ES2969671T3

ES2969671T3 - Obtención de imágenes con multiplexación usando MERFISH, microscopía de expansión y tecnologías relacionadas

Info

Publication number: ES2969671T3
Application number: ES17869515T
Authority: ES
Inventors: Xiaowei Zhuang; Jeffrey Moffitt; Guiping Wang
Original assignee: Harvard College
Current assignee: Harvard College
Priority date: 2016-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2024-05-21
Anticipated expiration: 2037-11-08
Also published as: WO2018089438A8; US20190276881A1; EP3538867B1; WO2018089438A1; CN110168346B; CN110168346A; EP3538867A1; EP4339956A2; EP3538867C0; EP4339956A3; CN116242687A; EP3538867A4

Abstract

La presente invención se refiere generalmente a microscopía y a sistemas y métodos para obtener imágenes o determinar ácidos nucleicos u otros objetivos deseados, por ejemplo, dentro de las células. En ciertos aspectos, una muestra está contenida dentro de un material expandible, que se expande y se representa de alguna manera. La expansión del material mejora la resolución efectiva de la imagen posterior. Esto se puede combinar, por ejemplo, con otras técnicas de superresolución, como STORM, y/o con técnicas como MERFISH para determinar ácidos nucleicos como el ARNm dentro de la muestra, por ejemplo, uniendo sondas de ácido nucleico a la muestra. Otros aspectos generalmente se dirigen a composiciones o dispositivos para usar en tales métodos, kits para usar en tales métodos o similares. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Obtención de imágenes con multiplexación usando MERFISH, microscopía de expansión y tecnologías relacionadasSolicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional estadounidense con n.º de serie 62/419.033, presentada el 8 de noviembre de 2016, titulada “Matrix Imprinting and Clearing”, de Zhuang,et al., y la solicitud de patente provisional estadounidense con n.º de serie 62/569.127, presentada el 6 de octubre de 2017, titulada “Multiplexed Imaging Using MERFISH, Expansion Microscopy, and Related Technologies”, de Zhuang,et al.

Financiación gubernamental

Esta invención se realizó con apoyo del gobierno mediante la subvención n.º OD022125 concedida por los Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos con respecto a la invención.

Campo

La presente invención se refiere de manera general a microscopía, y a sistemas y a métodos para obtener imágenes de, o determinar, ácidos nucleicos u otras dianas deseadas, por ejemplo, dentro células.

Antecedentes

La transcriptómica de células individuales basada en imágenes, en la que se identifican especies de ARN, se cuentan y se localizanin situmediante obtención de imágenes, conserva de manera natural el contexto espacial nativo de los ARN. La hibridaciónin situpor fluorescencia robusta frente a errores con multiplexación (MERFISH) es un método para obtención de imágenes de transcriptoma de células individuales y se ha demostrado que realiza el perfil de cientos a miles de ARN en células individuales. En MERFISH, se identifican ARN mediante un enfoque de marcaje combinatorio que codifica especies de ARN con códigos de barras binarios robustos frente a errores seguido por rondas secuenciales de hibridaciónin situpor fluorescencia de moléculas individuales (smFISH) para leer estos códigos de barras. La precisión de la identificación de ARN se basa en señales espacialmente separadas de moléculas de ARN individuales, lo cual limita la densidad de ARN que pueden medirse y hace que la obtención de imágenes con multiplexación de un gran número de ARN con alta abundancia sea difícil. Por consiguiente, se necesita mejoras en las técnicas de obtención de imágenes.

El documento US 2016/305856 A1 se refiere a microscopía de expansión iterativa.

El documento US 2015/144490 A1 se refiere a métodos y a composiciones para preparar muestras biológicas para análisis por microscopía.

El documento US 2015/087001 A1 se refiere a métodos para el fenotipado de tejidos enteros intactos.

Fei Chenet al., Nature Methods, vol.13, n.º 8, 2016, páginas 679-684, se refiere a obtención de imágenes a escala nanométrica de ARN con microscopía de expansión.

Nikolay Tsanovet al., Nucleic Acids Research, vol. 44, n.º 22, 2016, páginas e165-e165, se refiere a smiFISH y a FISH-quant, un enfoque de detección de ARN individual flexible con capacidad de superresolución.

Fei Chenet al., Science, vol. 347, n.º 6221, 2015, páginas 543-548, se refiere a microscopía de expansión, y Fei Chenet al., Science, vol.347, n.º 6221, 2015, páginas 1-18, se refiere a material complementario para microscopía de expansión.

El documento US 2016/304952 A1 secuenciación de ácido nucleicoin situde muestras biológicas expandidas.Sumario

La presente invención se define mediante las reivindicaciones.

La presente divulgación se refiere de manera general a microscopía, y a sistemas y a métodos para obtener imágenes de, o determinar, ácidos nucleicos u otras dianas deseadas, por ejemplo, dentro de células. El objeto de la presente divulgación implica, en algunos casos, productos interrelacionados, soluciones alternativas a un problema particular, y/o una pluralidad de usos diferentes de uno o más sistemas y/o artículos.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere de manera general a un artículo que comprende un material expandible. El material puede comprender una célula incorporada y una pluralidad de ácidos nucleicos inmovilizados en el material expandible. En algunos casos, al menos el 50 % de la pluralidad de ácidos nucleicos inmovilizados en el material expandible están inmovilizados en puntos individuales.

Según otro aspecto, la presente divulgación se refiere de manera general a un polímero que comprende una célula expandida y una pluralidad de ácidos nucleicos inmovilizados en el polímero. En algunas realizaciones, la célula se expande hasta al menos 5 veces su tamaño normal dentro del polímero. En determinados casos, al menos el 50 % de la pluralidad de ácidos nucleicos inmovilizados en el material expandible están inmovilizados en puntos individuales.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere de manera general a un método. En un conjunto de realizaciones, el método comprende incorporar células dentro de un material expandible, inmovilizar ácidos nucleicos a partir de las células en el material expandible, expandir el material expandible, exponer el material expandible a una pluralidad de sondas de ácido nucleico, y determinar la unión de las sondas de ácido nucleico a los ácidos nucleicos inmovilizados.

En otro conjunto de realizaciones, el método comprende inmovilizar una pluralidad de dianas en un material expandible, y expandir el material expandible. En algunos casos, al menos el 50 % de la pluralidad de dianas inmovilizadas en el material expandible están inmovilizadas en puntos individuales.

El método, en aún otro conjunto de realizaciones, incluye inmovilizar una pluralidad de ácidos nucleicos en un material expandible, exponer el material expandible a una pluralidad de sondas de ácido nucleico, expandir el material expandible y determinar la unión de las sondas de ácido nucleico a los ácidos nucleicos inmovilizados. En determinadas realizaciones, al menos el 50 % de la pluralidad de ácidos nucleicos inmovilizados en el material expandible están inmovilizados en puntos individuales.

En otro aspecto, la presente divulgación abarca métodos de realización de una o más de las realizaciones descritas en el presente documento, por ejemplo, MERFISH y microscopía de expansión. En todavía otro aspecto, la presente divulgación abarca métodos de usar una o más de las realizaciones descritas en el presente documento, por ejemplo, MERFISH y microscopía de expansión.

Otras ventajas y características novedosas de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de diversas realizaciones no limitativas de la invención cuando se consideran junto con las figuras adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

Se describirán realizaciones no limitativas de la presente invención a modo de ejemplo con referencia a las figuras adjuntas, que son esquemáticas y no se pretende que estén dibujadas a escala. En las figuras, cada componente idéntico o casi idéntico ilustrado se representa normalmente mediante un único número. Con fines de claridad, no todos los componentes están marcados en todas las figuras, ni se muestran todos los componentes de cada realización de la invención cuando no se necesita la ilustración para permitir que los expertos habituales en la técnica entiendan la invención. En las figuras:

las figuras 1A-1E ilustran medidas de ARN mediante MERFISH en una muestra no expandida;

las figuras 2A-2H ilustran medidas de ARN mediante MERFISH en una muestra expandida, en una realización de la invención;

las figuras 3A-3H ilustran la obtención de imágenes en muestras expandidas en combinación con MERFISH, en aún otra realización de la invención; y

las figuras 4A-4C ilustran esquemáticamente la unión de dianas en uno o más puntos de anclaje.

Descripción detallada

La presente divulgación se refiere de manera general a microscopía, y a sistemas y a métodos para obtener imágenes de, o determinar, ácidos nucleicos u otras dianas deseadas, por ejemplo, dentro de células. En determinados aspectos, una muestra está contenida dentro de un material expandible, que se expande y del que se obtienen imágenes de alguna manera. La expansión del material mejora la resolución efectiva de la imagen posterior. Esto puede combinarse, por ejemplo, con otras técnicas de superresolución, tales como STORM, y/o con técnicas tales como MERFISH para determinar ácidos nucleicos tales como ARNm dentro de la muestra, por ejemplo, uniendo sondas de ácido nucleico a la muestra. Otros aspectos se refieren de manera general a composiciones o a dispositivos para su uso en tales métodos, a kits para su uso en tales métodos, o similares. En determinados aspectos, una muestra está incorporada o contenida dentro de un material expandible, tal como gel de polielectrolito. La muestra puede ser, por ejemplo, una célula u otra estructura biológica, o una estructura no biológica en algunos casos. Tras la expansión del material expandible, la muestra se aumenta eficazmente de manera física, en vez de óptica. Se separan componentes de la muestra unos de otros mediante expansión del material, pero normalmente conservan geometrías o topologías comparables, especialmente si la expansión del material se produce sustancialmente de manera isotópica. Por tanto, componentes que inicialmente estaban cerca unos de otros ahora están más alejados, y pueden detectarse más fácilmente, por ejemplo, usando obtención de imágenes u otras técnicas.

Pueden combinarse técnicas de expansión con técnicas para determinar ácidos nucleicos tales como ARNm dentro de la muestra. En algunos casos, por ejemplo, se unen ácidos nucleicos dentro de la muestra al material expandible (por ejemplo, de manera covalente) antes de expandirse el material expandible. Entonces pueden detectarse los ácidos nucleicos, por ejemplo, usando exposiciones a sondas de ácido nucleico, por ejemplo, de manera repetida, lo cual puede usarse para determinar la distribución de ácidos nucleicos dentro del material. Por ejemplo, en técnicas tales como MERFISH (hibridaciónin situpor fluorescencia robusta frente a errores con multiplexación), se expone una muestra a diferentes rondas de sondas de ácido nucleico, y puede determinarse la unión de los ácidos nucleicos usando fluorescencia u otras técnicas. En determinados casos, puede identificarse un número relativamente grande de dianas diferentes usando un número relativamente pequeño de etiquetas, por ejemplo, usando diversos enfoques combinatorios. También puede potenciarse la identificación en algunas realizaciones usando códigos de comprobación de errores y/o de corrección de errores. Véase, por ejemplo, la solicitud de patente estadounidense con n.º de serie 15/329.683, titulada “Systems and Methods for Determining Nucleic Acids”, de Zhuang,et al., publicada como publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2017/0220733 el 3 de agosto de 2017.

En algunos casos, una o más dianas, por ejemplo, ácidos nucleicos tales como ARNm, pueden inmovilizarse con respecto al material expandible antes de la expansión. En determinadas realizaciones, se unen dianas al material expandible en un punto individual. Esto es importante en algunas realizaciones ya que las dianas unidas en dos o más puntos pueden expandirse junto con el material, lo cual puede hacer que sea más difícil resolver dianas con una alta resolución. Por ejemplo, haciendo referencia a la figura 4A, las dianas 10 y 11 se muestran dentro de un material 20 expandible. Por ejemplo, las dianas 10 y 11 pueden ser ácidos nucleicos. En la figura 4B, las dianas 10 y 11 están unidas en dos puntos (por ejemplo, sus extremos) y, tras la expansión mediante el material expandible, las dianas 10 y 11 se expanden (por ejemplo, “se estiran”) junto con el resto del material expandido dado que sus puntos de anclaje (mostrados como círculos) se expanden junto con el material expandido. En cambio, en la figura 4C, las dianas 10 y 11 están unidas únicamente en un punto (mostrado como un círculo) y, tras la expansión del material expandible, las dianas no se expanden ni se estiran. Por tanto, en la figura 4C, las dianas 10 y 11 están ahora más alejadas y pueden determinarse más fácilmente, mientras que en la figura 4B las dianas 10 y 11 todavía pueden estar físicamente superpuestas y, por tanto, pueden producir señales que no son distinguibles a pesar del procedimiento de expansión. Por consiguiente, en determinadas realizaciones de la invención, al menos algunas de las dianas, tales como ácidos nucleicos, se unen al material expandible en un punto individual. En algunas realizaciones, una molécula puede comportarse de la misma manera que la descrita en la figura 4C aunque esté unida al gel mediante múltiples uniones, por ejemplo, si las uniones están lo suficientemente cerca unas de otras a lo largo de la longitud de la molécula.

Además, componentes de la muestra que pueden contribuir al fondo, tal como proteínas, lípidos y/u otros compuestos distintos de diana, pueden “aclararse” de la muestra para mejorar la determinación en determinados casos. Sin embargo, puede evitarse que también se aclaren ácidos nucleicos u otras dianas deseadas, por ejemplo, uniendo los ácidos nucleicos (u otras dianas) al material expandible, tal como se indicó anteriormente. De esta manera, pueden combinarse materiales expandibles con técnicas tales como MERFISH para facilitar la detección de ARNm, otros ácidos nucleicos u otras dianas. Pueden encontrarse ejemplos no limitativos de tales técnicas, por ejemplo, en la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 62/419.033, titulada “Matrix Imprinting and Clearing”.

Puede usarse una variedad de técnicas para determinar la unión, incluyendo técnicas ópticas tales como microscopía por fluorescencia. En algunos casos, pueden determinarse posiciones espaciales a superresoluciones, o a resoluciones mejores que la longitud de onda de luz o el límite de difracción (aunque, en otras realizaciones, no se requieren superresoluciones). Por ejemplo, pueden usarse técnicas tales como STORM (microscopía de reconstrucción óptica estocástica). Véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 7.838.302, expedida el 23 de noviembre de 2010, titulada “Sub-Diffraction Limit Image Resolution and Other Imaging Techniques”, de Zhuang,et al.

La discusión anterior es un ejemplo no limitativo de una realización de la presente invención que puede usarse para determinar ácidos nucleicos u otras dianas en una muestra. Sin embargo, también son posibles otras realizaciones. Por consiguiente, más generalmente, diversos aspectos de la divulgación se refieren a diversos sistemas y métodos para obtener imágenes de, o determinar, ácidos nucleicos u otras dianas deseadas, por ejemplo, dentro de células u otras muestras.

Tal como se menciona, en un aspecto, una muestra está incorporada o contenida dentro de un material expandible. La muestra puede ser cualquier muestra adecuada y puede ser biológica en algunas realizaciones. En algunos casos, la muestra contiene ADN y/o ARN, por ejemplo, que puede determinarse dentro de la muestra. (En otras realizaciones, pueden determinarse otras dianas dentro de la muestra). En algunos casos, la muestra puede incluir células, tales como células de mamífero (incluyendo células humanas) u otros tipos de células. La muestra puede contener virus en algunos casos. Además, en algunos casos, la muestra puede ser una muestra de tejido, por ejemplo, de una biopsia, cultivada o que se ha hecho crecer artificialmente, etc.

En determinadas realizaciones, el material expandible es uno que puede expandirse, por ejemplo, cuando se expone a agua u otro líquido adecuado. Por ejemplo, el material puede mostrar un cambio relativo de tamaño de al menos 1,1, al menos 1,2 al menos 1,3, al menos 1,5, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 7, al menos 10 o al menos 15, etc., y/o un cambio relativo de tamaño que es de menos de 15, menos de 10, menos de 7, menos de 5, menos de 4, menos de 3, menos de 2, menos de 1,5, menos de 1,3 o menos de 1,2 (es decir, un cambio de tamaño de 2 significa que a muestra duplica la dimensión lineal) o a la inversa de esto (es decir, un cambio de tamaño inverso de 2 significa que una muestra reduce a la mitad la dimensión lineal).

En algunas realizaciones, el material expandible puede ser uno que no se distorsiona significativamente durante el procedimiento de expansión (por ejemplo, el material expandible puede expandirse de manera sustancialmente uniforme o isotrópica en las 3 dimensiones), aunque, en algunos casos, el material expandible puede mostrar algo de distorsión o expansión no isotrópica. Por ejemplo, el material expandible puede expandirse en una dimensión, con respecto a una dimensión ortogonal, en menos del 150 %, menos del 130 %, menos del 125 %, menos del 120 %, menos del 115 %, menos del 110 % o menos del 105 % por dimensión lineal con respecto a la expansión lineal más corta.

En algunos casos, el material expandible es un polímero. Los ejemplos no limitativos de polímeros adecuados incluyen polielectrolitos y agarosa. En algunos casos, el polímero es un gel o un hidrogel. Puede usarse una variedad de polímeros en diversas realizaciones incluyendo, pero sin limitarse a, ácido acrílico, acrilamida, diacrilato de etilenglicol, dimetarcrilato de etilenglicol, poli(dimetacrilato de etilenglicol), poli(N-isopropilacrilamida), metilcelulosa, terpolímeros de (óxido de etileno)-(óxido de propileno)-(óxido de etileno), alginato de sodio, poli(alcohol vinílico), alginato, quitosano, goma arábiga, gelatina, agarosa o similares. En algunos casos, el polímero puede seleccionarse para ser relativamente transparente de manera óptica. En algunos casos, el material expandible puede estar formado a partir de monómeros u oligómeros, por ejemplo, que comprenden uno o más metacrilatos, acrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, alcoholes vinílicos, vinilaminas, alilaminas, alcoholes alílicos, incluyendo agentes de reticulación divinílicos de los mismos (por ejemplo,N,N-alquilen-bisacrilamidas tales comoN,N-metilen-bisacrilamida) o similares sustituidos o no sustituidos. En algunos casos, pueden estar presentes iniciadores de la polimerización y/o agentes de reticulación. Por ejemplo, un precursor puede incluir uno o más agentes de reticulación, que pueden usarse para reticular un material expandible polimérico a medida que se forma, por ejemplo, durante el procedimiento de polimerización.

En algunos casos, la expansión del material expandible puede facilitarse exponiendo el material a agua, una disolución que comprende agua u otro medio adecuado (por ejemplo, un medio líquido). Sin desear limitarse a ninguna teoría, se cree que el flujo de agua al interior del material puede facilitar la expansión del material expandible. En determinadas realizaciones, la disolución puede ser hipotónica con respecto al material expandible, lo cual puede facilitar el transporte de agua al interior del material expandible, por ejemplo, debido a diferencias de tonicidad. En otras realizaciones pueden usarse otras maneras de expandir polímeros, tales como mediante cambios en el pH, cambios en un campo eléctrico/magnético externo, cambios en la temperatura, respuesta a la luz, etc. En algunos casos, la expansión del material puede restringirse después de haberse producido la expansión. Por ejemplo, el material puede estabilizarse de modo que el intercambio de otros tampones no provoque un cambio de tamaño. Esta estabilización puede producirse, por ejemplo, mediante modificación química del material expandible, o incorporación del material expandible en un segundo material que no es expandible.

Como ejemplo no limitativo, puede exponerse una muestra a uno o más monómeros u otros precursores que pueden reaccionar para formar el material expandible. En algunos casos, los precursores pueden permearse, difundirse o transportarse de otro modo a través de la muestra, antes de hacerse reaccionar. Por ejemplo, en algunos casos, un precursor puede estar presente en un líquido (por ejemplo, agua, solución salina u otro medio acuoso), que puede permear a través de una muestra de alguna manera.

En algunos casos, la muestra puede incorporarse dentro de un polímero o gel relativamente grande, que entonces puede seccionarse o cortarse en algunos casos para producir porciones más pequeñas para su análisis, por ejemplo, usando diversas técnicas de microtomía habitualmente disponibles para los expertos habituales en la técnica. Por ejemplo, pueden inmovilizarse tejidos u órganos dentro de un polímero o gel adecuado.

