CN110382104B - 包括测序引物和非测序实体的阵列 - Google Patents
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Abstract
阵列的实例包括：支持物，所述支持物包括多于一个离散孔、位于各个所述离散孔中的凝胶材料、被接枝至凝胶材料的测序引物、以及被接枝至凝胶材料的非测序实体。测序引物和非测序实体各自呈其如接枝的形式。
Description
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背景
生物阵列是用于检测和分析分子包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的宽范围的工具中的一种。在这些应用中，阵列被工程化成包括用于人类和其他生物体的基因中存在的核苷酸序列的探针。在某些应用中，例如，单独的DNA和RNA探针可以在阵列支持物上以几何栅格(或随机地)附接在小位置处。测试样品(如来自已知的人或生物体)可以暴露于栅格，使得互补片段与在阵列中的单独位点处的探针杂交。然后可以通过将扫描位点上的特定频率的光以通过片段杂交的位点的荧光识别出哪些片段存在于样品中来检查阵列。
生物阵列可以用于基因测序。通常，基因测序涉及确定一段遗传物质诸如DNA或RNA的片段中的核苷酸或核酸的顺序。越来越长的碱基对的序列被分析，并且所得到的序列信息可以在各种生物信息学方法中用于将片段逻辑地拟合在一起，以便可靠地确定片段源自的广泛长度的遗传物质的序列。已经开发了特征片段的自动化的基于计算机的检查，并且已经将其用于基因组作图、基因及其功能的识别、某些状况和疾病状态的风险的评估以及其他。除了这些应用之外，生物阵列还可以用于检测和评估宽范围的分子、分子家族、基因表达水平、单核苷酸多态性和基因分型。
概述
阵列的实例包括：支持物，所述支持物包括多于一个离散孔、位于各个所述离散孔中的凝胶材料、被接枝至凝胶材料的测序引物、以及被接枝至凝胶材料的非测序实体。测序引物和非测序实体各自呈其如接枝(as-grafted)的形式。
阵列的另一个实例包括：支持物，所述支持物包括多于一个离散孔、位于各个所述离散孔中的凝胶材料、被接枝至凝胶材料的测序引物、以及被接枝至凝胶材料的间隔物。间隔物选自由以下组成的组：树状聚合物、聚右旋糖酐、甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、聚(乙二醇)、聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、甲基丙烯酸炔丙酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(乙二醇)丙烯酸酯、聚(丙烯亚胺)、聚(乙烯醇)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酸、聚(trolox酯)及其组合。
在方法的实例中，凝胶位于支持物的多于一个离散孔中的各个孔中，测序引物被接枝至凝胶材料；并且非测序实体被接枝至凝胶材料。
附图简述
通过参考以下详细描述和附图，本公开内容的实例的特征和优点将变得明显，其中相似的附图标记(reference numberal)对应于类似的尽管可能不相同的组分。为了简洁起见，具有之前描述的功能的附图标记或特征可以结合或可以不结合其中它们出现的其他附图来描述。
图1是根据本公开内容的示例性阵列的图解表示，图示出了阵列的总体布局并且详细描述了各个位点的布置；
图2A至图2D是一起图示出本文公开的方法的实例的横截面图；
图3是图1和图2D中示出的各个位点中的一个的放大的透视剖视图；
图4是描绘在一个实例中包含不同摩尔比的非测序引物与测序引物的泳道的四氯荧光素(TET)质量控制(QC)结果的强度方面的图；
图5是描绘在一个实例中，不同摩尔比的非测序引物与测序引物的读段2C1A强度的图；
图6A和图6B是描绘在一个实例中，对于不同摩尔比的聚合物链非测序实体与测序引物，通过过滤器的簇的百分比的图；以及
图7A和图7B是描绘在一个实例中，对于不同摩尔比的聚合物链非测序实体与测序引物，垫跳跃(pad hopping)的百分比的图。
