置扩增子亚组具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含针对前置扩增子亚组中的一个亚组的前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；(E)使样品与第一标记探针组接触，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组中的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记是可切割的，并且其中第一标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；(F)检测与靶核酸结合的第一标记探针组的标记探针，从而检测第一靶核酸亚组；(G)从与第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组上切割标记；(H)使样品与第二标记探针组接触，其中第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第二标记探针亚组与第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记任选地是可切割的，并且其中第二标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的与第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；(I)检测与靶核酸结合的第二标记探针组的标记探针，从而检测第二靶核酸亚组，其中检测了多个靶核酸；和(J)使样品与酸试剂接触，从而破坏与靶核酸结合的探针的结合(参见例如图2B和6B，其中L＝2，并且其中从SGC上切割标记)。
在一个实施方案中，所述方法在步骤(J)之前包括：(K)从与第二靶核酸组结合的第二标记探针组上切割标记；(L)使样品与第三标记探针组接触，其中第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第三标记探针亚组与第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记是任选地可切割的，并且其中第三标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的与第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组；和(M)检测与靶核酸结合的第三标记探针组的标记探针，从而检测第三靶核酸亚组(参见例如图2B和6B，其中L＝3，并且其中从SGC上切割标记)。
在一个实施方案中，所述方法包括重复步骤(K)至(M)一次或多次(参见例如图2B和6B，其中L＝4+，并且其中从SGC上切割标记)。
在一个实施方案中，使细胞与酸试剂接触重复一次或多次。
在一个实施方案中，所述方法还包括重复步骤(A)至(J)或步骤(A)至(I)、(K)至(M)和(J)一次或多次(参见例如图2B和6B，其中K＝2+，并且其中从SGC上切割标记)。在这种方法的一个实施方案中，所述方法还包括重复步骤(A)至(I)或步骤(A)至(I)和(K)至(M)。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测多个核酸的方法，所述方法包括(A)使含有包含多个靶核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对靶探针；(B)使样品与一组前置前置扩增子接触，其中前置前置扩增子组包含多对前置前置扩增子，其中前置前置扩增子组包含对靶探针组的每对靶探针具有特异性的一对前置前置扩增子，其中前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含针对靶探针组的靶探针对的靶探针中的一个的结合位点，并且其中前置前置扩增子包含针对前置扩增子的多个结合位点；(C)使样品与一组前置扩增子接触，其中前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中多个前置扩增子包含对每对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含针对前置前置扩增子组的前置前置扩增子对中的一对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(D)使样品与一组扩增子接触，其中扩增子组包含对每个前置扩增子(其对每对前置前置扩增子具有特异性)具有特异性的多个扩增子亚组，其中扩增子亚组的扩增子包含针对对前置前置扩增子对具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；(E)使样品与第一标记探针组接触，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组中的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记是可切割的，并且其中第一标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；(F)检测与靶核酸结合的第一标记探针组的标记探针，从而检测第一靶核酸亚组；(G)从与第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组上切割标记；(H)使样品与第二标记探针组接触，其中第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第二标记探针亚组与第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记任选地是可切割的，并且其中第二标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的与第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；(I)检测与靶核酸结合的第二标记探针组的标记探针，从而检测第二靶核酸亚组，其中检测了多个靶核酸；和(J)使样品与酸试剂接触，从而破坏与靶核酸结合的探针的结合(参见例如图2B和6C，其中L＝2，并且其中从SGC上切割标记)。
在一个实施方案中，所述方法在步骤(J)之前包括：(K)从与第二靶核酸组结合的第二标记探针组上切割标记；(L)使样品与第三标记探针组接触，其中第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第三标记探针亚组与第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记是任选地可切割的，并且其中第三标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的与第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组；和(M)检测与靶核酸结合的第三标记探针组的标记探针，从而检测第三靶核酸亚组(参见例如图2B和6C，其中L＝3，并且其中从SGC上切割标记)。
在一个实施方案中，所述方法包括重复步骤(K)至(M)一次或多次(参见例如图2B和6C，其中L＝4，并且其中从SGC上切割标记)。
在一个实施方案中，使细胞与酸试剂接触重复一次或多次。
在一个实施方案中，所述方法还包括重复步骤(A)至(J)或步骤(A)至(I)、(K)至(M)和(J)一次或多次(参见例如图2B和6C，其中K＝2+，并且其中从SGC上切割标记)。在这种方法的一个实施方案中，所述方法还包括重复步骤(A)至(I)或步骤(A)至(I)和(K)至(M)。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测多个靶核酸的方法，所述方法包括(A)使含有包含多个靶核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对靶探针；(B)使样品与一组前置扩增子接触，其中前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中多个前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含针对靶探针组中的一组的靶探针对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(C)使样品与一组扩增子接触，其中扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含针对对靶探针组具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；(D)使样品与第一标记探针组接触，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组中的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中第一标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；(E)检测与靶核酸结合的第一标记探针组的标记探针，从而检测第一靶核酸亚组；(F)在高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育样品，从而从与第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组上去除标记；(G)使样品与第二标记探针组接触，其中第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第二标记探针亚组与第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在第二标记探针亚组之间是可区分的，并且任选地其中标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中第二标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的与第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；(H)检测与靶核酸结合的第二标记探针组的标记探针，从而检测第二靶核酸亚组，其中检测了多个靶核酸；和(I)使样品与酸试剂接触，从而破坏与靶核酸结合的探针的结合(参见例如图2B和6A，其中L＝2，并且其中不是从SGC上切割标记，而是使用高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于SGC的其他组分之间的解链温度的温度从SGC上去除标记探针)。
在一个实施方案中，所述方法在步骤(I)之前包括：(J)在高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育样品，从而从与第二靶核酸组结合的第二标记探针组上去除标记；(K)使样品与第三标记探针组接触，其中第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第三标记探针亚组与第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在第三标记探针亚组之间是可区分的，并且任选地其中标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中第三标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的与第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组；和(L)检测与靶核酸结合的第三标记探针组的标记探针，从而检测第三靶核酸亚组(参见例如图2B和6A，其中L＝3，并且其中不是从SGC上切割标记，而是使用高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于SGC的其他组分之间的解链温度的温度从SGC上去除标记探针)。
在一个实施方案中，所述方法包括重复步骤(J)至(L)一次或多次(参见例如图2B和6A，其中L＝4+，并且其中不是从SGC上切割标记，而是使用高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于SGC的其他组分之间的解链温度的温度从SGC上去除标记探针)。
在一个实施方案中，使细胞与酸试剂接触重复一次或多次。
在一个实施方案中，所述方法还包括重复步骤(A)至(I)或步骤(A)至(H)、(J)至(L)和(I)一次或多次(参见例如图2B和6A，其中K＝2+，并且其中不是从SGC上切割标记，而是使用高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于SGC的其他组分之间的解链温度的温度从SGC上去除标记探针)。在这种方法的一个实施方案中，所述方法还包括重复步骤(A)至(H)或步骤(A)至(H)和(J)至(L)。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测多个靶核酸的方法，所述方法包括(A)使含有包含多个靶核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对靶探针；(B)使样品与一组前置前置扩增子接触，其中前置前置扩增子组包含多个前置前置扩增子，其中多个前置前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含针对靶探针组中的一组的靶探针对的结合位点和针对前置扩增子的多个结合位点；(C)使样品与一组前置扩增子接触，其中前置扩增子组包含对每个前置前置扩增子具有特异性的多个前置扩增子亚组，其中每个前置扩增子亚组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子亚组的前置扩增子包含针对对靶探针组具有特异性的前置前置扩增子中的一个的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(D)使样品与一组扩增子接触，其中扩增子组包含对每个前置扩增子亚组具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含针对前置扩增子亚组中的一个亚组的前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；(E)使样品与第一标记探针组接触，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组中的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中第一标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；(F)检测与靶核酸结合的第一标记探针组的标记探针，从而检测第一靶核酸亚组；(G)在高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育样品，从而从与第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组上去除标记；(H)使样品与第二标记探针组接触，其中第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第二标记探针亚组与第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在第二标记探针亚组之间是可区分的，并且任选地其中标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中第二标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的与第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；(I)检测与靶核酸结合的第二标记探针组的标记探针，从而检测第二靶核酸亚组，其中检测了多个靶核酸；和(J)使样品与酸试剂接触，从而破坏与靶核酸结合的探针的结合(参见例如图2B和6B，其中L＝2，并且其中不是从SGC上切割标记，而是使用高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于SGC的其他组分之间的解链温度的温度从SGC上去除标记探针)。
在一个实施方案中，所述方法在步骤(J)之前包括：(K)在高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育样品，从而从与第二靶核酸组结合的第二标记探针组上去除标记；(L)使样品与第三标记探针组接触，其中第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第三标记探针亚组与第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在第三标记探针亚组之间是可区分的，并且任选地其中标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中第三标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的与第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组；和(M)检测与靶核酸结合的第三标记探针组的标记探针，从而检测第三靶核酸亚组(参见例如图2B和6B，其中L＝3，并且其中不是从SGC上切割标记，而是使用高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于SGC的其他组分之间的解链温度的温度从SGC上去除标记探针)。
在一个实施方案中，所述方法包括重复步骤(K)至(M)一次或多次(参见例如图2B和6B，其中L＝4+，并且其中不是从SGC上切割标记，而是使用高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于SGC的其他组分之间的解链温度的温度从SGC上去除标记探针)。
在一个实施方案中，使细胞与酸试剂接触重复一次或多次。
在一个实施方案中，所述方法还包括重复步骤(A)至(J)或步骤(A)至(I)、(K)至(M)和(J)一次或多次(参见例如图2B和6B，其中K＝2+，并且其中不是从SGC上切割标记，而是使用高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于SGC的其他组分之间的解链温度的温度从SGC上去除标记探针)。在这种方法的一个实施方案中，所述方法还包括重复步骤(A)至(I)或步骤(A)至(I)和(K)至(M)。
在一个实施方案中，本发明提供了一种检测多个核酸的方法，所述方法包括(A)使含有包含多个靶核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对靶探针；(B)使样品与一组前置前置扩增子接触，其中前置前置扩增子组包含多对前置前置扩增子，其中前置前置扩增子组包含对靶探针组的每对靶探针具有特异性的一对前置前置扩增子，其中前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含针对靶探针组的靶探针对的靶探针中的一个的结合位点，并且其中前置前置扩增子包含针对前置扩增子的多个结合位点；(C)使样品与一组前置扩增子接触，其中前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中多个前置扩增子包含对每对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含针对前置前置扩增子组的前置前置扩增子对中的一对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(D)使样品与一组扩增子接触，其中扩增子组包含对每个前置扩增子(其对每对前置前置扩增子具有特异性)具有特异性的多个扩增子亚组，其中扩增子亚组的扩增子包含针对对前置前置扩增子对具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；(E)使样品与第一标记探针组接触，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组中的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中第一标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；(F)检测与靶核酸结合的第一标记探针组的标记探针，从而检测第一靶核酸亚组；(G)在高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育样品，从而从与第一靶核酸亚组结合的第一标记探针组上去除标记；(H)使样品与第二标记探针组接触，其中第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第二标记探针亚组与第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在第二标记探针亚组之间是可区分的，并且任选地其中标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中第二标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的与第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；(I)检测与靶核酸结合的第二标记探针组的标记探针，从而检测第二靶核酸亚组，其中检测了多个靶核酸；和(J)使样品与酸试剂接触，从而破坏与靶核酸结合的探针的结合(参见例如图2B和6C，其中L＝2，并且其中不是从SGC上切割标记，而是使用高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于SGC的其他组分之间的解链温度的温度从SGC上去除标记探针)。