En determinadas realizaciones, la expansión del gel puede desenredar moléculas que estaban físicamente superpuestas. En un ejemplo no limitativo, dos moléculas de ARN pueden estar físicamente superpuestas dentro de la muestra. Anclando estas moléculas de ARN en una ubicación, la expansión del gel puede separar estas moléculas de modo que ya no están físicamente superpuestas siempre que los puntos de unión para cada ARN estén suficientemente separados dentro de la muestra. En algunas realizaciones, por ejemplo, si las moléculas de ARN están ancladas al gel en múltiples ubicaciones a lo largo de su longitud, entonces la expansión del gel puede no separar físicamente estas dos moléculas. En vez de eso, la expansión del gel puede estirar estas moléculas entre los puntos de unión, dejando las dos regiones de estas moléculas que estaban superpuestas todavía superpuestas tras la expansión. En este caso, estas moléculas pueden no ser capaces de distinguirse físicamente, por ejemplo, mediante técnicas ópticas. En algunos casos, los métodos de anclaje que son deterministas (por ejemplo, que seleccionan como diana una ubicación específica del ARN) frente a aleatorios (por ejemplo, que seleccionan como diana un gran número de ubicaciones diferentes en el ARN con la ubicación seleccionada como diana específica seleccionada de manera aleatoria), pueden diferir en cuanto a la probabilidad de que se anclen ARN en múltiples ubicaciones al gel y, por tanto, no sean capaces de separarse físicamente cuando están superpuestos. La selección como diana específica del extremo 3’ o 5’, o una ubicación definida, dentro del ARN puede conducir en algunos casos a un anclaje determinista que no estirará los ARN. Además, debe entenderse que, aunque se usó ARN en este ejemplo, tales consideraciones también se aplican a cualquier otra biomolécula dentro de muestras, por ejemplo ADN, u otras dianas descritas en el presente documento.

En un aspecto, una muestra que se expande puede someterse a obtención de imágenes o estudiarse para determinar ácidos nucleicos u otras dianas deseadas, por ejemplo, dentro de células, tejidos u otras muestras contenidas dentro de un material expandible. Las técnicas útiles para determinar ácidos nucleicos u otras dianas deseadas incluyen, pero no se limitan a, MERFISH, smFISH o técnicas tales como las divulgadas en la solicitud de patente estadounidense con n.º de serie 15/329.683, presentada el 27 de enero de 2017, titulada “Systems and Methods for Determining Nucleic Acids”, de Zhuang,et al., publicada como publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2017/0220733 el 3 de agosto de 2017; o la solicitud de patente estadounidense con n.º de serie 15/329.651, presentada el 27 de enero de 2017, titulada “Probe Library Construction”, de Zhuang,et al., publicada como publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2017/0212986 el 27 de julio de 2017. Además, en algunos casos, puede inmovilizarse una diana deseada dentro del material expandible (tal como un polímero o gel), mientras que otros componentes se “aclaran”, por ejemplo, mediante degradación y/o retirada física, por ejemplo, tal como se comenta en la solicitud de patente provisional estadounidense con n.º de serie 62/419.033, presentada el 8 de noviembre de 2016, titulada “Matrix Imprinting and Clearing”, de Zhuang,et al.

Si se desea determinar ácidos nucleicos, los ácidos nucleicos pueden ser, por ejemplo, ADN, ARN u otros ácidos nucleicos que están presentes dentro de una célula (u otra muestra). Los ácidos nucleicos pueden ser endógenos con respecto a la célula o añadirse a la célula. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser viral o crearse artificialmente. En algunos casos, el ácido nucleico que va a determinarse puede expresarse por la célula. El ácido nucleico es ARN en algunas realizaciones. El ARN puede ser ARN codificante y/o no codificante. Los ejemplos no limitativos de ARN que puede estudiarse dentro de la célula incluyen ARNm, ARNip, ARNr, miARN, ARNt, ARNlnc, ARNpno, ARNpn, ARNex, ARNpi o similares.

En algunos casos, puede estudiarse una porción significativa del ácido nucleico dentro de la célula. Por ejemplo, en algunos casos, puede determinarse suficiente cantidad del ARN presente dentro de una célula como para producir un transcriptoma parcial o completo de la célula. En algunos casos, se determinan al menos 4 tipos de ARNm dentro de una célula y, en algunos casos, pueden determinarse al menos 3, al menos 4, al menos 7, al menos 8, al menos 12, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 22, al menos 30, al menos 31, al menos 32, al menos 50, al menos 63, al menos 64, al menos 72, al menos 75, al menos 100, al menos 127, al menos 128, al menos 140, al menos 255, al menos 256, al menos 500, al menos 1.000, al menos 1.500, al menos 2.000, al menos 2.500, al menos 3.000, al menos 4.000, al menos 5.000, al menos 7.500, al menos 10.000, al menos 12.000, al menos 15.000, al menos 20.000, al menos 25.000, al menos 30.000, al menos 40.000, al menos 50.000, al menos 75.000 o al menos 100.000 tipos de ARNm dentro de una célula.

En algunos casos, puede determinarse el transcriptoma de una célula. Debe entenderse que el transcriptoma abarca generalmente todas las moléculas de ARN producidas dentro de una célula, no sólo ARNm. Por tanto, por ejemplo, el transcriptoma también puede incluir ARNr, ARNt, ARNip, etc. En algunas realizaciones, puede determinarse al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 15 %, al menos el 20 %, al menos el 25 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o el 100 % del transcriptoma de una célula.

La determinación de uno o más ácidos nucleicos dentro de la célula u otra muestra puede ser cualitativa y/o cuantitativa. Además, la determinación también puede ser espacial, por ejemplo, la posición del ácido nucleico dentro de la célula u otra muestra puede determinarse en dos o tres dimensiones. En algunas realizaciones, pueden determinarse las posiciones, número y/o concentraciones de ácidos nucleicos dentro de la célula (u otra muestra).

En algunos casos, puede determinarse una porción significativa del genoma de una célula. Los segmentos genómicos determinados pueden ser continuos o estar intercalados en el genoma. Por ejemplo, en algunos casos, se determinan al menos 4 segmentos genómicos dentro de una célula, y en algunos casos, pueden determinarse al menos 3, al menos 4, al menos 7, al menos 8, al menos 12, al menos 14, al menos 15, al menos 16, al menos 22, al menos 30, al menos 31, al menos 32, al menos 50, al menos 63, al menos 64, al menos 72, al menos 75, al menos 100, al menos 127, al menos 128, al menos 140, al menos 255, al menos 256, al menos 500, al menos 1.000, al menos 1.500, al menos 2.000, al menos 2.500, al menos 3.000, al menos 4.000, al menos 5.000, al menos 7.500, al menos 10.000, al menos 12.000, al menos 15.000, al menos 20.000, al menos 25.000, al menos 30.000, al menos 40.000, al menos 50.000, al menos 75.000 o al menos 100.000 segmentos genómicos dentro de una célula.

En algunos casos, puede determinarse todo el genoma de una célula. Debe entenderse que el genoma abarca generalmente todas las moléculas de ADN producidas dentro de una célula, no solo ADN cromosómico. Por tanto, por ejemplo, el genoma también puede incluir, en algunos casos, ADN mitocondrial, ADN cloroplástico, ADN de plásmido, etc. En algunas realizaciones, puede determinarse al menos aproximadamente el 5 %, al menos aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos aproximadamente el 25 %, al menos aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 90 % o el 100 % del genoma de una célula.

Sin embargo, tal como se comenta, debe entenderse que, en otras realizaciones de la invención, pueden determinarse o inmovilizarse otras dianas, por ejemplo, además y/o en lugar de ácidos nucleicos. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la invención, las dianas que van a determinarse o inmovilizarse pueden incluir proteínas (por ejemplo, anticuerpos, enzimas, proteínas estructurales), lípidos, hidratos de carbono, virus o similares. En una realización, pueden detectarse componentes celulares, tales como proteínas, mediante unión a los mismos de proteínas, tales como anticuerpos/inmunoglobulinas (anticuerpos primarios, anticuerpos secundarios, nanocuerpos, fragmentos de anticuerpos, IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, etc.), que están conjugados a sondas de oligonucleótido que están ancladas al polímero o gel. Entonces pueden retirarse estos componentes, dejando las sondas de oligonucleótido que van a detectarse mediante hibridación de sondas de ácido nucleico adicionales, de manera similar o idéntica a la detección de celular ácidos nucleicos. En otra realización, pueden detectarse múltiples especies celulares diferenciadas de manera simultánea dentro de la misma muestra, aunque se retiren los componentes originales a partir del gel o polímero. Por ejemplo, pueden detectarse moléculas de ARN mediante hibridación de sondas de ácido nucleico de manera simultánea con la detección de proteínas mediante conjugados de anticuerpo-oligonucleótido, tal como se describió anteriormente.

Tal como se menciona, la muestra puede inmovilizarse o incorporarse dentro de un polímero o un gel, de manera parcial o completa. Por ejemplo, la muestra puede incorporarse en un material expandible tal como se comentó anteriormente. En un conjunto de realizaciones, pueden usarse sondas de anclaje durante el procedimiento de polimerización. Las sondas de anclaje pueden incluir una porción de anclaje que es capaz de polimerizarse con el material expandible, por ejemplo, durante y/o después del procedimiento de polimerización, y una porción de selección como diana que es capaz de inmovilizar una diana, por ejemplo, de manera química y/o física. Por ejemplo, en el caso de poliacrilamida, la sonda de anclaje puede incluir una porción de acridita que puede polimerizarse e incorporarse en el polímero. Como otro ejemplo, una sonda de anclaje puede contener, como porción de selección como diana, una secuencia de ácidos nucleicos que es complementaria a una diana que es un ácido nucleico, tal como ARN (por ejemplo, ARNm) o ADN. La porción de selección como diana puede ser específica para una diana y/o puede asociarse de manera aleatoria con diferentes dianas dentro de una muestra (por ejemplo, debido a unión no específica). También pueden estar presentes otras porciones dentro de las sondas de anclaje.

Por ejemplo, para asociarse con un ácido nucleico diana, la sonda de anclaje puede comprender una secuencia de ácido nucleico sustancialmente complementaria a al menos una porción del ácido nucleico diana. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser complementario a al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 o más nucleótidos del ácido nucleico. En algunos casos la complementariedad puede ser exacta (complementariedad de Watson-Crick) o puede haber 1, 2 o más coincidencias erróneas.

Por tanto, la sonda de anclaje puede contener una porción que puede interaccionar con, y unirse a, moléculas de ácido nucleico en algunas realizaciones, y/u otras moléculas en las que se desea inmovilización, por ejemplo, proteínas o lípidos, otras dianas deseadas, etc. La inmovilización puede ser covalente o no covalente. Por ejemplo, para inmovilizar un ácido nucleico diana, la sonda de anclaje puede comprender un ácido nucleico que comprende una porción de acridita (por ejemplo, en el extremo 5’, el extremo 3’, una base interna, etc.), y una porción capaz de reconocer el ácido nucleico diana.

En algunos casos, la sonda de anclaje puede estar configurada para inmovilizar ARNm, por ejemplo, en el caso de análisis de transcriptoma. Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, la sonda de anclaje puede contener una pluralidad de nucleótidos de timina, por ejemplo, de manera secuencial, para unirse a la cola de poli-A de un ARNm. Por tanto, por ejemplo, la sonda de anclaje puede tener al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 o más nucleótidos de timina consecutivos (por ejemplo, una porción de poli-dT) dentro de la sonda de anclaje. En algunos casos, al menos algunos de los nucleótidos de timina pueden ser nucleótidos de timina “bloqueados”. Estos pueden comprender al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 % o al menos el 80 % de estos nucleótidos de timina. En determinadas realizaciones, los nucleótidos bloqueados y no bloqueados pueden alternarse. Tales nucleótidos de timina bloqueados pueden ser útiles, por ejemplo, para estabilizar la hibridación de las colas de poli-A del ARNm con la sonda de anclaje.

En otro conjunto de realizaciones, la sonda de anclaje puede comprender una secuencia sustancialmente complementaria a ARNm (u otro ácido nucleico diana), tal como se indicó anteriormente. La secuencia puede ser sustancialmente complementaria a la totalidad, o tan sólo a una porción, del ácido nucleico diana, por ejemplo, una porción de extremo (por ejemplo, hacia un extremo 5’ o un extremo 3’), o una porción central entre las porciones de extremo. Por ejemplo, puede inmovilizarse un ácido nucleico usando sondas de anclaje que tienen porciones sustancialmente complementarias a la diana de ADN o ARN. Puede haber, por ejemplo, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, 15 o más, 20 o más, 25 o más, 30 o más, 35 o más, 40 o más, 45 o más o 50 o más nucleótidos complementarios entre la sonda de anclaje y el ácido nucleico.

En otro conjunto de realizaciones, puede dirigirse una pluralidad de sondas de anclaje mediante los métodos descritos anteriormente a cada ARN de interés. Por ejemplo, pueden dirigirse 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 10 o más, 15 o más o 20 o más sondas de anclaje de ácido nucleico distintas a un ARN dado. Estas sondas pueden dirigirse a una región pequeña de este ARN de tal manera que, si múltiples sondas unen y anclan el ARN al gel, la mayor parte del ARN permanece sin estirar durante la expansión. Si se seleccionan como diana múltiples especies de ARN a la vez, entonces el número de sondas de anclaje únicas aplicadas a la muestra puede ser, por ejemplo, de 5 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 100 o más, 200 o más, 1.000 o más o 10.000 o más.

Pueden usarse otros métodos para anclar ácidos nucleicos u otras moléculas en las que se desea inmovilización. En un conjunto de realizaciones, pueden inmovilizarse ácidos nucleicos tales como ADN o ARN mediante unión covalente. Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, puede usarse un agente alquilante que se une de manera covalente a ARN o ADN y contiene un segundo resto químico que puede incorporarse en los polielectrolitos a medida que se polimeriza. En aún otro conjunto de realizaciones, la ribosa terminal en una molécula de ARN puede oxidarse usando peryodato de sodio (u otro agente oxidante) para producir un aldehído, que puede reticularse con acrilamida, u otro polímero o gel. En otras realizaciones, pueden usarse agentes químicos que son capaces de modificar bases, tales como aldehídos, por ejemplo paraformaldehído o gluteraldehído, agentes alquilantes o grupos que contienen succinimidilo; agentes químicos que modifican el fosfato terminal, tales como carbodiimidas, por ejemplo, EDC (1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida); agentes químicos que modifican azúcares internos, tales como isocianato de p-maleimido-fenilo; o agentes químicos que modifican azúcares terminales, tales como peryodato de sodio. En algunos casos, estos agentes químicos pueden portar un segundo resto químico que entonces puede reticularse directamente al gel o polímero, y/o que puede modificarse adicionalmente con un compuesto que puede reticularse directamente al gel o polímero.

En todavía otro conjunto de realizaciones, los ácidos nucleicos pueden estar físicamente enredados dentro del polímero o gel, por ejemplo, debido a su longitud, y, por tanto, ser incapaces de difundirse a partir de su ubicación original dentro del gel.

Pueden usarse sondas de anclaje similares para inmovilizar otros componentes a un polímero o gel, en otras realizaciones. Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, un anticuerpo capaz de unirse específicamente a una diana adecuada (por ejemplo, otra proteína, un lípido, un hidrato de carbono, un virus, etc.) puede modificarse para incluir un resto acridita que puede incorporarse dentro de un polímero o gel.

Además, debe entenderse que la incorporación de la muestra dentro del material expandible y la inmovilización de ácidos nucleicos (u otras dianas deseadas) puede realizarse en cualquier orden adecuado en diversas realizaciones. Por ejemplo, la inmovilización puede producirse antes, durante o después de la incorporación de la muestra. En algunos casos, la diana puede modificarse químicamente o hacerse reaccionar para reticularse al gel o polímero antes o durante la formación del gel o polímero.

Tal como se menciona, en algunas realizaciones de la invención, las sondas de anclaje inmovilizan una diana, tal como un ácido nucleico, al material expandible en un punto individual. En algunos casos, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % (en número) de las dianas inmovilizadas al material expandible se inmovilizan en un punto individual. Usando tan sólo un punto individual, pueden inmovilizarse números relativamente grandes de dianas con respecto al material expandible, sin afectar necesariamente a la función de las dianas. Por ejemplo, múltiples puntos de unión pueden perturbar posiblemente la estructura de la diana, por ejemplo, debido al “estiramiento” de la diana durante la expansión del material expandible (véanse, por ejemplo, las figuras 4A-4C), o debido a sustituciones o perturbaciones de la diana debido al anclaje (por ejemplo, si el anclaje se produce en o cerca de un sitio usado para unión o estabilidad estructural, etc.). Sin embargo, debe entenderse que, en algunas realizaciones, pueden unirse dianas al material expandible en más de un punto.

Puede usarse una variedad de técnicas para unir una diana tal como un ácido nucleico (por ejemplo, ARN o ADN) en un punto individual. Por ejemplo, pueden usarse sondas de anclaje que son complementarias a regiones específicas de un ácido nucleico (por ejemplo, basándose en complementariedad de secuencia). En algunos casos, las sondas de anclaje pueden ser específicas para cada ácido nucleico de manera individual (por ejemplo, teniendo secuencias de ácido nucleico únicas que son complementarias para la secuencia de ese ácido nucleico). Por tanto, pueden inmovilizarse ácidos nucleicos tales como ADN o ARN a un material expandible, por ejemplo, en un punto o región individual controlado mediante la secuencia de ácidos nucleicos dentro de la sonda de anclaje. Sin embargo, en otras realizaciones, las sondas de anclaje pueden incluir ácidos nucleicos que son complementarios a una característica común del ácido nucleico, tal como la cola de poli-A de un ARNm, de tal manera que las mismas sondas de anclaje pueden inmovilizar varios ácidos nucleicos diferentes (por ejemplo, secuencias de ARNm diferentes dentro de una muestra).

Además, en algunas realizaciones, puede usarse más de un tipo de sonda de anclaje, por ejemplo, que seleccionan como diana las mismas o diferentes porciones de una diana. Por ejemplo, en algunas realizaciones, pueden aplicarse una o más sondas de anclaje a una muestra de tal manera que, aunque no se anclen todas las dianas mediante todas las sondas de anclaje, s inmoviliza un porcentaje sustancial de dianas al material expandible. En algunos casos, por ejemplo, al menos el 20 %, al menos el 30 %, al menos el 40 %, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % de las dianas se inmovilizan al material expandible, por ejemplo, mediante una o más sondas de anclaje.

Pueden usarse otros enfoques para anclar ácidos nucleicos además de secuencias de ácido nucleico complementarias. Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, puede seleccionarse como diana el extremo 3’OH de una molécula de ARN, por ejemplo, de manera química, para su inmovilización al material expandible. Por ejemplo, puede convertirse un extremo 3’OH en un aldehído mediante oxidación con agentes tales como peryodato (por ejemplo, peryodato de sodio o peryodato de potasio). Entonces puede hacerse reaccionar el aldehído con hidrazinas, aminas u otros restos que pueden hacer que la sonda de anclaje sea capaz de incorporarse en el material expandible. Por ejemplo, puede unirse una hidrazina o una amina a restos químicos tales como acrilamida, metacrilamida u otros grupos químicos capaces de incorporarse en un material expandible tal como poliacrilamida. Anteriormente se han descrito ejemplos adicionales de técnicas de unión. Por tanto, en algunas realizaciones pueden anclarse moléculas de ARN únicamente en sus extremos 3’OH.

Como otro ejemplo no limitativo, el 3’OH puede ser un sitio mediante el cual la extensión enzimática del ARN puede añadir una sonda de anclaje. Por ejemplo, puede usarse poliA polimerasa para añadir nucleótidos de A modificados al extremo 3’ de la molécula de ARN. Estos nucleótidos de A pueden servir como sitio de unión para sondas de poliT tal como se describió anteriormente. Como otro ejemplo, los nucleótidos de A pueden modificarse químicamente de tal manera que contienen un resto químico apropiado que puede usarse para anclar el ARN. Por ejemplo, pueden adquirirse comercialmente nucleótidos de adenosina que contienen el reactivo de química clic azida. Entonces puede hacerse reaccionar esto con un grupo DBCO (dibenzociclooctino) que está unido a un grupo metacrilato mediante un éster de NHS, que entonces puede incorporarse en un material expandible, inmovilizando de ese modo el ARN mediante el extremo 3’OH al material expandible.