引言
在本文公开的阵列的第一方面中，阵列包括：支持物，所述支持物包括多于一个离散孔、位于各个所述离散孔中的凝胶材料、被接枝至凝胶材料的测序引物、以及被接枝至凝胶材料的非测序实体，测序引物和非测序实体各自呈其如接枝的(as-grafted)形式。
在阵列的第一方面中，非测序实体与测序引物的摩尔比在约0.25:1至约5:1的范围内。
在阵列的第一方面的一个实例中，非测序实体选自由以下组成的组：树状聚合物、聚右旋糖酐、甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、聚(乙二醇)、聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、甲基丙烯酸炔丙酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(乙二醇)丙烯酸酯、聚(丙烯亚胺)、聚(乙烯醇)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酸、聚(trolox酯)、肽和非功能性引物。非测序实体通过末端官能团被接枝至凝胶材料。在一些实例中，官能团选自由以下组成的组：炔烃、降冰片基、无铜点击部分和硫醇。作为该第一方面的一个实例，非测序实体是非功能性引物，并且非功能性引物是聚T或聚A。作为该第一方面的另一个实例，非测序实体是具有在约0.5KDa至小于约10KDa的范围内的分子量的聚(乙二醇)。
在阵列的第一方面的另一个实例中，非测序实体包括接头和结合至接头的三重态猝灭剂或抗氧化剂。在一些实例中，接头选自由以下组成的组：树状聚合物、聚右旋糖酐、甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、聚(乙二醇)、聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、甲基丙烯酸炔丙酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(乙二醇)丙烯酸酯、聚(丙烯亚胺)、聚(乙烯醇)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酸以及聚(trolox酯)。在该方面的一些实例中，三重态猝灭剂选自由以下组成的组：环辛基四烯(COT)、Trolox和硝基苄基醇(NBA)；并且在一些实例中，抗氧化剂选自由以下组成的组：抗坏血酸盐、谷胱甘肽、没食子酸、儿茶素、Trolox和维生素E。
在阵列的第一方面的仍然另一个实例中，非测序实体包括接头和结合至接头的荧光共振能量转移(FRET)供体。在一些实例中，接头选自由以下组成的组：树状聚合物、聚右旋糖酐、甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、聚(乙二醇)、聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、甲基丙烯酸炔丙酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙二醇)丙烯酸酯、聚(丙烯亚胺)、聚(乙烯醇)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酸以及聚(trolox酯)。在该方面的一些实例中，FRET供体选自由以下组成的组：具有绿色发光染料的FRET的供体染料和具有红色发光染料的FRET的供体染料。
应理解，阵列的第一方面的任何特征可以以任何期望的方式和/或配置组合在一起。
在本文公开的阵列的第二方面中，阵列包括：支持物，所述支持物包括多于一个离散孔、位于各个所述离散孔中的凝胶材料、被接枝至凝胶材料的测序引物、以及被接枝至凝胶材料的间隔物。在一些实例中，间隔物选自由以下组成的组：树状聚合物、聚右旋糖酐、甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、聚(乙二醇)、聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、甲基丙烯酸炔丙酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙二醇)丙烯酸酯、聚(丙烯亚胺)、聚(乙烯醇)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酸、聚(trolox酯)及其组合。
