ES2936079T3 - Matriz que incluye cebador de secuenciación y entidad no secuenciador - Google Patents

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Abstract

Un ejemplo de matriz incluye un soporte que incluye una pluralidad de pocillos discretos, un material de gel colocado en cada uno de los pocillos discretos, un cebador de secuenciación injertado en el material de gel y una entidad no secuenciadora injertada en el material de gel. Cada uno de los cebadores de secuenciación y la entidad de no secuenciación está en su forma injertada. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Matriz que incluye cebador de secuenciación y entidad no secuenciador
Antecedentes
Las matrices biológicas se encuentran entre una amplia gama de herramientas utilizadas para detectar y analizar moléculas, incluidos ácido desoxirribonucleico (ADN) y ácido ribonucleico (ARN). En estas aplicaciones, las matrices se diseñan para incluir sondas para secuencias de nucleótidos presentes en genes en seres humanos y otros organismos. En determinadas aplicaciones, por ejemplo, las sondas de ADN y ARN individuales se pueden unir en ubicaciones pequeñas en una disposición geométrica reticular (o aleatoriamente) en un soporte de matriz. Una muestra de prueba, por ejemplo, de una persona u organismo conocido, puede exponerse a la disposición reticular, de modo que los fragmentos complementarios se hibriden con las sondas en los sitios individuales en la matriz. La matriz puede examinarse entonces explorando frecuencias específicas de luz sobre los sitios para identificar qué fragmentos están presentes en la muestra, por fluorescencia de los sitios en los que se han hibridado los fragmentos.
Las matrices biológicas se pueden usar para la secuenciación genética. En general, la secuenciación genética implica determinar el orden de los nucleótidos o ácidos nucleicos en una longitud de material genético, tal como un fragmento de ADN o ARN. Se están analizando secuencias cada vez más largas de pares de bases, y la información de secuencia resultante puede usarse en varios métodos bioinformáticos para ajustar lógicamente los fragmentos entre sí para determinar de manera confiable la secuencia de longitudes extensas de material genético a partir de la cual se derivaron los fragmentos. Se ha desarrollado un examen automatizado e informático de fragmentos característicos, que se han utilizado en cartografía genómica, identificación de genes y su función, evaluación de los riesgos de determinadas afecciones y estados de enfermedad, etc. Más allá de estas aplicaciones, los conjuntos biológicos se pueden utilizar para la detección y evaluación de una amplia gama de moléculas, familias de moléculas, niveles de expresión genética, polimorfismos de un solo nucleótido y genotipificación.
Los siguientes documentos pueden ser útiles para comprender la presente invención. US2009118128A1 se refiere a métodos para generar plantillas para una reacción de secuenciación de ácido nucleico que comprenden: proporcionar al menos una molécula de ácido nucleico bicatenario, en donde ambas cadenas de la molécula de ácido nucleico bicatenario se unen a un soporte sólido en el extremo 5', escindir una o ambas cadenas de la molécula de ácido nucleico bicatenario y someter la o las cadenas escindidas a condiciones de desnaturalización para eliminar la parte de la o las cadenas escindidas no unidas al soporte sólido, generando de este modo una plantilla monocatenaria parcialmente o sustancialmente monocatenaria para una reacción de secuenciación de ácido nucleico. WO2013063382A2A describe una micromatriz diseñada para capturar una o más moléculas de interés en cada uno de una pluralidad de sitios en un sustrato. Los sitios comprenden almohadillas de base, tales como almohadillas de base de polímero, que promueven la unión de las moléculas en los sitios. La micromatriz puede fabricarse mediante una o más técnicas de modelado para crear una disposición de almohadillas de base en un patrón deseado. Además, las micromatrices pueden incluir características para fomentar la clonalidad en los sitios. WO03049677A2 proporciona capas de permeación de hidrogel de polímero sintético para su uso en dispositivos de matriz electrónica activa para ensayos biológicos. Las capas de permeación tienen un carácter poroso definido, con mesoporos en un rango de tamaños entre aproximadamente 100 nanómetros y aproximadamente 1000 nanómetros, y también pueden tener microporos en el rango de tamaños micrométricos. Además, también se incluyen capas de permeación de hidrogel de polímero sintético que contienen sitios de unión copolimerizados para sondas de ácido nucleico u otras biomoléculas.
Resumen
Un ejemplo de una matriz incluye un soporte que incluye una pluralidad de pocillos diferenciados, un material de gel colocado en cada uno de los pocillos diferenciados, un cebador de secuenciación injertado al material de gel y una entidad no secuenciadora injertada al material de gel. Cada uno del cebador de secuenciación y la entidad no secuenciadora está en su forma injertada.
Otro ejemplo de la matriz incluye un soporte que incluye una pluralidad de pocillos diferenciados, un material de gel colocado en cada uno de los pocillos diferenciados, un cebador de secuenciación injertado al material de gel y un espaciador injertado al material de gel. El espaciador se selecciona del grupo que consiste en un dendrímero, polidextrano, metacriloíloxietilfosforilcolina, poli(etilenglicol), poli(etilenimina), poli-L-lisina, metacrilato de propargilo, poli(metilmetacrilato), poli(N-isopropilacrilamida), acrilato de poli(etilenglicol), poli(propilenimina), poli(alcohol vinílico), poli(2-etil-2-oxazolina), ácido poliacrílico, poli(éster trolox) y combinaciones de los mismos.
En un ejemplo de un método, un gel se coloca en cada uno de una pluralidad de pocillos diferenciados de un soporte, un cebador de secuenciación se injerta al material de gel; y se injerta una entidad no secuenciadora al material de gel.
Breve descripción de los dibujos
Las características y ventajas de los ejemplos de la presente descripción se harán evidentes mediante referencia a la siguiente descripción detallada y dibujos, en los que los números de referencia similares corresponden a componentes similares, aunque quizás no idénticos. En aras de la brevedad, los números de referencia o las características cuya función ya se haya descrito anteriormente podrán o no describirse en relación con otros dibujos en los que aparezcan.
La Fig. 1 es una representación esquemática de una matriz ilustrativa según la presente descripción, que ilustra la disposición general de la matriz y detalla la disposición de sitios individuales;
las Figs. 2A a 2D son vistas transversales que en conjunto ilustran un ejemplo del método descrito en la presente memoria;
la Fig. 3 es una vista en corte ampliada, en perspectiva, de uno de los sitios individuales mostrados en las Figs. 1 y 2D;
la Fig. 4 es un gráfico que representa, en un ejemplo, los resultados del quality control (control de calidad - QC) de tetracloro fluoresceína (TET), en términos de intensidad, para carriles que incluyen diferentes relaciones molares de un cebador no secuenciador a un cebador secuenciador;
la Fig. 5 es un gráfico que representa, en un ejemplo, la Intensidad C1A de lectura 2 para diferentes relaciones molares de un cebador no secuenciador a un cebador de secuenciación;
las Figs.6A y 6B son gráficos que representan, en un ejemplo, el porcentaje de clústers que pasan a través de un filtro para diferentes relaciones molares de una entidad no secuenciadora de cadena polimérica a un cebador de secuenciación; y
las Figs. 7A y 7B son gráficos que representan, en un ejemplo, el porcentaje de salto de almohadilla para diferentes relaciones molares de una entidad no secuenciadora de cadena polimérica a un cebador de secuenciación.
introducción
En un primer aspecto de la matriz descrita en la presente memoria, la matriz comprende un soporte que incluye una pluralidad de pocillos diferenciados, un material de gel colocado en cada uno de los pocillos diferenciados, un cebador de secuenciación injertado al material de gel y una entidad no secuenciadora injertada al material de gel, estando cada uno del cebador de secuenciación y la entidad no secuenciadora en su forma injertada.
En el primer aspecto de la matriz, una relación molar de la entidad no secuenciadora con respecto al cebador de secuenciación varía de aproximadamente 0,25:1 a aproximadamente 5:1.
En un ejemplo del primer aspecto de la matriz, la entidad no secuenciadora se selecciona del grupo que consiste en un dendrímero, polidextrano, metacriloxietilfosforilcolina, poli(etilenglicol), poli(etilenimina), poli-L-lisina, metacrilato de propargilo, poli(metilmetacrilato), poli(N-isopropilacrilamida), acrilato de poli(etilenglicol), poli(propilenimina), poli(alcohol vinílico), poli(2-etil-2-oxazolina), ácido poliacrílico, poli(éster trolox), un péptido y un cebador no funcional. La entidad no secuenciadora se injerta al material de gel a través de un grupo funcional terminal. En algunos ejemplos, el grupo funcional se selecciona del grupo que consiste en un alquino, un norbornilo, un resto de química clic exento de cobre y un tiol. Como ejemplo en este primer aspecto, la entidad no secuenciadora es el cebador no funcional, y el cebador no funcional es poliT o poliA. Como otro ejemplo en este primer aspecto, la entidad no secuenciadora es poli(etilenglicol) que tiene un peso molecular que varía de aproximadamente 0,5 KDa a menos de aproximadamente 10 KDa.
En otro ejemplo del primer aspecto de la matriz, la entidad no secuenciadora incluye una entidad de unión y un atenuador de estado de triplete o un antioxidante unido a la entidad de unión. En algunos ejemplos, la entidad de unión se selecciona del grupo que consiste en un dendrímero, polidextrano, metacriloíloxietilfosforilcolina, poli(etilenglicol), poli(etilenimina), poli-L-lisina, metacrilato de propargilo, poli(metilmetacrilato), poli(N-isopropilacrilamida), acrilato de poli(etilenglicol), poli(propilenimina), poli(alcohol vinílico), poli(2-etil-2-oxazolina), ácido poliacrílico y poli(éster trolox). En algunos ejemplos de este aspecto, el atenuador de estado de triplete se selecciona del grupo que consiste en ciclooctiltetraeno (COT), Trolox y alcohol nitrobencílico (NBA); y en algunos ejemplos, el antioxidante se selecciona del grupo que consiste en ascorbato, glutatión, ácido gálico, catequina, Trolox y vitamina E.
En otro ejemplo del primer aspecto de la matriz, la entidad no secuenciadora incluye una entidad de unión y un donador de fluorescence resonance energy transfer (transferencia de energía de resonancia de fluorescencia - FRET) unido a la entidad de unión. En algunos ejemplos, la entidad de unión se selecciona del grupo que consiste en un dendrímero, polidextrano, metacriloíloxietilfosforilcolina, poli(etilenglicol), poli(etilenimina), poli-L-lisina, metacrilato de propargilo, poli(metilmetacrilato), acrilato de poli(etilenglicol), poli(propilenimina), poli(alcohol vinílico), poli(2-etil-2-oxazolina), ácido poliacrílico y poli(éster trolox). En algunos ejemplos de este aspecto, el donador de FRET se selecciona del grupo que consiste en un tinte donador para FRET con un tinte emisor en verde y un tinte donador para FRET con un tinte emisor en rojo.
Debe entenderse que cualquier característica del primer aspecto de la matriz puede combinarse de manera conjunta de cualquier modo y/o configuración deseable.
En un segundo aspecto de la matriz descrito en la presente memoria, la matriz comprende un soporte que incluye una pluralidad de pocillos diferenciados, un material de gel colocado en cada uno de los pocillos diferenciados, un cebador de secuenciación injertado al material de gel y un espaciador injertado al material de gel. En algunos ejemplos, seleccionándose el espaciador del grupo que consiste en un dendrímero, polidextrano, metacriloíloxietilfosforilcolina, poli(etilenglicol), poli(etilenimina), poli-L-lisina, metacrilato de propargilo, poli(metilmetacrilato), acrilato de poli(etilenglicol), poli(propilenimina), poli(alcohol vinílico), poli(2-etil-2-oxazolina), ácido poliacrílico, poli(éster trolox) y combinaciones de los mismos.
En el segundo aspecto de la matriz, una relación molar del espaciador con respecto al cebador de secuenciación varía de aproximadamente 0,25:1 a aproximadamente 5:1.
