JP2023502663A - 核酸を逐次検出するための方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、試料を酸試薬と接触させて、結合した核酸検出システムを除去し、それによって同じ検出システムを再び使用することを可能にし、異なる標的核酸を検出し、より高いレベルのマルチプレックスを提供することによる、複数の標的核酸のマルチプレックス検出方法に関する。本発明はまた、酸試薬、及び任意選択で標的核酸の検出のためのプローブを含むキットに関する。
Description
〔技術分野〕
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／９３８，１３８号の優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に完全に組み込まれる。
関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１１月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／９３８，１３８号の優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書に完全に組み込まれる。
〔背景技術〕
本発明は、概して、核酸の検出に関し、より具体的には、核酸のマルチプレックス検出に関する。
本発明は、概して、核酸の検出に関し、より具体的には、核酸のマルチプレックス検出に関する。
ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、特定のＲＮＡ配列、例えば、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）または組織切片などの細胞内のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を、細胞及び組織コンテキストを保持しながら測定及び局在化するために広く使用される分子生物学的技術である。したがって、ＲＮＡ ＩＳＨは、細胞及び組織内の遺伝子発現の時空間可視化ならびに定量化を提供する。それは、研究及び診断における幅広い応用を有する（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｒｋ．Ｒｅｓ．２（１）：１－１３，ｄｏｉ：１０．１１８６／２０５０－７７７１－２－３（２０１４）、Ｒａｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｅｕｓ ９（６）：ｅ１３２５．ｄｏｉ：１０．７７５９／ｃｕｒｅｕｓ．１３２５（２０１７）、Ｗｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２（２）：１０９－１１９ （２００２））。蛍光ＲＮＡ ＩＳＨは、それぞれ、ＲＮＡ標識及び検出のための蛍光色素及び蛍光顕微鏡を利用する。蛍光ＲＮＡ ＩＳＨは、典型的には、４～５個の標的配列の限定的なマルチプレックス化を提供する。限定的なマルチプレックス能力は、蛍光顕微鏡の光学系によって区別することができるスペクトル的に別個の蛍光色素の数が少ないことに大きく起因する。複雑な生物学的系を理解するための細胞及び組織マップの生成などの領域では、特にヒトの健康及び疾患において、より高いレベルのマルチプレックスが非常に望ましい。
ハイブリダイゼーション、イメージング、標識の除去、及び別個の標的への再ハイブリダイゼーションの連続ラウンドを利用するいくつかのアプローチが導入されており、理論的には、同じ細胞または組織切片内の４～５個の標的の複数のイメージングを提供する（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ９２（２）：３４２－３５７（２０１６）、Ｃｏｄｅｌｕｐｐｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５（１１）：９３２－９３５（２０１８）、Ｋｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６：５３３－５４４（２０１９））。しかしながら、実際には、前述の逐次的な蛍光ＩＳＨ（ＦＩＳＨ）法は、連続したラウンドのハイブリダイゼーション及び検出において、核酸検出感受性、特にＲＮＡ検出感受性、及び細胞形態の実質的な損失をもたらし得る。
酵素ＤＮＡｓｅ Ｉは、例えば、標的プローブの除去及びハイブリダイゼーション連鎖反応に基づくシグナル増幅システムに一般的に使用される（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，上記，２０１６）。しかしながら、ＤＮＡｓｅ Ｉ消化は、核アーキテクチャならびに細胞形態を損傷し、したがって、その後の画像レジストレーション及び分析ステップを妨げ得る。酵素エキソヌクレアーゼＩは、長いＤＮＡのコンカテマーに基づく増幅システムを剥離することも報告されている（Ｋｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，上記，２０１９）。しかしながら、この方法では、酵素活性を直接測定及び制御することはできず、手順は、比較的多量の酵素、より高い温度でのより長いインキュベーション時間、固定後及び広範な洗浄ステップを必要とする。
したがって、標的プローブの除去、及びＲＮＡ完全性などの細胞核酸の完全性にも最小限の影響を与えるシグナル増幅システムのため単純で、信頼性のある効果的な方法論、ならびにハイブリダイゼーションの複数回のラウンドを達成するため形態の必要性が存在する。本発明は、この必要性を満たし、関連する利点もまた提供する。
〔発明の概要〕
本発明は、細胞内の核酸に結合したプローブを除去する方法を提供し、方法は、細胞を酸試薬と接触させることであって、細胞は、細胞内の第１の標的核酸にハイブリダイゼーションした第１のプローブを含み、酸試薬は、第１のプローブと第１の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する、接触させることと、細胞から第１のプローブを除去することと、を含む。任意選択で、ステップは、細胞内の核酸のマルチプレックス検出の逐次的なラウンドを提供するために繰り返され得る。
本発明は、細胞内の核酸に結合したプローブを除去する方法を提供し、方法は、細胞を酸試薬と接触させることであって、細胞は、細胞内の第１の標的核酸にハイブリダイゼーションした第１のプローブを含み、酸試薬は、第１のプローブと第１の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する、接触させることと、細胞から第１のプローブを除去することと、を含む。任意選択で、ステップは、細胞内の核酸のマルチプレックス検出の逐次的なラウンドを提供するために繰り返され得る。
〔図面の簡単な説明〕
〔図１〕マルチプレックスアッセイ（ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＨｉＰｌｅｘア
ッセイワークフロー）のワークフローの概略図を示す。Ｎ標的配列を標的プローブ（ダブルＺプローブとして示される）にハイブリダイゼーションし、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）などの増幅システムにより同時にシグナルを増幅する。示される実施形態では、最初の４つの標的は、４つの非スペクトル重複蛍光色素共役オリゴ（標識プローブ）を介して検出され、従来の蛍光顕微鏡またはスキャナーを使用して画像化される。次いで、フルオロフォアを標識プローブから切断し、次の４つの標的を、同じ方法を使用して標識し、画像化する。それぞれ４つの標的のＬラウンドの検出後、画像レジストレーションソフトウェアアルゴリズムを使用して画像をレジストレーションし、単一細胞解像度で重ね合わせた画像の最終合成を作成する。
〔図２Ａ〕標的プローブを除去するための酸試薬を使用する核酸プローブの逐次的な
ハイブリダイゼーションの概略図を示す。逐次的なハイブリダイゼーションのための標的核酸（複数可）に結合したプローブ（複数可）の酸処理及び除去の概略図を示す。Ｎ標的プローブを、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイで、標的核酸にハイブリダイゼーションする。図式は、標的核酸にハイブリダイゼーションした標的プローブの任意のシグナル増幅を示す。細胞は、細胞の可視化を促進するために対比染色され得、例えば、核は、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色され得る。標的プローブ及び対比染色された細胞は、例えば、イメージングによって可視化され、それによって標的核酸を検出し、イメージングする。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）アッセイを使用する場合、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ダブルＺプローブ及びシグナルは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）増幅システムにより同時に増幅される。酸処理ステップを実行して、それぞれの標的（複数可）に結合した標的プローブ（複数可）を除去する。Ｎ標的核酸の１つ以上の追加のセットは、１回以上のラウンドのためにＮプレックスワークフロー全体を繰り返すことによって検出され得る。全ての標的が検出された後、画像レジストレーションソフトウェアアルゴリズムを使用して画像をレジストレーションし、単一細胞解像度で重ね合わせた画像の最終合成を作成する。この方法で利用可能なマルチプレックスの総レベルは、ラウンド当たりのＮ標的（複数可）×Ｎプレキシング（ｐｌｅｘｉｎｇ）のＫラウンドである。一般に、Ｎ＝１以上であり、酸除去ステップを含む場合、Ｋ＝２以上である。図２Ａに示される図式において、Ｋ＝１の場合、標的プローブのハイブリダイゼーション及びイメージングの１回のラウンドのみを行う必要があるため、酸除去ステップは必要とされない。
〔図２Ｂ〕標的プローブを除去するための酸試薬を使用する核酸プローブの逐次的な
ハイブリダイゼーションの概略図を示す。逐次的なハイブリダイゼーションのための標的核酸に結合したプローブの酸処理及び除去の概略図を示す。Ｎ標的プローブを、例えば、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＨｉＰｌｅｘアッセイなどのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイで、標的核酸にハイブリダイゼーションする。例えば、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ダブルＺプローブを使用して、Ｎ標的プローブを標的配列にハイブリダイゼーションし、例えば、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）増幅システムにより、同時にシグナルを増幅する。図式は、標的核酸にハイブリダイゼーションした標的プローブの任意のシグナル増幅を示す。細胞は、細胞の可視化を促進するために対比染色され得、例えば、核は、４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色され得る。Ｎ標的核酸は、標識、例えば、蛍光標識、イメージング、及び検出可能な標識の切断、例えば、蛍光標識の切断の反復的なラウンドにより検出される。図式において、Ｎ標的核酸をＮ標的プローブにハイブリダイゼーションし、反復して検出することにより、Ｎ標的のサブセット（Ｎ標的サブセット１）を標識して検出し、標識を標識された核酸のサブセットから切断し（Ｌラウンドの標識プローブハイブリダイゼーション、Ｌ＝１）、次いで、Ｎ標的の第２のサブセット（Ｎ標的サブセット２）を標識して検出し、標識を標識された核酸のサブセットから切断する（Ｌラウンドの標識プローブハイブリダイゼーション、Ｌ＝２）など、Ｎ標的核酸の全てが検出されるまで続く。全てのＮ標的核酸が所望の数の標識の数（Ｌ＝所望の標識ラウンド）で検出された後、ハイブリダイゼーションしたＮ標的プローブ（ＺＺプローブシグナル生成複合体など）を除去するために酸処理ステップを行う。Ｎ標的核酸（例えば、Ｎ’標的核酸、Ｎ’‘標的核酸など）の１つ以上の追加のセットは、１つ以上のラウンドのためにＮプレックスワークフロー全体を繰り返すことによって検出され得る。全ての標的が検出された後、画像レジストレーションソフトウェアアルゴリズムを使用して画像をレジストレーションし、単一細胞解像度で重ね合わせた画像の最終合成を作成する。この方法で利用可能なマルチプレックスの総レベルは、ラウンド当たりＮ標的核酸×Ｎ－プレキシングのＫラウンド（「Ｎ－プレキシング」は、「Ｎ標的プローブのハイブリダイゼーション」から「プローブ及び増幅剤の酸性除去」または最終ラウンドでは最後の「対比染色及びイメージング」ステップへのフローを指す）である。一般に、Ｎ＝１以上であり、酸除去ステップを含む場合、Ｋ＝２以上である。図２Ｂに示される図式において、Ｋ＝１の場合、Ｌラウンドの標識プローブハイブリダイゼーション、イメージング、及びフルオロフォア切断のみを行う必要があるため、プローブ及び増幅剤の酸除去ステップは必要とされない。
〔図３Ａ〕標的核酸の検出の逐次的なラウンドのための酸処理を示す。酸処理が、新
鮮な凍結マウスの脳における標的プローブ及び増幅複合体を効果的に除去したことを示す。新鮮な凍結切片として調製したマウスの脳におけるグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｄｈ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（Ｐｇｋ１）、塩基性ヘリックスループヘリックスファミリーメンバーＥ２２（Ｂｈｌｈｅ２２）、及びコンプレキシン２（Ｃｐｌｘ２）の４つの高度に発現された陽性対照遺伝子の検出を示す。４つの遺伝子の標的プローブ（ＺＺプローブ）を一緒にハイブリダイゼーションし、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＨｉＰｌｅｘ増幅システムを使用してシグナルを一緒に増幅した。４つの遺伝子を、これらの４つの標的プローブに割り当てられたシグナル増幅システムに対応する蛍光標識プローブを使用して、反復的な検出の１回目のラウンドで検出した。Ａｌｅｘａ ４８８、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、及びＡｌｅｘａ ７５０フルオロフォアを、それぞれ、Ｇａｐｄｈ、Ｐｇｋ１、Ｂｈｌｈｅ２２、及びＣｐｌｘ２を検出するために使用し、核を青色のＤＡＰＩ（４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドリン）で染色した（上部パネル）。シグナル検出後、組織切片を酸性溶液（２０％の酢酸、６．４倍のＳＳＣ）で５分間、室温（ＲＴ）で処理し、酸処理をさらに２回繰り返した。次いで、切片を、標的プローブを添加することなく、ハイブリダイゼーション及び増幅の２回目のラウンドに使用した。酸処理後の２回目のラウンドではシグナルはほとんどから全く検出されず（下部パネル）、したがって、以前ハイブリダイゼーションした標的プローブ及びシグナル増幅成分の完全な除去を示した。
〔図３Ｂ〕標的核酸の検出の逐次的なラウンドのための酸処理を示す。酸処理が新鮮
な凍結マウスの脳の細胞ＲＮＡ及び組織形態に最小限の影響を与えたことを示す。図３Ａ（上部パネル）に記載されるように、新鮮な凍結切片として調製されたマウスの脳において、４つの陽性対照遺伝子（Ｇａｐｄｈ、Ｐｇｋ１、Ｂｈｌｈｅ２２、及びＣｐｌｘ２）を検出した。シグナル検出後、酸処理を２回ではなく４回繰り返したことを除いて、切片を図３Ａに記載されるように酸溶液で処理した。次いで、処理した切片を、ハイブリダイゼーション及び増幅の２回目のラウンドに使用して、同じ４つの遺伝子を検出した。ハイブリダイゼーションの２回目のラウンド（下部パネル）で検出されたシグナルを、ハイブリダイゼーションの１回目のラウンド（上部パネル）で検出されたシグナルと比較すると、標的プローブのハイブリダイゼーション及びシグナル増幅の２回のラウンドは、同様の発現パターンをもたらし、繰り返された酸処理からのＲＮＡの最小限の損失を示す。
〔図４〕２回のラウンドの酸処理及び逐次的なハイブリダイゼーション後の良好な形
態及びシグナル検出を示す。図４において、上部パネルは、図２Ｂに概説されるワークフローに示されるように実質的に行った、標的プローブのハイブリダイゼーションの１回目のラウンド（ｋ＝１）及び反復的な検出の３回目のラウンド（ｌ＝３）での、新鮮な凍結マウスの脳切片における、４つの陽性対照遺伝子である、ＲＮＡポリメラーゼＩＩサブユニットＡ（Ｐｏｌｒ２Ａ）、ペプチジルプロリルイソメラーゼＢ（Ｐｐｉｂ）、ユビキチンＣ（Ｕｂｃ）、及びヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（Ｈｐｒｔ１）の検出を示す。１２個の標的プローブ（ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＨｉＰｌｅｘ １２プレックスマウス陽性対照）を、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）Ｈｉｐｌｅｘアッセイを使用して同時にハイブリダイゼーションし、増幅した。Ａｌｅｘａ ４８８、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、及びＡｌｅｘａ ７５０フルオロフォアを用いて１回目のラウンドで４つの遺伝子を検出し、フルオロフォアをイメージング後に切断した。次の４つの遺伝子を、同じ４つのフルオロフォアを使用して検出の２回目のラウンドで検出し、イメージング後にフルオロフォアを切断した。反復的な検出の３回目のラウンドを図４の上部パネルに示す。Ａｌｅｘａ ４８８、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、及びＡｌｅｘａ ７５０フルオロフォアを、それぞれ、Ｐｏｌｒ２ａ、Ｐｐｉｂ、Ｕｂｃ、及びＨｐｒｔ１を検出するために使用し、核を青色のＤＡＰＩで染色した。図４において、下部パネルは、標的プローブのハイブリダイゼーション及び増幅の３回目のラウンド（ｋ＝３）ならびに反復的な検出の１回目のラウンド（ｌ＝１）での、マウスの脳の線条体領域における、４つの異なる低発現標的である、５－ヒドロキシトリプタミン受容体７（Ｈｔｒ７）、プロトカドヘリン８（Ｐｃｄｈ８）、溶質担体ファミリー３２メンバー１（Ｓｌｃ３２ａ１）、及びチロシンヒドロキシラーゼ（Ｔｈ）の検出を示す。酸処理、標的ハイブリダイゼーション及び増幅ステップを、図３Ａに記載されるように、ラウンド１及びラウンド２の標的ハイブリダイゼーション後に行った。標的プローブのハイブリダイゼーション及び増幅の２回目のラウンドを酸処理後に実施した。標的プローブを含まず、代わりにプローブ希釈剤を使用した。標的プローブのハイブリダイゼーション及び増幅の３回目のラウンドを、１２個の異なる標的プローブを使用して、２回目の酸処理後に実施した。１２個の標的プローブのうちの４個を、下部パネルに示されるように、検出の１回目のラウンドで最初に検出した。
〔図５〕A～Cは、シグナル生成複合体（ＳＧＣ）を用いた核酸標的の前述の検出方法
の概略図を示す。ＰＰＡ、前－前増幅剤（ｐｒｅ－ｐｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）；ＰＡ、前増幅剤；ＡＭＰ、増幅剤；ＬＰ、標識プローブ。
〔図６Ａ〕標的核酸の直交標識の概略図を示す。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）アッ
セイに基づく標的核酸の直交標識が図６Ａに示される。それぞれのシグナル生成複合体（ＳＧＣ）を用いた３つの例示的な標的核酸の標識が図６Ａに示される。標的プローブ対１（ＴＰ１ａ及びＴＰ１ｂ）の標的核酸１への結合を示す。前増幅剤（ＰＡ１）が、標的プローブ対（ＴＰ１ａ及びＴＰ１ｂ）に結合していることが示される。複数の増幅剤（ＡＭＰ１）がＰＡ１に結合していることが示される。増幅剤に結合した複数の標識プローブ（ＬＰ１）を示す。それぞれの標的の各々に特異的なＳＧＣの構成成分（標的プローブ、前増幅剤、増幅剤、標識プローブ）を有する標的２及び３についての同様の構成を示す。
〔図６Ｂ〕標的核酸の直交標識の概略図を示す。図６Ａに示される構成の修正を示す
。それぞれのシグナル生成複合体（ＳＧＣ）を用いた２つの例示的な標的核酸の標識が図６Ｂに示される。標的プローブ対１（ＴＰ１ａ及びＴＰ１ｂ）の標的核酸１への結合を示す。前－前増幅剤（ＰＰＡ１）が、標的プローブ対（ＴＰ１ａ及びＴＰ１ｂ）に結合していることが示される。複数の前増幅剤（ＰＡ１）がＰＰＡ１に結合していることが示される。複数の増幅剤（ＡＭＰ１）がＰＡ１に結合していることが示される。簡単にするために、増幅剤が１つの前増幅剤に結合しているように示されているが、増幅剤は全ての増幅剤に結合され得ることを理解されたい。増幅剤に結合した複数の標識プローブ（ＬＰ１）を示す。それぞれの標的の各々に特異的なＳＧＣの構成成分（標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、増幅剤、標識プローブ）を有する標的２についての同様の構成を示す。
〔図６Ｃ〕標的核酸の直交標識の概略図を示す。Ｂａｓｅｓｃｏｐｅ（商標）アッセ
イに基づく標的核酸の直交標識が図６Ｃに示される。それぞれのシグナル生成複合体（ＳＧＣ）を用いた２つの例示的な標的核酸の標識が図６Ｃに示される。標的プローブ対１（ＴＰ１ａ及びＴＰ１ｂ）の標的核酸１への結合を示す。前－前増幅剤（ＰＰＡ１ａ及びＰＰＡ１ｂ）の対が、それぞれの標的プローブ対（ＴＰ１ａ及びＴＰ１ｂ）に結合していることが示される。前増幅剤（ＰＡ１）が、前増幅剤対（ＰＰＡ１ａ及びＰＰＡ１ｂ）に結合していることが示される。複数の増幅剤（ＡＭＰ１）がＰＡ１に結合していることが示される。簡単にするために、増幅剤が１つの前増幅剤に結合しているように示されているが、増幅剤は全ての増幅剤に結合され得ることを理解されたい。増幅剤に結合した複数の標識プローブ（ＬＰ１）を示す。それぞれの標的の各々に特異的なＳＧＣの構成成分（標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、増幅剤、標識プローブ）を有する標的２についての同様の構成を示す。
〔図１〕マルチプレックスアッセイ（ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＨｉＰｌｅｘア
ッセイワークフロー）のワークフローの概略図を示す。Ｎ標的配列を標的プローブ（ダブルＺプローブとして示される）にハイブリダイゼーションし、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）などの増幅システムにより同時にシグナルを増幅する。示される実施形態では、最初の４つの標的は、４つの非スペクトル重複蛍光色素共役オリゴ（標識プローブ）を介して検出され、従来の蛍光顕微鏡またはスキャナーを使用して画像化される。次いで、フルオロフォアを標識プローブから切断し、次の４つの標的を、同じ方法を使用して標識し、画像化する。それぞれ４つの標的のＬラウンドの検出後、画像レジストレーションソフトウェアアルゴリズムを使用して画像をレジストレーションし、単一細胞解像度で重ね合わせた画像の最終合成を作成する。
〔図２Ａ〕標的プローブを除去するための酸試薬を使用する核酸プローブの逐次的な
ハイブリダイゼーションの概略図を示す。逐次的なハイブリダイゼーションのための標的核酸（複数可）に結合したプローブ（複数可）の酸処理及び除去の概略図を示す。Ｎ標的プローブを、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイで、標的核酸にハイブリダイゼーションする。図式は、標的核酸にハイブリダイゼーションした標的プローブの任意のシグナル増幅を示す。細胞は、細胞の可視化を促進するために対比染色され得、例えば、核は、４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色され得る。標的プローブ及び対比染色された細胞は、例えば、イメージングによって可視化され、それによって標的核酸を検出し、イメージングする。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）アッセイを使用する場合、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ダブルＺプローブ及びシグナルは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）増幅システムにより同時に増幅される。酸処理ステップを実行して、それぞれの標的（複数可）に結合した標的プローブ（複数可）を除去する。Ｎ標的核酸の１つ以上の追加のセットは、１回以上のラウンドのためにＮプレックスワークフロー全体を繰り返すことによって検出され得る。全ての標的が検出された後、画像レジストレーションソフトウェアアルゴリズムを使用して画像をレジストレーションし、単一細胞解像度で重ね合わせた画像の最終合成を作成する。この方法で利用可能なマルチプレックスの総レベルは、ラウンド当たりのＮ標的（複数可）×Ｎプレキシング（ｐｌｅｘｉｎｇ）のＫラウンドである。一般に、Ｎ＝１以上であり、酸除去ステップを含む場合、Ｋ＝２以上である。図２Ａに示される図式において、Ｋ＝１の場合、標的プローブのハイブリダイゼーション及びイメージングの１回のラウンドのみを行う必要があるため、酸除去ステップは必要とされない。
〔図２Ｂ〕標的プローブを除去するための酸試薬を使用する核酸プローブの逐次的な
ハイブリダイゼーションの概略図を示す。逐次的なハイブリダイゼーションのための標的核酸に結合したプローブの酸処理及び除去の概略図を示す。Ｎ標的プローブを、例えば、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＨｉＰｌｅｘアッセイなどのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイで、標的核酸にハイブリダイゼーションする。例えば、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ダブルＺプローブを使用して、Ｎ標的プローブを標的配列にハイブリダイゼーションし、例えば、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）増幅システムにより、同時にシグナルを増幅する。図式は、標的核酸にハイブリダイゼーションした標的プローブの任意のシグナル増幅を示す。細胞は、細胞の可視化を促進するために対比染色され得、例えば、核は、４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色され得る。Ｎ標的核酸は、標識、例えば、蛍光標識、イメージング、及び検出可能な標識の切断、例えば、蛍光標識の切断の反復的なラウンドにより検出される。図式において、Ｎ標的核酸をＮ標的プローブにハイブリダイゼーションし、反復して検出することにより、Ｎ標的のサブセット（Ｎ標的サブセット１）を標識して検出し、標識を標識された核酸のサブセットから切断し（Ｌラウンドの標識プローブハイブリダイゼーション、Ｌ＝１）、次いで、Ｎ標的の第２のサブセット（Ｎ標的サブセット２）を標識して検出し、標識を標識された核酸のサブセットから切断する（Ｌラウンドの標識プローブハイブリダイゼーション、Ｌ＝２）など、Ｎ標的核酸の全てが検出されるまで続く。全てのＮ標的核酸が所望の数の標識の数（Ｌ＝所望の標識ラウンド）で検出された後、ハイブリダイゼーションしたＮ標的プローブ（ＺＺプローブシグナル生成複合体など）を除去するために酸処理ステップを行う。Ｎ標的核酸（例えば、Ｎ’標的核酸、Ｎ’‘標的核酸など）の１つ以上の追加のセットは、１つ以上のラウンドのためにＮプレックスワークフロー全体を繰り返すことによって検出され得る。全ての標的が検出された後、画像レジストレーションソフトウェアアルゴリズムを使用して画像をレジストレーションし、単一細胞解像度で重ね合わせた画像の最終合成を作成する。この方法で利用可能なマルチプレックスの総レベルは、ラウンド当たりＮ標的核酸×Ｎ－プレキシングのＫラウンド（「Ｎ－プレキシング」は、「Ｎ標的プローブのハイブリダイゼーション」から「プローブ及び増幅剤の酸性除去」または最終ラウンドでは最後の「対比染色及びイメージング」ステップへのフローを指す）である。一般に、Ｎ＝１以上であり、酸除去ステップを含む場合、Ｋ＝２以上である。図２Ｂに示される図式において、Ｋ＝１の場合、Ｌラウンドの標識プローブハイブリダイゼーション、イメージング、及びフルオロフォア切断のみを行う必要があるため、プローブ及び増幅剤の酸除去ステップは必要とされない。
〔図３Ａ〕標的核酸の検出の逐次的なラウンドのための酸処理を示す。酸処理が、新
鮮な凍結マウスの脳における標的プローブ及び増幅複合体を効果的に除去したことを示す。新鮮な凍結切片として調製したマウスの脳におけるグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｄｈ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（Ｐｇｋ１）、塩基性ヘリックスループヘリックスファミリーメンバーＥ２２（Ｂｈｌｈｅ２２）、及びコンプレキシン２（Ｃｐｌｘ２）の４つの高度に発現された陽性対照遺伝子の検出を示す。４つの遺伝子の標的プローブ（ＺＺプローブ）を一緒にハイブリダイゼーションし、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＨｉＰｌｅｘ増幅システムを使用してシグナルを一緒に増幅した。４つの遺伝子を、これらの４つの標的プローブに割り当てられたシグナル増幅システムに対応する蛍光標識プローブを使用して、反復的な検出の１回目のラウンドで検出した。Ａｌｅｘａ ４８８、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、及びＡｌｅｘａ ７５０フルオロフォアを、それぞれ、Ｇａｐｄｈ、Ｐｇｋ１、Ｂｈｌｈｅ２２、及びＣｐｌｘ２を検出するために使用し、核を青色のＤＡＰＩ（４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドリン）で染色した（上部パネル）。シグナル検出後、組織切片を酸性溶液（２０％の酢酸、６．４倍のＳＳＣ）で５分間、室温（ＲＴ）で処理し、酸処理をさらに２回繰り返した。次いで、切片を、標的プローブを添加することなく、ハイブリダイゼーション及び増幅の２回目のラウンドに使用した。酸処理後の２回目のラウンドではシグナルはほとんどから全く検出されず（下部パネル）、したがって、以前ハイブリダイゼーションした標的プローブ及びシグナル増幅成分の完全な除去を示した。
〔図３Ｂ〕標的核酸の検出の逐次的なラウンドのための酸処理を示す。酸処理が新鮮
な凍結マウスの脳の細胞ＲＮＡ及び組織形態に最小限の影響を与えたことを示す。図３Ａ（上部パネル）に記載されるように、新鮮な凍結切片として調製されたマウスの脳において、４つの陽性対照遺伝子（Ｇａｐｄｈ、Ｐｇｋ１、Ｂｈｌｈｅ２２、及びＣｐｌｘ２）を検出した。シグナル検出後、酸処理を２回ではなく４回繰り返したことを除いて、切片を図３Ａに記載されるように酸溶液で処理した。次いで、処理した切片を、ハイブリダイゼーション及び増幅の２回目のラウンドに使用して、同じ４つの遺伝子を検出した。ハイブリダイゼーションの２回目のラウンド（下部パネル）で検出されたシグナルを、ハイブリダイゼーションの１回目のラウンド（上部パネル）で検出されたシグナルと比較すると、標的プローブのハイブリダイゼーション及びシグナル増幅の２回のラウンドは、同様の発現パターンをもたらし、繰り返された酸処理からのＲＮＡの最小限の損失を示す。
〔図４〕２回のラウンドの酸処理及び逐次的なハイブリダイゼーション後の良好な形
態及びシグナル検出を示す。図４において、上部パネルは、図２Ｂに概説されるワークフローに示されるように実質的に行った、標的プローブのハイブリダイゼーションの１回目のラウンド（ｋ＝１）及び反復的な検出の３回目のラウンド（ｌ＝３）での、新鮮な凍結マウスの脳切片における、４つの陽性対照遺伝子である、ＲＮＡポリメラーゼＩＩサブユニットＡ（Ｐｏｌｒ２Ａ）、ペプチジルプロリルイソメラーゼＢ（Ｐｐｉｂ）、ユビキチンＣ（Ｕｂｃ）、及びヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（Ｈｐｒｔ１）の検出を示す。１２個の標的プローブ（ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＨｉＰｌｅｘ １２プレックスマウス陽性対照）を、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）Ｈｉｐｌｅｘアッセイを使用して同時にハイブリダイゼーションし、増幅した。Ａｌｅｘａ ４８８、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、及びＡｌｅｘａ ７５０フルオロフォアを用いて１回目のラウンドで４つの遺伝子を検出し、フルオロフォアをイメージング後に切断した。次の４つの遺伝子を、同じ４つのフルオロフォアを使用して検出の２回目のラウンドで検出し、イメージング後にフルオロフォアを切断した。反復的な検出の３回目のラウンドを図４の上部パネルに示す。Ａｌｅｘａ ４８８、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、及びＡｌｅｘａ ７５０フルオロフォアを、それぞれ、Ｐｏｌｒ２ａ、Ｐｐｉｂ、Ｕｂｃ、及びＨｐｒｔ１を検出するために使用し、核を青色のＤＡＰＩで染色した。図４において、下部パネルは、標的プローブのハイブリダイゼーション及び増幅の３回目のラウンド（ｋ＝３）ならびに反復的な検出の１回目のラウンド（ｌ＝１）での、マウスの脳の線条体領域における、４つの異なる低発現標的である、５－ヒドロキシトリプタミン受容体７（Ｈｔｒ７）、プロトカドヘリン８（Ｐｃｄｈ８）、溶質担体ファミリー３２メンバー１（Ｓｌｃ３２ａ１）、及びチロシンヒドロキシラーゼ（Ｔｈ）の検出を示す。酸処理、標的ハイブリダイゼーション及び増幅ステップを、図３Ａに記載されるように、ラウンド１及びラウンド２の標的ハイブリダイゼーション後に行った。標的プローブのハイブリダイゼーション及び増幅の２回目のラウンドを酸処理後に実施した。標的プローブを含まず、代わりにプローブ希釈剤を使用した。標的プローブのハイブリダイゼーション及び増幅の３回目のラウンドを、１２個の異なる標的プローブを使用して、２回目の酸処理後に実施した。１２個の標的プローブのうちの４個を、下部パネルに示されるように、検出の１回目のラウンドで最初に検出した。
〔図５〕A～Cは、シグナル生成複合体（ＳＧＣ）を用いた核酸標的の前述の検出方法
の概略図を示す。ＰＰＡ、前－前増幅剤（ｐｒｅ－ｐｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）；ＰＡ、前増幅剤；ＡＭＰ、増幅剤；ＬＰ、標識プローブ。
〔図６Ａ〕標的核酸の直交標識の概略図を示す。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）アッ
セイに基づく標的核酸の直交標識が図６Ａに示される。それぞれのシグナル生成複合体（ＳＧＣ）を用いた３つの例示的な標的核酸の標識が図６Ａに示される。標的プローブ対１（ＴＰ１ａ及びＴＰ１ｂ）の標的核酸１への結合を示す。前増幅剤（ＰＡ１）が、標的プローブ対（ＴＰ１ａ及びＴＰ１ｂ）に結合していることが示される。複数の増幅剤（ＡＭＰ１）がＰＡ１に結合していることが示される。増幅剤に結合した複数の標識プローブ（ＬＰ１）を示す。それぞれの標的の各々に特異的なＳＧＣの構成成分（標的プローブ、前増幅剤、増幅剤、標識プローブ）を有する標的２及び３についての同様の構成を示す。
〔図６Ｂ〕標的核酸の直交標識の概略図を示す。図６Ａに示される構成の修正を示す
。それぞれのシグナル生成複合体（ＳＧＣ）を用いた２つの例示的な標的核酸の標識が図６Ｂに示される。標的プローブ対１（ＴＰ１ａ及びＴＰ１ｂ）の標的核酸１への結合を示す。前－前増幅剤（ＰＰＡ１）が、標的プローブ対（ＴＰ１ａ及びＴＰ１ｂ）に結合していることが示される。複数の前増幅剤（ＰＡ１）がＰＰＡ１に結合していることが示される。複数の増幅剤（ＡＭＰ１）がＰＡ１に結合していることが示される。簡単にするために、増幅剤が１つの前増幅剤に結合しているように示されているが、増幅剤は全ての増幅剤に結合され得ることを理解されたい。増幅剤に結合した複数の標識プローブ（ＬＰ１）を示す。それぞれの標的の各々に特異的なＳＧＣの構成成分（標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、増幅剤、標識プローブ）を有する標的２についての同様の構成を示す。
〔図６Ｃ〕標的核酸の直交標識の概略図を示す。Ｂａｓｅｓｃｏｐｅ（商標）アッセ
イに基づく標的核酸の直交標識が図６Ｃに示される。それぞれのシグナル生成複合体（ＳＧＣ）を用いた２つの例示的な標的核酸の標識が図６Ｃに示される。標的プローブ対１（ＴＰ１ａ及びＴＰ１ｂ）の標的核酸１への結合を示す。前－前増幅剤（ＰＰＡ１ａ及びＰＰＡ１ｂ）の対が、それぞれの標的プローブ対（ＴＰ１ａ及びＴＰ１ｂ）に結合していることが示される。前増幅剤（ＰＡ１）が、前増幅剤対（ＰＰＡ１ａ及びＰＰＡ１ｂ）に結合していることが示される。複数の増幅剤（ＡＭＰ１）がＰＡ１に結合していることが示される。簡単にするために、増幅剤が１つの前増幅剤に結合しているように示されているが、増幅剤は全ての増幅剤に結合され得ることを理解されたい。増幅剤に結合した複数の標識プローブ（ＬＰ１）を示す。それぞれの標的の各々に特異的なＳＧＣの構成成分（標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、増幅剤、標識プローブ）を有する標的２についての同様の構成を示す。
〔発明を実施するための形態〕
本発明は、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる核酸の逐次的なマルチプレックス分析のための方法に関する。本発明の方法は、同じ試料内及び同じ細胞内の複数の標的核酸の検出を可能にする。
本発明は、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによる核酸の逐次的なマルチプレックス分析のための方法に関する。本発明の方法は、同じ試料内及び同じ細胞内の複数の標的核酸の検出を可能にする。
細胞核酸または細胞形態にほとんど影響を与えないオリゴヌクレオチドプローブ及び分岐鎖ＤＮＡ様シグナル増幅システムを迅速かつ効果的に除去することができる化学的方法が本明細書に記載される。これは、概して室温で、その間にほとんどまたは全く洗浄ステップなしで短時間に細胞または組織試料に適用される酸含有溶液を使用することによって達成される。本発明の方法は、より高いレベルのマルチプレックスを用いて核酸検出を行うことを可能にし、試料内及びさらには同じ細胞内の前述の核酸検出アッセイよりも多くの核酸の検出を達成する。
核酸検出の１つの方法は、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）と呼ばれるＲＮＡ ＩＳＨ技術を利用し、これは、「ダブルＺ」またはＺＺプローブと時に称される特別に設計されたオリゴヌクレオチドプローブを、分岐鎖ＤＮＡ様シグナル増幅システムと組み合わせて使用して、標準的な明視野顕微鏡下で、単分子感受性で１キロ塩基と同じくらい小さなＲＮＡを確実に検出する（Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１７（１０）：２２０１－２２０８（２０１６）、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．１４（１）：２２－２９（２０１２））。このようなプローブの設計は、各対の両方のプローブがそれらの意図された標的に結合する場合にのみ、シグナル増幅が生じ得るため、シグナル増幅の特異性を大幅に改善させる。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）技術は、蛍光検出を使用して最大４個または５個のＲＮＡ標的を同時に区別することができる。
最近記載された別の核酸検出方法（２０１９年２月１５日に出願された米国仮出願第６２／８０６，５７４号を参照されたい）は、Ｉ（Ｉ＝２、３、４、．．．）標的の繰り返し蛍光標識のＬ（Ｌ＝１、２、３、．．．）ラウンドを使用し、続いて、フルオロフォア切断として、図１に示される、標識のイメージング及び切断を使用する。反復的な検出方法は、単一ラウンドのハイブリダイゼーション及び増幅ステップからのＬｘＩの別個の標的配列（Ｎ）の同時可視化を提供する。図１の「Ｎ」は、検出される標的の総数を示し、上記の「Ｉ」は、Ｌラウンドの各々の反復当たりの標的の総数を示す。一般に、標識の各反復ラウンドにおける標的の数（Ｉ）は、本明細書に開示されるように、単一のラウンドにおいて明確に標識され、検出され得る最大数で、２個以上、３個以上、４個以上などである。所望である場合、単一の標的核酸（Ｉ＝１）をラウンドで検出することができる。いくつかの実施形態では、Ｉの標的の数は、各ラウンドで異なり得る。例えば、Ｉが、各それぞれのラウンドで４、４、及び１である３回のラウンドの検出では、合計９個の標的が検出される。したがって、標的の数はＮ＝ｓｕｍ（ｉ１、ｉ２、ｉ３．．．ｉＬ）であり、ｉ１、ｉ２、ｉ３は、各反復ラウンドで検出された標的の数であり、同一であっても異なっていてもよく、Ｌはラウンドの総数である。各ラウンドで数値「ｉ」が同一である場合、Ｎ＝ＬｘＩとなる。
反復的な検出ステップを実行する能力を提供するために、蛍光色素などの標識は、切断可能であり、例えば、化学的に切断可能であり、１回目のラウンドと同じ標識を使用してその後のラウンドの検出を可能にする。ラウンド内では、従来の蛍光顕微鏡法を用いて分光分離され得る蛍光色素コンジュゲートが使用される。次いで、蛍光色素を切断する。１つの例示的な切断剤は、還元剤トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）である。蛍光色素などの検出可能な標識の切断後、その後の標的検出のラウンド及びイメージングが実施される。アッセイ戦略は、前のラウンドからの標識プローブを剥離する（残りの標的と関連付けられた既存のシグナル増幅複合体を破壊し得る）必要性を排除し、また、最大化された検出のために組織及びＲＮＡの完全性を保持する。
ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）プローブと同様に、各標的プローブは、標的核酸内の特定の配列に結合する標的結合セグメント（標的結合部位）を含む。プローブはまた、本明細書に記載されるように、シグナル増幅分子に結合する「テール」配列を含む。２つのプローブは、標的核酸配列における隣接部位に対として結合する。両方のプローブがそれぞれの標的部位に結合する場合にのみ、シグナル増幅分子の完全な結合部位（例えば、図６Ａの前増幅剤または図６Ｂ及び６Ｃの前－前増幅剤）を形成し、シグナル増幅及び検出に成功することができる。同じラウンドで検出された異なる標的配列のプローブは、対応する直交増幅分子の独立した別個の結合配列を有するように設計される。そのような配列は、プローブのハイブリダイゼーション及び複数の標的のシグナル増幅を並行して達成するために、適切なアルゴリズムを使用して容易に設計することができる。標的は、各ラウンド内でスペクトル的に別個の、フルオロフォアなどの検出可能な標識を使用して、複数ラウンドで検出される。