在阵列的第二方面中，间隔物与测序引物的摩尔比在约0.25:1至约5:1的范围内。
阵列的第二方面的一个实例还包括结合至间隔物的三重态猝灭剂、抗氧化剂或荧光共振能量转移(FRET)供体。在该方面的一些实例中，三重态猝灭剂选自由以下组成的组：环辛基四烯(COT)、Trolox和硝基苄基醇(NBA)。在该方面的一些实例中，抗氧化剂选自由以下组成的组：抗坏血酸盐、谷胱甘肽、没食子酸、儿茶素、Trolox和维生素E。在该方面的一些实例中，FRET供体选自由以下组成的组：具有绿色发光染料的FRET的供体染料和具有红色发光染料的FRET的供体染料。
在阵列的第二方面的一个实例中，间隔物通过末端官能团被接枝至凝胶材料。在一些实例中，官能团选自由以下组成的组：炔烃、降冰片基、无铜点击部分和硫醇。
应理解，阵列的第二方面的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，应理解，第一方面和/或第二方面的特征的任何组合可以一起被使用，和/或来自这些方面中的任一方面或两者的任何特征可以与本文公开的任何实例组合。
方法的一个方面包括：将凝胶材料定位在支持物的多于一个离散孔中的各个孔中，将测序引物接枝至凝胶材料，以及将非测序实体接枝至凝胶材料。
在方法的该方面的一个实例中，在非测序实体被接枝至凝胶材料之前或之后，测序引物被接枝至凝胶材料。
在方法的该方面的另一个实例中，测序引物和非测序实体被共接枝至凝胶材料。共接枝通过将测序引物和非测序实体的混合物沉积到其上具有凝胶材料的支持物上；并且在预定的温度孵育支持物来完成。
在方法的该方面中，非测序实体选自由以下组成的组：树状聚合物、聚右旋糖酐、甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、聚(乙二醇)、聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、甲基丙烯酸炔丙酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙二醇)丙烯酸酯、聚(丙烯亚胺)、聚(乙烯醇)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酸、聚(trolox酯)、肽和非功能性引物；并且非测序实体通过末端官能团被接枝至凝胶材料。在一些实例中，末端官能团选自由以下组成的组：炔烃、降冰片基、无铜点击部分和硫醇。
在方法的一些方面中，非测序实体还包括结合至其的三重态猝灭剂、抗氧化剂或荧光共振能量转移(FRET)供体。
应理解，方法的该方面的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，应理解，方法的该方面的特征的任何组合可以与阵列的任何方面和/或本文公开的任何实例组合。
详细描述
本文公开的阵列的实例包括若干个位点，这些位点各自具有附接至凝胶材料的测序引物和非测序实体。测序引物可以用于结合和扩增脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，而非测序实体不参与结合或扩增。相反，非测序实体充当测序引物之间的间隔物。间隔开测序引物可以通过限制参与扩增过程的蛋白质的空间位阻来增强扩增。
除了充当间隔物之外，非测序实体还可以将其他功能引入阵列。作为实例，非测序实体可以i)在扩增和测序期间限制酶、蛋白质和/或其他小分子与凝胶材料的非特异性结合；ii)增加凝胶材料的亲水性，这可以帮助防止其在干燥条件下塌陷；iii)增强连接至凝胶材料的染料的荧光性质；和/或iv)i、ii和/或iii的组合。仍然进一步地，非测序实体可以帮助从表面暴露功能性表面引物。
应理解，除非另外说明，否则本文使用的术语将采用它们在相关领域中的普通含义。下文阐述了本文使用的若干个术语和它们的含义。