在一个实施方案中，所述方法在步骤(J)之前包括：(K)在高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育样品，从而从与第二靶核酸组结合的第二标记探针组上去除标记；(L)使样品与第三标记探针组接触，其中第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第三标记探针亚组与第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在第三标记探针亚组之间是可区分的，并且任选地其中标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中第三标记探针组特异性标记与多个靶探针组杂交的与第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组；和(M)检测与靶核酸结合的第三标记探针组的标记探针，从而检测第三靶核酸亚组(参见例如图2B和6C，其中L＝3，并且其中不是从SGC上切割标记，而是使用高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于SGC的其他组分之间的解链温度的温度从SGC上去除标记探针)。
在一个实施方案中，所述方法包括重复步骤(K)至(M)一次或多次(参见例如图2B和6C，其中L＝4+，并且其中不是从SGC上切割标记，而是使用高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于SGC的其他组分之间的解链温度的温度从SGC上去除标记探针)。
在一个实施方案中，使细胞与酸试剂接触重复一次或多次。
在一个实施方案中，所述方法还包括重复步骤(A)至(J)或步骤(A)至(I)、(K)至(M)和(J)一次或多次(参见例如图2B和6C，其中K＝2+，并且其中不是从SGC上切割标记，而是使用高于标记探针与扩增子之间的解链温度并低于SGC的其他组分之间的解链温度的温度从SGC上去除标记探针)。在这种方法的一个实施方案中，所述方法还包括重复步骤(A)至(I)或步骤(A)至(I)和(K)至(M)。
在使用靶探针组的本发明方法的一些实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性杂交的靶探针。
在本发明方法的一些实施方案中，酸试剂包含5％-40％或20％-30％或如本文公开的其他浓度的酸。在一个实施方案中，酸选自由乙酸、甲酸、丙酸、丁酸、戊酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸组成的组。
在一些实施方案中，酸试剂包含盐。在一个实施方案中，酸试剂包含SSC。在一个实施方案中，酸试剂包含1X至13X SSC或3.2X至12.8X SSC。
在本发明方法的一些实施方案中，靶核酸独立地是DNA或RNA。在一个实施方案中，靶核酸是RNA时独立地选自由信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、核糖体RNA(rRNA)、线粒体RNA和非编码RNA组成的组。
在本发明方法的一些实施方案中，样品是组织标本或来源于组织样本。在本发明方法的一些实施方案中，样品是血液样品或来源于血液样品。在本发明方法的一些实施方案中，样品是细胞学样品或来源于细胞学样品。
本发明的方法应用于靶核酸的多路复用检测。如本文所公开的，本发明的方法以迭代轮次的靶核酸亚组检测进行。还如本文所公开的，一个轮次中可检测的靶核酸的数目取决于所使用的标记探针的类型和在并行检测时区分对不同靶核酸具有特异性的标记探针的能力。更高水平的多路复用是通过迭代轮次的检测和酸处理实现的。例如，在图1所描绘的示例性实施方案中，一个轮次标记和检测提供四个靶核酸的检测，第二轮次的标记和检测提供八个靶核酸的检测，并且第三轮次的标记和检测提供十二个靶核酸的检测。在包括酸处理步骤的情况下，可以检测额外的靶核酸组，在此具体实例中，对于相同样品中的总共24个靶核酸而言，可以检测多达十二个额外的靶核酸。本领域技术人员可以容易地确定在本发明的测定中检测的靶核酸的期望数目。在一些实施方案中，在本发明的方法中使用两个轮次的标记和检测。在一些实施方案中，使用三个轮次的标记和检测。在一些实施方案中，可以使用4、5、6、7、8、9或10个或更多个轮次的标记和检测，只要有足够数目的SGC可用于唯一地标记和检测每个靶核酸，并且SGC在测定条件期间与靶核酸保持充分结合以检测靶核酸。本领域技术人员可以容易地确定可以在本发明的方法中应用的标记和检测的轮数，其中可以在每个轮次中检测靶核酸。
随着后续轮次的检测应用于样品，后续获得的靶核酸检测可以与之前检测的靶核酸检测轮次进行配准，使得可以确定在相同的样品中甚至在相同的细胞中所有检测的靶核酸的表达(参见图1、2A和2B)。靶核酸检测轮次的配准可以使用图像分析软件叠加不同轮次中检测的靶核酸的图像来实现。此类用于调准和叠加多个图像的配准算法在本领域所熟知的，例如，尺度不变的特征变换(SIFT)算法(Lowe"Distinctive Image Features fromScale-Invariant Keypoints",Internat.J.Computer Vision 60(2):91-110(2004))。本质上，这些算法将输入图像与参考图像进行比较，以产生变换矩阵来说明移位和旋转。例如，ImageJ中存在可以自动进行此任务(imagej.net/Registration)的工具(Schneider等人,Nature Methods 9(7):671-675(2012)；Schindelin等人,Mol.Reprod.Dev.82(7-8):518-529(2015))。
额外的多路复用可以通过利用相同的SGC组装但使用针对不同靶核酸的不同靶探针组来实现。在这种情况下，在检测具有在标记靶核酸亚组的迭代轮次中检测的SGC复合物的初始靶核酸组后，可以使用适当的条件从靶核酸中去除SGC复合物，以使SGC与靶核酸的杂交变性。一旦从样品中去除SGC复合物，相同的前置扩增子/扩增子/标记探针或前置前置扩增子/前置扩增子/扩增子/标记探针可以与靶探针组一起使用，所述靶探针组被设计成对与第一轮次的SGC检测中检测的靶核酸组不同的靶核酸组具有特异性。通过这种方式，可以实现额外靶核酸的检测。如本文所述，可以通过对样品进行酸处理以去除结合的靶探针和SGC，然后任选地重复使用相同但靶向不同的靶核酸的SGC，以在后续轮次中标记不同的靶核酸，来实现进一步的多路复用。
在再一实施方案中，本发明的方法可用于同时检测双链核酸和单链核酸，例如检测同一样品中的DNA和RNA。在这种情况下，可以设计探针以检测单链核酸(如RNA)(参见，例如，美国专利号7,709,198、美国公开2008/0038725和2009/0081688，和2017/0101672)和双链核酸，使得可以在同一样品中同时检测双链核酸和单链核酸，如DNA和RNA。
在一些实施方案中，对靶核酸具有特异性的每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性杂交的靶探针。在这种情况下，对靶核酸具有特异性的靶探针组中的靶探针对与靶核酸的不同和非重叠序列结合。当使用具有两对或更多对可与相同靶核酸特异性杂交的靶探针的靶探针组时，与靶探针对结合的分子，无论是前置扩增子(参见图5A和6A)，还是前置前置扩增子(参见图5B、5C、6B和6C)，对于相同靶探针组中的靶探针对通常是相同的。因此，与相同靶核酸结合的靶探针对可被设计成包含针对SGC中与靶探针对结合的分子(即前置扩增子或前置前置扩增子)的相同结合位点。使用多个靶探针对检测靶核酸提供了与多个SGC在相同靶核酸上的组装相关的更高信号。在一些实施方案中，用于与相同靶核酸结合的靶探针对的数目为每个靶标1-10、1-20、1-30、1-40、1-50、1-60、1-70、1-80、1-90、1-100、1-110、1-120、1-130、1-140、1-150、1-160、1-170、1-180、1-190或1-200对，或更大数目的对，或其间的任何整数对，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200对等。
本发明的方法可用于实现所需靶核酸的检测。在一个实施方案中，用多个靶探针对检测靶核酸。在这种情况下，靶探针对被设计成与靶核酸的多于一个区域结合，以允许多个SGC组装到靶核酸上。应理解，如果多个靶探针对用于与相同的靶核酸结合，则一个靶探针对的靶结合位点不与另一个靶探针对的靶结合位点重叠。
在本发明的一个实施方案中，通过本发明的方法检测的靶核酸可以是存在于细胞样品中的任何核酸，包括但不限于RNA，包括信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、核糖体RNA(rRNA)、线粒体RNA、非编码RNA等，或DNA等。在一个特定实施方案中，核酸是RNA。在用于核酸多路复用检测的本发明方法中，应理解，靶核酸可以独立地是DNA或RNA。换句话说，待检测的靶核酸可以是但不一定是相同类型的核酸。因此，在本发明的测定中待检测的靶核酸可以是DNA和RNA。在靶核酸是RNA的情况下，应理解，靶核酸可独立地选自由信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、核糖体RNA(rRNA)、线粒体RNA和非编码RNA组成的组。因此，靶核酸可以独立地是DNA或任何类型的RNA。
如本文所述，本发明的方法通常涉及靶核酸的原位检测。用于核酸的原位检测的方法是本领域技术人员熟知的(参见例如US2008/0038725；US 2009/0081688；Hicks等人,J.Mol.Histol.35:595-601(2004))。如本文所用，“原位杂交”或“ISH”是指使用直接或间接标记的互补DNA或RNA链(如探针)(原位)结合并定位样品(特别是组织的一部分或切片或细胞)中的特定核酸(如DNA或RNA)的杂交类型。探针类型可以是双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、单链互补RNA(sscRNA)、信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、核糖体RNA、线粒体RNA和/或合成的寡核苷酸。术语“荧光原位杂交”或“FISH”是指利用荧光标记的ISH类型。术语“发色原位杂交”或“CISH”是指具有发色标记的ISH类型。ISH、FISH和CISH方法是本领域技术人员熟知的(参见例如Stoler,Clinics in Laboratory Medicine 10(1):215-236(1990)；In situ hybridization.A practical approach,Wilkinson,编,IRL Press,Oxford(1992)；Schwarzacher and Heslop-Harrison,Practical in situhybridization,BIOS Scientific Publishers Ltd,Oxford(2000))。
对于用于原位检测细胞中核酸靶的本发明的方法，包括但不限于原位杂交或流式细胞术，任选地在靶探针杂交之前固定和/或透化细胞。将细胞固定和透化可促进核酸靶保留在细胞中并允许靶探针、标记探针、扩增子、前置扩增子、前置前置扩增子等进入细胞并到达靶核酸分子。任选地洗涤细胞以去除未被捕获到核酸靶上的物质。细胞可以在多个步骤中任一个之后洗涤，例如，在靶探针与核酸靶杂交以去除未结合的靶探针之后，在前置前置扩增子、前置扩增子、扩增子和/或标记探针与靶探针杂交之后，等等。用于固定和透化细胞以原位检测核酸的方法，以及用于杂交、洗涤和检测靶核酸的方法也是本领域熟知的(参见例如US 2008/0038725；US 2009/0081688；Hicks等人,J.Mol.Histol.35:595-601(2004)；Stoler,Clinics in Laboratory Medicine 10(1):215-236(1990)；In situhybridization.A practical approach,Wilkinson,编,IRL Press,Oxford(1992)；Schwarzacher and Heslop-Harrison,Practical in situ hybridization,BIOSScientific Publishers Ltd,Oxford(2000)；Shapiro,Practical Flow Cytometry第3版,Wiley-Liss,New York(1995)；Ormerod,Flow Cytometry,第2版,Springer(1999))。示例性固定剂包括但不限于醛(甲醛、戊二醛等)、丙酮、醇(甲醇、乙醇等)。示例性透化剂包括但不限于醇(甲醇、乙醇等)、酸(冰乙酸等)、去污剂(Triton、NP-40、TweenTM 20等)、皂苷、洋地黄皂苷、LeucopermTM(BioRad,Hercules,CA)和酶(例如溶菌酶、脂肪酶、蛋白酶和肽酶)。透化也可以通过机械破裂发生，如在组织切片中。
对于双链核酸的原位检测，通常处理样品以使样品中的双链核酸变性，以使靶探针通过杂交与靶双链核酸的链结合。使双链核酸变性的条件是本领域熟知的，并且包括热和化学变性，例如使用碱(NaOH)、甲酰胺、二甲亚砜等(参见Wang等人,Environ.HealthToxicol.29:e2014007(doi:10.5620/eht.2014.29.e2014007)2014；Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,John Wileyand Sons,Baltimore,MD(1999))。例如，NaOH、LiOH或KOH或其他高pH缓冲液(pH>11)可用于使双链核酸如DNA变性。另外，热和化学变性方法可以组合使用。
此类原位检测方法可用于固定在载玻片上的组织标本、悬浮液中的单细胞，如从血液样品中分离的外周血单核细胞(PBMC)，等。组织标本包括例如组织活检样品。血液样品包括例如为诊断目的而采集的血液样品。在血液样品的情况下，可以直接分析血液，如在血涂片中，或者可以处理血液，例如裂解红细胞、分离PBMC或白细胞、分离靶细胞等，使得通过本发明方法分析的样品中的细胞在血液样品中或来源于血液样品。类似地，可处理组织标本，例如，切碎并物理或酶促处理组织标本以将组织破碎成单个细胞或细胞簇。另外，如果需要，可处理细胞学样品以分离细胞或破坏细胞簇。因此，可以使用本领域熟知的方法获得和处理组织、血液和细胞学样品。本发明的方法可用于诊断应用以基于作为指示病理的生物标志物的核酸靶的存在或不存在来鉴定病理细胞的存在或不存在。
本领域技术人员应理解，许多合适的样品中的任一种可用于使用本发明的方法检测靶核酸。用于本发明方法的样品通常是生物样品或组织样品。这样的样品可以从生物受试者获得，包括生物组织或流体来源的样品，其收集自个体或一些其他来源的生物材料，如活检、尸检或法医材料。生物样品还包括来自含有或疑似含有癌前或癌细胞或组织的生物受试者区域的样品，例如组织活检，包括细针抽吸物、血液样品或细胞学标本。此类样品可以是，但不限于，从生物体如哺乳动物分离的器官、组织、组织级分和/或细胞。示例性生物样品包括但不限于细胞培养物，包括原代细胞培养物、细胞系、组织、器官、细胞器、生物流体等。另外的生物样品包括但不限于皮肤样品、组织活检(包括细针抽吸物)、细胞学样品、粪便、体液(包括血液和/或血清样品)、唾液、精液等。此类样品可用于医学或兽医诊断目的。样品也可以从其他来源获得，例如食物、土壤、物体表面等，以及需要检测靶核酸的其他材料。因此，本发明的方法可用于从得自个体或其他来源的生物样品中检测一种或多种病原体，如病毒、细菌、真菌、单细胞生物体如寄生虫等。
用于通过本发明的方法分析的细胞学样品的收集是本领域熟知的(参见例如，Dey,“Cytology Sample Procurement,Fixation and Processing”in Basic andAdvanced Laboratory Techniques in Histopathology and Cytology第121-132页,Springer,Singapore(2018)；“Non-Gynecological Cytology Practice Guideline”American Society of Cytopathology,ASC执行委员会于2004年3月2日通过)。处理用于分析宫颈组织的样品(包括组织活检和细胞学样品)的方法是本领域熟知的(参见例如，CecilTextbook of Medicine,Bennett and Plum,编,第20版,WB Saunders,Philadelphia(1996)；Colposcopy and Treatment of Cervical Intraepithelial Neoplasia:ABeginner’s Manual,Sellors and Sankaranarayanan,编,International Agency forResearch on Cancer,Lyon,France(2003)；Kalaf and Cooper,J.Clin.Pathol.60:449-455(2007)；Brown and Trimble,Best Pract.Res.Clin.Obstet.Gynaecol.26:233-242(2012)；Waxman等人,Obstet.Gynecol.120:1465-1471(2012)；Cervical CytologyPractice Guidelines TOC,美国细胞病理学会(ASC)执行委员会批准，2000年11月10日)。在一个实施方案中，细胞学样品是宫颈样品，例如巴氏涂片。在一个实施方案中，样品是细针抽吸物。
在本发明的特定实施方案中，样品是组织标本或来源于组织标本。在本发明的其他特定实施方案中，样品是血液样品或来源于血液样品。在本发明的再其他特定实施方案中，样品是细胞学样品或来源于细胞学样品。
本发明基于在靶核酸之间构建复合物以用可检测标记来标记靶核酸。这种复合物有时被称为信号产生复合物(SGC；参见例如US 20170101672)。这种复合物或SGC通过构建允许大量标记连接到靶核酸的分子层来实现。
本发明的方法可以使用信号产生复合物(SGC)，其中SGC包含多个分子而不是单个分子。这种SGC特别适用于放大可检测信号，提供对靶核酸的更高敏感性检测。此类用于放大信号的方法描述于例如美国专利号5,635,352、5,124,246、5,710,264、5,849,481和7,709,198，以及美国公开2008/0038725和2009/0081688，以及WO 2007/001986和WO 2012/054795中，其各自以引用的方式并入本文。SGC的产生是
Figure BDA0003741356720000511
测定的原理(参见美国专利号7,709,198、8,658,361和9,315,854，美国公开2008/0038725、2009/0081688和2016/0201117，以及WO 2007/001986和WO 2012/054795，其各自以引用的方式并入本文)。
基本信号产生复合物(SGC)在图5A中示出(也参见US2009/0081688，其以引用的方式并入本文)。图5中描绘为一对“Z”的一对靶探针与标记为“靶标”的互补分子序列杂交。每个靶探针含有与前置扩增子分子(PA，以绿色示出)互补的附加序列，其必须同时与靶探针对的两个成员杂交以稳定结合。前置扩增子分子由两个结构域组成：一个结构域具有与每个靶探针杂交的区域，并且一个结构域含有一系列核苷酸序列重复，每个都与扩增子分子(Amp，以黑色示出)上的序列互补。此序列的多个重复的存在允许多个扩增子分子与一个前置扩增子杂交，这增加了整体信号放大。每个扩增子分子由两个结构域组成，一个结构域具有与前置扩增子杂交的区域，并且一个结构域含有一系列核苷酸序列重复，每个都与标记探针(LP，以黄色示出)上的序列互补，从而允许多个标记探针与每个扩增子分子杂交，这进一步增加了整体信号放大。每个标记探针含有两个组分。一个组分由与扩增子分子上的重复序列互补以允许标记探针杂交的核苷酸序列组成。此核苷酸序列与第二组分连接，所述第二组分可以是任何信号产生实体，包括用于直接可视化的荧光或发色标记、可直接检测的金属同位素，或能够促进化学反应产生荧光、发色或其他可检测信号的酶或其他化学品，如本文所述。在图5A中，标记探针被描绘为代表核酸组分的线和代表信号产生组分的星号。总之，从靶探针到标记探针的组装被称为信号产生复合物(SGC)。
图5B示出了通过添加放大分子层(在这种情况下为前置前置扩增子分子(PPA，以红色显示))而放大的SGC。PPA与一个结构域中的两个靶探针和另一个结构域中的多个前置扩增子(PA)结合。
图5C示出了在前置扩增子水平上使用协同杂交的不同SGC结构(参见US 2017/0101672，其以引用的方式并入本文)。与图5A和5B中形成的SGC类似，一对靶探针与靶分子序列杂交。每个靶探针含有与独特的前置前置扩增子分子(PPA-1，以紫色示出；PPA-2，以红色示出)互补的附加序列。使用两个独立的分子建立了需要协同杂交的基础。每个前置前置扩增子分子由两个结构域组成，一个结构域具有与靶探针中一个杂交的区域，并且一个结构域含有一系列核苷酸序列重复，每个含有与前置扩增子分子(PA，以绿色示出)内的序列互补的序列，以及促进PPA-PA结合效率的间隔序列。为了稳定地连接到生长的SGC上，每个PA必须同时与两个PPA分子杂交。每个前置扩增子分子由两个结构域组成，一个结构域含有与两个前置前置扩增子互补以允许杂交的序列，并且一个结构域含有一系列核苷酸序列重复，每个与扩增子分子(AMP，以黑色示出)上的序列互补。扩增子杂交序列的多个重复允许多个扩增子分子与每个前置扩增子杂交，进一步增加信号放大。为了简化说明，扩增子分子被示为与一个前置扩增子分子杂交，但是应理解，扩增子可以与每个前置扩增子结合。每个扩增子分子含有与标记探针(LP，以黄色示出)内的序列互补的一系列核苷酸序列重复，从而允许几个标记探针与每个扩增子分子杂交。每个标记探针含有信号产生元件以提供信号检测。
