BE1030246B1

BE1030246B1 - Polymeer geassisteerde biomolecule analyse

Info

Publication number: BE1030246B1
Application number: BE20225070A
Authority: BE
Inventors: Leen Volker
Original assignee: Leen Volker
Priority date: 2022-02-04
Filing date: 2022-02-04
Publication date: 2023-09-04
Also published as: BE1030246A1

Abstract

Methoden en verbindingen voor de analyse van biomoleculen worden onthuld. De methode omvat het combineren van een specifieke markering van een biomolecule met een polymeer dat in staat toe te nemen in grootte, waardoor toegang wordt verkregen tot verbeterde informatie over de structuur en identiteit van de biomolecule.

Description

POLYMEER GEASSISTEERDE BIOMOLECULE ANALYSE

Technisch gebied van de uitvinding

[0001] Belichamingen hierin hebben in het algemeen betrekking op het enten van biomoleculen op een polymeermatrix, waarbij het polymeer en het fysische gedrag ervan genomische analyse mogelijk maken

Referenties — Gottfried A. et al. "Sequence-specific covalent labelling of DNA", Biochemical Society

Transactions, 39(2), 623-628 — Verbindingen en processen voor single-pot attachment van label aan nucleïnezuur,

US2006/0188927 — Proudnikov D., et al, (1996), Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling, Nucleic

Acids Research, , Vol. 24, 4535-4532 — Biomoleculaire markering, US6.657.052 B1 — Selectie van afzonderlijke nucleïnezuren op basis van optische handtekening, US2014/0011686 — Methoden voor het specifiek labelen van nucleïnezuren met CRISPR/CAS, US 2016/0168621 — Methoden en toestellen voor de analyse van het volledige genoom op basis van enkelmoleculen

US8628919 — Covalente labeling van nucleïnezuren, Nils Klöcker, Florian P. Weissenboeck en Andrea

Rentmeister; 10.1039/DOCS00600A, Chem. Soc. Rev., 2020, 49, 8749-8773.

Achtergrond van de uitvinding

[0002] De studie van biopolymeren wordt sterk vergemakkelijkt door methoden die gebruik maken van de ruimtelijke organisatie van specifieke monomeren of specifieke combinaties daarvan, met het doel de aanwezigheid, de positie, de overvloed of de volgorde van dergelijke specifieke plaatsen te lokaliseren. Voorbeelden van dergelijke specifieke plaatsen kunnen afzonderlijke nucleobasen, aminozuurzijketens of combinaties daarvan zijn.

[0003] Voorbeelden van methoden die dergelijke waarnemingen van sequentiespecifieke domeinen mogelijk maken zijn Fiber-FISH en Genomic Mapping, die beide uitgebreide toepassingen hebben in de menselijke diagnostiek.

[0004] Bij het streven naar longitudinale informatie bereiken deze benaderingen snel hun grenzen wanneer het erom gaat een groot aantal sequentiespecifieke domeinen te onderscheiden, waarbij de resolutie van de onderliggende sequentie-informatie ontoereikend is. Bovendien is longitudinale informatie een essentieel onderdeel van verschillende van de methoden, waarbij lange stukken biopolymeer nodig zijn om voldoende informatie te verkrijgen voor soortidentificatie, genoomscaffolding of analyse van structurele varianten.

[0005] Daarom is er behoefte aan methoden met een verbeterde resolutie, waarmee de waargenomen ruimtelijke ordeningen en patronen gedetailleerder en nauwkeuriger kunnen worden geanalyseerd.

Samenvatting van de uitvinding

[0006] De onderhavige uitvinding heeft betrekking op en omvat methoden en samenstellingen voor biopolymeeranalyse

[0007] Eén aspect van de huidige onthulling heeft betrekking op het enten van een gelineariseerd biopolymeer, hetzij als zodanig of met een specifieke merker die aan het gelineariseerde biopolymeer is gebonden, op een polymere matrix. Deze polymere matrix wordt dan in grootte verhoogd. Deze toename van de omvang vindt plaats in de dimensie van het lineaire biopolymeer, maar kan zich over meerdere dimensies uitstrekken. Naarmate de omvang toeneemt volgens bepaalde modellen, behouden de locatiespecifieke markers op het geënte biopolymeer of de geënte bijbehorende markers hun relatieve volgorde, en/of kunnen afstandspatronen worden gereconstrueerd. Het meten van de orde en/of afstand op de polymere matrix in zijn toegenomen omvang levert een verbeterd oplossend vermogen van de orde en/of afstand op, zodat de onderliggende biopolymeerstructuur en -identiteit met een verhoogde resolutie en nauwkeurigheid kan worden geanalyseerd.

[0008] In één aspect heeft de uitvinding ook betrekking op het enten van het biopolymeer op een hydrogel, waarbij de groottevergroting wordt verkregen door zwelling van de hydrogel door toevoeging van water.

[0009] De onderhavige uitvinding is zeer geschikt voor de analyse van polynucleotiden, zoals

DNA en RNA en polypeptiden.

[0010] Andere aspecten van de uitvinding zullen blijken uit de beschrijving en de voorbeelden hieronder, en kunnen worden samengevat aan de hand van de volgende genummerde belichamingen. 1) Een biopolymeer analysemethode, bestaande uit; 1. Enten van de combinatie van een gelineariseerd biopolymeer en biopolymeerplaats-specifieke markers op een polymeer 2. Vergroting van de ruimtelijke dimensies van het verknoopte polymeer langs de linearisatie-as 3. Verkrijgen van positie-informatie op de plaats-specifieke labels

Korte beschrijving van de tekeningen

Tekening 1 is een schematische voorstelling van de uitvinding

Tekening 2 is een schematische voorstelling van een belichaming van de uitvinding

Tekening 3 schematische voorstelling van één belichaming van de uitvinding

Tekening 4 zijn enkele van de chemische verbindingen zoals gebruikt in de uitvinding

Definities

[0011] De volgende termen en bijbehorende definities worden in deze tekst gebruikt.