この検出戦略は、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）と呼ばれるＲＮＡ ＩＳＨ技術に適合させた。結果は、単一細胞解像度で複数の標的核酸配列の特異的かつ増幅された検出を同時に提供するＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＨｉＰｌｅｘと称されるアッセイである。これは、全ての標的配列の同時標的ハイブリダイゼーション及び増幅、続いて連続したラウンドにおける概して３～５個の核酸標的の反復的な検出によって達成される。このアッセイで検出され得る標的配列の数は、使用される直交ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）シグナル増幅システムの数によって制限される。
検出システム、例えば、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）シグナル増幅システム、及び共通のスペクトルプロファイルを有する蛍光色素を使用して、単一細胞解像度で、反復様式での２つ以上の標的核酸配列の特異的な検出を提供するアッセイ及び検出戦略が本明細書に記載される。追加の直交ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）シグナル増幅システムを必要とせずにマルチプレックスレベルを増加させる１つの方法は、全ての標的が検出され、イメージングされた後に、標的プローブ及びそれらの関連するシグナル増幅システムを完全に除去することである。次いで、同じ検出システムを、その後の標的プローブのハイブリダイゼーション及びシグナル増幅のラウンドのために再び使用することができる。
本発明は、細胞における核酸配列の高感度かつ特異的な検出を可能にする方法に関する。本発明の方法は、研究及び診断における多数の実用的な用途を有する（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｒｋ．Ｒｅｓ．２（１）：１－１３，ｄｏｉ：１０．１１８６／２０５０－７７７１－２－３（２０１４）、Ｒａｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｅｕｓ ９（６）：ｅ１３２５．ｄｏｉ：１０．７７５９／ｃｕｒｅｕｓ．１３２５（２０１７）、Ｗｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．２（２）：１０９－１１９（２００２））。本発明の方法は、例えば、神経系及び腫瘍微小環境などの高度に複合体化された組織における空間的組織のマッピング、既知の細胞型及び新しい細胞型の識別、細胞状態の識別、疾患細胞及び組織における改変された遺伝子発現の検出、特定の細胞型における改変された遺伝子発現の局在化、腫瘍不均一性の分析、がん診断及び予後または他の疾患状態のためのバイオマーカーの検出、コンパニオン診断のためのバイオマーカーの検出、ならびに病原体（例えば、細菌、ウイルス、真菌、微生物寄生虫）の検出及び識別のために使用することができる。
本発明は、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）技術のコアにおけるプローブ設計原理及び分岐鎖ＤＮＡ様シグナル増幅（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，上記，２０１２）を、同じ細胞及び／または組織切片内の複数の核酸標的（反復様式で検出される１つを超える標的核酸）の高感度かつ特異的な配列検出に拡張する。同じ反復アッセイ設計戦略を、短い配列を検出するために適用され得る、Ｂａｓｅｓｃｏｐｅ（商標）シグナル増幅システムとともに使用することができる（Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８（１）：１９９８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１７－０２２９５－５（２０１７））。方法は、複数の標的のＤＮＡ検出にも適用することができる。本発明の方法はまた、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４５（１２），ｐｉｉ：ｄｅｖ１６５７５３，ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．１６５７５３（２０１８））などの当該技術分野で既知の他のシグナル増幅方法にも適用することができる。最新バージョンのＨＣＲ（ＨＣＲ ｖ３．０）は、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，上記，２０１８）と同様の対合したプローブ設計を用いる。本発明の方法が適用され得る他のシグナル増幅システムには、これらに限定されないが、ローリングサークル増幅（Ｌａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７（５）：３９５－３９７（２０１０））、ｃｌａｍｐＦＩＳＨ（Ｒｏｕｈａｎｉｆａｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＲｘｉｖ，２２２７９４（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２２２７９４）（２０１８））、及びＳＡＢＥＲ（Ｋｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，上記，２０１９）が含まれる。
本発明の方法を使用して、単一細胞及び／または組織切片における複数の遺伝子標的を標識することができる。これは、組織微小環境の空間的状況における多数のバイオマーカーを蛍光検出するために、蛍光に基づく検出ならびにイメージングマスサイトメトリー（Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ．６（１）：２５－３６（２０１８））の両方とともに使用することができる。方法は、研究及び診断用途で使用することができる。
酸処理を使用する本発明の方法は、様々な標的プローブ、及び使用される場合任意選択で増幅システムを除去し、マルチプレックスのレベルを増加させるためのハイブリダイゼーションの逐次的なラウンドを提供するために普遍的に使用され得る。本発明の方法は、ハイブリダイゼーション連鎖反応（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，上記，２０１８）、ローリングサークル増幅（Ｌａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，上記，２０１０）、ｃｌａｍｐＦＩＳＨ（Ｒｏｕｈａｎｉｆａｒｄ ｅｔ ａｌ．，上記，２０１８）、及びＳＡＢＥＲ（Ｋｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，上記，２０１９）などのオリゴヌクレオチドに基づくシグナル増幅方法に適用可能である。
本発明の方法は、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＨｉＰｌｅｘアッセイと組み合わせて使用して、単一細胞／組織切片において検出される遺伝子標的の数をさらに増加させることができる。本発明の方法は、既存のプローブ及び増幅剤を除去するために逐次的なハイブリダイゼーションを必要とする任意の他のＤＮＡオリゴヌクレオチドに基づくＩＳＨ検出とともに使用することもできる。方法は、例えば、組織微小環境の空間的状況における多数のバイオマーカーを蛍光検出するために使用することができる。
一実施形態では、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＨｉＰｌｅｘアッセイは、標的プローブのハイブリダイゼーション及びシグナル増幅のＫラウンド、ならびに各イメージングラウンドごとにＩのスペクトル的に別個のフルオロフォアを用いる反復的な検出を使用して、１つ以上のセットのＮ（例えば、１２）標的を検出するために使用される（図２Ｂを参照されたい）。図２Ｂに示される実施形態では、Ｋ逐次的ラウンド（外側ループ）は、Ｎ標的の１つ以上のセットを検出するために使用され、Ｌ反復ラウンド（内側ループ）は、各ＫラウンドにおけるＮ標的のサブセットを検出するために使用される。最初のＮ標的を検出した後、酢酸などの酸及び塩の混合物を含む酸溶液を使用して、標的プローブ及びシグナル増幅システムを組織／細胞から除去する。酸処理は、信頼性が高く、速く、非常に効果的であり、細胞ＲＮＡ及び組織形態を最小限に損傷する（実施例Ｉならびに図３Ａ及び３Ｂを参照されたい）。次いで、酸処理された組織試料は、例えば、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＨｉＰｌｅｘアッセイを使用して、標的プローブの新しいセットで標識される準備ができている。このプロセスをＫ回繰り返して、同じ細胞または組織内のＮの合計×Ｋ標的を検出することができる。実施例ＩＩ及び図４に示されるように、新鮮な凍結マウスの脳組織の酸処理後の逐次的なラウンドで２セットの標的を検出した。
図１、５、及び６において、標的プローブは、例えば、米国特許第７，７０９，１９８号、米国公開２００８／００３８７２５及び２００９／００８１６８８、ならびにＷＯ２００７／００１９８６及びＷＯ２００７／００２００６に記載されているように、「Ｚ」構成で示されている。図１、５、及び６に示されるＺ構成は、標的プローブの前増幅剤（図５Ａ及び６Ａ）または前－前増幅剤（図５Ｂ、５Ｃ、６Ｂ、及び６Ｃ）結合部位に対する標的結合部位５’を有する。そのような構成は、図１、５、及び６に示されるように、単なる例示であり、配向は逆であってもよく、すなわち、標的結合部位は、前増幅剤または前－前増幅剤結合部位に対して３’であり得ることを理解されたい。標的プローブ対は独立して、いずれかの配向にあり得ること、すなわち、標的プローブ対の１つのメンバーは、前増幅剤または前－前増幅剤結合部位に対する標的結合部位５’または３’を有することができ、前増幅剤または前－前増幅剤に対する結合部位５’または３’を有する第２のプローブと対合することができることを理解されたい。
本明細書で使用される場合、「標識プローブ」という用語は、標的分子に直接または間接的に、一般に間接的に結合し、標的を検出することを可能にする実体を指す。標識プローブ（または「ＬＰ」）は、典型的には、検出可能なシグナルを直接または間接的に提供する１つ以上の標識を含む、一本鎖ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである、核酸結合部分を含む。標識は、ポリヌクレオチドに共有結合され得るか、またはポリヌクレオチドは、標識に結合するように構成され得る。例えば、ビオチン化ポリヌクレオチドは、ストレプトアビジン関連標識に結合し得る。標識プローブは、例えば、標的核酸に直接ハイブリダイゼーションすることができる。一般に、標識プローブは、順に標的核酸にハイブリダイゼーションされる核酸、または標的核酸にハイブリダイズされる１つ以上の他の核酸にハイブリダイゼーションすることができる。したがって、標識プローブは、標的核酸のポリヌクレオチド配列、特に一部に相補的であるポリヌクレオチド配列を含むことができる。あるいは、標識プローブは、本明細書に記載されるような、増幅剤、前増幅剤、前－前増幅剤、シグナル生成複合体（ＳＧＣ）などにおけるポリヌクレオチド配列に相補的である少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含むことができる。一般に、本発明の実施形態では、標識プローブは、増幅剤に結合する。本明細書で使用される場合、酵素標識を含む標識プローブは、オリゴヌクレオチドなどの核酸結合部分と、核酸結合部分に結合される酵素とを含む標識プローブを指す。本明細書に開示されるように、核酸結合部分への酵素の結合は、共有結合であり得るか、またはビオチン／アビジンもしくは他の同様の高親和性結合分子などの高親和性結合相互作用を介するものであり得る。
本明細書で使用される場合、「標的プローブ」は、標的核酸にハイブリダイゼーションし、かつ標識プローブまたはシグナル生成複合体（ＳＧＣ）構成成分、例えば、増幅剤、前増幅剤、または前－前増幅剤を、その標的核酸に捕捉または結合することができるポリヌクレオチドである。標的プローブは、標的プローブに直接ハイブリダイゼーションすることができるか、またはそれは順に標識プローブにハイブリダイゼーションする１つ以上の核酸にハイブリダイゼーションすることができ、例えば、標的プローブは、ＳＧＣ内の増幅剤、前増幅剤、または前－前増幅剤にハイブリダイゼーションすることができる。したがって、標的プローブは、標的核酸のポリヌクレオチド配列に相補的である第１のポリヌクレオチド配列、及び標識プローブ、増幅剤、前増幅剤、前－前増幅剤などのポリヌクレオチド配列に相補的である第２のポリヌクレオチド配列を含む。一般に、本発明の実施形態では、標的プローブは、図５Ａ及び６Ａのように前増幅剤に結合するか、または図５Ｂ、５Ｃ、６Ｂ、及び６Ｃのように前－前増幅剤に結合する。相補配列が、対応する標的核酸、標識プローブ、増幅剤、前増幅剤、または前－前増幅剤とハイブリダイゼーションするのに利用可能となるように、標的プローブは、一般に一本鎖である。本発明の実施形態では、標的プローブは、対として提供される。
本明細書で使用される場合、「増幅剤」は、複数の標識プローブにハイブリダイゼーションすることができる分子、典型的にはポリヌクレオチドである。典型的には、増幅剤は、複数の同一の標識プローブにハイブリダイゼーションする。増幅剤はまた、標的核酸に、標的プローブ対の少なくとも１つの標的プローブに、標的プローブ対の両方の標的プローブに、または増幅剤、前増幅剤、もしくは前－前増幅剤などの標的プローブに結合した核酸にハイブリダイゼーションすることもできる。例えば、増幅剤は、少なくとも１つの標的プローブに、及び複数の標識プローブに、または前増幅剤及び複数の標識プローブにハイブリダイゼーションすることができる。一般に、本発明の実施形態では、増幅剤は、前増幅剤にハイブリダイゼーションすることができる。増幅剤は、例えば、直鎖状、フォーク状、櫛状、または分岐状核酸であり得る。全てのポリヌクレオチドについて本明細書に記載されるように、増幅剤は、修飾ヌクレオチド及び／または非標準的なヌクレオチド間結合、ならびに標準的なデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／またはホスホジエステル結合を含み得る。好適な増幅剤は、例えば、米国特許第５，６３５，３５２号、第５，１２４，２４６号、第５，７１０，２６４号、第５，８４９，４８１号、及び第７，７０９，１９８号、ならびに米国公開２００８／００３８７２５及び２００９／００８１６８８に記載されており、これらの各々は参照により組み込まれる。一般に、本発明の実施形態では、増幅剤は、前増幅剤及び標識プローブに結合する（図５及び６を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「前増幅剤」は、１つ以上の標的プローブと１つ以上の増幅剤との間の中間結合成分として機能する分子、典型的にはポリヌクレオチドである。典型的には、前増幅剤は、１つ以上の標的プローブ及び複数の増幅剤に同時にハイブリダイズする。例示的な前増幅剤は、例えば、米国特許第５，６３５，３５２号、第５，６８１，６９７号、及び第７，７０９，１９８号、ならびに米国公開２００８／００３８７２５、２００９／００８１６８８、及び２０１７／０１０１６７２に記載されており、これらの各々は参照により組み込まれる。一般に、本発明の実施形態では、前増幅剤は、標的プローブ対の両方のメンバー（図５Ａ及び６Ａを参照されたい）に、標的プローブ対に結合することができる前－前増幅剤（図５Ｂ及び６Ｂ）に、または標的プローブ対に結合することができる前－前増幅剤の対の両方のメンバー（図５Ｃ及び６Ｃを参照されたい）に結合する。前増幅剤はまた、増幅剤に結合する（図５及び６を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「前－前増幅剤」は、１つ以上の標的プローブと１つ以上の前増幅剤との間の中間結合成分として機能する分子、典型的にはポリヌクレオチドである。典型的には、前－前増幅剤は、１つ以上の標的プローブ及び複数の前増幅剤に同時にハイブリダイズする。例示的な前－前増幅剤は、例えば、参照により組み込まれる２０１７／０１０１６７２に記載されている。一般に、本発明の実施形態では、前－前増幅剤は、標的プローブ対（図５Ｂ及び６Ｂを参照されたい）に、または標的プローブ対のメンバー（図５Ｃ及び６Ｃを参照されたい）に、及び前増幅剤に結合する。
本明細書で使用される場合、「複数」という用語は、２つ以上を意味すると理解される。したがって、複数は、例えば、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上、２３以上、２４以上、２５以上、２６以上、２７以上、２８以上、２９以上、３０以上、３１以上、３２以上、３３以上、３４以上、３５以上、３６以上、３７以上、３８以上、３９以上、４０以上、４１以上、４２以上、４３以上、４４以上、４５以上、４６以上、４７以上、４８以上、４９以上、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、７５以上、８０以上、８５以上、９０以上、９５以上、１００以上、１１０以上、１２０以上、１３０以上、１４０以上、１５０以上、１６０以上、１７０以上、１８０以上、１９０以上、２００以上、３００以上、４００以上、５００以上、６００以上、７００以上、８００以上、９００以上、もしくは１０００以上、または特定の使用のために所望である場合、さらにより大きな数を指し得る。
本明細書に記載されるように、本発明は、標的核酸のマルチプレックス検出に関し、方法は、以前に記載されたｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションの方法よりも多い数の標的核酸の検出を提供する。方法は、プローブの酸除去、続いて標的プローブのハイブリダイゼーション及び検出の繰り返しラウンド（複数可）によるさらなるマルチプレックスと組み合わせて、検出の反復ラウンドにおいて複数の標的核酸を明確に検出するために直交増幅システムを用いることができる。
図２Ａは、逐次的なハイブリダイゼーションのための標的核酸（複数可）に結合したプローブ（複数可）の酸処理及び除去を使用する本発明の実施形態の概略図を示す。Ｎ標的プローブを、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイで、標的核酸にハイブリダイゼーションする。図式は、標的核酸にハイブリダイゼーションした標的プローブの任意のシグナル増幅を示す。細胞は、細胞の可視化を促進するために対比染色され得、例えば、核は、４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色され得る。標的プローブ及び対比染色された細胞は、例えば、イメージングによって可視化され、それによって標的核酸を検出し、イメージングする。ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）アッセイを使用する場合、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ダブルＺプローブ及びシグナルは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）増幅システムにより同時に増幅される。酸処理ステップを実行して、それぞれの標的（複数可）に結合した標的プローブ（複数可）を除去する。Ｎ標的核酸の１つ以上の追加のセットは、１つ以上のラウンドのためにＮプレックスワークフロー全体を繰り返すことによって検出され得る。全ての標的が検出された後、画像レジストレーションソフトウェアアルゴリズムを使用して画像をレジストレーションし、単一細胞解像度で重ね合わせた画像の最終合成を作成する。この方法で利用可能なマルチプレックスの総レベルは、ラウンド当たりのＮ標的（複数可）×ＮプレキシングのＫラウンドである。一般に、Ｎ＝１以上であり、酸除去ステップを含む場合、Ｋ＝２以上である。図２Ａに示される図式において、Ｋ＝１の場合、標的プローブのハイブリダイゼーション及びイメージングの１ラウンドのみを行えば十分であるため、酸除去ステップは必要とされない。
一実施形態では、本発明は、細胞内の核酸に結合したプローブの結合を破壊する方法を提供し、方法は、細胞を酸試薬と接触させることを含み、細胞は、細胞内の第１の標的核酸にハイブリダイゼーションした第１のプローブを含み、酸試薬は、第１のプローブと第１の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する。
一実施形態では、細胞を酸試薬と接触させることは、１回以上繰り返される。一実施形態では、方法は、細胞から第１のプローブを除去することをさらに含む。
一実施形態では、方法は、細胞を第２のプローブと接触させるステップをさらに含み、第２のプローブは、細胞内の第２の標的核酸にハイブリダイゼーションし、第２の標的核酸は、第１の標的核酸と同一であるか、または異なる。一実施形態では、方法は、細胞を酸試薬と接触させるステップをさらに含み、酸試薬は、第２のプローブと第２の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する。一実施形態では、細胞を酸試薬と接触させることは、１回以上繰り返される。一実施形態では、方法は、細胞から第２のプローブを除去するステップをさらに含む。
一実施形態では、本発明は、細胞内の核酸に結合したプローブの結合を破壊するための方法を提供し、方法は、細胞を酸試薬と接触させることを含み、細胞は、細胞内の１つ以上の第１の標的核酸にハイブリダイゼーションした１つ以上の第１のプローブを含み、酸試薬は、１つ以上の第１のプローブと１つ以上の第１の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する。
一実施形態では、細胞を酸試薬と接触させることは、１回以上繰り返される。一実施形態では、方法は、細胞から１つ以上の第１のプローブを除去することをさらに含む。一実施形態では、細胞は、２つ以上の第１の標的核酸にハイブリダイゼーションした２つ以上の第１のプローブを含む。一実施形態では、第１の標的核酸の各々は、第１のプローブへのハイブリダイゼーションによって標識され、各第１の標的核酸上の標識は、第１のプローブにハイブリダイゼーションした他の第１の標的核酸（複数可）上の標識から区別可能である。
一実施形態では、方法は、細胞を１つ以上の第２のプローブと接触させるステップをさらに含み、１つ以上の第２のプローブは、細胞内の１つ以上の第２の標的核酸にハイブリダイゼーションし、１つ以上の第２の標的核酸は、１つ以上の第１の標的核酸と同一であるか、または異なる。一実施形態では、細胞は、２つ以上の第２の標的核酸にハイブリダイゼーションした２つ以上の第２のプローブを含む。一実施形態では、第２の標的核酸の各々は、第２のプローブへのハイブリダイゼーションによって標識され、各第２の標的核酸上の標識は、第２のプローブにハイブリダイゼーションした他の第２の標的核酸（複数可）上の標識から区別可能である。
一実施形態では、方法は、細胞を酸試薬と接触させるステップをさらに含み、酸試薬は、第２のプローブと１つ以上の第２の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する。一実施形態では、細胞を酸試薬と接触させることは、１回以上繰り返される。一実施形態では、方法は、細胞から第２のプローブを除去するステップをさらに含む。
本発明は、酸試薬が細胞を含む試料に適用され得るという発見に基づいており、細胞は、核酸を検出するために使用されるプローブなどの１つ以上のプローブにハイブリダイゼーションした核酸を含み、それにより、酸試薬が核酸とプローブとの間のハイブリダイゼーションの破壊を引き起こす。細胞内の標的核酸に結合したプローブを除去するために、細胞内の核酸の完全性及び細胞の形態を依然として保持しながら、かつ細胞内の核酸のハイブリダイゼーション及び検出の繰り返しラウンドを可能にする酸試薬が使用され得ることは以前は認識されていなかった。核酸の完全性は、検出可能なプローブへのハイブリダイゼーションによって検出される核酸の能力を指す。本明細書で使用される場合、「酸試薬」は、核酸プローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらし、それによって標的核酸に結合したプローブ間の結合を破壊し、かつ使用される場合、細胞内のシグナル増幅剤分子間の結合を破壊し、それによってプローブならびに使用される場合、任意の構築済みシグナル増幅複合体を細胞から除去することを可能にする酸、及び任意選択で塩を含む溶液であり、酸試薬による細胞の処理は、標的核酸に対するプローブのハイブリダイゼーションの１つ以上の追加のラウンドが細胞に適用され得るように、細胞内の細胞の形態及び核酸の完全性を保持する。本発明は、本明細書に開示されるように、本発明の酸試薬を含む組成物を提供する。
本明細書に記載されるように、本発明の方法は、標的核酸に結合したプローブの結合を破壊するために酸試薬を使用することによって、標的核酸のマルチプレックス検出を提供し、それによって、同じ検出システムを逐次的なラウンドの検出で使用することを可能にする。本明細書に記載されるように、核酸に結合したプローブは、概して、核酸である少なくともいくつかの構成成分を有するプローブを指し、それによって、当該技術分野で周知のような核酸ハイブリダイゼーションによって、標的核酸へのプロープの結合を提供する。標的核酸へのプロープの結合を破壊するために酸試薬を使用する本発明の方法は、ハイブリダイゼーションによって標的核酸に結合した任意のプローブに適用され得ることを理解されたい。酸試薬を使用してプローブと標的核酸との間の結合を破壊することができる標的核酸に結合しているプローブは、標的核酸に直接結合した単一の核酸であるプローブであり得るか、または複数の核酸成分の複合体であるプローブであり得ることがさらに理解されたい。したがって、本発明の酸試薬によって破壊される標的核酸へのプローブの結合は、標的核酸に直接結合したプローブ及び／または標的核酸に結合しているプローブ複合体の任意の構成成分の破壊であり得る。複数の核酸成分の複合体であるプローブの例には、本明細書に開示されるシグナル生成複合体（ＳＧＣ）、ならびに標的核酸を検出するために使用され得る他の種類のプローブ及びプローブシステム（例えば、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １４５（１２），ｐｉｉ：ｄｅｖ１６５７５３，ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．１６５７５３（２０１８）、ローリングサークル増幅（Ｌａｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ７（５）：３９５－３９７（２０１０）、ｃｌａｍｐＦＩＳＨ（Ｒｏｕｈａｎｉｆａｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＲｘｉｖ，２２２７９４（ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２２２７９４）（２０１８）、及びＳＡＢＥＲ（Ｋｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １６：５３３－５４４（２０１９））が挙げられる。したがって、酸試薬を使用してプローブの標的核酸への結合を破壊する本発明の方法を使用して、標的核酸に結合した任意の所望のプローブまたはプローブシステムを破壊することができる。酸処理後、同じプローブまたはプローブシステムを再び使用して、同じまたは異なる標的核酸を検出することができる。
本発明の酸試薬は、酸を含む。酸試薬での使用に好適な例示的な酸としては、これらに限定されないが、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸などが挙げられる。酸試薬は、一般に、約５～４０％の酸濃度を含む。一実施形態では、酸試薬は、２０～３０％の酸を含む。例えば、酸試薬は、５～４０％の酸、例えば、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、または４０％の酸（体積／体積％）を含み得る。特定の実施形態では、酸試薬は、５～４０％の酢酸、例えば、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、もしくは４０％の酢酸（体積／体積％）、またはその間の濃度を含む。
任意選択で、酸試薬はまた、塩も含み得る。一実施形態では、酸試薬は、酸に加えて、生理食塩水クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を含み、ここで、２０倍のＳＳＣは、ｐＨ７．０で、３．０ＭのＮａＣｌ及び０．３Ｍのクエン酸ナトリウムに対応する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９）を参照されたい）。一実施形態では、酸試薬は、１倍のＳＳＣ～１３倍のＳＳＣを含む。例えば、酸試薬は、１倍、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５倍、５．１倍、５．２倍、５．３倍、５．４倍、５．５倍、５．６倍、５．７倍、５．８倍、５．９倍、６倍、６．１倍、６．２倍、６．３倍、６．４倍、６．５倍、６．６倍、６．７倍、６．８倍、６．９倍、７倍、７．１倍、７．２倍、７．３倍、７．４倍、７．５倍、７．６倍、７．７倍、７．８倍、７．９倍、８倍、８．１倍、８．２倍、８．３倍、８．４倍、８．５倍、８．６倍、８．７倍、８．８倍、８．９倍、９倍、９．１倍、９．２倍、９．３倍、９．４倍、９．５倍、９．６倍、９．７倍、９．８倍、９．９倍、１０倍、１０．１倍、１０．２倍、１０．３倍、１０．４倍、１０．５倍、１０．６倍、１０．７倍、１０．８倍、１０．９倍、１１倍、１１．１倍、１１．２倍、１１．３倍、１１．４倍、１１．５倍、１１．６倍、１１．７倍、１１．８倍、１１．９倍、１２倍、１２．１倍、１２．２倍、１２．３倍、１２．４倍、１２．５倍、１２．６倍、１２．７倍、１２．８倍、１２．９倍、１３倍など、またはその間の濃度のＳＳＣを含み得る。
別の実施形態では、酸試薬は、酸に加えて、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）（ＳＳＰＥ）を含み、ｐＨ７．４で、２０倍のＳＳＰＥは、３．０Ｍの塩化ナトリウム、０．２Ｍのリン酸水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、０．０２ Ｍのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）に対応する（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）を参照されたい）。一実施形態では、酸試薬は、１倍のＳＳＰＥ～１３倍のＳＳＰＥを含む。例えば、酸試薬は、１倍、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４倍、４．１倍、４．２倍、４．３倍、４．４倍、４．５倍、４．６倍、４．７倍、４．８倍、４．９倍、５倍、５．１倍、５．２倍、５．３倍、５．４倍、５．５倍、５．６倍、５．７倍、５．８倍、５．９倍、６倍、６．１倍、６．２倍、６．３倍、６．４倍、６．５倍、６．６倍、６．７倍、６．８倍、６．９倍、７倍、７．１倍、７．２倍、７．３倍、７．４倍、７．５倍、７．６倍、７．７倍、７．８倍、７．９倍、８倍、８．１倍、８．２倍、８．３倍、８．４倍、８．５倍、８．６倍、８．７倍、８．８倍、８．９倍、９倍、９．１倍、９．２倍、９．３倍、９．４倍、９．５倍、９．６倍、９．７倍、９．８倍、９．９倍、１０倍、１０．１倍、１０．２倍、１０．３倍、１０．４倍、１０．５倍、１０．６倍、１０．７倍、１０．８倍、１０．９倍、１１倍、１１．１倍、１１．２倍、１１．３倍、１１．４倍、１１．５倍、１１．６倍、１１．７倍、１１．８倍、１１．９倍、１２倍、１２．１倍、１２．２倍、１２．３倍、１２．４倍、１２．５倍、１２．６倍、１２．７倍、１２．８倍、１２．９倍、１３倍など、またはその間の濃度のＳＳＰＥを含み得る。
別の実施形態では、酸試薬は、酸に加えて、ｐＨ７．８、または任意選択で７～８のｐＨ範囲の、１０～５００ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。例えば、酸試薬は、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、２１０ｍＭ、２２０ｍＭ、２３０ｍＭ、２４０ｍＭ、２５０ｍＭ、２６０ｍＭ、２７０ｍＭ、２８０ｍＭ、２９０ｍＭ、３００ｍＭ、３１０ｍＭ、３２０ｍＭ、３３０ｍＭ、３４０ｍＭ、３５０ｍＭ、３６０ｍＭ、３７０ｍＭ、３８０ｍＭ、３９０ｍＭ、４００ｍＭ、４１０ｍＭ、４２０ｍＭ、４３０ｍＭ、４４０ｍＭ、４５０ｍＭ、４６０ｍＭ、４７０ｍＭ、４８０ｍＭ、４９０ｍＭ、５００ｍＭなど、またはその間の濃度のリン酸ナトリウムを含み得る。
別の実施形態では、酸試薬は、酸に加えて、１０ｍＭ～６Ｍの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む。例えば、酸試薬は、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭ、５５０ｍＭ、６００ｍＭ、６５０ｍＭ、７００ｍＭ、７５０ｍＭ、８００ｍＭ、８５０ｍＭ、９００ｍＭ、９５０ｍＭ、１Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３ Ｍ １．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、２Ｍ、２．１Ｍ、２．２Ｍ、２．３Ｍ、２．４Ｍ、２．５Ｍ、２．６Ｍ、２．７Ｍ、２．８Ｍ、２．９Ｍ、３Ｍ、３．１Ｍ、３．２Ｍ、３．３Ｍ、３．４Ｍ、３．５Ｍ、３．６Ｍ、３．７Ｍ、３．８Ｍ、３．９Ｍ、４Ｍ、４．１Ｍ、４．２Ｍ、４．３Ｍ、４．４Ｍ、４．５Ｍ、４．６Ｍ、４．７Ｍ、４．８Ｍ、４．９Ｍ、５Ｍ、５．１Ｍ、５．２Ｍ、５．３Ｍ、５．４Ｍ、５．５Ｍ、５．６Ｍ、５．７Ｍ、５．８Ｍ、５．９Ｍ、６Ｍなど、またはその間の濃度の塩化ナトリウムを含み得る。
いくつかの実施形態では、酸試薬は、５～４０％の酸及び１倍～１２．８倍のＳＳＣを含む。酸試薬は、本明細書に開示される酸及びＳＳＣの濃度の組み合わせのうちのいずれかにおいて、独立して、５～４０％の酸及び１倍～１２．８倍ＳＳＣを含み得ることを理解されたい。いくつかの実施形態では、酸試薬は、本明細書で開示されるように、２０～３０％の酸及び３．２倍～１２．８倍のＳＳＣ、または独立して、その間の酸及びＳＳＣの増加を含む。いくつかの実施形態では、酸は、酢酸である。いくつかの実施形態では、酸は、ギ酸である。いくつかの実施形態では、酸試薬は、２０％の酸及び３．２倍のＳＳＣを含む。別の実施形態では、酸試薬は、２０％の酸及び６．４倍のＳＳＣを含む。別の特定の実施形態では、酸試薬は、２０％の酸及び１２．８倍のＳＳＣを含む。別の特定の実施形態では、酸試薬は、３０％の酸及び３．２倍のＳＳＣを含む。別の特定の実施形態では、酸試薬は、３０％の酸及び６．４倍のＳＳＣを含む。別の特定の実施形態では、酸試薬は、３０％の酸及び１２．８倍のＳＳＣを含む。特定の実施形態では、酸試薬は、２０％の酢酸及び３．２倍のＳＳＣを含む。別の特定の実施形態では、酸試薬は、２０％の酢酸及び６．４倍のＳＳＣを含む。別の特定の実施形態では、酸試薬は、２０％の酢酸及び１２．８倍のＳＳＣを含む。別の特定の実施形態では、酸試薬は、３０％の酢酸及び３．２倍のＳＳＣを含む。別の特定の実施形態では、酸試薬は、３０％の酢酸及び６．４倍のＳＳＣを含む。別の特定の実施形態では、酸試薬は、３０％の酢酸及び１２．８倍のＳＳＣを含む。
いくつかの実施形態では、細胞内の標的核酸にハイブリダイゼーションしたプローブ間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらすために細胞に酸試薬を適用することに関する本発明の方法は、室温で実施される。他の実施形態では、酸試薬は、室温をちょうど下回るかまたは上回る温度で細胞に適用され得る。したがって、細胞内の標的核酸にハイブリダイゼーションしたプローブ間の破壊をもたらすために細胞に酸試薬を適用するための本発明の方法は、例えば、約４℃～約４０℃の温度で実施され得る。例えば、方法は、４℃、５℃、６℃，７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、もしくは４０℃の温度、またはその間の増加の温度で実施され得る。
細胞内の標的核酸にハイブリダイゼーションしたプローブ間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらすために細胞に酸試薬を適用することに関する本発明の方法では、方法は、一定期間実施され、任意選択で繰り返される。酸試薬は、一般に、１～３０分間、またはそれ以上細胞と接触させる。例えば、酸試薬は、１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、もしくはそれ以上など、またはその間の増加の間、細胞と接触させる。いくつかの実施形態では、酸試薬処理は、１～１０回繰り返される。例えば、酸試薬処理は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１回実施される（すなわち、最大１０回繰り返される）。別の例では、酸試薬処理は、１、２、３、４、５、または６回実施される（すなわち、最大５回繰り返される）。いくつかの実施形態では、酸試薬は、酸試薬を除去することなく（例えば、細胞から酸試薬を吸引することによって）、または細胞を洗浄することなく（例えば、酸試薬の適用の間に細胞を洗浄することによって）、逐次的に細胞と接触させる。任意選択で、酸試薬は、例えば、細胞から酸試薬を吸引するか、または好適な緩衝液で細胞を洗浄することによって、細胞との接触から除去され得る。好適な洗浄緩衝液には、これらに限定されないが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイで日常的に使用される緩衝液が含まれる。
本明細書に開示されるように、細胞内の標的核酸に結合したプローブを除去するための条件は、本明細書に開示されるように、酸試薬の構成成分及び構成成分の濃度、細胞との酸試薬のインキュベーションの時間、ならびにインキュベーションを繰り返す回数に応じて容易に決定され得ることを理解されたい。細胞からのプローブの除去の有効性は、標的核酸を検出するために使用されるのと同じ方法を使用して細胞を分析し、残留プローブが検出され得るかどうかを確認することによって容易に決定され得る（実施例Ｉ及びＩＩを参照されたい）。残留プローブが依然として存在する場合、酸試薬処理は、以前に検出されたプローブが検出されなくなるか、または十分に低いレベルで検出されるまで単に繰り返され、その後のラウンドの標識において同じ標識を有する標的核酸の検出可能な標識を可能にする必要がある。同様に、核酸のその後の検出を可能にするために、細胞内の核酸の細胞形態及び完全性を保持しながら、細胞が酸試薬で処理され得る回数は、所与の酸試薬について細胞の酸試薬処理を繰り返し行い、所与の一連の条件下で、標的核酸が依然として検出され得るか否かを決定することによって、例えば、細胞内の陽性対照核酸を検出する能力を決定することによって、または細胞が酸試薬で１回以上処理された後に細胞内で同様の細胞形態が検出され得ることを決定することによって、容易に決定され得る（実施例Ｉ及びＩＩを参照されたい）。所与の酸試薬を適用するインキュベーション時間及び繰り返し数の一連の条件が決定されると、条件は、他の細胞試料に適用され得る。本明細書に開示されるように、ある範囲の酸試薬及び条件が試験され、標的核酸の新たなラウンドの検出が適用され得るように、細胞形態及び核酸の完全性を保持したプローブと標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊するのに有効であることが示された（実施例ＩＩＩを参照されたい）。
いくつかの実施形態では、各ラウンドで、単一の標的核酸を検出する。このような場合には、試料を、複数の標的核酸に対する複数の標的プローブのセットと接触させるのではなく、試料は、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションし得る標的プローブのセットと接触させる。他の実施形態では、本明細書に開示されるように、単一のラウンで複数の標的を検出する。
したがって、本発明は、標的核酸のより高いマルチプレックス検出を達成するための、複数の核酸標的の独自の標識の使用及び標的核酸のサブセットの反復的な検出、続いて標的核酸のより高いマルチプレックス検出を達成するための、結合されたプローブを除去するための酸試薬処理に関する。反復的なラウンドで、標的核酸のマルチプレックス検出を行う本発明の方法の有効性は、実施例に記載されているように、本発明で実証されている。
図１に示されるように、一実施形態では、本発明の方法では、標的核酸を検出するために、複数の標的核酸に対する標的プローブの同時ハイブリダイゼーションと、増幅システムを用いる。しかしながら、全ての標的核酸を一度に検出するのではなく、標的核酸の標識及び検出は、反復的なラウンドで行い、その際には、１回目のラウンドでは、標的プローブが結合した標的核酸サブセットのみを検出する。これは、標的１～４を１回目のラウンドで検出するものとして、図１に概略的に示されている。切断可能な標識を用いることによって、１回目のラウンドで、標的核酸（図１の標的１～４）に結合した検出可能な標識をイメージング後、標識を試料から除去する（図１の「フルオロフォアの切断」）。１回目のラウンドで標的核酸に結合した標識を切断すると、概して、標的核酸の異なるサブセット（図１に標的５～８として示される）を検出する標識の第２の群を付加することによって、２回目のラウンドの検出が適用される。１回目のラウンドの標識を標的核酸から切断することによって、１回目のラウンドと同じ検出可能な標識（図１にフルオロフォアとして示される）を２回目のラウンドで使用することができる。標的核酸に結合した標識を切断し、標的核酸の新しいサブセットを検出するために標識を付加するこのようなサイクルは、以前に記載された方法よりも同じ試料及び同じ細胞内でのさらに多くの核酸標的の検出を可能にする。図２Ｂに示されるように、マルチプレックスのさらなる層（複数可）は、図１に示される方法の新しいラウンドが繰り返され得るように、標的プローブ及び増幅システム（例えば、ＳＧＣ）を除去するための試料の酸処理によって達成され得る。