除非上下文另外清楚地指出，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”、和“该(the)”包括复数指示物。
如本文使用的，“烷基”指的是完全饱和(即，不包含双键或三键)的直链或支链的烃链。烷基基团可以具有1个至20个碳原子。示例性烷基基团包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基及类似基团。作为实例，名称“C1-4烷基”指示在烷基链中存在一个至四个碳原子，即，该烷基链选自由以下组成的组：甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。
如本文使用的，“烯基”指的是包含一个或更多个双键的直链或支链的烃链。烯基基团可以具有2个至20个碳原子。示例性烯基基团包括乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基及类似基团。烯基基团可以被指定为例如“C2-4烯基”，其指示在烯基链中存在两个至四个碳原子。
如本文使用的，“炔基”指的是包含一个或更多个三键的直链或支链的烃链。炔基基团可以具有2个至20个碳原子。炔基基团可以被指定为例如“C2-4炔基”，其指示在炔烃链中存在两个至四个碳原子。
“氨基”官能团指的是-NRaRb基团，其中Ra和Rb各自独立地选自氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基，如本文定义的。
如本文使用的，“芳基”指的是在环骨架中仅包含碳的芳香族环或芳香族环体系(即，共享两个相邻的碳原子的两个或更多个稠环)。当芳基是环体系时，该体系中的每一个环是芳香族的。芳基基团可以具有6个至18个碳原子，其可以被指定为C6-18。芳基基团的实例包括苯基、萘基、薁基和蒽基。
措辞“如接枝的形式”指的是引物和/或非测序实体如同由于接枝而附接至凝胶材料，并且没有任何改变的状态。在本文公开的实例中，呈其如接枝的形式的非测序实体不能经历DNA或RNA测序。换言之，从非测序实体被接枝至凝胶材料的点，非测序实体不能被测序。照此，不必采取额外的处理步骤以便使非测序实体在测序期间为非反应性的。相反，当非测序实体被接枝时，它不能被测序。
如本文使用的，术语“附接”指的是两个事物彼此接合、紧固、粘附、连接或结合的状态。例如，核酸可以通过共价键或非共价键附接至诸如凝胶材料的材料。共价键的特征在于共享原子之间的电子对。非共价键是不涉及电子对的共享的化学键，并且可以包括例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。
“叠氮化物”或“叠氮基”官能团指的是-N3。
如本文使用的，“碳环基”意指在环体系骨架中仅包含碳原子的非芳香族环或非芳香族环体系。当碳环基是环体系时，两个或更多个环可以以稠合的、桥接的或螺连接的方式接合在一起。碳环基可以具有任何饱和度，条件是在环体系中的至少一个环不是芳香族的。因此，碳环基包括环烷基、环烯基和环炔基。碳环基基团可以具有3个至20个碳原子(即，C3-20)。碳环基环的实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、2,3-二氢-茚、双环[2.2.2]辛基、金刚烷基以及螺[4.4]壬基。
如本文使用的，如本文使用的术语“羧酸”或“羧基”指的是-C(O)OH。
如本文使用的，“环烷基”意指完全饱和的碳环基环或碳环基环体系。实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。
如本文使用的，“亚环烷基”意指经由两个附接点附接至分子的剩余部分的完全饱和的碳环基环或碳环基环体系。
如本文使用的，“环烯基”或“环烯烃”意指具有至少一个双键的碳环基环或碳环基环体系，其中环体系中没有环是芳香族的。实例包括环己烯基或环己烯和降冰片烯或降冰片烯基。也如本文使用的，“杂环烯基”或“杂环烯烃”意指具有至少一个双键的、在环骨架中具有至少一个杂原子的碳环基环或碳环基环体系，其中环体系中没有环是芳香族的。
如本文使用的，“环炔基”或“环炔烃”意指具有至少一个三键的碳环基环或碳环基环体系，其中环体系中没有环是芳香族的。一个实例是环辛炔。另一个实例是双环壬炔。也如本文使用的，“杂环炔基”或“杂环炔烃”意指具有至少一个三键的、在环骨架中具有至少一个杂原子的碳环基环或碳环基环体系，其中环体系中没有环是芳香族的。