[0012] "Stochastisch”" een willekeurige waarschijnlijkheidsverdeling of een willekeurig patroon die statistisch kunnen worden geanalyseerd, maar niet precies kunnen worden voorspeld

[0013] Onder “optisch aflezen" wordt hier verstaan: een methode die gebruik maakt van lichtsignalen om specifieke informatie over het monster af te lezen.

[0014] Onder “biorthogonaal" wordt hier verstaan: chemische reacties die in biologische systemen kunnen worden gebruikt, waarbij een reactieve groep specifiek aan een andere reactieve groep wordt gekoppeld: zonder nevenreacties; in neutrale, waterige oplossing; en onder bijkomende omstandigheden die verenigbaar zijn met het biologische systeem. Selectieve reactie tussen bioorthogonale bindingspartners kan nevenreacties met andere bindmiddelen, biologische verbindingen, of andere niet-complementaire bioorthogonale bindmiddelen of niet- complementaire bioorthogonale functionele groepen tot een minimum beperken.

Bioorthogonale functionele groepen van bioorthogonale bindmiddelen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, een azide en alkyne voor de vorming van een triazool via Click-chemistry reacties, trans-cyclooctene (TCO) en tetrazine (Tz) (b.v. 1,2,4,5-tetrazine), en anderen. De bindmiddelen die nuttig zijn in de huidige onthulling kunnen een hoge reactiviteit hebben met het overeenkomstige bindmiddel, zodat de reactie snel verloopt.

[0015] De hier gebruikte term "complementair" verwijst naar de hybridisatie of basenparing tussen nucleotiden of nucleïnezuren, zoals bijvoorbeeld tussen de twee strengen van een dubbelstrengs DNA-molecuul of tussen een oligonucleotideprimer en een primerbindingsplaats op een enkelstrengs nucleïnezuur dat moet worden gesequenced of geamplificeerd.

Complementaire nucleotiden zijn in het algemeen A en T (of A en U), of C en G. Van twee enkelstrengs RNA- of DNA-moleculen wordt gezegd dat zij complementair zijn wanneer de nucleotiden van de ene streng, optimaal uitgelijnd en vergeleken en met de juiste nucleotide- invoegingen of -verwijderingen, paren vormen met ten minste ongeveer 80% van de nucleotiden van de andere streng, gewoonlijk ten minste ongeveer 90% tot 95%, en bij voorkeur van ongeveer 98 tot 100%. Er is ook sprake van complementariteit wanneer een RNA- of DNA-streng onder selectieve hybridisatieomstandigheden hybridiseert met zijn complement. Kenmerkend is dat selectieve hybridisatie optreedt wanneer er sprake is van ten minste 65% complementariteit over een strook van ten minste 14 tot 25 nucleotiden, bij voorkeur ten minste 75%, en bij voorkeur ten minste 90% complementariteit.

[0016] De term "affiniteits-ligand" verwijst naar een molecule die in staat is zich met een specifieke affiniteit aan een specifiek molecule te binden, en in de onderhavige uitvinding verwijst de term naar moleculen die in staat zijn zich selectief aan een eiwit of aptameer te binden. Merk op dat het affiniteits-ligand gewoon "ligand" kan worden genoemd.

[0017] De termen "binding" en "bindmiddel" verwijzen naar een chemisch of biologisch agens dat specifiek bindt aan een doelwit (bv. een gericht biomolecuul), en daarbij een stabiele associatie vormt tussen het bindmiddel en het specifieke doelwit. Met "stabiel geassocieerd" of “stabiele associatie" wordt bedoeld dat een molecuul onder fysiologische standaardomstandigheden gebonden is aan of anderszins geassocieerd is met een ander molecuul of een andere structuur. Bindingen kunnen covalente bindingen en niet-covalente interacties omvatten, zoals, maar niet beperkt tot, ionische bindingen, hydrofobe interacties, waterstofbruggen, van der Waals krachten (bijv. London dispersiekrachten), dipool-dipool interacties, en dergelijke. Een targeting-agent kan lid zijn van een specifiek bindingspaar, zoals, maar niet beperkt tot: lid van een receptor/ligand-paar; een ligand-bindend deel van een receptor; lid van een antilichaam/antigeen-paar; een antigeen-bindend fragment van een antilichaam; een hapten; lid van een lectine/koolhydraat-paar; lid van een enzym/substraat-paar; biotine/avidine

[0018] De term "contact" of "contact" verwijst naar het proces waarbij ten minste twee verschillende soorten met elkaar in contact worden gebracht zodat ze met elkaar kunnen interageren, zoals in een niet-covalente of covalente bindende interactie of bindingsreactie. Het resulterende complex of reactieproduct kan echter rechtstreeks worden geproduceerd uit een interactie of een reactie tussen de toegevoegde reagentia of uit een tussenproduct van een of meer van de toegevoegde reagentia of samenstellingen, dat in het contactmengsel kan worden geproduceerd.

[0019] De term "positie-informatie" verwijst naar positiewaarden in een coördinatenstelsel.

Door de aanwezigheid en de combinatie van dergelijke waarden ontstaan ruimtelijke patronen, die kunnen worden geïnterpreteerd om informatie over het systeem te verkrijgen.

[0020] De term "plaatsgebonden" verwijst naar processen, bindingsgebeurtenissen, reacties, "docking"-gebeurtenissen en dergelijke die plaatsvinden in functie van de aan- of afwezigheid van specifieke combinaties van biomonomeren. Voorbeelden hiervan zijn reacties op specifieke nucleobasen, aminozuren en combinaties daarvan. Locaties kunnen bestaan uit specifieke combinaties van nucleobasen, aminozuren en combinaties daarvan. Dergelijke combinaties kunnen bestaan uit een willekeurig aantal monomeren, maar bij voorkeur tussen 2 en 20.