図２Ｂは、逐次的なハイブリダイゼーションのための標的核酸に結合したプローブの酸処理及び除去の概略図を示す。Ｎ標的プローブを、例えば、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＨｉＰｌｅｘアッセイなどのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイで、標的核酸にハイブリダイゼーションする。Ｎ標的プローブを、標的配列にハイブリダイゼーションし（例えば、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ダブルＺプローブ）、同時にシグナルを増幅する（例えば、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）増幅システム）。図２Ｂの図式は、標的核酸にハイブリダイゼーションした標的プローブの任意のシグナル増幅を示す。細胞は、細胞の可視化を促進するために対比染色され得、例えば、核は、４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色され得る。Ｎ標的核酸は、標識、例えば、蛍光標識、イメージング、及び検出可能な標識の切断、例えば、蛍光標識の切断の反復ラウンドにより検出される。図式において、Ｎ標的核酸をＮ標的プローブにハイブリダイゼーションし、反復して検出することにより、Ｎ標的のサブセット（Ｎ標的サブセット１）を標識して検出し、標識を標識された核酸のサブセットから切断し（Ｌラウンドの標識プローブハイブリダイゼーション、Ｌ＝１）、次いで、Ｎ標的の第２のサブセット（Ｎ標的サブセット２）を標識して検出し、標識を標識された核酸のサブセットから切断する（Ｌラウンドの標識プローブハイブリダイゼーション、Ｌ＝２）など、Ｎ標的核酸の全てが検出されるまで続く。全てのＮ標的核酸が所望の数の標識の数（Ｌ＝所望の標識のラウンド）で検出された後、ハイブリダイゼーションしたＮ標的プローブを除去（例えば、本明細書に記載されるような、シグナル生成複合体（ＳＧＣ）の除去）するために酸処理ステップを行う。Ｎ標的核酸（例えば、Ｎ’標的核酸、Ｎ’’標的核酸など）の１つ以上の追加のセットは、１つ以上のラウンドのためにＮプレックスワークフロー全体を繰り返すことによって検出され得る。全ての標的が検出された後、画像レジストレーションソフトウェアアルゴリズムを使用して画像をレジストレーションし、単一細胞解像度で重ね合わせた画像の最終合成を作成する。この方法で利用可能なマルチプレックスの総レベルは、ラウンド当たりＮ標的核酸× Ｎ－プレキシングのＫラウンド（「Ｎ－プレキシング」は、「Ｎ標的プローブのハイブリダイゼーション」から「プローブ及び増幅剤の酸性除去」または最終ラウンドでは最後の「対比染色及びイメージング」ステップへのフローを指す）である。一般に、Ｎ＝１以上であり、酸除去ステップを含む場合、Ｋ＝２以上である。図２Ｂに示される図式において、Ｋ＝１の場合、Ｌラウンドの標識プローブハイブリダイゼーション、イメージング、及びフルオロフォア切断のみを行う必要があるため、プローブ及び増幅剤の酸除去ステップは必要とされない。さらに、追加のＮ標的核酸が検出されないＮ標的核酸の検出の最終ラウンド（すなわち、Ｋ＝Ｎ最終であり、「Ｎ」はＫラウンドの総数である）で、酸処理ステップを必要としないことを理解されたい。したがって、図２Ｂに示される概略図において、全ての所望の標的核酸が検出及びイメージングされた後、さらなる標識切断ステップ及び／または酸処理ステップを必要とせずに、標的核酸の分析のために画像レジストレーションを行う。
概して、標的核酸のマルチプレックス検出のために、別個かつ区別可能な標識を用いる場合には、同時に区別され得る別個の標識の数には制限がある。例えば、蛍光標識の場合には、複数の標識を同時に検出するには、フルオロフォアからの複数の発光のスペクトルを分離して、蛍光顕微鏡が、フルオロフォアを同時に区別できるようにしなければならない。フルオロフォアからの発光のスペクトルを分離する必要性により、同時に可視化できるフルオロフォアの数が制限される。本発明は、逐次的なラウンドで、同じフルオロフォアを使用して、標的核酸を検出できるように、標識を反復的に検出することによって、この制限を解消する。
本発明の方法で使用され得る検出システムの直交性を図６に示す。図６Ａは、３つの例示的な標的核酸及びそれぞれの直交検出システム（本発明では、シグナル生成複合体（ＳＧＣ）とも称される）を用いた一実施形態を示す。図６Ａに示されるように、各標的核酸は、特異的な標的プローブ対（ＴＰ１ａ及びＴＰ１ｂ、ＴＰ２ａ及びＴＰ２ｂ、ＴＰ３ａ及びＴＰ３ｂ）にハイブリダイゼーションし、続いて、それぞれの特異的な前増幅剤（ＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ３）にハイブリダイゼーションし、その次に、それぞれの特異的な複数の増幅剤（ＡＭＰ１、ＡＭＰ２、ＡＭＰ３）にハイブリダイゼーションし、その後、それぞれの特異的な複数の標識プローブ（ＬＰ１、ＬＰ２、ＬＰ３）にハイブリダイゼーションする。図６Ｂは、２つの例示的な標的核酸及びそれぞれの直交検出システムを用いた別の実施形態を示す。図６Ｂに示されるように、各標的核酸は、特異的な標的プローブ対（ＴＰ１ａ及びＴＰ１ｂ、ＴＰ２ａ及びＴＰ２ｂ）にハイブリダイゼーションし、続いて、それぞれの特異的な前－前増幅剤（ＰＰＡ１、ＰＰＡ２）にハイブリダイゼーションし、その次に、それぞれの特異的な複数の前増幅剤（ＰＡ１、ＰＡ２）にハイブリダイゼーションし、その後、それぞれの特異的な複数の増幅剤（ＡＭＰ１、ＡＭＰ２）にハイブリダイゼーションした後、それぞれの特異的な複数の標識プローブ（ＬＰ１、ＬＰ２）にハイブリダイゼーションする。図６Ｃは、２つの例示的な標的核酸及びそれぞれの直交検出システムを用いた別の実施形態を示す。図６Ｃに示されるように、各標的核酸は、特異的な標的プローブ対（ＴＰ１ａ及びＴＰ１ｂ、ＴＰ２ａ及びＴＰ２ｂ）にハイブリダイゼーションし、続いて、それぞれの特異的な前－前増幅剤の対（ＰＰＡ１ａ及びＰＰＡ１ｂ、ＰＰＡ２ａ及びＰＰＡ２ｂ）にハイブリダイゼーションし、その次に、両方の前－前増幅剤が、それぞれの特異的な前増幅剤（ＰＡ１及びＰＡ２）にハイブリダイゼーションし、その後、それぞれの特異的な増幅剤（ＡＭＰ１及びＡＭＰ２）にハイブリダイゼーションした後、それぞれの特異的な標識プローブ（ＬＰ１及びＬＰ２）にハイブリダイゼーションする。簡単にするために、複数の増幅剤が、前増幅剤のうちの１つに結合しているように示されているが、増幅剤は前増幅剤の各々に結合し得ることを理解されたい。図６に示されるように、各核酸標的は、特異的な検出システムを有し、そのシステムの構成成分の結合は、１つの特異的な複合体には結合させるが、他の複合体には結合させない固有の結合部位によって媒介される。ＳＧＣの構成成分が、特異的な標的核酸にハイブリダイゼーションするためのこのような固有の結合部位は、当該技術分野で周知であるように、かつ本明細書に記載されているように、所望の特異性が得られるように、結合部位（核酸配列）を設計することによって達成され得る。各標的が独自に標識されるこの直交検出システムにより、同じ試料内の複数の標的核酸を検出することが可能になる。
本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、方法は、複数の標的核酸が同じ試料内、及びさらに同じ細胞内で分析され得るように、直交増幅システムを利用して標的核酸を独自に標識する。本発明では、特定の標的核酸に特異的であるシグナル生成複合体（ＳＧＣ）の構築を利用して、各標的核酸を独自に特定できるようにする。一実施形態では、試料は、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションすることができる標的プローブの対を含む標的プローブのセットと接触させる。試料は、各標的プローブのセットに特異的な前増幅剤を含むとともに、それぞれの標的核酸にハイブリダイゼーションする標的プローブ対にハイブリダイゼーションできる前増幅剤セットとも接触させる。このような実施形態を、図６Ａに概略的に示す。試料は、増幅剤とも接触させ、その増幅剤は、標的核酸に特異的である標的プローブ対に特異的である各前増幅剤に特異的な増幅剤のサブセットを含む。すなわち、各標的核酸は、標的核酸間の判別を行う、ＳＧＣの固有の成分、すなわち、標的プローブ対（複数可）、前増幅剤、及び増幅剤からなるアセンブリを有する。追加の実施形態では、前－前増幅剤が、標的プローブ対及び前増幅剤の間の追加の増幅層として、標的プローブ対に結合し得る（図５Ｂ及び６Ｂを参照されたい）。
別の実施形態では、試料は、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションすることができる標的プローブの対を含む標的プローブのセットと接触させる。試料は、各標的プローブのセットに特異的な前－前増幅剤の対を含むとともに、それぞれの標的核酸にハイブリダイゼーションする標的プローブ対にハイブリダイゼーションすることができる前－前増幅剤のセットとも接触させる。このような実施形態を、図６Ｃに概略的に示す。試料は、標的に特異的である標的プローブの対に特異的である前－前増幅剤の両方の対に特異的に結合することができる前増幅剤を含む前増幅剤のセットとも接触させる。試料は、増幅剤とも接触させ、その増幅剤は、標的核酸に特異的である標的プローブ対に特異的である前－前増幅剤の対に特異的である各前増幅剤に特異的な増幅剤のサブセットを含む。すなわち、各標的核酸は、標的核酸間の判別を行う、ＳＧＣの固有の成分、すなわち、標的プローブ対、前－前増幅剤、前増幅剤、及び増幅剤からなるアセンブリを有する。
標的核酸を検出するために、標識プローブのセットを試料と接触させる。試料を、全ての標的核酸を検出することができる標識プローブと接触させる代わりに、試料は、標的核酸のサブセットを検出することができる標識プローブのセットと接触させる。したがって、全ての標的核酸を一度に検出するのではなく、反復的な検出ラウンドで、標的核酸を検出する。１回のラウンド内では、１回目のラウンドの適用標識プローブと関連付けられた全ての標的核酸が同時に検出され得るように、それぞれの標的核酸に特異的な標識プローブは、互いに区別可能なものである。
１回のラウンドで同時に検出できる標的核酸の数は、標識プローブで用いられる標識の種類と、その標識が区別され得る方法によって決まることになる。例えば、蛍光標識を使用する場合には、１回のラウンドで使用されるフルオロフォアは、区別可能である必要があるため、フルオロフォアの発光のスペクトル分離がされなければならない。同時に区別され得るフルオロフォアの数は、検出システム、ならびに重複する発光を持つフルオロフォアを区別するために使用され得るフィルター及び／またはソフトウェアの可用性に応じて、最大１０個であり、当該技術分野において周知であるように、それらを区別できる場合には、スペクトル分離があるとみなされる。複数の蛍光標識を検出するためのイメージングシステムは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｖｅｃｔｒａ Ｐｏｌａｒｉｓ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ ＭＡ）。
一実施形態では、本発明の方法は、ラウンド当たり１つ以上の標的核酸の検出に適用され、例えば、各ラウンドで、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上の標的核酸が検出される。本明細書で開示されるように、当業者は、試料内で所望の数の標的核酸が検出可能になるように、好適な別個の標識及び好適な回数のラウンドの検出を選択することができる。
１回目のラウンドの検出で使用された標識の区別可能な特徴を、その後のラウンドで利用するために、いくつかの実施形態では、標識プローブ上の標識は、切断可能である。したがって、標的核酸のサブセットを検出する１回目のラウンドを実施すると、標的核酸に結合した標識を切断して、標的核酸の第１のサブセットから標識を除去する。標識プローブに対する標識の例示的な切断可能なコンジュゲートは、本明細書に記載されている。標識が切断されると、試料を、概して１回目のラウンドで検出された標的核酸とは異なる標的核酸に特異的な標識プローブの第２のセットと接触させることによって、２回目のラウンドの検出を実施する。１回目のラウンドの標識は、それぞれの標的核酸から切断されているため、２回目のラウンドの検出の標識プローブでも、同じ区別可能な標識が使用され得る。本明細書に記載されるように、上記のステップが、標的核酸の異なるセットを検出するために繰り返され得るように、結合プローブ及び増幅システム（例えば、ＳＧＣ）を除去するために、試料の酸処理によって、さらなるマルチプレックスが達成され得る。標的核酸のサブセットの反復的な検出ラウンドにおいて、同じ標識が使用され得るが、その後の検出ラウンドでは、同じラウンドで使用される標識が区別可能である限りは、同じ標識を使用する必要はないことを理解されたい。
２回目のラウンドの標的核酸のサブセットの検出が実施されると、任意選択で、１回以上の追加のラウンドの切断、標識、及び検出が試料に適用され得る。例えば、標的核酸の第２のサブセットの検出後、標的核酸の第２のサブセット上にアセンブリしたＳＧＣから、標識が切断され得、３回目のラウンドの標識及び検出を実施して、標的核酸の第１及び第２のサブセットとは別個の標的核酸の第３のサブセットを検出することができる。標的核酸のこのような反復的なラウンドの検出は、検出の反復を所望の回数行うことを利用して、複数の標的核酸を所望の数、検出する目的で実施することができる。本明細書に記載されるように、上記のステップが、所望の数の標的核酸を検出するために、標的核酸の同じまたは異なるセットを検出するために繰り返され得るように、結合プローブ及び増幅システム（例えば、ＳＧＣ）を除去するために、試料の酸処理によって、さらなるマルチプレックスが達成され得る。最後の反復的な検出ラウンドでは、標識プローブは、さらなる検出ラウンドを実施することはないため、切断可能な標識を含む必要はないことを理解されたい。したがって、最後の反復的な検出ラウンドでは、切断可能な標識を含む標識プローブを使用することは任意であり、すなわち、標識プローブは、切断可能な標識を含むことも、含まないこともできる。概して、検出ラウンドは、各ラウンドで異なる標的核酸が検出されるように実施される。しかしながら、その後のラウンドの検出は、同じ標的核酸または重複する標的核酸が１つ以上の逐次的なラウンドで検出されるように、以前のラウンドと重複する１つ以上の標的核酸（複数可）（以前のラウンドにおける最大全ての核酸を含む）の検出を含み得ることを理解されたい。このように、逐次的なラウンドでの同じ標的核酸または重複する標的核酸の検出を使用して、各ラウンドで、所定の色配列で、同じ標的核酸が検出された時に、各標的核酸に対して一時的なバーコードを生成することができる。このような方法は、例えば、逐次的バーコード蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ｓｅｑＦＩＳＨ）として以前に説明されている（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ ９２（２）：３４２－３５７（２０１６）を参照されたい）。したがって、細胞内の標的核酸に結合したプローブを除去するために酸試薬を使用する本発明の方法は、ｓｅｑＦＩＳＨなどの方法に適用して、より高いレベルのマルチプレックスのためのバーコードを生成するために複数回のラウンドのハイブリダイゼーションを行うための効率的な方法を提供することができる。
一実施形態では、本発明は、細胞内の複数の標的核酸のマルチプレックス検出のための方法を提供し、方法は、（Ａ）複数の標的核酸を含む細胞を含む試料を、１つ以上の標的核酸に特異的なプローブのセットと接触させることであって、標的核酸に対するプローブが、（ａ）標的プローブのセットであって、標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの１つ以上の対を含む、標的プローブのセットと、（ｂ）前増幅剤のセットであって、前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前増幅剤が、標的プローブの対に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前増幅剤のセットと、（ｃ）増幅剤のセットであって、増幅剤のセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤が、前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、増幅剤のセットと、（ｄ）標識プローブのセットであって、標識プローブのセットの標識プローブが各々、増幅剤に対する標識及び結合部位を含む、標識プローブのセットと、を含む、接触させることと、（Ｂ）それぞれの標的核酸に結合した検出可能な標識を検出することと、（Ｃ）試料を酸試薬と接触させて、それによって標的核酸に結合したプローブの結合を破壊することと、を含む（図２Ａ及び６Ａを参照されたい）。
一実施形態では、本発明は、細胞内の複数の標的核酸のマルチプレックス検出のための方法を提供し、方法は、（Ａ）複数の標的核酸を含む細胞を含む試料を、１つ以上の標的核酸に特異的なプローブのセットと接触させることであって、標的核酸に対するプローブが、（ａ）標的プローブのセットであって、標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの１つ以上の対を含む、標的プローブのセットと、（ｂ）前－前増幅剤のセットであって、前－前増幅剤のセットが、１つ以上の前－前増幅剤を含み、各前－前増幅剤が、標的プローブの１つ以上の対に対する結合部位を含む、前－前増幅剤のセットと、（ｃ）前増幅剤のセットであって、前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前増幅剤が、前－前増幅剤に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前増幅剤のセットと、（ｄ）増幅剤のセットであって、増幅剤のセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤が、前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、増幅剤のセットと、（ｅ）標識プローブのセットであって、標識プローブのセットの標識プローブが各々、増幅剤に対する標識及び結合部位を含む、標識プローブのセットと、を含む、接触させることと、（Ｂ）それぞれの標的核酸に結合した検出可能な標識を検出することと、（Ｃ）試料を酸試薬と接触させて、それによって標的核酸に結合したプローブの結合を破壊することと、を含む（例えば、図２Ａ及び６Ｂを参照されたい）。
一実施形態では、本発明は、細胞内の複数の標的核酸のマルチプレックス検出のための方法を提供し、方法は、（Ａ）複数の標的核酸を含む細胞を含む試料を、１つ以上の標的核酸に特異的なプローブのセットと接触させることであって、標的核酸に対するプローブが、（ａ）標的プローブのセットであって、標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの１つ以上の対を含む、標的プローブのセットと、（ｂ）前－前増幅剤のセットであって、前－前増幅剤のセットが、前－前増幅剤の１つ以上の対を含み、前－前増幅剤の対の各前－前増幅剤が、標的プローブの対の標的プローブのうちの１つに対する結合部位を含む、前－前増幅剤のセットと、（ｃ）前増幅剤のセットであって、前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前増幅剤が、前－前増幅剤の対に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前増幅剤のセットと、（ｄ）増幅剤のセットであって、増幅剤のセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤が、前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、増幅剤のセットと、（ｅ）標識プローブのセットであって、標識プローブのセットの標識プローブが各々、増幅剤に対する標識及び結合部位を含む、標識プローブのセットと、を含む、接触させることと、（Ｂ）それぞれの標的核酸に結合した検出可能な標識を検出することと、（Ｃ）試料を酸試薬と接触させて、それによって標的核酸に結合したプローブの結合を破壊することと、を含む（例えば、図２Ａ及び６Ｃを参照されたい）。
一実施形態では、細胞を酸試薬と接触させることは、１回以上繰り返される。一実施形態では、方法は、１回以上、ステップ（Ａ）及び（Ｂ）を繰り返すこと、またはステップ（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）を繰り返すことをさらに含む。
一実施形態では、本発明は、複数の標的核酸を検出する方法を提供し、方法は、（Ａ）複数の核酸を含む細胞を含む試料を、複数の標的プローブのセットと接触させることであって、各標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの対を含む、接触させることと、（Ｂ）試料を、前増幅剤のセットと接触させることであって、前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、複数の前増幅剤が、各標的プローブのセットに特異的な前増幅剤を含み、各前増幅剤が、標的プローブのセットのうちの１つの標的プローブの対に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、接触させることと、（Ｃ）試料を、増幅剤のセットと接触させることであって、増幅剤のセットが、各前増幅剤に特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤の各サブセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤のサブセットの増幅剤が、標的プローブのセットに特異的な前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、接触させることと、（Ｄ）試料を、標識プローブの第１のセットと接触させることであって、標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々における標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける標識が、標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、標識が切断可能であり、標識プローブの第１のセットが、複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｅ）標的核酸に結合した標識プローブの第１のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第１のサブセットを検出することと、（Ｆ）標的核酸の第１のサブセットに結合した標識プローブの第１のセットから標識を切断することと、（Ｇ）試料を、標識プローブの第２のセットと接触させることであって、標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第２のサブセットが、標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける標識が、標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、標識が、任意選択で切断可能であり、標識プローブの第２のセットが、標的核酸の第１のサブセットとは異なる複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｈ）標的核酸に結合した標識プローブの第２のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第２のサブセットを検出することであって、複数の標的核酸が検出される、検出することと、（Ｉ）試料を酸試薬と接触させて、それによって標的核酸に結合したプローブの結合を破壊することと、を含む（例えば、図２Ｂ及び６Ａ（Ｌ＝２であり、標識がＳＧＣから切断される）を参照されたい）。
そのような方法の一実施形態では、方法は、ステップ（Ｉ）の前に、（Ｊ）標的核酸の第２のサブセットに結合した標識プローブの第２のセットから標識を切断することと、（Ｋ）試料を、標識プローブの第３のセットと接触させることであって、標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第３のサブセットが、標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける標識が、標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、標識が、任意選択で切断可能であり、標識プローブの第３のセットが、標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｌ）標的核酸に結合した標識プローブの第３のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第３のサブセットを検出することと、を含む（例えば、図２Ｂ及び６Ａ（Ｌ＝３であり、標識がＳＧＣから切断される）を参照されたい）。
一実施形態では、方法は、ステップ（Ｊ）～（Ｌ）を１回以上繰り返すことを含む（例えば、図２Ｂ及び６Ａ（Ｌ＝４＋であり、標識がＳＧＣから切断される）を参照されたい）。
任意選択で、本発明の方法では、細胞を酸試薬と接触させることは、１回以上繰り返される。
一実施形態では、方法は、ステップ（Ａ）～（Ｉ）またはステップ（Ａ）～（Ｈ）、（Ｊ）～（Ｌ）及び（Ｉ）を１回以上繰り返すことをさらに含む（例えば、図２Ｂ及び６Ａ（Ｋ＝２＋であり、標識がＳＧＣから切断される）を参照されたい）。そのような方法の一実施形態では、方法は、ステップ（Ａ）～（Ｈ）またはステップ（Ａ）～（Ｈ）及び（Ｊ）～（Ｌ）を繰り返すことをさらに含む。
一実施形態では、本発明は、複数の標的核酸を検出する方法を提供し、方法は、（Ａ）複数の核酸を含む細胞を含む試料を、複数の標的プローブのセットと接触させることであって、各標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの対を含む、接触させることと、（Ｂ）試料を、前－前増幅剤のセットと接触させることであって、前－前増幅剤のセットが、複数の前－前増幅剤を含み、複数の前－前増幅剤が、各標的プローブのセットに特異的な前－前増幅剤を含み、各前－前増幅剤が、標的プローブのセットのうちの１つの標的プローブの対に対する結合部位及び前増幅剤に対する複数の結合部位を含む、接触させることと、（Ｃ）試料を、前増幅剤のセットと接触させることであって、前増幅剤のセットが、各前－前増幅剤に特異的な前増幅剤の複数のサブセットを含み、前増幅剤の各サブセットが、複数の前増幅剤を含み、前増幅剤のサブセットの前増幅剤が、標的プローブのセットに特異的な前－前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、接触させることと、（Ｄ）試料を、増幅剤のセットと接触させることであって、増幅剤のセットが、前増幅剤の各サブセットに特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤の各サブセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤のサブセットの増幅剤が、前増幅剤のサブセットのうちの１つの前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、接触させることと、（Ｅ）試料を、標識プローブの第１のセットと接触させることであって、標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々における標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける標識が、標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、標識が切断可能であり、標識プローブの第１のセットが、複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｆ）標的核酸に結合した標識プローブの第１のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第１のサブセットを検出することと、（Ｇ）標的核酸の第１のサブセットに結合した標識プローブの第１のセットから標識を切断することと、（Ｈ）試料を、標識プローブの第２のセットと接触させることであって、標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第２のサブセットが、標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける標識が、標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、標識が、任意選択で切断可能であり、標識プローブの第２のセットが、標的核酸の第１のサブセットとは異なる複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｉ）標的核酸に結合した標識プローブの第２のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第２のサブセットを検出することであって、複数の標的核酸が検出される、検出することと、（Ｊ）試料を酸試薬と接触させて、それによって標的核酸に結合したプローブの結合を破壊することと、を含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｂ（Ｌ＝２であり、標識がＳＧＣから切断される）を参照されたい）。
一実施形態では、方法は、ステップ（Ｊ）の前に、（Ｋ）標的核酸の第２のサブセットに結合した標識プローブの第２のセットから標識を切断することと、（Ｌ）試料を、標識プローブの第３のセットと接触させることであって、標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第３のサブセットが、標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける標識が、標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、標識が、任意選択で切断可能であり、標識プローブの第３のセットが、標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｍ）標的核酸に結合した標識プローブの第３のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第３のサブセットを検出することと、を含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｂ（Ｌ＝３であり、標識がＳＧＣから切断される）を参照されたい）。
一実施形態では、方法は、ステップ（Ｋ）～（Ｍ）を１回以上繰り返すことを含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｂ（Ｌ＝４＋であり、標識がＳＧＣから切断される）を参照されたい）。
一実施形態では、細胞を酸試薬と接触させることは、１回以上繰り返される。
一実施形態では、方法は、ステップ（Ａ）～（Ｊ）またはステップ（Ａ）～（Ｉ）、（Ｋ）～（Ｍ）及び（Ｊ）を１回以上繰り返すことをさらに含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｂ（Ｋ＝２＋であり、標識がＳＧＣから切断される）を参照されたい）。そのような方法の一実施形態では、方法は、ステップ（Ａ）～（Ｉ）またはステップ（Ａ）～（Ｉ）及び（Ｋ）～（Ｍ）を繰り返すことをさらに含む。
一実施形態では、本発明は、複数の核酸を検出する方法を提供し、方法は、（Ａ）複数の核酸を含む細胞を含む試料を、複数の標的プローブのセットと接触させることであって、各標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの対を含む、接触させることと、（Ｂ）試料を、前－前増幅剤のセットと接触させることであって、前－前増幅剤のセットが、前－前増幅剤の複数の対を含み、前－前増幅剤のセットが、標的プローブのセットの標的プローブの対の各々に特異的な前－前増幅剤の対を含み、前－前増幅剤の対の各前－前増幅剤は、標的プローブのセットの標的プローブの対の標的プローブのうちの１つに対する結合部位を含み、前－前増幅剤が、前増幅剤に対する複数の結合部位を含む、接触させることと、（Ｃ）試料を、前増幅剤のセットと接触させることであって、前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、複数の前増幅剤が、前－前増幅剤の各対に特異的な前増幅剤を含み、各前増幅剤が、前－前増幅剤のセットの前－前増幅剤の対のうちの１つに対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、接触させることと、（Ｄ）試料を、増幅剤のセットと接触させることであって、増幅剤のセットが、前－前増幅剤の各対に特異的な各前増幅剤に特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤のサブセットの増幅剤が、前－前増幅剤の対に特異的な前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、接触させることと、（Ｅ）試料を、標識プローブの第１のセットと接触させることであって、標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々における標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける標識が、標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、標識が切断可能であり、標識プローブの第１のセットが、複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｆ）標的核酸に結合した標識プローブの第１のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第１のサブセットを検出することと、（Ｇ）標的核酸の第１のサブセットに結合した標識プローブの第１のセットから標識を切断することと、（Ｈ）試料を、標識プローブの第２のセットと接触させることであって、標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第２のサブセットが、標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける標識が、標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、標識が、任意選択で切断可能であり、標識プローブの第２のセットが、標的核酸の第１のサブセットとは異なる複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｉ）標的核酸に結合した標識プローブの第２のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第２のサブセットを検出することであって、複数の標的核酸が検出される、検出することと、（Ｊ）試料を酸試薬と接触させて、それによって標的核酸に結合したプローブの結合を破壊することと、を含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｃ（Ｌ＝２であり、標識がＳＧＣから切断される）を参照されたい）。
一実施形態では、方法は、ステップ（Ｊ）の前に、（Ｋ）標的核酸の第２のサブセットに結合した標識プローブの第２のセットから標識を切断することと、（Ｌ）試料を、標識プローブの第３のセットと接触させることであって、標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第３のサブセットが、標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける標識が、標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、標識が、任意選択で切断可能であり、標識プローブの第３のセットが、標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｍ）標的核酸に結合した標識プローブの第３のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第３のサブセットを検出することと、を含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｃ（Ｌ＝３であり、標識がＳＧＣから切断される）を参照されたい）。
一実施形態では、方法は、ステップ（Ｋ）～（Ｍ）を１回以上繰り返すことを含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｃ（Ｌ＝４であり、標識がＳＧＣから切断される）を参照されたい）。
一実施形態では、細胞を酸試薬と接触させることは、１回以上繰り返される。
一実施形態では、方法は、ステップ（Ａ）～（Ｊ）またはステップ（Ａ）～（Ｉ）、（Ｋ）～（Ｍ）及び（Ｊ）を１回以上繰り返すことをさらに含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｃ（Ｋ＝２＋であり、標識がＳＧＣから切断される）を参照されたい）。そのような方法の一実施形態では、方法は、ステップ（Ａ）～（Ｉ）またはステップ（Ａ）～（Ｉ）及び（Ｋ）～（Ｍ）を繰り返すことをさらに含む。
一実施形態では、本発明は、複数の標的核酸を検出する方法を提供し、方法は、（Ａ）複数の核酸を含む細胞を含む試料を、複数の標的プローブのセットと接触させることであって、各標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの対を含む、接触させることと、（Ｂ）試料を、前増幅剤のセットと接触させることであって、前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、複数の前増幅剤が、各標的プローブのセットに特異的な前増幅剤を含み、各前増幅剤が、標的プローブのセットのうちの１つの標的プローブの対に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、接触させることと、（Ｃ）試料を、増幅剤のセットと接触させることであって、増幅剤のセットが、各前増幅剤に特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤の各サブセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤のサブセットの増幅剤が、標的プローブのセットに特異的な前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、接触させることと、（Ｄ）試料を、標識プローブの第１のセットと接触させることであって、標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々における標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける標識が、標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、標識プローブと増幅剤との間の融解温度が、標的プローブ、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、標識プローブの第１のセットが、複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｅ）標的核酸に結合した標識プローブの第１のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第１のサブセットを検出することと、（Ｆ）標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつ標的プローブ、前増幅剤及び増幅剤の間の融解温度を下回る温度で試料をインキュベートし、それによって標的核酸の第１のサブセットに結合した標識プローブの第１のセットから標識を除去することと、（Ｇ）試料を、標識プローブの第２のセットと接触させることであって、標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第２のサブセットが、標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける標識が、標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、任意選択で、標識プローブと増幅剤との間の融解温度が、標的プローブ、前増幅剤及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、標識プローブの第２のセットが、標的核酸の第１のサブセットとは異なる複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｈ）標的核酸に結合した標識プローブの第２のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第２のサブセットを検出することであって、複数の標的核酸が検出される、検出することと、（Ｉ）試料を酸試薬と接触させて、それによって標的核酸に結合したプローブの結合を破壊することと、を含む（例えば、図２Ｂ及び６Ａ（Ｌ＝２であり、標識をＳＧＣから切断するのではなく、標識プローブは、標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつＳＧＣの他の構成成分間の融解温度を下回る温度を使用してＳＧＣから除去される）を参照されたい）。
一実施形態では、方法は、ステップ（Ｉ）の前に、（Ｊ）標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつ標的プローブ、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度を下回る温度で試料をインキュベートし、それによって標的核酸の第２のサブセットに結合した標識プローブの第２のセットから標識を除去することと、（Ｋ）試料を、標識プローブの第３のセットと接触させることであって、標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第３のサブセットが、標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける標識が、標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、任意選択で、標識プローブと増幅剤との間の融解温度が、標的プローブ、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、標識プローブの第３のセットが、標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｌ）標的核酸に結合した標識プローブの第３のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第３のサブセットを検出することと、を含む（例えば、図２Ｂ及び６Ａ（Ｌ＝３であり、標識をＳＧＣから切断するのではなく、標識プローブは、標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつＳＧＣの他の構成成分間の融解温度を下回る温度を使用してＳＧＣから除去される）を参照されたい）。
一実施形態では、方法は、ステップ（Ｊ）～（Ｌ）を１回以上繰り返すことを含む（例えば、図２Ｂ及び６Ａ（Ｌ＝４＋であり、標識をＳＧＣから切断するのではなく、標識プローブは、標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつＳＧＣの他の構成成分間の融解温度を下回る温度を使用してＳＧＣから除去される）を参照されたい）。
一実施形態では、細胞を酸試薬と接触させることは、１回以上繰り返される。
一実施形態では、方法は、ステップ（Ａ）～（Ｉ）またはステップ（Ａ）～（Ｈ）、（Ｊ）～（Ｌ）及び（Ｊ）を１回以上繰り返すことをさらに含む（例えば、図２Ｂ及び６Ａ（Ｋ＝２＋であり、標識をＳＧＣから切断するのではなく、標識プローブは、標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつＳＧＣの他の構成成分間の融解温度を下回る温度を使用してＳＧＣから除去される）を参照されたい）。そのような方法の一実施形態では、方法は、ステップ（Ａ）～（Ｈ）またはステップ（Ａ）～（Ｈ）及び（Ｊ）～（Ｌ）を繰り返すことをさらに含む。