Como todavía otro ejemplo, en algunas realizaciones, puede seleccionarse como diana el extremo 5’ de una molécula de ARN, por ejemplo, químicamente, para su inmovilización al material expandible. Por ejemplo, pueden usarse grupos carbodiimida para reaccionar con el fosfato en 5’ presente en moléculas de ARN con los sitios reactivos no ocupados. Pueden desocuparse los sitios reactivos de moléculas de ARN con los sitios reactivos ocupados usando enzimas de desocupación de sitios reactivos tales como Dcp2 (enzima de desocupación de sitios reactivos de ARNm 2). Por ejemplo, pueden hacerse reaccionar agentes de reticulación tales como EDC (1-etil-3-3-dimetil-aminopropilcarbodiimida) con ARN con sitios reactivos desocupados para marcar específicamente el extremo 5’ del ARN. Entonces pueden unirse estas moléculas a restos de anclaje tales como acrilamida o metacrilato, por ejemplo, mediante reacción con moléculas de metacrilato que contienen una amina primaria. Entonces pueden incorporarse tales restos en un material expandible, inmovilizando de ese modo el ARN mediante el extremo 5’ al material expandible.

También pueden anclarse otras moléculas, tales como proteínas, a la matriz expandida, en diversas realizaciones. Por ejemplo, pueden marcarse proteínas con reactivos que contienen restos de anclaje. Puede usarse una variedad de métodos para la modificación química de proteínas, incluyendo reticulación con aminas a través de aldehídos, reticulación con cisteínas a través de enlaces disulfuro o maleimida, etc. También pueden anclarse proteínas en algunas realizaciones al gel expandible mediante interacciones con anticuerpos, que pueden marcarse de la manera anterior.

Tras la inmovilización de ácidos nucleicos, u otras moléculas adecuadas, en el polímero o gel, pueden “aclararse” otros componentes dentro de la muestra. Tal aclaramiento puede incluir la retirada de los componentes y/o la degradación de los componentes (por ejemplo, para dar componentes más pequeños, componentes que no emiten fluorescencia, etc.) que no son la diana deseada. En algunos casos, al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % de los componentes no deseados dentro de la muestra pueden aclararse. También pueden realizarse múltiples etapas de aclaramiento en determinadas realizaciones, por ejemplo, para retirar diversos componentes no deseados. Tal como se comenta, se cree que la retirada de tales componentes puede reducir el fondo durante el análisis (por ejemplo, reduciendo el fondo y/o la unión fuera de la diana), mientras que los componentes deseados (tales como ácidos nucleicos) pueden inmovilizarse y, por tanto, no aclararse.

Por ejemplo, pueden aclararse proteínas a partir de la muestra usando enzimas, agentes desnaturalizantes, agentes quelantes, agentes químicos y similares, que pueden descomponer las proteínas para dar componentes más pequeños y/o aminoácidos. Estos componentes más pequeños pueden ser más fáciles de retirar físicamente y/o pueden ser lo suficientemente pequeños o inertes de tal manera que no afectan significativamente al fondo. De manera similar, pueden aclararse lípidos a partir de la muestra usando tensioactivos o similares. En algunos casos, se usan uno o más de los mismos, por ejemplo, de manera simultánea o de manera secuencial. Los ejemplos no limitativos de enzimas adecuadas incluyen proteinasas tales como proteinasa K, proteasas o peptidasas, o enzimas digestivas tales como tripsina, pepsina o quimotripsina. Los ejemplos no limitativos de agentes desnaturalizantes adecuados incluyen guanidina·HCl, acetona, ácido acético, urea o perclorato de litio. Los ejemplos no limitativos de agentes químicos capaces de desnaturalizar proteínas incluyen disolventes tales como fenol, cloroformo, isocianato de guanidinio, urea, formamida, etc. Los ejemplos no limitativos de tensioactivos incluyen Triton X-100 (p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil éter de polietilenglicol), SDS (dodecilsulfato de sodio), Igepal CA-630 o poloxámeros. Los ejemplos no limitativos de agentes quelantes incluyen ácido etilendiaminatetraacético (EDTA), citrato o poli(ácido aspártico). En algunas realizaciones, pueden aplicarse compuestos tales como estos a la muestra para aclarar proteínas, lípidos y/u otros componentes. Por ejemplo, puede aplicarse una disolución tampón (por ejemplo, que contiene Tris o tris(hidroximetil)aminometano) a la muestra, después retirarse.

Los ejemplos no limitativos de enzimas de ADN que pueden usarse para retirar ADN incluyen ADNasa I, ADNasabc, una variedad de enzimas de restricción, etc. Los ejemplos no limitativos de técnicas para aclarar ARN incluyen enzimas de ARN tales como ARNasa A, ARNasa T o ARNasa H, o agentes químicos, por ejemplo, mediante hidrólisis alcalina (por ejemplo, aumentando el pH hasta más de 10). Los ejemplos no limitativos de sistemas para retirar azúcares o matriz extracelular incluyen enzimas tales como quitinasa, heparinasas u otras glicosilasas. Los ejemplos no limitativos de sistemas para retirar lípidos incluyen enzimas tales como lipidasas, agentes químicos tales como alcoholes (por ejemplo, metanol o etanol) o detergentes tales como Triton X-100 o dodecilsulfato de sodio. Muchos de estos están fácilmente disponibles de manera comercial. De esta manera, puede retirarse el fondo de la muestra, lo cual puede facilitar el análisis de las sondas de ácido nucleico u otras dianas deseadas, por ejemplo, usando microscopía por fluorescencia u otras técnicas tal como se comenta en el presente documento. Tal como se menciona, en diversas realizaciones, pueden inmovilizarse diversas dianas (por ejemplo, ácidos nucleicos, determinadas proteínas, lípidos, virus o similares), mientras que otros compuestos distintos de diana pueden aclararse usando agentes o enzimas adecuados. Como un ejemplo no limitativo, si se inmoviliza una proteína (tal como un anticuerpo), entonces pueden usarse enzimas de ARN, enzimas de ADN, sistemas para retirar lípidos, azúcares, etc.

En algunos casos, la diana deseada es un ácido nucleico. En un conjunto de realizaciones, como ejemplo ilustrativo no limitativo, la muestra puede estudiarse exponiéndola a uno o más tipos de sondas de ácido nucleico, de manera simultánea y/o de manera secuencial. Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, las sondas de ácido nucleico pueden incluir sondas de smFISH o MERFISH, tales como las comentadas en las publicaciones de solicitud de patente internacional n.<os>WO 2016/018960 o WO 2016/018963. Sin embargo, debe entenderse que lo siguiente es únicamente a modo de ejemplo y, en otras realizaciones, la diana deseada puede ser, por ejemplo, una proteína, un lípido, un virus o similar.

Las sondas de ácido nucleico pueden comprender ácidos nucleicos (o entidades que pueden hibridarse con un ácido nucleico, por ejemplo, específicamente) tal como ADN, ARN, ANB (ácidos nucleicos bloqueados), ANP (ácidos nucleicos peptídicos) o combinaciones de los mismos. En algunos casos, también pueden estar presentes componentes adicionales dentro de las sondas de ácido nucleico, por ejemplo, tal como se comenta a continuación. Puede usarse cualquier método adecuado para introducir sondas de ácido nucleico en una célula u otra muestra.

Por ejemplo, en algunas realizaciones, se fija la célula u otra muestra antes de introducir las sondas de ácido nucleico, por ejemplo, para conservar las posiciones de los ácidos nucleicos dentro de la muestra. Los expertos habituales en la técnica conocen técnicas para fijar células y tejidos. Como ejemplos no limitativos, puede fijarse una célula usando productos químicos tales como formaldehído, paraformaldehído, glutaraldehído, etanol, metanol, acetona, ácido acético o similares. En una realización, puede fijarse una célula usando disolvente orgánico mediado por tampón de ácido glutámico-Hepes (HOPE). Las células pueden fijarse, en algunas realizaciones, antes de la formación y/o después de la formación del material expandible. En algunos casos, las células se fijan antes de la expansión del material expandible.

Las sondas de ácido nucleico pueden introducirse en la célula (u otra muestra) usando cualquier método adecuado. En algunos casos, la célula puede permeabilizarse suficientemente de tal manera que las sondas de ácido nucleico pueden introducirse en la célula haciendo fluir un fluido que contiene las sondas de ácido nucleico alrededor de las células. En algunos casos, las células pueden permeabilizarse suficientemente como parte de un procedimiento de fijación; en otras realizaciones, pueden permeabilizarse las células mediante exposición a determinados productos químicos tales como etanol, metanol, Triton X-100 o similares. Además, en algunas realizaciones, pueden usarse técnicas tales como electroporación o microinyección para introducir sondas de ácido nucleico en una célula u otra muestra.

Determinados aspectos de la presente divulgación se refieren generalmente a sondas de ácido nucleico que se introducen en una célula (u otra muestra). Las sondas pueden comprender cualquiera de una variedad de entidades que pueden hibridarse con un ácido nucleico, normalmente mediante emparejamiento de bases de Watson-Crick, tal como ADN, ARN, ANB, ANP, etc., dependiendo de la aplicación. La sonda de ácido nucleico contiene normalmente una secuencia diana que es capaz de unirse a al menos una porción de un ácido nucleico diana, en algunos casos de manera específica. Cuando se introduce en una célula u otra muestra, la sonda de ácido nucleico puede ser capaz de unirse a un ácido nucleico diana específico (por ejemplo, un ARNm u otros ácidos nucleicos tal como se comenta en el presente documento). En algunos casos, las sondas de ácido nucleico pueden determinarse usando entidades de señalización (por ejemplo, tal como se comenta a continuación) y/o usando sondas de ácido nucleico secundarias capaces de unirse a las sondas de ácido nucleico (es decir, a sondas de ácido nucleico primarias). La determinación de tales sondas de ácido nucleico se comenta en detalle a continuación.

En algunos casos, puede aplicarse más de un tipo de sonda de ácido nucleico (primaria) a una muestra, por ejemplo, de manera simultánea. Por ejemplo, puede haber al menos 2, al menos 5, al menos 10, al menos 25, al menos 50, al menos 75, al menos 100, al menos 300, al menos 1.000, al menos 3.000, al menos 10.000, al menos 30.000, al menos 50.000, al menos 100.000, al menos 250.000, al menos 500.000 o al menos 1.000.000 sondas de ácido nucleico distinguibles que se aplican a una muestra, por ejemplo, de manera simultánea o de manera secuencial.

La secuencia diana puede estar posicionada en cualquier lugar dentro de la sonda de ácido nucleico (o sonda de ácido nucleico primaria o sonda de ácido nucleico codificante). La secuencia diana puede contener una región que es sustancialmente complementaria a una porción de un ácido nucleico diana. En algunos casos, las porciones pueden ser complementarias en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 92 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 %. En algunos casos, la secuencia diana puede tener una longitud de al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 65, al menos 75, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400 o al menos 450 nucleótidos. En algunos casos, la secuencia diana puede tener una longitud de no más de 500, no más de 450, no más de 400, no más de 350, no más de 300, no más de 250, no más de 200, no más de 175, no más de 150, no más de 125, no más de 100, be no más de 75, no más de 60, no más de 65, no más de 60, no más de 55, no más de 50, no más de 45, no más de 40, no más de 35, no más de 30, no más de 20 o no más de 10 nucleótidos. También son posibles combinaciones de cualquiera de estos, por ejemplo, la secuencia diana puede tener una longitud de entre 10 y 30 nucleótidos, entre 20 y 40 nucleótidos, entre 5 y 50 nucleótidos, entre 10 y 200 nucleótidos o entre 25 y 35 nucleótidos, entre 10 y 300 nucleótidos, etc. Normalmente, se determina la complementariedad basándose en el emparejamiento de bases de nucleótidos de Watson-Crick.

La secuencia diana de una sonda de ácido nucleico (primaria) puede determinarse con referencia a un ácido nucleico diana que se sospecha que está presente dentro de una célula u otra muestra. Por ejemplo, puede determinarse un ácido nucleico diana para una proteína usando la secuencia de la proteína, determinando los ácidos nucleicos que se expresan para formar la proteína. En algunos casos, sólo se usa una porción de los ácidos nucleicos que codifican para la proteína, por ejemplo, que tienen las longitudes tal como se comentó anteriormente. Además, en algunos casos, puede usarse más de una secuencia diana que puede usarse para identificar una diana particular. Por ejemplo, pueden usarse múltiples sondas, de manera secuencial y/o de manera simultánea, que pueden unirse a, o hibridarse con, diferentes regiones de la misma diana. Normalmente la hibridación se refiere a un procedimiento de apareamiento mediante el cual se asocian ácidos nucleicos monocatenarios complementarios mediante emparejamiento de bases de nucleótidos de Watson-Crick (por ejemplo, formación de enlaces de hidrógeno, guanina-citosina y adenina-timina) para formar ácido nucleico bicatenario.

En algunas realizaciones, una sonda de ácido nucleico, tal como una sonda de ácido nucleico primaria, también puede comprender una o más secuencias de “lectura”. Sin embargo, debe entenderse que las secuencias de lectura no son necesarias en todos los casos. En algunas realizaciones, la sonda de ácido nucleico puede comprender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 o más, 20 o más, 32 o más, 40 o más, 50 o más, 64 o más, 75 o más, 100 o más, 128 o más secuencias de lectura. Las secuencias de lectura pueden estar posicionadas en cualquier lugar dentro de la sonda de ácido nucleico. Si está presente más de una secuencia de lectura, las secuencias de lectura pueden estar posicionadas unas junto a otras y/o intercaladas con otras secuencias.

Las secuencias de lectura, si están presentes, pueden tener cualquier longitud. Si se usa más de una secuencia de lectura, las secuencias de lectura pueden tener independientemente longitudes iguales o diferentes. Por ejemplo, la secuencia de lectura puede tener una longitud de al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 65, al menos 75, al menos 100, al menos 125, al menos 150, al menos 175, al menos 200, al menos 250, al menos 300, al menos 350, al menos 400 o al menos 450 nucleótidos. En algunos casos, la secuencia de lectura puede tener una longitud de no más de 500, no más de 450, no más de 400, no más de 350, no más de 300, no más de 250, no más de 200, no más de 175, no más de 150, no más de 125, no más de 100, be no más de 75, no más de 60, no más de 65, no más de 60, no más de 55, no más de 50, no más de 45, no más de 40, no más de 35, no más de 30, no más de 20 o no más de 10 nucleótidos. También son posibles combinaciones de cualquiera de los mismos, por ejemplo, la secuencia de lectura puede tener una longitud de entre 10 y 30 nucleótidos, entre 20 y 40 nucleótidos, entre 5 y 50 nucleótidos, entre 10 y 200 nucleótidos o entre 25 y 35 nucleótidos, entre 10 y 300 nucleótidos, etc.

La secuencia de lectura puede ser arbitraria o aleatoria en algunas realizaciones. En determinados casos, las secuencias de lectura se eligen para reducir o minimizar la homología con otros componentes de la célula u otra muestra, por ejemplo, de tal manera que las propias secuencias de lectura no se unen a, o se hibridan con, otros ácidos nucleicos que se sospecha que están dentro de la célula u otra muestra. En algunos casos, la homología puede ser de menos del 10 %, menos del 8 %, menos del 7 %, menos del 6 %, menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 % o menos del 1 %. En algunos casos, puede haber una homología de menos de 20 pares de bases, menos de 18 pares de bases, menos de 15 pares de bases, menos de 14 pares de bases, menos de 13 pares de bases, menos de 12 pares de bases, menos de 11 pares de bases o menos de 10 pares de bases. En algunos casos, los pares de bases son secuenciales.

En un conjunto de realizaciones, una población de sondas de ácido nucleico pueden contener un determinado número de secuencias de lectura, que pueden ser menos que el número de dianas de las sondas de ácido nucleico en algunos casos. Los expertos habituales en la técnica sabrán que, si hay una entidad de señalización ynsecuencias de lectura, entonces en general pueden identificarse de manera única 2n-1 diferente dianas de ácido nucleico. Sin embargo, no se necesita usar todas las combinaciones posibles. Por ejemplo, una población de sondas de ácido nucleico pueden seleccionar como diana 12 secuencias de ácido nucleico diferentes, pero contener no más de 8 secuencias de lectura. Como otro ejemplo, una población de ácidos nucleicos pueden seleccionar como diana 140 especies de ácido nucleico diferentes, pero contener no más de 16 secuencias de lectura. Pueden identificarse de manera independiente diferentes dianas de secuencia de ácido nucleico usando diferentes combinaciones de secuencias de lectura dentro de cada sonda. Por ejemplo, cada sonda puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, etc. o más secuencias de lectura. En algunos casos, una población de sondas de ácido nucleico pueden contener el mismo número de secuencias de lectura, aunque, en otros casos, puede haber diferentes números de secuencias de lectura presentes en las diversas sondas.

Como ejemplo no limitativo, una primera sonda de ácido nucleico puede contener una primera secuencia diana, una primera secuencia de lectura y una segunda secuencia de lectura, mientras que una segunda sonda de ácido nucleico diferente puede contener una segunda secuencia diana, la misma primera secuencia de lectura, pero una tercera secuencia de lectura en lugar de la segunda secuencia de lectura. De ese modo, tales sondas pueden distinguirse determinando las diversas secuencias de lectura presentes o asociadas con una sonda o ubicación dada, tal como se comenta en el presente documento.

Además, las sondas de ácido nucleico (y sus sitios complementarios correspondientes en las sondas codificantes), en determinadas realizaciones, pueden prepararse usando únicamente 2 o únicamente 3 de las 4 bases, tal como omitiendo todas las “G” u omitiendo todas las “C” dentro de la sonda. Las secuencias que carecen o bien de “G” o bien de “C” pueden formar muy poca estructura secundaria en determinadas realizaciones y pueden contribuir a una hibridación más uniforme y más rápida.

En algunas realizaciones, la sonda de ácido nucleico puede contener una entidad de señalización. Sin embargo, debe entenderse que no se requieren entidades de señalización en todos los casos; por ejemplo, la sonda de ácido nucleico puede determinarse usando sondas de ácido nucleico secundarias en algunas realizaciones, tal como se comenta a continuación en detalle adicional. A continuación también se comentan en más detalle ejemplos de entidades de señalización que pueden usarse.

También pueden estar presentes otros componentes dentro de una sonda de ácido nucleico. Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, pueden estar presentes una o más secuencias de cebador, por ejemplo, para permitir la amplificación enzimática de sondas. Los expertos habituales en la técnica conocerán secuencias de cebador adecuadas para aplicaciones tales como amplificación (por ejemplo, usando PCR u otras técnicas adecuadas). Muchas de tales secuencias de cebador están comercialmente disponibles. Otros ejemplos de secuencias que pueden estar presentes dentro de una sonda de ácido nucleico primaria incluyen, pero no se limitan a, secuencias de promotor, operones, secuencias de identificación, secuencias sin sentido o similares.

Normalmente, un cebador es un ácido nucleico monocatenario o parcialmente bicatenario (por ejemplo, ADN) que sirve como punto de partida para la síntesis de ácido nucleico, permitiendo que enzimas de polimerasa tales como ácido nucleico polimerasa extiendan el cebador y repliquen la cadena complementaria. Un cebador es (por ejemplo, está diseñado para ser) complementario a, e hibridarse con, un ácido nucleico diana. En algunas realizaciones, un cebador es un cebador sintético. En algunas realizaciones, un cebador es un cebador que no se produce de manera natural. Un cebador tiene normalmente una longitud de 10 a 50 nucleótidos. Por ejemplo, un cebador puede tener una longitud de 10 a 40, de 10 a 30, de 10 a 20, de 25 a 50, de 15 a 40, de 15 a 30, de 20 a 50, de 20 a 40 o de 20 a 30 nucleótidos. En algunas realizaciones, un cebador tiene una longitud de 18 a 24 nucleótidos.

Además, los componentes de la sonda de ácido nucleico pueden estar dispuestos en cualquier orden adecuado. Por ejemplo, en una realización, los componentes pueden estar dispuesto en una sonda de ácido nucleico como: cebador-secuencias de lectura-secuencia de selección como diana-secuencias de lectura-cebador inverso. Las “secuencias de lectura” en esta estructura pueden contener, cada una, cualquier número (incluyendo 0) de secuencias de lectura, siempre que esté presente al menos una secuencia de lectura en la sonda. Los ejemplos no limitativos de estructuras incluyen cebador-secuencia de selección como diana-secuencias de lectura-cebador inverso, cebador-secuencias de lectura-secuencia de selección como diana-cebador inverso, secuencia de selección como diana-cebador-secuencia de selección como diana-secuencias de lectura-cebador inverso, secuencia de selección como diana-cebador-secuencias de lectura-secuencia de selección como diana-cebador inverso, cebadorsecuencia diana-secuencias de lectura-secuencia de selección como diana-cebador inverso, secuencia de selección como diana-cebador-secuencia de lectura-cebador inverso, secuencia de selección como diana-secuencia de lectura-cebador, secuencia de lectura-secuencia de selección como diana-cebador, secuencia de lectura-cebadorsecuencia de selección como diana-cebador inverso, etc. Además, el cebador inverso es opcional en algunas realizaciones, incluyendo en todos los ejemplos anteriormente descritos.