[0021] De term "linker", "gelinkt" of "koppeling" verwijst naar een chemisch deel dat twee delen aan elkaar bindt, zoals een verbinding van de huidige openbaarmaking aan een biologisch materiaal dat zich richt op een specifiek celtype, zoals een kankercel, een ander type zieke cel of een normaal celtype. De koppeling kan geschieden via covalente bindingen, ionische bindingen, hydrofobe interacties, waterstofbruggen, van der Waals krachten (b.v. London dispersiekrachten), dipool-dipool interacties, en dergelijke. De koppeling kan een directe koppeling zijn tussen de twee samenstellende delen die worden gekoppeld, of een indirecte, zoals via een linker. Linkers die nuttig zijn in belichamingen van de onderhavige onthulling omvatten linkers met 30 koolstofatomen of minder in lengte. In sommige belichamingen, zijn de linkers 1-15 koolstofatomen in lengte, zoals 1-12 koolstofatomen, of 1-10 koolstofatomen, of 5-10 koolstofatomen in lengte. De representatieve linkers kunnen 1 tot 100 verbindende atomen hebben, en kunnen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, ethyleen-oxygroepen, aminen, esters, amiden, carbamaten, carbonaten, en keton functionele groepen. Linkers kunnen bijvoorbeeld 1 tot 50 bindingsatomen hebben, of 1 tot 30 bindingsatomen. Andere soorten bindingen kunnen ook worden gebruikt in belichamingen van de huidige onthulling.

[0022] De termen "bindmiddel" of "bindmiddel" verwijzen naar een proces of een agens met een functionele groep die in staat is een covalente binding te vormen met een complementaire functionele groep van een ander bindmiddel in een biologisch milieu. Binding tussen bindmiddelen in een biologische omgeving kan ook worden aangeduid als bioconjugatie.

Representatieve bindmiddelen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, een amine en een geactiveerde ester, een amine en een isocyanaat, een amine en een isothiocyanaat, thiolen voor de vorming van disulfiden, een aldehyde en een amine voor enaminevorming, een azide voor de vorming van een amide via een Staudinger ligatie. Bindmiddelen omvatten ook bioorthogonale bindmiddelen, dat wil zeggen bindmiddelen met bioorthogonale functionele groepen. 5 [0023] De "nucleïnezuren" of "polynucleotiden" van de uitvinding omvatten, maar zijn niet beperkt tot, ribonucleïnezuren (RNA's), desoxyribonucleïnezuren (DNA's}, threosenucleïnezuren (TNA's), glycolnucleïnezuren (GNA's), peptidenucleïnezuren (PNA's), gesloten nucleïnezuren (LNA's, met inbegrip van LNA met een B-D-ribo-configuratie, a-LNA met een a-L-ribo-configuratie (een diastereomeer van LNA), 2'-amino-LNA met een 2'-aminofunctionalisering, en 2'-amino-a-

LNA met een 2'-aminofunctionalisering), ethyleennucleïnezuren (ENA), cyclohexenylnucleïnezuren (CeNA) of hybriden of combinaties daarvan.

[0024] De term "oligonucleotide", zoals gebruikt in de uitvinding, verwijst naar een kort nucleïnezuurmolecuul van ongeveer 8 tot ongeveer 50, eventueel tot ongeveer 90 nucleotiden lengte, natuurlijk of synthetisch, dat kan fungeren als een beginpunt van complementaire nucleïnezuurhybridisatie. Het oligonucleotide zelf kan desgewenst ook van een label worden voorzien door er een verbinding in op te nemen die met spectroscopische, fotochemische, biochemische, immunochemische of chemische middelen kan worden opgespoord. Nuttige labels zijn bijvoorbeeld fluorescerende kleurstoffen, elektronendichte reagentia, biotine, of kleine peptiden waarvoor antisera of monoklonale antilichamen beschikbaar zijn.

[0025] Een “reactieve groep" is een chemisch deel dat met een chemisch partnerdeel kan reageren om een covalent of niet-covalent verbond te vormen. Een groep kan als een reactieve groep worden beschouwd op grond van zijn hoge reactiviteit met een enkel partner-molecuul, een stel partner-moleculen, of op grond van zijn reactiviteit met vele partners.

[0026] "DNA-mapping" verwijst naar een proces waarbij sequentiespecifieke merkers in een polynucleotide worden ingebracht, en waarbij de afstandsinformatie tussen deze merkers informatie oplevert over de genetische samenstelling van het polynucleotide. DNA-kartering kan betrekking hebben op alle polynucleotiden in een monster, met inbegrip van maar niet beperkt tot genomisch DNA, plasmide-DNA, mRNA, tRNA en genomisch RNA.

Gedetailleerde beschrijving van de uitvinding

[0027] De onderhavige uitvinding zal worden beschreven aan de hand van bijzondere uitvoeringen en onder verwijzing naar bepaalde tekeningen, maar de uitvinding wordt hiertoe niet beperkt, doch uitsluitend door de conclusies. Verder worden de termen eerste, tweede en dergelijke in de beschrijving en in de conclusies gebruikt om onderscheid te maken tussen gelijksoortige elementen en niet noodzakelijkerwijs om een volgorde te beschrijven, hetzij in de tijd, ruimtelijk, in de rangorde of op enige andere wijze. Het is te begrijpen dat de aldus gebruikte termen onder passende omstandigheden onderling verwisselbaar zijn en dat de hierin beschreven belichamingen van de uitvinding ook in andere volgordes kunnen werken dan hierin beschreven of geïllustreerd.

[0028] Er zij op gewezen dat de in de conclusies gebruikte term "bestaande uit" niet moet worden uitgelegd als zijnde beperkt tot de hierna genoemde middelen; hij sluit andere elementen of stappen niet uit. De term moet dus worden uitgelegd als een specificatie van de aanwezigheid van de genoemde kenmerken, gehele getallen, stappen of componenten, maar sluit de aanwezigheid of toevoeging van een of meer andere kenmerken, gehele getallen, stappen of componenten, of groepen daarvan, niet uit. De draagwijdte van de uitdrukking "een hulpmiddel bestaande uit de onderdelen A en B" mag dus niet worden beperkt tot hulpmiddelen die alleen bestaan uit de onderdelen A en B. Het betekent dat, wat de onderhavige uitvinding betreft, de enige relevante onderdelen van het hulpmiddel A en B zijn.