Un ejemplo del segundo aspecto de la matriz comprende además un inactivador de estado de triplete, un antioxidante o un donador de fluorescence resonance energy transfer (transferencia de energía de resonancia de fluorescencia -FRET) unido al espaciador. En algunos ejemplos de este aspecto, el atenuador de estado de triplete se selecciona del grupo que consiste en ciclo-octiltetraeno (COT), Trolox y alcohol nitrobencílico (NBA). En algunos ejemplos de este aspecto, el antioxidante se selecciona del grupo que consiste en ascorbato, glutatión, ácido gálico, catequina, Trolox y vitamina E. En algunos ejemplos de este aspecto, el donador de FRET se selecciona del grupo que consiste en un tinte donador de FRET con un tinte emisor en verde y un tinte donador de FRET con un tinte emisor en rojo.
En un ejemplo del segundo aspecto de la matriz, el espaciador se injerta al material de gel a través de un grupo funcional terminal. En algunos ejemplos, el grupo funcional se selecciona del grupo que consiste en un alquino, un norbornilo, un resto de química clic exento de cobre y un tiol.
Debe entenderse que cualquier característica del segundo aspecto de la matriz puede combinarse de cualquier manera deseable. Además, debe entenderse que toda combinación de características del primer aspecto y/o segundo aspecto puede usarse de manera conjunta, y/o que toda característica de uno o ambos de estos aspectos puede combinarse con cualquiera de los ejemplos descritos en la presente memoria.
Un aspecto del método comprende colocar un material de gel en cada uno de una pluralidad de pocillos diferenciados de un soporte, injertar un cebador de secuenciación con el material de gel e injertar una entidad no secuenciadora al material de gel.
En un ejemplo de este aspecto del método, el cebador de secuenciación se injerta al material de gel antes o después de injertar la entidad no secuenciadora al material de gel.
En otro ejemplo de este aspecto del método, el cebador de secuenciación y la entidad no secuenciadora se coinjertan al material de gel. El coinjerto se logra mediante el depósito de una mezcla del cebador de secuenciación y la entidad no secuenciadora en el soporte que tiene el material de gel en el mismo; e incubando el soporte a una temperatura predeterminada.
En este aspecto del método, la entidad no secuenciadora se selecciona del grupo que consiste en un dendrímero, polidextrano, metacriloxietilfosforilcolina, poli(etilenglicol), poli(etilenimina), poli-L-lisina, metacrilato de propargilo, poli(metilmetacrilato), acrilato de poli(etilenglicol), poli(propilenimina), poli(alcohol vinílico), poli(2-etil-2-oxazolina), ácido poliacrílico, poli(éster trolox), un péptido y un cebador no funcional; y la entidad no secuenciadora se injerta al material de gel a través de un grupo funcional terminal. En algunos ejemplos, el grupo funcional terminal se selecciona del grupo que consiste en un alquino, un norbornilo, un resto de química clic exento de cobre y un tiol.
En algunos aspectos del método, la entidad no secuenciadora comprende además un comprende un atenuador de estado de triplete, un antioxidante o un fluorescence resonance energy transfer (donador de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia - FRET) unido a este.
Debe entenderse que cualesquiera características de este aspecto del método pueden combinarse de cualquier manera deseable. Además, debe entenderse que cualquier combinación de características de este aspecto del método puede combinarse con cualesquiera de los aspectos de la matriz y/o cualesquiera de los ejemplos descritos en la presente memoria.
Descripción detallada
Los ejemplos de los conjuntos descritos en la presente memoria incluyen varios sitios, cada uno de los cuales tiene el cebador de secuenciación y la entidad no secuenciadora unida al material de gel. El cebador de secuenciación puede usarse en la unión y amplificación de ácidos desoxirribonucleicos (ADN) o ácidos ribonucleicos (ARN), mientras que la entidad no secuenciadora no participa en la unión o amplificación. Más bien, la entidad no secuenciadora actúa como un espaciador entre los cebadores de secuenciación. El espaciado de los cebadores de secuenciación puede mejorar la amplificación al limitar el obstáculo estérico para las proteínas involucradas en el proceso de amplificación.
Además de actuar como espaciador, la entidad no secuenciadora también puede introducir otras funcionalidades en la matriz. Como ejemplos, la entidad no secuenciadora puede i) limitar la unión no específica de enzimas, proteínas y/u otras moléculas pequeñas al material de gel durante la amplificación y secuenciación; ii) aumentar la hidrofilicidad del material del gel, lo que puede ayudar a prevenir su desintegración en condiciones secas; iii) mejorar las propiedades de fluorescencia de los tintes enlazados al material de gel; y/o iv) combinaciones de i, ii y/o iii. Es más, la entidad no secuenciadora puede ayudar a exponer los cebadores de superficie funcionales de la superficie.
Debe entenderse que los términos utilizados en la presente memoria adoptarán su significado habitual en la técnica correspondiente, a menos que se especifique lo contrario. A continuación se exponen varios términos utilizados en la presente memoria, y sus significados.
Las formas singulares “uno/a” , “un” y “el” incluyen referentes plurales, salvo que el contexto indique claramente lo contrario.
Como se utiliza en la presente memoria, “ alquilo” se refiere a una cadena de hidrocarburos recta o ramificada que está completamente saturada (es decir, no contiene enlaces dobles ni triples). El grupo alquilo puede tener de 1 a 20 átomos de carbono. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, butilo terciario, pentilo, hexilo y similares. Como ejemplo, la designación “ alquilo C1-4” indica que hay de uno a cuatro átomos de carbono en la cadena alquilo, es decir, la cadena alquilo se selecciona del grupo que consiste en metilo, etilo, propilo, iso-propilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo y t-butilo.
Como se utiliza en la presente memoria, “ alquenilo” se refiere a una cadena de hidrocarburo lineal o ramificada que contiene uno o más dobles enlaces. El grupo alquenilo puede tener de 2 a 20 átomos de carbono. Los grupos alquenilo ilustrativos incluyen etenilo, propenilo, butenilo, pentenilo, hexenilo y similares. El grupo alquenilo se puede designar, por ejemplo, como “alquenilo C2-4” , lo que indica que hay de dos a cuatro átomos de carbono en la cadena alquenilo.
Como se utiliza en la presente memoria, “alquinilo” se refiere a una cadena de hidrocarburos recta o ramificada que contiene uno o más enlaces triples. El grupo alquinilo puede tener de 2 a 20 átomos de carbono. El grupo alquinilo se puede designar, por ejemplo, como “alquinilo C2-4” , lo que indica que hay de dos a cuatro átomos de carbono en la cadena alquinilo.
Un grupo funcional “amino” se refiere a un grupo -NR a Rb, donde Ra y Rb se seleccionan cada uno independientemente de hidrógeno, alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 5-10 miembros, tal como se define en la presente memoria.
Como se utiliza en la presente memoria, “arilo” se refiere a un anillo o sistema de anillos aromáticos (es decir, dos o más anillos fusionados que comparten dos átomos de carbono adyacentes) que contienen solo carbono en la cadena principal del anillo. Cuando el arilo es un sistema de anillos, cada anillo del sistema es aromático. El grupo arilo puede tener de 6 a 18 átomos de carbono, lo que puede designarse como C6-18. Los ejemplos de grupos arilo incluyen fenilo, naftilo, azulenilo y antracenilo.
La expresión “forma injertada” se refiere al estado de un cebador y/o una entidad no secuenciadora estando unida al material de gel como resultado del injerto, y sin ninguna alteración. En los ejemplos descritos en la presente memoria, la entidad no secuenciadora en su forma injertada no es susceptible de experimentar secuenciación de a Dn ni de ARN. En otras palabras, desde el momento en el que la entidad no secuenciadora se injerta al material de gel, no se puede secuenciar. Por lo tanto, no es necesario realizar etapas de procesamiento adicionales para hacer que la entidad no secuenciadora no reaccione durante la secuenciación, sino que, cuando se injerta la entidad no secuenciadora, esta no se puede secuenciar.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ unido” se refiere al estado de dos cosas que se unen, sujetan, adhieren, conectan o unen entre sí. Por ejemplo, un ácido nucleico se puede unir a un material, tal como el material de gel, mediante un enlace covalente o no covalente. Un enlace covalente se caracteriza por el intercambio de pares de electrones entre átomos. Un enlace no covalente es un enlace químico que no implica el intercambio de pares de electrones y puede incluir, por ejemplo, enlaces de hidrógeno, enlaces iónicos, fuerzas de van der Waals, interacciones hidrófilas e interacciones hidrófobas.
Un grupo funcional “ azida” o “azido” se refiere a -N3.
Como se utiliza en la presente memoria, “carbociclilo” significa un anillo o sistema de anillos cíclicos no aromático/s que contiene solo átomos de carbono en la cadena principal del sistema de anillo. Cuando el carbociclilo es un sistema de anillo, se pueden unir dos o más anillos de forma fusionada, por puentes o conectada en espiral. Los carbociclilos pueden tener cualquier grado de saturación, siempre que al menos un anillo en un sistema de anillos no sea aromático. Por lo tanto, los carbociclilos incluyen cicloalquilos, cicloalquenilos y cicloalquinilos. El grupo carbociclilo puede tener de 3 a 20 átomos de carbono (es decir, C3-20). Los ejemplos de anillos carbociclilo incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, ciclohexenilo, 2,3-dihidro-indeno, biciclo[2.2.2]octanilo, adamantilo y espiro[4.4]nonanilo.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ácido carboxílico” o “carboxilo” como se utiliza en la presente memoria se refiere a -C(O)OH.
Como se utiliza en la presente memoria, “cicloalquilo” significa un anillo o sistema de anillos carbociclilo completamente saturado. Los ejemplos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo y ciclohexilo.
Como se utiliza en la presente memoria, “cicloalquileno” significa un anillo o sistema de anillos carbociclilo completamente saturado que está unido al resto de la molécula a través de dos puntos de unión.
Como se utiliza en la presente memoria, “cicloalquenilo” o “cicloalqueno” significa un anillo o sistema de anillos carbociclilo que tiene/n al menos un enlace doble, en donde ningún anillo en el sistema de anillos es aromático. Los ejemplos incluyen ciclohexenilo o ciclohexeno y norborneno o norbornenilo. Como se utiliza en la presente memoria, “heterocicloalquenilo” o “ heterocicloalqueno” significa un anillo o sistema de anillos carbociclilo con al menos un heteroátomo en la cadena principal del anillo, que tiene al menos un enlace doble, en donde ningún anillo en el sistema de anillos es aromático.
Como se utiliza en la presente memoria, “cicloalquinilo” o “cicloalquino” significa un anillo o sistema de anillos carbociclilo que tiene/n al menos un enlace triple, en donde ningún anillo en el sistema de anillos es aromático. Un ejemplo es ciclooctino. Otro ejemplo es biciclononina. Como se utiliza también en la presente memoria, “ heterocicloalquinilo” o “ heterocicloalquino” significa un anillo o sistema de anillos carbociclilo con al menos un heteroátomo en la cadena principal del anillo, que tiene al menos un enlace triple, en donde ningún anillo en el sistema de anillos es aromático.
El término “depósito” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a cualquier técnica de aplicación adecuada, que puede ser manual o automatizada. Generalmente, el depósito se puede realizar utilizando técnicas de deposición de vapor, técnicas de recubrimiento, técnicas de injerto o similares. Algunos ejemplos específicos incluyen chemical vapor deposition (deposición química de vapor - CVD), recubrimiento por pulverización, recubrimiento por centrifugado, recubrimiento por baño o inmersión, dispensación de charcos o similares.
El término “cada uno” , cuando se utiliza en referencia a una colección de artículos, pretende identificar un artículo individual en la colección, pero no se refiere necesariamente a cada artículo de la colección. Puede haber excepciones si la descripción explícita o el contexto claramente dictan lo contrario.