如上所述，无论使用图5A、5B、6A或6B所描绘的配置，还是图5C和6C所描绘的配置，都要设计SGC的组分使得需要结合两个靶探针以构建SGC。在图5A、5B、6A或6B的配置的情况下，前置扩增子(或图5B和6B中的前置前置扩增子)必须与靶探针对的两个成员结合以发生稳定结合。这通过以下来实现：设计靶探针与前置扩增子(或前置前置扩增子)之间的结合位点，使得两个靶探针与前置扩增子(或前置前置扩增子)的结合具有比单个靶探针与前置扩增子(或前置前置扩增子)的结合更高的解链温度(Tm)，并且其中单个靶探针的结合在测定条件下是不稳定的。此设计先前已描述于例如美国专利号7,709,198、美国公开2008/0038725和2009/0081688、WO 2007/001986、WO 2007/002006，Wang等人，同上，2012，Anderson等人，同上，2016)中。通过以这种方式配置SGC组分，当两个靶探针都与靶核酸和前置扩增子结合时实现了SGC的组装，从而由于作为假阳性的SGC的组装被最小化而降低了背景噪声。
在图5C和6C的配置的情况下，仅在靶探针对的两个成员都与靶核酸结合时才形成SGC的要求是通过要求前置扩增子与两个前置前置扩增子结合来实现的，这两个前置前置扩增子继而分别与靶探针对的两个成员结合。此要求通过以下来实现：设计前置前置扩增子与前置扩增子之间的结合位点，使得两个前置前置扩增子与前置扩增子的结合之间的解链温度(Tm)高于任一单独的前置前置扩增子的解链温度，并且其中前置前置扩增子中的一个与前置扩增子的结合在测定条件下是不稳定的。这种设计先前已经描述于例如US20170101672、WO 2017/066211和Baker等人，同上，2017)中。除非前置扩增子与两个前置前置扩增子结合，否则扩增子和标记探针不能组装成与靶核酸结合的SGC，从而由于作为假阳性的SGC的组装被最小化而降低了背景噪声。
如本文所公开的，所述方法可基于构建与靶核酸结合的信号产生复合物(SGC)以检测细胞中靶核酸的存在。用于构建SGC的组分通常包含核酸，使得核酸杂交反应用于将SGC的组分与靶核酸结合。选择适当区域并设计与靶核酸结合的特异性和选择性试剂的方法，特别是与靶核酸或SGC的其他组分特异性和选择性结合的寡核苷酸或探针，是本领域技术人员熟知的(参见Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory,New York(2001)；Ausubel等人,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,MD(1999))。设计靶探针使得探针与靶核酸特异性杂交。可以使用对靶核酸区域以及适当长度的结合剂如寡核苷酸或探针的适当选择来实现期望的特异性，并且这种选择方法是本领域技术人员公熟知的。因此，本领域技术人员将容易理解并且可以容易地确定适当的试剂，如寡核苷酸或探针，其可以用于靶向一种特定靶核酸而不是另一种靶核酸，或者提供与SGC组分的结合。可以通过以下来实现靶特异性SGC的类似特异性：使用对独特序列的适当选择，使得靶特异性SGC的给定组分(例如，靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子、扩增子、标记探针)将与相应的组分结合，使得SGC与特异性靶标结合(参见图6)。
如本文所述，本发明的实施方案包括使用靶探针对。在一对靶探针与同一前置扩增子结合(图5A和6A)或前置前置扩增子(图5B和6B)的情况下，可以使用探针配置，有时称为“Z”配置。这种配置及其用于增加敏感性和减少背景的优点例如在美国专利号7,709,198、美国公开2008/0038725和2009/0081688，以及WO 2007/001986和WO 2007/002006中进行了描述，其各自以引用的方式并入本文。美国专利号7,709,198和美国公开2008/0038725和2009/0081688另外描述了用于选择靶探针(如靶探针对)的特征的细节，包括长度、方向、杂交条件等。本领域技术人员可以基于本文的教导和例如美国专利号7,709,198、美国公开2008/0038725和2009/0081688以及WO 2007/001986和WO 2007/002006中的教导容易地确定合适的配置。
如本文所述，靶探针对中的靶探针的靶结合位点可以是任何期望的方向和组合。例如，靶探针对的一个成员的靶结合位点可以是前置扩增子或前置前置扩增子结合位点的5'或3'，并且所述对的另一个成员可以独立地将靶结合位点定位于前置扩增子或前置前置扩增子结合位点的5'或3'。
在另一个实施方案中，用于检测靶核酸存在的SGC是基于SGC的一个或多个组分的协同杂交(参见US 20170101672和WO 2017/066211，其各自以引用的方式并入本文)。这种协同杂交在本文中也称为BaseScopeTM。在协同杂交效应中，SGC的两个组分之间的结合通过两个结合位点介导，并且同时与两个位点结合的解链温度高于单独一个位点结合的解链温度(参见US 20170101672和WO 2017/066211)。协同杂交效应可通过如US 20170101672和WO2017/066211中所述的靶探针组配置来增强。
本发明的方法和相关组合物可利用协同杂交来增加特异性并降低核酸靶的原位检测中的背景，其中复杂的生理化学环境和大量非靶分子的存在可产生高噪音。使用这种协同杂交方法，标记探针的结合仅在SGC与靶核酸结合时发生。如US 20170101672和WO2017/066211中所述及其图1中所示，通过增加SGC的一个或多个组分中协同杂交的数目，可以容易地修改所述方法以提供所需的信噪比。
在另一个实施方案中，协同杂交可应用于SGC的各种组分。例如，如本文所述，SGC的组分之间的结合可以是稳定的反应，或者也如本文所述，所述结合可以被配置成需要协同杂交。在这种情况下，设计用于协同杂交的结合组分，使得所述组分含有与另一组分结合的两个区段。
因此，用于检测靶核酸的方法可利用协同杂交用于检测系统中提供与靶核酸特异性结合的SGC的任一个或所有组分之间的结合反应。可以基于所需的测定条件、被测定的样品类型、所需的测定敏感性等选择应用协同杂交的组分数目和组分类型。协同杂交结合反应的任一种或组合可用于增加测定的敏感性和特异性。在本发明的实施方案中，协同杂交可以在前置前置扩增子与前置扩增子之间、在前置扩增子与扩增子之间、在扩增子与标记探针之间，或其组合(参见例如US 20170101672和WO 2017/066211)。
如本文所公开的，组分通常彼此直接结合。在含有核酸的组分的情况下，结合反应通常通过杂交进行。在杂交反应的情况下，组分之间的结合是直接的。如果需要，可以包括中间组分，使得一种组分与另一种组分的结合是间接的，例如，中间组分含有互补结合位点以桥接两个其他组分。
如本文所述，可选择各种组分的配置以提供所需的稳定或协同杂交结合反应(参见例如US 20170101672)。应理解，即使结合反应在本文中示例为稳定的或不稳定的反应，如对于协同杂交，但结合反应中的任一种可根据需要进行修改，只要检测到靶核酸即可。还应理解，可以根据所用的测定和杂交条件改变和选择配置。通常，如果期望结合反应是稳定的，则组分之间的互补核酸序列的区段通常在10至50个核苷酸或更多的范围内，例如16至30个核苷酸，如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸或更多。如果期望结合反应相对不稳定，如当采用协同杂交结合反应时，组分之间的互补核酸序列的区段通常在5至18个核苷酸的范围内，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个核苷酸。应理解，对于稳定或不稳定杂交，核苷酸长度可以稍短或稍长，这取决于测定中使用的序列(例如GC含量)和条件。还应理解，如本文所公开的，修饰的核苷酸如锁核酸(LNA)或桥核酸(BNA)可用于增加修饰碱基处的结合强度，从而允许减少结合区段的长度。因此，应理解，关于与其他核酸区段互补的核酸区段的长度，如果需要，本文所述的长度可进一步减少。本领域技术人员可以容易地确定适当的探针设计，包括长度、修饰核苷酸的存在等，以实现核酸组分之间所需的相互作用。
在设计包含互补序列的两个核酸序列之间的结合位点时，可以任选地设计互补序列以最大化解链温度的差异(dTm)。这可以通过使用本领域已知的解链温度计算算法来完成(参见例如SantaLucia,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:1460–1465(1998))。此外，已知人工修饰的碱基如锁核酸(LNA)或桥核酸(BNA)和天然存在的2'-O-甲基RNA增强互补对之间的结合强度(Petersen和Wengel,Trends Biotechnol.21:74–81(2003)；Majlessi等人,Nucl.Acids Res.26:2224–2229(1998))。这些修饰的碱基可以根据需要策略性地引入到SGC组分之间的结合位点中。
一种方法是利用修饰的核苷酸(LNA、BNA或2′-O-甲基RNA)。因为每个修饰的碱基可以增加解链温度，所以两个核酸序列(即互补序列)之间的结合区的长度可以显著缩短。修饰的碱基与其补体的结合强度更强，并且解链温度的差异(dTm)增加。又一实施方案是在待杂交的核酸组分的互补序列中或在例如信号产生复合物(SGC)的两个核酸组分之间使用三个修饰碱基(例如三个LNA、BNA或2'-O-甲基RNA碱基，或两个或三个不同修饰碱基的组合)。此类组分可以是例如前置前置扩增子、前置扩增子、扩增子、标记探针或靶探针对。
修饰的碱基，如LNA或BNA，可用于SGC选定组分的区段中，特别是介导核酸组分之间结合的那些，这增加了碱基与其互补碱基的结合强度，使得互补区段的长度减少(参见例如Petersen和Wengel,Trends Biotechnol.21:74–81(2003)；美国专利号7,399,845)。扩展天然4字母表如人工扩展的遗传信息系统(AEGIS；Yang等人,Nucl.Acids Res.34(21):6095-6101(2006))的人工碱基可以掺入SGC的相互作用组分之间的结合位点中。这些人工碱基可增加相互作用组分的特异性，所述相互作用组分继而可允许较低严格性杂交反应产生较高信号。
关于靶探针对，可以将靶探针对设计成与靶核酸的紧邻区段结合或位于靶探针对的靶探针结合位点之间具有一至多个碱基的区段上。通常，靶探针对被设计成与靶核酸结合，使得在靶核酸上的结合位点之间通常存在0至500个碱基，例如5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、420、440、460、480或500个碱基，或其间的任何整数长度。在特定实施方案中，靶探针对的结合位点在0至100、0至200、或0至300个碱基之间，或其间的任何整数长度。在靶探针组中使用多于一个靶探针对以与相同靶核酸(RNA或单链DNA)结合的情况下，并且在一对靶探针之间的结合位点中存在间隙的情况下，应理解不同靶探针对的结合位点不重叠。在检测双链核酸如DNA的情况下，不同靶探针对之间可发生一些重叠，只要靶探针对能够并行地与双链靶核酸的相应结合位点结合即可。
SGC还包含多个标记探针(LP)。每个LP包括可检测的区段。可检测组分可直接连接到LP，或LP可与包含可检测组分即标记的另一核酸杂交。如本文所用，“标记”是促进分子检测的部分。本发明上下文中的常见标记包括荧光、发光、光散射和/或比色标记。合适的标记包括酶、荧光和发色部分、以及放射性核素、底物、辅因子、抑制剂、化学发光部分、磁性颗粒、稀土金属、金属同位素等。在本发明的一个特定实施方案中，标记是酶。示例性酶标记包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等以及各种蛋白酶。其他标记包括但不限于荧光团、二硝基苯基(DNP)等。标记是本领域技术人员熟知的，例如描述于Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego(1996)，以及美国专利号3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149；和4,366,241中。许多标记是可商购获得的并且可用于本发明的方法和测定中，包括可检测的酶/底物组合(Pierce,Rockford IL；Santa Cruz Biotechnology,Dallas TX；LifeTechnologies,Carlsbad CA)。在本发明的一个特定实施方案中，酶可利用发色或荧光底物以产生可检测信号，如本文所述。本文描述了示例性标记。
可以使用多种酶或非酶标记中的任一种，只要可以分别检测到酶活性或非酶标记即可。酶由此产生可检测信号，其可用于检测靶核酸。特别有用的可检测信号是发色或荧光信号。因此，用作标记的特别有用的酶包括可获得发色或荧光底物的酶。此类发色或荧光底物可以通过酶促反应转化为容易检测的发色或荧光产物，其可以使用显微镜或光谱法容易地检测和/或定量。此类酶是本领域技术人员熟知的，包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶等(参见Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego(1996))。具有熟知的发色或荧光底物的其他酶包括各种肽酶，其中发色或荧光肽底物可用于检测蛋白水解切割反应。发色和荧光底物的使用在细菌诊断学中也是熟知的，包括但不限于使用α-和β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、6-磷酸-β-D-半乳糖苷6-磷酸半乳糖苷水解酶、β-葡糖苷酶、α-葡糖苷酶、淀粉酶、神经氨酸酶、酯酶、脂肪酶等(Manafi等人,Microbiol.Rev.55:335-348(1991))，并且这些具有已知发色或荧光底物的酶可容易地适用于本发明的方法。
产生可检测信号的各种发色或荧光底物是本领域技术人员熟知的并且是可商购获得的。可用于产生可检测信号的示例性底物包括但不限于用于辣根过氧化物酶的3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、氯萘酚(4-CN)(4-氯-1-萘酚)、2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、邻苯二胺二盐酸盐(OPD)和3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)；用于碱性磷酸酶的5-溴-4-氯-3-吲哚基-1-磷酸(BCIP)、氮蓝四唑(NBT)、固红(固红TR/AS-MX)和对硝基苯基磷酸酯(PNPP)；用于β-半乳糖苷酶的1-甲基-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷和2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-吡喃半乳糖苷；用于β-葡糖苷酶的2-甲氧基-4-(2-硝基乙烯基)苯基β-D-吡喃葡萄糖苷等。示例性荧光底物包括但不限于用于碱性磷酸酶的4-(三氟甲基)伞形基磷酸酯；用于磷酸酶的4-甲基伞形基磷酸酯双(2-氨基-2-甲基-1,3-丙二醇)、4-甲基伞形基磷酸酯双(环己基铵)和4-甲基伞形基磷酸酯；用于辣根过氧化物酶的QuantaBluTM和QuantaRedTM；用于β-半乳糖苷酶的4-甲基伞形基β-D-吡喃半乳糖苷、荧光素二(β-D-吡喃半乳糖苷)和萘荧光素二(β-D-吡喃半乳糖苷)；用于β-葡糖苷酶的3-乙酰基伞形基β-D-吡喃葡糖苷和4-甲基伞形基-β-D-吡喃葡糖苷；和用于α-半乳糖苷酶的4-甲基伞形基-α-D-吡喃半乳糖苷。用于产生可检测信号的示例性酶和底物也描述于例如美国公开2012/0100540中。各种可检测的酶底物(包括发色或荧光底物)是熟知的且可商购获得的(Pierce,Rockford IL；Santa Cruz Biotechnology,Dallas TX；Invitrogen,Carlsbad CA；42Life Science；Biocare)。通常，将底物转化为形成沉淀的产物，沉淀沉积在靶核酸的位点。其他示例性底物包括但不限于HRP-Green(42LifeScience)、Betazoid DAB、Cardassian DAB、Romulin AEC、Bajoran紫、Vina绿、Deep SpaceBlackTM、Warp RedTM、Vulcan固红和来自Biocare的Ferangi蓝(Concord CA；biocare.net/products/detection/chromogens)。
适合作为可检测标记的示例性稀土金属和金属同位素包括但不限于镧系元素(III)同位素，例如141Pr、142Nd、143Nd、144Nd、145Nd、146Nd、147Sm、148Nd、149Sm、150Nd、151Eu、152Sm、153Eu、154Sm、155Gd、156Gd、158Gd、159Tb、160Gd、161Dy、162Dy、163Dy、164Dy、165Ho、166Er、167Er、168Er、169Tm、170Er、171Yb、172Yb、173Yb、174Yb、175Lu和176Yb。金属同位素可以例如使用飞行时间质谱法(TOF-MS)(例如，Fluidigm Helios和Hyperion systems,fluidigm.com/systems；South San Francisco,CA)检测。
生物素-抗生物素蛋白(或生物素-链霉抗生物素蛋白)是熟知的信号放大系统，其基于以下事实：两个分子彼此具有特别高的亲和力并且一个抗生物素蛋白/链霉抗生物素蛋白分子可结合四个生物素分子。抗体被广泛用于免疫组织化学和ISH中的信号放大。酪酰胺信号放大(TSA)是基于因过氧化物酶活性导致大量半抗原化的酪酰胺分子沉积。酪胺是酚类化合物。在少量过氧化氢存在下，固定的辣根过氧化物酶(HRP)将标记的底物转化成短寿命、极具反应性的中间体。然后活化的底物分子在过氧化物酶结合位点处或附近与蛋白质的富电子部分如酪氨酸非常迅速地反应并共价结合。通过这种方式，可以在杂交位点原位引入许多与酪酰胺缀合的半抗原分子。随后，沉积的酪酰胺-半抗原分子可以直接或间接可视化。例如在美国公开2012/0100540中更详细地描述了这种检测系统。
本文所述的实施方案可利用酶使用适当的发色或荧光底物产生可检测信号。应理解，或者，标记探针可以具有直接与标记探针的核酸部分偶联的可检测标记。示例性可检测标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于发色或荧光标记(参见Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego(1996))。可用作标记的示例性荧光团包括但不限于罗丹明衍生物，例如四甲基罗丹明、罗丹明B、罗丹明6G、磺基罗丹明B、德克萨斯红(磺基罗丹明101)、罗丹明110及其衍生物，如四甲基罗丹明-5-(或6)、丽丝胺罗丹明B等；7-硝基苯-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)；荧光素及其衍生物；萘如丹磺酰(5-二甲基氨基萘-1-磺酰基)；香豆素衍生物，如7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)、7-二乙基氨基-3-[(4'-(碘乙酰基)氨基)苯基]-4-甲基香豆素(DCIA)、Alexa荧光染料(Molecular Probes)等；4,4-二氟-4-硼杂-3a,4a-二氮杂-s-引达省(BODIPYTM)及其衍生物(Molecular Probes；Eugene,OR)；芘和磺化芘，如Cascade BlueTM及其衍生物，包括8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸等；吡啶基恶唑衍生物和达巴氧基衍生物(Molecular Probes)；荧光黄(3,6-二磺酸-4-氨基-萘二酰亚胺)及其衍生物；CyDyeTM荧光染料(Amersham/GE Healthcare Life Sciences；Piscataway NJ)；ATTO 390、DyLight 395XL、ATTO 425、ATTO 465、ATTO 488、ATTO 490LS、ATTO 495、ATTO 514、ATTO 520、ATTO 532、ATTO Rho6G、ATTO 542、ATTO 550、ATTO 565、ATTO Rho3B、ATTO Rho11、ATTO Rho12、ATTO Thio12、ATTO Rho101、ATTO 590、ATTO 594、ATTO Rho13、ATTO 610、ATTO 620、ATTO Rho14、ATTO 633、ATTO 643、ATTO 647、ATTO 647N、ATTO 655、ATTO Oxa12、ATTO 665、ATTO 680、ATTO 700、ATTO 725、ATTO 740、Cyan 500NHS-酯(ATTO-TECH,Siegen,Germany)等。示例性发色团包括但不限于酚酞、孔雀石绿、硝基芳族化合物如硝基苯基、重氮染料、dabsyl(4-二甲基氨基偶氮苯-4'-磺酰基)等。
如本文所公开的，所述方法可利用多个靶核酸的并行检测。在使用荧光团作为标记的情况下，选择用于检测多个靶核酸的荧光团，使得每种荧光团是可区分的，并且在并行检测靶核酸的情况下可以在荧光显微镜中被并行地检测。选择此类荧光团以使发射光谱分离，使得可以并行检测靶核酸的不同标记。选择用于本发明方法的合适的可区分荧光团的方法是本领域熟知的(参见例如Johnson和Spence,“Molecular Probes Handbook,a Guideto Fluorescent Probes and Labeling Technologies,第11版,Life Technologies(2010))。