[0029] Verwijzing in deze specificatie naar "een belichaming" of "een uitvoering" betekent dat een bepaald kenmerk, een bepaalde structuur of een bepaald kenmerk dat in verband met de uitvoering wordt beschreven, in ten minste één uitvoering van de onderhavige uitvinding is opgenomen. De uitdrukkingen "in een belichaming" of "in een belichaming" die op verschillende plaatsen in deze specificatie voorkomen, verwijzen dus niet noodzakelijkerwijs allemaal naar dezelfde belichaming, maar kunnen wel allemaal naar dezelfde belichaming verwijzen. Voorts kunnen de bijzondere eigenschappen, structuren of kenmerken op om het even welke geschikte manier worden gecombineerd, zoals voor iemand van gewone vaardigheid in de kunst duidelijk zou zijn uit deze onthulling, in één of meer belichamingen.

[0030] Evenzo dient te worden begrepen dat in de beschrijving van exemplarische belichamingen van de uitvinding, verschillende kenmerken van de uitvinding soms worden gegroepeerd in één enkele belichaming, figuur of beschrijving daarvan, met het doel de onthulling te stroomlijnen en te helpen bij het begrijpen van één of meer van de verschillende inventieve aspecten. Deze methode van openbaarmaking mag echter niet worden geïnterpreteerd als zou het de bedoeling zijn dat de geclaimde uitvinding meer kenmerken vereist dan die welke uitdrukkelijk in elke conclusie worden vermeld. Integendeel, zoals uit de volgende conclusies blijkt, liggen de uitvindersaspecten in minder dan alle kenmerken van één enkele voornoemde geopenbaarde belichaming. Aldus worden de op de gedetailleerde beschrijving volgende conclusies hierbij uitdrukkelijk in deze gedetailleerde beschrijving opgenomen, waarbij elke conclusie op zichzelf staat als een afzonderlijke belichaming van deze uitvinding.

[0031] In de hierin gegeven beschrijving worden talrijke specifieke details uiteengezet. Het is echter duidelijk dat belichamingen van de uitvinding ook zonder deze specifieke details kunnen worden toegepast. In andere gevallen zijn bekende methoden, structuren en technieken niet in detail weergegeven om het begrip van deze beschrijving niet te vertroebelen.

[0032] De methode van de uitvinding omvat het bekomen van een gelineariseerd biopolymeer in of op een polymere matrix, waar de polymere matrix bijdraagt aan analyse van het gelineariseerde biopolymeer

[0033] Een belichaming van de beschreven methode 100 is weergegeven in fig. 1 en omvat 3 verschillende stappen, [10, 20,30], die als volgt kunnen worden onderverdeeld

A. Verkrijging van een gelineariseerd biopolymeer dat op specifieke plaatsen is gemarkeerd en aan een polymere matrix is gebonden

B. Vergroting van de afmetingen van het polymeer, en dit minstens in lijn met het gelineariseerde biopolymeer

C. Analyse van het signaal

[0034] Voor de methoden van de uitvinding kan de eerste stap zelf uit verschillende deelstappen bestaan. Zo kan een biomolecuul op een plaatsspecifieke manier reageren om labels op bekende plaatsen binnen het polymeer te plaatsen, gevolgd door linearisatie van het biomolecuul samen met de gebonden labels. Een andere mogelijkheid is dat het biomolecuul eerst wordt gelineariseerd, gevolgd door specifieke binding op geselecteerde plaatsen binnen het biomolecuul.

[0035] Linearisatie van het biomolecuul kan worden uitgevoerd door linearisatie op een oppervlak of in een stromingssysteem. Voorbeelden van linearisatie zijn linearisatie in op oppervlakken (Kaykov et al. Sci Rep 6, 19636 (2016) of in stromingssystemen (Kim et al, Lab Chip, 2011,11, 1721-1729).

[0036] Vergroting van de afmetingen van het polymeer kan worden bereikt door het polymeer louter fysiek uit te rekken, door een kracht uit te oefenen. Aangezien de richting van de gelineariseerde biopolymeren bekend is, kan de richting van de kracht in overeenstemming zijn met de richting van het biopolymeer.

[0037] In een specifieke belichaming vormt de polymeermatrix een opzwelbare matrix. Een bekend voorbeeld van een dergelijke opzwellende matrix zijn hydrogels, die bestaan uit een polymeergaas en een waterige oplossing. Bij verdere stimulatie nemen de fysische afmetingen van de hydrogel toe. Traditionele stimuli die een hydrogelreactie uitlokken zijn pH, temperatuur, oplosmiddelen en ionensterkte. Met verschillende hydrogelrecepten kunnen gemakkelijk afmetingen worden bereikt die 4-20 maal groter zijn.

[0038] In weer een andere belichaming wordt de zwelling in een aantal van zijn dimensies beperkt door een houder. Dit kan de gel dwingen om de zwelling in een voorkeursrichting te beperken, de zwelling in een voorkeursrichting te versterken of een juiste hantering van de gel te verzekeren.

[0039] Bij voorkeur volgt de omvanguitbreiding van het polymeer vooraf bepaalde patronen, zodat de oorspronkelijke biologische informatie met hoge resolutie kan worden getraceerd. Dit patroon kan een lineaire grootte-uitbreiding zijn. Voor toepassingen waarbij alleen de aanwezigheid en volgorde van specifieke locaties van belang is, is dit vooraf bekende expansiepatroon van minder belang. In een specifieke belichaming is een meting opgenomen in de workflow om het profiel van de grootte-uitbreiding te analyseren.

[0040] Groepen die een dergelijke enting op de polymeermatrix kunnen bewerkstelligen zijn onder meer, maar niet uitsluitend, vinyl of vinylmonomeren zoals styreen en derivaten daarvan (b.v. divinylbenzeen), acrylamide en derivaten daarvan, butadieen, acrylonitril, vinylacetaat, maleïmiden, alkynen, epoxiden, aldehyden of acrylaten en acrylzuurderivaten.

[0041] In een verdere belichaming kunnen de methoden van de uitvindingen een stap omvatten die het biopolymeer verbreekt na enting van de specifieke signalen op de polymere matrix. Dit kan gunstig zijn voor de uniformiteit van de maattoename, aangezien de covalente bindingen in het biopolymeer de lokale maattoename kunnen belemmeren als ze niet worden verbroken.