一実施形態では、本発明は、複数の標的核酸を検出する方法を提供し、方法は、（Ａ）複数の核酸を含む細胞を含む試料を、複数の標的プローブのセットと接触させることであって、各標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの対を含む、接触させることと、（Ｂ）試料を、前－前増幅剤のセットと接触させることであって、前－前増幅剤のセットが、複数の前－前増幅剤を含み、複数の前－前増幅剤が、各標的プローブのセットに特異的な前－前増幅剤を含み、各前－前増幅剤が、標的プローブのセットのうちの１つの標的プローブの対に対する結合部位及び前増幅剤に対する複数の結合部位を含む、接触させることと、（Ｃ）試料を、前増幅剤のセットと接触させることであって、前増幅剤のセットが、各前－前増幅剤に特異的な前増幅剤の複数のサブセットを含み、前増幅剤の各サブセットが、複数の前増幅剤を含み、前増幅剤のサブセットの前増幅剤が、標的プローブのセットに特異的な前－前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、接触させることと、（Ｄ）試料を、増幅剤のセットと接触させることであって、増幅剤のセットが、前増幅剤の各サブセットに特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤の各サブセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤のサブセットの増幅剤が、前増幅剤のサブセットのうちの１つの前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、接触させることと、（Ｅ）試料を、標識プローブの第１のセットと接触させることであって、標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々における標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける標識が、標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、標識プローブと増幅剤との間の融解温度が、標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、標識プローブの第１のセットが、複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｆ）標的核酸に結合した標識プローブの第１のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第１のサブセットを検出することと、（Ｇ）標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつ標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度を下回る温度で試料をインキュベートし、それによって標的核酸の第１のサブセットに結合した標識プローブの第１のセットから標識を除去することと、（Ｈ）試料を、標識プローブの第２のセットと接触させることであって、標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第２のサブセットが、標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける標識が、標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、任意選択で、標識プローブと増幅剤との間の融解温度が、標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、標識プローブの第２のセットが、標的核酸の第１のサブセットとは異なる複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｉ）標的核酸に結合した標識プローブの第２のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第２のサブセットを検出することであって、複数の標的核酸が検出される、検出することと、（Ｊ）試料を酸試薬と接触させて、それによって標的核酸に結合したプローブの結合を破壊することと、を含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｂ（Ｌ＝２であり、標識をＳＧＣから切断するのではなく、標識プローブは、標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつＳＧＣの他の構成成分間の融解温度を下回る温度を使用してＳＧＣから除去される）を参照されたい）。
一実施形態では、方法は、ステップ（Ｊ）の前に、（Ｋ）標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつ標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤及び増幅剤の間の融解温度を下回る温度で試料をインキュベートし、それによって標的核酸の第２のサブセットに結合した標識プローブの第２のセットから標識を除去することと、（Ｌ）試料を、標識プローブの第３のセットと接触させることであって、標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第３のサブセットが、標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける標識が、標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、任意選択で、標識プローブと増幅剤との間の融解温度が、標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、標識プローブの第３のセットが、標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｍ）標的核酸に結合した標識プローブの第３のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第３のサブセットを検出することと、を含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｂ（Ｌ＝３であり、標識をＳＧＣから切断するのではなく、標識プローブは、標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつＳＧＣの他の構成成分間の融解温度を下回る温度を使用してＳＧＣから除去される）を参照されたい）。
一実施形態では、方法は、ステップ（Ｋ）～（Ｍ）を１回以上繰り返すことを含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｂ（Ｌ＝４＋であり、標識をＳＧＣから切断するのではなく、標識プローブは、標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつＳＧＣの他の構成成分間の融解温度を下回る温度を使用してＳＧＣから除去される）を参照されたい）。
一実施形態では、細胞を酸試薬と接触させることは、１回以上繰り返される。
一実施形態では、方法は、ステップ（Ａ）～（Ｊ）またはステップ（Ａ）～（Ｉ）、（Ｋ）～（Ｍ）及び（Ｊ）を１回以上繰り返すことをさらに含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｂ（Ｋ＝２＋であり、標識をＳＧＣから切断するのではなく、標識プローブは、標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつＳＧＣの他の構成成分間の融解温度を下回る温度を使用してＳＧＣから除去される）を参照されたい）。そのような方法の実施形態の１つでは、方法は、ステップ（Ａ）～（Ｉ）またはステップ（Ａ）～（Ｉ）及び（Ｋ）～（Ｍ）を繰り返すことをさらに含む。
一実施形態では、本発明は、複数の核酸を検出する方法を提供し、方法は、（Ａ）複数の核酸を含む細胞を含む試料を、複数の標的プローブのセットと接触させることであって、各標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの対を含む、接触させることと、（Ｂ）試料を、前－前増幅剤のセットと接触させることであって、前－前増幅剤のセットが、前－前増幅剤の複数の対を含み、前－前増幅剤のセットが、標的プローブのセットの標的プローブの対の各々に特異的な前－前増幅剤の対を含み、前－前増幅剤の対の各前－前増幅剤は、標的プローブのセットの標的プローブの対の標的プローブのうちの１つに対する結合部位を含み、前－前増幅剤が、前増幅剤に対する複数の結合部位を含む、接触させることと、（Ｃ）試料を、前増幅剤のセットと接触させることであって、前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、複数の前増幅剤が、前－前増幅剤の各対に特異的な前増幅剤を含み、各前増幅剤が、前－前増幅剤のセットの前－前増幅剤の対のうちの１つに対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、接触させることと、（Ｄ）試料を、増幅剤のセットと接触させることであって、増幅剤のセットが、前－前増幅剤の各対に特異的な各前増幅剤に特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤のサブセットの増幅剤が、前－前増幅剤の対に特異的な前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、接触させることと、（Ｅ）試料を、標識プローブの第１のセットと接触させることであって、標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々における標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける標識が、標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、標識プローブと増幅剤との間の融解温度が、標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、標識プローブの第１のセットが、複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｆ）標的核酸に結合した標識プローブの第１のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第１のサブセットを検出することと、（Ｇ）標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつ標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度を下回る温度で試料をインキュベートし、それによって標的核酸の第１のサブセットに結合した標識プローブの第１のセットから標識を除去することと、（Ｈ）試料を、標識プローブの第２のセットと接触させることであって、標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第２のサブセットが、標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける標識が、標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、任意選択で、標識プローブと増幅剤との間の融解温度が、標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、標識プローブの第２のセットが、標的核酸の第１のサブセットとは異なる複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｉ）標的核酸に結合した標識プローブの第２のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第２のサブセットを検出することであって、複数の標的核酸が検出される、検出することと、（Ｊ）試料を酸試薬と接触させて、それによって標的核酸に結合したプローブの結合を破壊することと、を含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｃ（Ｌ＝２であり、標識をＳＧＣから切断するのではなく、標識プローブは、標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつＳＧＣの他の構成成分間の融解温度を下回る温度を使用してＳＧＣから除去される）を参照されたい）。
一実施形態では、方法は、ステップ（Ｊ）の前に、（Ｋ）標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつ標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤及び増幅剤の間の融解温度を下回る温度で試料をインキュベートし、それによって標的核酸の第２のサブセットに結合した標識プローブの第２のセットから標識を除去することと、（Ｌ）試料を、標識プローブの第３のセットと接触させることであって、標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第３のサブセットが、標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける標識が、標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、任意選択で、標識プローブと増幅剤との間の融解温度が、標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、標識プローブの第３のセットが、標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識する、接触させることと、（Ｍ）標的核酸に結合した標識プローブの第３のセットの標識プローブを検出し、それによって標的核酸の第３のサブセットを検出することと、を含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｃ（Ｌ＝３であり、標識をＳＧＣから切断するのではなく、標識プローブは、標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつＳＧＣの他の構成成分間の融解温度を下回る温度を使用してＳＧＣから除去される）を参照されたい）。
一実施形態では、方法は、ステップ（Ｋ）～（Ｍ）を１回以上繰り返すことを含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｃ（Ｌ＝４＋であり、標識をＳＧＣから切断するのではなく、標識プローブは、標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつＳＧＣの他の構成成分間の融解温度を下回る温度を使用してＳＧＣから除去される）を参照されたい）。
一実施形態では、細胞を酸試薬と接触させることは、１回以上繰り返される。
一実施形態では、方法は、ステップ（Ａ）～（Ｊ）またはステップ（Ａ）～（Ｉ）、（Ｋ）～（Ｍ）及び（Ｊ）を１回以上繰り返すことをさらに含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｃ（Ｋ＝２＋であり、標識をＳＧＣから切断するのではなく、標識プローブは、標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつＳＧＣの他の構成成分間の融解温度を下回る温度を使用してＳＧＣから除去される）を参照されたい）。そのような方法の一実施形態では、方法は、ステップ（Ａ）～（Ｉ）またはステップ（Ａ）～（Ｉ）及び（Ｋ）～（Ｍ）を繰り返すことをさらに含む。
標的プローブのセットを使用する本発明の方法のいくつかの実施形態では、各標的プローブのセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイズする標的プローブの２つ以上の対を含む。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、酸試薬は、５～４０％もしくは２０～３０％の酸、または本明細書に開示される他の濃度を含む。一実施形態では、酸は、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、及びクエン酸からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、酸試薬は、塩を含む。一実施形態では、酸試薬は、ＳＳＣを含む。一実施形態では、酸試薬は、１倍～１３倍のＳＳＣまたは３．２倍～１２．８倍のＳＳＣを含む。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、標的核酸は独立して、ＤＮＡまたはＲＮＡである。一実施形態では、ＲＮＡである標的核酸は独立して、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ミトコンドリアＲＮＡ、及び非コードＲＮＡからなる群から選択される。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、試料は、組織標本であるか、または組織標本に由来する。本発明の方法のいくつかの実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料に由来する。本発明の方法のいくつかの実施形態では、試料は、細胞診試料であるか、または細胞診試料に由来する。
本発明の方法は、標的核酸のマルチプレックス検出に適用される。本明細書に開示されるように、本発明の方法は、標的核酸のサブセットの反復的な検出ラウンドで実施される。また、本明細書に開示されように、１回のラウンドで検出され得る標的核酸の数は、使用されている標識プローブの種類と、同時に検出する際に、異なる標的核酸に特異的な標識プローブを区別する能力に依存する。より高いレベルのマルチプレックスは、反復的なラウンドの検出及び酸処理によって達成される。例えば、図１に示される例示的な実施形態では、１回のラウンドの標識及び検出により、４個の標的核酸が検出され、２回目のラウンドの標識及び検出により、８個の標的核酸が検出され、３回目のラウンドの標識及び検出により、１２個の標的核酸が検出される。酸処理ステップを含むことにより、標的核酸の追加のセットを検出することができ、この特定の実施例では、同じ試料中の合計２４個の標的核酸に対して、最大１２個の追加の標的核酸を検出することができる。当業者は、本発明のアッセイで検出する標的核酸の所望の数を容易に判定できる。いくつかの実施形態では、本発明の方法において、２回のラウンドの標識及び検出が使用される。いくつかの実施形態では、３回のラウンドの標識及び検出が使用される。いくつかの実施形態では、各標的核酸を独自に標識及び検出するのに十分な数のＳＧＣがあり、かつＳＧＣが、標的核酸を検出するためのアッセイ条件の間、標的核酸に十分に結合したままである限り、４、５、６、７、８、９、または１０回以上のラウンドの標識及び検出を使用することができる。当業者は、本発明の方法で適用され得る標識及び検出のラウンドの回数を容易に判定することができ、各ラウンドで、標的核酸が検出され得る。
その後のラウンドの検出が試料に適用されるため、その後に得られた、標的核酸の検出を、以前に検出されたラウンド（複数可）の標的核酸の検出に登録することができ、それにより同じ試料内及びさらに同じ細胞内で検出された全ての標的核酸の発現を判定することができる（図１、２Ａ及び２Ｂを参照されたい）。標的核酸の検出のラウンドのレジストレーションは、異なるラウンドで検出された標的核酸の画像を重ね合わせる画像解析ソフトウェアを使用して達成され得る。複数の画像のアライメント及び重ね合わせのためのそのようなレジストレーションアルゴリズムは、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓｃａｌｅ－Ｉｎｖａｒｉａｎｔ Ｆｅａｔｕｒｅ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（ＳＩＦＴ）アルゴリズム（Ｌｏｗｅ”Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ Ｉｍａｇｅ Ｆｅａｔｕｒｅｓ ｆｒｏｍ Ｓｃａｌｅ－Ｉｎｖａｒｉａｎｔ Ｋｅｙｐｏｉｎｔｓ”，Ｉｎｔｅｒｎａｔ．Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｖｉｓｉｏｎ ６０（２）：９１－１１０（２００４））である。本質的に、これらのアルゴリズムは、入力画像と参照画像を比較して、移動及び回転に対応するための変換マトリックスを生成する。例えば、ＩｍａｇｅＪには、このタスクを自動的に実行できるツールが存在する（ｉｍａｇｅｊ．ｎｅｔ／Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９（７）：６７１－６７５（２０１２）、Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．８２（７－８）：５１８－５２９（２０１５））。
同じＳＳＧであるが、異なる標的核酸に対する異なる標的プローブのセットを含むＳＧＣアセンブリを利用することによって、追加のマルチプレックスを達成することができる。このような場合には、標的核酸のサブセットを標識する反復的なラウンドで検出されたＳＧＣ複合体を有する標的核酸の最初のセットを検出した後、ＳＧＣの標的核酸へのハイブリダイゼーションを変性させるのに適切な条件を用いて、ＳＧＣ複合体をその標的核酸から除去することができる。ＳＧＣ複合体が試料から除去されると、同じ前増幅剤／増幅剤／標識プローブ、または同じ前－前増幅剤／前増幅剤／増幅剤／標識プローブは、１回目のラウンドのＳＧＣ検出で検出された標的核酸の異なるセットに特異的となるように設計した標的プローブのセットとともに使用され得る。このようにして、追加の標的核酸の検出を達成することができる。本明細書に記載される場合、さらなるマルチプレックスは、試料を酸処理して、結合した標的プローブ及びＳＧＣを除去し、次いで、任意選択で、同じＳＧＣを再利用することによって達成することができるが、異なる標的核酸を標的とし、その後のラウンドで異なる標的核酸を標識する。
さらに別の実施形態では、本発明の方法は、二本鎖核酸及び一本鎖核酸の同時検出、例えば、同じ試料内のＤＮＡ及びＲＮＡの検出に適用できる。このような場合には、プローブは、ＲＮＡのような一本鎖核酸を検出するように（例えば、米国特許第７，７０９，１９８号、米国公開２００８／００３８７２５、２００９／００８１６８８、及び２０１７／０１０１６７２を参照されたい）、かつ二本鎖核酸を検出するように設計して、同じ試料内で、二本鎖核酸及び一本鎖核酸の両方（ＤＮＡ及びＲＮＡなど）を検出できるようにできる。
いくつかの実施形態では、標的核酸に特異的である各標的プローブのセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの２つ以上の対を含む。このような場合には、標的核酸に特異的な標的プローブのセットにおける標的プローブの対は、標的核酸の異なる非重複配列に結合する。同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションできる標的プローブ対を２対以上有する標的プローブのセットを使用する場合には、それらの標的プローブ対に結合する分子、すなわち、前増幅剤（図５Ａ及び６Ａを参照されたい）または前－前増幅剤（図５Ｂ、５Ｃ、６Ｂ及び６Ｃを参照されたい）のいずれかは、同じ標的プローブのセットにおける標的プローブ対において、概ね同じである。したがって、同じ標的核酸に結合する標的プローブ対は、それらの標的プローブ対に結合する、ＳＧＣにおける上記分子、すなわち、前増幅剤または前－前増幅剤に対する同じ結合部位を含むように設計できる。標的核酸を検出するために、複数の標的プローブ対を使用することにより、同じ標的核酸上で、複数のＳＧＣからなるアセンブリと関連付けられたさらに高度なシグナルが得られる。いくつかの実施形態では、同じ標的核酸に結合させるのに使用される標的プローブ対の数は、標的当たり１～１０対、１～２０対、１～３０対、１～４０対、１～５０対、１～６０対、１～７０対、１～８０対、１～９０対、１～１００対、１～１１０対、１～１２０対、１～１３０対、１～１４０対、１～１５０対、１～１６０対、１～１７０対、１～１８０対、１～１９０対、１～２００対の範囲もしくはこれを上回る数の対であるか、またはこれらの間のいずれかの整数分の対、例えば、１対、２対、３対、４対、５対、６対、７対、８対、９対、１０対、１１対、１２対、１３対、１４対、１５対、１６対、１７対、１８対、１９対、２０対、２１対、２２対、２３対、２４対、２５対、２６対、２７対、２８対、２９対、３０対、３１対、３２対、３３対、３４対、３５対、３６対、３７対、３８対、３９対、４０対、４１対、４２対、４３対、４４対、４５対、４６対、４７対、４８対、４９対、５０対、５１対、５２対、５３対、５４対、５５対、５６対、５７対、５８対、５９対、６０対、６１対、６２対、６３対、６４対、６５対、６６対、６７対、６８対、６９対、７０対、７１対、７２対、７３対、７４対、７５対、７６対、７７対、７８対、７９対、８０対、８１対、８２対、８３対、８４対、８５対、８６対、８７対、８８対、８９対、９０対、９１対、９２対、９３対、９４対、９５対、９６対、９７対、９８対、９９対、１００対、１０１対、１０２対、１０３対、１０４対、１０５対、１０６対、１０７対、１０８対、１０９対、１１０対、１１１対、１１２対、１１３対、１１４対、１１５対、１１６対、１１７対、１１８対、１１９対、１２０対、１２１対、１２２対、１２３対、１２４対、１２５対、１２６対、１２７対、１２８対、１２９対、１３０対、１３１対、１３２対、１３３対、１３４対、１３５対、１３６対、１３７対、１３８対、１３９対、１４０対、１４１対、１４２対、１４３対、１４４対、１４５対、１４６対、１４７対、１４８対、１４９対、１５０対、１５１対、１５２対、１５３対、１５４対、１５５対、１５６対、１５７対、１５８対、１５９対、１６０対、１６１対、１６２対、１６３対、１６４対、１６５対、１６６対、１６７対、１６８対、１６９対、１７０対、１７１対、１７２対、１７３対、１７４対、１７５対、１７６対、１７７対、１７８対、１７９対、１８０対、１８１対、１８２対、１８３対、１８４対、１８５対、１８６対、１８７対、１８８対、１８９対、１９０対、１９１対、１９２対、１９３対、１９４対、１９５対、１９６対、１９７対、１９８対、１９９対、２００対などである。
本発明の方法を利用して、所望の標的核酸の検出を達成することができる。一実施形態では、複数の標的プローブ対を用いて標的核酸を検出する。このような場合には、標的核酸への複数のＳＧＣのアセンブリを可能にするように、標的プローブ対は、標的核酸の２つ以上の領域に結合するように設計される。複数の標的プローブ対が同じ標的核酸に結合するために使用されている場合、１つの標的プローブ対の標的結合部位は、別の標的プローブ対の標的結合部位と重複しないことを理解されたい。
本発明の一実施形態では、本発明の方法によって検出される標的核酸は、これらに限定されないが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ミトコンドリアＲＮＡ、非コードＲＮＡなど、またはＤＮＡなどを含むＲＮＡを含む、細胞試料中に存在する任意の核酸であり得る。特定の実施形態では、核酸は、ＲＮＡである。核酸のマルチプレックス検出のための本発明の方法では、標的核酸は独立して、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得ることを理解されたい。言い換えると、検出される標的核酸は、同じ種類の核酸であることができるが、必ずしもそうではない。したがって、本発明のアッセイにおいて検出される標的核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡであり得る。標的核酸がＲＮＡである場合には、標的核酸は独立して、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ミトコンドリアＲＮＡ、及び非コードＲＮＡからなる群から選択され得ることを理解されたい。したがって、標的核酸は、独立して、ＤＮＡまたは任意の種類のＲＮＡであり得る。
本明細書に記載されるように、本発明の方法は、概して、標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出に関する。核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のための方法は、当業者に周知である（例えば、ＵＳ２００８／００３８７２５、ＵＳ２００９／００８１６８８、Ｈｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．３５：５９５－６０１（２００４）を参照されたい）。本明細書で使用される場合、「ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション」または「ＩＳＨ」とは、プローブなどの、直接または間接的に標識した相補的なＤＮＡ鎖またはＲＮＡ鎖を用いて、試料、特に、組織または細胞の一部または切片（ｉｎ ｓｉｔｕ）におけるＤＮＡまたはＲＮＡなどの特定の核酸に結合して、その核酸を局在化するタイプのハイブリダイゼーションを指す。プローブの種類は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、一本鎖相補的ＲＮＡ（ｓｓｃＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ、ミトコンドリアＲＮＡ及び／または合成オリゴヌクレオチドであり得る。「蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション」または「ＦＩＳＨ」という用語は、蛍光標識を利用するタイプのＩＳＨを指す。「発色ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション」または「ＣＩＳＨ」という用語は、発色標識を用いるタイプのＩＳＨを指す。ＩＳＨ、ＦＩＳＨ、及びＣＩＳＨ法は、当業者に周知である（例えば、Ｓｔｏｌｅｒ，Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０（１）：２１５－２３６（１９９０）；Ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９２）；Ｓｃｈｗａｒｚａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｈｅｓｌｏｐ－Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ（２０００）を参照されたい）。
これらに限定されないが、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたはフローサイトメトリーを含む、細胞内の核酸標的のｉｎ ｓｉｔｕ検出のための本発明の方法について、標的プローブのハイブリダイゼーション前に、細胞は、任意に固定及び／または透過処理される。細胞を固定及び透過処理することで、核酸標的が細胞内に留まるように促し、標的プローブ、標識プローブ、増幅剤、前増幅剤、前－前増幅剤などが細胞内に入って、標的核酸分子に到達することを可能にする。細胞を任意選択で洗浄して、核酸標的に捕捉されなかった物質を除去する。様々なステップのうちのいずれの後も、例えば、未結合の標的プローブを除去するために、標的プローブを核酸標的にハイブリダイゼーションした後、前－前増幅剤、前増幅剤、増幅剤、及び／または標識プローブを標的プローブにハイブリダイゼーションした後に、細胞を洗浄することができる。核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のために、細胞を固定及び透過処理する方法、ならびに標的核酸をハイブリダイゼーション、洗浄、及び検出する方法もまた、当該技術分野で周知である（例えば、ＵＳ２００８／００３８７２５、ＵＳ２００９／００８１６８８、Ｈｉｃｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｈｉｓｔｏｌ．３５：５９５－６０１（２００４）、Ｓｔｏｌｅｒ，Ｃｌｉｎｉｃｓ ｉｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １０（１）：２１５－２３６（１９９０）、Ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ．Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９２）、Ｓｃｈｗａｒｚａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｈｅｓｌｏｐ－Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ，Ｏｘｆｏｒｄ（２０００）、Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）、Ｏｒｍｅｒｏｄ，Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９９）を参照されたい）。例示的な固定剤としては、これらに限定されないが、アルデヒド（ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）、アセトン、アルコール（メタノール、エタノールなど）が挙げられる。例示的な浸透化剤としては、これらに限定されないが、アルコール（メタノール、エタノールなど）、酸（氷酢酸など）、洗浄剤（Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ－４０、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０など）、サポニン、ジギトニン、Ｌｅｕｃｏｐｅｒｍ（商標）（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、ならびに酵素（例えば、リゾチーム、リパーゼ、プロテアーゼ及びペプチダーゼ）が挙げられる。透過処理は、組織薄切片におけるように、機械的破砕によって行うこともできる。
二本鎖核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出について、概して、試料を処理して、試料中の二本鎖核酸を変性させ、標的プローブを到達可能にして、標的プローブが、ハイブリダイゼーションによって、標的二本鎖核酸のうちの一本鎖に結合するようにする。二本鎖核酸を変性させるための条件は、当該技術分野で周知であり、熱及び化学物質、例えば、塩基（ＮａＯＨ）、ホルムアミド、ジメチルスルホキシドなどによる変性を含む（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ Ｔｏｘｉｃｏｌ．２９：ｅ２０１４００７（ｄｏｉ：１０．５６２０／ｅｈｔ．２０１４．２９．ｅ２０１４００７）２０１４、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９））。例えば、ＮａＯＨ、ＬｉＯＨもしくはＫＯＨ、またはその他の高ｐＨ緩衝剤（ｐＨ１１超）を用いて、ＤＮＡのような二本鎖核酸を変性させることができる。加えて、熱による変性方法と、化学物質による変性方法は、組み合わせて使用され得る。
このようなｉｎ ｓｉｔｕ検出方法は、ガラススライドに固定化した組織標本、血液試料から単離した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などの懸濁液中の単一細胞などに対して使用され得る。組織標本としては、例えば、組織生検試料が挙げられる。血液試料には、例えば、診断目的で採取した血液試料が含まれる。血液試料の場合、血液塗抹標本におけるように、血液を直接解析でき、あるいは、血液を処理して、例えば、赤血球細胞の溶解、ＰＢＭＣまたは白血球の単離、標的細胞の単離などを行って、試料中の細胞のうち、本発明の方法によって解析する細胞が、血液試料中に存在するように、または血液試料から抽出されるようにできる。同様に、組織標本の処理を行うことができ、例えば、組織標本を細かく切断し、物理的または酵素的に処理して、組織を破壊して、個々の細胞または細胞クラスターの状態にすることができる。さらに、所望である場合、細胞診試料を処理して、細胞を単離するか、または細胞クラスターを破壊することができる。したがって、組織、血液、及び細胞診試料は、当該技術分野で周知の方法を使用して取得及び処理することができる。本発明の方法は、病態を示すバイオマーカーである核酸標的の有無に基づき、病的細胞の有無を特定する診断用途で使用され得る。
本発明の方法を用いて標的核酸を検出するために、いずれかの数の好適な試料を使用することができることが、当業者には理解される。本発明の方法で使用するための試料は、概して、生体試料または組織試料となる。このような試料は、生体対象から得ることができ、個体または何らかの他の生体物質源（生検体、剖検体または鑑定物質など）から採取される生体組織または体液由来の試料が挙げられる。生体試料には、前がん細胞、がん細胞、前がん組織もしくはがん組織を含むか、またはその細胞もしくは組織を含む疑いのある、生体対象の領域からの試料、例えば、組織生検体（細針吸引物、血液試料または細胞診標本が挙げられる）も含まれる。このような試料は、これらに限定されないが、哺乳動物のような生物から単離した器官、組織、組織断片、及び／または細胞であり得る。例示的な生体試料としては、これらに限定されないが、細胞培養物（初代細胞培養物を含む）、細胞株、組織、器官、細胞小器官、生体液などが挙げられる。追加の生体試料としては、これらに限定されないが、皮膚試料、組織生検体（細針吸引物を含む）、細胞診試料、便、体液（血液及び／または血清の試料、唾液、精液を含む）などが挙げられる。このような試料は、医学または獣医学における診断目的で用いることができる。試料は、他の供給源、例えば、食物、土壌、物体表面など、及び標的核酸の検出が望まれるその他の物質から得ることができる。したがって、本発明の方法は、個体またはその他の供給源から採取した生体試料から、１つ以上の病原体（ウイルス、細菌、真菌、寄生虫のような単細胞生物など）を検出するのに用いることができる。
本発明の方法による分析用の細胞診試料の採取は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｄｅｙ，“Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ，Ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ”ｉｎ Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ ｐｐ．１２１－１３２，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ（２０１８）、“Ｎｏｎ－Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ”Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ａｄｏｐｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ＡＳＣ ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ ｂｏａｒｄ Ｍａｒｃｈ ２，２００４を参照されたい）。子宮頸部組織の分析用に、試料（組織生検体及び細胞診試料を含む）を処理する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｃｅｃｉｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｂｅｎｎｅｔｔ ａｎｄ Ｐｌｕｍ，ｅｄｓ．，２０ｔｈ ｅｄ．，ＷＢ Ｓａｕｎｄｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９６）、Ｃｏｌｐｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ：Ａ Ｂｅｇｉｎｎｅｒ’ｓ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｌｌｏｒｓ ａｎｄ Ｓａｎｋａｒａｎａｒａｙａｎａｎ，ｅｄｓ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ａｇｅｎｃｙ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｎ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ（２００３）、Ｋａｌａｆ ａｎｄ Ｃｏｏｐｅｒ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．６０：４４９－４５５ （２００７）、Ｂｒｏｗｎ ａｎｄ Ｔｒｉｍｂｌｅ，Ｂｅｓｔ Ｐｒａｃｔ．Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎａｅｃｏｌ．２６：２３３－２４２（２０１２）、Ｗａｘｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．１２０：１４６５－１４７１（２０１２）、Ｃｅｒｖｉｃａｌ Ｃｙｔｏｌｏｇｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ＴＯＣ，Ａｐｐｒｏｖｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ（ＡＳＣ）Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ Ｂｏａｒｄ，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １０，２０００）を参照されたい）。一実施形態では、細胞診試料は、子宮頸部試料、例えば、パップスメアである。一実施形態では、試料は、細針吸引物である。
本発明の特定の実施形態では、試料は、組織標本であるか、または組織標本に由来する。本発明の別の特定の実施形態では、試料は、血液試料であるか、または血液試料に由来する。本発明のさらに他の特定の実施形態では、試料は、細胞診試料であるか、または細胞診試料に由来する。
本発明は、標的核酸を検出可能な標識で標識するために、標的核酸間に複合体を構築することに基づく。このような複合体は、シグナル生成複合体（ＳＧＣ、例えばＵＳ２０１７０１０１６７２を参照されたい）と称する場合がある。このような複合体、すなわちＳＧＣは、標的核酸への多数の標識の結合を可能にする分子の層を構築することによって達成される。
本発明の方法では、シグナル生成複合体（ＳＧＣ）を用いることができ、ＳＧＣは、１つの分子ではなく、複数の分子を含む。このようなＳＧＣは、検出可能なシグナルを増幅し、標的核酸のより高感度な検出を提供するために特に有用である。シグナルを増幅するためのそのような方法は、例えば、米国特許第５，６３５，３５２号、第５，１２４，２４６号、第５，７１０，２６４号、第５，８４９，４８１号、及び第７，７０９，１９８号、ならびに米国公開２００８／００３８７２５及び２００９／００８１６８８、ならびにＷＯ２００７／００１９８６及びＷＯ２０１２／０５４７９５に記載されており、これらの各々が参照により本明細書に組み込まれる。ＳＧＣの生成は、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）アッセイの原理である（米国特許第７，７０９，１９８号、第８，６５８，３６１号、及び第９，３１５，８５４号、米国公開２００８／００３８７２５、２００９／００８１６８８、及び２０１６／０２０１１１７、ならびにＷＯ２００７／００１９８６及びＷＯ２０１２／０５４７９５を参照されたく、これらの各々が参照により本明細書に組み込まれる）。