可以利用熟知的方法如显微镜法、细胞计数法(例如，质量细胞计数法、通过飞行时间的细胞计数法(CyTOF)、流式细胞术)或光谱法来可视化与相应靶核酸相关的发色、荧光或金属可检测信号。通常，如果在同一测定中使用不同的标记，则将发色底物或荧光底物，或发色或荧光标记，或稀土或金属同位素用于特定测定，使得可以使用单个类型的仪器来检测同一样品中的核酸靶。
如本文所公开的，标记探针可以设计成使得标记是任选地可切割的。如本文所用，可切割标记是指与标记探针连接或缀合的标记，使得此标记可以以从SGC中去除，例如，以便在后续轮次的靶核酸的标记和检测中使用相同的标记。通常，标记通过可切割的化学接头与标记探针缀合。将标记与标记探针缀合使得标记可切割的方法是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Hermanson,Bioconjugate Techniques,Academic Press,San Diego(1996)；Daniel等人,BioTechniques24(3):484-489(1998))。一种特定的寡核苷酸标记系统是FastTagTM系统(Daniel等人，同上，1998；Vector Laboratories，Burlinghame CA)。接头中可包含各种可切割部分，使得可从标记探针上切割标记。此类可切割部分包括可以化学、光化学或酶促切割的基团。可切割化学接头可包括可切割的化学部分，如可通过还原切割的二硫化物、可被高碘酸盐切割的乙二醇或二醇、可被连二亚硫酸盐切割的重氮键、可被羟胺切割的酯、可被碱切割的砜等(参见Hermanson，同上，1996)。一种特别有用的可切割接头是含有二硫键的接头，其可以通过还原二硫键来切割。在其他实施方案中，接头可以包括用于被酶切割的位点。例如，接头可以含有蛋白水解切割位点。通常，这样的切割位点用于序列特异性蛋白酶。此类蛋白酶包括但不限于人鼻病毒3C蛋白酶(切割位点LEVLFQ/GP)、肠激酶(切割位点DDDDK/)、因子Xa(切割位点IEGR/)、烟草蚀刻病毒蛋白酶(切割位点ENLYFQ/G)，以及凝血酶(切割位点LVPR/GS)(参见例如，Oxford Genetics,Oxford,UK)。另一个可切割部分可以是，例如，尿嘧啶-DNA(含有尿嘧啶的DNA)，它可以被尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG)切割(参见，例如，Sidorenko等人,FEBS Lett.582(3):410–404(2008))。
在一些实施方案中，本发明涉及使用可切割标记，使得与靶核酸结合的标记可以从靶核酸中去除。可以通过应用切割标记并将其从标记探针释放的剂如化学剂或光来去除可切割标记。如上所述，用于化学切割的有用切割剂包括但不限于还原剂、高碘酸盐、连二亚硫酸盐、羟胺、碱等(参见Hermanson，同上，1996)。一种用于切割含有二硫键的接头的有用方法是使用三(2-羧乙基)膦(TCEP)(参见Moffitt等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 113:11046-11051(2016))。在一个实施方案中，TCEP用作从标记探针上切割标记的剂。
在另一个实施方案中，不使用可切割标记，可以通过将连接到靶核酸的SGC暴露于高于标记探针-扩增子结合序列的Tm的温度下来选择性去除或洗掉与SGC结合的标记探针。通过选择合适的温度和条件以破坏标记探针与SGC中的扩增子之间的结合，选择性去除SGC的组分，如去除与SGC中的扩增子结合的标记探针的方法是本领域熟知的并在本文公开。在使用从SGC中选择性去除标记探针的情况下，SGC的组分被设计成使得除了标记探针-扩增子相互作用之外，SGC的其他组分的相互作用在破坏标记探针与扩增子的结合的条件下仍然稳定。与使用包含可切割标记的标记探针类似，应理解，在最终迭代轮次的检测中，标记探针与扩增子之间的解链温度不必低于靶探针、前置前置扩增子(如果使用)、前置扩增子与扩增之间的解链温度，因为无需进行进一步轮次的检测。因此，在最终迭代检轮次的测中，标记探针与扩增子之间的解链温度任选地低于靶探针、前置前置扩增子(如果使用)、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，使得标记探针和标记在最终迭代轮次的检测中仍然与SGC结合。
本文所述的发明通常涉及检测样品中的多个靶核酸。应理解，本发明的方法另外可用于检测样品中的多个靶核酸和任选的其他分子，特别是在与靶核酸相同的细胞中。例如，除了检测多个靶核酸外，细胞中表达的蛋白质也可使用本文所述用于检测靶核酸的类似原理并行地检测。在这种情况下，在多个靶核酸的一个或多个轮次的检测中，可以任选地检测细胞中表达的一种或多种蛋白质，例如，通过使用可检测的标记来检测蛋白质。如果在较早轮次的靶核酸检测中检测蛋白质，则可以使用可切割标记检测蛋白质，所述可切割标记类似于用于检测靶核酸的标记。如果在最后一个轮次的检测中检测蛋白质，则标记不需要是可切割的。细胞中蛋白质的检测是本领域技术人员熟知的，例如，通过使用熟知的检测系统(包括本文所述的用于检测靶核酸的那些)中的任一种检测蛋白质特异性抗体的结合。已经描述了在同一细胞中检测靶核酸和蛋白质(也参见Schulz等人,Cell Syst.6(1):25-36(2018))。
应理解，本发明可以以任何期望的顺序进行，只要检测到靶核酸即可。因此，在本发明的方法中，使细胞与用于SGC组装的任何组分接触的步骤可以以任何所需顺序进行，可以按顺序进行，或可以同时进行，或一些步骤可以按顺序进行，而其他步骤可以根据需要同时进行，只要检测到靶核酸即可。还应理解，本文公开的实施方案可以根据需要独立地与本文公开的其他实施方案组合，以便利用各种配置、组分大小、测定条件、测定敏感性等。
应理解，本发明可以以提供靶核酸检测的任何形式进行。尽管本文已经使用原位杂交一般性地描述了本发明的实施方式，但是应理解，如本领域所熟知的，本发明可以用于以其他形式检测靶核酸，特别是用于检测细胞中的靶核酸。可用于检测细胞中的靶核酸的一种方法是流式细胞术，如本领域熟知的(参见例如Shapiro,Practical Flow Cytometry第3版,Wiley-Liss,New York(1995)；Ormerod,Flow Cytometry,第2版,Springer(1999))。因此，本发明的方法、样品和试剂盒可用于原位杂交测定形式或其他形式，如流式细胞术。核酸检测方法(包括原位杂交)对流式细胞术的应用先前已有描述(参见例如Hanley等人,PLoS One,8(2):e57002.doi:10.1371/journal.pone.0057002(2013)；Baxter等人,NatureProtocols 12(10):2029-2049(2017))。
在一些情况下，可能需要减少测定步骤的数目，例如减少杂交和洗涤步骤的数目。减少测定步骤数目的一种方式是在与细胞接触之前预组装SGC的一些或全部组分。这种预组装可以通过在接触靶核酸之前将SGC的一些或全部组分杂交在一起来进行。
本发明还提供了包含酸试剂的试剂盒，如本文所公开的。酸试剂使得靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏，并保持细胞形态和核酸完整性。本发明试剂盒的组分可以任选地在容器中，并且可以任选地提供使用试剂盒的说明书。说明书可以描述例如用于进行本发明的方法的步骤，如本文所公开的。任选地，试剂盒可包含如本文所述的SGC的一个或多个组分，其中试剂盒不包括靶核酸。如本文所公开的，这样的试剂盒可以包含前置扩增子(PA)、扩增子(AMP)和标记探针(LP)，以及任选的前置前置扩增子(PPA)。任选地，试剂盒可包含针对特定靶核酸或多个靶核酸的靶探针(TP)。
在一个实施方案中，本发明提供了试剂盒，所述试剂盒包含一个或多个对一个或多个核酸靶具有特异性的探针，以及进行如本文公开的本发明方法的说明。
在一个实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含在用于破坏与细胞中的核酸结合的探针的结合的方法中使用的酸试剂，其中所述方法包括使细胞与酸试剂接触，其中细胞包含与细胞中第一靶核酸杂交的第一探针，其中酸试剂破坏第一探针与第一靶核酸之间的杂交。
在这种试剂盒的一个实施方案中，使细胞与酸试剂接触重复一次或多次。
在这种试剂盒的一个实施方案中，所述方法还包括从细胞中去除第一探针。在这种试剂盒的一个实施方案中，所述方法还包括使细胞与第二探针接触的步骤，其中第二探针与细胞中的第二靶核酸杂交，其中第二靶核酸与第一靶核酸相同或不同。在这种试剂盒的一个实施方案中，所述方法还包括使细胞与酸试剂接触的步骤，其中酸试剂破坏第二探针与第二靶核酸之间的杂交。在一个实施方案中，使细胞与酸试剂接触重复一次或多次。在这种试剂盒的一个实施方案中，所述方法还包括从细胞中去除第二探针的步骤。
在一个实施方案中，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含在用于破坏与细胞中的核酸结合的探针的结合的方法中使用的酸试剂，其中所述方法包括使细胞与酸试剂接触，其中细胞包含与细胞中一个或多个第一靶核酸杂交的一个或多个第一探针，其中酸试剂破坏一个或多个第一探针与一个或多个第一靶核酸之间的杂交。
在这种试剂盒的一个实施方案中，使细胞与酸试剂接触重复一次或多次。
在这种试剂盒的一个实施方案中，所述方法还包括从细胞中去除一个或多个第一探针。在这种试剂盒的一个实施方案中，细胞包含与两个或更多个第一靶核酸杂交的两个或更多个第一探针。在这种试剂盒的一个实施方案中，第一靶核酸中的每个通过与第一探针杂交而被标记，并且其中每个第一靶核酸上的标记与和第一探针杂交的其他第一靶核酸上的标记是可区分的。
在这种试剂盒的一个实施方案中，所述方法还包括使细胞与一个或多个第二探针接触的步骤，其中一个或多个第二探针与细胞中的一个或多个第二靶核酸杂交，其中一个或多个第二靶核酸与一个或多个第一靶核酸相同或不同。在一个实施方案中，细胞包含与两个或更多个第二靶核酸杂交的两个或更多个第二探针。
在这种试剂盒的一个实施方案中，第二靶核酸中的每个通过与第二探针杂交而被标记，并且其中每个第二靶核酸上的标记与和第二探针杂交的其他第二靶核酸上的标记是可区分的。在这种试剂盒的一个实施方案中，所述方法还包括使细胞与酸试剂接触的步骤，其中酸试剂破坏第二探针与一个或多个第二靶核酸之间的杂交。在一个实施方案中，使细胞与酸试剂接触重复一次或多次。在一个实施方案中，这种方法还包括从细胞中去除第二探针的步骤。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含(A)一组前置扩增子，其中前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子包含针对靶探针对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(B)一组扩增子，其中扩增子组包含多个扩增子，其中扩增子包含针对前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；(C)一组标记探针，其中标记探针组的标记探针各自包含标记和针对扩增子的结合位点；和(D)酸试剂，其中酸试剂使得靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏(参见例如，图2A和6A)。在一个实施方案中，试剂盒包含一组靶探针，其中靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对或多对靶探针。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含(A)一组前置前置扩增子，其中前置前置扩增子组包含一个或多个前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含针对一对或多对靶探针的结合位点；(B)一组前置扩增子，其中前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子包含针对前置前置扩增子的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(C)一组扩增子，其中扩增子组包含多个扩增子，其中扩增子包含针对前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；(D)一组标记探针，其中标记探针组的标记探针各自包含标记和针对扩增子的结合位点；和(E)酸试剂，其中酸试剂使得靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏(参见例如，图2A和6B)。在一个实施方案中，试剂盒包含一组靶探针，其中靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对或多对靶探针。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含(A)一组前置前置扩增子，其中前置前置扩增子组包含一对或多对前置前置扩增子，其中前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含针对一对靶探针中的一个靶探针的结合位点；(B)一组前置扩增子，其中前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子包含针对前置前置扩增子对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(C)一组扩增子，其中扩增子组包含多个扩增子，其中扩增子包含针对前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；(D)一组标记探针，其中标记探针组的标记探针各自包含标记和针对扩增子的结合位点；和(E)酸试剂，其中酸试剂使得靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏(参见例如，图2A和6C)。在一个实施方案中，试剂盒包含一组靶探针，其中靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对或多对靶探针。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含(A)一组前置扩增子，其中前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中多个前置扩增子包含对一个或多个靶探针组中的每个具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含针对靶探针组中的一组的靶探针对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(B)一组扩增子，其中扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含针对对靶探针组具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；(C)第一标记探针组，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组中的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记是可切割的，并且其中第一标记探针组可特异性标记第一靶核酸亚组；(D)第二标记探针组，其中第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第二标记探针亚组与第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记是可切割的，并且其中第二标记探针组可以特异性标记与第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；和(E)酸试剂，其中酸试剂使得靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏(参见例如图2B和6A)。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含第三标记探针组，其中第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第三标记探针亚组与第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记是可切割的，并且其中第三标记探针组可以特异性标记与第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含(A)一组前置前置扩增子，其中前置前置扩增子组包含多个前置前置扩增子，其中多个前置前置扩增子包含对一个或多个靶探针组中的每个具有特异性的前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含针对靶探针组中的一组的靶探针对的结合位点和针对前置扩增子的多个结合位点；(B)一组前置扩增子，其中前置扩增子组包含对每个前置前置扩增子具有特异性的多个前置扩增子亚组，其中每个前置扩增子亚组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子亚组的前置扩增子包含针对对靶探针组具有特异性的前置前置扩增子中的一个的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(C)一组扩增子，其中扩增子组包含对每个前置扩增子亚组具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含针对前置扩增子亚组中的一个亚组的前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；(D)第一标记探针组，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组中的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记是可切割的，并且其中第一标记探针组可特异性标记第一靶核酸亚组；(E)第二标记探针组，其中第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第二标记探针亚组与第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记是可切割的，并且其中第二标记探针组可以特异性标记与第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；(F)酸试剂，其中酸试剂使得靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏(参见例如图2B和6B)。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含第三标记探针组，其中第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第三标记探针亚组与第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记是可切割的，并且其中第三标记探针组可以特异性标记与第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含(A)一组前置前置扩增子，其中前置前置扩增子组包含多对前置前置扩增子，其中前置前置扩增子组包含对一个或多个靶探针组中的一对靶探针的每个靶探针具有特异性的一对前置前置扩增子，其中前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含针对靶探针组中的一对靶探针的一个靶探针的结合位点，并且其中前置前置扩增子包含针对前置扩增子的多个结合位点；(B)一组前置扩增子，其中前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中多个前置扩增子包含对每对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含针对前置前置扩增子组的前置前置扩增子对中的一对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(C)一组扩增子，其中扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性(其对每对前置前置扩增子具有特异性)的多个扩增子亚组，其中扩增子亚组的扩增子包含针对对一对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；(D)第一标记探针组，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组中的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记是可切割的，并且其中第一标记探针组可特异性标记第一靶核酸亚组；(E)第二标记探针组，其中第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第二标记探针亚组与第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记是可切割的，并且其中第二标记探针组可以特异性标记与第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；和(F)酸试剂，其中酸试剂使得靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏(参见图2B和6C)。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含第三标记探针组，其中第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第三标记探针亚组与第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记是可切割的，并且其中第三标记探针组可以特异性标记与第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