Voorbeelden van dergelijke stappen zijn een UV-behandeling om de polynucleotideketens te verstoren of een enzymatische stap, met een nuclease- of proteïnase-enzyme.

[0042] In belichamingen van de uitvinding is het plaatsgebonden labelen van DNA een sleutelelement van de methoden. Dergelijke sequentiespecifieke markering van DNA is een zich snel ontwikkelend gebied, besproken door Gottfried A. et al. "Sequence-specific covalent labeling of DNA", Biochemical Society Transactions, 39(2), 623-628" en de beschreven sequentiespecifieke methoden zijn hierin opgenomen door middel van verwijzing.

Enzymgerichte methoden omvatten het labelen met methyltransferase-enzymen, nicking-

enzymen, polymerasen en CRISPR-CAS-methoden. Chemische methoden omvatten het gebruik van sequentiespecifieke liganden, die kleine moleculen of oligomeren kunnen zijn.

[0043] In het algemeen zijn DNA-nucleobasen begraven in de DNA-helix, met slechts beperkte beschikbaarheid voor chemische modificatie op de nucleobase. In een specifieke uitvoering van de uitvinding wordt DNA echter gelineariseerd op een oppervlak met behulp van moleculaire combing. Dit moleculair kammen veroorzaakt een gedeeltelijk smelten van het DNA, waardoor nucleobasen toegankelijker worden voor chemische reacties. Bijvoorbeeld, bisulfiet gemedieerde transaminering van cytosines is in staat om een DNA-handtekening te genereren binnen een polymere matrix. In een dergelijke belichaming kan het gunstig zijn om het DNA na linearisatie op een niet-specifieke manier op de polymere matrix te enten. De polymeermatrix kan dan worden onderworpen aan de vereiste chemicaliën en oplossingen zonder het risico dat het DNA loskomt van zijn positie op het oppervlak.

[0044] De methoden van de uitvinding zijn gemakkelijk te vertalen naar sommige bestaande

DNA-karteringsbenaderingen, waarbij sequentiespecifieke markers op DNA worden aangebracht vóór analyse. Door dit DNA verder te modificeren met een polymeriseerbaar gedeelte, kan het DNA worden onderworpen aan enting met een polymeermatrix, kan het polymeer worden uitgebreid en kan DNA-kartering met verbeterde resolutie plaatsvinden.

[0045] Een bepaalde eigenschap van DNA kan worden gebruikt voor het efficiënt opwekken van signalen of het inbouwen van monomeermoleculen. Agentia die zich binden aan de hoofd- of de kleine groef van DNA kunnen een sequentiespecifiek signaal opwekken (Dervan et al, . Proc Natl

Acad Sci U S A. 2006; 103(4):867.), dienen als een manier om monomere eenheden langs de

DNA-backbone in te brengen of een combinatie van beide.

[0046] In een andere belichaming wordt het DNA gedenatureerd om eenstrengs-DNA te verkrijgen, gevolgd door hybridisatie met willekeurige oligomeren. De oligomeren kunnen dan gemodificeerde oligomeren zijn, die polymeriseerbare groepen of labels bevatten, of een combinatie daarvan.

[0047] In sommige belichamingen omvat de methode voorts de detectie van een relatieve afstand tussen de labels op het gelineariseerde polynucleotide, waardoor een streepjescode wordt verkregen van een deel van de genomische informatie. Deze relatieve afstand kan door fluorescentiemicroscopie worden verkregen.

[0048] Het is duidelijk dat de gelineariseerde biomolecules zich niet in de polymere matrix moeten bevinden, maar dat de sequentiespecifieke markering enkel naar de polymere matrix gebonden of getransfereerd dient te worden. De biopolymeren kunnen zich dus op of tegen de polymere matrix bevinden, en de sequentie specifieke markering wordt gebonden aan of in de polymere matrix.

[0049] In zulke belichamingen van de methodes van de uitvinding wordt het signaal ter analyse dus niet langer een direct signaal van het biomolecule, maar van zijn identiteit. Het biomolecule dient zijn integriteit dus niet langer te behouden na het binden van de specifieke merkers aan of in de polymere matrix.

[0050] Sequentiespecifieke markering van RNA kan worden bereikt door sequentiespecifieke interacties of directe reacties met specifieke nucleobasen.

[0051] Sequentiespecifieke interacties, of interacties die afhankelijk zijn van de volgorde van meer dan één nucleobase, die kunnen worden gebruikt voor de methoden van de uitvinding zijn bijvoorbeeld complementaire hybridisatieprobes of sequentiespecifieke enzymen.

[0052] Voor deze belichamingen kunnen de hybridisatiesondes bij voorkeur worden geselecteerd voor een hoge smelttemperatuur, zodat de secundaire en tertiaire structuren van het RNA worden verstoord. Voorbeelden van dergelijke hybridisatiesondes met gunstige binding zijn peptiden nucleïnezuren (PNA), gesloten nucleïnezuren (LNA) en andere niet-natuurlijke polynucleotiden.

[0053] De lengte van de hybridisatiesondes wordt afhankelijk van de toepassing gekozen, maar ligt bij voorkeur tussen 4 en 400 nucleotiden.

[0054] Belangrijk is dat in de methoden die in de uitvinding worden beschreven, de sequentiespecifieke handtekening wordt getransponeerd op een polymere matrix. De integriteit van het biomolecuul hoeft niet te worden gehandhaafd om de sequentiespecifieke handtekening te analyseren.

[0055] Om het lineariseren te vergemakkelijken kunnen aan het linearisatiemengsel stoffen worden toegevoegd die de secundaire en tertiaire RNA-structuur verstoren en die anders het linearisatieproces zouden belemmeren. Dergelijke middelen kunnen willekeurige oligonucleotiden zijn (b.v. willekeurige hexamers of nonamers), middelen die waterstofbruggen verbreken (b.v. formamide, ureum) of ladingneutraliserende zouten.