如本文使用的术语“沉积”指的是任何合适的施加技术，其可以是手动的或自动的。通常，沉积可以使用气相沉积技术、涂覆技术、接枝技术或类似技术来进行。一些具体的实例包括化学气相沉积(CVD)、喷涂、旋涂、浸泡或浸涂、水坑分配(puddle dispensing)或类似技术。
当提及物品的集合使用时，术语“各个(each)”旨在识别集合中的单个项目，但不一定指的是集合中的每个(every)项目。如果明确的公开内容或上下文另外清楚地指出，则可能发生例外。
“荧光增强剂”是可以改善荧光的性质或减少光诱导的损伤的任何分子。例如，荧光增强剂可以是改善荧光染料(或在合成测序(SBS)过程中掺入的全功能核苷酸(FFN))的光稳定性的抗氧化剂。对于另一个实例，荧光增强剂可以是荧光共振能量转移(FRET)供体，该荧光共振能量转移(FRET)供体在吸收光谱的一个区域内吸收能量，并且在另一个区域内供给能量以激发染料(例如，其可以附接至核苷酸)。FRET供体可以是FRET的供体染料，其中染料在合成测序(SBS)工作流程中掺入并被检测。对于仍然另一个实例，荧光增强剂可以是三重态猝灭剂，该三重态猝灭剂可以减轻高反应性三重态荧光团可能引起的光诱导的损伤(例如，对核酸的损伤)。三重态猝灭剂可以缩短处于三重态的激发化合物的寿命，从而减少三重态化合物可能对附接至凝胶材料的另一组分造成光诱导的损伤的时间量。
如本文使用的，术语“凝胶材料”旨在意指对液体和气体可渗透的半刚性材料。通常，凝胶材料是水凝胶，该水凝胶当液体被吸收时可以膨胀，并且当液体通过干燥被去除时可以收缩。
如本文使用的，“杂芳基”指的是在环骨架中包含一个或更多个杂原子(即，不同于碳的元素，包括但不限于氮、氧和硫)的芳香族环或芳香族环体系(即，共享两个相邻原子的两个或更多个稠环)。当杂芳基是环体系时，该体系中的每个环是芳香族的。杂芳基基团可以具有5个-18个环成员。
如本文使用的，“杂环基”意指在环骨架中包含至少一个杂原子的非芳香族环或非芳香族环体系。杂环基可以以稠合的、桥接的或螺连接的方式接合在一起。杂环基可以具有任何饱和度，条件是在环体系中的至少一个环不是芳香族的。在环体系中，杂原子可以存在于非芳香族环或芳香族环中。杂环基基团可以具有3个至20个环成员(即，构成环骨架的原子的数量，包括碳原子和杂原子)。杂环基基团可以被指定为“3-6元杂环基”或类似的指定。在一些实例中，杂原子是O、N或S。
如本文使用的术语“肼”或“肼基”指的是-NHNH2基团。
如本文使用的术语“腙”或“腙基”指的是
基团，其中Ra和Rb之前在本文中被定义。
如本文使用的，“羟基”是–OH基团。
如本文使用的，术语“间隙区域”指的是基底/支持物中的或表面上的区域，该区域分离基底或表面的其他区域。例如，间隙区域可以将阵列的一个特征与阵列的另一个特征分离。彼此分离的两个特征可以是离散的，即，缺乏彼此接触。在另一个实例中，间隙区域可以将特征的第一部分与特征的第二部分分离。在许多实例中，间隙区域是连续的，而特征是离散的，例如，如对于在其他连续表面中限定的多于一个孔的情况。由间隙区域提供的分离可以是部分的或完全的分离。间隙区域可以具有与在表面中限定的特征的表面材料不同的表面材料。例如，阵列的特征可以具有超过存在于间隙区域的量或浓度的凝胶材料、测序引物和非测序实体的量或浓度。在一些实例中，凝胶材料、测序引物和非测序实体可以不存在于间隙区域。
如本文使用的“腈氧化物”意指“RaC≡N+O-”基团，其中Ra之前在本文中被定义。制备腈氧化物的实例包括通过用氯酰胺-T处理或通过碱对亚胺酰氯[RC(Cl)＝NOH]的作用从醛肟原位生成。
如本文使用的“硝酮”意指“RaRbC＝NRc +O-”基团，其中Ra和Rb之前在本文中被定义，并且Rc选自如本文定义的C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-7碳环基、C6-10芳基、5-10元杂芳基和5-10元杂环基。