基本的なシグナル生成複合体（ＳＧＣ）は、図５Ａに示されている（参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００９／００８１６８８もまた参照されたい）。「Ｚ」の対として図５に示される標的プローブの対は、「標的」と標識された相補滴な分子配列にハイブリダイゼーションする。各標的プローブは、前増幅剤分子（ＰＡ、緑色で示される）と相補的な追加の配列を含み、このＰＡは、安定して結合するためには、標的プローブ対の両方のメンバーに同時にハイブリダイゼーションしなければならない。前増幅剤分子は、各標的プローブにハイブリダイゼーションする領域を有する１つのドメインと、増幅剤分子（Ａｍｐ、黒色で示される）上の配列とそれぞれ相補的な一連のヌクレオチド配列リピートを含む１つのドメインという２つのドメインから構成される。この配列において複数のリピートが存在することで、１つの前増幅剤に複数の増幅剤分子がハイブリダイゼーション可能になり、それにより、全体のシグナル増幅が増加する。各増幅剤分子は、前増幅剤にハイブリダイゼーションする領域を有する１つのドメインと、標識プローブ（ＬＰ、黄色で示される）上の配列とそれぞれ相補的な一連のヌクレオチド配列リピートを含む１つのドメインという２つのドメインから構成され、このことにより、複数の標識プローブが各増幅剤分子にハイブリダイゼーション可能になり、それにより、全体のシグナル増幅がさらに増大する。各標識プローブは、２つの構成成分を含む。１つの構成成分は、標識プローブをハイブリダイゼーションするように、増幅剤分子上のリピート配列と相補的なヌクレオチド配列から構成される。このヌクレオチド配列は、第２の構成成分に連結されており、この第２の構成成分は、本明細書に記載されるように、直接可視化するための蛍光標識もしくは発色標識、直接検出可能な金属同位体、または蛍光、発色、もしくは他の検出可能なシグナルを生成する化学反応を促進することができる酵素もしくは他の化学物質を含む、いずれかのシグナル生成物であり得る。図５Ａでは、標識プローブは、核酸成分を表す線と、シグナル生成成分を表す星印として描かれている。総称して、標的プローブから標識プローブまでのアセンブリは、シグナル生成複合体（ＳＧＣ）と称される。
図５Ｂは、増幅分子層、この場合では、前－前増幅剤分子（ＰＰＡ、赤色で示される）を加えることによって増強されたＳＧＣを示す。ＰＰＡは、一方のドメインでは、両方の標的プローブに結合し、もう一方のドメインでは、複数の前増幅剤（ＰＡ）に結合する。
図５Ｃは、前増幅剤レベルで連携的ハイブリダイゼーションを利用する異なるＳＧＣ構造を示す（参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１７／０１０１６７２を参照されたい）。図５Ａ及び５Ｂで形成されるＳＧＣと同様に、標的プローブの対は、標的分子配列にハイブリダイゼーションする。各標的プローブは、固有の前－前増幅剤分子（ＰＰＡ－１、紫色で示される；ＰＰＡ－２、赤色で示される）と相補的な追加の配列を含む。２つの独立した分子を使用することで、連携的ハイブリダイゼーションを必要とされ得る土台が確立される。各前－前増幅剤分子は、標的プローブのうちの１つにハイブリダイゼーションする領域を有する１つのドメインと、前増幅剤分子（ＰＡ、緑色で示される）内の配列と相補的な配列を両方がそれぞれ含む１連のヌクレオチド配列リピートを含む１つのドメイン配列という２つのドメイン、ならびにＰＰＡとＰＡの結合効率を促進するスペーサー配列から構成される。成長しているＳＧＣに安定して結合するように、各ＰＡは、両方のＰＰＡ分子に同時にハイブリダイゼーションしなければならない。各前増幅剤分子は、ハイブリダイゼーションを可能にするように、両方の前－前増幅剤と相補的な配列を含む１つのドメインと、増幅剤分子（ＡＭＰ、黒色で示される）上の配列とそれぞれ相補的な１連のヌクレオチド配列リピートを含む１つのドメインという２つのドメインから構成される。増幅剤ハイブリダイゼーション配列の複数の繰り返しにより、複数の増幅剤分子が各前増幅剤へのハイブリダイゼーションが可能になり、シグナル増幅がさらに増加する。図の簡略化のために、増幅剤分子は、１つの前増幅剤分子にハイブリダイゼーションするように示されているが、増幅剤が、各前増幅剤に結合できることが理解される。各増幅剤分子は、標識プローブ（ＬＰ、黄色で示される）内の配列と相補的な一連のヌクレオチド配列リピートを含み、これにより、数個の標識プローブが、各増幅剤分子へハイブリダイゼーションすることを可能にする。各標識プローブは、シグナルを検出させるためのシグナル生成エレメントを含む。
上記のように、図５Ａ、５Ｂ、６Ａ、もしくは６Ｂに示される構成、または図５Ｃ及び６Ｃに示される構成を用いるかにかかわらず、ＳＧＣを構築するには、両方の標的プローブの結合が必要となるように、ＳＧＣの成分を設計する。図５Ａ、５Ｂ、６Ａ、または６Ｂの構成の場合には、前増幅剤（または図５Ｂ及び６Ｂの前－前増幅剤）は、安定な結合を実現させるには、標的プローブ対のメンバーの両方に結合しなければならない。このことは、標的プローブの両方と前増幅剤（または前－前増幅剤）との結合の融解温度（Ｔｍ）が、１つの標的プローブと前増幅剤（または前－前増幅剤）との結合のＴｍよりも高くなるように、かつ１つの標的プローブが結合している状態が、アッセイ条件下では不安定になるように、標的プローブと前増幅剤（または前－前増幅剤）との結合部位を設計することによって実現する。この設計は、例えば、米国特許第７，７０９，１９８号、米国公開２００８／００３８７２５及び２００９／００８１６８８、ＷＯ２００７／００１９８６、ＷＯ２００７／００２００６、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，上記，２０１２、Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，上記，２０１６に以前に説明されている。ＳＧＣの構成成分をこの方法で構成することによって、両方の標的プローブが標的核酸及び前増幅剤に結合すると、ＳＧＣのアセンブルが行われ、それによって、ＳＧＣが偽陽性としてアセンブルされるのが最小限に抑えられることに起因して、バックグラウンドノイズが軽減される。
図５Ｃ及び６Ｃの構成の場合、それぞれ標的プローブ対の両方のメンバーに逐次に結合している前－前増幅剤の両方に前増幅剤が結合することを必要とすることによって、標的プローブ対のメンバーの両方が標的核酸に結合した場合のみに、ＳＧＣが形成されなければならないという要件が実現する。両方の前－前増幅剤と前増幅剤との結合の融解温度（Ｔｍ）が、いずれかの前－前増幅剤単独の融解温度よりも高くなるように、かつ前－前増幅剤のうちの１つが前増幅剤に結合している状態が、アッセイ条件下では不安定になるように、前－前増幅剤と前増幅剤との結合部位を設計することによって、上記の要件が実現する。この設計は、例えば、ＵＳ２０１７０１０１６７２、ＷＯ２０１７／０６６２１１、及びＢａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，上記，２０１７に以前に説明されている。前増幅剤が、両方の前－前増幅剤に結合しない限り、増幅剤及び標識プローブは、標的核酸に結合したＳＧＣにアセンブルできず、それによって、ＳＧＣが偽陽性としてアセンブルされるのが最小限に抑えられることに起因して、バックグラウンドノイズが軽減される。
本明細書で開示されるように、方法は、細胞内の標的核酸の存在を検出するために、標的核酸に結合したシグナル生成複合体（ＳＧＣ）を構築することに基づくことができる。核酸のハイブリダイゼーション反応を利用して、ＳＧＣの成分を標的核酸に結合させるように、ＳＧＣを構築するための構成成分は、概して、核酸を含む。適切な領域を選択して、標的核酸に結合する特異的かつ選択的な試薬、具体的には、標的核酸に特異的かつ選択的に結合するオリゴヌクレオチドまたはプローブ、またはＳＧＣの他の構成成分を設計する方法は、当業者に周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９）を参照されたい）。標的プローブは、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションするように設計される。適切な選択の標的核酸領域、及び適切な長さの結合剤（オリゴヌクレオチドまたはプローブなど）を用いて、所望の特異性を実現でき、このような選択方法は、当業者に周知である。したがって、当業者は、１つの特定の標的核酸を、別の標的核酸に標的化するか、またはＳＧＣの構成成分への結合を提供するのに使用され得る適切な試薬（オリゴヌクレオチドまたはプローブなど）を容易に把握し、容易に決定することができる。標的特異的ＳＧＣの所与の構成成分（例えば、標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、増幅剤、標識プローブ）が、それぞれの構成成分に結合して、ＳＧＣが、特異的標的には結合するように、固有配列の適切な選択を用いることによって、標的特異的ＳＧＣにおいて、同様の特異性が実現され得る（図６を参照されたい）。
本明細書に記載されるように、本発明の実施形態は、標的プローブ対の使用を含む。標的プローブ対が、同じ前増幅剤（図５Ａ及び６Ａ）または前－前増幅剤（図５Ｂ及び５Ｂ）に結合する場合には、「Ｚ」構成と時に称されるプローブ構成が使用され得る。感度を上昇させ、バックグラウンドを軽減するためのこのような構成及びその利点は例えば、米国特許第７，７０９，１９８号、米国公開２００８／００３８７２５及び２００９／００８１６８８、ならびにＷＯ２００７／００１９８６及びＷＯ２００７／００２００６で説明されており、これらの各々が参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第７，７０９，１９８号、ならびに米国公開２００８／００３８７２５及び２００９／００８１６８８には、加えて、標的プローブ対のような標的プローブの特徴（長さ、配向、ハイブリダイゼーション条件などを含む）の選択に関する詳細が記載されている。当業者は、本明細書、ならびに例えば、米国特許第７，７０９，１９８号、米国公開２００８／００３８７２５、２００９／００８１６８８、ＷＯ２００７／００１９８６、及びＷＯ２００７／００２００６の教示に基づき、好適な構成を容易に特定できる。
本明細書に記載されるように、標的プローブ対における標的プローブの標的結合部位は、いずれかの所望の配向及び組み合わせであることができる。例えば、標的プローブ対のメンバーの１つの標的結合部位は、前増幅剤または前－前増幅剤の結合部位の５’または３’側であることができ、標的プローブ対のもう一方のメンバーは独立して、前増幅剤または前－前増幅剤の結合部位の５’または３’側に標的結合部位を有する配向にできる。
別の実施形態では、標的核酸の存在を検出するのに用いるＳＧＣは、ＳＧＣの１つ以上の構成成分が連携的にハイブリダイゼーションすることに基づくものである（ＵＳ２０１７０１０１６７２及びＷＯ２０１７／０６６２１１を参照されたく、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる）。このような連携的ハイブリダイゼーションは、本明細書ではＢａｓｅＳｃｏｐｅ（商標）とも称される。連携的ハイブリダイゼーションの効果では、ＳＧＣの２つの構成成分間の結合は、２つの結合部位によって媒介され、その２つの部位が同時に結合した場合の融解温度は、１つの部位が単独で結合した場合の融解温度よりも高い（ＵＳ２０１７０１０１６７２及びＷＯ２０１７／０６６２１１を参照されたい）。連携的ハイブリダイゼーションの効果は、ＵＳ２０１７０１０１６７２及びＷＯ２０１７／０６６２１１に記載されているような標的プローブのセット構成によって増強され得る。
本発明の方法及び関連する組成物では、連携的ハイブリダイゼーションを用いて、核酸標的のｉｎ ｓｉｔｕ検出（複雑な生理化学的環境及び圧倒的な数の非標的分子の存在により、ノイズが高くなり得る）において、特異性を向上させるとともに、バックグラウンドを軽減することができる。このような連携的ハイブリダイゼーション法を用いて、ＳＧＣが標的核酸に結合した場合のみに、標識プローブを結合させる。ＵＳ２０１７０１０１６７２及びＷＯ２０１７／０６６２１１に記載され、その図１に示されるように、方法は、ＳＧＣの１つ以上の構成成分における連携的ハイブリダイゼーションの回数を増加させることによって、所望のシグナルノイズ比を提供するように容易に修正され得る。
別の実施形態では、連携的ハイブリダイゼーションは、ＳＧＣの様々な構成成分に適用できる。例えば、ＳＧＣの構成成分間の結合は、本明細書に記載されるように、安定な反応であり得、あるいは、結合は、本明細書にまた記載されるように、連携的ハイブリダイゼーションを必要とするように構成され得る。このような場合、連携的ハイブリダイゼーションが想定される結合構成成分は、別の構成成分に結合する２つのセグメントを含むように設計する。
すなわち、標的核酸を検出する方法は、標的核酸に特異的に結合するＳＧＣをもたらす検出システムにおける構成成分のいずれか１つまたは全部の結合反応に、連携的ハイブリダイゼーションを用いることができる。いくつの成分かつどの成分に連携的ハイブリダイゼーションを適用するかは、所望のアッセイ条件、アッセイする試料の種類、所望のアッセイ感度などに基づいて選択できる。連携的ハイブリダイゼーション結合反応のいずれか１つまたはそれらを組み合わせたものを使用して、アッセイの感度及び特異性を向上できる。本発明の実施形態では、連携的ハイブリダイゼーションは、前－前増幅剤及び前増幅剤の間、前増幅剤及び増幅剤の間、増幅剤及び標識プローブの間、またはこれらの組み合わせであることができる（例えば、ＵＳ２０１７０１０１６７２及びＷＯ２０１７／０６６２１１を参照されたい）。
本明細書に開示されるように、構成成分は、概して、互いに直接結合される。核酸含有成分の場合、結合反応は、概して、ハイブリダイゼーションによるものである。ハイブリダイゼーション反応の場合、構成成分間の結合は、直接的な結合である。所望である場合、ある１つの構成成分と別の構成成分との結合が間接的な結合になるように、中間構成成分を含めることができ、例えば、中間構成成分は、２つの他の成分を架橋するための相補的な結合部位を含む。
本明細書に記載されるように、様々な構成成分の構成は、所望の安定的または連携的ハイブリダイゼーション結合反応をもたらすように選択できる（例えば、ＵＳ２０１７０１０１６７２を参照されたい）。本明細書において、結合反応が安定な反応として例示されていても、または連携的ハイブリダイゼーションにおけるように、不安定な反応として例示されていても、そのいずれの結合反応も、標的核酸が検出される限りは、所望に応じて改変できることを理解されたい。さらに、使用するアッセイ条件及びハイブリダイゼーション条件に応じて、構成を変更及び選択できることを理解されたい。概して、結合反応が安定的であることが望ましい場合には、構成成分間の相補的な核酸配列のセグメントは、概して、１０～５０ヌクレオチド、またはそれ以上、例えば、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４１ヌクレオチド、４２ヌクレオチド、４３ヌクレオチド、４４ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、４６ヌクレオチド、４７ヌクレオチド、４８ヌクレオチド、４９ヌクレオチド、もしくは５０ヌクレオチド、またはそれ以上など、１６～３０ヌクレオチドの範囲である。連携的ハイブリダイゼーション結合反応を用いる場合など、結合反応が、比較的不安定であることが望ましい場合には、構成成分間の相補的な核酸配列のセグメントは、概して、５～１８ヌクレオチドの範囲、例えば、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、または１８ヌクレオチドである。このヌクレオチド長は、安定または不安定なハイブリダイゼーションのためには、アッセイで用いる配列（例えばＧＣ含有率）及び条件に応じて、上記よりも若干短いことも長いことも可能であることを理解されたい。さらに、本明細書で開示されるように、ロックト核酸（ＬＮＡ）または架橋型核酸（ＢＮＡ）のような修飾ヌクレオチドを用いて、修飾塩基において結合強度を向上させることによって、結合セグメントの長さを短縮させることができることを理解されたい。すなわち、他の核酸セグメントと相補的である核酸セグメントの長さについては、望ましい場合には、本明細書に記載されている長さをさらに短縮できることを理解されたい。当業者は、核酸成分間の相互作用が所望のものとなるように、長さ、修飾ヌクレオチドの存在などを含む適切なプローブデザインを容易に判断できる。
相補的な配列を含む２つの核酸配列間の結合部位を設計する際には、相補的な配列は、任意選択で、融解温度差（ｄＴｍ）が最大になるように設計され得る。これは、当該技術分野で既知である融解温度算出アルゴリズムを用いることによって行うことができる（例えば、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１４６０－１４６５（１９９８）を参照されたい）。加えて、ロックト核酸（ＬＮＡ）または架橋型核酸（ＢＮＡ）のような人工的な修飾塩基、及び天然の２’－Ｏ－メチルＲＮＡは、相補対間の結合強度を高めることが知られている（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７４－８１（２００３）、Ｍａｊｌｅｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：２２２４－２２２９（１９９８））。これらの修飾塩基は戦略的に、所望に応じて、ＳＧＣの構成成分間の結合部位に導入され得る。
アプローチの１つは、修飾ヌクレオチド（ＬＮＡ、ＢＮＡ、または２’－Ｏ－メチルＲＮＡ）を利用することである。各修飾塩基は、融解温度を上昇させることができるため、２つの核酸配列（すなわち、相補的な配列）間の結合領域の長さを実質的に短縮することができる。修飾塩基のその補体への結合強度はより強く、融解温度（ｄＴｍ）の差が大きくなる。さらに別の実施形態は、例えば、ハイブリダイゼーションすることになるシグナル生成複合体（ＳＧＣ）の核酸成分の相補的な配列内、または２つの核酸成分間で、３つの修飾塩基（例えば、３つのＬＮＡ、ＢＮＡもしくは２’－Ｏ－メチルＲＮＡ塩基、または２つもしくは３つの異なる修飾塩基を組み合わせたもの）を用いることである。このような構成成分は例えば、前－前増幅剤、前増幅剤、増幅剤、標識プローブ、または標的プローブの対であり得る。
ＬＮＡまたはＢＮＡのような修飾塩基は、ＳＧＣの選択された構成成分のセグメント、具体的には、核酸成分間の結合を媒介するセグメントで用いることができ、それにより、その塩基と、その相補的塩基との結合強度を向上して、その相補的なセグメントの長さを短縮可能にする（例えば、Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：７４－８１（２００３）、米国特許第７，３９９，８４５号を参照されたい）。人工的に拡張された遺伝子情報システム（ＡＥＧＩＳ；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４（２１）：６０９５－６１０１（２００６））を、ＳＧＣの相互作用構成成分のうちの結合部位に組み込むことができる。これらの人工塩基は、この相互作用構成成分の特異性を向上でき、それは次いでより低ストリンジェントなハイブリダイゼーション反応を可能にして、より高度なシグナルを生成できる。
標的プローブ対に関しては、標的核酸の直接隣接するセグメント、または標的プローブ対の標的プローブ結合部位の間に、１個から相当数の塩基を有するセグメントに結合するように、標的プローブ対を設計できる。概して、標的プローブ対は、標的核酸に結合して、概して、標的核酸上の結合部位間に、０～５００塩基、例えば、５塩基、１０塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、４０塩基、４５塩基、５０塩基、６０塩基、７０塩基、８０塩基、９０塩基、１００塩基、１２０塩基、１４０塩基、１６０塩基、１８０塩基、２００塩基、２２０塩基、２４０塩基、２６０塩基、２８０塩基、３００塩基、３２０塩基、３４０塩基、３６０塩基、３８０塩基、４００塩基、４２０塩基、４４０塩基、４６０塩基、４８０塩基もしくは５００塩基、またはこれらの間のいずれかの整数の塩基長が存在するように設計する。特定の実施形態では、標的プローブの対に対する結合部位は、０～１００塩基長、０～２００塩基長もしくは０～３００塩基長、またはこれらの間のいずれかの整数の塩基長である。標的プローブのセットにおいて、２つ以上の標的プローブ対を用いて、ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡである同じ標的核酸に結合し、かつ標的プローブ対の間において、結合部位にギャップがある場合には、異なる標的プローブ対の結合部位は重複しないことを理解されたい。ＤＮＡのような二本鎖核酸を検出する場合には、標的プローブ対が、二本鎖標的核酸のそれぞれの結合部位に同時に結合できる限りは、異なる標的プローブ対間で、ある程度重複し得る。
ＳＧＣは、複数の標識プローブ（ＬＰ）も含む。各ＬＰは、検出可能であるセグメントを含む。検出可能な構成成分は、ＬＰに直接結合され得るか、またはＬＰは、検出可能な構成成分、すなわち、標識を含む別の核酸にハイブリダイゼーションすることができる。本明細書で使用される場合、「標識」は、分子の検出を促進する部分である。本発明の文脈における一般的な標識には、蛍光標識、発光標識、光散乱標識及び／または比色標識が含まれる。好適な標識としては、酵素部分、蛍光部分、発色部分、放射性核種、基質、補因子、阻害剤、化学発光部分、磁性粒子、希土類金属、金属同位体などが挙げられる。本発明の特定の実施形態では、標識は、酵素である。例示的な酵素標識としては、これらに限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなど、及び各種プロテアーゼが挙げられる。他の標識としては、これらに限定されないが、フルオロフォア、ジニトロフェニル（ＤＮＰ）などが挙げられる。標識は、例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）、ならびに米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号、及び第４，３６６，２４１号に記載されるように、当業者に周知である。検出可能な酵素／基質の組み合わせ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ ＴＸ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を含む、多くの標識が市販されており、本発明の方法及びアッセイで使用され得る。本発明の特定の実施形態では、酵素は、発色基質または蛍光基質を利用して、本明細書に記載されるように、検出可能なシグナルを生成することができる。例示的な標識は、本明細書に記載される。
酵素活性標識または非酵素標識が、それぞれ検出できるものである限りは、いずれの数の酵素標識または非酵素標識も使用できる。酵素は、検出可能なシグナルを生成し、そのシグナルを利用して、標的核酸を検出できる。特に有用である検出可能なシグナルは、発色シグナルまたは蛍光シグナルである。したがって、標識として用いるのに特に有用な酵素には、発色基質または蛍光基質が利用可能である酵素が含まれる。このような発色基質または蛍光基質を酵素反応によって容易に検出可能な発色生成物または蛍光生成物に変換し、この生成物は、顕微鏡法または分光法を用いて、容易に検出及び／または定量化することができる。このような酵素は、当業者に周知であり、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼなどが挙げられるが、これらに限らない（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）を参照されたい）。周知の発色基質または蛍光基質を有する他の酵素には、様々なペプチダーゼが含まれ、その発色ペプチド基質または蛍光ペプチド基質を用いて、タンパク質切断反応を検出できる。発色基質及び蛍光基質の利用は、細菌の診断でも周知であり、これらに限定されないが、α－ガラクトシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼ、６－ホスホ－β－Ｄ－ガラクトシド６－ホスホガラクトヒドロラーゼ、β－グルコシダーゼ、α－グルコシダーゼ、アミラーゼ、ノイラミニダーゼ、エステラーゼ、リパーゼなどの使用を含み（Ｍａｎａｆｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５５：３３５－３４８（１９９１））、既知の発色基質または蛍光基質を有するこのような酵素は、本発明の方法で使用するために容易に適合させることができる。
検出可能なシグナルを生成させるための様々な発色基質または蛍光基質は、当業者に周知であり、市販されている。検出可能なシグナルを生成させるのに利用できる例示的な基質としては、これらに限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼに対する３，３’－ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、クロロナフトール（４－ＣＮ）（４－クロロ－１－ナフトール）、２，２’－アジノ－ビス（３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）及び３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、アルカリホスファターゼに対する５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－１－リン酸（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ファストレッド（ファストレッドＴＲ／ＡＳ－ＭＸ）及びｐ－ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）、β－ガラクトシダーゼに対する１－メチル－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド及び２－メトキシ－４－（２－ニトロビニル）フェニルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド、β－グルコシダーゼに対する２－メトキシ－４－（２－ニトロビニル）フェニルβ－Ｄ－グルコピラノシドなどが挙げられる。例示的な蛍光基質としては、これらに限定されないが、アルカリホスファターゼに対する４－（トリフルオロメチル）ウンベリフェリルリン酸、ホスファターゼに対する４－メチルウンベリフェリルリン酸ビス（２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール）、４－メチルウンベリフェリルリン酸ビス（シクロヘキシルアンモニウム）及び４－メチルウンベリフェリルリン酸、西洋ワサビペルオキシダーゼに対するＱｕａｎｔａＢｌｕ（商標）及びＱｕａｎｔａＲｅｄ（商標）、β－ガラクトシダーゼに対する４－メチルウンベリフェリルβ－Ｄ－ガラクトピラノシド、フルオレセインジ（β－Ｄ－ガラクトピラノシド）及びナフトフルオレセインジ－（β－Ｄ－ガラクトピラノシド）、β－グルコシダーゼに対する３－アセチルウンベリフェリルβ－Ｄ－グルコピラノシド及び４－メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－グルコピラノシド、ならびにα－ガラクトシダーゼに対する４－メチルウンベリフェリル－α－Ｄ－ガラクトピラノシドが挙げられる。検出可能なシグナルを生成させる例示的な酵素及び基質は例えば、米国公開２０１２／０１００５４０にも記載されている。発色基質または蛍光基質を含む様々な検出可能な酵素基質は、周知であり、市販されている（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＬ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｌａｓ ＴＸ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ、４２ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｉｏｃａｒｅ）。概して、基質は、標的核酸の部位で沈着する沈殿物を形成する生成物に変換される。他の例示的な基質としては、これらに限定されないが、ＨＲＰ－Ｇｒｅｅｎ（４２ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｂｅｔａｚｏｉｄ ＤＡＢ、Ｃａｒｄａｓｓｉａｎ ＤＡＢ、Ｒｏｍｕｌｉｎ ＡＥＣ、Ｂａｊｏｒａｎ Ｐｕｒｐｌｅ、Ｖｉｎａ Ｇｒｅｅｎ、Ｄｅｅｐ Ｓｐａｃｅ Ｂｌａｃｋ（商標）、Ｗａｒｐ Ｒｅｄ（商標）、Ｖｕｌｃａｎ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ、及びＦｅｒａｎｇｉ Ｂｌｕｅ（Ｂｉｏｃａｒｅから）（Ｃｏｎｃｏｒｄ ＣＡ；ｂｉｏｃａｒｅ．ｎｅｔ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ／ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｓ）が挙げられる。
検出可能な標識として好適な例示的な希土類金属及び金属同位体としては、これらに限定されないが、１４１Ｐｒ、１４２Ｎｄ、１４３Ｎｄ、１４４Ｎｄ、１４５Ｎｄ、１４６Ｎｄ、１４７Ｓｍ、１４８Ｎｄ、１４９Ｓｍ、１５０Ｎｄ、１５１Ｅｕ、１５２Ｓｍ、１５３Ｅｕ、１５４Ｓｍ、１５５Ｇｄ、１５６Ｇｄ、１５８Ｇｄ、１５９Ｔｂ、１６０Ｇｄ、１６１Ｄｙ、１６２Ｄｙ、１６３Ｄｙ、１６４Ｄｙ、１６５Ｈｏ、１６６Ｅｒ、１６７Ｅｒ、１６８Ｅｒ、１６９Ｔｍ、１７０Ｅｒ、１７１Ｙｂ、１７２Ｙｂ、１７３Ｙｂ、１７４Ｙｂ、１７５Ｌｕ及び１７６Ｙｂのようなランタニド（ＩＩＩ）同位体が挙げられる。金属同位体は、例えば、飛行時間型質量分析（ＴＯＦ－ＭＳ）（例えば、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ Ｈｅｌｉｏｓ及びＨｙｐｅｒｉｏｎシステム、ｆｌｕｉｄｉｇｍ．ｃｏｍ／ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）を使用して検出することができる。
ビオチン－アビジン（またはビオチン－ストレプトアビジン）は、それらの２つの分子の相互の親和性が非常に高いことと、１つのアビジン／ストレプトアビジン分子が４つのビオチン分子と結合できるという事実に基づく周知のシグナル増幅システムである。抗体は、免疫組織化学及びＩＳＨでのシグナル増幅に広く使用される。チラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）は、ペルオキシダーゼ活性による多数のハプテン化チラミド分子の堆積に基づく。チラミンは、フェノール化合物である。固定化された西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、少量の過酸化水素の存在下で、標識基質を、極めて反応性の高い短命な中間体に変換する。続いて、活性化した基質分子は、ペルオキシダーゼ結合部位またはペルオキシダーゼ結合部位の近くで、電子の豊富なタンパク質部分（チロシンなど）と非常に速やかに反応して、その部分に共有結合する。このようにして、チラミドにコンジュゲートした多くのハプテン分子をハイブリダイゼーション部位で、ｉｎ ｓｉｔｕに導入できる。その後、沈着したチラミド－ハプテン分子を直接または間接的に可視化することができる。このような検出システムは例えば、米国公開２０１２／０１００５４０にさらに詳細に記載されている。
本明細書に記載される実施形態では、酵素を利用して、適切な発色基質または蛍光基質を使用する検出可能なシグナルを生成することができる。あるいは、標識プローブは、標識プローブの核酸部分に直接結合した検出可能な標識を有し得ることを理解されたい。例示的な検出可能な標識は、当業者に周知であり、これらに限定されないが、発色標識または蛍光標識を含む（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）を参照されたい）。標識として有用な例示的なフルオロフォアには、これらに限定されないが、ローダミン誘導体、例えば、テトラメチルローダミン、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、スルホルホダミンＢ、テキサスレッド（スルホダミン１０１）、ローダミン１１０、及びそれらの誘導体（テトラメチルローダミン－５－（または６）、リサミンローダミンＢなど）；７－ニトロベンズ－２－オキサ－１，３－ジアゾール（ＮＢＤ）；フルオレセイン及びその誘導体；ナフタレン（ダンシル（５－ジメチルアミノナフタレン－１－スルホニル）など）；クマリン誘導体（７－アミノ－４－メチルクマリン－３－酢酸（ＡＭＣＡ）、７－ジエチルアミノ－３－［（４’－（ヨードアセチル）アミノ）フェニル］－４－メチルクマリン（ＤＣＩＡ）、Ａｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）など）；４，４－ジフルオロ－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン（ＢＯＤＩＰＹ（商標））及びその誘導体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）；ピレン及びスルホン化ピレン（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ（商標）及びその誘導体（８－メトキシピレン－１，３，６－トリスルホン酸などを含む）；ピリジルオキサゾール誘導体及びダポキシル誘導体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；ルシファーイエロー（３，６－ジスルホネート－４－アミノ－ナフタリミド）及びその誘導体；ＣｙＤｙｅ（商標）蛍光色素（Ａｍｅｒｓｈａｍ／ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ＮＪ）；ＡＴＴＯ ３９０、ＤｙＬｉｇｈｔ ３９５ＸＬ、ＡＴＴＯ ４２５、ＡＴＴＯ ４６５、ＡＴＴＯ ４８８、ＡＴＴＯ ４９０ＬＳ、ＡＴＴＯ ４９５、ＡＴＴＯ ５１４、ＡＴＴＯ ５２０、ＡＴＴＯ ５３２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ ５４２、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ５６５、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ ５９０、ＡＴＴＯ ５９４、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ ６１０、ＡＴＴＯ ６２０、ＡＴＴＯ Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ ６３３、ＡＴＴＯ ６４３、ＡＴＴＯ ６４７、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ ６５５、ＡＴＴＯ Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ ６６５、ＡＴＴＯ ６８０、ＡＴＴＯ ７００、ＡＴＴＯ ７２５、ＡＴＴＯ ７４０、Ｃｙａｎ ５００ ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒ（ＡＴＴＯ－ＴＥＣＨ、Ｓｉｅｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）などが挙げられる。例示的な発色団としては、これらに限定されないが、フェノールフタレイン、マラカイトグリーン、芳香族ニトロ化合物（ニトロフェニルなど）、ジアゾ色素、ダブシル（４－ジメチルアミノアゾベンゼン－４’－スルホニル）などが挙げられる。
本明細書で開示されるように、方法は、複数の標的核酸の同時検出を利用することができる。フルオロフォアを標識として使用する場合、複数の標的核酸の検出に使用されるフルオロフォアは、標的核酸の同時検出の場合に、各フルオロフォアが区別可能であり、フルオロフォアを蛍光顕微鏡で同時に検出できるように選択される。このようなフルオロフォアは、標的核酸の別個の標識を同時に検出できるように、発光線のスペクトルが分離されるように選択される。本発明の方法で使用するのに好適な区別可能なフルオロフォアを選択する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ ａｎｄ Ｓｐｅｎｃｅ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１１ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（２０１０）を参照されたい）。
顕微鏡、サイトメトリー（例えば、マスサイトメトリー、飛行時間型サイトメトリー（ＣｙＴＯＦ）、フローサイトメトリー）または分光法のような周知の方法を利用して、それぞれの標的核酸と関連する検出可能な発色シグナル、蛍光シグナルまたは金属シグナルを可視化することができる。概して、同じ試料内の核酸標的の検出に、１種類の計器を使用できるように、同じアッセイで、それぞれ異なる標識を使用する場合、特定のアッセイに合わせて、発色基質、蛍光基質、発色標識、蛍光標識または希土類金属同位体のいずれかを使用する。
本明細書で開示されるように、標識プローブは、標識が任意選択で切断可能となるように設計され得る。本明細書で使用される場合、切断可能な標識とは、例えば、標的核酸を標識及び検出するその後のラウンドで、同じ標識を使用するために、標識をＳＧＣから除去できるように、標識プローブに結合またはコンジュゲートされている標識を指す。概して、標識は、切断可能である化学リンカーによって、標識プローブにコンジュゲートされている。標識が切断可能となるように、標識を標識プローブにコンジュゲートする方法は、当業者に周知である（例えば、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（１９９６）、Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（３）：４８４－４８９（１９９８）を参照されたい）。オリゴヌクレオチドを標識する１つの特定のシステムは、ＦａｓｔＴａｇ（商標）システムである（Ｄａｎｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，上記，１９９８；Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍｅ ＣＡ）。様々な切断可能な部分は、標識を標識プローブから切断できるようにリンカーに含まれ得る。このような切断可能な部分は、化学的、光化学的、または酵素的に切断され得る基を含む。切断可能な化学リンカーは、還元によって切断できるジスルフィド、過ヨウ素酸塩によって切断できるグリコールまたはジオール、亜ジチオン酸塩によって切断できるジアゾ結合、ヒドロキシルアミンによって切断できるエステル、塩基によって切断できるスルホンなどのような切断可能な化学的部分を含むことができる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，上記，１９９６を参照されたい）。特に有用である切断可能なリンカーの１つは、ジスルフィド結合を還元することによって切断され得るジスルフィド結合を含むリンカーである。他の実施形態では、リンカーは、酵素による切断のための部位を含むことができる。例えば、リンカーは、タンパク質切断部位を含むことができる。概して、このような切断部位は、配列特異的プロテアーゼに対するものである。このようなプロテアーゼとしては、これらに限定されないが、ヒトライノウイルス３Ｃプロテアーゼ（切断部位ＬＥＶＬＦＱ／ＧＰ）、エンテロキナーゼ（切断部位ＤＤＤＤＫ／）、第Ｘａ因子（切断部位ＩＥＧＲ／）、タバコエッチウイルスプロテアーゼ（切断部位ＥＮＬＹＦＱ／Ｇ）、及びトロンビン（切断部位ＬＶＰＲ／ＧＳ）が挙げられる（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫを参照されたい）。別の切断可能な部分は、例えば、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）によって切断され得るウラシル－ＤＮＡ（ウラシルを含むＤＮＡ）であり得る（例えば、Ｓｉｄｏｒｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５８２（３）：４１０－４０４（２００８）を参照されたい）。
本発明は、いくつかの実施形態では、標的核酸に結合した標識を標的核酸から除去できるように、切断可能な標識を使用することに関するものである。切断可能な標識は、標識を切断し、その標識を標識プローブから解離する目的で、化学的な薬剤のような薬剤または光を適用することによって除去することができる。上で論じたように、化学的な切断に有用な切断剤としては、これらに限定されないが、還元剤、過ヨウ素酸、亜ジチオン酸塩、ヒドロキシルアミン、塩基などが挙げられる（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，上記，１９９６を参照されたい）。ジスルフィド結合を含むリンカーを切断するのに有用な方法の１つは、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）の使用である（Ｍｏｆｆｉｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１３：１１０４６－１１０５１（２０１６）を参照されたい）。一実施形態では、ＴＣＥＰは、標識を標識プローブから切断するための薬剤として使用される。
別の実施形態では、切断可能な標識を用いる代わりに、標的核酸に結合したＳＧＣを、標識プローブと増幅剤との結合配列のＴｍよりも高い温度に曝露することによって、ＳＧＣに結合した標識プローブを選択的に除去するか、または洗い流すことができる。ＳＧＣにおける標識プローブと増幅剤との間の結合を破壊するのに好適な温度及び条件を選択することによって、ＳＧＣにおいて増幅剤に結合した標識プローブを除去する方法のように、ＳＧＣの構成成分を選択的に除去する方法は、当該技術分野で周知であり、本明細書に開示されている。標識プローブをＳＧＣから選択的に除去することを用いる場合には、ＳＧＣの成分の相互作用のうち、標識プローブと増幅剤との相互作用以外の相互作用が、標識プローブの増幅剤への結合を破壊する条件下でも、安定な状態を維持するように、ＳＧＣの構成成分を設計する。切断可能な標識を含む標識プローブを用いるのと同様に、最後の反復的な検出ラウンドでは、それ以上の検出ラウンドを行わないことから、標識プローブ及び増幅剤の間の融解温度を、標的プローブ、前－前増幅剤（使用する場合）、前増幅剤及び増幅剤の間の融解温度よりも低くする必要は必ずしもないことを理解されたい。したがって、最後の反復的な検出ラウンドでは、標識プローブ及び増幅剤の間の融解温度を、標的プローブ、前－前増幅剤（使用する場合）、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度よりも低くするかは任意であり、その結果、最後の反復的な検出ラウンドで、標識プローブと標識がＳＧＣに結合したままとなる。