El “potenciador de fluorescencia” es cualquier molécula que puede mejorar una propiedad de fluorescencia o que puede disminuir el daño fotoinducido. Por ejemplo, el potenciador de fluorescencia puede ser un antioxidante que mejora la fotoestabilidad de un tinte de fluorescencia (o fully functional nucleotide (nucleótido completamente funcional - FFN) incorporado en el proceso de sequencing by synthesis (secuenciación por síntesis - SBS)). Para otro ejemplo, el potenciador de fluorescencia puede ser un donador de fluorescence resonance energy transfer (transferencia de energía de resonancia de fluorescencia - FRET), que absorbe energía en una región del espectro de absorción y dona energía para excitar tintes (p. ej., que pueden unirse a nucleótido/s) en otra región. El donador de FRET puede ser un tinte donador de FRET con el tinte incorporado y detectado en un flujo de trabajo de sequencing by synthesis (secuenciación por síntesis - SBS). Para otro ejemplo, el potenciador de fluorescencia puede ser un atenuador de estado de triplete que puede mitigar el daño fotoinducido (p. ej., a ácidos nucleicos) que puede ser causado por fluoróforos de estado de triplete altamente reactivos. El atenuador de estado de triplete puede acortar la vida útil de un compuesto excitado en un estado de triplete, reduciendo de este modo la cantidad de tiempo que el compuesto en estado de triplete puede causar daño fotoinducido a otro componente unido al material de gel.
Como se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término “ material de gel” signifique un material semirrígido que es permeable a líquidos y gases. Típicamente, el material de gel es un hidrogel que puede hincharse cuando se absorbe el líquido y puede contraerse cuando se retira el líquido por secado.
Como se utiliza en la presente memoria, “ heteroarilo” se refiere a un anillo o sistema de anillos aromáticos (es decir, dos o más anillos fusionados que comparten dos átomos adyacentes) que contiene/n uno o más heteroátomos, es decir, un elemento que no es carbono, incluidos, aunque no de forma limitativa, nitrógeno, oxígeno y azufre, en la cadena principal del anillo. Cuando el heteroarilo es un sistema de anillos, cada anillo en el sistema es aromático. El grupo heteroarilo puede tener 5-18 miembros de anillo.
Como se utiliza en la presente memoria, “ heterociclilo” significa un anillo o sistema de anillos cíclico no aromático que contiene al menos un heteroátomo en la cadena principal del anillo. Los heterociclilos pueden unirse entre sí de forma fusionada, por puentes o conectada a espiro. Los heterociclilos pueden tener cualquier grado de saturación siempre que al menos un anillo en el sistema de anillos no sea aromático. En el sistema de anillos, el/los heteroátomo/s puede/n estar presente/s en un anillo aromático o no aromático. El grupo heterociclilo puede tener de 3 a 20 miembros del anillo (es decir, la cantidad de átomos que conforman la cadena principal del anillo, incluidos átomos de carbono y heteroátomos). El grupo heterociclilo puede designarse como “ heterociclilo de 3-6 miembros” o designaciones similares. En algunos ejemplos, el/los heteroátomo/s son O, N o S.
El término “ hidrazina ” o “ hidrazinilo ” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un grupo -NHNH2.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ hidrazona” o “ hidrazonilo” como se utiliza en la presente
memoria se refiere
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Como se utiliza en la presente memoria, “ hidroxilo” es un grupo -OH.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ región intersticial” se refiere a un área en un sustrato/soporte o en una superficie que separa otras áreas del sustrato o superficie. Por ejemplo, una región intersticial puede separar una característica de una matriz de otra característica de la matriz. Las dos características que están separadas entre sí pueden ser diferenciadas, es decir, carecen de contacto entre sí. En otro ejemplo, una región intersticial puede separar una primera parte de una característica de una segunda parte de una característica. En muchos ejemplos, la región intersticial es continua mientras que las características son diferenciadas, por ejemplo, como es el caso de una pluralidad de pocillos definidos en una superficie de otro modo continua. La separación proporcionada por una región intersticial puede ser una separación parcial o total. Las regiones intersticiales pueden tener un material de superficie que difiere del material de superficie de las características definidas en la superficie. Por ejemplo, las características de una matriz pueden tener una cantidad o concentración de material de gel, cebador/es de secuenciación y entidades no secuenciadoras que exceden la cantidad o concentración presente en las regiones intersticiales. En algunos ejemplos, el material en gel, cebador/es de secuenciación y las entidades no secuenciadoras pueden no estar presentes en las regiones intersticiales.
“Óxido de nitrilo” , como se utiliza en la presente memoria, significa un grupo “ RaCEN+O-” en el que Ra se define previamente en la presente memoria. Los ejemplos de preparación de óxido de nitrilo incluyen la generación in situ a partir de aldoximas mediante tratamiento con cloramida-T o mediante la acción de una base sobre cloruros de imidoilo [RC(Cl)=NOH].
“ Nitrona” , como se utiliza en la presente memoria, significa un grupo “ RaRbC=NRc+O-” en el que Ra y Rb se definen previamente en la presente memoria y Rc se selecciona de alquilo C1-6, alquenilo C2-6, alquinilo C2-6, carbociclilo C3-7, arilo C6-10, heteroarilo de 5-10 miembros y heterociclilo de 5-10 miembros, tal como se define en la presente memoria.
Como se utiliza en la presente memoria, un “ nucleótido” incluye una base heterocíclica que contiene nitrógeno, un azúcar y uno o más grupos fosfato. Los nucleótidos son unidades monoméricas de una secuencia de ácido nucleico. En el ARN, el azúcar es una ribosa, y en el ADN una desoxirribosa, es decir, un azúcar que carece de un grupo hidroxilo que está presente en la posición 2’ en la ribosa. La base heterocíclica que contiene nitrógeno puede ser una base de purina o una base de pirimidina. Las bases de purina incluyen adenina (A) y guanina (G), y derivados modificados o análogos de las mismas. Las bases de pirimidina incluyen citosina (C), timina (T) y uracilo (U) y derivados modificados o análogos de los mismos. El átomo C-1 de la desoxirribosa se une al N-1 de una pirimidina o al N-9 de una purina.
La “entidad no secuenciadora” a la que se hace referencia en la presente memoria puede ser cualquier molécula espectadora que no participe activamente en la síntesis de ADN o ARN. La entidad no secuenciadora se puede utilizar para proporcionar separación entre los cebadores de secuenciación injertados. La entidad no secuenciadora también puede tener otra/s función/funciones, tales como limitar la unión no específica, aumentar la hidrofilicidad del material de gel, mejorar las propiedades de fluorescencia, o combinaciones de estas. Como tal, la entidad no secuenciadora puede ser monofuncional, bifuncional o multifuncional. Los ejemplos de la entidad no secuenciadora incluyen un cebador no funcional, una cadena de polímero, un péptido y/o un potenciador de fluorescencia.
El “cebador no funcional” es cualquier secuencia de ácido nucleico monocatenario que no participará en la síntesis de ADN o ARN. Los ejemplos de cebadores no funcionales incluyen una secuencia poli T o una secuencia poli A. La longitud del cebador no funcional puede seleccionarse de modo que no tenga lugar hibridación no específica. A modo de ejemplo, la longitud del cebador no funcional puede variar de 3 a 10. En algunos casos, la longitud del cebador no funcional es inferior a 10 bases.
La “cadena polimérica” es una molécula compuesta por unas pocas unidades monoméricas repetidas (es decir, un oligómero) o muchas unidades monoméricas repetidas (es decir, un polímero). La cadena polimérica puede ser lineal, ramificada o hiperramificada. Los ejemplos de polímeros ramificados incluyen polímeros de tipo estrella, polímeros de tipo peine, polímeros de tipo cepillo, polímeros dendronizados, escaleras y dendrímeros. En los ejemplos descritos en la presente memoria, la cadena polimérica incluye un grupo funcional terminal en un extremo que puede reaccionar con el material de gel. En algunos casos, el otro extremo de la cadena polimérica puede incluir un grupo funcional terminal que se une a un atenuador de estado de triplete, un antioxidante o un tinte. En estos casos, la cadena polimérica puede funcionar como una entidad de unión, que liga (une) el atenuador de estado de triplete, el antioxidante o el tinte al material de gel.
El “péptido” es una cadena corta de monómeros de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos (amida).
Como se utiliza en la presente memoria, el “cebador de secuenciación” se define como una secuencia de ácido nucleico monocatenario (p. ej., ADN monocatenario o ARN monocatenario) que sirve como punto de partida para la síntesis de ADN o ARN. El extremo 5’ del cebador de secuenciación puede modificarse para permitir una reacción de acoplamiento con un material de gel. La longitud del cebador de secuenciación puede ser cualquier cantidad de bases largas y puede incluir una variedad de nucleótidos no naturales. En un ejemplo, el cebador de secuenciación es una cadena corta, que incluye de 20 bases a 40 bases.
Como se utiliza en la presente memoria, un “sitio” se refiere a una ubicación definida sobre o en un soporte donde se pueden unir el material de gel, el cebador de secuenciación y la entidad no secuenciadora.
Los términos “sustrato” y “soporte” se utilizan indistintamente en la presente memoria, y se refieren a una superficie en la cual o sobre la cual se ubica el sitio. El soporte es generalmente rígido y es insoluble en líquido acuoso. El soporte puede ser inerte a una química que se utiliza para modificar el material de gel. Por ejemplo, un soporte sólido puede ser inerte a los procesos químicos utilizados para unir los cebadores de secuenciación y la entidad no secuenciadora, al material de gel en un método expuesto en la presente memoria. Los ejemplos de soportes adecuados incluyen vidrio y vidrio modificado o funcionalizado, plásticos (incluidos acrílicos, poliestireno y copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, politetrafluoroetileno (PTFE) (tal como TEFLON® de Chemours), olefinas cíclicas/polímeros de cicloolefina (COP) (tal como ZEONOR® de Zeon), poliimidas, etc.), nailon, cerámica, sílice o materiales a base de sílice, silicio y silicio modificado, carbono, metales, vidrios inorgánicos y haces de fibras ópticas.
Como se utilizan en la presente memoria, los términos “tetrazina” y “tetrazinilo” se refieren a un grupo heteroarilo de seis miembros que comprende cuatro átomos de nitrógeno. La tetrazina puede estar opcionalmente sustituida.
“Tetrazol” , como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un grupo heterocíclico de cinco miembros que incluye cuatro átomos de nitrógeno. El tetrazol puede estar opcionalmente sustituido.
El término “grupo funcional terminal” se refiere a un grupo funcional que está suspendido en una entidad no secuenciadora y, por lo tanto, es accesible para la reacción con el material de gel.
Un grupo funcional “tiol” se refiere a -SH.
Como se utiliza en la presente memoria, el término “ pocillo” se refiere a una característica cóncava diferenciada en un soporte que tiene una abertura de superficie que está completamente rodeada por región/regiones intersticial/es de la superficie de soporte. Los pocillos pueden tener cualquiera de una variedad de formas en su abertura en una superficie incluidas, como ejemplos, formas redonda, elíptica, cuadrada, poligonal, de estrella (con cualquier número de vértices), etc. La sección transversal de un pocillo tomada ortogonalmente con la superficie puede ser curva, cuadrada, poligonal, hiperbólica, cónica, angular, etc.
Los aspectos y ejemplos expuestos en la presente memoria y mencionados en las reivindicaciones pueden entenderse en vista de las definiciones anteriores.
Con referencia ahora a la Fig. 1, se ilustra un ejemplo de la matriz 10. En general, la matriz 10 incluye un sustrato o soporte 12 y líneas o canales 14 de flujo a través del soporte 12. Cada uno de los canales 14 de flujo incluye múltiples sitios 16 que están separados entre sí por regiones intersticiales 18. En cada sitio 16, el/los cebador/es 20 de secuenciación y una entidad/entidades no secuenciadora/s 22 se depositan/ y une/n al material de gel (24, 24’, por ejemplo, en la Fig. 2D).