在一个实施方案中，包含可切割标记的本发明试剂盒包含从标记探针上切割可切割标记的切割剂。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含(A)一组前置扩增子，其中前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中多个前置扩增子包含对一个或多个靶探针组中的每个具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含针对靶探针组中的一组的靶探针对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(B)一组扩增子，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含针对对靶探针组具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；(C)第一标记探针组，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组中的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中第一标记探针组可特异性标记第一靶核酸亚组；(D)第二标记探针组，其中第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第二标记探针亚组与第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中第二标记探针组可以特异性标记与第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；和(E)酸试剂，其中酸试剂使得靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏(参见例如图。2B和6A)。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含第三标记探针组，其中第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中所述第三标记探针亚组与第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中第三标记探针组可以特异性标记与第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含(A)一组前置前置扩增子，其中前置前置扩增子组包含多对前置前置扩增子，其中前置前置扩增子组包含对一个或多个靶探针组中的一对靶探针的每个具有特异性的一对前置前置扩增子，其中前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含针对靶探针组中的一对靶探针的一个靶探针的结合位点，并且其中前置前置扩增子包含针对前置扩增子的多个结合位点；(B)一组前置扩增子，其中前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中多个前置扩增子包含对每对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含针对前置前置扩增子组的前置前置扩增子对中的一对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(C)一组扩增子，其中扩增子组包含对每个前置扩增子(其对每对前置前置扩增子具有特异性)具有特异性的多个扩增子亚组，其中扩增子亚组的扩增子包含针对对一对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子中的一个的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；(D)第一标记探针组，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组中的标记探针包含标记和用于扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中第一标记探针组可特异性标记第一靶核酸亚组；(E)第二标记探针组，其中第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第二标记探针亚组与第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记是可切割的，并且其中第二标记探针组可以特异性标记与第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；和(F)酸试剂，其中酸试剂使得靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏(参见例如图2B和6C)。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含第三标记探针组，其中第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中所述第三标记探针亚组与第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中第三标记探针组可以特异性标记与第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含(A)一组前置前置扩增子，其中前置前置扩增子组包含多个前置前置扩增子，其中多个前置前置扩增子包含对一个或多个靶探针组中的每个具有特异性的前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含针对靶探针组中的一组的靶探针对的结合位点和针对前置扩增子的多个结合位点；(B)一组前置扩增子，其中前置扩增子组包含对每个前置前置扩增子具有特异性的多个前置扩增子亚组，其中每个前置扩增子亚组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子亚组的前置扩增子包含针对对靶探针组具有特异性的前置前置扩增子中的一个的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；(C)一组扩增子，其中扩增子组包含对每个前置扩增子亚组具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的扩增子包含针对前置扩增子亚组中的一个亚组的前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；(D)第一标记探针组，其中第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组中的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的标记在第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中第一标记探针组可特异性标记第一靶核酸亚组；(E)第二标记探针组，其中第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中第二标记探针亚组与第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的标记在第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中第二标记探针组可以特异性标记与第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；和(F)酸试剂，其中酸试剂使得靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏(参见例如图2B和6B)。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含第三标记探针组，其中第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子具有特异性，其中所述第三标记探针亚组与第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个标记探针亚组的标记探针包含标记和针对扩增子亚组中的一个亚组的扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的标记在第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中标记探针与扩增子之间的解链温度低于靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中第三标记探针组可以特异性标记与第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
在本发明的试剂盒的一些实施方案中，所述试剂盒包含靶探针组，所述试剂盒包含一个或多个靶探针组，其中每个靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对靶探针。在一个实施方案中，每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性杂交的靶探针。
在本发明的试剂盒的一些实施方案中，所述试剂盒包含至少一种用于固定和/或透化细胞的试剂。
在本发明的试剂盒的一些实施方案中，酸试剂包含5％-40％或20％-30％或本文公开的其他浓度的酸。在一个实施方案中，酸选自由乙酸、甲酸、丙酸、丁酸、戊酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸组成的组。
在本发明的试剂盒的一些实施方案中，酸试剂包含盐。在一个实施方案中，酸试剂包含SSC。在一个实施方案中，酸试剂包含1X至13X SSC或3.2X至12.8X SSC。
本发明还提供了包含一个细胞或多个细胞的样品，其中酸试剂已被应用到细胞上并且存在于细胞上。细胞可任选地被固定。细胞可任选地被透化。将细胞固定和/或透化特别适用于原位杂交测定。任选地，细胞可以包含一个或多个结合如本文公开的探针配置中的任一种的靶核酸。
本发明另外提供了包含一个细胞或多个细胞的载玻片，其中酸试剂已被应用到并且存在于载玻片上的细胞上。任选地，将一个或多个细胞固定在载玻片上。任选地，将一个或多个细胞透化。在特定实施方案中，将载玻片上的细胞固定和/或透化用于原位测定。任选地，载玻片上的细胞可以包含一个或多个结合如本文公开的探针配置中的任一种的靶核酸。
应理解，在本文提供的本发明的定义内还提供了基本上不影响本发明的各种实施方案的活性的修改。因此，以下实施例旨在说明而非限制本发明。
实施例I
酸处理有效去除与靶核酸杂交的探针，并且对细胞RNA和组织形态的影响最小
此实施例描述了有效去除与细胞中的靶核酸杂交的探针并保持细胞RNA和组织形态。
图3A和3B显示了用于连续轮次的靶核酸检测的酸处理。图3A显示了酸处理有效去除新鲜冷冻小鼠脑中的靶探针和放大复合物。显示在制备为新鲜冷冻切片的小鼠脑中检测四种高表达的阳性对照基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)、磷酸甘油酸激酶1(Pgk1)、碱性螺旋-环-螺旋家族成员E22(Bhlhe22)和络合蛋白(complexin)2(Cplx2)。针对四种基因的靶探针(ZZ探针)一起进行杂交，并使用
Figure BDA0003741356720000781
HiPlex放大系统一起放大信号。在第一轮次的迭代检测中使用荧光标记的探针检测这四种基因，这些探针对应于分配给这四种靶探针的信号放大系统。Alexa 488、ATTO 550、ATTO 647N和Alexa 750荧光团分别用于检测Gapdh、Pgk1、Bhlhe22和Cplx2。用DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)将细胞核染成蓝色(上图)。信号检测后，将组织切片在室温(RT)下用酸溶液(20％乙酸，6.4X SSC)处理5分钟，并且再重复两次酸处理。然后将切片用于第二轮次的杂交和放大，无需添加靶探针。在酸处理后的第二轮次中几乎没有检测到信号(下图)，因此这表明完全去除了先前杂交的靶探针和信号放大组分。
图3B显示了酸处理对新鲜冷冻小鼠脑的细胞RNA和组织形态的影响最小。在制备为新鲜冷冻切片的小鼠脑中检测到四种阳性对照基因(Gapdh、Pgk1、Bhlhe22和Cplx2)，如图3A(上图)中所述。信号检测后，用酸溶液处理切片，如图3A所述，不同的是酸处理重复四次而不是两次。然后将处理过的切片用于第二轮次的杂交和放大以检测相同的四个基因。将第二轮次的杂交(下图)中检测到的信号与第一轮次的杂交(上图)中检测到的信号进行比较，两个轮次的靶探针杂交和信号放大产生了相似的表达模式，这表明酸处理的RNA损失最小。
这些结果表明，用酸试剂处理细胞对于去除与细胞中的靶核酸杂交的探针以及保持细胞RNA和组织形态是有效的。
实施例II
多个轮次的酸处理和连续轮次的探针杂交保持细胞形态和可检测的核酸
此实施例描述了可以对细胞应用多个轮次的酸处理以去除与靶核酸结合的探针，并且可以在酸处理后检测靶核酸。
实验基本上如图2B所示进行。如图2B所示，描绘了两个“轮次”，“K”和“L”，其中K是指N个靶探针杂交的连续轮次，并且L是指每K轮次内标记探针杂交的迭代轮次。在本实验中，进行3个连续轮次的靶探针杂交，并且在每个连续轮次内进行3个迭代轮次的标记探针杂交和成像。为了在本实验中证明，在每“K”轮次中使用12个靶探针：对于轮次K＝1，RNA聚合酶II亚基A(Polr2A)、肽基脯氨酰异构酶B(Ppib)、泛素C(Ubc)、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(Hprt1)、肌动蛋白β(ActB)、微管蛋白β3第III类(Tubb3)、桥接整合因子1(Bin1)、乳酸脱氢酶A(Ldha)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)、磷酸甘油酸激酶1(Pgk1)、碱性螺旋-环-螺旋家族成员E22(Bhlhe22)和络合蛋白2(Cplx2)；对于轮次K＝3，5-羟色胺受体7(Htr7)、原钙粘蛋白8(Pcdh8)、溶质载体家族32成员1(Slc32a1)、酪氨酸羟化酶(Th)、突触孔蛋白(Synpr)、晶状体蛋白钼(Crym)、沃尔夫拉明(wolframin)ER跨膜糖蛋白(Wfs1)、钙结合蛋白1(Calb1)、(Drd1a)、多巴胺受体D1(Drd2)、大麻素受体1(Cnr1)、叉头框P1(Foxp1)。
各组的12个靶探针各自在连续轮次1和3中进行杂交，并且在第二连续轮次中使用了12个“虚拟”靶探针或空白探针缓冲液。在靶探针杂交的连续轮次(K个轮次)之间进行酸处理步骤。在图4中，图像的上图对应在第一连续轮次(K＝1)内的第三迭代检测轮次(L＝3)。在图4中，下图图像来自在第三连续轮次(K＝3)的靶探针杂交内的第一轮次的迭代检测(L＝1)。
图4显示了两个轮次的酸处理和连续杂交后良好的形态和信号检测。在图4中，上图显示了第一轮次(K＝1)的靶探针杂交和第三轮次的迭代检测(L＝3)中，在新鲜冷冻小鼠脑切片中检测四个阳性对照基因Polr2A、Ppib、Ubc和Hprt1，基本上如在图2B中概述的工作流程所示进行。Alexa 488、ATTO 550、ATTO 647N和Alexa 750荧光团分别用于检测Polr2a、Ppib、Ubc和Hprt1，并用DAPI将细胞核染成蓝色。在图4中，下图显示了第三轮次(K＝3)的靶探针杂交和放大以及第一轮次的迭代检测(L＝1)中，在小鼠脑的纹状体区域中检测四种不同的低表达靶标Htr7、Pcdh8、Slc32a和Th。如图3A中所述，在第1轮次和第2轮次靶标杂交之后进行酸处理、靶标杂交和放大步骤。
这些结果表明，可以对细胞应用多个轮次的酸处理以去除与靶核酸结合的探针。结果还表明，在酸处理后可以检测到靶核酸。
实施例III
示例性酸处理试剂和条件
此实施例描述了测试各种酸处理试剂和条件的实验。
在探索优化的酸处理条件的一系列实验中，用
Figure BDA0003741356720000801
HiPlex方案(Advanced Cell Diagnostics；Newark CA)对新鲜冷冻小鼠脑或福尔马林固定石蜡包埋的HeLa细胞对于各种阳性对照基因进行染色。成像后，载玻片在各种条件下用乙酸处理，以去除结合的靶探针和信号产生复合物。酸处理后，在不添加任何靶探针的情况下进行
Figure BDA0003741356720000802
HiPlex信号放大步骤，以便检测来自前一轮次的残留结合靶探针的任何信号。对载玻片进行成像和可视化评估。结果示于表1。
表1.酸处理实验总结。
Figure BDA0003741356720000811
1“---”代表检测到最小信号；“--+”代表观察到微弱的信号。
2核糖体蛋白L5(RPL5)、β-2-微球蛋白(B2M)和肌动蛋白β(ACTB)。
这些结果表明，各种酸试剂可用于去除与细胞中的靶核酸结合的探针。
在整个申请中，引用了各种出版物。这些出版物的公开内容全部特此以引用的方式并入本申请，以便更全面地描述本发明所涉及的技术现状。尽管已参考以上提供的实施例描述本发明，但应理解在不脱离本发明精神的情况下可做出各种修改。

Claims (116)

1.一种用于破坏与细胞中的核酸结合的探针的结合的方法，所述方法包括使所述细胞与酸试剂接触，其中所述细胞包含与所述细胞中的第一靶核酸杂交的第一探针，其中所述酸试剂破坏所述第一探针与所述第一靶核酸之间的杂交。
2.如权利要求1所述的方法，其中使所述细胞与所述酸试剂接触重复一次或多次。
3.如权利要求1或2所述的方法，其还包括从所述细胞中去除所述第一探针。
4.如权利要求3所述的方法，其还包括使所述细胞与第二探针接触的步骤，其中所述第二探针与所述细胞中的第二靶核酸杂交，其中所述第二靶核酸与所述第一靶核酸相同或不同。
5.如权利要求4所述的方法，其还包括使所述细胞与所述酸试剂接触的步骤，其中所述酸试剂破坏所述第二探针与所述第二靶核酸之间的杂交。
6.如权利要求5所述的方法，其中使所述细胞与所述酸试剂接触重复一次或多次。
7.如权利要求5或6所述的方法，其还包括从所述细胞中去除所述第二探针的步骤。
8.一种用于破坏与细胞中的核酸结合的探针的结合的方法，所述方法包括使所述细胞与酸试剂接触，其中所述细胞包含与所述细胞中的一个或多个第一靶核酸杂交的一个或多个第一探针，其中所述酸试剂破坏所述一个或多个第一探针与所述一个或多个第一靶核酸之间的杂交。
9.如权利要求8所述的方法，其中使所述细胞与所述酸试剂接触重复一次或多次。
10.如权利要求8或9所述的方法，其还包括从所述细胞中去除所述一个或多个第一探针。
11.如权利要求8或9所述的方法，其中所述细胞包含与两个或更多个第一靶核酸杂交的两个或更多个第一探针。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述第一靶核酸中的每个通过与所述第一探针杂交而被标记，并且其中每个第一靶核酸上的标记与和所述第一探针杂交的其他第一靶核酸上的标记是可区分的。
13.如权利要求8至12中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞与一个或多个第二探针接触的步骤，其中所述一个或多个第二探针与所述细胞中的一个或多个第二靶核酸杂交，其中所述一个或多个第二靶核酸与所述一个或多个第一靶核酸相同或不同。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述细胞包含与两个或更多个第二靶核酸杂交的两个或更多个第二探针。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述第二靶核酸中的每个通过与所述第二探针杂交而被标记，并且其中每个第二靶核酸上的标记与和所述第二探针杂交的其他第二靶核酸上的标记是可区分的。
16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，其还包括使所述细胞与所述酸试剂接触的步骤，其中所述酸试剂破坏所述第二探针与所述一个或多个第二靶核酸之间的杂交。
17.如权利要求16所述的方法，其中使所述细胞与所述酸试剂接触重复一次或多次。
18.如权利要求16或17所述的方法，其还包括从所述细胞中去除所述第二探针的步骤。
19.一种用于细胞中多个靶核酸的多路复用检测的方法，所述方法包括：
(A)使含有包含多个靶核酸的细胞的样品与对一个或多个靶核酸具有特异性的一组探针接触，其中针对靶核酸的所述探针包括：
(a)一组靶探针，其中所述靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对或多对靶探针；
(b)一组前置扩增子，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含针对所述靶探针对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(c)一组扩增子，其中所述扩增子组包含多个扩增子，其中所述扩增子包含针对所述前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；和