Tras la introducción de las sondas de ácido nucleico en una célula u otra muestra, pueden determinarse directamente las sondas de ácido nucleico determinando entidades de señalización (si están presentes) y/o pueden determinarse las sondas de ácido nucleico usando una o más sondas de ácido nucleico secundarias, según determinados aspectos de la divulgación. Tal como se menciona, en algunos casos, la determinación puede ser espacial, por ejemplo, en dos o tres dimensiones. Además, en algunos casos, la determinación puede ser cuantitativa, por ejemplo, puede determinarse la cantidad o concentración de una sonda de ácido nucleico primaria (y de un ácido nucleico diana). Adicionalmente, las sondas secundarias pueden comprender cualquiera de una variedad de entidades capaces de hibridarse con un ácido nucleico, por ejemplo, ADN, ARN, ANB y/o ANP, etc., dependiendo de la aplicación. A continuación se comentan en más detalle entidades de señalización.

Una sonda de ácido nucleico secundaria puede contener una secuencia de reconocimiento capaz de unirse a, o hibridarse con, una secuencia de lectura de una sonda de ácido nucleico primaria. En algunos casos, la unión es específica, o la unión puede ser de tal manera que una secuencia de reconocimiento se une preferiblemente a, o se hibrida con, tan sólo una de las secuencias de lectura que están presentes. La sonda de ácido nucleico secundaria también puede contener una o más entidades de señalización. Si se usa más de una sonda de ácido nucleico secundaria, las entidades de señalización pueden ser iguales o diferentes.

Las secuencias de reconocimiento pueden tener cualquier longitud y múltiples secuencias de reconocimiento pueden tener longitudes iguales o diferentes. Si se usa más de una secuencia de reconocimiento, las secuencias de reconocimiento pueden tener independientemente longitudes iguales o diferentes. Por ejemplo, la secuencia de reconocimiento puede tener una longitud de al menos 5, al menos 10, al menos 15, al menos 20, al menos 25, al menos 30, al menos 35, al menos 40 o al menos 50 nucleótidos. En algunos casos, la secuencia de reconocimiento puede tener una longitud de no más de 75, no más de 60, no más de 65, no más de 60, no más de 55, no más de 50, no más de 45, no más de 40, no más de 35, no más de 30, no más de 20 o no más de 10 nucleótidos. También son posibles combinaciones de cualquiera de estos, por ejemplo, la secuencia de reconocimiento puede tener una longitud de entre 10 y 30, entre 20 y 40 o entre 25 y 35 nucleótidos, etc. En una realización, la secuencia de reconocimiento tiene la misma longitud que la secuencia de lectura. Además, en algunos casos, la secuencia de reconocimiento puede ser complementaria en al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 92 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o al menos el 100 % a una secuencia de lectura de la sonda de ácido nucleico primaria.

Tal como se menciona, en algunos casos, la sonda de ácido nucleico secundaria puede comprender una o más entidades de señalización. A continuación se comentan en más detalle ejemplos de entidades de señalización.

Tal como se comenta, en determinados aspectos de la divulgación, se usan sondas de ácido nucleico que contienen diversas “secuencias de lectura”. Por ejemplo, una población de sondas de ácido nucleico primarias pueden contener determinadas “secuencias de lectura” que pueden unirse a algunas de las sondas de ácido nucleico secundarias, y las ubicaciones de las sondas de ácido nucleico primarias se determinan dentro de la muestra usando sondas de ácido nucleico secundarias, por ejemplo, que comprenden una entidad de señalización. Tal como se menciona, en algunos casos, una población de secuencias de lectura pueden combinarse en diversas combinaciones para producir diferentes sondas de ácido nucleico, por ejemplo, de tal manera que puede usarse un número relativamente pequeño de secuencias de lectura para producir un número relativamente grande de sondas de ácido nucleico diferentes.

Por tanto, en algunos casos, una población de sondas de ácido nucleico primarias (u otras sondas de ácido nucleico) pueden contener, cada una, un determinado número de secuencias de lectura, algunas de las cuales se comparten entre diferentes sondas de ácido nucleico primarias de tal manera que la población total de sondas de ácido nucleico primarias puede contener un determinado número de secuencias de lectura. Una población de sondas de ácido nucleico puede tener cualquier número adecuado de secuencias de lectura. Por ejemplo, una población de sondas de ácido nucleico primarias puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc., secuencias de lectura. También son posibles más de 20 en algunas realizaciones. Además, en algunos casos, una población de sondas de ácido nucleico puede tener, en total, 1 o más, 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 11 o más, 12 o más, 13 o más, 14 o más, 15 o más, 16 o más, 20 o más, 24 o más, 32 o más, 40 o más, 50 o más, 60 o más, 64 o más, 100 o más, 128 o más, etc., secuencias de lectura posibles presentes, aunque algunas o la totalidad de las sondas pueden contener, cada una, más de una secuencia de lectura, tal como se comenta en el presente documento. Además, en algunas realizaciones, la población de sondas de ácido nucleico puede tener no más de 100, no más de 80, no más de 64, no más de 60, no más de 50, no más de 40, no más de 32, no más de 24, no más de 20, no más de 16, no más de 15, no más de 14, no más de 13, no más de 12, no más de 11, no más de 10, no más de 9, no más de 8, no más de 7, no más de 6, no más de 5, no más de 4, no más de 3 o no más de dos secuencias de lectura presentes. También son posibles combinaciones de cualquiera de estos, por ejemplo, una población de sondas de ácido nucleico puede comprender entre 10 y 15 secuencias de lectura en total.

Como ejemplo no limitativo de un enfoque para producir de manera combinatoria un número relativamente grade de sondas de ácido nucleico a partir de un número relativamente pequeño de secuencias de lectura, en una población de 6 tipos diferentes de sondas de ácido nucleico, que comprenden, cada una, una o más secuencias de lectura, el número total de secuencias de lectura dentro de la población puede ser no mayor de 4. Debe entenderse que, aunque se usan 4 secuencias de lectura en este ejemplo por facilidad de explicación, en otras realizaciones pueden realizarse números mayores de sondas de ácido nucleico, por ejemplo, usando 5, 8, 10, 16, 32, etc. o más secuencias de lectura, o cualquier otro número adecuado de secuencias de lectura descritas en el presente documento, dependiendo de la aplicación. Si cada una de las sondas de ácido nucleico primarias contiene dos secuencias de lectura diferentes, entonces, usando 4 de tales secuencias de lectura (A, B, C, y D), pueden identificarse de manera independiente hasta 6 sondas. Debe observarse que, en este ejemplo, el orden de secuencias de lectura en una sonda de ácido nucleico no es esencial, es decir, “AB” y “BA” pueden tratarse como sinónimos (aunque, en otras realizaciones, el orden de secuencias de lectura puede ser esencial y “AB” y “BA” pueden no ser necesariamente sinónimos). De manera similar, si se usan 5 secuencias de lectura (A, B, C, D y E) en la población de sondas de ácido nucleico primarias, pueden identificarse de manera independiente hasta 10 sondas. Por ejemplo, un experto habitual en la técnica entenderá que, paraksecuencias de lectura en una población conn

secuencias de lectura en cada sonda, pueden producirse hasta sondas diferentes, suponiendo que el orden de secuencias de lectura no es esencial; dado que no es necesario que todas las sondas tengan el mismo número de secuencias de lectura y no es necesario usar todas las combinaciones de secuencias de lectura en todas las realizaciones, también pueden usarse más o menos de este número de diferentes sondas en determinadas realizaciones. Además, también debe entenderse que no es necesario que el número de secuencias de lectura en cada sonda sea idéntico en algunas realizaciones. Como caso de ejemplo, algunas sondas pueden contener 2 secuencias de lectura mientras que otras sondas pueden contener 3 secuencias de lectura.

En algunos aspectos, las secuencias de lectura y/o el patrón de unión de sondas de ácido nucleico dentro de una muestra pueden usarse para definir un código con detección de errores y/o corrección de errores, por ejemplo, para reducir o prevenir la identificación errónea o errores de los ácidos nucleicos. Por tanto, por ejemplo, si se indica la unión (por ejemplo, tal como se determina usando una entidad de señalización), entonces la ubicación puede identificarse con un “1”; a la inversa, si no se indica unión, entonces la ubicación puede identificarse con un “0” (o viceversa, en algunos casos). Entonces pueden usarse múltiples rondas de determinaciones de unión, por ejemplo, usando diferentes sondas de ácido nucleico, para crear una “palabra de código”, por ejemplo, para esa ubicación espacial. En algunas realizaciones, la palabra de código puede someterse a detección y/o corrección de errores. Por ejemplo, las palabras de código pueden organizarse de tal manera que, si no se encuentra ninguna coincidencia para un conjunto dado de secuencias de lectura o patrón de unión de sondas de ácido nucleico, entonces puede identificarse la coincidencia como un error y, opcionalmente, puede aplicarse corrección de errores a secuencias para determinar la diana correcta para las sondas de ácido nucleico. En algunos casos, las palabras de código pueden tener menos “letras” o posiciones que el número total de ácidos nucleicos codificados por las palabras de código, por ejemplo en los que cada palabra de código codifica para un ácido nucleico diferente.

Tal código con detección de errores y/o corrección de errores puede adoptar una variedad de formas. Anteriormente se ha desarrollado una variedad de tales códigos en otros contextos tales como la industria de telecomunicaciones, tal como códigos de Golay o códigos de Hamming. En un conjunto de realizaciones, las secuencias de lectura o patrones de unión de las sondas de ácido nucleico se asignan de tal manera que no se asignan todas las combinaciones posibles.

Por ejemplo, si son posibles 4 secuencias de lectura y una sonda de ácido nucleico primaria contiene 2 secuencias de lectura, entonces pueden identificarse hasta 6 sondas de ácido nucleico primarias; pero el número de sondas de ácido nucleico primarias usadas puede ser de menos de 6. De manera similar, paraksecuencias de lectura en una

población connsecuencias de lectura en cada sonda de ácido nucleico primaria, pueden producirse sondas diferentes, pero el número de sondas de ácido nucleico primarias que se usan puede ser cualquier número mayor o

menor de . Además, pueden asignarse de manera aleatoria o asignarse de maneras específicas para aumentar la capacidad de detectar y/o corregir errores.

Como otro ejemplo, si se usan múltiples rondas de sondas de ácido nucleico, el número de rondas puede elegirse de manera arbitraria. Si, en cada ronda, cada diana puede proporcionar dos desenlaces posibles, tal como detectarse o no detectarse, pueden ser posibles hasta 2ndianas diferentes paranrondas de sondas, pero el número de dianas de ácido nucleico que se usan realmente puede ser cualquier número menor de 2n. Por ejemplo, si, en cada ronda, cada diana puede proporcionar más de dos desenlaces posibles, tal como detectarse en diferentes canales de color, pueden ser posibles más de 2n(por ejemplo 3n, 4n...) dianas diferentes paranrondas de sondas. En algunos casos, el número de dianas de ácido nucleico que se usan realmente puede ser cualquier número menor que este número. Además, pueden asignarse de manera aleatoria o asignarse de maneras específicas para aumentar la capacidad de detectar y/o corregir errores.

Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, las palabras de código o sondas de ácido nucleico pueden asignarse dentro de un espacio de código de tal manera que las asignaciones están separadas por una distancia de Hamming, que mide el número de “lecturas” incorrectas en un patrón dado que hacen que la sonda de ácido nucleico se interprete de manera errónea como una sonda de ácido nucleico válida diferente. En determinados casos, la distancia de Hamming puede ser de al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, al menos 6 o similar. Además, en un conjunto de realizaciones, las asignaciones pueden formarse como un código de Hamming, por ejemplo, un código de Hamming(7, 4), un código de Hamming(15, 11), un código de Hamming(31, 26), un código de Hamming(63, 57), un código de Hamming(127, 120), etc. En otro conjunto de realizaciones, las asignaciones pueden formar un código de SECDED, por ejemplo, un código de SECDED(8,4), un código de SECDED(16,4), un código de SCEDED(16, 11), un código de SCEDED(22, 16), un código de SCEDED(39, 32), un código de SCEDED(72, 64), etc. En aún otro conjunto de realizaciones, las asignaciones pueden formar un código de Golay binario extendido, un código de Golay binario perfecto o un código de Golay ternario. En otro conjunto de realizaciones, las asignaciones pueden representar un subconjunto de los valores posibles tomados a partir de cualquiera de los códigos anteriormente descritos.

Por ejemplo, un código con las mismas propiedades de corrección de errores del código de SECDED puede formarse usando únicamente palabras binarias que contienen un número fijo de bits “1”, tal como 4, para codificar las dianas. En otro conjunto de realizaciones, las asignaciones pueden representar un subconjunto de los valores posibles tomados a partir de códigos descritos anteriormente con el propósito de abordar errores de lecturas asimétricas. Por ejemplo, en algunos casos, un código en el que el número de bits “1” puede ser fijo para todas las palabras binarias usadas puede eliminar la medición sesgada de palabras con números diferentes de “1” cuando la tasa a la que los bits “0” se miden como “1” o los bits “1” se miden como “0” son diferentes.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, una vez determinada la palabra de código (por ejemplo, tal como se comenta en el presente documento), puede compararse la palabra de código con las palabras de código de ácido nucleico conocidas. Si se encuentra una coincidencia, entonces puede identificarse o determinarse la diana de ácido nucleico. Si no se encuentra ninguna coincidencia, entonces puede identificarse un error en la lectura de la palabra de código. En algunos casos, también puede aplicarse corrección de errores para determinar la palabra de código correcta y, por tanto, dar como resultado la identidad correcta de la diana de ácido nucleico. En algunos casos, las palabras de código pueden seleccionarse de tal manera que, suponiendo que sólo está presente un error, sólo está disponible una palabra de código correcta posible y, por tanto, sólo es posible una identidad correcta de la diana de ácido nucleico. En algunos casos, esto también puede generalizarse a separaciones de palabra de código o distancias de Hamming más grandes; por ejemplo, las palabras de código pueden seleccionarse de tal manera que si están presentes dos, tres o cuatro errores (o más en algunos casos), sólo está disponible una palabra de código correcta posible y, por tanto, sólo es posible una identidad correcta de las dianas de ácido nucleico.

El código con corrección de errores puede ser un código con corrección de errores binario o puede basarse en otros sistemas de numeración, por ejemplo, códigos con corrección de errores ternarios o cuaternarios. Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, puede usarse más de un tipo de entidad de señalización y asignarse a diferentes números dentro de un código con corrección de errores. Por tanto, como ejemplo no limitativo, puede asignarse una primera entidad de señalización (o más de una entidad de señalización, en algunos casos) como “1” y puede asignarse una segunda entidad de señalización (o más de una entidad de señalización, en algunos casos) como “2” (indicando “0” que no hay ninguna entidad de señalización presente), y distribuirse las palabras de código para definir un código con corrección de errores ternario. De manera similar, puede asignarse adicionalmente una tercera entidad de señalización como “3” para realizar un código con corrección de errores cuaternario, etc.

Tal como se comentó anteriormente, en determinados aspectos, se determinan entidades de señalización, por ejemplo, para determinar sondas de ácido nucleico y/o para crear palabras de código. En algunos casos, pueden determinarse entidades de señalización dentro de una muestra, por ejemplo, de manera espacial, usando una variedad de técnicas. En algunas realizaciones, las entidades de señalización pueden ser fluorescentes, y las técnicas para determinar fluorescencia dentro de una muestra, tales como microscopía por fluorescencia o microscopía confocal, pueden usarse para identificar espacialmente las posiciones de entidades de señalización dentro de una célula. En algunos casos, las posiciones de entidades dentro de la muestra pueden determinarse en dos o incluso tres dimensiones. Además, en algunas realizaciones, pueden determinarse más de una entidad de señalización cada vez (por ejemplo, entidades de señalización con diferentes colores o emisiones), y/o de manera secuencial.

Además, en algunas realizaciones, puede determinarse un nivel de confianza para la diana de ácido nucleico identificada. Por ejemplo, el nivel de confianza puede determinarse usando una razón del número de coincidencias exactas con respecto al número de coincidencias que tienen uno o más errores de un bit. En algunos casos, pueden usarse tan sólo las coincidencias que tienen una razón de confianza mayor que un determinado valor. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, sólo pueden aceptarse coincidencias si la razón de confianza para la coincidencia es mayor de aproximadamente 0,01, mayor de aproximadamente 0,03, mayor de aproximadamente 0,05, mayor de aproximadamente 0,1, mayor de aproximadamente 0,3, mayor de aproximadamente 0,5, mayor de aproximadamente 1, mayor de aproximadamente 3, mayor de aproximadamente 5, mayor de aproximadamente 10, mayor de aproximadamente 30, mayor de aproximadamente 50, mayor de aproximadamente 100, mayor de aproximadamente 300, mayor de aproximadamente 500, mayor de aproximadamente 1000 o cualquier otro valor adecuado. Además, en algunas realizaciones, sólo pueden aceptarse coincidencias si la razón de confianza para la diana de ácido nucleico identificada es mayor que un patrón interno o control de falsos positivos en aproximadamente 0,01, aproximadamente 0,03, aproximadamente 0,05, aproximadamente 0,1, aproximadamente 0,3, aproximadamente 0,5, aproximadamente 1, aproximadamente 3, aproximadamente 5, aproximadamente 10, aproximadamente 30, aproximadamente 50, aproximadamente 100, aproximadamente 300, aproximadamente 500, aproximadamente 1000 o cualquier otro valor adecuado.

En algunas realizaciones, las posiciones espaciales de las entidades (y, por tanto, sondas de ácido nucleico con las que pueden estar asociadas las entidades) pueden determinarse a resoluciones relativamente altas. Por ejemplo, las posiciones pueden determinarse a resoluciones espaciales mejores que aproximadamente 100 micrómetros, mejores que aproximadamente 30 micrómetros, mejores que aproximadamente 10 micrómetros, mejores que aproximadamente 3 micrómetros, mejores que aproximadamente 1 micrómetro, mejores que aproximadamente 800 nm, mejores que aproximadamente 600 nm, mejores que aproximadamente 500 nm, mejores que aproximadamente 400 nm, mejores que aproximadamente 300 nm, mejores que aproximadamente 200 nm, mejores que aproximadamente 100 nm, mejores que aproximadamente 90 nm, mejores que aproximadamente 80 nm, mejores que aproximadamente 70 nm, mejores que aproximadamente 60 nm, mejores que aproximadamente 50 nm, mejores que aproximadamente 40 nm, mejores que aproximadamente 30 nm, mejores que aproximadamente 20 nm o mejores que aproximadamente 10 nm, etc.

Hay una variedad de técnicas capaces de determinar u obtener imágenes de las posiciones espaciales de entidades o dianas de manera óptica, por ejemplo, usando microscopía por fluorescencia, usando radioactividad, mediante conjugación con cromóforos adecuados o similares. Por ejemplo, diversas técnicas de microscopía convencionales que pueden usarse en diversas realizaciones de la invención incluyen, pero no se limitan a, microscopía por epifluorescencia, microscopía de reflectancia interna total, microscopía de iluminación delgada de alta inclinación (HILO), microscopía de hoja luminosa, microscopía confocal de barrido, microscopía confocal de barrido lineal, microscopía confocal de disco giratorio u otras técnicas de microscopía convencionales comparables.

En algunas realizaciones, pueden usarse técnicas de hibridaciónin situ(ISH) para marcar ácidos nucleicos tales como ADN o ARN, por ejemplo, en las que pueden hibridarse sondas de ácido nucleico a ácidos nucleicos en muestras. Estas pueden realizarse, por ejemplo, a resoluciones a escala celular o a escala de moléculas individuales. En algunos casos, las sondas de ISH pueden estar compuestas por ARN, ADN, ANP, ANB, otros nucleótidos sintéticos o similares, y/o una combinación de cualquiera de los mismos. La presencia de una sonda hibridada puede medirse, por ejemplo, con radioactividad usando sondas de ácido nucleico marcadas con radioactividad, inmunohistoquímica usando, por ejemplo, sondas de ácido nucleico marcadas con biotina, generación de cromóforos o fluoróforos enzimáticos usando, por ejemplo, sondas que pueden unirse a enzimas tales como peroxidasa del rábano y enfoques tales como amplificación de señal de tiramida, obtención de imágenes por fluorescencia usando sondas de ácido nucleico directamente marcadas con fluoróforos, o hibridación de sondas de ácido nucleico secundarias a estas sondas primarias, detectándose las sondas secundarias mediante cualquiera de los métodos anteriores.