[0056] Functionalisering van de RNA-soorten volgens de methoden van de uitvinding kan ook worden bewerkstelligd door specifieke nucleobase-interacties op RNA te richten. Bijvoorbeeld, bisulfiet gemedieerde cytosine transaminering zet alle cytosines snel en volledig om in een amine uitgewisselde variant. Op deze wijze kunnen alle cytosines in een RNA worden gefunctionaliseerd met zowel signaalmoleculen als monomeerfunctionaliteiten. Het sequentiespecifieke signaal dat wordt gegenereerd na binding aan de polymeermatrix en expansie is derhalve een lineair beeld van het cytosinegehalte van het RNA. Guanine-labeling kan worden bewerkstelligd door de werking van reagentia zoals de elektrofiele stikstofmosterds, platina-reagentia, die bij voorkeur reageren op de stikstof van guaninenucleobasen.

[0057] In een specifieke belichaming wordt de nucleobasespecifieke labeling gecombineerd met hybridisatiesondes. Bijvoorbeeld, bisulfiet gemedieerde transaminering wordt gehinderd wanneer delen van het RNA worden gehybridiseerd. Als zodanig kunnen RNA-signalen worden bereid die zowel een signaal op niet-gehybridiseerde plaatsen combineren, dat de aanwezigheid van cytosine weergeeft, als een "donker signaal" op de positie van specifieke hybridisatiesondes.

Als alternatief wordt een eerste cytosine transaminering uitgevoerd in aanwezigheid van hybridisatieprobes, en wordt signaal gegenereerd in één kanaal (b.v. één kleur), met hybridisatieprobes in een tweede kanaal (b.v. een andere kleur).

[0058] Een uniek voordeel van de methoden van de uitvinding is dat de combinatie van sequentiespecifieke markering van RNA met een uitgebreide polymeermatrix RNA binnen het bereik brengt van genomische kartering en Fiber FISH met hoge resolutie, methoden die voorheen werden geblokkeerd door de beperkte omvang van het meeste RNA. Er bestaan geen andere methoden die de directe beeldvorming en identificatie van mRNA en rRNA mogelijk maken.

[0059] In een specifieke belichaming van de uitvinding bevinden er zich hybridizatie of affiniteits probes in het polymerizatiemengsel, het polymerizatiemidden of het linearizatiemidden die bijdragn aan de linearizatie van het biopolymeer. Deze probes kunnen ook een signaal functie dragen. Een mogelijk voorbeeld is een hybridizatieprobe voor RNA, zoals een poly-T staart ter hybridizatie van poly-A bevattend RNA.

[0060] Met name directe beeldvorming van rRNA en de genetische signatuur daarvan zal uitgebreide toepassingen kennen bij de identificatie van soorten, lineage en fylogenetica en de analyse van complexe mengsels, of microbiomen. Momenteel worden deze signalen indirect gemeten via de analyse van het DNA dat codeert voor het rRNA, door gerichte amplificatie van de genen gevolgd door sequencing, microarray-analyse, qPCR en andere methoden.

[0061] In specifieke belichamingen wordt de methode uitgebreid tot het in kaart brengen van

Eiwitten. Door specifieke aminozuurzijketens met signalen te markeren, het polypeptide te lineariseren en het aan het polymeermatricum te binden, kan een lineair signaal worden verkregen. Dit signaal komt overeen met een grove representatie van de totale eiwitsequentie.

Deze grove weergave van de volgorde van aminozuren bevat echter voldoende informatie om de identiteit van het eiwit vast te stellen.

[0062] Het is voor iemand die in de kunst is opgeleid duidelijk dat met diffractiebeperkte microscopiemethoden de resolutie van de verkregen genetische informatie nog kan worden verhoogd.

[0063] De methoden van de uitvinding hebben een breed toepassingspotentieel op het gebied van biotechnologie, genomica, geneeskunde en daarbuiten.

[0064] Met name maken de methoden een ongekende resolutie mogelijk bij benaderingen van genomische kartering, waarbij sequentiespecifieke handtekeningen van gelineariseerd DNA worden gebruikt om de identiteit en oorsprong van het DNA vast te stellen. Dergelijke genomische kartering wordt gebruikt bij de identificatie van soorten, het in kaart brengen van het genoom, genomische en genetische analyse en analyse van structurele varianten. Hier is de sequentiespecifieke handtekening direct gerelateerd aan de lengte, aangezien het DNA-stuk unieker wordt in functie van de lengte. In de huidige genomische karteringsbenaderingen zijn sequentiespecifieke elementen gericht op 4 tot 8 baseparen, en DNA-stukken zijn langer dan 10 kbp tot MBp. De uitbreiding van de genetische signatuur leidt tot een grotere oplossend vermogen van de genetische signatuur, en daardoor tot een specifiekere toeschrijving.

[0065] Tot dusver zijn geen genetische karteringsmethoden uitgebreid tot RNA-soorten. Dit wordt grotendeels toegeschreven aan de bovenvermelde lengte-eisen. Met mRNA enkele honderden tot enkele duizenden basen lang, zou de handtekening verkregen in genomic mapping benaderingen niet voldoende informatie voor verder gebruik bevatten. Echter, voortbouwend op de methoden van de uitvinding, hoge dichtheid markering van RNA kan fysiek worden gescheiden door de uitbreiding van het polymeer een bruikbare spoor opleveren. Als zodanig wordt het genomisch in kaart brengen van mRNA van weefsels en cellen haalbaar. rRNA van verschillende organismen en mengsels daarvan kunnen direct worden gevisualiseerd, bestudeerd en toegewezen.

[0066] Deze methoden kunnen ook worden toegepast op andere enzymen en eiwitten die zich binden aan specifieke plaatsen op een polynucleotide of aan specifieke toestanden van een polynucleotide. Voorbeelden van dergelijke enzymen en eiwitten die zich op een sequentiespecifieke manier buiten methyltransferasen aan polynucleotiden binden, zijn transcriptiefactoren of eiwitten die DNA-bindende domeinen bevatten zoals Helix-turn-helix,

Zinkvinger, Leucine-rits, Winged helix, Winged helix-turn-helix, Helix-loop-helix, HMG-box,

Wor3-domein, OB-fold-domein, Immunoglobuline fold, B3-domein of TAL-effector. Een specifiek geval van DNA-bindende eiwitten zijn eiwitten die door RNA worden geleid. Cas9 bijvoorbeeld kan worden gebruikt als een aanpasbaar RNA-gestuurd DNA-bindend platform, en wanneer gecombineerd met liganden zoals beschreven in deze uitvinding, in staat zijn gerichte DNA- modificatie te bewerkstelligen.