(d)一组标记探针，其中所述标记探针组的所述标记探针各自包含标记和针对所述扩增子的结合位点；
(B)检测与相应靶核酸结合的可检测标记；和
(C)使所述样品与酸试剂接触，从而破坏与所述靶核酸结合的所述探针的结合。
20.一种用于细胞中多个靶核酸的多路复用检测的方法，所述方法包括：
(A)使含有包含多个靶核酸的细胞的样品与对一个或多个靶核酸具有特异性的一组探针接触，其中针对靶核酸的所述探针包括：
(a)一组靶探针，其中所述靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对或多对靶探针；
(b)一组前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含一个或多个前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含针对所述一对或多对靶探针的结合位点；
(c)一组前置扩增子，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含针对所述前置前置扩增子的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(d)一组扩增子，其中所述扩增子组包含多个扩增子，其中所述扩增子包含针对所述前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；和
(e)一组标记探针，其中所述标记探针组的所述标记探针各自包含标记和针对所述扩增子的结合位点；
(B)检测与相应靶核酸结合的可检测标记；和
(C)使所述样品与酸试剂接触，从而破坏与所述靶核酸结合的所述探针的结合。
21.一种用于细胞中多个靶核酸的多路复用检测的方法，所述方法包括：
(A)使含有包含多个靶核酸的细胞的样品与对一个或多个靶核酸具有特异性的一组探针接触，其中针对靶核酸的所述探针包括：
(a)一组靶探针，其中所述靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对或多对靶探针；
(b)一组前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含一对或多对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含针对所述靶探针对的一个所述靶探针的结合位点；
(c)一组前置扩增子，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含针对所述前置前置扩增子对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(d)一组扩增子，其中所述扩增子组包含多个扩增子，其中所述扩增子包含针对所述前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；和
(e)一组标记探针，其中所述标记探针组的所述标记探针各自包含标记和针对所述扩增子的结合位点；
(B)检测与相应靶核酸结合的可检测标记；和
(C)使所述样品与酸试剂接触，从而破坏与所述靶核酸结合的所述探针的结合。
22.如权利要求19至21中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述酸试剂接触重复一次或多次。
23.如权利要求19至22中任一项所述的方法，其还包括重复步骤(A)和(B)或重复步骤(A)、(B)和(C)一次或多次。
24.一种检测多个靶核酸的方法，所述方法包括：
(A)使含有包含多个核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对靶探针；
(B)使所述样品与一组前置扩增子接触，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含针对所述靶探针组中的一组的所述靶探针对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(C)使所述样品与一组扩增子接触，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的所述扩增子包含针对对靶探针组具有特异性的所述前置扩增子中的一个的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；
(D)使所述样品与第一标记探针组接触，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组中的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的所述标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记是可切割的，并且其中所述第一标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；
(E)检测与所述靶核酸结合的所述第一标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第一靶核酸亚组；
(F)从与所述第一靶核酸亚组结合的所述第一标记探针组上切割所述标记；
(G)使所述样品与第二标记探针组接触，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第二标记探针亚组与所述第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的所述标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记任选地是可切割的，并且其中所述第二标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；
(H)检测与所述靶核酸结合的所述第二标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第二靶核酸亚组，其中检测了多个靶核酸；和
(I)使所述样品与酸试剂接触，从而破坏与所述靶核酸结合的所述探针的结合。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述方法在步骤(I)之前包括：
(J)从与所述第二靶核酸组结合的所述第二标记探针组上切割所述标记；
(K)使所述样品与第三标记探针组接触，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第三标记探针亚组与所述第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的所述标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记是任选地可切割的，并且其中所述第三标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的与所述第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组；和
(L)检测与所述靶核酸结合的所述第三标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第三靶核酸亚组。
26.如权利要求25所述的方法，其包括重复步骤(J)至(L)一次或多次。
27.如权利要求24至26中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述酸试剂接触重复一次或多次。
28.如权利要求24至27中任一项所述的方法，其还包括重复步骤(A)至(I)或步骤(A)至(H)、(J)至(L)和(I)一次或多次。
29.如权利要求28所述的方法，其还包括重复步骤(A)至(H)或步骤(A)至(H)和(J)至(L)。
30.一种检测多个靶核酸的方法，所述方法包括：
(A)使含有包含多个核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对靶探针；
(B)使所述样品与一组前置前置扩增子接触，其中所述前置前置扩增子组包含多个前置前置扩增子，其中所述多个前置前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含针对所述靶探针组中的一组的所述靶探针对的结合位点和针对前置扩增子的多个结合位点；
(C)使所述样品与一组前置扩增子接触，其中所述前置扩增子组包含对每个前置前置扩增子具有特异性的多个前置扩增子亚组，其中每个前置扩增子亚组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子亚组的所述前置扩增子包含针对对靶探针组具有特异性的所述前置前置扩增子中的一个的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(D)使所述样品与一组扩增子接触，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子亚组具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的所述扩增子包含针对所述前置扩增子亚组中的一个亚组的所述前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；
(E)使所述样品与第一标记探针组接触，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组中的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的所述标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记是可切割的，并且其中所述第一标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；
(F)检测与所述靶核酸结合的所述第一标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第一靶核酸亚组；
(G)从与所述第一靶核酸亚组结合的所述第一标记探针组上切割所述标记；
(H)使所述样品与第二标记探针组接触，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第二标记探针亚组与所述第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的所述标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记任选地是可切割的，并且其中所述第二标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；
(I)检测与所述靶核酸结合的所述第二标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第二靶核酸亚组，其中检测了多个靶核酸；和
(J)使所述样品与酸试剂接触，从而破坏与所述靶核酸结合的所述探针的结合。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述方法在步骤(J)之前包括：
(K)从与所述第二靶核酸组结合的所述第二标记探针组上切割所述标记；
(L)使所述样品与第三标记探针组接触，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第三标记探针亚组与所述第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的所述标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记是任选地可切割的，并且其中所述第三标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的与所述第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组；和
(M)检测与所述靶核酸结合的所述第三标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第三靶核酸亚组。
32.如权利要求31所述的方法，其包括重复步骤(K)至(M)一次或多次。
33.如权利要求30至32中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述酸试剂接触重复一次或多次。
34.如权利要求30至33中任一项所述的方法，其还包括重复步骤(A)至(J)或步骤(A)至(I)、(K)至(M)和(J)一次或多次。
35.如权利要求34所述的方法，其还包括重复步骤(A)至(I)或步骤(A)至(I)和(K)至(M)。
36.一种检测多个核酸的方法，所述方法包括：
(A)使含有包含多个核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对靶探针；
(B)使所述样品与一组前置前置扩增子接触，其中所述前置前置扩增子组包含多对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含对所述靶探针组的每对靶探针具有特异性的一对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含针对靶探针组的所述靶探针对的一个所述靶探针的结合位点，并且其中所述前置前置扩增子包含针对前置扩增子的多个结合位点；
(C)使所述样品与一组前置扩增子接触，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含针对所述前置前置扩增子组的所述前置前置扩增子对中的一对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(D)使所述样品与一组扩增子接触，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，所述每个前置扩增子对每对前置前置扩增子具有特异性，其中扩增子亚组的所述扩增子包含针对对前置前置扩增子对具有特异性的所述前置扩增子中的一个的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；
(E)使所述样品与第一标记探针组接触，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组中的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的所述标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记是可切割的，并且其中所述第一标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；
(F)检测与所述靶核酸结合的所述第一标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第一靶核酸亚组；
(G)从与所述第一靶核酸亚组结合的所述第一标记探针组上切割所述标记；
(H)使所述样品与第二标记探针组接触，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第二标记探针亚组与所述第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的所述标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记任选地是可切割的，并且其中所述第二标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；
(I)检测与所述靶核酸结合的所述第二标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第二靶核酸亚组，其中检测了多个靶核酸；和
(J)使所述样品与酸试剂接触，从而破坏与所述靶核酸结合的所述探针的结合。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述方法在步骤(J)之前包括：
(K)从与所述第二靶核酸组结合的所述第二标记探针组上切割所述标记；
(L)使所述样品与第三标记探针组接触，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第三标记探针亚组与所述第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的所述标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记是任选地可切割的，并且其中所述第三标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的与所述第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组；和
(M)检测与所述靶核酸结合的所述第三标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第三靶核酸亚组。
38.如权利要求37所述的方法，其包括重复步骤(K)至(M)一次或多次。
39.如权利要求36至38中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述酸试剂接触重复一次或多次。
40.如权利要求36至39中任一项所述的方法，其还包括重复步骤(A)至(J)或步骤(A)至(I)、(K)至(M)和(J)一次或多次。
41.如权利要求40所述的方法，其还包括重复步骤(A)至(I)或步骤(A)至(I)和(K)至(M)。
42.一种检测多个靶核酸的方法，所述方法包括：
(A)使含有包含多个核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对靶探针；
(B)使所述样品与一组前置扩增子接触，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含针对所述靶探针组中的一组的所述靶探针对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(C)使所述样品与一组扩增子接触，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的所述扩增子包含针对对靶探针组具有特异性的所述前置扩增子中的一个的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；
(D)使所述样品与第一标记探针组接触，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组中的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的所述标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；
(E)检测与所述靶核酸结合的所述第一标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第一靶核酸亚组；
(F)在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度并低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品，从而从与所述第一靶核酸亚组结合的所述第一标记探针组上去除所述标记；
(G)使所述样品与第二标记探针组接触，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第二标记探针亚组与所述第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的所述标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且任选地其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第二标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；
(H)检测与所述靶核酸结合的所述第二标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第二靶核酸亚组，其中检测了多个靶核酸；和
(I)使所述样品与酸试剂接触，从而破坏与所述靶核酸结合的所述探针的结合。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述方法在步骤(I)之前包括：
(J)在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度并低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品，从而从与所述第二靶核酸组结合的所述第二标记探针组上去除所述标记；
(K)使所述样品与第三标记探针组接触，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第三标记探针亚组与所述第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的所述标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且任选地其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的与所述第一和第二靶核酸亚组不同第三靶核酸亚组；和