本明細書に記載される本発明は、概して、試料内の複数の標的核酸の検出に関する。本発明の方法は、さらに、複数の標的核酸と、任意選択で、試料内、特に標的核酸と同じ細胞内の他の分子を検出することにも適用され得ることを理解されたい。例えば、複数の標的核酸を検出するのに加えて、細胞内で発現されたタンパク質もまた、標的核酸を検出するために明細書に記載される原理と同様の原理を用いて、同時に検出され得る。この場合には、１回以上ラウンドの複数の標的核酸の検出において、任意選択で、細胞内で発現された１つ以上のタンパク質は、例えば、タンパク質を検出するための検出可能な標識を使用することによって検出され得る。初期の標的核酸検出ラウンドで、タンパク質を検出している場合には、タンパク質は、標的核酸を検出するのに用いた切断可能な標識と同様に、切断可能な標識によって検出され得る。最後の検出ラウンドで、タンパク質を検出している場合には、標識は、切断可能である必要はない。例えば、標的核酸の検出用として、本明細書に記載されるシステムを含む周知の検出システムのうちのいずれかを用いて、タンパク質に特異的な抗体の結合を検出することによって、細胞内のタンパク質を検出することは、当業者には周知である。同じ細胞内の標的核酸及びタンパク質の検出が記載されている（Ｓｃｈｕｌｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ．６（１）：２５－３６（２０１８）もまた参照されたい）。
本発明は、標的核酸が検出される限り、任意の所望の順序で実施され得ることを理解されたい。すなわち、本発明の方法では、標的核酸が検出される限りは、ＳＧＣをアセンブリするためにいずれかの構成成分と細胞を接触させるステップは、いずれの所望の順序でも行うことができ、逐次的にも実施することができ、もしくは同時に実施することができ、または標的核酸が検出される限り、所望に応じて、いくつかのステップは、逐次的に実施することができる一方で、他のステップが同時に行われる。さらに、各種の構成、構成成分のサイズ、アッセイ条件、アッセイ感度などを使用する目的で、所望に応じて、本明細書に開示されている実施形態は独立して、本明細書に開示されている他の実施形態と組み合わせることができることを理解されたい。
本発明は、標的核酸の検出を提供するいずれの形式でも実施され得ることを理解されたい。本発明の実施は、概して、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して本明細書に記載されてきたが、本発明は、当該技術分野で周知であるように、他の形式での標的核酸の検出のため、特に細胞内の標的核酸の検出のために実施され得ることを理解されたい。細胞内の標的核酸を検出するために使用され得る１つの方法は、当該技術分野で周知であるフローサイトメトリーである（例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ３ｒｄ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）、Ｏｒｍｅｒｏｄ，Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（１９９９）を参照されたい）。したがって、本発明の方法、試料及びキットは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイの形式、またはフローサイトメトリーなどの別の形式で使用され得る。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含む核酸検出方法のフローサイトメトリーへの適用は、以前に記載されている（例えば、Ｈａｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，８（２）：ｅ５７００２．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５７００２（２０１３）、Ｂａｘｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １２（１０）：２０２９－２０４９（２０１７））。
いくつかの場合では、アッセイのステップ数を減らすこと、例えば、ハイブリダイゼーション及び洗浄のステップ数を減らすことが望ましいことがある。アッセイのステップ数を減らす方法の１つは、細胞と接触させる前に、ＳＧＣの構成成分の一部または全部を事前アセンブリすることである。このように事前アセンブリは、標的核酸と接触させる前に、ＳＧＣの構成成分の一部または全部を一緒にハイブリダイゼーションすることによって行うことができる。
本発明は、本明細書に開示されるように、酸試薬を含むキットをさらに提供する。酸試薬は、標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらし、細胞形態及び核酸の完全性を保持する。本発明のキットの構成成分は、任意選択で、容器に入っていることができ、任意選択で、キットを使用するための説明書が提供され得る。説明書は、例えば、本明細書に開示されるように、本発明の方法を実施するためのステップを説明し得る。任意選択で、キットは、本明細書に記載されるＳＧＣの１つ以上の構成成分を含んでもよく、キットは標的核酸を含まない。このようなキットは、本明細書に開示されるように、前増幅剤（ＰＡ）、増幅剤（ＡＭＰ）及び標識プローブ（ＬＰ）、ならびに任意に前－前増幅剤（ＰＰＡ）を含み得る。任意選択で、キットは、特定の標的核酸、または複数の標的核酸を対象とする標的プローブ（ＴＰ）を含み得る。
一実施形態では、本発明は、１つ以上の核酸標的に特異的な１つ以上のプローブと、本明細書に開示される本発明の方法を実施するための説明書とを含むキットを提供する。
一実施形態では、本発明は、細胞内の核酸に結合したプローブの結合を破壊する方法で使用するための酸試薬を含むキットを提供し、方法は、細胞を酸試薬と接触させることを含み、細胞は、細胞内の第１の標的核酸にハイブリダイゼーションした第１のプローブを含み、酸試薬は、第１のプローブと第１の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する。
そのようなキットの一実施形態では、細胞を酸試薬と接触させることは、１回以上繰り返される。
そのようなキットの一実施形態では、方法は、細胞から第１のプローブを除去することをさらに含む。そのようなキットの一実施形態では、方法は、細胞を第２のプローブと接触させるステップをさらに含み、第２のプローブは、細胞内の第２の標的核酸にハイブリダイゼーションし、第２の標的核酸は、第１の標的核酸と同一であるか、または異なる。そのようなキットの一実施形態では、方法は、細胞を酸試薬と接触させるステップをさらに含み、酸試薬は、第２のプローブと第２の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する。一実施形態では、細胞を酸試薬と接触させることは、１回以上繰り返される。そのようなキットの一実施形態では、方法は、細胞から第２のプローブを除去するステップをさらに含む。
一実施形態では、本発明は、細胞内の核酸に結合したプローブの結合を破壊するための方法で使用するための酸試薬を含むキットを提供し、方法は、細胞を酸試薬と接触させることを含み、細胞は、細胞内の１つ以上の第１の標的核酸にハイブリダイゼーションした１つ以上の第１のプローブを含み、酸試薬は、１つ以上の第１のプローブと１つ以上の第１の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する。
そのようなキットの一実施形態では、細胞を酸試薬と接触させることは、１回以上繰り返される。
そのようなキットの一実施形態では、方法は、細胞から１つ以上の第１のプローブを除去することをさらに含む。そのようなキットの一実施形態では、細胞は、２つ以上の第１の標的核酸にハイブリダイゼーションした２つ以上の第１のプローブを含む。そのようなキットの一実施形態では、第１の標的核酸の各々は、第１のプローブへのハイブリダイゼーションによって標識され、各第１の標的核酸上の標識は、第１のプローブにハイブリダイゼーションした他の第１の標的核酸（複数可）上の標識から区別可能である。
そのようなキットの一実施形態では、方法は、細胞を１つ以上の第２のプローブと接触させるステップをさらに含み、１つ以上の第２のプローブは、細胞内の１つ以上の第２の標的核酸にハイブリダイゼーションし、１つ以上の第２の標的核酸は、１つ以上の第１の標的核酸と同一であるか、または異なる。一実施形態では、細胞は、２つ以上の第２の標的核酸にハイブリダイゼーションした２つ以上の第２のプローブを含む。
そのようなキットの一実施形態では、第２の標的核酸の各々は、第２のプローブへのハイブリダイゼーションによって標識され、各第２の標的核酸上の標識は、第２のプローブにハイブリダイゼーションした他の第２の標的核酸（複数可）上の標識から区別可能である。そのようなキットの一実施形態では、方法は、細胞を酸試薬と接触させるステップをさらに含み、酸試薬は、第２のプローブと１つ以上の第２の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する。一実施形態では、細胞を酸試薬と接触させることは、１回以上繰り返される。一実施形態では、そのような方法は、細胞から第２のプローブを除去するステップをさらに含む。
一実施形態では、本発明は、（Ａ）前増幅剤のセットであって、前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前増幅剤が、前－前増幅剤の対に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前増幅剤のセットと、（Ｂ）増幅剤のセットであって、増幅剤のセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤が、前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、増幅剤のセットと、（Ｃ）標識プローブのセットであって、標識プローブのセットの標識プローブが各々、増幅剤に対する標識及び結合部位を含む、標識プローブのセットと、（Ｄ）酸試薬であって、酸試薬が、標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、酸試薬と、を含む、標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットを提供する（例えば、図２Ａ及び６Ａを参照されたい）。一実施形態では、キットは、標的プローブのセットを含み、標的プローブのセットは、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの１つ以上の対を含む。
一実施形態では、本発明は、（Ａ）前－前増幅剤のセットであって、前－前増幅剤のセットが、１つ以上の前－前増幅剤を含み、各前－前増幅剤が、標的プローブの１つ以上の対に対する結合部位を含む、前－前増幅剤のセットと、（Ｂ）前増幅剤のセットであって、前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前増幅剤が、前－前増幅剤に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前増幅剤のセットと、（Ｃ）増幅剤のセットであって、増幅剤のセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤が、前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、増幅剤のセットと、（Ｄ）標識プローブのセットであって、標識プローブのセットの標識プローブが各々、増幅剤に対する標識及び結合部位を含む、標識プローブのセットと、（Ｅ）酸試薬であって、酸試薬が、標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、酸試薬と、を含む、標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットを提供する（例えば、図２Ａ及び６Ｂを参照されたい）。一実施形態では、キットは、標的プローブのセットを含み、標的プローブのセットは、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの１つ以上の対を含む。
一実施形態では、本発明は、（Ａ）前－前増幅剤のセットであって、前－前増幅剤のセットが、前－前増幅剤の１つ以上の対を含み、前－前増幅剤の対の各前－前増幅剤が、標的プローブの対の標的プローブのうちの１つに対する結合部位を含む、前－前増幅剤のセットと、（Ｂ）前増幅剤のセットであって、前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前増幅剤が、前－前増幅剤の対に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前増幅剤のセットと、（Ｃ）増幅剤のセットであって、増幅剤のセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤が、前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、増幅剤のセットと、（Ｄ）標識プローブのセットであって、標識プローブのセットの標識プローブが各々、増幅剤に対する標識及び結合部位を含む、標識プローブのセットと、（Ｅ）酸試薬であって、酸試薬が、標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、酸試薬と、を含む、標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットを提供する（例えば、図２Ａ及び６Ｃを参照されたい）。一実施形態では、キットは、標的プローブのセットを含み、標的プローブのセットは、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの１つ以上の対を含む。
一実施形態では、本発明は、標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットを提供し、キットは、（Ａ）前増幅剤のセットであって、前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、複数の前増幅剤が、１つ以上の標的プローブのセットの各々に特異的な前増幅剤を含み、各前増幅剤が、標的プローブのセットのうちの１つの標的プローブの対に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前増幅剤のセットと、（Ｂ）増幅剤のセットであって、増幅剤のセットが、各前増幅剤に特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤の各サブセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤のサブセットの増幅剤が、標的プローブのセットに特異的な前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、増幅剤のセットと、（Ｃ）標識プローブの第１のセットであって、標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々における標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける標識が、標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、標識が、切断可能であり、標識プローブの第１のセットが、標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識することができる、標識プローブの第１のセットと、（Ｄ）標識プローブの第２のセットであって、標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第２のサブセットが、標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける標識が、標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、標識が、切断可能であり、標識プローブの第２のセットが、標的核酸の第１のサブセットとは異なる標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識することができる、標識プローブの第２のセットと、（Ｅ）酸試薬であって、酸試薬が、標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、酸試薬と、を含む（例えば、図２Ｂ及び６Ａを参照されたい）。
一実施形態では、キットは、標識プローブの第３のセットをさらに含み、標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第３のサブセットが、標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける標識が、標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、標識が、切断可能であり、標識プローブの第３のセットが、標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識することができる。
一実施形態では、本発明は、標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットを提供し、キットは、（Ａ）前－前増幅剤のセットであって、前－前増幅剤のセットが、複数の前－前増幅剤を含み、複数の前－前増幅剤が、１つ以上の標的プローブのセットの各々に特異的な前－前増幅剤を含み、各前－前増幅剤が、標的プローブのセットのうちの１つの標的プローブの対に対する結合部位及び前増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前－前増幅剤のセットと、（Ｂ）前増幅剤のセットであって、前増幅剤のセットが、各前－前増幅剤に特異的な前増幅剤の複数のサブセットを含み、前増幅剤の各サブセットが、複数の前増幅剤を含み、前増幅剤のサブセットの前増幅剤が、標的プローブのセットに特異的な前－前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前増幅剤のセットと、（Ｃ）増幅剤のセットであって、増幅剤のセットが、前増幅剤の各サブセットに特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤の各サブセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤のサブセットの増幅剤が、前増幅剤のサブセットのうちの１つの前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、増幅剤のセットと、（Ｄ）標識プローブの第１のセットであって、標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々における標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける標識が、標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、標識が、切断可能であり、標識プローブの第１のセットが、標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識することができる、標識プローブの第１のセットと、（Ｅ）標識プローブの第２のセットであって、標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第２のサブセットが、標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける標識が、標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、標識が、切断可能であり、標識プローブの第２のセットが、標的核酸の第１のサブセットとは異なる標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識することができる、標識プローブの第２のセットと、（Ｆ）酸試薬であって、酸試薬が、標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、酸試薬と、を含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｂを参照されたい）。
一実施形態では、キットは、標識プローブの第３のセットをさらに含み、標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第３のサブセットが、標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける標識が、標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、標識が、切断可能であり、標識プローブの第３のセットが、標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識することができる。
一実施形態では、本発明は、標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットを提供し、キットは、（Ａ）前－前増幅剤のセットであって、前－前増幅剤のセットが、前－前増幅剤の複数の対を含み、前－前増幅剤のセットが、１つ以上の標的プローブのセットの標的プローブの対の各標的プローブに特異的な前－前増幅剤の対を含み、前－前増幅剤の対の各前－前増幅剤は、標的プローブのセットの標的プローブの対の標的プローブのうちの１つに対する結合部位を含み、前－前増幅剤が、前増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前－前増幅剤のセットと、（Ｂ）前増幅剤のセットであって、前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、複数の前増幅剤が、前－前増幅剤の各対に特異的な前増幅剤を含み、各前増幅剤が、前－前増幅剤のセットの前－前増幅剤の対のうちの１つに対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前増幅剤のセットと、（Ｃ）増幅剤のセットであって、増幅剤のセットが、前－前増幅剤の各対に特異的な各前増幅剤に特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤のサブセットの増幅剤が、前－前増幅剤の対に特異的な前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、増幅剤のセットと、（Ｄ）標識プローブの第１のセットであって、標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々における標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける標識が、標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、標識が、切断可能であり、標識プローブの第１のセットが、標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識することができる、標識プローブの第１のセットと、（Ｅ）標識プローブの第２のセットであって、標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第２のサブセットが、標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける標識が、標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、標識が、切断可能であり、標識プローブの第２のセットが、標的核酸の第１のサブセットとは異なる標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識することができる、標識プローブの第２のセットと、（Ｆ）酸試薬であって、酸試薬が、標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、酸試薬と、を含む（図２Ｂ及び６Ｃを参照されたい）。
一実施形態では、キットは、標識プローブの第３のセットをさらに含み、標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第３のサブセットが、標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける標識が、標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、標識が、切断可能であり、標識プローブの第３のセットが、標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識することができる。
一実施形態では、切断可能な標識を含む本発明のキットは、標識プローブから切断可能な標識を切断するための切断剤を含む。
一実施形態では、本発明は、標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットを提供し、キットは、（Ａ）前増幅剤のセットであって、前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、複数の前増幅剤が、１つ以上の標的プローブのセットの各々に特異的な前増幅剤を含み、各前増幅剤が、標的プローブのセットのうちの１つの標的プローブの対に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前増幅剤のセットと、（Ｂ）増幅剤のセットであって、増幅剤のセットが、各前増幅剤に特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤の各サブセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤のサブセットの増幅剤が、標的プローブのセットに特異的な前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、増幅剤のセットと、（Ｃ）標識プローブの第１のセットであって、標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々における標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける標識が、標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、標識プローブと増幅剤との間の融解温度が、標的プローブ、前増幅剤及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、標識プローブの第１のセットが、標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識することができる、標識プローブの第１のセットと、（Ｄ）標識プローブの第２のセットであって、標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第２のサブセットが、標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける標識が、標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、標識プローブと増幅剤との間の融解温度が、標的プローブ、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、標識プローブの第２のセットが、標的核酸の第１のサブセットとは異なる標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識することができる、標識プローブの第２のセットと、（Ｅ）酸試薬であって、酸試薬が、標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、酸試薬と、を含む（例えば、図２Ｂ及び６Ａを参照されたい）。
一実施形態では、キットは、標識プローブの第３のセットをさらに含み、標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第３のサブセットが、標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける標識が、標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、標識プローブと増幅剤との間の融解温度が、標的プローブ、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、標識プローブの第３のセットが、標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識することができる。
一実施形態では、本発明は、標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットを提供し、キットは、（Ａ）前－前増幅剤のセットであって、前－前増幅剤のセットが、前－前増幅剤の複数の対を含み、前－前増幅剤のセットが、１つ以上の標的プローブのセットの標的プローブの対の各々に特異的な前－前増幅剤の対を含み、前－前増幅剤の対の各前－前増幅剤は、標的プローブのセットの標的プローブの対の標的プローブのうちの１つに対する結合部位を含み、前－前増幅剤が、前増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前－前増幅剤のセットと、（Ｂ）前増幅剤のセットであって、前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、複数の前増幅剤が、前－前増幅剤の各対に特異的な前増幅剤を含み、各前増幅剤が、前－前増幅剤のセットの前－前増幅剤の対のうちの１つに対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前増幅剤のセットと、（Ｃ）増幅剤のセットであって、増幅剤のセットが、前－前増幅剤の各対に特異的な各前増幅剤に特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤のサブセットの増幅剤が、前－前増幅剤の対に特異的な前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、増幅剤のセットと、（Ｄ）標識プローブの第１のセットであって、標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々における標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける標識が、標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、標識プローブと増幅剤との間の融解温度が、標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、標識プローブの第１のセットが、標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識することができる、標識プローブの第１のセットと、（Ｅ）標識プローブの第２のセットであって、標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第２のサブセットが、標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける標識が、標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、標識が、切断可能であり、標識プローブの第２のセットが、標的核酸の第１のサブセットとは異なる標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識することができる、標識プローブの第２のセットと、（Ｆ）酸試薬であって、酸試薬が、標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、酸試薬と、を含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｃを参照されたい）。
一実施形態では、キットは、標識プローブの第３のセットをさらに含み、標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第３のサブセットが、標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける標識が、標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、標識プローブと増幅剤との間の融解温度が、標的プローブ、前前増幅剤、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、標識プローブの第３のセットが、標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識することができる。
一実施形態では、本発明は、標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットを提供し、キットは、（Ａ）前－前増幅剤のセットであって、前－前増幅剤のセットが、複数の前－前増幅剤を含み、複数の前－前増幅剤が、１つ以上の標的プローブのセットの各々に特異的な前－前増幅剤を含み、各前－前増幅剤が、標的プローブのセットのうちの１つの標的プローブの対に対する結合部位及び前増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前－前増幅剤のセットと、（Ｂ）前増幅剤のセットであって、前増幅剤のセットが、各前－前増幅剤に特異的な前増幅剤の複数のサブセットを含み、前増幅剤の各サブセットが、複数の前増幅剤を含み、前増幅剤のサブセットの前増幅剤が、標的プローブのセットに特異的な前－前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前増幅剤のセットと、（Ｃ）増幅剤のセットであって、増幅剤のセットが、前増幅剤の各サブセットに特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤の各サブセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤のサブセットの増幅剤が、前増幅剤のサブセットのうちの１つの前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、増幅剤のセットと、（Ｄ）標識プローブの第１のセットであって、標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々における標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける標識が、標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、標識プローブと増幅剤との間の融解温度が、標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、標識プローブの第１のセットが、標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識することができる、標識プローブの第１のセットと、（Ｅ）標識プローブの第２のセットであって、標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第２のサブセットが、標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける標識が、標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、標識プローブと増幅剤との間の融解温度が、標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、標識プローブの第２のセットが、標的核酸の第１のサブセットとは異なる標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識することができる、標識プローブの第２のセットと、（Ｆ）酸試薬であって、酸試薬が、標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、酸試薬と、を含む（例えば、図２Ｂ及び６Ｂを参照されたい）。
一実施形態では、キットは、標識プローブの第３のセットをさらに含み、標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に特異的であり、標識プローブの第３のサブセットが、標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、標識プローブのサブセットの各々の標識プローブが、増幅剤のサブセットのうちの１つの増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける標識が、標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、標識プローブと増幅剤との間の融解温度が、標的プローブ、前前増幅剤、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、標識プローブの第３のセットが、標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識することができる。
標的プローブのセットを含む本発明のキットのいくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の標的プローブのセットを含み、各標的プローブのセットは、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの対を含む。一実施形態では、各標的プローブのセットは、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションすることができる標的プローブの２つ以上の対を含む。
本発明のキットのいくつかの実施形態では、キットは、細胞を固定及び／または透過処理するための少なくとも１つの試薬を含む。
本発明のキットのいくつかの実施形態では、酸試薬は、５～４０％もしくは２０～３０％の酸、または本明細書に開示される他の濃度を含む。一実施形態では、酸は、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、及びクエン酸からなる群から選択される。
本発明のキットのいくつかの実施形態では、酸試薬は、塩を含む。一実施形態では、酸試薬は、ＳＳＣを含む。一実施形態では、酸試薬は、１倍～１３倍のＳＳＣまたは３．２倍～１２．８倍のＳＳＣを含む。
本発明はまた、細胞または複数の細胞を含む試料を提供し、酸試薬は、細胞に適用され、細胞上に存在する。細胞は、任意選択で固定され得る。細胞は、任意選択で、透過処理され得る。細胞の固定及び／または透過処理は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイに特に適用可能である。任意選択で、細胞は、本明細書に開示されるプローブ構成のうちのいずれかに結合した１つ以上の標的核酸を含むことができる。
本発明はさらに、細胞または複数の細胞を含むスライドを提供し、酸試薬は、スライド上の細胞に適用され、スライド上の細胞上に存在する。任意選択で、細胞は、スライドに固定される。任意選択で、細胞は、透過処理される。特定の実施形態では、スライド上の細胞は、ｉｎ ｓｉｔｕアッセイのために固定及び／または透過処理される。任意選択で、スライド上の細胞は、本明細書に開示されるプローブ構成のうちのいずれかに結合した１つ以上の標的核酸を含むことができる。
本明細書に示されている、本発明の定義内で、本発明の様々な実施形態の活性に実質的に影響を及ぼさない修正が行われることも理解されたい。したがって、以下の実施例は、例示するためのものであり、本発明を限定しないことが意図される。
実施例Ｉ
酸処理は、標的核酸にハイブリダイゼーションしたプローブを効果的に除去し、細胞ＲＮＡ及び組織形態に最小限の影響を与える
この実施例は、細胞内の標的核酸にハイブリダイゼーションしたプローブの効果的な除去と、細胞ＲＮＡ及び組織形態の保持とを記載する。
酸処理は、標的核酸にハイブリダイゼーションしたプローブを効果的に除去し、細胞ＲＮＡ及び組織形態に最小限の影響を与える
この実施例は、細胞内の標的核酸にハイブリダイゼーションしたプローブの効果的な除去と、細胞ＲＮＡ及び組織形態の保持とを記載する。
図３Ａ及び３Ｂは、標的核酸の検出の逐次的なラウンドのための酸処理を示す。図３Ａは、酸処理が、新鮮な凍結マウスの脳における標的プローブ及び増幅複合体を効果的に除去したことを示す。新鮮な凍結切片として調製したマウスの脳におけるグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｄｈ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（Ｐｇｋ１）、塩基性ヘリックスループヘリックスファミリーメンバーＥ２２（Ｂｈｌｈｅ２２）、及びコンプレキシン２（Ｃｐｌｘ２）の４つの高度に発現された陽性対照遺伝子の検出を示す。４つの遺伝子の標的プローブ（ＺＺプローブ）を一緒にハイブリダイゼーションし、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＨｉＰｌｅｘ増幅システムを使用してシグナルを一緒に増幅した。４つの遺伝子を、これらの４つの標的プローブに割り当てられたシグナル増幅システムに対応する蛍光標識プローブを使用して、反復的な検出の１回目のラウンドで検出した。Ａｌｅｘａ ４８８、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、及びＡｌｅｘａ ７５０フルオロフォアを、それぞれ、Ｇａｐｄｈ、Ｐｇｋ１、Ｂｈｌｈｅ２２、及びＣｐｌｘ２を検出するために使用した。核を青色のＤＡＰＩ（４′，６－ジアミジノ－２－フェニルインドリン）で染色した（上部パネル）。シグナル検出後、組織切片を酸性溶液（２０％の酢酸、６．４倍のＳＳＣ）で５分間、室温（ＲＴ）で処理し、酸処理をさらに２回繰り返した。次いで、切片を、標的プローブを添加することなく、ハイブリダイゼーション及び増幅の２回目のラウンドに使用した。酸処理後の２回目のラウンドではシグナルはほとんどから全く検出されず（下部パネル）、したがって、以前ハイブリダイゼーションした標的プローブ及びシグナル増幅成分の完全な除去を示した。
図３Ｂは、酸処理が新鮮な凍結マウスの脳の細胞ＲＮＡ及び組織形態に最小限の影響を与えたことを示す。図３Ａ（上部パネル）に記載されるように、新鮮な凍結切片として調製されたマウスの脳において、４つの陽性対照遺伝子（Ｇａｐｄｈ、Ｐｇｋ１、Ｂｈｌｈｅ２２、及びＣｐｌｘ２）を検出した。シグナル検出後、酸処理を２回ではなく４回繰り返したことを除いて、切片を図３Ａに記載されるように酸溶液で処理した。次いで、処理した切片を、ハイブリダイゼーション及び増幅の２回目のラウンドに使用して、同じ４つの遺伝子を検出した。ハイブリダイゼーションの２回目のラウンド（下部パネル）で検出されたシグナルを、ハイブリダイゼーションの１回目のラウンド（上部パネル）で検出されたシグナルと比較すると、標的プローブのハイブリダイゼーション及びシグナル増幅の２回目のラウンドは、同様の発現パターンをもたらし、酸処理からのＲＮＡの最小限の損失を示す。