如本文使用的，“核苷酸”包括含氮杂环碱基、糖以及一个或更多个磷酸酯基团。核苷酸是核酸序列的单体单元。在RNA中，糖是核糖，并且在DNA中糖是脱氧核糖，即缺乏存在于核糖中的2’位的羟基基团的糖。含氮杂环碱基可以是嘌呤碱基或嘧啶碱基。嘌呤碱基包括腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)及其修饰的衍生物或类似物。嘧啶碱基包括胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)及其修饰的衍生物或类似物。脱氧核糖的C-1原子结合至嘧啶的N-1或嘌呤的N-9。
本文提及的“非测序实体”可以是不积极参与DNA或RNA合成的任何旁观分子。非测序实体可以用于提供接枝的测序引物之间的间隔。非测序实体还可以具有其他功能，以便诸如限制非特异性结合、增加凝胶材料的亲水性、增强荧光性质或其组合。照此，非测序实体可以是单功能的、双功能的或多功能的。非测序实体的实例包括非功能性引物、聚合物链、肽和/或荧光增强剂。
“非功能性引物”是将不参与DNA或RNA合成的任何单链核酸序列。非功能性引物的实例包括聚T序列或聚A序列。可以选择非功能性引物的长度，使得非特异性杂交不发生。作为实例，非功能性引物长度可以在3至10的范围内。在一些情况下，非功能性引物长度小于10个碱基。
“聚合物链”是包含几个重复单体单元(即，低聚物)或许多重复单体单元(即，聚合物)的分子。聚合物链可以是直链的、支链的或超支化的。支链聚合物的实例包括星形聚合物、梳状聚合物、刷状聚合物、树枝状聚合物、梯形物和树状聚合物。在本文公开的实例中，聚合物链在一个末端处包括可以与凝胶材料反应的末端官能团。在一些情况下，聚合物链的另一个末端可以包括附接三重态猝灭剂、抗氧化剂或染料的末端官能团。在这些情况下，聚合物链可以用作接头，该接头将三重态猝灭剂、抗氧化剂或染料连接(附接)至凝胶材料。
“肽”是由肽键(酰胺键)连接的氨基酸单体的短链。
如本文使用的，“测序引物”被定义为用作DNA或RNA合成的起点的单链核酸序列(例如，单链DNA或单链RNA)。测序引物的5’末端可以被修饰以允许与凝胶材料的偶联反应。测序引物长度可以是任何数目的碱基长的，并且可以包括多种非天然的核苷酸。在一个实例中，测序引物是包含20个碱基至40个碱基的短链。
如本文使用的，“位点”指的是凝胶材料、测序引物和非测序实体可以附接的在支持物上或在支持物中限定的位置。
术语“基底”和“支持物”在本文中可互换使用，并且指的是位点所位于的表面。支持物通常是刚性的，并且不溶于水性液体。支持物对用于修饰凝胶材料的化学物质可以是惰性的。例如，在本文阐述的方法中，固体支持物对用于将测序引物和非测序实体附接至凝胶材料的化学物质可以是惰性的。合适的支持物的实例包括玻璃和改性的或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸树脂、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(PTFE)(诸如来自Chemours的
)、环烯烃/环烯烃聚合物(COP)(诸如来自Zeon的
)、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅和改性的硅、碳、金属、无机玻璃和光学纤维束。
如本文使用的，术语“四嗪”和“四嗪基”指的是包含四个氮原子的六元杂芳基基团。四嗪可以任选地被取代。
如本文使用的“四唑”指的是包含四个氮原子的五元杂环基团。四唑可以任选地被取代。
术语“末端官能团”指的是悬垂于非测序实体上并且因此易于与凝胶材料反应的官能团。
“硫醇”官能团指的是-SH。
如本文使用的，术语“孔”指的是支持物中的离散凹形特征，其具有完全被支持物表面的间隙区域包围的表面开口。孔可以在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，作为实例包括圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数目的顶点)等。与表面正交地截取的孔的横截面可以是弯曲的、正方形的、多边形的、双曲线的、锥形的、角形的(angular)等。
鉴于上文的定义，本文阐述的以及在权利要求中引述的方面和实例能够被理解。