En algunos casos, las posiciones espaciales pueden determinarse a superresoluciones, o a resoluciones mejores que la longitud de onda de luz o el límite de difracción (aunque, en otras realizaciones, no se requieren superresoluciones). Los ejemplos no limitativos incluyen STORM (microscopía de reconstrucción óptica estocástica), STED (microscopía de agotamiento de emisión estimulada), NSOM (microscopía óptica de barrido de campo cercano), 4Pi microscopía, SIM (microscopía de iluminación estructurada), microscopía de SMI (iluminación espacialmente modulada), RESOLFT (microscopía de transición de fluorescencia ópticamente lineal saturable reversible), GSD (microscopía de agotamiento de estado fundamental), SSIM (microscopía de iluminación estructurada saturada), SPDM (microscopía de distancia de precisión espectral), microscopía de localización por fotoactivación (PALM), microscopía de localización por fotoactivación de fluorescencia (FPALM), LIMON (microscopía de nanodimensionamiento microscópica óptica en 3D), obtención de imágenes por fluctuación óptica con superresolución (SOFI) o similares. Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 7.838.302, expedida el 23 de noviembre de 2010, titulada “Sub-Diffraction Limit Image Resolution and Other Imaging Techniques”, de Zhuang,et al.; la patente estadounidense n.º 8.564.792, expedida el 22 de octubre de 2013, titulada “Sub-diffraction Limit Image Resolution in Three Dimensions”, de Zhuang,et al.; o la publicación de solicitud de patente internacional n.º WO 2013/090360, publicada el 20 de junio de 2013, titulada “High Resolution Dual-Objective Microscopy”, de Zhuang,et al.

En una realización, la muestra puede iluminarse mediante líneas de láser de modo gaussiano individual. En algunas realizaciones, la iluminación en perfil puede aplanarse haciendo pasar las líneas de láser a través de una fibra multimodo que se hace vibrar mediante medios piezoeléctricos u otros medios mecánicos. En algunas realizaciones, el perfil de iluminación puede aplanarse haciendo pasar haces gaussianos de modo individual a través de una variedad de conformadores de haces de refracción, tales como el dispositivo piShaper o una serie de lentes de Powell apiladas. En aún otro conjunto de realizaciones, los haces gaussianos pueden hacerse pasar a través de una variedad de elementos de difusión diferentes, tales como vidrio esmerilado o difusores modificados por ingeniería, que pueden hacerse girar en algunos casos a altas velocidades para eliminar la granularidad de láser residual. En aún otra realización, puede hacerse pasar la iluminación de láser a través de una serie de matriz de lentillas para producir imágenes superpuestas de la iluminación que se aproximan a un campo de iluminación plano.

En algunas realizaciones, pueden determinarse los centroides de las posiciones espaciales de las entidades. Por ejemplo, puede determinarse un centroide de una entidad de señalización dentro de una imagen o serie de imágenes usando algoritmos de análisis de imágenes conocidos por los expertos habituales en la técnica. En algunos casos, los algoritmos pueden seleccionarse para determinar emisores individuales no superpuestos y/o emisores individuales parcialmente superpuestos en una muestra. Los ejemplos no limitativos de técnicas adecuadas incluyen un algoritmo de probabilidad máxima, un algoritmo de mínimos cuadrados, un algoritmo bayesiano, un algoritmo de detección comprimido o similares. También pueden usarse combinaciones de estas técnicas en algunos casos.

Además, la entidad de señalización puede inactivarse en algunos casos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, puede aplicarse una primera sonda de ácido nucleico secundaria que contiene una entidad de señalización a una muestra que puede reconocer una primera secuencia de lectura, después puede inactivarse la primera sonda de ácido nucleico secundaria antes de aplicarse una segunda sonda de ácido nucleico secundaria a la muestra. Si se usan múltiples entidades de señalización, pueden usarse técnicas iguales o diferentes para inactivar las entidades de señalización, y pueden inactivarse algunas o la totalidad de las múltiples entidades de señalización, por ejemplo, de manera secuencial o de manera simultánea.

La inactivación puede provocarse mediante retirada de la entidad de señalización (por ejemplo, a partir de la muestra, o a partir de la sonda de ácido nucleico, etc.) y/o mediante alteración química de la entidad de señalización de alguna manera, por ejemplo, mediante fotoblanqueo de la entidad de señalización, blanqueo o alteración química de la estructura de la entidad de señalización, por ejemplo, mediante reducción, etc. Por ejemplo, en un conjunto de realizaciones, puede inactivarse una entidad de señalización fluorescente mediante técnicas químicas u ópticas tales como oxidación, fotoblanqueo, blanqueo químico, lavado riguroso o digestión o reacción enzimática mediante exposición a una enzima, disociación de la entidad de señalización a partir de otros componentes (por ejemplo, una sonda), reacción química de la entidad de señalización (por ejemplo, frente a un reactivo capaz de alterar la estructura de la entidad de señalización) o similares. Por ejemplo, puede producirse blanqueo mediante exposición a oxígeno, agentes reductores o puede escindirse químicamente la entidad de señalización a partir de la sonda de ácido nucleico y aclararse mediante lavado por un flujo de fluido.

En algunas realizaciones, diversas sondas de ácido nucleico (incluyendo sondas de ácido nucleico primarias y/o secundarias) pueden incluir una o más entidades de señalización. Si se usa más de una sonda de ácido nucleico, las entidades de señalización pueden ser, cada una, iguales o diferentes. En determinadas realizaciones, una entidad de señalización es cualquier entidad capaz de emitir luz. Por ejemplo, en una realización, la entidad de señalización es fluorescente. En otras realizaciones, la entidad de señalización puede ser fosforescente, radioactiva, absorbente, etc. En algunos casos, la entidad de señalización es cualquier entidad que puede determinarse dentro de una muestra a resoluciones relativamente altas, por ejemplo, a resoluciones mejores que la longitud de onda de luz visible o el límite de difracción. La entidad de señalización puede ser, por ejemplo, un colorante, una molécula pequeña, un péptido o proteína, o similares. La entidad de señalización puede ser una única molécula en algunos casos. Si se usan múltiples sondas de ácido nucleico secundarias, las sondas de ácido nucleico pueden comprender entidades de señalización iguales o diferentes.

Los ejemplos no limitativos de entidades de señalización incluyen entidades fluorescentes (fluoróforos) o entidades fosforescentes, por ejemplo, colorantes de cianina (por ejemplo, Cy2, Cy3, Cy3B, Cy5, Cy5.5, Cy7, etc.), colorantes de Alexa Fluor, colorantes de Atto, colorantes de fotoactivación, colorantes fotoactivables, colorantes fluorescentes, nanopartículas de metal, nanopartículas de semiconductor o “puntos cuánticos”, proteínas fluorescentes tales como GFP (proteína verde fluorescente) o proteínas fluorescentes fotoactivables, tales como PAGFP, PSCFP, PSCFP2, Dendra, Dendra2, EosFP, tdEos, mEos2, mEos3, PAmCherry, PAtagRFP, mMaple, mMaple2 y mMaple3. Los expertos habituales en la técnica conocen otras entidades de señalización adecuadas. Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.º 7.838.302 o la solicitud de patente estadounidense con n.º de serie 61/979.436. En algunos casos, pueden usarse colorantes fluorescentes espectralmente distintos.

En un conjunto de realizaciones, la entidad de señalización puede unirse a una secuencia de oligonucleótido mediante un enlace que puede escindirse para liberar la entidad de señalización. En un conjunto de realizaciones, puede conjugarse un fluoróforo a un oligonucleótido mediante un enlace escindible, tal como un enlace fotoescindible. Los ejemplos no limitativos de enlaces fotoescindibles incluyen, pero no se limitan a, 1-(2-nitrofenil)etilo, 2-nitrobencilo, fosforamidita de biotina, fosforamidita acrílica, dietilaminocumarina, 1-(4,5-dimetoxi-2-nitrofenil)etilo, ciclododecil-(dimetoxi-2-nitrofenil)etilo, 4-aminometil-3-nitrobencilo, éster de ácido (4-nitro-3-(1-clorocarboniloxietil)fenil)metil-S-acetiltioico, éster de ácido (4-nitro-3-(1-tlorocarboniloxietil)fenil)metil-3-(2-piridilditiopropiónico), 3-(4,4’-dimetoxitritil)-1-(2-nitrofenil)-propano-1,3-diol-[2-cianoetil-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita, 1-[2-nitro-5-(6-trifluoroacetilcaproamidometil)fenil]-etil-[2-cianoetil-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita, 1-[2-nitro-5-(6-(4,4’-dimetoxitritiloxi)butiramidometil)fenil]-etil-[2-cianoetil-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita, 1-[2-nitro-5-(6-(N-(4,4’dimetoxitritil))-biotinamidocaproamidometil)fenil]-etil-[2-cianoetil-(N,N-diisopropil)]-fosforamidita o grupos de unión similares. En otro conjunto de realizaciones, el fluoróforo puede conjugarse a un oligonucleótido mediante un enlace disulfuro. El enlace disulfuro puede escindirse mediante una variedad de agentes reductores tales como, pero sin limitarse a, ditiotreitol, ditioeritritol, beta-mercaptoetanol, borohidruro de sodio, tiorredoxina, glutarredoxina, tripsinógeno, hidrazina, hidruro de diisobutilaluminio, ácido oxálico, ácido fórmico, ácido ascórbico, ácido fosforoso, cloruro de estaño, glutatión, tioglicolato, 2,3-dimercaptopropanol, 2-mercaptoetilamina, 2-aminoetanol, tris(2-carboxietil)fosfina, bis(2-mercaptoetil)sulfona, N,N’-dimetil-N,N’-bis(mercaptoacetil)hidrazina, 3-mercaptopropionato, dimetilformamida, tiopropil-agarosa, tri-n-butilfosfina, cisteína, sulfato de hierro, sulfito de sodio, fosfito, hipofosfito, fosforotioato o similares, y/o combinaciones de cualquiera de los mismos. En otra realización, el fluoróforo puede conjugarse a un oligonucleótido mediante uno o más nucleótidos modificados con fosforotioato en los que la modificación con azufre sustituye al oxígeno que forma puente y/o que no forma puente. El fluoróforo puede escindirse a partir del oligonucleótido, en determinadas realizaciones, mediante adición de compuestos tales como, pero sin limitarse a, yodoetanol, yodo mezclado en etanol, nitrato de plata o cloruro de mercurio. En aún otro conjunto de realizaciones, la entidad de señalización puede inactivarse químicamente mediante reducción u oxidación. Por ejemplo, en una realización, puede reducirse un cromóforo tal como Cy5 o Cy7 usando borohidruro de sodio para dar un estado estable sin fluorescencia. En todavía otro conjunto de realizaciones, puede conjugarse un fluoróforo a un oligonucleótido mediante un enlace azo, y el enlace azo puede escindirse con 2-[(2-N-arilamino)fenilazo]piridina. En aún otro conjunto de realizaciones, puede conjugarse un fluoróforo a un oligonucleótido mediante un segmento de ácido nucleico adecuado que puede escindirse tras la exposición adecuada a ADNasa, por ejemplo, una exodesoxirribonucleasa o una endodesoxirribonucleasa. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, desoxirribonucleasa I o desoxirribonucleasa II. En un conjunto de realizaciones, la escisión puede producirse mediante una endonucleasa de restricción. Los ejemplos no limitativos de endonucleasas de restricción posiblemente adecuadas incluyen BamHI, BsrI, NotI, XmaI, PspAI, DpnI, MboI, MnlI, Eco57I, Ksp632I, DraIII, AhaII, SmaI, MluI, HpaI, ApaI, BclI, BstEII, TaqI, EcoRI, SacI, HindII, HaeII, DraII, Tsp509I, Sau3AI, PacI, etc. Se han estudiado en detalle más de 3000 enzimas de restricción y más de 600 de las mismas están comercialmente disponibles. En aún otro conjunto de realizaciones, puede conjugarse un fluoróforo a biotina, y conjugarse el oligonucleótido a avidina o estreptavidina. Una interacción entre biotina y avidina o estreptavidina permite conjugar el fluoróforo al oligonucleótido, mientras que una exposición suficiente a un exceso de adición, la biotina libre puede “superar” a la unión y provocar de ese modo que se produzca la escisión. Además, en otro conjunto de realizaciones, las sondas pueden retirarse usando “sondas de sujeción” correspondientes, que comprenden la misma secuencia que la sonda, así como un número adicional de bases de homología con respecto a las sondas codificantes (por ejemplo, 1-20 bases adicionales, por ejemplo, 5 bases adicionales). Estas sondas pueden retirar la sonda de lectura marcada mediante una interacción de desplazamiento de cadena.

Tal como se usa en el presente documento, el término “luz” se refiere de manera general a radiación electromagnética, que tiene cualquier longitud de onda adecuada (o, de manera equivalente, frecuencia). Por ejemplo, en algunas realizaciones, la luz puede incluir longitudes de onda en el rango óptico o visual (por ejemplo, que tienen una longitud de onda de entre aproximadamente 400 nm y aproximadamente 700 nm, es decir, “luz visible”), longitudes de onda infrarrojas (por ejemplo, que tienen una longitud de onda de entre aproximadamente 300 micrómetros y 700 nm), longitudes de onda ultravioletas (por ejemplo, que tienen una longitud de onda de entre aproximadamente 400 nm y aproximadamente 10 nm) o similares. En determinados casos, tal como se comenta en detalle a continuación, puede usarse más de una entidad, es decir, entidades que son químicamente diferentes o distintas, por ejemplo, desde el punto de vista estructural. Sin embargo, en otros casos, las entidades pueden ser químicamente idénticas o al menos químicamente idénticas de manera sustancial.

Otro aspecto de la divulgación se refiere a un método implementado por ordenador. Por ejemplo, puede proporcionarse un ordenador y/o un sistema automatizado que es capaz de realizar de manera automática y/o repetitiva cualquiera de los métodos descritos en el presente documento. Tal como se usan en el presente documento, los dispositivos “automatizados” se refieren a dispositivos que son capaces de funcionar sin instrucciones humanas, es decir, un dispositivo automatizado puede realizar una función durante un periodo de tiempo después de que cualquier ser humano haya terminado de realizar cualquier acción para fomentar la función, por ejemplo introduciendo instrucciones en un ordenador para iniciar el procedimiento. Normalmente, los equipos automatizados pueden realizar funciones repetitivas después de este momento. Las etapas de procesamiento también pueden grabarse en un medio legible por máquina en algunos casos.

Por ejemplo, en algunos casos, puede usarse un ordenador para controlar la obtención de imágenes de la muestra, por ejemplo, usando microscopía por fluorescencia, STORM u otras técnicas de superresolución tales como las descritas en el presente documento. En algunos casos, el ordenador también puede controlar operaciones tales como corrección de deriva, registro físico, hibridación y alineación de agrupaciones en análisis de imágenes, decodificación de agrupaciones (por ejemplo, decodificación de agrupaciones fluorescentes), detección o corrección de errores (por ejemplo, tal como se comenta en el presente documento), reducción de ruido, identificación de características de primer plano con respecto a características de fondo (tal como ruido o residuos en imágenes) o similares. Como un ejemplo, el ordenador puede usarse para controlar la activación y/o excitación de entidades de señalización dentro de la muestra, y/o la adquisición de imágenes de las entidades de señalización. En un conjunto de realizaciones, puede excitarse una muestra usando luz que tiene diversas longitudes de onda y/o intensidades, y la secuencia de las longitudes de onda de luz usada para excitar la muestra puede correlacionarse, usando un ordenador, con las imágenes adquiridas de la muestra que contiene las entidades de señalización. Por ejemplo, el ordenador puede aplicar luz que tiene diversas longitudes de onda y/o intensidades a una muestra para producir diferentes números promedio de entidades de señalización en cada región de interés (por ejemplo, una entidad activada por cada ubicación, dos entidades activadas por cada ubicación, etc.). En algunos casos, esta información puede usarse para construir una imagen y/o determinar las ubicaciones de las entidades de señalización, en algunos casos a altas resoluciones, tal como se indicó anteriormente.

Se hace referencia a los siguientes documentos: solicitud de patente internacional n.º PCT/US2007/017618, presentada el 7 de agosto de 2007, titulada “Sub-Diffraction Image Resolution and Other Imaging Techniques”, de Zhuang,et al., publicada como WO 2008/091296 el 31 de julio de 2008; patente estadounidense n.º 7.776.613, expedida el 17 de agosto de 2010, titulada “Sub-Diffraction Image Resolution and Other Imaging Techniques”, de Zhuang,et al.; patente estadounidense n.º 7.838.302, expedida el 23 de noviembre de 2010, titulada “Sub-Diffraction Image Resolution and Other Imaging Techniques”, de Zhuang,et al.; solicitud de patente internacional n.º PCT/US2015/042559, presentada el 29 de julio de 2015, titulada “Probe Library Construction”, de Zhuang,et al., publicada como WO 2016/018963 el 4 de febrero de 2016; solicitud de patente internacional n.º PCT/US2015/042556, presentada el 29 de julio de 2015, titulada “Systems and Methods for Determining Nucleic Acids”, de Zhuang,et al., publicada como WO 2016/018960 el 4 de febrero de 2016; solicitud de patente estadounidense con n.º de serie 15/329.683, presentada el 27 de enero de 2017, titulada “Systems and Methods for Determining Nucleic Acids”, de Zhuang,et al., publicada como publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2017/0220733 el 3 de agosto de 2017; solicitud de patente estadounidense con n.º de serie 15/329.651, presentada el 27 de enero de 2017, titulada “Probe Library Construction”, de Zhuang,et al., publicada como publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2017/0212986 el 27 de julio de 2017; solicitud de patente estadounidense con n.º de serie 15/252.307, presentada el 31 de agosto de 2016, titulada “Sub-Diffraction Image Resolution and Other Imaging Techniques”, de Zhuang,et al., publicada como publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2016/0370295 el 22 de diciembre de 2016; solicitud de patente provisional estadounidense con n.º de serie 62/419.033, presentada el 8 de noviembre de 2016, titulada “Matrix Imprinting and Clearing”, de Zhuang,et al.; solicitud de patente provisional estadounidense con n.º de serie 62/511.920, presentada el 26 de mayo de 2017, titulada “Systems and Methods for High-Throughput Image-Based Screening”, de Zhuang,et al.; y solicitud de patente provisional estadounidense con n.º de serie 62/569.127, presentada el 6 de octubre de 2017, titulada “Multiplexed Imaging Using MERFISH, Expansion Microscopy, and Related Technologies”, de Zhuang,et al.

Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren determinadas realizaciones de la presente invención, pero no muestran a modo de ejemplo el alcance completo de la invención.

EJEMPLO 1

Algunos de los siguientes ejemplos ilustran MERFISH de expansión, basándose en determinadas realizaciones de la invención, que aprovechan la microscopía de expansión para aumentar sustancialmente la densidad total de ARN que puede medirse mediante MERFISH. En estos ejemplos, se anclan ARN a un gel de polímero que se expandió 12 veces en volumen para reducir físicamente las densidades de ARN. Con esto, se demostró una identificación precisa de los ARN en una biblioteca de MERFISH compuesta por ARN abundantes, cuya densidad total era >10 veces superior a bibliotecas de ARN anteriormente medidas.

Además, algunos de los siguientes ejemplos ilustran la combinación de inmunofluorescencia con MERFISH de expansión, basándose en determinadas realizaciones, que aprovechan anticuerpos conjugados con oligonucleótidos modificados con acridita para revelar la ubicación y expresión de proteínas junto con medidas de ARN. En estos ejemplos, se tiñeron muestras con anticuerpos conjugados con oligonucleótidos modificados con acridita antes de la proteólisis, proporcionando reticulación del gel expandible y después se digirieron. Se tiñeron los oligonucleótidos unidos para revelar la ubicación original de los anticuerpos junto con lectura de MERFISH de ARN.