これらの結果は、酸試薬による細胞の処理が、細胞内の標的核酸にハイブリダイゼーションしたプローブの効果的な除去と、細胞ＲＮＡ及び組織形態の保持とに効果的であることを示す。
実施例ＩＩ
複数ラウンドの酸処理及び逐次的なラウンドのプローブハイブリダイゼーションは、細胞形態及び検出可能な核酸を保持する
この実施例は、標的核酸に結合したプローブを除去するために複数ラウンドの酸処理を細胞に適用することができ、酸処理後に標的核酸を検出することができることを説明する。
複数ラウンドの酸処理及び逐次的なラウンドのプローブハイブリダイゼーションは、細胞形態及び検出可能な核酸を保持する
この実施例は、標的核酸に結合したプローブを除去するために複数ラウンドの酸処理を細胞に適用することができ、酸処理後に標的核酸を検出することができることを説明する。
実験は、実質的に、図２Ｂに示されるように実施した。図２Ｂに示されるように、「Ｋ」及び「Ｌ」という２つの「ラウンド」が示されており、Ｋは、Ｎ標的プローブハイブリダイゼーションの逐次的なラウンドを指し、Ｌは、各Ｋラウンド内の標識プローブハイブリダイゼーションの反復的なラウンドを指す。この実験では、３回の逐次的なラウンドの標的プローブハイブリダイゼーションを行い、各逐次的なラウンド内で、３回の反復的なラウンドの標識プローブハイブリダイゼーション及びイメージングを行った。この実験における実証目的のために、１２個の標的プローブを各「Ｋ」ラウンドで使用した：ラウンドＫ＝１の場合、ＲＮＡポリメラーゼＩＩサブユニットＡ（Ｐｏｌｒ２Ａ）、ペプチジルプロリルイソメラーゼＢ（Ｐｐｉｂ）、ユビキチンＣ（Ｕｂｃ）、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ１（Ｈｐｒｔ１）、アクチンベータ（ＡｃｔＢ）、チューブリンベータ３クラスＩＩＩ（Ｔｕｂｂ３）、架橋インテグレーター１（Ｂｉｎ１）、乳酸デヒドロゲナーゼＡ（Ｌｄｈａ）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｄｈ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（Ｐｇｋ１）、塩基性ヘリックスループヘリックスファミリーメンバーＥ２２（Ｂｈｌｈｅ２２）、及びコンプレキシン２（Ｃｐｌｘ２）；ラウンドＫ＝３の場合、５－ヒドロキシトリプタミン受容体７（Ｈｔｒ７）、プロトカドヘリン８（Ｐｃｄｈ８）、溶質担体ファミリー３２メンバー１（Ｓｌｃ３２ａ１）、チロシンヒドロキシラーゼ（Ｔｈ）、シナプトポリン（ｓｙｎａｐｔｏｐｏｒｉｎ）（Ｓｙｎｐｒ）、クリスタリンミュー（Ｃｒｙｍ）、ウォルフラミンＥＲ膜貫通型糖タンパク質（Ｗｆｓ１）、カルビンジン１（Ｃａｌｂ１）、（Ｄｒｄ１ａ）、ドーパミン受容体Ｄ１（Ｄｒｄ２）、カンナビノイド受容体１（Ｃｎｒ１）、フォークヘッドボックスＰ１（Ｆｏｘｐ１）。
１２個の標的プローブのそれぞれの群を、逐次的なラウンド１及び３でそれぞれハイブリダイゼーションし、１２個の「ダミー」標的プローブまたはブランクのプローブ緩衝液を、２回目の逐次的なラウンドで使用した。標的プローブハイブリダイゼーションの逐次的なラウンド（Ｋラウンド）の間に酸処理ステップを行った。図４において、画像の上部パネルは、１回目の逐次的なラウンド（Ｋ＝１）内の３回目の反復的な検出ラウンド（Ｌ＝３）に対応する。図４において、下部パネルの画像は、標的プローブハイブリダイゼーションの３回目の逐次的なラウンド（Ｋ＝３）内の１回目のラウンドの反復的な検出（Ｌ＝１）からであった。
図４は、２回のラウンドの酸処理及び逐次的なハイブリダイゼーション後の良好な形態及びシグナル検出を示す。図４において、上部パネルは、図２Ｂに概説されるワークフローに示されるように実質的に行った、標的プローブのハイブリダイゼーションの１回目のラウンド（Ｋ＝１）及び反復的な検出の３回目のラウンド（Ｌ＝３）での、新鮮な凍結マウスの脳切片における、４つの陽性対照遺伝子である、Ｐｏｌｒ２Ａ、Ｐｐｉｂ、Ｕｂｃ、及びＨｐｒｔ１の検出を示す。Ａｌｅｘａ ４８８、ＡＴＴＯ ５５０、ＡＴＴＯ ６４７Ｎ、及びＡｌｅｘａ ７５０フルオロフォアを、それぞれ、Ｐｏｌｒ２ａ、Ｐｐｉｂ、Ｕｂｃ、及びＨｐｒｔ１を検出するために使用し、核を青色のＤＡＰＩで染色した。図４において、下部パネルは、標的プローブのハイブリダイゼーション及び増幅の３回目のラウンド（Ｋ＝３）ならびに反復的な検出の１回目のラウンド（Ｌ＝１）での、マウスの脳の線条体領域における、４つの異なる低発現標的である、Ｈｔｒ７、Ｐｃｄｈ８、Ｓｌｃ３２ａ、及びＴｈの検出を示す。酸処理、標的ハイブリダイゼーション及び増幅ステップを、図３Ａに記載されるように、ラウンド１及びラウンド２の標的ハイブリダイゼーション後に行った。
これらの結果は、複数ラウンドの酸処理を細胞に適用して、標的核酸に結合したプローブを除去することができることを示す。結果はまた、標的核酸が酸処理後に検出され得ることを示す。
実施例ＩＩＩ
例示的な酸処理試薬及び条件
この実施例では、様々な酸処理試薬及び条件を試験する実験を記載する。
例示的な酸処理試薬及び条件
この実施例では、様々な酸処理試薬及び条件を試験する実験を記載する。
最適化された酸処理条件を探索するための一連の実験において、新鮮な凍結マウスの脳またはホルマリン固定パラフィン包埋ＨｅＬａ細胞を、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＨｉＰｌｅｘプロトコル（Ａｄｖａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｎｅｗａｒｋ ＣＡ）を用いて様々な陽性対照遺伝子について染色した。イメージング後、スライドを、様々な条件で、酢酸で処理して、結合した標的プローブ及びシグナル生成複合体を除去した。酸処理後、ＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）ＨｉＰｌｅｘシグナル増幅ステップを、以前のラウンドから残留結合標的プローブからの任意のシグナルを検出するために、任意の標的プローブを付加することなく行った。スライドを画像化し、視覚的に評価した。結果を表１に示す。
これらの結果は、細胞内の標的核酸に結合したプローブを除去するために様々な酸試薬を使用することができることを実証している。
この出願の全体を通じて、様々な刊行物が参照されている。これらの刊行物の開示内容の全体は、参照により、本発明が属する分野の現状をさらに十分に説明する目的で、本明細書に組み込まれる。上記の実施例を参照しながら、本発明について説明してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく、様々な修正を加えることができることが理解されるべきである。
Claims (116)
- 細胞内の核酸に結合したプローブの結合を破壊するための方法であって、前記細胞を酸試薬と接触させることを含み、前記細胞が、前記細胞内の第１の標的核酸にハイブリダイゼーションした第１のプローブを含み、前記酸試薬が、前記第１のプローブと前記第１の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する、前記方法。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させることが、１回以上繰り返される、請求項１に記載の方法。
- 前記細胞から前記第１のプローブを除去することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
- 前記細胞を第２のプローブと接触させるステップをさらに含み、前記第２のプローブが、前記細胞内の第２の標的核酸にハイブリダイゼーションし、前記第２の標的核酸が、前記第１の標的核酸と同一であるか、または異なる、請求項３に記載の方法。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させるステップをさらに含み、前記酸試薬が、前記第２のプローブと前記第２の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する、請求項４に記載の方法。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させることが、１回以上繰り返される、請求項５に記載の方法。
- 前記細胞から前記第２のプローブを除去するステップをさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
- 細胞内の核酸に結合したプローブの結合を破壊するための方法であって、前記細胞を酸試薬と接触させることを含み、前記細胞が、前記細胞内の１つ以上の第１の標的核酸にハイブリダイゼーションした１つ以上の第１のプローブを含み、前記酸試薬が、前記１つ以上の第１のプローブと前記１つ以上の第１の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する、前記方法。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させることが、１回以上繰り返される、請求項８に記載の方法。
- 前記細胞から前記１つ以上の第１のプローブを除去することをさらに含む、請求項８または９に記載の方法。
- 前記細胞が、２つ以上の第１の標的核酸にハイブリダイゼーションした２つ以上の第１のプローブを含む、請求項８または９に記載の方法。
- 前記第１の標的核酸の各々が、前記第１のプローブへのハイブリダイゼーションによって標識され、各第１の標的核酸上の前記標識が、前記第１のプローブにハイブリダイゼーションした他の第１の標的核酸（複数可）上の前記標識から区別可能である、請求項１１に記載の方法。
- 前記細胞を１つ以上の第２のプローブと接触させるステップをさらに含み、前記１つ以上の第２のプローブが、前記細胞内の１つ以上の第２の標的核酸にハイブリダイゼーションし、前記１つ以上の第２の標的核酸が、前記１つ以上の第１の標的核酸と同一であるか、または異なる、請求項８～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞が、２つ以上の第２の標的核酸にハイブリダイゼーションした２つ以上の第２のプローブを含む、請求項１３に記載の方法。
- 前記第２の標的核酸の各々が、前記第２のプローブへのハイブリダイゼーションによって標識され、各第２の標的核酸上の前記標識が、前記第２のプローブにハイブリダイゼーションした他の第２の標的核酸（複数可）上の前記標識から区別可能である、請求項１４に記載の方法。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させるステップをさらに含み、前記酸試薬が、前記第２のプローブと前記１つ以上の第２の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させることが、１回以上繰り返される、請求項１６に記載の方法。
- 前記細胞から前記第２のプローブを除去するステップをさらに含む、請求項１６または１７に記載の方法。
- 細胞内の複数の標的核酸のマルチプレックス検出のための方法であって、
（Ａ）複数の標的核酸を含む細胞を含む試料を、１つ以上の標的核酸に特異的なプローブのセットと接触させることであって、標的核酸に対する前記プローブが、
（ａ）標的プローブのセットであって、前記標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの１つ以上の対を含む、前記標的プローブのセットと、
（ｂ）前増幅剤のセットであって、前記前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前記前増幅剤が、前記標的プローブの対に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記前増幅剤のセットと、
（ｃ）増幅剤のセットであって、前記増幅剤のセットが、複数の増幅剤を含み、前記増幅剤が、前記前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記増幅剤のセットと、
（ｄ）標識プローブのセットであって、前記標識プローブのセットの前記標識プローブが各々、前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含む、前記標識プローブのセットと、を含む、前記接触させることと、
（Ｂ）それぞれの標的核酸に結合した検出可能な標識を検出することと、
（Ｃ）前記試料を酸試薬と接触させて、それによって前記標的核酸に結合した前記プローブの結合を破壊することと、を含む、前記方法。 - 細胞内の複数の標的核酸のマルチプレックス検出のための方法であって、
（Ａ）複数の標的核酸を含む細胞を含む試料を、１つ以上の標的核酸に特異的なプローブのセットと接触させることであって、標的核酸に対する前記プローブが、
（ａ）標的プローブのセットであって、前記標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの１つ以上の対を含む、前記標的プローブのセットと、
（ｂ）前－前増幅剤（ｐｒｅ－ｐｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）のセットであって、前記前－前増幅剤のセットが、１つ以上の前－前増幅剤を含み、各前－前増幅剤が、標的プローブの前記１つ以上の対に対する結合部位を含む、前記前－前増幅剤のセットと、
（ｃ）前増幅剤のセットであって、前記前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前記前増幅剤が、前記前－前増幅剤に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記前増幅剤のセットと、
（ｄ）増幅剤のセットであって、前記増幅剤のセットが、複数の増幅剤を含み、前記増幅剤が、前記前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記増幅剤のセットと、
（ｅ）標識プローブのセットであって、前記標識プローブのセットの前記標識プローブが各々、前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含む、前記標識プローブのセットと、を含む、前記接触させることと、
（Ｂ）それぞれの標的核酸に結合した検出可能な標識を検出することと、
（Ｃ）前記試料を酸試薬と接触させて、それによって前記標的核酸に結合した前記プローブの結合を破壊することと、を含む、前記方法。 - 細胞内の複数の標的核酸のマルチプレックス検出のための方法であって、
（Ａ）複数の標的核酸を含む細胞を含む試料を、１つ以上の標的核酸に特異的なプローブのセットと接触させることであって、標的核酸に対する前記プローブが、
（ａ）標的プローブのセットであって、前記標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの１つ以上の対を含む、前記標的プローブのセットと、
（ｂ）前－前増幅剤のセットであって、前記前－前増幅剤のセットが、前－前増幅剤の１つ以上の対を含み、前記前－前増幅剤の対の各前－前増幅剤が、前記標的プローブの対の前記標的プローブのうちの１つに対する結合部位を含む、前記前－前増幅剤のセットと、
（ｃ）前増幅剤のセットであって、前記前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前記前増幅剤が、前記前－前増幅剤の対に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記前増幅剤のセットと、
（ｄ）増幅剤のセットであって、前記増幅剤のセットが、複数の増幅剤を含み、前記増幅剤が、前記前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記増幅剤のセットと、
（ｅ）標識プローブのセットであって、前記標識プローブのセットの前記標識プローブが各々、前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含む、前記標識プローブのセットと、を含む、前記接触させることと、
（Ｂ）それぞれの標的核酸に結合した検出可能な標識を検出することと、
（Ｃ）前記試料を酸試薬と接触させて、それによって前記標的核酸に結合した前記プローブの結合を破壊することと、を含む、前記方法。 - 前記細胞を前記酸試薬と接触させることが、１回以上繰り返される、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
- １回以上、ステップ（Ａ）及び（Ｂ）を繰り返すこと、またはステップ（Ａ）、（Ｂ）、及び（Ｃ）を繰り返すことをさらに含む、請求項１９～２２のいずれか１項に記載の方法。
- 複数の標的核酸を検出する方法であって、
（Ａ）複数の核酸を含む細胞を含む試料を、複数の標的プローブのセットと接触させることであって、各標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの対を含む、前記接触させることと、
（Ｂ）前記試料を、前増幅剤のセットと接触させることであって、前記前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前記複数の前増幅剤が、各標的プローブのセットに特異的な前増幅剤を含み、各前増幅剤が、前記標的プローブのセットのうちの１つの前記標的プローブの対に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
（Ｃ）前記試料を、増幅剤のセットと接触させることであって、前記増幅剤のセットが、各前増幅剤に特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤の各サブセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤のサブセットの前記増幅剤が、標的プローブのセットに特異的な前記前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
（Ｄ）前記試料を、標識プローブの第１のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々における前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、切断可能であり、前記標識プローブの第１のセットが、前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｅ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第１のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第１のサブセットを検出することと、
（Ｆ）前記標的核酸の第１のサブセットに結合した前記標識プローブの第１のセットから前記標識を切断することと、
（Ｇ）前記試料を、標識プローブの第２のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第２のサブセットが、前記標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、任意選択で切断可能であり、前記標識プローブの第２のセットが、前記標的核酸の第１のサブセットとは異なる前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｈ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第２のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第２のサブセットを検出することであって、複数の標的核酸が検出される、前記検出することと、
（Ｉ）前記試料を酸試薬と接触させて、それによって前記標的核酸に結合した前記プローブの結合を破壊することと、を含む、前記方法。 - 前記方法が、ステップ（Ｉ）の前に、
（Ｊ）前記標的核酸の第２のサブセットに結合した前記標識プローブの第２のセットから前記標識を切断することと、
（Ｋ）前記試料を、標識プローブの第３のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第３のサブセットが、前記標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、任意選択で切断可能であり、前記標識プローブの第３のセットが、前記標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｌ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第３のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第３のサブセットを検出することと、を含む、請求項２４に記載の方法。 - ステップ（Ｊ）～（Ｌ）を１回以上繰り返すことを含む、請求項２５に記載の方法。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させることが、１回以上繰り返される、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。
- ステップ（Ａ）～（Ｉ）またはステップ（Ａ）～（Ｈ）、（Ｊ）～（Ｌ）及び（Ｉ）を１回以上繰り返すことをさらに含む、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の方法。
- ステップ（Ａ）～（Ｈ）またはステップ（Ａ）～（Ｈ）及び（Ｊ）～（Ｌ）を繰り返すことをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
- 複数の標的核酸を検出する方法であって、
（Ａ）複数の核酸を含む細胞を含む試料を、複数の標的プローブのセットと接触させることであって、各標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの対を含む、前記接触させることと、
（Ｂ）前記試料を、前－前増幅剤のセットと接触させることであって、前記前－前増幅剤のセットが、複数の前－前増幅剤を含み、前記複数の前－前増幅剤が、各標的プローブのセットに特異的な前－前増幅剤を含み、各前－前増幅剤が、前記標的プローブのセットのうちの１つの前記標的プローブの対に対する結合部位及び前増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
（Ｃ）前記試料を、前増幅剤のセットと接触させることであって、前記前増幅剤のセットが、各前－前増幅剤に特異的な前増幅剤の複数のサブセットを含み、前増幅剤の各サブセットが、複数の前増幅剤を含み、前増幅剤のサブセットの前記前増幅剤が、標的プローブのセットに特異的な前記前－前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
（Ｄ）前記試料を、増幅剤のセットと接触させることであって、前記増幅剤のセットが、前増幅剤の各サブセットに特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤の各サブセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤のサブセットの前記増幅剤が、前記前増幅剤のサブセットのうちの１つの前記前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
（Ｅ）前記試料を、標識プローブの第１のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々における前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、切断可能であり、前記標識プローブの第１のセットが、前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｆ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第１のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第１のサブセットを検出することと、
（Ｇ）前記標的核酸の第１のサブセットに結合した前記標識プローブの第１のセットから前記標識を切断することと、
（Ｈ）前記試料を、標識プローブの第２のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第２のサブセットが、前記標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、任意選択で切断可能であり、前記標識プローブの第２のセットが、前記標的核酸の第１のサブセットとは異なる前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｉ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第２のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第２のサブセットを検出することであって、複数の標的核酸が検出される、前記検出することと、
（Ｊ）前記試料を酸試薬と接触させて、それによって前記標的核酸に結合した前記プローブの結合を破壊することと、を含む、前記方法。 - 前記方法が、ステップ（Ｊ）の前に、
（Ｋ）前記標的核酸の第２のサブセットに結合した前記標識プローブの第２のセットから前記標識を切断することと、
（Ｌ）前記試料を、標識プローブの第３のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第３のサブセットが、前記標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、任意選択で切断可能であり、前記標識プローブの第３のセットが、前記標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｍ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第３のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第３のサブセットを検出することと、を含む、請求項３０に記載の方法。 - ステップ（Ｋ）～（Ｍ）を１回以上繰り返すことを含む、請求項３１に記載の方法。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させることが、１回以上繰り返される、請求項３０～３２のいずれか１項に記載の方法。
- ステップ（Ａ）～（Ｊ）またはステップ（Ａ）～（Ｉ）、（Ｋ）～（Ｍ）及び（Ｊ）を１回以上繰り返すことをさらに含む、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の方法。
- ステップ（Ａ）～（Ｉ）またはステップ（Ａ）～（Ｉ）及び（Ｋ）～（Ｍ）を繰り返すことをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
- 複数の核酸を検出する方法であって、
（Ａ）複数の核酸を含む細胞を含む試料を、複数の標的プローブのセットと接触させることであって、各標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの対を含む、前記接触させることと、
（Ｂ）前記試料を、前－前増幅剤のセットと接触させることであって、前記前－前増幅剤のセットが、前－前増幅剤の複数の対を含み、前記前－前増幅剤のセットが、前記標的プローブのセットの標的プローブの前記対の各々に特異的な前－前増幅剤の対を含み、前記前－前増幅剤の対の各前－前増幅剤は、標的プローブのセットの標的プローブの前記対の前記標的プローブのうちの１つに対する結合部位を含み、前記前－前増幅剤が、前増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
（Ｃ）前記試料を、前増幅剤のセットと接触させることであって、前記前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前記複数の前増幅剤が、前－前増幅剤の各対に特異的な前増幅剤を含み、各前増幅剤が、前記前－前増幅剤のセットの前－前増幅剤の前記対のうちの１つに対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
（Ｄ）前記試料を、増幅剤のセットと接触させることであって、前記増幅剤のセットが、前－前増幅剤の各対に特異的な各前増幅剤に特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤のサブセットの前記増幅剤が、前－前増幅剤の対に特異的な前記前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
（Ｅ）前記試料を、標識プローブの第１のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々における前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、切断可能であり、前記標識プローブの第１のセットが、前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｆ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第１のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第１のサブセットを検出することと、
（Ｇ）前記標的核酸の第１のサブセットに結合した前記標識プローブの第１のセットから前記標識を切断することと、
（Ｈ）前記試料を、標識プローブの第２のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第２のサブセットが、前記標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、任意選択で切断可能であり、前記標識プローブの第２のセットが、前記標的核酸の第１のサブセットとは異なる前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｉ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第２のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第２のサブセットを検出することであって、複数の標的核酸が検出される、前記検出することと、
（Ｊ）前記試料を酸試薬と接触させて、それによって前記標的核酸に結合した前記プローブの結合を破壊することと、を含む、前記方法。 - 前記方法が、ステップ（Ｊ）の前に、
（Ｋ）前記標的核酸の第２のサブセットに結合した前記標識プローブの第２のセットから前記標識を切断することと、
（Ｌ）前記試料を、標識プローブの第３のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第３のサブセットが、前記標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、任意選択で切断可能であり、前記標識プローブの第３のセットが、前記標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｍ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第３のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第３のサブセットを検出することと、を含む、請求項３６に記載の方法。 - ステップ（Ｋ）～（Ｍ）を１回以上繰り返すことを含む、請求項３７に記載の方法。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させることが、１回以上繰り返される、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の方法。
- ステップ（Ａ）～（Ｊ）またはステップ（Ａ）～（Ｉ）、（Ｋ）～（Ｍ）及び（Ｊ）を１回以上繰り返すことをさらに含む、請求項３６～３９のいずれか１項に記載の方法。
- ステップ（Ａ）～（Ｉ）またはステップ（Ａ）～（Ｉ）及び（Ｋ）～（Ｍ）を繰り返すことをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
- 複数の標的核酸を検出する方法であって、
（Ａ）複数の核酸を含む細胞を含む試料を、複数の標的プローブのセットと接触させることであって、各標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの対を含む、前記接触させることと、
（Ｂ）前記試料を、前増幅剤のセットと接触させることであって、前記前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前記複数の前増幅剤が、各標的プローブのセットに特異的な前増幅剤を含み、各前増幅剤が、前記標的プローブのセットのうちの１つの前記標的プローブの対に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
（Ｃ）前記試料を、増幅剤のセットと接触させることであって、前記増幅剤のセットが、各前増幅剤に特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤の各サブセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤のサブセットの前記増幅剤が、標的プローブのセットに特異的な前記前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
（Ｄ）前記試料を、標識プローブの第１のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々における前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度が、前記標的プローブ、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度よりも低く、前記標識プローブの第１のセットが、前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｅ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第１のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第１のサブセットを検出することと、
（Ｆ）前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度を上回り、かつ前記標的プローブ、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度を下回る温度で前記試料をインキュベートし、それによって前記標的核酸の第１のサブセットに結合した前記標識プローブの第１のセットから前記標識を除去することと、
（Ｇ）前記試料を、標識プローブの第２のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第２のサブセットが、前記標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、任意選択で、前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度が、前記標的プローブ、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度よりも低く、前記標識プローブの第２のセットが、前記標的核酸の第１のサブセットとは異なる前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｈ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第２のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第２のサブセットを検出することであって、複数の標的核酸が検出される、前記検出することと、
（Ｉ）前記試料を酸試薬と接触させて、それによって前記標的核酸に結合した前記プローブの結合を破壊することと、を含む、前記方法。 - 前記方法が、ステップ（Ｉ）の前に、
（Ｊ）前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度を上回り、かつ前記標的プローブ、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度を下回る温度で前記試料をインキュベートし、それによって前記標的核酸の第２のサブセットに結合した前記標識プローブの第２のセットから前記標識を除去することと、
（Ｋ）前記試料を、標識プローブの第３のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第３のサブセットが、前記標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、任意選択で、前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度が、前記標的プローブ、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度よりも低く、前記標識プローブの第３のセットが、前記標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｌ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第３のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第３のサブセットを検出することと、を含む、請求項４２に記載の方法。 - ステップ（Ｊ）～（Ｌ）を１回以上繰り返すことを含む、請求項４３に記載の方法。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させることが、１回以上繰り返される、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。
- ステップ（Ａ）～（Ｉ）またはステップ（Ａ）～（Ｈ）、（Ｊ）～（Ｌ）及び（Ｉ）を１回以上繰り返すことをさらに含む、請求項４２～４５のいずれか１項に記載の方法。
- ステップ（Ａ）～（Ｈ）またはステップ（Ａ）～（Ｈ）及び（Ｊ）～（Ｌ）を繰り返すことをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
- 複数の標的核酸を検出する方法であって、
（Ａ）複数の核酸を含む細胞を含む試料を、複数の標的プローブのセットと接触させることであって、各標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの対を含む、前記接触させることと、
（Ｂ）前記試料を、前－前増幅剤のセットと接触させることであって、前記前－前増幅剤のセットが、複数の前－前増幅剤を含み、前記複数の前－前増幅剤が、各標的プローブのセットに特異的な前－前増幅剤を含み、各前－前増幅剤が、前記標的プローブのセットのうちの１つの前記標的プローブの対に対する結合部位及び前増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
（Ｃ）前記試料を、前増幅剤のセットと接触させることであって、前記前増幅剤のセットが、各前－前増幅剤に特異的な前増幅剤の複数のサブセットを含み、前増幅剤の各サブセットが、複数の前増幅剤を含み、前増幅剤のサブセットの前記前増幅剤が、標的プローブのセットに特異的な前記前－前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
（Ｄ）前記試料を、増幅剤のセットと接触させることであって、前記増幅剤のセットが、前増幅剤の各サブセットに特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤の各サブセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤のサブセットの前記増幅剤が、前記前増幅剤のサブセットのうちの１つの前記前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
（Ｅ）前記試料を、標識プローブの第１のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々における前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度が、前記標的プローブ、前記前－前増幅剤、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度よりも低く、前記標識プローブの第１のセットが、前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｆ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第１のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第１のサブセットを検出することと、
（Ｇ）前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度を上回り、かつ前記標的プローブ、前記前－前増幅剤、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度を下回る温度で前記試料をインキュベートし、それによって前記標的核酸の第１のサブセットに結合した前記標識プローブの第１のセットから前記標識を除去することと、
（Ｈ）前記試料を、標識プローブの第２のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第２のサブセットが、前記標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、任意選択で、前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度が、前記標的プローブ、前記前－前増幅剤、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度よりも低く、前記標識プローブの第２のセットが、前記標的核酸の第１のサブセットとは異なる前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｉ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第２のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第２のサブセットを検出することであって、複数の標的核酸が検出される、前記検出することと、
（Ｊ）前記試料を酸試薬と接触させて、それによって前記標的核酸に結合した前記プローブの結合を破壊することと、を含む、前記方法。 - 前記方法が、ステップ（Ｊ）の前に、