[0067] Een ander voorbeeld zijn enzymen die zich binden aan toegankelijk chromatine, functionaliteit overdragen op genoemd chromatine en specifieke analyse van de toegankelijkheid van chromatine en het gebruik daarvan bij genetische analyse mogelijk maken.

[0068] Een specifieke belichaming is het gebruik van de methoden van de uitvindingen voor de analyse van epigenetische en post-translatiemarkeringen op polynucleotiden en polypeptiden.

Voorbeelden hiervan zijn het plaatsgebonden labelen van bijvoorbeeld DNA- hydroxymethylering, DNA-carbonylering, specifieke RNA-basen zoals pseudouridine of eiwitmodificaties zoals prenylering of fosforylering. Er bestaan specifieke chemische, enzymatische of chemoenzymatische benaderingen voor het overbrengen van functionaliteit naar deze specifieke plaatsen, en wanneer deze gecombineerd worden met linearisering en enting op een polymere matrix, kan de uitbreiding van het signaal de analyse van deze merktekens verbeteren.

[0069] Verdere belichamingen van de uitvindingen kunnen het enzym vervangen door synthetische macromoleculen die in staat zijn specifieke docking-posities op het biomolecuul te herkennen. Een voorbeeld van dergelijke macromoleculen kan een aptameer zijn. Een ander voorbeeld van dergelijke macromoleculen kan een antilichaam zijn. Specifieke antilichamen en aptameren zijn in de literatuur beschreven voor genetische kenmerken zoals DNA-methylering en specifieke sequentiecombinaties, en kunnen daarom gemakkelijk worden opgenomen in de methoden van de uitvinding.

[0070] Bij elke hierboven beschreven methode kunnen a) de biopolymeerlabelingsreacties in hetzelfde reactievat worden uitgevoerd, of b) biopolymeer uit het monster in aliquots worden verdeeld en aan verschillende reactievaten worden toegevoegd, waarbij in elk reactievat biopolymeerlabelingsreacties worden uitgevoerd. De verschillende reacties kunnen vervolgens worden gerecombineerd of onafhankelijk van elkaar worden geanalyseerd.

[0071] In de kits van de uitvinding kan ten minste één markeringsentiteit een fluorofoor zijn of een molecuul waaraan een fluorofoor kan worden bevestigd.

[0072] Elk van de kits van de uitvinding kan verder ten minste één affiniteits- chromatografiekolom bevatten.

[0073] Elk van de kits van de uitvinding kan verder ten minste één buffer bevatten.

[0074] Elk van de kits van de uitvinding kan verder een of meer andere enzymen bevatten voor het uitvoeren van reacties die vereist zijn in methoden van de uitvinding. De enzymen kunnen

DNA-methyltransferasen, DNA-nickase of een DNA-polymerase omvatten.

[0075] Bijzonder nuttig zijn labels die optisch detecteerbaar zijn. Voorbeelden zijn chromoforen, luminoforen en fluoroforen. Fluoroforen zijn bijzonder nuttig en omvatten bijvoorbeeld fluorescerende nanokristallen, quantum dots, fluoresceïne, rhodamine, tetramethylrhodamine, eosine, erythrosine, cumarine, methyl-cumarines, pyreen, malachietgroen, Cy3, Cy5, stilbeen, Lucifergeel, Cascadeblauw, Texasrood, Alexakleurstoffen,

SETA-kleurstoffen, Atto-kleurstoffen, fycoerythine, bodipy en analogen daarvan. Nuttige optische sondes worden beschreven in Haugland, Molecular Probes Handbook, (Eugene, Oreg.) 6th Edition; de Synthegen-catalogus (Houston, Tex.), Lakowicz, Principles of Fluorescence

Spectroscopy, 2nd Ed., Plenum Press New York (1999), of WO 98/59066; WO 91/06678 of US

Pat. Appl. Publ. No. 2010/0092957 A1, die alle hierin zijn opgenomen door middel van verwijzing. Optische labels bieden het voordeel van een snelle, relatief niet-invasieve detectie.

[0076] Andere labels, waarvan sommige niet-optische labels zijn, kunnen worden gebruikt in diverse toepassingen van de hier beschreven methoden en samenstellingen. Voorbeelden zijn, zonder beperking, een isotopisch label zoals een natuurlijk niet-overvloedig radioactief of zwaar isotoop; magnetische substantie; elektron-rijk materiaal zoals een metaal; elektrochemiluminescent label zoals Ru(bpy); of een deel dat kan worden gedetecteerd op basis van een kernmagnetisch, paramagnetisch, elektrisch, lading-massa, of thermisch kenmerk.

Labels kunnen ook magnetische deeltjes of optisch gecodeerde nanodeeltjes omvatten.

Dergelijke labels kunnen worden gedetecteerd met behulp van geschikte methoden die bekend zijn bij diegenen die deskundig zijn op dit gebied. Een geladen label kan bijvoorbeeld worden gedetecteerd met een elektrische detector zoals die welke worden gebruikt in commercieel verkrijgbare sequencingsystemen van lon Torrent (Guilford, Conn., een dochteronderneming van

Life Technologies) of detectiesystemen die worden beschreven in US Pat. App. Publ. Nos. 2009/0026082 A1; 2009/0127589 A1; 2010/0137143 A1; en 2010/0282617 A1, die alle hierin zijn opgenomen door middel van verwijzing. Het zal duidelijk zijn dat voor sommige toepassingen een nucleotide-analoog geen label hoeft te hebben.