Los enfoques basados en obtención de imágenesin situfrente a transcriptómica de células individuales permite no sólo determinar el perfil de expresión de células individuales, sino también localizar las posiciones espaciales de moléculas de ARN individual. Estos enfoques proporcionan medios potentes para mapear las organizaciones espaciales de ARN dentro de células y las células transcripcionalmente distintas en tejidos. Los métodos de determinación de perfiles de ARN de células individuales basados en imágenes actualmente disponibles se basan i bien en hibridaciónin situpor fluorescencia con multiplexación (FISH) o bien en secuenciaciónin situ. En particular, FISH robusta frente a errores con multiplexación (MERFISH), una forma con multiplexación masiva de FISH de moléculas individuales (smFISH), permite obtener imágenes de ARN a escala transcriptómica. Como método potente que obtiene imágenes de moléculas de ARN individuales dentro de células, smFISH proporciona el número de copias preciso y la organización espacial de ARN en células individuales. MERFISH multiplexa medidas de smFISH marcando los ARN de manera combinatoria con sondas de oligonucleótidos que contienen códigos de barras robustos frente a errores y midiendo estos códigos de barras mediante rondas secuenciales de obtención de imágenes por smFISH. Usando este enfoque, se ha demostrado la obtención de imágenes simultánea de cientos a miles de especies de ARN en células individuales usando esquemas de códigos de barras con detección/corrección de error. Véanse, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2017-0220733, titulada “Systems and Methods for Determining Nucleic Acids”, y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 2017-0212986, titulada “Probe Library Construction”.

También puede aumentarse el rendimiento de medición de MERFISH hasta decenas de miles de células por cada medición de único día de duración. Además, se han desarrollado enfoques de aclaramiento de muestra que aumentan la razón de señal con respecto a fondo anclando ARN celulares a una matriz de polímero y retirando otros componentes celulares que dan lugar a fondo de fluorescencia, y estos enfoques de aclaramiento permiten la medición de MERFISH de alta calidad de secciones de tejido. Véanse, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 62/419.033, titulada “Matrix Imprinting and Clearing”; y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 62/511.920, titulada “Systems and Methods for High-Throughput Image-Based Screening”.

Con el fin de identificar con precisión moléculas de ARN, MERFISH, así como otros métodos de determinación de perfiles de ARN basados en secuenciaciónin situo FISH con multiplexación, requiere señales de fluorescencia no superpuestas a partir de ARN individuales. Sin embargo, debido al límite de difracción, cuando las moléculas están lo suficientemente cerca unas de otras, sus señales fluorescentes se superpondrán, limitando la densidad de ARN de los que pueden obtenerse imágenes de manera simultánea. Este problema puede superarse, por ejemplo, mediante métodos de obtención de imágenes de superresolución, o bien mediante medios ópticos o bien mediante expansión de muestra. Estos ejemplos ilustran la expansión de muestra y microscopía de expansión (ExM) para mejorar sustancialmente la capacidad de resolver moléculas cercanas.

En este enfoque, se conjuga la señal deseada con un gel de poliacrilamida expandible, y después se expande físicamente el gel cambiando la intensidad iónica del tampón, separando moléculas que de lo contrario habrían producido señales fluorescentes superpuestas. Estos ejemplos demuestran un enfoque para combinar MERFISH y microscopía de expansión. Los ARNm se anclan a un gel de polímero expandible mediante oligonucleótidos de polidT modificados con acridita y se obtienen imágenes de una biblioteca de ARN de alta abundancia en células de osteosarcoma humanas (U-2OS) cultivadas, que contiene ~130 especies de ARN. Sin expansión de gel, estos ARN no se resolvieron bien y, por tanto, se detectaron con una eficiencia de detección relativamente baja de ~15-20 %. En cambio, en la muestra expandida, las moléculas de ARN individuales se resolvieron bien, conduciendo a un aumento sustancial de su eficiencia de detección. La comparación con resultados de secuenciación a granel y de smFISH demostró que estos ARN en la muestra expandida se detectaron con alta precisión y una eficiencia cerca del 100 %. Estos ejemplos también demostraron la capacidad de realizar obtención de imágenes de ARN de MERFISH y obtención de imágenes de inmunofluorescencia de proteínas simultáneas en estas muestras expandidas.

EJEMPLO 2

Efecto de la densidad de ARN sobre la eficiencia de detección de mediciones de MERFISH. Para ilustrar el efecto de la densidad de ARN sobre mediciones de smFISH con multiplexación, se midió una biblioteca de 129 ARN de alta abundancia usando códigos binarios de distancia de Hamming modificada 4 (MHD4) de 16 bits anteriormente publicado, lo cual permite la detección y corrección de errores. Este código incluye 140 palabras de código únicas, y se usaron ~129 de las mismas para codificar los ARN. Se usaron ~11 como controles de blanco que no corresponden a ningún ARN. Entre los 129 ARN seleccionados como diana, 106 estaban en el intervalo de abundancia de 40 - 250 copias por célula, y los 23 restantes abarcaban un intervalo de abundancia de 1 – 1000 copias por célula para cuantificar el rendimiento a lo largo de diferentes abundancias. La abundancia total de los ARN en esta biblioteca era 14 veces superior a una biblioteca de 130 ARN anteriormente medida usando el código MHD4 con una eficiencia de detección de ~80-90 %.

En las mediciones de MERFISH, se marcaron los ARN con dos conjuntos de sondas. En la primera etapa, se hibridó cada ARN celular con un conjunto complejo de sondas de oligonucleótidos denominadas “sondas codificantes”, que contenían secuencias de selección como diana que se unen a ARN celulares y secuencias de lectura que determinan los códigos de barras de estos ARN. En una segunda etapa, se detectaron las secuencias de lectura, y por tanto los códigos de barras, mediante una serie de mediciones de smFISH, cada ronda con una o más sondas de lectura complementarias a una o más secuencias de lectura. Se llevaron a cabo mediciones de MERFISH en células U-2OS usando métodos de aclaramiento basados en impresión de matriz. Véase la publicación de solicitud de patente estadounidense n.º 62/419.033, titulada “Matrix Imprinting and Clearing”. En resumen, se fijaron las células, se permeabilizaron, se marcaron con sondas codificantes para las 129 especies de ARN así como sondas de poli-dT modificadas con acridita que seleccionan como diana ARN poliadenilados (poliA). Se incorporaron las células en un gel de polímero y se retiraron proteínas y lípidos celulares mediante digestión con proteinasa K y extracción con detergente, mientras que se anclaron los ARN poliA al gel mediante las sondas de poli-dT. Tras el aclaramiento, se llevaron a cabo ocho rondas de mediciones de smFISH en dos colores, cada una con dos sondas de lectura, para leer los códigos de barras de 16 bits en los ARN, se usó escisión química para retirar los fluoróforos que se unieron a las sondas de lectura entre rondas consecutivas de obtención de imágenes por smFISH. Dado que la altura de las células era mayor que el grosor de una sección óptica individual, se obtuvieron imágenes de la muestra con múltiples secciones z para garantizar que se detectaba >90 % de las moléculas de ARN dentro de las células.

A diferencia de mediciones de MERFISH anteriores con bibliotecas de ARN de abundancia inferior, debido a la alta densidad molecular asociada con esta biblioteca de ARN con una abundancia 14 veces superior, una fracción sustancial de señales de smFISH están superpuestas en el espacio en cada ronda de obtención de imágenes (figura 1A, B). Como resultado, sólo podía decodificarse una pequeña fracción de las moléculas de ARN (figura 1C). La comparación con secuenciación de ARN a granel muestra que el número de copias promedio por célula detectado para estos ARN mediante MERFISH se correlacionaba con la abundancia de ARN medida mediante secuenciación de ARN con un coeficiente de correlación de Pearson de 0,6 entre los valores de log10(figura 1D). Para determinar la eficiencia de detección, se compararon los resultados de MERFISH con las mediciones de smFISH para 12 genes en esta biblioteca, también llevadas a cabo usando el método de aclaramiento basado en impresión de matriz. Esta comparación mostró que los números de copias por célula determinados mediante MERFISH sólo eran del 21 % /-4 % (promedio /- EEM) o el 16 % (mediana) de los determinados mediante smFISH (figura 1E).

La figura 1 muestra medidas mediante MERFISH de una biblioteca de ARN de alta abundancia en muestras de U-2OS sin expandir. Se aclararon las muestras usando el método de aclaramiento basado en impresión de matriz tal como se describió anteriormente. La figura 1A muestra una imagen de medida de MERFISH en una muestra de U-2OS no expandida teñida con sondas codificantes para 129 ARN y visualizada con una sonda de lectura marcada con Cy5 en un plano focal de la exploración z. Las líneas continuas marcan el borde de una célula y las líneas discontinuas marcan la región teñida con DAPI de un núcleo. La figura 1B muestra imágenes de fluorescencia sometidas a filtro de paso alto de las 8 rondas de obtención de imágenes por smFISH en dos colores para la subregión encuadrada (figura 1A). Diferentes sombreados representan el canal de Cy5 (verde) y el canal de Alexa 750 (rojo), respectivamente. La figura 1C muestra las ubicaciones de todos los ARN decodificados en la figura 1A basándose en sus códigos de barras binarios medidos. El recuadro insertado muestra las ubicaciones de todos los ARN decodificados de la región mostrada en la figura 1B. Se presentan los ARN decodificados a lo largo de todas las secciones ópticas. Las líneas continuas marcan el borde de una célula y las líneas discontinuas marcan la región teñida con DAPI de un núcleo. La figura 1D muestra los números de copias de ARN promedio por célula para las 129 especies de ARN determinados mediante MERFISH frente a las abundancias tal como se determinan mediante secuenciación de ARN. El coeficiente de correlación de Pearson entre los valores de log10(ρ10) es de 0,6. La figura 1E muestra los números de copias de ARN promedio por célula determinados mediante MERFISH frente a los determinados mediante mediciones de smFISH para 12 de los 129 ARN. Se realizó una exploración z de 5 micrómetros de profundidad para cada conjunto de datos para garantizar que se incluía al menos el 90 % de las moléculas de ARN en la profundidad sometida a obtención de imágenes. El coeficiente de correlación de Pearson entre los valores de log10(ρ10) es de 0,75. La razón media de los valores de número de copias determinados mediante MERFISH con respecto a los determinados mediante smFISH es del 21 % /- 4 % (EEM,n= 12 especies de ARN) y la mediana es del 16 %.

EJEMPLO 3

Mediciones de MERFISH de alta densidad de ARN con microscopía de expansión. Se cree que la eficiencia de detección de MERFISH reducida puede deberse, en parte, a señales de moléculas individuales superpuestas. Este problema puede superarse, tal como se muestra en este ejemplo, mediante métodos de obtención de imágenes de superresolución, o bien mediante medios ópticos o bien mediante expansión de muestra. Este ejemplo ilustra la expansión de muestra con moléculas ancladas en una única ubicación y microscopía de expansión (ExM) para aumentar la distancia entre moléculas y mejorar sustancialmente la capacidad parar moléculas cercanas.

En este ejemplo, se fijaron células y se permeabilizaron, y se marcaron con sondas codificantes y sondas de anclaje de poli-dT tal como se describió anteriormente. Después, se incorporaron las células en un gel de polímero expandible. Después de eso, se digirieron las células mediante proteinasa K para retirar proteínas y homogenizar las propiedades mecánicas del gel. Después se expandió el gel en tampón de bajo contenido en sal y finalmente se incorporó de nuevo en un gel no expandible para estabilizarlo en el estado expandido (figura 2A). Se ancló el ARN al gel en su cola de poli(A), lo cual crea un contacto de punto individual entre moléculas de ARN individuales y el gel y evita el estiramiento del ARNm durante el procedimiento de expansión. Esto debe facilitar la separación de las moléculas cercanas. Se tiñeron sondas codificantes de MERFISH antes de incorporar muestras en un gel dado que se encontró que las sondas de MERFISH no penetraban de manera fiablemente correcta después de incorporarse las muestras dos veces, al menos en algunas realizaciones. Se usó un tampón de bajo contenido en sal (0,5x solución salina-citrato de sodio (SSC)) en lugar de agua para diálisis para conservar la unión específica de sondas durante la expansión, lo cual dio como resultado un factor de expansión inferior. Las mediciones del volumen de gel mostraron que la diálisis en 0,5x solución salina-citrato de sodio (SSC) produjo una expansión de volumen de 12 veces. Se observó que, mientras la expansión fuera suficiente para separar moléculas de ARN contiguas, un factor de expansión inferior tenía la ventaja de permitir una obtención de imágenes más rápida, en determinadas aplicaciones.

De manera notable, en las muestras expandidas en estos experimentos, moléculas de ARN individuales se resolvieron bien (figura 2B, C) y se decodificaron satisfactoriamente (figura 2D). El número de copias promedio por célula detectado para estos ARN mediante MERFISH se correlacionó con la abundancia de ARN medida mediante secuenciación de ARN con un coeficiente de correlación de Pearson de 0,83 entre los valores de log10(figura 2E).

Para cuantificar la mejora sobre el rendimiento de decodificación con expansión, se compararon las cuentas de MERFISH promedio por cada especie de ARN por célula entre muestras expandidas y no expandidas. Se encontró que los números de copias por célula para las 129 especies de ARN detectados en muestras expandidas se correlacionaban fuertemente con aquellos en las muestras no expandidas con un alto coeficiente de correlación de Pearson de 0,88 entre los valores de log10(figura 2F). Sin embargo, los números de copias por célula detectados en muestras expandidas eran 7,5 /- 0,3 veces (promedio /-EEM) o 6,6 veces (mediana) superiores a los detectados en muestras no expandidas para esas 129 especies de ARN, indicando que la eficiencia de detección para la muestra expandida era sustancialmente superior en comparación con la muestra no expandida para esta biblioteca de alta abundancia. Los resultados de número de copias por célula eran altamente reproducibles entre repeticiones de experimentos (figura 2G). La comparación con medidas de smFISH mostró que los números de copias por célula determinados mediante MERFISH eran el 105 % /- 9 % (promedio /- EEM) o el 111 % (mediana) de los determinados mediante smFISH (figura 2H), indicando que la eficiencia de detección tras la expansión era próxima al 100 %.

La figura 2 muestra medidas mediante MERFISH de una biblioteca de ARN de alta abundancia en células U-2OS expandidas. La figura 2A muestra una representación esquemática de la implementación básica de MERFISH de expansión. Se tiñeron conjuntamente ARN diana con sondas de anclaje de poli-dT modificadas con acridita y sondas codificantes de MERFISH, y después se anclaron a un gel de polímero expandible mediante las sondas de poli-dT. Después de eso, se incubaron muestras en tampón de digestión con proteinasa K y SDS para la retirada de proteínas y lípidos, respectivamente, para homogenizar las propiedades mecánicas del gel. Finalmente, después se expandió el gel mediante diálisis en tampón de bajo contenido en sal y se incorporó de nuevo el gel expandido en gel de poliacrilamida para estabilizarlo en el estado expandido. La figura 2B muestra una imagen de medida de MERFISH en una muestra de U-2OS teñida con sondas codificantes para 129 ARN, incorporada, aclarada, expandida, incorporada de nuevo y visualizada con una sonda de lectura marcada con Cy5 en un plano focal de la exploración z. Las líneas continuas marcan el borde de una célula y las líneas discontinuas marcan la región teñida con DAPI de un núcleo. La figura 2C muestra imágenes de fluorescencia sometidas a filtro de paso alto de las 8 rondas de obtención de imágenes por smFISH en dos colores para la subregión encuadrada en la figura 2B. El sombreado representa el canal de Cy5 (verde) y el canal de Alexa 750 (rojo). La figura 2D muestra las ubicaciones de todos los ARN decodificados en la figura 2B coloreados según sus códigos de barras binarios medidos. El recuadro insertado muestra las ubicaciones de todos los ARN decodificados a partir de la región mostrada en la figura 2C. Se visualizan ARN decodificados a lo largo de todas las secciones ópticas. Las líneas continuas marcan el borde de una célula y las líneas discontinuas marcan la región teñida con DAPI de un núcleo. La figura 2E muestra los números de copias de ARN promedio por célula para las 129 especies de ARN determinados mediante MERFISH frente a las abundancias tal como se determinan mediante secuenciación de ARN. El coeficiente de correlación de Pearson entre los valores de log10(ρ10) es de 0,83. La figura 2F muestra los números de copias de ARN promedio por célula para las 129 especies de ARN determinados mediante MERFISH de expansión frente a los determinados mediante MERFISH en muestras no expandidas. Se realizó una exploración z de 12 micrómetros de profundidad para mediciones mediante MERFISH de expansión y se realizó una exploración z de 5 micrómetros de profundidad para muestras no expandidas para garantizar que se incluía al menos el 90 % de las moléculas de ARN en la profundidad sometida a obtención de imágenes. El coeficiente de correlación de Pearson entre los valores de log10(ρ10) es de 0,88. Los números de copias por célula detectados en muestras expandidas eran 7,5 /- 0,3 veces (promedio /- EEM) o 6,6 veces (mediana) los detectados en muestras no expandidas para esas 129 especies de ARN. La figura 2G muestra los números de copias de ARN promedio por célula para las 129 especies de ARN detectados en una muestra expandida frente a una segunda. El coeficiente de correlación de Pearson entre los valores de log10(ρ10) es de 0,94. La figura 2H muestra los números de copias de ARN promedio por célula determinados mediante MERFISH de expansión frente a los determinados mediante mediciones de smFISH de muestras aclaradas y no expandidas para 12 de los 129 ARN. Se realizaron mediciones de smFISH para la muestra no expandida pero aclarada tal como se muestra en la figura 1. El coeficiente de correlación de Pearson entre los valores de log10(ρ10) es de 0,96. La razón media entre resultados de MERFISH y de smFISH fue del 105 % /- 9 % (EEM,n= 12 especies de ARN) y la mediana de la razón del 111 %.

EJEMPLO 4

Incorporación de obtención de imágenes por inmunofluorescencia en experimentos de MERFISH de muestras expandidas. Una célula es un sistema altamente complejo compuesto por diferentes estructuras y compartimentos y la inmunofluorescencia es una técnica potente para visualizar estructuras y compartimentos subcelulares específicos. Por tanto, este ejemplo sometió a prueba si era posible la combinación de obtención de imágenes por inmunofluorescencia y MERFISH en las muestras expandidas. Se ha demostrado la microscopía de expansión en muestras inmunoteñidas, usando anticuerpos conjugados con oligonucleótidos y sondas complementarias con un grupo metacriloílo para incorporar señales en el gel. Entonces, estos oligonucleótidos marcan las posiciones de la diana de proteína y pueden detectarse mediante hibridación de oligonucleótidos complementarios marcados con fluoróforo, que se incorporaron en las mediciones de lectura de MERFISH. En el procedimiento experimental, se realizó inmunotinción de las dianas de proteína con anticuerpos marcados con oligonucleótidos (secundarios) tras la hibridación de las células con las sondas codificantes de MERFISH y sondas de anclaje de ARN, y después se incorporó la muestra marcada en un gel expandible. Se añadió modificación con acridita al oligonucleótido en los anticuerpos de modo que podía incorporarse en el gel de polímero durante la etapa de incorporación. Tras la digestión, expansión de gel y segunda incorporación en un gel no expandible tal como se describió anteriormente, se realizó el procedimiento de lectura de MERFISH para detectar en primer lugar las secuencias de lectura en las sondas codificantes de ARN y después con una ronda adicional de detección de FISH para leer las secuencias de oligonucleótidos que representan la diana de proteína.

Para este ejemplo, se inmunotiñó cadherina células U-2OS cultivadas, que se tiñeron con la misma biblioteca de MERFISH de alta abundancia descrita anteriormente. Se observó tanto la tinción específica de cadherina en la periferia celular (figura 3A) como los puntos de smFISH resueltos con claridad en las mismas células (figura 3B-D) La combinación con inmunofluorescencia no afectó a la calidad de obtención de imágenes por MERFISH (figuras 3E y 3F). Se observó la misma correlación alta de resultados de MERFISH y los resultados de secuenciación de ARN con un coeficiente de correlación de Pearson de 0,83 entre los valores de log10(figura 3E). Los números de copias promedio por cada especie de ARN por célula detectados en muestras inmunoteñidas se correlacionaron fuertemente con aquellos en muestras detectadas no sometidas a inmunotinción, con un coeficiente de correlación de Pearson de 0,95 entre los valores de log10(figura 3F). En promedio, la razón de números de copias por cada especie de ARN por célula entre muestras inmunoteñidas y no inmunoteñidas es del 99 % /- 3 % (EEM), lo que indica una alteración despreciable en el rendimiento de MERFISH en combinación con inmunofluorescencia. La tinción de cadherina en muestras expandidas y marcadas de MERFISH también tuvo un aspecto similar a la tinción de cadherina en muestras de U-2OS de control inmunoteñidas directamente tras la fijación sin obtención de imágenes por MERFISH del ARN (figura 3G). Para cuantificar si la tinción con anticuerpo se veía afectada por los procedimientos de MERFISH de marcaje de ARN, incorporación en gel, digestión y expansión, se comparó la intensidad de cadherina por unidad de longitud en la periferia celular (normalizado con respecto a la longitud real antes de la expansión) en muestras de MERFISH de expansión frente a muestras de control, con resultados comparables (figura 3H).