La matriz 10 ilustrada en la Fig. 1 y descrita en la presente descripción puede disponerse o formarse como una parte de una celda de flujo, que es una cámara que incluye una superficie sólida a través de la cual pueden fluir varios fluidos portadores, reactivos, etc. En un ejemplo, la celda de flujo puede incluir la matriz 10 unida a un sustrato superior a través de un material de sellado (p. ej., poliimida negra u otro material de unión adecuado). La unión tiene lugar en regiones de unión del soporte 12, el material de sellado y el sustrato superior. Las regiones de unión pueden estar ubicadas entre los canales de flujo de modo que el material de sellado separe físicamente un canal 14 de flujo de un canal 14 de flujo adyacente (para evitar la contaminación cruzada) y pueden estar ubicadas en la periferia de la celda de flujo (para sellar la celda de flujo frente a la contaminación externa). Debe entenderse, sin embargo, que las regiones de unión y el material de sellado pueden estar ubicados en cualquier región deseada dependiendo de la implementación. La unión se puede lograr mediante unión por láser, unión por difusión, unión anódica, unión eutéctica, unión por activación de plasma, unión por frita de vidrio u otros métodos conocidos en la técnica.
Otros ejemplos de celdas de flujo y sistemas fluídicos relacionados y plataformas de detección que pueden integrarse con la matriz 10 y/o utilizarse fácilmente en los métodos de la presente descripción se describen, por ejemplo, en Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; US 7.057.026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7.329.492; US 7.211.414; US 7.315.019; US 7.405.281, y US 2008/0108082.
En algunas aplicaciones, la celda de flujo se utiliza para realizar reacciones químicas o bioquímicas controladas en un dispositivo de automatización de reacción, tal como en un secuenciador de nucleótidos. Las aberturas 26 se pueden perforar a través del soporte 12. Al conectarse a las aberturas 26, el dispositivo de automatización de reacción puede controlar el flujo de reactivo/s y producto/s en los canales 14 de flujo sellados. El dispositivo de automatización de reacción puede, en algunas aplicaciones, ajustar la presión, temperatura, composición de gas y otras condiciones ambientales de la celda de flujo. Además, en algunas aplicaciones, las aberturas 26 se pueden perforar en el sustrato superior o tanto en el soporte 12 como en el sustrato superior. En algunas aplicaciones, las reacciones que tienen lugar en los canales 14 de flujo sellados se pueden monitorizar a través del sustrato superior y/o el soporte 12 mediante imágenes o mediciones de calor, emisión de luz y/o fluorescencia.
Debe entenderse que la orientación particular de los canales 14 de flujo, los sitios 16, etc. pueden diferir de las ilustradas en la Fig. 1. En algunos ejemplos, los sitios 16 son contiguos y, por lo tanto, no es necesario que estén separados por regiones intersticiales 18.
La matriz 10 de la Fig. 1, y los ejemplos de cómo se puede hacer la matriz 10, se describirán ahora con más detalle en referencia a las Figs. 2A a 2D.
La Fig. 2A representa el soporte 12 que tiene sitios 16 definidos en el mismo y separados por regiones intersticiales 18. Este soporte 12 tiene una superficie estampada. Una “ superficie modelada” se refiere a una disposición de diferentes regiones (es decir, sitios 16) en o sobre una capa expuesta del soporte sólido 12. Por ejemplo, uno o más de los sitios 16 pueden ser características donde están presentes uno o más cebadores 20 de secuenciación (amplificación) y entidades 22 no secuenciadoras. Las características pueden estar separadas por las regiones intersticiales 18, donde los cebadores 20 de secuenciación y las entidades 22 no secuenciadoras no están presentes. Se pueden contemplar muchos diseños diferentes de los sitios 16, incluidos patrones regulares, repetitivos y no regulares. En un ejemplo, los sitios 16 están dispuestos en una disposición reticular hexagonal para un empaquetamiento cerrado y una densidad mejorada. Otros diseños pueden incluir, por ejemplo, diseños rectilíneos (es decir, rectangulares), diseños triangulares, y así sucesivamente. Como ejemplos, el diseño o patrón puede ser un formato x-y de sitios 16 que están en filas y columnas. En algunos otros ejemplos, el diseño o patrón puede ser una disposición repetitiva de sitios 16 y/o regiones intersticiales 18. En todavía otros ejemplos, la disposición o patrón puede ser una disposición aleatoria de sitios 16 y/o regiones intersticiales 18. El patrón puede incluir puntos, almohadillas, pocillos, postes, rayas, remolinos, líneas, triángulos, rectángulos, círculos, arcos, cuadros, cuadrículas, diagonales, flechas, cuadrados y/o tramas. Otros ejemplos de superficies con patrones que se pueden utilizar en los ejemplos establecidos en la presente memoria se describen en las patentes estadounidenses US 8.778.849; US 9.079.148; US 8.778.848; y la publicación de patente de Estados Unidos núm. 2014/0243224.
El diseño o patrón se puede caracterizar con respecto a la densidad de los sitios 16 (es decir, número de sitios 16) en un área definida. Por ejemplo, los sitios 16 pueden estar presentes a una densidad de aproximadamente 2 millones por mm2. La densidad puede ajustarse a diferentes densidades incluidas, por ejemplo, una densidad de al menos aproximadamente 100 por mm2, aproximadamente 1000 por mm2, aproximadamente 0,1 millones por mm2, aproximadamente 1 millón por mm2, aproximadamente 2 millones por mm2, aproximadamente 5 millones por mm2, aproximadamente 10 millones por mm2, aproximadamente 50 millones por mm2 o más. De manera alternativa o adicional, la densidad puede ajustarse de modo que no sea de más que aproximadamente 50 millones por mm2, aproximadamente 10 millones por mm2, aproximadamente 5 millones por mm2, aproximadamente 2 millones por mm2, aproximadamente 1 millón por mm2, aproximadamente 0,1 millones por mm2, aproximadamente 1000 por mm2, aproximadamente 100 por mm2 o menos. Debe entenderse además que la densidad de los sitios 16 en el soporte 12 puede estar entre uno de los valores inferiores y uno de los valores superiores seleccionados de los intervalos anteriores. Como ejemplos, una matriz de alta densidad puede caracterizarse por tener sitios 16 separados por menos de aproximadamente 15 pm, una matriz de densidad media puede caracterizarse por tener sitios 16 separados por aproximadamente 15 pm a aproximadamente 30 pm, y una matriz de baja densidad puede caracterizarse por tener sitios 16 separados por más de aproximadamente 30 pm.
El diseño o patrón puede caracterizarse también o alternativamente en términos de la inclinación promedio, es decir, la separación desde el centro del sitio 16 hasta el centro de una región 18 intersticial adyacente (separación de centro a centro). El patrón puede ser regular de modo que el coeficiente de variación alrededor del espaciado promedio sea pequeño, o el patrón puede ser no regular, en cuyo caso el coeficiente de variación puede ser relativamente grande. En cualquier caso, el espaciado promedio puede ser, por ejemplo, de al menos aproximadamente 10 nm, aproximadamente 0,1 pm, aproximadamente 0,5 pm, aproximadamente 1 pm, aproximadamente 5 pm, aproximadamente 10 pm, aproximadamente 100 pm o más. De manera alternativa o adicional, el espaciado promedio puede ser, por ejemplo, como máximo, de aproximadamente 100 pm, aproximadamente 10 pm, aproximadamente 5 pm, aproximadamente 1 pm, aproximadamente 0,5 pm aproximadamente 0,1 pm o menos. El espaciado promedio para un patrón particular de sitios 16 puede estar entre uno de los valores inferiores y uno de los valores superiores seleccionados de los intervalos anteriores. En un ejemplo, los sitios 16 tienen un espaciado (separación de centro a centro) de aproximadamente 1,5 pm.
En algunos ejemplos, los sitios 16 son pocillos 16’ y, por lo tanto, el soporte 12 incluye una matriz de pocillos 16’ en una de sus superficies. Los pocillos 16’ (u otros sitios 16 con diferentes configuraciones, tales como forma, sección transversal, etc.) se pueden fabricar usando una variedad de técnicas, incluidas, por ejemplo, fotolitografía, litografía de nanoimpresión, técnicas de estampado, técnicas de gofrado, técnicas de moldeo, técnicas de micrograbado, técnicas de impresión, etc. Como apreciarán los expertos en la técnica, la técnica utilizada dependerá de la composición y forma del soporte 12.
Los pocillos 16’ pueden ser micropocillos (que tienen al menos una dimensión en la escala micrométrica, p. ej., de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 1000 pm) o nanopocillos (que tienen al menos una dimensión en la nanoescala, p. ej., de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 1000 nm). Cada pocillo 16’ puede caracterizarse por su volumen, área de apertura de pocillo, profundidad y/o diámetro.
Cada pocillo 16’ puede tener cualquier volumen que permita confinar un líquido. El volumen mínimo o máximo se puede seleccionar, por ejemplo, para acomodar el rendimiento (p. ej., multiplexidad), resolución, composición de analito o reactividad de analito esperada para usos posteriores de la matriz 10. Por ejemplo, el volumen puede ser al menos aproximadamente 1x10-3 pm3, aproximadamente 1x10-2 pm3, aproximadamente 0,1 pm3, aproximadamente 1 pm3, aproximadamente 10 pm3, aproximadamente 100 pm3 o más. De manera alternativa o adicional, el volumen puede ser como máximo aproximadamente 1x104 pm3, aproximadamente 1x103 pm3, aproximadamente 100 pm3, aproximadamente 10 pm3, aproximadamente 1 pm3, aproximadamente 0,1 pm3 o menos. Debe entenderse que el material 24 de gel puede llenar todo o parte del volumen de un pocilio 16’. El volumen del material 24 de gel en un pocilio individual 16’ puede ser mayor que, menor que o estar situado entre los valores especificados anteriormente.
El área ocupada por cada abertura de pocillo en una superficie se puede seleccionar en función de criterios similares a los establecidos anteriormente para el volumen del pocillo. Por ejemplo, el área para cada abertura de pocillo en una superficie puede ser de al menos aproximadamente 1x10-3 pm2, aproximadamente 1x10-2 pm2, aproximadamente 0,1 pm2, aproximadamente 1 pm2, aproximadamente 10 pm2, aproximadamente 100 pm2 o más. De manera alternativa o adicional, el área puede ser como máximo aproximadamente 1x103 pm2, aproximadamente 100 pm2, aproximadamente 10 pm2, aproximadamente 1 pm2, aproximadamente 0,1 pm2, aproximadamente 1x10-2 pm2 o menos.
La profundidad de cada pocillo 16’ puede ser de al menos aproximadamente 0,1 pm, aproximadamente 1 pm, aproximadamente 10 pm, aproximadamente 100 pm o más. De manera alternativa o adicional, la profundidad puede ser como máximo aproximadamente 1x103 pm, aproximadamente 100 pm, aproximadamente 10 pm, aproximadamente 1 pm, aproximadamente 0,1 pm o menos.
En algunos casos, el diámetro de cada pocillo 16’ puede ser al menos aproximadamente 50 nm, aproximadamente 0,1 pm, aproximadamente 0,5 pm, aproximadamente 1 pm, aproximadamente 10 pm, aproximadamente 100 pm o más. De manera alternativa o adicional, el diámetro puede ser como máximo aproximadamente 1x103 pm, aproximadamente 100 pm, aproximadamente 10 pm, aproximadamente 1 pm, aproximadamente 0,5 pm, aproximadamente 0,1 pm, aproximadamente 50 nm o menos.
En el conjunto 10 que se forma, el material 24 de gel se coloca en cada uno de los pocillos separados 16’. La colocación del material 24 de gel en cada pocillo 16’ se puede lograr recubriendo primero la superficie modelada del soporte 12 con el material 24 de gel, como se muestra en la Fig. 2B, y a continuación retirando el material 24 de gel, por ejemplo, mediante pulido químico o mecánico, de al menos las regiones intersticiales 18 en la superficie del soporte estructurado 12 entre los pocillos 16’. En algunos ejemplos, el material de gel puede retirarse de las regiones intersticiales mediante etapas de lavado que no requieren pulido químico o mecánico. Estos procesos retienen al menos parte del material 24 de gel en los pocillos 16’, pero retiran o inactivan al menos sustancialmente todo el material 24 de gel de las regiones intersticiales 18 en la superficie del soporte estructurado 12 entre los pocillos 16’. Por lo tanto, estos procesos crean almohadillas 24’ de gel (Fig. 2D) utilizadas para la secuenciación que pueden ser estables durante las tandas de secuenciación con una gran cantidad de ciclos. En otros ejemplos, el material 24 de gel se coloca en cada pocillo 16’ mediante técnicas de deposición selectiva que tampoco requieren etapas de pulido químico o mecánico para retirar el material de gel de las regiones intersticiales.