（Ｋ）前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度を上回り、かつ前記標的プローブ、前記前－前増幅剤、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度を下回る温度で前記試料をインキュベートし、それによって前記標的核酸の第２のサブセットに結合した前記標識プローブの第２のセットから前記標識を除去することと、
（Ｌ）前記試料を、標識プローブの第３のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第３のサブセットが、前記標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、任意選択で、前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度が、前記標的プローブ、前記前－前増幅剤、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度よりも低く、前記標識プローブの第３のセットが、前記標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｍ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第３のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第３のサブセットを検出することと、を含む、請求項４８に記載の方法。 - ステップ（Ｋ）～（Ｍ）を１回以上繰り返すことを含む、請求項４９に記載の方法。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させることが、１回以上繰り返される、請求項４８～５０のいずれか１項に記載の方法。
- ステップ（Ａ）～（Ｊ）またはステップ（Ａ）～（Ｉ）、（Ｋ）～（Ｍ）及び（Ｊ）を１回以上繰り返すことをさらに含む、請求項４８～５１のいずれか１項に記載の方法。
- ステップ（Ａ）～（Ｉ）またはステップ（Ａ）～（Ｉ）及び（Ｋ）～（Ｍ）を繰り返すことをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
- 複数の核酸を検出する方法であって、
（Ａ）複数の核酸を含む細胞を含む試料を、複数の標的プローブのセットと接触させることであって、各標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの対を含む、前記接触させることと、
（Ｂ）前記試料を、前－前増幅剤のセットと接触させることであって、前記前－前増幅剤のセットが、前－前増幅剤の複数の対を含み、前記前－前増幅剤のセットが、前記標的プローブのセットの標的プローブの前記対の各々に特異的な前－前増幅剤の対を含み、前記前－前増幅剤の対の各前－前増幅剤は、標的プローブのセットの標的プローブの前記対の前記標的プローブのうちの１つに対する結合部位を含み、前記前－前増幅剤が、前増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
（Ｃ）前記試料を、前増幅剤のセットと接触させることであって、前記前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前記複数の前増幅剤が、前－前増幅剤の各対に特異的な前増幅剤を含み、各前増幅剤が、前記前－前増幅剤のセットの前－前増幅剤の前記対のうちの１つに対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
（Ｄ）前記試料を、増幅剤のセットと接触させることであって、前記増幅剤のセットが、前－前増幅剤の各対に特異的な各前増幅剤に特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤のサブセットの前記増幅剤が、前－前増幅剤の対に特異的な前記前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記接触させることと、
（Ｅ）前記試料を、標識プローブの第１のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々における前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度が、前記標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、前記標識プローブの第１のセットが、前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｆ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第１のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第１のサブセットを検出することと、
（Ｇ）前記標識プローブと増幅剤との間の融解温度を上回り、かつ前記標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度を下回る温度で試料をインキュベートし、それによって前記標的核酸の第１のサブセットに結合した前記標識プローブの第１のセットから前記標識を除去することと、
（Ｈ）前記試料を、標識プローブの第２のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第２のサブセットが、前記標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、任意選択で、前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度が、前記標的プローブ、前－前増幅剤、前増幅剤、及び増幅剤の間の融解温度よりも低く、前記標識プローブの第２のセットが、前記標的核酸の第１のサブセットとは異なる前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｉ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第２のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第２のサブセットを検出することであって、複数の標的核酸が検出される、前記検出することと、
（Ｊ）前記試料を酸試薬と接触させて、それによって前記標的核酸に結合した前記プローブの結合を破壊することと、を含む、前記方法。 - 前記方法が、ステップ（Ｊ）の前に、
（Ｋ）前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度を上回り、かつ前記標的プローブ、前記前－前増幅剤、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度を下回る温度で前記試料をインキュベートし、それによって前記標的核酸の第２のサブセットに結合した前記標識プローブの第２のセットから前記標識を除去することと、
（Ｌ）前記試料を、標識プローブの第３のセットと接触させることであって、前記標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第３のサブセットが、前記標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、任意選択で、前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度が、前記標的プローブ、前記前－前増幅剤、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度よりも低く、前記標識プローブの第３のセットが、前記標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる前記複数の標的プローブのセットにハイブリダイゼーションした標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識する、前記接触させることと、
（Ｍ）前記標的核酸に結合した前記標識プローブの第３のセットの前記標識プローブを検出し、それによって前記標的核酸の第３のサブセットを検出することと、を含む、請求項５４に記載の方法。 - ステップ（Ｋ）～（Ｍ）を１回以上繰り返すことを含む、請求項５５に記載の方法。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させることが、１回以上繰り返される、請求項５４～５６のいずれか１項に記載の方法。
- ステップ（Ａ）～（Ｊ）またはステップ（Ａ）～（Ｉ）、（Ｋ）～（Ｍ）及び（Ｊ）を１回以上繰り返すことをさらに含む、請求項５４～５７のいずれか１項に記載の方法。
- ステップ（Ａ）～（Ｉ）またはステップ（Ａ）～（Ｉ）及び（Ｋ）～（Ｍ）を繰り返すことをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
- 各標的プローブのセットが、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの２つ以上の対を含む、請求項２４～５９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記酸試薬が、５～４０％または２０～３０％の酸を含む、請求項１～６０のいずれか１項に記載の方法。
- 前記酸が、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、及びクエン酸からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
- 前記酸試薬が、塩を含む、請求項１～６２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記酸試薬が、ＳＳＣを含む、請求項６３に記載の方法。
- 前記酸試薬が、１倍～１３倍のＳＳＣまたは３．２倍～１２．８倍のＳＳＣを含む、請求項６４に記載の方法。
- 前記標的核酸が独立して、ＤＮＡまたはＲＮＡである、請求項１～６５のいずれか１項に記載の方法。
- ＲＮＡである前記標的核酸が独立して、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、ミトコンドリアＲＮＡ、及び非コードＲＮＡからなる群から選択される、請求項６６に記載の方法。
- 前記試料が、組織標本であるか、または組織標本に由来する、請求項１～６７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記試料が、血液試料であるか、または血液試料に由来する、請求項１～６７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記試料が、細胞診試料であるか、または細胞診試料に由来する、請求項１～６７のいずれか１項に記載の方法。
- １つ以上の核酸標的に特異的な１つ以上のプローブと、請求項１～７０のいずれか１項に記載の方法を実施するための説明書と、を含む、キット。
- 細胞内の核酸に結合したプローブの結合を破壊するための方法で使用するための酸試薬を含むキットであって、前記方法が、前記細胞を前記酸試薬と接触させることを含み、前記細胞が、前記細胞内の第１の標的核酸にハイブリダイゼーションした第１のプローブを含み、前記酸試薬が、前記第１のプローブと前記第１の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する、前記キット。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させることが、１回以上繰り返される、請求項７２に記載のキット。
- 前記細胞から前記第１のプローブを除去することをさらに含む、請求項７２または７３に記載のキット。
- 前記細胞を第２のプローブと接触させるステップをさらに含み、前記第２のプローブが、前記細胞内の第２の標的核酸にハイブリダイゼーションし、前記第２の標的核酸が、前記第１の標的核酸と同一であるか、または異なる、請求項７４に記載のキット。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させるステップをさらに含み、前記酸試薬が、前記第２のプローブと前記第２の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する、請求項７５に記載のキット。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させることが、１回以上繰り返される、請求項７６に記載のキット。
- 前記細胞から前記第２のプローブを除去するステップをさらに含む、請求項７６または７７に記載のキット。
- 細胞内の核酸に結合したプローブの結合を破壊するための方法で使用するための酸試薬を含むキットであって、前記方法が、前記細胞を前記酸試薬と接触させることを含み、前記細胞が、前記細胞内の１つ以上の第１の標的核酸にハイブリダイゼーションした１つ以上の第１のプローブを含み、前記酸試薬が、前記１つ以上の第１のプローブと前記１つ以上の第１の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する、前記キット。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させることが、１回以上繰り返される、請求項７９に記載のキット。
- 前記細胞から前記１つ以上の第１のプローブを除去することをさらに含む、請求項７９または８０に記載のキット。
- 前記細胞が、２つ以上の第１の標的核酸にハイブリダイゼーションした２つ以上の第１のプローブを含む、請求項７９または８０に記載のキット。
- 前記第１の標的核酸の各々が、前記第１のプローブへのハイブリダイゼーションによって標識され、各第１の標的核酸上の前記標識が、前記第１のプローブにハイブリダイゼーションした他の第１の標的核酸（複数可）上の前記標識から区別可能である、請求項８２に記載のキット。
- 前記細胞を１つ以上の第２のプローブと接触させるステップをさらに含み、前記１つ以上の第２のプローブが、前記細胞内の１つ以上の第２の標的核酸にハイブリダイゼーションし、前記１つ以上の第２の標的核酸が、前記１つ以上の第１の標的核酸と同一であるか、または異なる、請求項７９～８３のいずれか１項に記載のキット。
- 前記細胞が、２つ以上の第２の標的核酸にハイブリダイゼーションした２つ以上の第２のプローブを含む、請求項８４に記載のキット。
- 前記第２の標的核酸の各々が、前記第２のプローブへのハイブリダイゼーションによって標識され、各第２の標的核酸上の前記標識が、前記第２のプローブにハイブリダイゼーションした他の第２の標的核酸（複数可）上の前記標識から区別可能である、請求項８５に記載のキット。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させるステップをさらに含み、前記酸試薬が、前記第２のプローブと前記１つ以上の第２の標的核酸との間のハイブリダイゼーションを破壊する、請求項８４～８６のいずれか１項に記載のキット。
- 前記細胞を前記酸試薬と接触させることが、１回以上繰り返される、請求項８７に記載のキット。
- 前記細胞から前記第２のプローブを除去するステップをさらに含む、請求項８７または８８に記載のキット。
- 標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットであって、
（Ａ）前増幅剤のセットであって、前記前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前記前増幅剤が、標的プローブの対に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記前増幅剤のセットと、
（Ｂ）増幅剤のセットであって、前記増幅剤のセットが、複数の増幅剤を含み、前記増幅剤が、前記前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記増幅剤のセットと、
（Ｃ）標識プローブのセットであって、前記標識プローブのセットの前記標識プローブが各々、前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含む、前記標識プローブのセットと、
（Ｄ）酸試薬であって、前記酸試薬が、前記標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、前記酸試薬と、を含む、前記キット。 - 前記キットが、標的プローブのセットを含み、前記標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの１つ以上の対を含む、請求項９０に記載のキット。
- 標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットであって、
（Ａ）前－前増幅剤のセットであって、前記前－前増幅剤のセットが、１つ以上の前－前増幅剤を含み、各前－前増幅剤が、標的プローブの１つ以上の対に対する結合部位を含む、前記前－前増幅剤のセットと、
（Ｂ）前増幅剤のセットであって、前記前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前記前増幅剤が、前記前－前増幅剤に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記前増幅剤のセットと、
（Ｃ）増幅剤のセットであって、前記増幅剤のセットが、複数の増幅剤を含み、前記増幅剤が、前記前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記増幅剤のセットと、
（Ｄ）標識プローブのセットであって、前記標識プローブのセットの前記標識プローブが各々、前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含む、前記標識プローブのセットと、
（Ｅ）酸試薬であって、前記酸試薬が、前記標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、前記酸試薬と、を含む、前記キット。 - 前記キットが、標的プローブのセットを含み、前記標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの１つ以上の対を含む、請求項９２に記載のキット。
- 標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットであって、
（Ａ）前－前増幅剤のセットであって、前記前－前増幅剤のセットが、前－前増幅剤の１つ以上の対を含み、前記前－前増幅剤の対の各前－前増幅剤が、標的プローブの対の前記標的プローブのうちの１つに対する結合部位を含む、前記前－前増幅剤のセットと、
（Ｂ）前増幅剤のセットであって、前記前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前記前増幅剤が、前記前－前増幅剤の対に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記前増幅剤のセットと、
（Ｃ）増幅剤のセットであって、前記増幅剤のセットが、複数の増幅剤を含み、前記増幅剤が、前記前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記増幅剤のセットと、
（Ｄ）標識プローブのセットであって、前記標識プローブのセットの前記標識プローブが各々、前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含む、前記標識プローブのセットと、
（Ｅ）酸試薬であって、前記酸試薬が、前記標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、前記酸試薬と、を含む、前記キット。 - 前記キットが、標的プローブのセットを含み、前記標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの１つ以上の対を含む、請求項９４に記載のキット。
- 標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットであって、
（Ａ）前増幅剤のセットであって、前記前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前記複数の前増幅剤が、１つ以上の標的プローブのセットの各々に特異的な前増幅剤を含み、各前増幅剤が、前記標的プローブのセットのうちの１つの標的プローブの対に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記前増幅剤のセットと、
（Ｂ）増幅剤のセットであって、前記増幅剤のセットが、各前増幅剤に特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤の各サブセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤のサブセットの前記増幅剤が、標的プローブのセットに特異的な前記前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記増幅剤のセットと、
（Ｃ）標識プローブの第１のセットであって、前記標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々における前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、切断可能であり、前記標識プローブの第１のセットが、標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識することができる、前記標識プローブの第１のセットと、
（Ｄ）標識プローブの第２のセットであって、前記標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第２のサブセットが、前記標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、切断可能であり、前記標識プローブの第２のセットが、前記標的核酸の第１のサブセットとは異なる標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識することができる、前記標識プローブの第２のセットと、
（Ｅ）酸試薬であって、前記酸試薬が、前記標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、前記酸試薬と、を含む、前記キット。 - 標識プローブの第３のセットをさらに含み、前記標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第３のサブセットが、前記標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、切断可能であり、前記標識プローブの第３のセットが、前記標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識することができる、請求項９６に記載のキット。
- 標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットであって、
（Ａ）前－前増幅剤のセットであって、前記前－前増幅剤のセットが、複数の前－前増幅剤を含み、前記複数の前－前増幅剤が、１つ以上の標的プローブのセットの各々に特異的な前－前増幅剤を含み、各前－前増幅剤が、前記標的プローブのセットのうちの１つの標的プローブの対に対する結合部位及び前増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記前－前増幅剤のセットと、
（Ｂ）前増幅剤のセットであって、前記前増幅剤のセットが、各前－前増幅剤に特異的な前増幅剤の複数のサブセットを含み、前増幅剤の各サブセットが、複数の前増幅剤を含み、前増幅剤のサブセットの前記前増幅剤が、標的プローブのセットに特異的な前記前－前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記前増幅剤のセットと、
（Ｃ）増幅剤のセットであって、前記増幅剤のセットが、前増幅剤の各サブセットに特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤の各サブセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤のサブセットの前記増幅剤が、前記前増幅剤のサブセットのうちの１つの前記前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記増幅剤のセットと、
（Ｄ）標識プローブの第１のセットであって、前記標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々における前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、切断可能であり、前記標識プローブの第１のセットが、標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識することができる、前記標識プローブの第１のセットと、
（Ｅ）標識プローブの第２のセットであって、前記標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第２のサブセットが、前記標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、切断可能であり、前記標識プローブの第２のセットが、前記標的核酸の第１のサブセットとは異なる標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識することができる、前記標識プローブの第２のセットと、
（Ｆ）酸試薬であって、前記酸試薬が、前記標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、前記酸試薬と、を含む、前記キット。 - 標識プローブの第３のセットをさらに含み、前記標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第３のサブセットが、前記標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、切断可能であり、前記標識プローブの第３のセットが、前記標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識することができる、請求項９８に記載のキット。
- 標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットであって、
（Ａ）前－前増幅剤のセットであって、前記前－前増幅剤のセットが、前－前増幅剤の複数の対を含み、前記前－前増幅剤のセットが、１つ以上の標的プローブのセットの標的プローブの対の各標的プローブに特異的な前－前増幅剤の対を含み、前記前－前増幅剤の対の各前－前増幅剤は、標的プローブのセットの標的プローブの対の前記標的プローブのうちの１つに対する結合部位を含み、前記前－前増幅剤が、前増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記前－前増幅剤のセットと、
（Ｂ）前増幅剤のセットであって、前記前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前記複数の前増幅剤が、前－前増幅剤の各対に特異的な前増幅剤を含み、各前増幅剤が、前記前－前増幅剤のセットの前－前増幅剤の前記対のうちの１つに対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記前増幅剤のセットと、
（Ｃ）増幅剤のセットであって、前記増幅剤のセットが、前－前増幅剤の各対に特異的な各前増幅剤に特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤のサブセットの前記増幅剤が、前－前増幅剤の対に特異的な前記前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記増幅剤のセットと、
（Ｄ）標識プローブの第１のセットであって、前記標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々における前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、切断可能であり、前記標識プローブの第１のセットが、標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識することができる、前記標識プローブの第１のセットと、
（Ｅ）標識プローブの第２のセットであって、前記標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第２のサブセットが、前記標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、切断可能であり、前記標識プローブの第２のセットが、前記標的核酸の第１のサブセットとは異なる標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識することができる、前記標識プローブの第２のセットと、
（Ｆ）酸試薬であって、前記酸試薬が、前記標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、前記酸試薬と、を含む、前記キット。 - 標識プローブの第３のセットをさらに含み、前記標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第３のサブセットが、前記標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、切断可能であり、前記標識プローブの第３のセットが、前記標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識することができる、請求項１００に記載のキット。
- 前記キットが、前記切断可能な標識を前記標識プローブから切断するための切断剤を含む、請求項９６～１０１のいずれか１項に記載のキット。
- 標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットであって、
（Ａ）前増幅剤のセットであって、前記前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前記複数の前増幅剤が、１つ以上の標的プローブのセットの各々に特異的な前増幅剤を含み、各前増幅剤が、前記標的プローブのセットのうちの１つの標的プローブの対に対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記前増幅剤のセットと、
（Ｂ）増幅剤のセットであって、前記増幅剤のセットが、各前増幅剤に特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤の各サブセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤のサブセットの前記増幅剤が、標的プローブのセットに特異的な前記前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記増幅剤のセットと、
（Ｃ）標識プローブの第１のセットであって、前記標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々における前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度が、前記標的プローブ、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度よりも低く、前記標識プローブの第１のセットが、標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識することができる、前記標識プローブの第１のセットと、
（Ｄ）標識プローブの第２のセットであって、前記標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第２のサブセットが、前記標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度が、前記標的プローブ、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度よりも低く、前記標識プローブの第２のセットが、前記標的核酸の第１のサブセットとは異なる標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識することができる、前記標識プローブの第２のセットと、
（Ｅ）酸試薬であって、前記酸試薬が、前記標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、前記酸試薬と、を含む、前記キット。 - 標識プローブの第３のセットをさらに含み、前記標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第３のサブセットが、前記標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度が、前記標的プローブ、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度よりも低く、前記標識プローブの第３のセットが、前記標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識することができる、請求項１０３に記載のキット。
- 標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットであって、
（Ａ）前－前増幅剤のセットであって、前記前－前増幅剤のセットが、前－前増幅剤の複数の対を含み、前記前－前増幅剤のセットが、１つ以上の標的プローブのセットの標的プローブの対の各々に特異的な前－前増幅剤の対を含み、前記前－前増幅剤の対の各前－前増幅剤は、標的プローブのセットの標的プローブの対の前記標的プローブのうちの１つに対する結合部位を含み、前記前－前増幅剤が、前増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記前－前増幅剤のセットと、
（Ｂ）前増幅剤のセットであって、前記前増幅剤のセットが、複数の前増幅剤を含み、前記複数の前増幅剤が、前－前増幅剤の各対に特異的な前増幅剤を含み、各前増幅剤が、前記前－前増幅剤のセットの前－前増幅剤の前記対のうちの１つに対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記前増幅剤のセットと、
（Ｃ）増幅剤のセットであって、前記増幅剤のセットが、前－前増幅剤の各対に特異的な各前増幅剤に特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤のサブセットの前記増幅剤が、前－前増幅剤の対に特異的な前記前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記増幅剤のセットと、
（Ｄ）標識プローブの第１のセットであって、前記標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々における前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度が、前記標的プローブ、前記前－前増幅剤、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度よりも低く、前記標識プローブの第１のセットが、標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識することができる、前記標識プローブの第１のセットと、
（Ｅ）標識プローブの第２のセットであって、前記標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第２のサブセットが、前記標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、前記標識が、切断可能であり、前記標識プローブの第２のセットが、前記標的核酸の第１のサブセットとは異なる標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識することができる、前記標識プローブの第２のセットと、
（Ｆ）酸試薬であって、前記酸試薬が、前記標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、前記酸試薬と、を含む、前記キット。 - 標識プローブの第３のセットをさらに含み、前記標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第３のサブセットが、前記標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度が、前記標的プローブ、前記前－前増幅剤、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度よりも低く、前記標識プローブの第３のセットが、前記標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識することができる、請求項１０５に記載のキット。
- 標的核酸のｉｎ ｓｉｔｕ検出のためのキットであって、
（Ａ）前－前増幅剤のセットであって、前記前－前増幅剤のセットが、複数の前－前増幅剤を含み、前記複数の前－前増幅剤が、１つ以上の標的プローブのセットの各々に特異的な前－前増幅剤を含み、各前－前増幅剤が、前記標的プローブのセットのうちの１つの標的プローブの対に対する結合部位及び前増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記前－前増幅剤のセットと、
（Ｂ）前増幅剤のセットであって、前記前増幅剤のセットが、各前－前増幅剤に特異的な前増幅剤の複数のサブセットを含み、前増幅剤の各サブセットが、複数の前増幅剤を含み、前増幅剤のサブセットの前記前増幅剤が、標的プローブのセットに特異的な前記前－前増幅剤のうちの１つに対する結合部位及び増幅剤に対する複数の結合部位を含む、前記前増幅剤のセットと、
（Ｃ）増幅剤のセットであって、前記増幅剤のセットが、前増幅剤の各サブセットに特異的な増幅剤の複数のサブセットを含み、増幅剤の各サブセットが、複数の増幅剤を含み、増幅剤のサブセットの前記増幅剤が、前記前増幅剤のサブセットのうちの１つの前記前増幅剤に対する結合部位及び標識プローブに対する複数の結合部位を含む、前記増幅剤のセットと、
（Ｄ）標識プローブの第１のセットであって、前記標識プローブの第１のセットが、標識プローブの複数の第１のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標的プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々における前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第１のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第１のサブセット間で区別可能であり、前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度が、前記標的プローブ、前記前－前増幅剤、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度よりも低く、前記標識プローブの第１のセットが、標的核酸の第１のサブセットを特異的に標識することができる、前記標識プローブの第１のセットと、
（Ｅ）標識プローブの第２のセットであって、前記標識プローブの第２のセットが、標識プローブの複数の第２のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第２のサブセットが、前記標識プローブの第１のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第２のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第２のサブセット間で区別可能であり、前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度が、前記標的プローブ、前記前－前増幅剤、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度よりも低く、前記標識プローブの第２のセットが、前記標的核酸の第１のサブセットとは異なる標的核酸の第２のサブセットを特異的に標識することができる、前記標識プローブの第２のセットと、
（Ｆ）酸試薬であって、前記酸試薬が、前記標的プローブとそれぞれの標的核酸との間のハイブリダイゼーションの破壊をもたらす、前記酸試薬と、を含む、前記キット。 - 標識プローブの第３のセットをさらに含み、前記標識プローブの第３のセットが、標識プローブの複数の第３のサブセットを含み、標識プローブの各サブセットが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に特異的であり、前記標識プローブの第３のサブセットが、前記標識プローブの第１及び第２のサブセットとは異なる増幅剤のサブセットの増幅剤に特異的であり、標識プローブの各サブセットが、複数の標識プローブを含み、前記標識プローブのサブセットの各々の前記標識プローブが、前記増幅剤のサブセットのうちの１つの前記増幅剤に対する標識及び結合部位を含み、標識プローブの各第３のサブセットにおける前記標識が、前記標識プローブの第３のサブセット間で区別可能であり、前記標識プローブと前記増幅剤との間の融解温度が、前記標的プローブ、前記前－前増幅剤、前記前増幅剤、及び前記増幅剤の間の融解温度よりも低く、前記標識プローブの第３のセットが、前記標的核酸の第１及び第２のサブセットとは異なる標的核酸の第３のサブセットを特異的に標識することができる、請求項１０７に記載のキット。
- 前記キットが、１つ以上の標的プローブのセットを含み、各標的プローブのセットが、標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションする標的プローブの対を含む、請求項９６～１０８のいずれか１項に記載のキット。
- 各標的プローブのセットが、同じ標的核酸に特異的にハイブリダイゼーションすることができる標的プローブの２つ以上の対を含む、請求項１０９に記載のキット。
- 前記キットが、細胞を固定及び／または透過処理するための少なくとも１つの試薬を含む、請求項９６～１１０のいずれか１項に記載のキット。
- 前記酸試薬が、５～４０％または２０～３０％の酸を含む、請求項７１～１１１のいずれか１項に記載のキット。
- 前記酸が、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、酪酸、吉草酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、及びクエン酸からなる群から選択される、請求項１１２に記載のキット。
- 前記酸試薬が、塩を含む、請求項７１～１１３のいずれか１項に記載のキット。
- 前記酸試薬が、ＳＳＣを含む、請求項１１４に記載のキット。
- 前記酸試薬が、１倍～１３倍のＳＳＣまたは３．２倍～１２．８倍のＳＳＣを含む、請求項１１５に記載のキット。
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