La figura 3 muestra la incorporación de obtención de imágenes por inmunofluorescencia en medidas mediante MERFISH de muestras expandidas. La figura 3A muestra una imagen de una muestra de U-2OS expandida teñida con sondas codificantes de MERFISH, anticuerpos primarios frente a cadherina, anticuerpos secundarios conjugados con oligonucleótidos y una sonda complementaria conjugada con Cy5. La figura 3B muestra una imagen de smFISH de medida de MERFISH para la subregión encuadrada en la figura 3A, visualizada con una sonda de lectura marcada con Cy5 en un plano focal de la exploración z. La figura 3C muestra imágenes de fluorescencia sometidas a filtro de paso alto de las 8 rondas de obtención de imágenes por smFISH en dos colores para la subregión encuadrada en la figura 3B. El sombreado representa el canal de Cy5 (verde) y el canal de Alexa 750 (rojo). La figura 3D muestra las ubicaciones de todos los ARN decodificados en la figura 3B coloreados según sus códigos de barras binarios medidos. El recuadro insertado muestra las ubicaciones de todos los ARN decodificados de la región mostrada en la figura 3C. Se visualizan ARN decodificados a lo largo de todas las secciones ópticas. La figura 3E muestra los números de copias de ARN promedio por célula para las 129 especies de ARN determinados mediante MERFISH frente a las abundancias tal como se determinan mediante secuenciación de ARN. El coeficiente de correlación de Pearson entre los valores de log10(ρ10) fue de 0,83. La figura 3F muestra los números de copias de ARN promedio por célula para las 129 especies de ARN determinados mediante MERFISH de expansión en muestras inmunoteñidas frente a aquellos en muestras sólo de MERFISH. Se realizó una exploración z de 12 micrómetro de profundidad para ambos casos. El coeficiente de correlación de Pearson entre los valores de log10(ρ10) fue de 0,95. La razón media entre los números de copias de ARN determinados en los dos experimentos fue del 99 % /- 3 % (EEM,n= 129 especies de ARN) y la mediana de la razón del 94 %. La figura 3G muestra una imagen de células U-2OS cultivadas no expandidas teñidas con anticuerpos primarios frente a cadherina, anticuerpos secundarios conjugados con oligonucleótidos y una sonda complementaria conjugada con Cy5 justo después de la fijación y permeabilización. La figura 3H muestra la intensidad de cadherina por unidad de longitud (normalizada con respecto a la longitud real antes de la expansión) en muestras de MERFISH expandida y de control. Se combinaron las intensidades a lo largo de apilamientos de exploración z tras la eliminación del fondo.

EJEMPLO 5

Estos ejemplos han demostrado un enfoque para combinar MERFISH y microscopía de expansión para medir bibliotecas de ARN de alta abundancia. Se mostró que, cuando la densidad de ARN total es alta, la superposición entre señales a partir de moléculas de ARN cercanas reducía la eficiencia de detección de MERFISH y que la expansión de muestra podía superar este problema de superposición y aumentar sustancialmente la eficiencia de detección, recuperando una eficiencia de detección de MERFISH de cerca del 100 % para estas bibliotecas de ARN de alta abundancia.

Cada célula de mamífero tiene decenas de miles de especies de ARN diferentes. Puede usarse obtención de imágenes por MERFISH para determinar miles de especies de ARN en células individuales. Para aumentar el número de especies de ARN de las que pueden obtenerse imágenes de manera simultánea en células individuales mientras se mantiene un número similar de rondas de obtención de imágenes, puede aumentarse la densidad de ARN de los que se obtienen imágenes por ronda y probablemente puede llegar a ser un factor limitante importante en el número de ARN de los que pueden obtenerse imágenes. El enfoque de MERFISH de expansión puede facilitar un aumento sustancial del número de especies de ARN que pueden medirse en células individuales.

En estos ejemplos, se demostró la combinación de MERFISH con inmunofluorescencia en estas muestras expandidas, lo cual puede proporcionar información importante sobre el contexto celular para análisis de transcriptoma. En inmunofluorescencia convencional con anticuerpos conjugados con fluoróforo, el número de fluoróforos espectralmente distintos limita el número de dianas que pueden estudiarse de manera simultánea. El uso de anticuerpos conjugados con oligonucleótidos permite posiblemente visualizar muchas proteínas en rondas secuenciales de hibridación y obtención de imágenes usando tan solo uno o unos pocos fluoróforos espectralmente distintos. Por tanto, la combinación de obtención de imágenes por MERFISH e inmunofluorescencia puede permitir una medición proteómica y transcriptómica combinada de manera simultánea en células individuales.

EJEMPLO 6

Este ejemplo describe diversos materiales y métodos usados en algunos de los ejemplos anteriores.

Diseño de sondas codificantes. Las sondas codificantes de MERFISH se diseñaron usando un código de distancia de Hamming 4, de ponderación de Hamming 4, de 16 bits con 140 códigos de barras posibles. En este esquema de codificación, todos los códigos de barras usados estaban separados por una distancia de Hamming de al menos 4, y, por tanto, deben leerse al menos cuatro bits de manera incorrecta para cambiar un código de barras válido por otro. Se usa una ponderación de Hamming constante (es decir, el número de bits “1” en cada código de barras) de 4 para evitar un posible sesgo de medición debido a una tasa diferencial de errores de “1” a “0” y de “0” a “1”. El conjunto de sondas codificantes contenía 92 sondas codificantes por cada ARN. Cada sonda codificante comprendía una región diana de 30 nt diseñada usando una canalización, flanqueada por dos secuencias de lectura de 20 nt seleccionadas aleatoriamente de las cuatro asignadas a cada ARN, una región de cebado de 20 nt en el extremo 5’ y otra región de cebado de 20 nt usando el complemento inverso del promotor de T7 en el extremo 3’. Se añadieron espaciadores de nucleótidos de adenosina adicionales entre secuencias de lectura y regiones diana para evitar tripletes de guanina terminales en las secuencias de lectura y para evitar que las regiones diana se combinaran con G de secuencias adyacentes para formar cuadrupletes de G. La región de cebado en el extremo 5’ tenía una timina en el extremo, que se puso en la unión de las regiones de cebado en el extremo 5’ y la región codificante. Esto se diseñó para incorporar un uracilo en el cebador directo usado en la etapa de transcripción inversa de la construcción de sonda, que puede escindirse mediante enzima de reactivo de escisión específico de uracilo (USER). El diseño de cebador escindible junto con el uso de complemento inverso del promotor de T7 como segundo cebador permitió la construcción de sondas codificantes con una longitud de 72 nt. La reducción de la longitud de sonda puede facilitar la penetración de sondas y reducir la unión no específica.

Para incluir algunos ARN abundantes pero cortos en la presente biblioteca, en lugar de diseñar sondas que seleccionaban como diana regiones distintas de los ARN, se permitió que las sondas compartieran hasta 20 nt con otra sonda. Esta modificación ayudó a aumentar el número de sondas que podían diseñarse para cada gen en 2 veces. Se seleccionaron aleatoriamente 92 regiones diana por cada ARN de todas las posibles regiones diana de un ARN. Permitiendo una superposición de hasta 20 nt entre sondas codificantes contiguas, este diseño permitió seleccionar como diana ARN tan cortos como de 1.200 nt mediante 92 sondas codificantes con una secuencia de selección como diana de 30 nt. Dado que un ARN celular dado se une normalmente a menos de una tercera parte de las 92 sondas codificantes, se esperaba que las sondas codificantes con regiones de selección como diana superpuestas no interfirieran sustancialmente entre sí, pero compensaría parcialmente la unión reducida debido a regiones locales inaccesibles en el ARN diana (por ejemplo, estructura secundaria) o pérdida de durante la síntesis.

Construcción de las sondas codificantes. Se construyó el conjunto de sondas codificantes a partir de combinaciones de oligonucleótidos complejas. En resumen, se amplificaron las combinaciones de oligonucleótidos (CustomArray) mediante PCR de ciclos limitados para producir moldes de transcripciónin vitro, se convirtieron estos moldes en ARN mediante transcripciónin vitro(New England Biolabs) y se convirtió el ARN de nuevo en ADN mediante transcripción inversa (Maxima RT H, Thermo Fisher Scientific). Después se digirieron las sondas mediante enzima USER (New England Biolabs) a una dilución de 1:30 (v/v) incubada a 37 ºC durante 24 h para escindir la región de cebado en el sitio de un uracilo entre regiones de cebado en el extremo 5’ y la región diana. Después de eso, se purificó el ADN mediante hidrólisis alcalina para retirar ARN y purificación en columna (Zymo Research). Se resuspendieron las sondas finales en agua libre de ARNasa y se almacenaron a -20 ºC.

Conjugación de oligonucleótidos a anticuerpos secundarios. Se conjugaron oligonucleótidos que contenían las sondas de lectura deseadas a anticuerpos secundarios mediante una combinación de químicas de éster de NHS y de clic libe de cobre. En primer lugar, se marcaron anticuerpos secundarios con un agente de reticulación de clic libre de cobre usando química de éster de NHS. Específicamente, se retiró conservante de azida a partir de los anticuerpos secundarios de burro anti-conejo sin conjugar (Thermoscientific) usando una membrana de diálisis basada en columna de centrifugación (Amicon, punto de corte de peso molecular de 100 kDa) según las instrucciones del fabricante. Se diluyó el agente de reticulación de éster de NHS, PEG5, DBCO (Kerafast) hasta una concentración de 10 micromolar en DMSO anhidro (Thermoscientific). Después se combinaron 2 microlitros de este agente de reticulación con 100 microlitros de 2 mg/ml del anticuerpo en 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS). Se incubó esta reacción a temperatura ambiente durante 1 hora y después se terminó mediante una segunda ronda de purificación usando las columnas de Amicon tal como se describió anteriormente. Se determinó el número promedio de agentes de reticulación de DBCO por cada anticuerpo mediante la absorción relativa de la muestra a 280 nm (anticuerpo) y 309 nm (DBCO). En promedio, las cantidades de agente de reticulación descritas anteriormente produjeron ~7 agentes de reticulación DBCO por cada anticuerpo.

Se pidieron de IDT sondas de oligonucleótidos que contenían la secuencia deseada así como una acridita en 5’, para permitir la reticulación con el gel de polímero, y una azida en 3’, para permitir la reticulación con los anticuerpos marcados con DBCO, y se suspendieron hasta 100 micromolar en 1x PBS. Después se añadieron 20 microlitros del oligonucleótido apropiado a 100 microlitros de los anticuerpos marcados con DBCO a una concentración final de ~2 mg/ml. Se incubó esta reacción a 4 ºC durante al menos 12 horas. Los anticuerpos marcados no se purificaron adicionalmente ya que se espera que los oligonucleótidos residuales, no conjugados a anticuerpos, se eliminen fácilmente mediante lavado a partir de las muestras.

Cultivo celular y fijación. Se cultivaron células U-2OS (ATCC) con medio esencial mínimo de Eagle (ATCC) que contenía FBS al 10 % (v/v) (Thermo Fisher Scientific). Se sembraron las células en cubreobjetos n.º 1,5, de 40 mm de diámetro (Bioptechs) a 350.000 células por cubreobjetos y se incubaron en placas Petri a 37 ºC con CO2al 5 % durante 48 h. Se fijaron las células, se permeabilizaron y se tiñeron con sondas codificantes. En resumen, se fijaron las células durante 15 min en paraformaldehído al 4 % (v/v) (Electron Microscopy Sciences) en 1x PBS a temperatura ambiente, se lavaron tres veces con 1x PBS, se permeabilizaron durante 10 min con Triton X-100 al 0,5 % (v/v) (Sigma) en 1x PBS a temperatura ambiente y se lavaron una vez con 1x PBS.

Tinción con sonda codificante para medición de MERFISH. Se incubaron células permeabilizadas durante 5 min en tampón de lavado de codificación que comprendía 2x solución salina-citrato de sodio (SSC) (Ambion) y formamida al 30 % (v/v) (Ambion). Después se añadieron 30 microlitros de sondas codificantes ~300 micromolar y sonda de anclaje 3,3 micromolar (una secuencia de 20 nt de dT y ácido nucleico bloqueado con timidina (dT+) alternantes con un complemento inverso de 20 nt de una secuencia de lectura y una modificación con acridita en 5’ (Integrated DNA Technologies)) en tampón de hibridación codificante a la superficie de Parafilm (Bemis) y se cubrió con un cubreobjetos que contenía células. Después se incubaron muestras en una cámara húmeda dentro de un horno de hibridación a 37 ºC durante 40 h. El tampón de hibridación de codificación estaba compuesto por tampón de lavado de codificación complementado con ARNt de levadura al 0,1 % (p/v) (Life Technologies), inhibidor de ARNasa murina al 1 % (v/v) (New England Biolabs) y sulfato de dextrano al 10 % (p/v) (Sigma). Después se lavaron células con tampón de lavado de codificación y se incubaron a 47 ºC durante 30 min; esta etapa de lavado se repitió una vez.

Inmunotinción. Tras teñirse con sondas codificantes y de anclaje, se fijaron posteriormente las muestras con paraformaldehído al 4 % (v/v) (Electron Microscopy Sciences) a temperatura ambiente durante 10 min. Después se bloquearon las muestras a temperatura ambiente durante 30 min en tampón de bloqueo con BSA ultrapura al 4 % (p/v) (Thermo Fisher Scientific) en 2x SSC (Ambion) complementado con inhibidores de ribonucleasa RNasin al 3 % (v/v) (Promega), inhibidores de ARNasa murina al 6 % (v/v) (New England Biolabs) y ARNt de levadura 1 mg/ml (Life Technologies). Se incubaron las muestras con anticuerpos primarios (anti-pan cadherina, Abcam) en tampón de bloqueo a una concentración de 2 microgramos/ml durante 1 h a temperatura ambiente, y se lavaron tres veces con 2x SSC durante 10 min cada vez. Después se incubaron las muestras con anticuerpos secundarios marcados con oligonucleótidos en tampón de bloqueo a una concentración de 3,75 microgramos/ml durante 1 h a temperatura ambiente, después se lavaron con 2x SSC tres veces durante 10 min cada vez. Se fijaron las muestras de nuevo con paraformaldehído al 4 % (v/v) (Electron Microscopy Sciences) durante 10 min.

Incorporación, digestión y aclaramiento para muestras no expandidas. En primer lugar se incubaron muestras teñidas sobre cubreobjetos durante 5 min con una disolución de poliacrilamida desgasificada con el 4 % (v/v) de acrilamida/bis-acrilamida 19:1 (BioRad), Tris·HCl 60 mM pH 8 (ThermoFisher), NaCl 0,3 M (ThermoFisher), tetrametiletilendiamina al 0,2 % (v/v) (TEMED) y una dilución 1:25.000 de perlas fluorescentes naranjas modificadas con carboxilato de 0,1 micrómetros de diámetro (Life Technologies). Las perlas sirvieron como marcadores de referencia para la alineación de imágenes tomadas a lo largo de múltiples rondas de obtención de imágenes por smFISH.

Para colar una película de poliacrilamida delgada, para cada muestra, se añadieron 50 microlitros de la disolución final a la superficie de una placa de vidrio (TED Pella) que se había tratado previamente durante 5 min con 1 ml de GelSlick (Lonza) para no adherirse al gel de poliacrilamida. Se aspiraron muestras sobre cubreobjetos, tratadas tal como se describió anteriormente, y se les dio la vuelta suavemente sobre esta gotita de 50 microlitros para formar una capa delgada de disolución entre el cubreobjetos y la placa de vidrio. Después se dejó polimerizar la disolución durante 2 h a temperatura ambiente en una cámara interna llena con nitrógeno. Después se separaron suavemente el cubreobjetos y la placa de vidrio y se lavó la película de PA una vez con un tampón de digestión con SDS al 2 % (p/v) (Thermo Fisher Scientific), Triton X-100 al 0,5 % (v/v) en 2x SSC (Ambion). El tampón de digestión usó SDS al 2 % (p/v) para facilitar la retirada de lípidos. Tras el lavado, se cubrió el gel con tampón de digestión complementado con proteinasa K al 1 % (v/v) (New England Biolabs). Se digirió la muestra en este tampón durante >12 h en un incubador humidificado a 37 ºC y después se lavó tres veces con 2x SSC. O bien se realizaron mediciones de MERFISH inmediatamente o bien se almacenó la muestra en 2x SSC complementado con inhibidor de ARNasa murina al 0,1 % (v/v) (New England Biolabs) a 4 ºC durante no más de 48 h.

Silanización de cubreobjetos para muestras no expandidas. Se lavaron cubreobjetos n.º 1,5 de 40 mm de diámetro (Bioptechs) durante 30 min mediante inmersión en una mezcla 1:1 de HCl al 37 % (v/v) y metanol a temperatura ambiente. Después se aclararon los cubreobjetos tres veces en agua desionizada y una vez en etanol al 70 % (v/v). Se secaron los cubreobjetos mediante soplado con gas nitrógeno y después se sumergieron en trietilamina al 0,1 % (v/v) (Millipore) y aliltriclorosilano al 0,2 % (v/v) (Sigma) en cloroformo durante 30 min a temperatura ambiente. Se lavaron los cubreobjetos una vez con cada uno de cloroformo y etanol y después se secaron mediante soplado con gas nitrógeno. Después se almacenaron cubreobjetos silanizados a temperatura ambiente en una cámara desecada durante la noche antes de su uso, para deshidratar la capa de silano.

Incorporación, digestión y aclaramiento para muestras expandidas. Se preparó la disolución de monómero que contenía NaCl 2 M (Thermo Fisher Scientific), acrilato de sodio al 7,7 % (p/p) (Sigma), el 4 % (v/v) de acrilamida/bisacrilamida 19:1 (BioRad) y Tris HCl 60 mM pH 8 (Thermo Fisher Scientific), se congeló en alícuotas a -20 ºC y se descongeló antes de su uso. Se desgasificó la disolución de monómero y se enfrió hasta 4 ºC antes de su uso. Se añadió TEMED con una concentración final del 0,2 % (v/v) y una dilución 1:5.000 de perlas fluorescentes naranjas modificadas con carboxilato de 0,1 micrómetros de diámetro (Life Technologies) a la disolución. Las perlas sirvieron como marcadores de referencia para la alineación de imágenes tomadas a lo largo de múltiples rondas de obtención de imágenes por smFISH. Se incubaron muestras teñidas en la disolución durante 5 min a temperatura ambiente. Entonces se mantuvo la disolución en hielo y se complementó adicionalmente con persulfato de amonio (Sigma) a una concentración final del 0,2 % (p/v).

Para colar una película de polímero delgada, para cada muestra, se añadieron 50 microlitros de la disolución final a la superficie de una placa de vidrio (TED Pella) que se había tratado previamente durante 5 min con 1 ml de GelSlick (Lonza) para no adherirse al gel. Se aspiraron las muestras sobre cubreobjetos, tratadas tal como se describió anteriormente, y se les dio la vuelta suavemente sobre esta gotita de 50 mitrolitros p ara formar una capa delgada de disolución entre el cubreobjetos y la placa de vidrio. Después se dejó polimerizar la disolución durante 2 h a temperatura ambiente en una cámara interna llena con nitrógeno. Después se separaron suavemente el cubreobjetos y la placa de vidrio y se lavó el gel una vez con un tampón de digestión con SDS al 2 % (p/v) (Thermo Fisher Scientific), Triton X-100 al 0,5 % (v/v) en 2x SSC (Ambion) tal como se describió anteriormente. Después del lavado, se recortó cuidadosamente la película delgada del gel a los tamaños deseados usando una cuchilla y se cubrió con tampón de digestión complementado con proteinasa K al 1 % (v/v) (New England Biolabs). Se digirió la muestra en este tampón durante >12 h en un incubador humidificado a 37 ºC y después se lavó con 2x SSC (Ambion) tres veces. El gel se expandió ~1,5 veces durante la digestión.