Los materiales 24 de gel particularmente útiles se ajustarán a la forma del sitio 16 donde reside. Algunos materiales 24 de gel útiles pueden tanto (a) ajustarse a la forma del sitio 16 (p. ej., el pocillo 16’ u otra característica cóncava) donde reside como (b) tener un volumen que no exceda al menos sustancialmente el volumen del sitio 16 donde reside.
Un ejemplo de un material 24 de gel adecuado incluye un polímero con una unidad recurrente de Fórmula (I):
Figure imgf000010_0001
en donde:
R1 es H o alquilo opcionalmente sustituido;
se selecciona del grupo que consiste en azido, amino opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, hidrazona opcionalmente sustituida, hidrazina opcionalmente sustituida, carboxilo, hidroxilo, tetrazol opcionalmente sustituido, tetrazina opcionalmente sustituida, óxido de nitrilo, nitrona y tiol; R5 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo opcionalmente sustituido;
cada uno de los -(CH2)p- puede ser sustituido en forma opcional;
p es un número entero en el rango de 1 a 50;
n es un número entero en el rango de 1 a 50.000; y
m es un número entero en el rango de 1 a 100.000.
Los polímeros adecuados como la Fórmula (I) se describen, por ejemplo, en la publicación de patente estadounidense n. ° 2014/0079923 A1 o 2015/0005447 A1.
En la estructura de la Fórmula (I), un experto en la técnica entenderá que las subunidades “ n” y “ m” son subunidades recurrentes que están presentes en un orden aleatorio a lo largo del polímero.
Son ejemplos específicos de un recubrimiento de polímero tal como la Fórmula (I) la poli(N-(5-azidoacetamidilpentil) acrilamida-co-acrilamida (PAZAM), descrita, por ejemplo, en las publicaciones de patente de Estados Unidos n.° 2014/0079923 A1, o 2015/0005447 A1, que comprende la estructura que se muestra a continuación:
Figure imgf000011_0001
en donde n es un número entero en el intervalo de 1-20.000, y m es un número entero en el intervalo de 1-100.000. Al igual que con la Fórmula (I), un experto en la técnica reconocerá que las subunidades “ n” y “ m” son unidades recurrentes que están presentes en orden aleatorio en toda la estructura de polímero.
El peso molecular del polímero de Fórmula (I) o polímero de PAZAM puede variar de aproximadamente 10 kDa a aproximadamente 1500 kDa, o puede ser, en un ejemplo específico, aproximadamente 312 kDa.
En algunos ejemplos, el polímero de Fórmula (I) o el polímero de PAZAM es un polímero lineal. En algunas otras realizaciones, el polímero de Fórmula (I) o de PAZAM es un polímero ligeramente reticulado. En otros ejemplos, el polímero de Fórmula (I) o de PAZAM comprende ramificación. Otros polímeros adecuados son copolímeros de SFA y SFA derivatizados con un grupo bromo-acetamida (p. ej., BRAPA), o copolímeros de SFA y SFA derivatizada con un grupo azido-acetamida.
Otros ejemplos de materiales 24 de gel adecuados incluyen los que tienen una estructura coloidal, tal como agarosa; o una estructura de trama polimérica, tal como gelatina; o una estructura de polímero reticulado, tal como polímeros y copolímeros de poliacrilamida, acrilamida exenta de silano (SFA, véase, por ejemplo, la publicación de patente estadounidense n.° 2011/0059865,
o una versión azidolizada de SFA. Los ejemplos de polímeros de poliacrilamida adecuados pueden formarse a partir de acrilamida y un ácido acrílico o un ácido acrílico que contiene un grupo vinilo como se describe, por ejemplo, en WO 2000/031148 o a partir de monómeros que forman reacciones de foto-cicloadición [2+2], por ejemplo, como se describe en WO 2001/001143 o WO 2003/0014392.
El material 24 de gel puede ser un material de gel formado previamente. Los materiales de gel formados previamente se pueden recubrir usando recubrimiento de centrifugado, o inmersión, o flujo del gel bajo presión positiva o negativa, o técnicas establecidas en la patente estadounidense US 9.01 2022.
La inmersión o recubrimiento por inmersión puede ser una técnica de deposición selectiva, dependiendo del soporte 12 y el material 24 de gel que se utilizan. Como ejemplo, el soporte 12 con patrón se sumerge en un material 24 de gel formado previamente, y el material 24 de gel puede llenar los sitios 16 de forma selectiva (es decir, el material 24 de gel no se deposita en las regiones intersticiales 18), y el pulido (u otro proceso de eliminación) puede no ser necesario. El polímero preformado o la PAZAM se puede recubrir en el soporte 12 con patrón usando recubrimiento de centrifugado, o inmersión, o flujo del gel bajo presión positiva o negativa, o técnicas establecidas en la patente estadounidense US 9.012.022. La unión del polímero o PAZAM también puede tener lugar a través de una polimerización radical de transferencia de átomos iniciada en la superficie (SI-ATRP) a una superficie silanizada. En este ejemplo, la superficie 12 de soporte se puede pretratar con APTS (metoxi o etoxi silano) para enlazar de forma covalente el silicio a uno o más átomos de oxígeno en la superficie (sin la intención de mantenimiento mediante mecanismo, cada silicio se puede enlazar a uno, dos o tres átomos de oxígeno). Esta superficie tratada químicamente se hornea para formar una monocapa de grupo amina. Los grupos amina se hacen reaccionar a continuación con Sulfo-HSAB para formar un derivado azido. La activación por UV a 21 °C con 1 J/cm2 a 30 J/cm2 de energía genera una especie de nitreno activa, que puede experimentar fácilmente una variedad de reacciones de inserción con la PAZAM.
Otros ejemplos para recubrir PAZAM en el soporte 12 se describen en la publicación de patente estadounidense n.° 2014/0200158, e
incluyen enlace mediado por ultravioleta (UV) de monómeros de PAZAM a una superficie funcionalizada con amina, o una reacción de enlace térmico que implica un grupo activo (cloruro de acriloílo u otra molécula que contiene alqueno o alquino) con depósito posterior de PAZAM y aplicación de calor. En algunos ejemplos, la superficie se modifica con grupos alquenilo o cicloalquenilo, que a continuación pueden reaccionar con polímeros funcionalizados con azido tales como PAZAM o los que comprenden SFA derivatizada con azido, en condiciones tales como procesos químicos clic, para formar enlaces covalentes entre la superficie modificada y el polímero.
En otros ejemplos, la PAZAM se puede depositar en el soporte 12, que incluye, en su superficie, un silano o derivado de silano que se puede unir a un grupo funcional de la PAZAM. Por ejemplo, el silano o derivado de silano puede contener un resto insaturado (p. ej., cicloalquenos, cicloalquinos, heterocicloalquenos, heterocicloalquinos, variantes sustituidas de los mismos y combinaciones de los mismos) que puede unirse covalentemente a un grupo funcional de la PAZAM. Los ejemplos de restos insaturados de cicloalqueno incluyen norborneno, un derivado de norborneno (p. ej., un (hetero)norborneno que incluye un oxígeno o nitrógeno en lugar de uno de los átomos de carbono), transcicloocteno, derivados de transcicloocteno, transciclopenteno, transciclohepteno, transciclononeno, biciclo[3.3.1]non-1-eno, biciclo[4.3.1]dec-1 (9)-eno, biciclo [4.2.1]non-1 (8)-eno y biciclo[4.2.1]non-1-eno. Cualquiera de estos cicloalquenos se puede sustituir como se describe en la publicación de patente estadounidense n.° 2015/0005447.
Un ejemplo del derivado de norborneno incluye [(5-biciclo[2.2.1]hept-2-enil)etil]trimetoxisilano. Los ejemplos de restos insaturados de cicloalquino incluyen ciclooctino, un derivado de ciclooctino o biciclonononinos (p. ej., biciclo[6.1.0]non-4-ino o derivados de este, biciclo[6.1.0]non-2-ino o biciclo[6.1.0]non-3-ino). Estos cicloalquinos también se pueden sustituir como se describe en la publicación de patente estadounidense n.° 2015/0005447.
En estos ejemplos, la PAZAM se puede depositar en la superficie del soporte silanizado 12 usando recubrimiento de centrifugado, o inmersión o recubrimiento por inmersión, o flujo de la molécula funcionalizada bajo presión positiva o negativa, o técnicas establecidas en la patente US 9.012.022. Para la deposición, la PAZAM puede estar presente en una solución (p. ej., una mezcla de etanol y agua). Después de ser depositada, la solución de PAZAM también se puede exponer a un proceso de curado para formar el material 24 de gel.
El material 24 de gel puede ser un líquido que posteriormente forma el material 24 de gel. Un ejemplo de aplicación de líquido que posteriormente forma el material 24 de gel es el recubrimiento de un conjunto de sitios 16 con acrilamida exenta de silano y N-[5-(2-bromoacetil)aminopentil]acrilamida (BRAPA) en forma líquida y que permite que los reactivos formen un gel mediante polimerización en la superficie. Otro ejemplo implica recubrir un conjunto de sitios 16 con monómeros PAZAM en forma líquida y permitir que los reactivos formen un gel mediante polimerización en la superficie. En el recubrimiento de una matriz de este modo se pueden utilizar reactivos y procedimientos químicos como se establece en la publicación de patente estadounidense n.° 2011/0059865.
El material 24 de gel puede estar unido covalentemente al soporte 12 (en los sitios 16) o puede no estar unido covalentemente al soporte 12. La unión covalente del material 24 de gel a los sitios 16 es útil para mantener el gel en los sitios estructurados 16 durante la vida útil de la matriz 10 durante una variedad de usos. Los siguientes son algunos ejemplos de reacciones que pueden tener lugar entre PAZAM y un silano o derivado de silano en algunos ejemplos del soporte 12, que dan lugar a enlaces covalentes.
Cuando el silano o derivado de silano en el soporte 12 incluye norborneno o un derivado de norborneno como el resto insaturado, el norborneno o un derivado de norborneno puede: i) someterse a una reacción de cicloadición 1,3-dipolar con un grupo azida/azido de PAZAM; ii) someterse a una reacción de acoplamiento con un grupo tetrazina unido a PAZAM; someterse a una reacción de cicloadición con un grupo hidrazona unido a PAZAM; someterse a una fotorreacción clic con un grupo tetrazol unido a PAZAM; o someterse a una cicloadición con un grupo de óxido de nitrilo unido a PAZAM.
Cuando el silano o derivado de silano en el soporte 12 incluye ciclooctino o un derivado de ciclooctino como resto insaturado, el ciclooctino o derivado de ciclooctino puede: i) someterse a una reacción de 1,3-cicloadición de azidaalquino (SPAAC) promovida por tensión con una azida/azido de PAZAM, o ii) someterse a una reacción de cicloadición de óxido de alquilnitrilo promovida por tensión con un grupo óxido de nitrilo unido a PAZAM.
Cuando el silano o derivado de silano en el soporte 12 incluye un biciclononino como el resto insaturado, el biciclononino puede experimentar una cicloadición de alquino SPAAC similar con azidas u óxidos de nitrilo unidos a PAZAM debido a la tensión en el sistema de anillos bicíclicos.
Si bien se proporcionan varios ejemplos de enlaces covalentes entre el soporte 12 y el material 24 de gel, como se indicó anteriormente, y en muchos ejemplos, el material 24 de gel no tiene por qué estar unido covalentemente a los sitios 16. Por ejemplo, la acrilamida exenta de silano, SFA, no está unida de forma covalente a ninguna parte del soporte 12.
Tal como se mencionó anteriormente, la Fig. 2C ilustra la eliminación del material 24 de gel de las regiones intersticiales 18. La eliminación puede lograrse mediante pulido. El pulido puede ser un proceso de tratamiento mecánico y/o químico.