(L)检测与所述靶核酸结合的所述第三标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第三靶核酸亚组。
44.如权利要求43所述的方法，其包括重复步骤(J)至(L)一次或多次。
45.如权利要求42至44中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述酸试剂接触重复一次或多次。
46.如权利要求42至45中任一项所述的方法，其还包括重复步骤(A)至(I)或步骤(A)至(H)、(J)至(L)和(I)一次或多次。
47.如权利要求46所述的方法，其还包括重复步骤(A)至(H)或步骤(A)至(H)和(J)至(L)。
48.一种检测多个靶核酸的方法，所述方法包括：
(A)使含有包含多个核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对靶探针；
(B)使所述样品与一组前置前置扩增子接触，其中所述前置前置扩增子组包含多个前置前置扩增子，其中所述多个前置前置扩增子包含对每个靶探针组具有特异性的前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含针对所述靶探针组中的一组的所述靶探针对的结合位点和针对前置扩增子的多个结合位点；
(C)使所述样品与一组前置扩增子接触，其中所述前置扩增子组包含对每个前置前置扩增子具有特异性的多个前置扩增子亚组，其中每个前置扩增子亚组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子亚组的所述前置扩增子包含针对对靶探针组具有特异性的所述前置前置扩增子中的一个的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(D)使所述样品与一组扩增子接触，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子亚组具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的所述扩增子包含针对所述前置扩增子亚组中的一个亚组的所述前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；
(E)使所述样品与第一标记探针组接触，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组中的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的所述标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；
(F)检测与所述靶核酸结合的所述第一标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第一靶核酸亚组；
(G)在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度并低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品，从而从与所述第一靶核酸亚组结合的所述第一标记探针组上去除所述标记；
(H)使所述样品与第二标记探针组接触，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第二标记探针亚组与所述第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的所述标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且任选地其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第二标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；
(I)检测与所述靶核酸结合的所述第二标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第二靶核酸亚组，其中检测了多个靶核酸；和
(J)使所述样品与酸试剂接触，从而破坏与所述靶核酸结合的所述探针的结合。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述方法在步骤(J)之前包括：
(K)在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度并低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品，从而从与所述第二靶核酸组结合的所述第二标记探针组上去除所述标记；
(L)使所述样品与第三标记探针组接触，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第三标记探针亚组与所述第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的所述标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且任选地其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的与所述第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组；和
(M)检测与所述靶核酸结合的所述第三标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第三靶核酸亚组。
50.如权利要求49所述的方法，其包括重复步骤(K)至(M)一次或多次。
51.如权利要求48至50中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述酸试剂接触重复一次或多次。
52.如权利要求48至51中任一项所述的方法，其还包括重复步骤(A)至(J)或步骤(A)至(I)、(K)至(M)和(J)一次或多次。
53.如权利要求52所述的方法，其还包括重复步骤(A)至(I)或步骤(A)至(I)和(K)至(M)。
54.一种检测多个核酸的方法，所述方法包括：
(A)使含有包含多个核酸的细胞的样品与多个靶探针组接触，其中每个靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对靶探针；
(B)使所述样品与一组前置前置扩增子接触，其中所述前置前置扩增子组包含多对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含对所述靶探针组的每对靶探针具有特异性的一对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含针对靶探针组的所述靶探针对的一个所述靶探针的结合位点，并且其中所述前置前置扩增子包含针对前置扩增子的多个结合位点；
(C)使所述样品与一组前置扩增子接触，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含针对所述前置前置扩增子组的所述前置前置扩增子对中的一对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(D)使所述样品与一组扩增子接触，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，所述每个前置扩增子对每对前置前置扩增子具有特异性，其中扩增子亚组的所述扩增子包含针对对前置前置扩增子对具有特异性的所述前置扩增子中的一个的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；
(E)使所述样品与第一标记探针组接触，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组中的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的所述标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的第一靶核酸亚组；
(F)检测与所述靶核酸结合的所述第一标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第一靶核酸亚组；
(G)在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度并低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品，从而从与所述第一靶核酸亚组结合的所述第一标记探针组上去除所述标记；
(H)使所述样品与第二标记探针组接触，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第二标记探针亚组与所述第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的所述标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且任选地其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第二标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；
(I)检测与所述靶核酸结合的所述第二标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第二靶核酸亚组，其中检测了多个靶核酸；和
(J)使所述样品与酸试剂接触，从而破坏与所述靶核酸结合的所述探针的结合。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述方法在步骤(J)之前包括：
(K)在高于所述标记探针与扩增子之间的解链温度并低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度的温度下孵育所述样品，从而从与所述第二靶核酸组结合的所述第二标记探针组上去除所述标记；
(L)使所述样品与第三标记探针组接触，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第三标记探针亚组与所述第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的所述标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且任选地其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组特异性标记与所述多个靶探针组杂交的与所述第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组；和
(M)检测与所述靶核酸结合的所述第三标记探针组的所述标记探针，从而检测所述第三靶核酸亚组。
56.如权利要求55所述的方法，其包括重复步骤(K)至(M)一次或多次。
57.如权利要求54至56中任一项所述的方法，其中使所述细胞与所述酸试剂接触重复一次或多次。
58.如权利要求54至57中任一项所述的方法，其还包括重复步骤(A)至(J)或步骤(A)至(I)、(K)至(M)和(J)一次或多次。
59.如权利要求58所述的方法，其还包括重复步骤(A)至(I)或步骤(A)至(I)和(K)至(M)。
60.如权利要求24至59中任一项所述的方法，其中每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性杂交的靶探针。
61.如权利要求1至60中任一项所述的方法，其中所述酸试剂包含5％-40％或20％-30％的酸。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述酸选自由乙酸、甲酸、丙酸、丁酸、戊酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸组成的组。
63.如权利要求1至62中任一项所述的方法，其中所述酸试剂包含盐。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述酸试剂包含SSC。
65.如权利要求64所述的方法，其中所述酸试剂包含1X至13XSSC或3.2X至12.8X SSC。
66.如权利要求1至65中任一项所述的方法，其中所述靶核酸独立地为DNA或RNA。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述靶核酸是RNA时独立地选自由信使RNA(mRNA)、微小RNA(miRNA)、核糖体RNA(rRNA)、线粒体RNA和非编码RNA组成的组。
68.如权利要求1至67中任一项所述的方法，其中所述样品是组织标本或来源于组织标本。
69.如权利要求1至67中任一项所述的方法，其中所述样品是血液样品或来源于血液样品。
70.如权利要求1至67中任一项所述的方法，其中所述样品是细胞学样品或来源于细胞学样品。
71.一种试剂盒，所述试剂盒包含对一个或多个核酸靶具有特异性的一个或多个探针，以及进行如权利要求1至70中任一项所述的方法的说明。
72.一种试剂盒，所述试剂盒包含在用于破坏与细胞中的核酸结合的探针的结合的方法中使用的酸试剂，其中所述方法包括使所述细胞与所述酸试剂接触，其中所述细胞包含与所述细胞中的第一靶核酸杂交的第一探针，其中所述酸试剂破坏所述第一探针与所述第一靶核酸之间的杂交。
73.如权利要求72所述的试剂盒，其中使所述细胞与所述酸试剂接触重复一次或多次。
74.如权利要求72或73所述的试剂盒，其还包括从所述细胞中去除所述第一探针。
75.如权利要求74所述的试剂盒，其还包括使所述细胞与第二探针接触的步骤，其中所述第二探针与所述细胞中的第二靶核酸杂交，其中所述第二靶核酸与所述第一靶核酸相同或不同。
76.如权利要求75所述的试剂盒，其还包括使所述细胞与所述酸试剂接触的步骤，其中所述酸试剂破坏所述第二探针与所述第二靶核酸之间的杂交。
77.如权利要求76所述的试剂盒，其中使所述细胞与所述酸试剂接触重复一次或多次。
78.如权利要求76或77所述的试剂盒，其还包括从所述细胞中去除所述第二探针的步骤。
79.一种试剂盒，所述试剂盒包含在用于破坏与细胞中的核酸结合的探针的结合的方法中使用的酸试剂，其中所述方法包括使所述细胞与所述酸试剂接触，其中所述细胞包含与所述细胞中的一个或多个第一靶核酸杂交的一个或多个第一探针，其中所述酸试剂破坏所述一个或多个第一探针与所述一个或多个第一靶核酸之间的杂交。
80.如权利要求79所述的试剂盒，其中使所述细胞与所述酸试剂接触重复一次或多次。
81.如权利要求79或80所述的试剂盒，其还包括从所述细胞中去除所述一个或多个第一探针。
82.如权利要求79或80所述的试剂盒，其中所述细胞包含与两个或更多个第一靶核酸杂交的两个或更多个第一探针。
83.如权利要求82所述的试剂盒，其中所述第一靶核酸中的每个通过与所述第一探针杂交而被标记，并且其中每个第一靶核酸上的标记与和所述第一探针杂交的其他第一靶核酸上的标记是可区分的。
84.如权利要求79至83中任一项所述的试剂盒，其还包括使所述细胞与一个或多个第二探针接触的步骤，其中所述一个或多个第二探针与所述细胞中的一个或多个第二靶核酸杂交，其中所述一个或多个第二靶核酸与所述一个或多个第一靶核酸相同或不同。
85.如权利要求84所述的试剂盒，其中所述细胞包含与两个或更多个第二靶核酸杂交的两个或更多个第二探针。
86.如权利要求85所述的试剂盒，其中所述第二靶核酸中的每个通过与所述第二探针杂交而被标记，并且其中每个第二靶核酸上的标记与和所述第二探针杂交的其他第二靶核酸上的标记是可区分的。
87.如权利要求84至86中任一项所述的试剂盒，其还包括使所述细胞与所述酸试剂接触的步骤，其中所述酸试剂破坏所述第二探针与所述一个或多个第二靶核酸之间的杂交。
88.如权利要求87所述的试剂盒，其中使所述细胞与所述酸试剂接触重复一次或多次。
89.如权利要求87或88所述的试剂盒，其还包括从所述细胞中去除所述第二探针的步骤。
90.一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含：
(A)一组前置扩增子，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含针对靶探针对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(B)一组扩增子，其中所述扩增子组包含多个扩增子，其中所述扩增子包含针对所述前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；
(C)一组标记探针，其中所述标记探针组的所述标记探针各自包含标记和针对所述扩增子的结合位点；和
(D)酸试剂，其中所述酸试剂使得所述靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏。
91.如权利要求90所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含一组靶探针，其中所述靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对或多对靶探针。
92.一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含：
(A)一组前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含一个或多个前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含针对一对或多对靶探针的结合位点；
(B)一组前置扩增子，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含针对所述前置前置扩增子的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(C)一组扩增子，其中所述扩增子组包含多个扩增子，其中所述扩增子包含针对所述前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；
(D)一组标记探针，其中所述标记探针组的所述标记探针各自包含标记和针对所述扩增子的结合位点；和
(E)酸试剂，其中所述酸试剂使得所述靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏。
93.如权利要求92所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含一组靶探针，其中所述靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对或多对靶探针。
94.一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含：
(A)一组前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含一对或多对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含针对一对靶探针中的一个所述靶探针的结合位点；
(B)一组前置扩增子，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述前置扩增子包含针对所述前置前置扩增子对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(C)一组扩增子，其中所述扩增子组包含多个扩增子，其中所述扩增子包含针对所述前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；
(D)一组标记探针，其中所述标记探针组的所述标记探针各自包含标记和针对所述扩增子的结合位点；和
(E)酸试剂，其中所述酸试剂使得所述靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏。
95.如权利要求94所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含一组靶探针，其中所述靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对或多对靶探针。
96.一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含：
(A)一组前置扩增子，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对一个或多个靶探针组中的每个具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含针对所述靶探针组中的一组的靶探针对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(B)一组扩增子，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的所述扩增子包含针对对靶探针组具有特异性的所述前置扩增子中的一个的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；
(C)第一标记探针组，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组中的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的所述标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记是可切割的，并且其中所述第一标记探针组可特异性标记第一靶核酸亚组；