Expansión y nueva incorporación. Tras la digestión, se expandieron las muestras en 0,5x tampón de SSC complementado con proteinasa K al 0,2 % (v/v) (New England Biolabs) a temperatura ambiente. Se añadió proteinasa K para mantener muestras en un entorno libre de ARNasa. Se cambió el tampón cada 30 min hasta que las muestras ya no se expandían (normalmente durante aproximadamente 2 h). Volvieron a incorporarse los geles expandidos en gel de poliacrilamida para estabilizar el gel para rondas secuenciales de hibridación de sondas de lectura y obtención de imágenes. En resumen, se incubaron muestras en disolución de nueva incorporación compuesta por el 4 % (v/v) de acrilamida/bis-acrilamida 19:1 (BioRad) con NaCl 30 mM (Thermo Fisher Scientific), Tris HCl 6 mM pH 8 (Thermo Fisher Scientific) y el 0,2 % (v/v) de TEMED (Sigma) durante 20 min a temperatura ambiente en un balancín. Después se mantuvo la disolución de nueva incorporación en hielo y se complementó adicionalmente con persulfato de amonio (Sigma) a una concentración final del 0,2 % (p/v). Se colocaron los geles sobre un cubreobjetos tratado con silano de unión (véase a continuación), se aclararon con la disolución y se secaron rápidamente con toallitas KimWipes (Kimtech). Se pusieron los cubreobjetos con geles en una cámara de nitrógeno interna, se cubrieron con una placa de vidrio (TED Pella) y se dejaron polimerizar a temperatura ambiente durante 1 h.

Tratamiento con silano de unión de cubreobjetos. Se sometieron cubreobjetos n.º 1,5 de 40 mm de diámetro (Bioptechs) a sonicación en hidróxido de potasio 1 M durante 30 min, se lavaron tres veces con agua desionizada y se sometieron de nuevo a sonicación en etanol al 70 % (v/v) durante 30 min. Después se sumergieron los cubreobjetos en ácido acético glacial al 5 % (v/v) y silano de unión al 0,38 % (v/v) (GE Healthcare) en etanol al 99 % (v/v) durante 1 h a temperatura ambiente. Tras lavarse rápidamente con etanol al 70 % (v/v) tres veces, se pusieron los cubreobjetos en un horno a 60 ºC hasta que se secaron completamente. Pueden almacenarse los cubreobjetos en recipientes sellados con desecantes durante hasta un mes.

Rondas secuenciales de tinción de sonda de lectura y obtención de imágenes. Para ayudar a elegir el plano focal correcto para la obtención de imágenes, se hibridaron muestras incorporadas en placas con el primer par de sondas de lectura en dos colores en tampón de hibridación compuesto por 2x SSC (Ambion), carbonato de etileno al 5 % (v/v) (Sigma), inhibidor de ARNasa murina al 0,1 % (v/v) en agua libre de nucleasa y 3 nM de las sondas de lectura apropiadas, durante 30 min (muestras expandidas) o 10 min (muestras no expandidas) a temperatura ambiente y se lavaron durante 20 min (muestras expandidas) o 7 min (muestras no expandidas) en tampón de lavado compuesto por 2x SSC (Ambion) y carbonato de etileno al 10 % (v/v) (Sigma) en agua libre de nucleasa. Después se lavaron las muestras con 2x SSC una vez, se tiñeron con DAPI a 10 microgramos/microlitro en 2x SSC (Ambion) durante 10 min y se lavaron 3 veces en 2x SSC (Ambion) durante 5 min cada vez.

Se montaron las muestras en una cámara de flujo y se controló el intercambio de tampón a través de esta cámara para realizar el seguimiento de obtención de imágenes e hibridación mediante un sistema de fluidos interno compuesto por tres válvulas de ocho vías controladas por ordenador (Hamilton) y una bomba peristáltica controlada por ordenador (Gilson), con tiempo de flujo e incubación prolongado para muestras expandidas (además del tiempo de hibridación y lavado tal como se describió en la sección anterior. Se aumentó el tiempo de incubación con clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) hasta 30 min y el tiempo de intercambio de tampón hasta 7 min) para permitir que la difusión alcanzara el equilibrio dentro del gel.

Con el fin de comparar de manera precisa las cuentas por célula entre diferentes muestras, debe atraparse más del 90 % de los ARN diana en una célula. Para cuantificar la distribución de ARN a lo largo de diferentes planos z, se realizó un seccionamiento óptico en planos de obtención de imágenes diferenciados a lo largo de la célula con un tamaño de etapa de 0,5 micrómetros y se cuantificó la distribución de señales de smFISH en función de la posición z. Se encontró que >90 % de los ARN estaban ubicados en el volumen de los primeros 5 micrómetros de profundidad en muestras no expandidas y en el volumen de los primeros 12 micrómetros de profundidad en muestras expandidas desde la superficie de los cubreobjetos. Por tanto, se exploró un volumen de 5 micrómetros de profundidad para muestras no expandidas y se exploró un volumen de 12 micrómetros de profundidad para muestras expandidas con un tamaño de etapa de 1 micrómetro. La exploración en la dirección z se controló mediante un posicionador nanométrico Nano-F200 (Mad City Labs).

Se llevó a cabo la obtención de imágenes de MERFISH y la retirada de señal secuenciales con una plataforma de obtención de imágenes de alto rendimiento. En resumen, tras la hibridación, se obtuvieron imágenes de muestras con un área de FOV de 223 x 223 micrómetros usando una cámara de semiconductor de óxido de metal complementario científico (sCMOS), de 2.048 x 2.048 píxeles, en combinación con una alta abertura digital (NA = 1,3) y un objetivo de aceite de silicona de alto aumento (60x). Tras la obtención de imágenes de ~100-400 FOV, se extinguió la fluorescencia de las sondas de lectura incubando la muestra en un tampón de escisión reductor compuesto por 2x SSC y TCEP 50 mM (Sigma). Se repitió el procedimiento de hibridación, obtención de imágenes y escisión química ocho veces con canal de DAPI de 405 nm sometido a obtención de imágenes junto con la primera ronda de obtención de imágenes de lectura.

Registro de imágenes y decodificación. Se llevó a cabo el registro de imágenes del mismo FOV a lo largo de rondas de obtención de imágenes así como la decodificación de los códigos de barras de ARN de la siguiente manera. En resumen, se corrigieron pilas z en cada ubicación a partir de diferentes rondas de obtención de imágenes para corregir desviaciones laterales basándose en la ubicación de perlas de referencia. Se sometieron pilas z corregidas a filtro de paso alto para eliminar el fondo, se desconvolucionaron para contraer los puntos de ARN y después se sometieron a filtro de paso bajo para conectar centroides de ARN que diferían ligeramente en cuanto a la ubicación entre imágenes. Para corregir diferencias en el brillo entre canales de color, en primer lugar se normalizaron las imágenes igualando sus histogramas de intensidad y se refinaron adicionalmente mediante un procedimiento iterativo para eliminar la variación sustancial en la intensidad de fluorescencia entre diferentes bits. El conjunto de 16 valores de intensidad normalizados (correspondientes a la obtención de imágenes de 16 sondas de lectura) observados para cada pixel en cada FOV en cada plano focal representaba un vector en un espacio de 16 dimensiones. Se normalizó el vector de píxeles y se comparó con cada uno de los 140 códigos de barras en el código de MHD4 de 16 bits. Se asignó un pixel a un código de barras si la distancia euclidiana entre el vector y un código de barras era menor que un umbral dado definido mediante la distancia de un error de un único bit. Se combinaron píxeles adyacentes para dar un único ARN supuesto usando una matriz de conectividad en 3D con conectividad de vecinos máxima. Se calcularon los límites de célula usando el algoritmo de transformación divisoria basado en la densidad de códigos de barras invertida con regiones teñidas con DAPI como semillas iniciales.

Se dividieron los cálculos entre la agrupación Odyssey soportada por FAS Division of Science, Research Computing Group en la Universidad de Harvard y un servidor de sobremesa que contenía dos CPU Intel Xeon E5-2680 de 2,8 GHz de 10 núcleos y 256 GB de RAM.

FISH de moléculas individuales. Cada sonda de smFISH contiene una región diana de 30 nt y una secuencia de lectura diseñada de manera personalizada de 20 nt. Se diseñaron 48 sondas para cada gen. Tras la permeabilización, se incubaron las células durante 5 min en tampón de lavado de codificación que comprendía 2x solución salina-citrato de sodio (SSC) (Ambion) y formamida al 30 % (v/v) (Ambion). Después se añadieron 30 microlitros de sondas de smFISH 2 micromolar y sonda de anclaje 3,3 micromolar en tampón de hibridación de codificación a la superficie de Parafilm (Bemis) y se cubrieron con un cubreobjetos que contenía células. Después se incubaron las muestras en una cámara húmeda dentro de un horno de hibridación a 37 ºC durante 24 h. El tampón de hibridación de codificación estaba compuesto por tampón de lavado de codificación complementado con ARNt de levadura al 0,1 % (p/v) (Life Technologies), inhibidor de ARNasa murina al 1 % (v/v) (New England Biolabs) y sulfato de dextrano al 10 % (p/v) (Sigma). Después se lavaron las células con tampón de lavado de codificación y se incubaron a 47 ºC durante 30 min; se repitió esta etapa de lavado una vez. Después se incorporaron las células y se aclararon usando el método de aclaramiento basado en impresión de matriz descrito tal como se describió anteriormente para la incorporación, digestión y aclaramiento para muestras no expandidas. Se hibridaron las muestras incorporadas en placas con sondas de lectura de 20 nt de Cy5 en tampón de hibridación, se lavaron y se tiñeron con DAPI tal como se describió en la sección de rondas secuenciales de tinción de sonda de lectura y obtención de imágenes. Se recogieron imágenes explorando un volumen de 5 micrómetros de profundidad con un tamaño de etapa de 1 micrómetro y se recogieron 100 FOV para cada conjunto de sondas de smFISH.

Aunque se han descrito e ilustrado varias realizaciones de la presente invención en el presente documento, los expertos habituales en la técnica concebirán fácilmente una variedad de otros medios y/o estructuras para realizar las funciones y/u obtener los resultados y/o una o más de las ventajas descritas en el presente documento, y se considera que cada una de tales variaciones y/o modificaciones está definida por las reivindicaciones. Más generalmente, los expertos en la técnica apreciarán fácilmente que se pretende que todos los parámetros, dimensiones, materiales y configuraciones descritos en el presente documento sean a modo de ejemplo y que los parámetros, dimensiones, materiales y/o configuraciones reales dependerán de la aplicación o aplicaciones específicas para las que se usen las enseñanzas de la presente invención. Los expertos en la técnica reconocerán, o serán capaces de determinar usando únicamente experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención descritas en el presente documento. Por tanto, debe entenderse que las realizaciones anteriores se presentan únicamente a modo de ejemplo y que, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención puede ponerse en práctica de otra manera distinta de la descrita específicamente. La presente divulgación se refiere a cada característica, sistema, artículo, material, kit y/o método individual descrito en el presente documento. Además, cualquier combinación de dos o más de tales características, sistemas, artículos, materiales, kits y/o métodos, si tales características, sistemas, artículos, materiales, kits y/o métodos de divulgación no son mutuamente incompatibles, queda incluida dentro del alcance de la presente invención.

Debe entenderse que todas las definiciones, tal como se definen y se usan en el presente documento, priman con respecto a definiciones de diccionario y/o significados habituales de los términos definidos.

Los artículos indefinidos “un” y “una”, tal como se usan en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, deberán entenderse como que significan “al menos uno”.

La expresión “y/o”, tal como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, debe entenderse como que significa “cualquiera o ambos” de los elementos así unidos, es decir, elementos que están presentes de manera conjuntiva en algunos casos y presentes de manera disyuntiva en otros casos. Múltiples elementos indicados con “y/o” deben interpretarse de la misma manera, es decir, “uno o más” de los elementos así unidos. Otros elementos pueden estar opcionalmente presentes, distintos de los elementos específicamente identificados mediante la cláusula de “y/o”, ya estén relacionados o no relacionados con los elementos específicamente identificados. Por tanto, como ejemplo no limitativo, una referencia a “A y/o B”, cuando se usa junto con expresiones abiertas tales como “que comprende”, puede referirse, en una realización, únicamente a A (incluyendo opcionalmente elementos distintos de B); en otra realización, únicamente a B (incluyendo opcionalmente elementos distintos de A); en aún otra realización, tanto A como B (incluyendo opcionalmente otros elementos); etc. Tal como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, debe entenderse que “o” tiene el mismo significado que “y/o” tal como se definió anteriormente. Por ejemplo, cuando se separan elementos en una lista, se interpretará que “o” o “y/o” son inclusivos, es decir, la inclusión de al menos uno, pero también incluyendo más de uno, de un número o lista de elementos, y, opcionalmente, elementos adicionales no indicados. Sólo los términos que indiquen claramente lo contrario, tales como “tan sólo uno de” o “exactamente uno de”, o, cuando se usa en las reivindicaciones, “que consiste en”, se referirán a la inclusión de exactamente un elemento de un número o lista de elementos. En general, el término “o” tal como se usa en el presente documento sólo se interpretará como que indica alternativas exclusivas (es decir “uno u otro, pero no ambos”) cuando va precedido por términos de exclusividad, tales como “o bien”, “uno de”, “tan sólo uno de” o “exactamente uno de”. Tal como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la expresión “al menos uno”, haciendo referencia a una lista de uno o más elementos, debe entenderse como que significa al menos un elemento seleccionado de uno cualquiera o más de los elementos en la lista de elementos, pero no necesariamente incluyendo al menos uno de todos y cada uno de los elementos específicamente indicados dentro de la lista de elementos y sin excluir cualquier combinación de elementos en la lista de elementos. Esta definición también permite que puedan estar opcionalmente presentes elementos distintos de los elementos específicamente identificados dentro de la lista de elementos a la que se refiere la expresión “al menos uno”, ya estén relacionados o no relacionados con los elementos específicamente identificados. Por tanto, como ejemplo no limitativo, “al menos uno de A y B” (o, de manera equivalente, “al menos uno de A o B”, o, de manera equivalente “al menos uno de A y/o B”) puede referirse, en una realización, a al menos un, incluyendo opcionalmente más de un, A, sin que esté presente B (e incluyendo opcionalmente elementos distintos de B); en otra realización, a al menos uno, incluyendo opcionalmente más de un, B, sin que esté presente A (e incluyendo opcionalmente elementos distintos de A); en aún otra realización, a al menos un, incluyendo opcionalmente más de un, A, y al menos un, incluyendo opcionalmente más de un, B (e incluyendo opcionalmente otros elementos); etc.

Cuando se usa el término “aproximadamente” en el presente documento haciendo referencia a un número, debe entenderse que todavía otra realización de la invención incluye ese número no modificado por la presencia del término “aproximadamente”.

También debe entenderse que, a menos que se indique claramente lo contrario, en cualquier método reivindicado en el presente documento que incluye más de una etapa o acción, el orden de las etapas o acciones del método no está necesariamente limitado al orden en el que se mencionan las etapas o acciones del método.

En las reivindicaciones, así como en la memoria descriptiva anterior, todas las expresiones de transición tales como “que comprende”, “que incluye”, “que porta”, “que tiene”, “que contiene”, “que implica”, “que sujeta”, “compuesto por” y similares deben entenderse como abiertas, es decir, significan que incluye pero sin limitarse a. Tan sólo las expresiones de transición “que consiste en” y “que consiste esencialmente en” serán expresiones de transición cerradas o semicerradas, respectivamente, tal como se expone en el manual de procedimientos de examen de patentes de la oficina de patentes de los Estados Unidos, sección 2111.03.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Método, que comprende:

incorporar células dentro de un material expandible, comprendiendo el material expandible acrilatos y/o acrilamidas;

inmovilizar ácidos nucleicos diana a partir de las células en el material expandible, que comprende exponer los ácidos nucleicos diana a una pluralidad de sondas de anclaje que inmovilizan los ácidos nucleicos diana en una única región de cada ácido nucleico diana en el material expandible, en el que cada una de la pluralidad de sondas de anclaje comprende una secuencia de ácido nucleico complementaria a al menos una porción de los ácidos nucleicos diana a partir de las células y una porción que reacciona con el material expandible;

expandir el material expandible, que comprende exponer el material expandible a una disolución que comprende agua y/o a una disolución hipotónica con respecto al material expandible;

exponer el material expandible a una pluralidad de sondas de ácido nucleico; y

determinar la unión de las sondas de ácido nucleico a los ácidos nucleicos diana inmovilizados.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende inmovilizar los ácidos nucleicos en una región ubicada en:

(a) un extremo 5’ de los ácidos nucleicos; o

(b) un extremo 3’ de los ácidos nucleicos; o

(c) una porción central de los ácidos nucleicos.

3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2,

(a) en el que se usa una sonda de anclaje única para cada ácido nucleico diana, o en el que se usan una o más sondas de anclaje únicas para cada ácido nucleico diana; y/o

(b) en el que al menos algunas de la pluralidad de sondas de anclaje comprenden una poli-dT.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que al menos algunas de la pluralidad de sondas de anclaje comprenden un oligonucleótido modificado con acridita.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que incorporar células dentro de un material expandible comprende rodear las células con un precursor del material expandible, y hacer que el precursor del material expandible forme el material expandible que rodea las células, preferiblemente en el que: (a) el precursor del material expandible comprende un monómero; y/o

(b) hacer que el precursor forme el material expandible comprende polimerizar el precursor; y/o

(c) hacer que el precursor forme el material expandible comprende exponer el precursor a un agente de reticulación.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el precursor comprende acrilamida y/o un acrilato.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el material expandible comprende un gel y/o poliacrilamida y/o metacrilato.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende expandir el material expandible de manera isotópica.

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, que comprende además fijar las células, preferiblemente en el que fijar las células comprende exponer las células a paraformaldehído.

10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende además, para cada al menos algunas de la pluralidad de sondas de ácido nucleico, determinar la unión de las sondas de ácido nucleico dentro de la muestra.

11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende además crear palabras de código basándose en la unión de la pluralidad de sondas de ácido nucleico; y, para al menos algunas de las palabras de código, hacer coincidir la palabra de código con una palabra de código válida en el que, si no se encuentra ninguna coincidencia, aplicar corrección de errores a la palabra de código para formar una palabra de código válida.

12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, que comprende exponer las células a:

(a) al menos 5 sondas de ácido nucleico diferentes; y/o

(b) la pluralidad de sondas de ácido nucleico de manera simultánea; y/o

(c) la pluralidad de sondas de ácido nucleico de manera secuencial.

13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en el que la pluralidad de sondas de ácido nucleico comprende una combinación combinatoria de sondas de ácido nucleico con secuencias diferentes.

14. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que al menos algunas de la pluralidad de sondas de ácido nucleico comprenden una primera porción que comprende una secuencia diana y una segunda porción que comprende una o más secuencias de lectura, preferiblemente:

(a) en el que la pluralidad de sondas de ácido nucleico comprende sondas de ácido nucleico distinguibles formadas a partir de una combinación combinatoria de una o más secuencias de lectura tomadas a partir de la una o más secuencias de lectura; y/o

(b) que comprende exponer las células a una primera sonda secundaria que comprende una primera entidad de señalización, la primera sonda secundaria capaz de unirse a algunas de las secuencias de lectura de las sondas de ácido nucleico, y determinar la unión de las sondas de ácido nucleico mediante la determinación de la primera entidad de señalización, preferiblemente que comprende además exponer las células a una segunda sonda secundaria que comprende una segunda entidad de señalización, la segunda sonda secundaria capaz de unirse a algunas de las secuencias de lectura de las sondas de ácido nucleico, y determinar la unión de las sondas de ácido nucleico mediante la determinación de la segunda entidad de señalización.

15. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, que comprende determinar la unión de las sondas de ácido nucleico dentro de la muestra:

(a) a una resolución mejor que 300 nm tras la expansión del material expandible, preferiblemente mejor que 100 nm; y/o

(b) a una resolución efectiva mejor que 30 nm antes de la expansión del material expandible, preferiblemente mejor que 10 nm; y/o

(c) mediante obtención de imágenes de al menos una porción del material expandible; y/o

(d) usando una técnica de obtención de imágenes óptica; y/o

(e) usando una técnica de obtención de imágenes por fluorescencia; y/o

(f) usando una técnica de obtención de imágenes por fluorescencia de superresolución.