El pulido mecánico se puede llevar a cabo mediante la aplicación de fuerzas abrasivas a la superficie del soporte sólido 12 (que tiene el material 24 de gel sobre este). Los métodos ilustrativos incluyen abrasión con una suspensión de perlas, limpieza con una lámina o paño, raspado o similares. Se entenderá que las perlas utilizadas para el pulido pueden ser o no ser esféricas, y pueden tener formas irregulares, formas poligonales, formas ovoides, formas alargadas, formas cilíndricas, etc. La superficie de las perlas puede ser lisa o rugosa. Cualquiera de una variedad de partículas puede ser útil como perlas para el pulido. Un ejemplo de pulido incluye el uso de una toallita sin pelusa (grado de sala limpia) recubierta con una suspensión de perlas de sílice de 3 pm (10 % p/v en agua) para retirar el material 24 de gel de las regiones intersticiales 18. También se puede utilizar una rueda de pulido/amoladora con esta u otra suspensión.
Otro ejemplo de pulido mecánico también se puede lograr usando un chorro de fluido o chorro de gas (p. ej., aire o gas inerte tal como argón o nitrógeno) para retirar el gel de las regiones intersticiales 18.
También se pueden utilizar técnicas de pulido químico, tales como hidrólisis o degradación a base de radicales de acrilamida (p. ej., mediante exposición a peróxido de benzoílo o peróxido de hidrógeno diluido). Durante esta forma de pulido, los productos químicos se pueden proporcionar en un estado sólido, líquido, gas o plasma. Por consiguiente, el pulido con plasma puede ser útil en algunos ejemplos.
El pulido puede implicar también una combinación de métodos de pulido químico y mecánico donde se usa una suspensión química que contiene una suspensión coloidal de partículas para exfoliar mecánicamente y a continuación disolver químicamente partes desplazadas del material 24 de gel de las regiones intersticiales 18. En un ejemplo, se puede utilizar un sistema de pulido químico mecánico, p. ej., un pulidor de obleas que incluye un cabezal de pulido Strasbaugh ViPRR II, u otro cabezal de pulido adecuado, para retirar el material 24 de gel de las regiones intersticiales 18 sin influir negativamente en el soporte subyacente 12 en esas regiones 18. Este tipo de sistema de pulido se puede utilizar con la suspensión de perlas de sílice descrita anteriormente, o con una suspensión química más suave. En un ejemplo, la suspensión química suave es una suspensión acuosa básica que incluye una partícula abrasiva que se selecciona del grupo que consiste en carbonato de calcio (CaCO3) y poli(metilmetacrilato) (PMMA). El tamaño de partícula promedio del CaCO3 puede variar de aproximadamente 15 nm a aproximadamente 5 pm, y en un ejemplo es de aproximadamente 700 nm. Además del CaCO3, la suspensión acuosa básica también puede incluir un amortiguador, un agente quelante, un tensioactivo y/o un dispersante. Un ejemplo del amortiguador incluye base tris (es decir, tris(hidroximetil)aminometano), que puede estar presente en una solución que tiene un pH de aproximadamente 9. Un ejemplo del agente quelante es el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), que puede estar presente en una solución que tiene un pH de aproximadamente 8. Un ejemplo del tensioactivo es dodecilsulfato de sodio. Se pueden utilizar dispersantes de poliacrilato que tienen diferentes pesos moleculares. Un ejemplo del dispersante es poli(sal sódica de ácido acrílico).
Otros métodos para pulir o limpiar las regiones intersticiales 18 incluyen técnicas basadas en adhesivo, por ejemplo, técnicas en las que se aplica una película adhesiva rígida y plana con afinidad con el material 24 de gel, haciendo de este modo contacto íntimo (p. ej., mediante enlace químico) con el material 24 de gel en las regiones intersticiales 18. La retirada/desprendimiento mecánico de esta película adhesiva dará como resultado la retirada mecánica del material 24 de gel de las regiones intersticiales 18, pero dejando el material 24 de gel en los sitios 16.
En un ejemplo, la SFA con injerto de tiofosfato se puede retirar de las regiones intersticiales 18 en una superficie de soporte 12 de la siguiente manera: una toallita Whatman humedecida en agua se puede frotar en óxido de aluminio (~100 mg, 0,3 um) o perlas de acero, y a continuación la suspensión formada se puede frotar en la superficie del soporte (que tiene la SFA con injerto de tiofosfato en esta), en pequeños círculos concéntricos, usando presión uniforme, y a continuación se puede usar una toallita Whatman húmeda en agua limpia para retirar la suspensión y la SFA con injerto de tiofosfato de la superficie.
Los métodos de pulido mecánicos y químicos que se ilustran en la presente memoria para retirar el material 24 de gel de las regiones intersticiales 18 también se pueden utilizar para inactivar el material de gel en las regiones intersticiales 18, independientemente de que se elimine o no el material 24 de gel. Por ejemplo, el material 24 de gel puede inactivarse con respecto a la capacidad de acoplar el cebador 20 de secuenciación y la entidad 22 no secuenciadora.
Una vez que el material 24 de gel se ha colocado en cada pocillo 16’, el(los) cebador(es) 20 de secuenciación y la entidad/las entidades 22 no secuenciadoras se injertan al material 24 de gel. En algunos ejemplos, el/los cebador/es 20 se puede/n injertar antes o después de que la entidad/las entidades 22 no secuenciadoras se injerte/n al material 24 de gel. En otros ejemplos, el/los cebador/es 20 y la entidad/las entidades 22 no secuenciadoras se injertan conjuntamente al material 24 de gel.
El injerto secuencial se puede lograr exponiendo el soporte 12 (que tiene el material 24 de gel en los sitios 16) a una solución o mezcla que contiene/n el/los cebador/es 20 de secuenciación y la incubación, y a continuación a una solución o mezcla que contiene la entidad 22 no secuenciadora y la incubación. Alternativamente, el injerto secuencial se puede lograr exponiendo el soporte 12 (que tiene el material 24 de gel en los sitios 16) a una solución o mezcla que contiene la entidad 22 no secuenciadora y la incubación, y a continuación a una solución o mezcla que contiene el/los cebador/es 20 de secuenciación y la incubación.
El coinjerto se puede lograr exponiendo el soporte 12 (que tiene el material 24 de gel en los sitios 16) a una solución o mezcla que contiene el/los cebador/es 20 de secuenciación y la entidad 22 no secuenciadora, y a continuación incubar. La exposición del soporte 12 a esta solución o mezcla se puede lograr mediante el depósito de una mezcla de el/los cebador/es 20 de secuenciación y la entidad 22 no secuenciadora en el soporte 12. En un ejemplo, la solución o mezcla puede extraerse a través del soporte 12 recubierto de material 24 de gel (que se muestra en la Fig. 2C).
En cualquiera de los ejemplos de injerto, la incubación tiene lugar a una temperatura predeterminada que depende, en parte, de/de los cebador/es 20 de secuenciación y la entidad 22 no secuenciadora utilizada. Como ejemplos, la incubación se puede lograr a una temperatura que varía de temperatura ambiente (es decir, aproximadamente 25 0C) hasta aproximadamente 60 0C.
También en cualquiera de los ejemplos de injerto, la solución puede incluir el/os cebador/es 20 de secuenciación y/o la entidad 22 no secuenciadora, agua, un amortiguador y un catalizador. La relación molar de la entidad 22 no secuenciadora con respecto al cebador 20 de secuenciación, ya sea presente en la misma solución/mezcla o soluciones/mezclas separadas, varía de aproximadamente 0,25:1 a aproximadamente 5:1.
Los ejemplos de cebadores 20 de secuenciación adecuados incluyen cebadores de amplificación directa o cebadores de amplificación inversa. Los ejemplos de cebadores 20 de secuenciación adecuados incluyen cebadores P5 o P7. Los cebadores P5 y P7 se utilizan en la superficie de celdas de flujo comercial vendidas por Illumina Inc. para la secuenciación en plataformas de instrumentos HiSeq®, HiSeqX®, MiSeq®, NextSeq® y Genome Analyzer®. Las secuencias de cebadores P5 y P7 incluyen lo siguiente:
P5: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA(dU)CTACAC (Id. de sec. n.° 1)
P7: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT (Id. de. sec. n.° 2)
en donde G* es una 8-oxoguanina.
Opcionalmente, uno o ambos de los cebadores P5 y P7 pueden incluir una cola de poli T. La cola de poli T generalmente está ubicada en el extremo 5' de la secuencia, pero en algunos casos puede estar ubicada en el extremo 3'. La secuencia poli T puede incluir cualquier cantidad de nucleótidos T, por ejemplo, de 2 a 20.
Los cebadores P5 y P7, así como otros cebadores 20 de secuenciación, se pueden modificar en el extremo 5' con un grupo que es capaz de reaccionar con un grupo funcional del material 24 de gel. Un ejemplo de un grupo funcional adecuado es biciclo[6.1.0]non-4-ino (BCN), que puede reaccionar con una azida del material 24 de gel. Otros cebadores con terminaciones ilustrativos incluyen un cebador con terminación de tetrazina, un cebador con terminación de norborneno, un cebador con terminación de alquino, un cebador con terminación de amino, un cebador con terminación de epoxi o glicidilo, un cebador con terminación de tiofosfato y un cebador con terminación de triazolinediona. En algunas realizaciones, los cebadores con terminación incluyen un cebador con terminación de alquino. En otras modalidades, los cebadores con terminación incluyen un cebador con terminación de tiofosfato. Un experto en la técnica comprenderá cómo diseñar y utilizar cebadores 20 de secuenciación que sean adecuados para la captura y amplificación de ácidos nucleicos como se presenta en la presente memoria.
Los ejemplos de entidades 22 no secuenciadoras adecuadas incluyen el cebador no funcional, la cadena polimérica, el péptido y/o el potenciador de fluorescencia.
Como se mencionó anteriormente, el cebador no funcional es cualquier secuencia de ácido nucleico monocatenario que, en su forma injertada, no participará en la síntesis de ADN o ARN. Los ejemplos incluyen una secuencia poli T o una secuencia poli A.
Los ejemplos de la cadena polimérica incluyen un dendrímero (p. ej., poli(amido)amina o PAMAM), polidextrano, metacriloíloxietilfosforilcolina (PCA), poli(etilenglicol) (PEG, es decir, poli(óxido de etileno) o PEO), poli(etilenimina) (PEI), poli-L-lisina (PLL), metacrilato de propargilo (PMA), poli(metilmetacrilato) (PMMA), poli(N-isopropilacrilamida) (PNIPAM), acrilato de poli(etilenglicol) (POEGA), poli(propilenimina) (PPI, que es un núcleo de dendrímero), poli(alcohol vinílico) (PVA), poli(2-etil-2-oxazolina), ácido poliacrílico (PAA) y poli(trolox).
Cada uno de estos materiales de cadena polimérica puede funcionar como espaciadores para crear espacio adicional entre los cebadores 20 de secuenciación que están unidos al material 24 de gel. Algunos de estos materiales de cadena polimérica también tienen propiedades que pueden añadir hidrofilicidad al material 24 de gel y limitar la unión no específica al material 24 de gel. Un ejemplo de este material de cadena polimérica incluye PEG. En los ejemplos descritos en la presente memoria, el PEG tiene un peso molecular que varía de aproximadamente 0,5 KDa a aproximadamente 10 KDa. Otros materiales de la cadena polimérica también son multifuncionales; por ejemplo, el poli(éster trolox) puede ser un espaciador y puede ser un antioxidante.
La cadena polimérica incluye un grupo funcional que puede reaccionar con el/los grupo/s del material 24 de gel, o se modifica para incluir un grupo funcional que puede reaccionar con el/los grupo/s del material 24 de gel. Los ejemplos de dichos grupos funcionales incluyen un alquino, un norbornilo, un resto de química clic exento de cobre (p. ej., dibenzociclooctino (DIBO) u otros) y un tiol. Los alquinos, norbornilos y restos de química clics libres de cobre pueden reaccionar con azidas de PAZAM a través de reacciones clic. Los tioles pueden reaccionar con la SFA. Un ejemplo de un material de cadena polimérica que incluye uno de los grupos funcionales indicados es PMA, que incluye un alquino. Los ejemplos de cadenas de polímeros modificados incluyen PEG con terminación alquino, PMMA con terminación alquino, PMMA con terminación norbornilo, PNIPAM con terminación tiol, PVA con terminación alquino, PVA con terminación tiol, PAA con terminación alquino y PAA con terminación tiol.