[0077] In één belichaming is de reporter een oligonucleotide. Door specifieke hybridisatie met complementaire oligonucleotiden kan deze reporter dienen als een streepjescode voor het biomolecuul dat oorspronkelijk op de genoemde plaats aanwezig was. De complementaire oligonucleotiden kunnen fluorescent gelabeld zijn (d.w.z. ze zijn geconjugeerd met een fluorofoor). Fluoroforen die zijn geconjugeerd aan imagerstrengen van verschillende nucleotidesequentie kunnen identiek zijn aan elkaar, of zij kunnen een emissieprofiel hebben dat overlapt of dat niet overlapt met dat van andere fluoroforen. De fluorescent gelabelde imagerstreng kan ten minste één fluorofoor bevatten. Zowel de reporteroligonucleotiden als de signaleringsoligonucleotiden kunnen een haarspeld secundaire structuur bezitten.

[0078] In één belichaming is de complementaire oligonucleotide hybridisatie van voorbijgaande aard, met bindtijden in een voldoende lange tijdschaal om een "knipperende" gebeurtenis te veroorzaken.

[0079] In weer een andere belichaming omvat de reportergroep meerdere afzonderlijke signalen

[0080] Voor sommige van de belichamingen van de uitvinding kan een vorm van signaalversterking nuttig zijn. Een dergelijke signaalversterking zorgt voor een goede aflezing van signalen met een lage abundantie of maakt het mogelijk de techniek te gebruiken in minder veeleisende analytische opstellingen, aangezien de behoefte aan dure detectoren en gevoelige aflezing minder groot is. Voorbeelden van dergelijke amplificatiemethoden kunnen op hybridisatie gebaseerd zijn, zoals Hybridization-Chain-Reaction (HCR), SABER of Rolling Circle amplificatie. Afhankelijk van het type versterkt signaal, kan deze versterking voor of na de zwelling worden uitgevoerd. Een ander voorbeeld van signaalversterking is het gebruik van antennekleurstoffen, die het door één kleurstof opgewekte signaal versterken door het oogsten van excitatielicht.

[0081] Een ander type label dat nuttig kan zijn, is een secundair label dat indirect wordt gedetecteerd, bijvoorbeeld via interactie met een primair label, binding aan een receptor of omzetting in een detecteerbaar product door een enzymenkatalysator of een andere stof. Een voorbeeld van een secundair label is een ligand zoals biotine of analogen daarvan, dat kan worden gedetecteerd via binding aan een receptor zoals avidine, streptavidine of analogen daarvan.

Andere nuttige liganden zijn epitopen die zich kunnen binden aan receptoren zoals antilichamen of actieve fragmenten daarvan, en koolhydraten die zich kunnen binden aan receptoren zoals lectines.

De receptoren kunnen worden gelabeld, bijvoorbeeld met een optisch label, zodat ze kunnen worden gedetecteerd.

In bijzondere toepassingen kan het ligand op zodanige wijze aan een nucleotide-analoog worden gehecht dat de affiniteit voor een receptor wordt verminderd of verhinderd.

Het vrijkomen van het ligand kan dan worden gedetecteerd op basis van de affiniteit van het ligand voor zijn respectieve receptor wanneer het wordt losgemaakt van het nucleotide-analoog.

Het ligand kan verder worden gekoppeld aan een blokkerende groep of kan zelf als blokkerende groep fungeren, zoals hierboven meer in het algemeen is uiteengezet voor labelgroepen.

Aldus kan verwijdering van het ligand van een nucleotide-analoog functioneren om het nucleotide-analoog te deblokkeren en een detecteerbare gebeurtenis te verschaffen.

Voorbeelden

[0082] Voorbeeld 1

Lambda faag-DNA wordt geïncubeerd met in de aanwezigheid van Product 1 (Afbeelding 4) bij 55°C gedurende 60 minuten. Het DNA wordt gedeponeerd op een polymeeroppervlak in overeenstemming met literatuurvoorbeelden (Kaykov et al. Sci Rep 6, 19636 (2016)). Het oppervlak wordt bedekt met een polymerisatiemengsel (waterige oplossing van natriumacrylaat, bisacrylamide, TEMED en APTS, in lijn met standaard literatuurrecepten), en polymerisatie wordt gedurende 40 minuten uitgevoerd. De polymere gel wordt voorzichtig losgemaakt van het substraat en laat men gedurende 30 minuten bij 37°C incuberen in een oplossing die TAMRA-DBCO (Jena Biosciences) in PBS bevat. De gel wordt uitgebreid gewassen met PBS, gevolgd door opzwellen in dubbel gedestilleerd water gedurende een nacht. De opgezwollen gel wordt op een dekglaasje gemonteerd en belicht. De lineaire kenmerken worden geanalyseerd in overeenstemming met de literatuur (Torche PC, PLoS ONE 12(6): e0179041) om het sequentiespecifieke signaal bloot te leggen.

Claims

Conclusies

1. Een methode voor het karakteriseren van biopolymeren, de methode bestaande uit : ij) Enten van de combinatie van een gelineariseerd biopolymeer en biopolymeerplaats- specifieke markers op een polymeer ii) Vergroting van de ruimtelijke dimensies van het polymeer langs de linearisatie-as iii) Verkrijgen van positionele informatie van de plaats-specifieke labels

2. De methode volgens conclusie 1 waar het vergroten van de ruimtelijke dimensies van het polymeer bekomen wordt door de zwelling van een hydrogel

3. De methode volgens conclusie 1 waar het vergroten van de ruimtelijke dimensies van het polymeer bekomen wordt door uitoefen van een kracht op het polymeer

4. De methode volgens conclusie 1 waar het biopolymeer een polynucleotide is

5. De methode volgens conclusie 2 waar het biopolymeer DNA is

6. De methode volgens conclusie 2 waar het biopolymeer RNA is

7. De methode volgens conclusie 2 waar de positionele informatie bekomen wordt door fluorescentie microscopie

8. De methode volgens conclusie 7 waar deze toepast wordt ter identificatie van de origine van het biopolymeer

9. De methode volgens conclusie 7 waar deze toegepast wordt in cellulaire analyse

10. De methode volgens conclusie 7 waar deze wordt toegepast in de identificatie of behandeling van een ziekte