(D)第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第二标记探针亚组与所述第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的所述标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记是可切割的，并且其中所述第二标记探针组可特异性标记与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；和
(E)酸试剂，其中所述酸试剂使得所述靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏。
97.如权利要求96所述的试剂盒，其还包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第三标记探针亚组与所述第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的所述标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记是可切割的，并且其中所述第三标记探针组可特异性标记与所述第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
98.一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含：
(A)一组前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含多个前置前置扩增子，其中所述多个前置前置扩增子包含对一个或多个靶探针组中的每个具有特异性的前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含针对所述靶探针组中的一组的靶探针对的结合位点和针对前置扩增子的多个结合位点；
(B)一组前置扩增子，其中所述前置扩增子组包含对每个前置前置扩增子具有特异性的多个前置扩增子亚组，其中每个前置扩增子亚组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子亚组的所述前置扩增子包含针对对靶探针组具有特异性的所述前置前置扩增子中的一个的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(C)一组扩增子，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子亚组具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的所述扩增子包含针对所述前置扩增子亚组中的一个亚组的所述前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；
(D)第一标记探针组，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组中的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的所述标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记是可切割的，并且其中所述第一标记探针组可特异性标记第一靶核酸亚组；
(E)第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第二标记探针亚组与所述第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的所述标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记是可切割的，并且其中所述第二标记探针组可特异性标记与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；
(F)酸试剂，其中所述酸试剂使得所述靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏。
99.如权利要求98所述的试剂盒，其还包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第三标记探针亚组与所述第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的所述标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记是可切割的，并且其中所述第三标记探针组可特异性标记与所述第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
100.一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含：
(A)一组前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含多对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含对一个或多个靶探针组中的一对靶探针的每个靶探针具有特异性的一对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含针对靶探针组中的一对靶探针的一个靶探针的结合位点，并且其中所述前置前置扩增子包含针对前置扩增子的多个结合位点；
(B)一组前置扩增子，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含针对所述前置前置扩增子组的所述前置前置扩增子对中的一对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(C)一组扩增子，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，所述每个前置扩增子对每对前置前置扩增子具有特异性，其中扩增子亚组的所述扩增子包含针对对一对前置前置扩增子具有特异性的所述前置扩增子中的一个的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；
(D)第一标记探针组，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组中的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的所述标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记是可切割的，并且其中所述第一标记探针组可特异性标记第一靶核酸亚组；
(E)第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第二标记探针亚组与所述第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的所述标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记是可切割的，并且其中所述第二标记探针组可特异性标记与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；和
(F)酸试剂，其中所述酸试剂使得所述靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏。
101.如权利要求100所述的试剂盒，其还包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第三标记探针亚组与所述第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的所述标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记是可切割的，并且其中所述第三标记探针组可特异性标记与所述第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
102.如权利要求96至101中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含从所述标记探针上切割所述可切割标记的切割剂。
103.一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含：
(A)一组前置扩增子，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对一个或多个靶探针组中的每个具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含针对所述靶探针组中的一组的靶探针对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(B)一组扩增子，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的所述扩增子包含针对对靶探针组具有特异性的所述前置扩增子中的一个的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；
(C)第一标记探针组，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组中的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的所述标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组可特异性标记第一靶核酸亚组；
(D)第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第二标记探针亚组与所述第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的所述标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第二标记探针组可特异性标记与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；和
(E)酸试剂，其中所述酸试剂使得所述靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏。
104.如权利要求103所述的试剂盒，其还包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第三标记探针亚组与所述第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的所述标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组可特异性标记与所述第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
105.一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含：
(A)一组前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含多对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含对一个或多个靶探针组中的一对靶探针的每个具有特异性的一对前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子对的每个前置前置扩增子包含针对靶探针组中的一对靶探针的一个靶探针的结合位点，并且其中所述前置前置扩增子包含针对前置扩增子的多个结合位点；
(B)一组前置扩增子，其中所述前置扩增子组包含多个前置扩增子，其中所述多个前置扩增子包含对每对前置前置扩增子具有特异性的前置扩增子，其中每个前置扩增子包含针对所述前置前置扩增子组的所述前置前置扩增子对中的一对的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(C)一组扩增子，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子具有特异性的多个扩增子亚组，所述每个前置扩增子对每对前置前置扩增子具有特异性，其中扩增子亚组的所述扩增子包含针对对一对前置前置扩增子具有特异性的所述前置扩增子中的一个的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；
(D)第一标记探针组，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组中的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的所述标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组可特异性标记第一靶核酸亚组；
(E)第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第二标记探针亚组与所述第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的所述标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记是可切割的，并且其中所述第二标记探针组可特异性标记与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；和
(F)酸试剂，其中所述酸试剂使得所述靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏。
106.如权利要求105所述的试剂盒，其还包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第三标记探针亚组与所述第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的所述标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组可特异性标记与所述第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
107.一种用于靶核酸的原位检测的试剂盒，所述试剂盒包含：
(A)一组前置前置扩增子，其中所述前置前置扩增子组包含多个前置前置扩增子，其中所述多个前置前置扩增子包含对一个或多个靶探针组中的每个具有特异性的前置前置扩增子，其中每个前置前置扩增子包含针对所述靶探针组中的一组的靶探针对的结合位点和针对前置扩增子的多个结合位点；
(B)一组前置扩增子，其中所述前置扩增子组包含对每个前置前置扩增子具有特异性的多个前置扩增子亚组，其中每个前置扩增子亚组包含多个前置扩增子，其中前置扩增子亚组的所述前置扩增子包含针对对靶探针组具有特异性的所述前置前置扩增子中的一个的结合位点和针对扩增子的多个结合位点；
(C)一组扩增子，其中所述扩增子组包含对每个前置扩增子亚组具有特异性的多个扩增子亚组，其中每个扩增子亚组包含多个扩增子，其中扩增子亚组的所述扩增子包含针对所述前置扩增子亚组中的一个亚组的所述前置扩增子的结合位点和针对标记探针的多个结合位点；
(D)第一标记探针组，其中所述第一标记探针组包含多个第一标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组中的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第一标记探针亚组中的所述标记在所述第一标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第一标记探针组可特异性标记第一靶核酸亚组；
(E)第二标记探针组，其中所述第二标记探针组包含多个第二标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第二标记探针亚组与所述第一标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第二标记探针亚组中的所述标记在所述第二标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第二标记探针组可特异性标记与所述第一靶核酸亚组不同的第二靶核酸亚组；和
(F)酸试剂，其中所述酸试剂使得所述靶探针与相应靶核酸之间的杂交被破坏。
108.如权利要求107所述的试剂盒，其还包含第三标记探针组，其中所述第三标记探针组包含多个第三标记探针亚组，其中每个标记探针亚组对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子具有特异性，其中所述第三标记探针亚组与所述第一和第二标记探针亚组相比对不同扩增子亚组的扩增子具有特异性，其中每个标记探针亚组包含多个标记探针，其中每个所述标记探针亚组的所述标记探针包含标记和针对所述扩增子亚组中的一个亚组的所述扩增子的结合位点，其中每个第三标记探针亚组中的所述标记在所述第三标记探针亚组之间是可区分的，并且其中所述标记探针与所述扩增子之间的解链温度低于所述靶探针、前置前置扩增子、前置扩增子与扩增子之间的解链温度，并且其中所述第三标记探针组可特异性标记与所述第一和第二靶核酸亚组不同的第三靶核酸亚组。
109.如权利要求96至108中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含一个或多个靶探针组，其中每个靶探针组包含与靶核酸特异性杂交的一对靶探针。
110.如权利要求109所述的试剂盒，其中每个靶探针组包含两对或更多对与相同靶核酸特异性杂交的靶探针。
111.如权利要求96至110中任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于固定和/或透化细胞的至少一种试剂。
112.如权利要求71至111中任一项所述的试剂盒，其中所述酸试剂包含5％-40％或20％-30％的酸。
113.如权利要求112所述的试剂盒，其中所述酸选自由乙酸、甲酸、丙酸、丁酸、戊酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸和柠檬酸组成的组。
114.如权利要求71至113中任一项所述的试剂盒，其中所述酸试剂包含盐。
115.如权利要求114所述的试剂盒，其中所述酸试剂包含SSC。
116.如权利要求115所述的试剂盒，其中所述酸试剂包含1X至13X SSC或3.2X至12.8XSSC。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024124041A1 (en) * 2022-12-07 2024-06-13 Advanced Cell Diagnostics, Inc. Multiplexed detection of nucleic acid targets

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3042963A1 (en) * 2005-06-20 2016-07-13 Advanced Cell Diagnostics, Inc. Methods of detecting nucleic acids in individual cells and of identifying rare cells from large heterogeneous cell populations
US20130023433A1 (en) * 2009-09-28 2013-01-24 Yuling Luo Methods of detecting nucleic acid sequences with high specificity
WO2017196527A1 (en) * 2016-05-10 2017-11-16 Arizona Board Of Regents On Behalf Of Arizona State University Consecutive hybridization for multiplexed analysis of biological samples
US11352660B2 (en) * 2016-10-04 2022-06-07 Howard Hughes Medical Institute Materials and methods for serial multiplexed detection of RNA in cells and tissues
US20190276881A1 (en) * 2016-11-08 2019-09-12 President And Fellows Of Harvard College Multiplexed imaging using merfish, expansion microscopy, and related technologies
WO2020168162A1 (en) * 2019-02-15 2020-08-20 Bio-Techne Corporation Methods for multiplex detection of nucleic acids by in situ hybridization

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114555825A (zh) * 2019-02-15 2022-05-27 领先细胞医疗诊断有限公司 用于通过原位杂交进行核酸的多路复用检测的方法

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