En algunos ejemplos, las cadenas de polímero como se describe pueden injertarse al material 24 de gel como la entidad 22 no secuenciadora.
En otros ejemplos, las cadenas poliméricas tal como se describen pueden ser una entidad de unión que une un potenciador de fluorescencia, tal como un atenuador de estado de triplete, un antioxidante o un donador de FRET, al material 24 de gel. Por ejemplo, la cadena polimérica puede terminarse con un alquino en un extremo para la unión al material 24 de gel y un grupo funcional (p. ej., tiol, amina, aldehído o ácido carboxílico) en el otro extremo para la unión al atenuador de estado de triplete, el antioxidante o el donador de FRET.
Los ejemplos de atenuadores de estado de triplete adecuados se seleccionan del grupo que consiste en ciclooctiltetraeno (COT), Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico (Hoffmann-La Roche AG)) y alcohol nitrobencílico (NBA). Los ejemplos de antioxidantes adecuados se seleccionan del grupo que consiste en ascorbato, glutatión, ácido gálico, catequina, Trolox y vitamina E. El donador de FRET unido se adapta o selecciona de modo que tenga una superposición espectral óptima y eficiencia FRET con los fully functional nucleotides (nucleótidos completamente funcionales - FFN) (tinte detectado en secuenciación, incorporado en sequencing-bysynthesis (secuenciación por síntesis - SBS)). Los ejemplos del donador de FRET se seleccionan del grupo que consiste en un tinte donador de FRET con un tinte emisor en verde (incorporado en nucleótidos en un flujo de trabajo de secuenciación) y un tinte donador de FRET con un tinte emisor en rojo (incorporado en nucleótidos en un flujo de trabajo de secuenciación). Los ejemplos específicos de tintes donadores a FRET con fully functional nucleotides (nucleótidos completamente funcionales - FFN) emisores en verde incluyen Cy2® (tinte de cianina, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), tintes Alexa Fluor® (p. ej., 488) (ThermoFisher Scientific) y tintes Atto (p. ej., 465, 488 y 490) (Atto-Tec); y ejemplos específicos de tintes donadores de FRET con FFN que emiten en el rojo incluyen Cy3® (tinte de cianina, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), tintes Alexa Fluor® (p. ej., 546, 555, 568 y 594) (ThermoFisher Scientific) y tintes Atto (p. ej., 532) (Atto-Tec). Los donadores de FRET pueden ser adecuados para su uso en una o dos secuenciaciones por configuraciones de síntesis de tintes que implican 542 nm, 550 nm, 565 nm (longitud de onda de absorción) y/o Rodamina 6G.
En estos otros ejemplos, las cadenas de polímeros y el potenciador de fluorescencia unido conforman conjuntamente la entidad 22 no secuenciadora. En estos otros ejemplos, el otro extremo de la cadena de polímero (p. ej., el extremo opuesto al extremo que está unido al material 24 de gel) incluye un grupo funcional que puede incorporar o reaccionar con el/los grupo/s del potenciador de fluorescencia, o se modifica para incluir un grupo funcional que puede incorporar o reaccionar con el/los grupo/s del potenciador de fluorescencia. Los ejemplos de dichos grupos funcionales incluyen un tiol, una amina, un aldehído y un ácido carboxílico. También se pueden utilizar otros grupos funcionales que pueden unir el potenciador de fluorescencia a la cadena polimérica.
Como ejemplos, la vitamina E puede conjugarse con PAA, y glutatión, ácido ascórbico, ácido gálico o catequina pueden conjugarse con PEG o PMMA.
Como otros ejemplos, el donador de FRET puede conjugarse con cualquiera de las cadenas de polímero que tienen o están modificadas con un grupo alquino.
Otro ejemplo más de la entidad no secuenciadora es un péptido.
En las Figs. 2D y 3 se muestran el/os cebador/es 20 de secuenciación injertado/s y la entidad/las entidades no secuenciadora/s 22. La relación molar de la entidad 22 no secuenciadora injertada con respecto al cebador 20 de secuenciación injertado varía de aproximadamente 0,25:1 a aproximadamente 5:1. En otro ejemplo, la relación molar de la entidad 22 no secuenciadora injertada con respecto al cebador 20 de secuenciación injertado varía de aproximadamente 0,5:1 a aproximadamente 2:1. La entidad/las entidades 22 no secuenciadora/s injertada/s no participará/n en técnicas de secuenciación realizadas posteriormente, sino que separará/n el/los cebador/es 20 de secuenciación en el sitio 16 y permitirá/n proporcionar funcionalidad adicional al sitio 16.
La matriz 10 descrita en la presente memoria puede usarse en una variedad de enfoques o tecnologías de secuenciación, incluidas técnicas a las que a menudo se hace referencia como sequencing-by-synthesis (secuenciación por síntesis - SBS), secuenciación por ligadura, pirosecuenciación, etc. Con cualquiera de estas técnicas, dado que el material 24 de gel y los cebadores 20 de secuenciación unidos están presentes en los sitios 16 y no en las regiones intersticiales 18, la amplificación se limitará a los diversos sitios 16.
Brevemente, una reacción de sequencing by synthesis (secuenciación por síntesis - SBS) se puede ejecutar en un sistema tal como los sistemas secuenciadores HiSeq®, HiSeqX ®, MiSeq ® o NextSeq® de Illumina (San Diego, CA). Un conjunto de moléculas de ADN diana a secuenciar se hibrida con los cebadores 20 de secuenciación unidos (y no con la entidad 22 no secuenciadora) y a continuación se amplifica mediante amplificación por puente o mediante amplificación de exclusión cinética. La desnaturalización deja plantillas monocatenarias ancladas al material 24 de gel, y se generan varios millones de clústers densos de ADN bicatenario (es decir, generación de clústers). Se llevan a cabo las reacciones de secuenciación y, en algunos ejemplos, los cebadores 20 de secuenciación y las entidades 22 no secuenciadoras (y los amplicones que incluyen cebadores extendidos durante las etapas de amplificación para incluir copias del ADN diana) se unen entonces del material 24 de gel de modo que la superficie es reutilizable en futuras reacciones de secuenciación. Por lo tanto, se pueden repetir una o más de las etapas de unión de cebadores 20 de secuenciación y entidades 22 no secuenciadoras al material 24 de gel, hibridación de moléculas de ADN diana a los cebadores 20 de secuenciación, amplificación por puente, secuenciación del ADN diana y eliminación de cebadores 20 de secuenciación y entidades 22 no secuenciadoras y amplicones. Se puede realizar una o más repeticiones.
Para ilustrar adicionalmente la presente descripción, la presente memoria incluye ejemplos. Cabe mencionar que estos ejemplos se proporcionan con fines ilustrativos y no deben interpretarse como limitativos del alcance de la presente descripción.
Ejemplos
Ejemplo 1
Los cebadores de secuenciación (p. ej., P5/P7 con colas poli T) se injertaron con un cebador no secuenciador (es decir, 5’-hexino-TTT, denominado NSP) en pocillos de una celda de flujo comercializada por Illumina, Inc. La relación molar del cebador no secuenciador con respecto al cebador secuenciador varió entre las muestras. El cebador de secuenciación se utilizó sin un cebador no secuenciador para dos muestras de control.
Se preparó una mezcla para cada muestra. La mezcla incluía agua ultrapura, un amortiguador y un exceso de catalizadores (p. ej., CuSÜ4 (20 mM - 200 mM), ascorbato (20 mM - 200 mM) y pentametildietilentriamina (PMDTA) (105 mM - 1050 mM). La concentración del/de los cebador/es de secuenciación era de aproximadamente 1 pM. La cantidad total de catalizador fue la misma en cada muestra. La relación molar del non-sequencing primer (cebador no secuenciador - NSP) con respecto al cebador secuenciador (P5/P7) se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1
Figure imgf000016_0001
Cada mezcla se aplicó a un carril de celda de flujo respectivo y se incubó a aproximadamente 60 0C. La celda de flujo se lavó para retirar los cebadores no unidos.
Se aplicó una mezcla de tetracloro-fluoresceína (TET) que incluía un amortiguador y oligos de TET (es decir, oligonucleótidos marcados con tinte que tienen secuencias complementarias a los cebadores P5/P7) a los carriles de celdas de flujo para teñir los cebadores de secuenciación de superficie. La TET se puede hibridar con los cebadores P5/P7 en una superficie; el exceso de TET se puede lavar y la concentración de tinte unido (en términos de intensidad) se puede medir mediante detección de fluorescencia utilizando un instrumento de exploración, como un Typhoon Scanner (General Electric). A partir de los datos de intensidad, se puede determinar la distribución espacial y la densidad del cebador. Los resultados se muestran en la Fig. 4. Los resultados indican que el injerto de los cebadores de secuenciación con el cebador no secuenciador fue comparable al injerto de los cebadores de secuenciación sin el cebador no secuenciador a relaciones molares inferiores a 10:1.
Ejemplo 2
Los cebadores de secuenciación (p. ej., P5/P7 con colas poli T) se injertaron con un cebador no secuenciador (es decir, 5’-hexino-TTT) en pocillos de una celda de flujo comercializada por Illumina, Inc. La relación molar del cebador no secuenciador con respecto al cebador secuenciador varió entre las muestras. El cebador de secuenciación se utilizó sin un cebador no secuenciador para una muestra de control.
Se preparó una mezcla para cada muestra. La mezcla incluía agua ultrapura, un amortiguador y un exceso de catalizadores (p. ej., CuSÜ4 (20 mM - 200 mM), ascorbato (20 mM - 200 mM) y pentametildietilentriamina (PMDTA) (105 mM - 1050 mM). La concentración de los cebadores de secuenciación P5/P7 fue de aproximadamente 1 pM. La cantidad total de catalizador varió para algunas de las mezclas. La relación molar del cebador no secuenciador con respecto al cebador secuenciador y las variaciones en la cantidad de catalizador se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2
Figure imgf000017_0001
*X = una cantidad base de los tres catalizadores
Cada mezcla se aplicó a un carril de celda de flujo respectivo y se incubó a aproximadamente 60 0C. La celda de flujo se lavó para retirar los cebadores no unidos.
La celda de flujo se expuso a hibridación para formación de imágenes, formación de clústers y secuenciación. Se midieron las intensidades C1A de lectura 2, y estos resultados se muestran en la Fig. 5. Estos resultados ilustran que el injerto del cebador de secuenciación con el cebador no secuenciador sin un exceso de catalizador permite aumentar la intensidad de secuenciación.
Ejemplo 3
Los cebadores de secuenciación P5/P7 con colas de poli T se injertaron con una cadena polimérica, como entidad no secuenciadora (denominada non-sequencing polymer strand - cadena polimérica no secuenciadora o NSPS), a dos celdas de flujo disponibles de Illumina Inc. La cadena polimérica fue PEG-alquino, y el peso molecular del alquino PEG varió entre las muestras. La relación molar de la cadena polimérica no secuenciadora con respecto al cebador de secuenciación también varió entre las muestras. El cebador de secuenciación se utilizó sin la cadena polimérica no secuenciadora para cuatro muestras de control.
Se prepararon dos mezclas. Una mezcla de cebador de secuenciación incluyó agua ultrapura, un amortiguador y un exceso de catalizadores (p. ej., CuSÜ4 (20 mM - 200 mM), ascorbato (20 mM - 200 mM) y pentametildietilentriamina (PMDTA) (105 mM - 1050 mM). La concentración de los cebadores de secuenciación P5/P7 fue de aproximadamente 1 pM. Se utilizaron soluciones de PEG-alquino recién preparadas (p. ej., se disolvieron diferentes alquinos de PEG de peso molecular en agua).
La mezcla de cebador de secuenciación se aplicó a un carril de celda de flujo respectivo, con o sin una de las soluciones de cadena polimérica no secuenciadora a las relaciones molares deseadas, como se muestra en la Tabla 3. La Tabla 3 también indica el peso molecular de PEG-alquino que se utilizó en cada carril. Las celdas de flujo se incubaron a aproximadamente 60 0C y se lavaron para retirar los materiales no unidos.
Tabla 3
Figure imgf000017_0002
Figure imgf000018_0001
Las celdas de flujo se expusieron a hibridación para formación de imágenes, formación de clústers y secuenciación. Los datos de secuenciación se recopilaron, y los resultados del porcentaje de clústers que pasaron a través de un filtro (% paso de filtro (PF)) se muestran en las Figs. 6a (celda de flujo 1) y 6B (celda de flujo 2) y los resultados para pad hopping (salto de almohadilla - PH) se muestran en las Figs. 7A (celda de flujo 1) y 7B (celda de flujo 2). El % de paso de filtro (PF) es el parámetro utilizado para describir clústers que superan un umbral de castidad y se utilizan para el procesamiento y análisis adicional de datos de secuenciación. El % de salto de almohadilla es un parámetro que describe la cantidad de clústeres duplicados ubicados cerca de un clúster único. Un mayor % de paso de filtro y un menor % de salto de almohadilla dan como resultado un mayor rendimiento de clústers únicos utilizados para secuenciar los datos. Estos resultados ilustran que el injerto de los cebadores de secuenciación con el peso molecular de PEG-alquino inferior (es decir, KDa > 10) fue comparable al injerto de los cebadores de secuenciación sin ningún PEG-alquino. Por lo tanto, la introducción de la entidad no secuenciadora de cadena polimérica no influye negativamente en los resultados de secuenciación y permite añadir hidrofilicidad al material de gel en los pocillos de celda de flujo, limitar la unión no específica, etc.
Notas adicionales
La referencia a lo largo de la descripción a “como un ejemplo” , “otro ejemplo” , “un ejemplo” , etc., denota que un elemento en particular (p. ej., propiedad, estructura y/o característica) que se describe en relación con el ejemplo se incluye en al menos un ejemplo descrito en la presente memoria, y puede estar presente o no en otros ejemplos. Además, debe entenderse que los elementos descritos para cualquier ejemplo pueden combinarse de cualquier manera adecuada en los diversos ejemplos, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Debe entenderse que los intervalos proporcionados en la presente memoria incluyen el intervalo establecido y cualquier valor o subintervalo dentro del intervalo establecido. Por ejemplo, se debe interpretar que un intervalo de aproximadamente 0,5 KDa a menos de aproximadamente 10 KDa incluye no solo los límites explícitamente mencionados de aproximadamente 0,5 KDa a menos de aproximadamente 10 KDa, sino que también incluye valores individuales, tales como aproximadamente 0,8 KDa, aproximadamente 3,25 KDa, aproximadamente 5 KDa, aproximadamente 7,5 KDa, etc., y subintervalos, tales como de aproximadamente 4,25 KDa a aproximadamente 9 KDa, de aproximadamente 5,4 KDa a aproximadamente 7,75 KDa, etc. Además, cuando “aproximadamente” y/o “sustancialmente” se utiliza/n para describir un valor, esto pretende abarcar variaciones menores (hasta /- 10 %) del valor establecido.

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Una matriz, que comprende:
un soporte que incluye una pluralidad de pocillos diferenciados;
un material de gel colocado en cada uno de los pocillos diferenciados;
un cebador de secuenciación injertado al material de gel; y
una entidad no secuenciadora injertada al material de gel y conectada a través de una entidad de unión a un atenuador de estado de triple o antioxidante;
estando cada uno del cebador de secuenciación y la entidad no secuenciadora en su forma injertada; en donde
la entidad no secuenciadora se selecciona del grupo que consiste en un dendrímero, polidextrano, metacriloxietilfosforilcolina, poli(etilenglicol), poli(etilenimina), poli-L-lisina, metacrilato de propargilo, poli(metilmetacrilato), poli(N-isopropilacrilamida), acrilato de poli(etilenglicol), poli(propilenimina), poli(alcohol vinílico), poli(2-etil-2-oxazolina), ácido poliacrílico, poli(éster trolox), un péptido y un cebador no funcional siendo cualquier secuencia de ácido nucleico monocatenario que no participará en la síntesis de ADN o ARN.
2. La matriz como se define en la reivindicación 1, en donde la entidad no secuenciadora es el cebador no funcional, y en donde el cebador no funcional es poliT o poliA;
o
la entidad no secuenciadora es poli(etilenglicol) que tiene un peso molecular que varía de aproximadamente 0,5 KDa a aproximadamente 10 KDa.
3. La matriz como se define en la reivindicación 1, en donde la entidad no secuenciadora se injerta al material de gel a través de un grupo funcional terminal seleccionado del grupo que consiste en un alquino, un norbornilo, un resto de química clic exento de cobre, y un tiol.
4. La matriz como se define en cualquiera de la reivindicación 1 o la reivindicación 3, en donde la entidad no secuenciadora incluye una entidad de unión y un atenuador de estado de triplete o un antioxidante unido a la entidad de unión;
y en donde opcionalmente
la entidad de unión se selecciona del grupo que consiste en un dendrímero, polidextrano, metacriloiloxietilfosforilcolina, poli(etilenglicol), poli(etilenimina), poli-L-lisina, metacrilato de propargilo, poli(metilmetacrilato), poli(N-isopropilacrilamida), acrilato de poli(etilenglicol), poli(propilenimina), poli(alcohol vinílico), poli(2-etil-2-oxazolina), ácido poliacrílico y poli(éster trolox); y
uno de:
el atenuador de estado de triplete se selecciona del grupo que consiste en ciclooctiltetraeno (COT), Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico) y alcohol nitrobencílico (NBA); o
el antioxidante se selecciona del grupo que consiste en ascorbato, glutatión, ácido gálico, catequina, Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico) y vitamina E.
5. La matriz como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, en donde un donador de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) está unido a la entidad de unión; y
el donador de FRET se selecciona del grupo que consiste en un tinte donador para FRET con un tinte emisor en verde y un tinte donador para FRET con un tinte emisor en rojo.
6. La matriz como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde una relación molar de la entidad no secuenciadora al cebador secuenciador varía de aproximadamente 0,25:1 y aproximadamente 5:1.
7. La matriz como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde:
el material de gel incluye una unidad recurrente de Fórmula (I):
Figure imgf000020_0001
en donde:
R1 es H o alquilo opcionalmente sustituido;
se selecciona del grupo que consiste en azido, amino opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, hidrazona opcionalmente sustituida
hidrazina opcionalmente sustituida, carboxilo, hidroxilo, tetrazol opcionalmente sustituido, tetrazina opcionalmente sustituida, óxido de nitrilo, nitrona y tiol;
R5 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo opcionalmente sustituido;
cada uno de los -(CH2)p- puede ser sustituido en forma opcional;
p es un número entero en el rango de 1 a 50;
n es un número entero en el rango de 1 a 50.000; y
m es un número entero en el rango de 1 a 100.000.
Una matriz, que comprende:
un soporte que incluye una pluralidad de pocillos diferenciados;
un material de gel colocado en cada uno de los pocillos diferenciados;
un cebador de secuenciación injertado al material de gel;
un separador injertado al material de gel y conectado a través de una entidad de unión a un atenuador de estado de triplete, un antioxidante, o un donador de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET); y
seleccionándose el espaciador del grupo que consiste en un dendrímero, polidextrano, metacriloiloxietilfosforilcolina, poli(etilenglicol), poli(etilenimina), poli-L-lisina, metacrilato de propargilo, poli(metilmetacrilato), poli(N-isopropilacrilamida), acrilato de poli(etilenglicol), poli(propilenimina), poli(alcohol vinílico), poli(2-etil-2-oxazolina), ácido poliacrílico, poli(éster trolox), y combinaciones de los mismos.
La matriz como se define en la reivindicación 8 en donde:
el atenuador de estado de triplete está unido al espaciador; y
el atenuador de estado de triplete se selecciona del grupo que consiste en ciclo-octiltetraeno (COT), Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico) y alcohol nitrobencílico (NBA);
o en donde
el antioxidante está unido al espaciador; y
el antioxidante se selecciona del grupo que consiste en ascorbato, glutatión, ácido gálico, catequina, Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico), y vitamina E; o en donde
el donador de FRET está unido al espaciador; y
el donador de FRET se selecciona del grupo que consiste en un tinte donador para FRET con un tinte emisor en verde y un tinte donador para FRET con un tinte emisor en rojo.
La matriz como se define en cualquiera de las reivindicaciones 8-9, en donde una relación molar del espaciador al cebador de secuenciación varía de aproximadamente 0,25:1 a aproximadamente 5:1; y/o
en donde el espaciador se injerta al material de gel a través de un grupo funcional terminal seleccionado del grupo que consiste en un alquino, un norbornilo, un resto de química clic exento de cobre, y un tiol.
Un método, que comprende:
colocar un material de gel en cada uno de una pluralidad de pocillos discretos de un soporte; injertar un cebador de secuenciación al material de gel; e
injertar una entidad no secuenciadora al material de gel y conectar dicha entidad no secuenciadora a través de una entidad de unión a un atenuador de estado de triple o antioxidante; en donde la entidad no secuenciadora se selecciona del grupo que consiste en un dendrímero, polidextrano, metacriloxietilfosforilcolina, poli(etilenglicol), poli(etilenimina), poli-L-lisina, metacrilato de propargilo, poli(metilmetacrilato), poli(N-isopropilacrilamida), acrilato de poli(etilenglicol), poli(propilenimina), poli(alcohol vinílico), poli(2-etil-2-oxazolina), ácido poliacrílico, poli(éster trolox), un péptido, y un cebador no funcional siendo cualquier secuencia de ácido nucleico monocatenario que no participará en la síntesis de ADN o ARN.
El método como se define en la reivindicación 11 en donde el cebador de secuenciación se injerta al material de gel antes o después de que la entidad no secuenciadora se injerte al material de gel;
o
el cebador de secuenciación y la entidad no secuenciadora se coinjertan al material de gel.
El método como se define en la reivindicación 12 en donde el coinjerto se logra:
depositando una mezcla del cebador de secuenciación y la entidad no secuenciadora sobre el soporte que tiene el material de gel sobre el mismo; e
incubando el soporte a una temperatura predeterminada.
El método como se define en cualquiera de las reivindicaciones 11-13 en donde:
la entidad no secuenciadora se selecciona del grupo que consiste en un dendrímero, polidextrano, metacriloxietilfosforilcolina, poli(etilenglicol), poli(etilenimina), poli-L-lisina, metacrilato de propargilo, poli(metilmetacrilato), acrilato de poli(etilenglicol), poli(propilenimina), poli(alcohol vinílico), poli(2-etil-2-oxazolina), ácido poliacrílico, poli(éster de trolox), un péptido, y un cebador no funcional; y
la entidad no secuenciadora se injerta al material de gel a través de un grupo funcional terminal seleccionado del grupo que consiste en un alquino, un norbornilo, un resto de química clic exento de cobre, y un tiol.
El método definido en cualquiera de las reivindicaciones 11-14 en donde:
el material de gel incluye una unidad recurrente de Fórmula (I):
Figure imgf000021_0001
en donde:
R1 es H o alquilo opcionalmente sustituido;
R^ se selecciona del grupo que consiste en azido, amino opcionalmente sustituido, alquenilo opcionalmente sustituido, hidrazona opcionalmente sustituida
hidrazina opcionalmente sustituida, carboxilo, hidroxilo, tetrazol opcionalmente sustituido, tetrazina opcionalmente sustituida, óxido de nitrilo, nitrona, y tiol;
R5 se selecciona del grupo que consiste en H y alquilo opcionalmente sustituido;
cada uno de los -(CH2)p- puede ser sustituido en forma opcional;
p es un número entero en el rango de 1 a 50;
n es un número entero en el rango de 1 a 50.000; y
m es un número entero en el rango de 1 a 100.000.
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