现在参考图1，描绘了阵列10的实例。通常，阵列10包括基底或支持物12以及跨越支持物12的线或流动通道14。各个流动通道14包括多个(mutiple)位点16，这些位点16通过间隙区域18彼此分离。在各个位点16处，测序引物20和非测序实体22被沉积并且附接至凝胶材料(例如，在图2D中的24、24’)。
在图1中图示出的和本公开内容中讨论的阵列10可以设置在流动池中或形成为流动池的一部分，流动池是包括固体表面的室，各种载体流体、试剂等可以流过该固体表面。在一个实例中，流动池可以包括通过密封材料(例如，黑色聚酰亚胺或另一种合适的结合材料)结合至顶部基底的阵列10。结合发生在支持物12、密封材料和顶部基底的结合区域中。结合区域可以位于流动通道之间，使得密封材料将一条流动通道14与相邻的流动通道14物理地分离(以防止交叉污染)，并且可以位于流动池的外围(以密封流动池免受外部污染)。然而，应理解，取决于实施方式，结合区域和密封材料可以位于任何期望的区域。结合可以经由激光结合、扩散结合、阳极结合、共晶结合、等离子体活化结合、玻璃料结合或本领域已知的其他方法来完成。
可以与阵列10整合和/或在本公开内容的方法中容易使用的流动池和相关的流体系统和检测平台的其他实例在以下中被描述：例如，Bentley等人，Nature 456:53-59(2008)，WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281，以及US 2008/0108082，这些文献各自通过引用以其整体并入本文。
在一些应用中，流动池在反应自动化装置中诸如在核苷酸测序仪中用于进行受控的化学或生物化学反应。端口26可以钻穿支持物12。通过连接至端口26，反应自动化装置可以控制密封的流动通道14中的试剂和产品的流动。在一些应用中，反应自动化装置可以调节流动池的压力、温度、气体组成和其他环境条件。此外，在一些应用中，端口26可以钻入顶部基底中，或钻入支持物12和顶部基底两者中。在一些应用中，通过对热、光发射和/或荧光进行成像或测量，可以通过顶部基底和/或支持物12监测在密封的流动通道14中发生的反应。
应理解，流动通道14、位点16等的特定取向可以不同于图1中图示出的那些。在一些实例中，位点16是连续的，并且因此不需要由间隙区域18分离。
图1的阵列10以及可以如何制造阵列10的实例现在将参考图2A至2D更详细地描述。
图2A描绘了支持物12，该支持物12具有限定在其中并且由间隙区域18分离的位点16。该支持物12具有图案化表面。“图案化表面”指的是不同的区域(即，位点16)在固体支持物12的暴露的层中或暴露的层上的布置。例如，位点16中的一个或更多个可以是其中存在一个或更多个测序(扩增)引物20和非测序实体22的特征。特征可以由间隙区域18分离，在该间隙区域18中不存在测序引物20和非测序实体22。可以设想位点16的许多不同的布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在一个实例中，位点16被设置成六边形栅格用于紧密填充和改善的密度。其他布局可以包括例如直线(即，矩形)布局、三角形布局等等。作为实例，布局或图案可以是呈行和列的x-y格式的位点16。在一些其他实例中，布局或图案可以是位点16和/或间隙区域18的重复布置。在仍然其他实例中，布局或图案可以是位点16和/或间隙区域18的随机布置。图案可以包括斑点、垫、孔、柱、条带、漩涡、线、三角形、矩形、圆形、弧形、棋盘格、方格、对角线、箭头、正方形和/或交叉影线。可以用于本文阐述的实例的图案化表面的仍然其他实例在美国专利第8,778,849号；第9,079,148号；第8,778,848号，以及美国专利公布第2014/0243224号中描述，这些文献各自通过引用以其整体并入本文。
布局或图案可以在所限定的区域中的位点16的密度(即，位点16的数目)方面表征。例如，位点16可以以每mm2约200万的密度存在。密度可以被调节至不同的密度，包括例如每mm2至少约100、每mm2约1,000、每mm2约10万、每mm2约100万、每mm2约200万、每mm2约500万、每mm2约1000万、每mm2约5000万或更大的密度。可选择地或另外地，密度可以被调节为不大于每mm2约5000万、每mm2约1000万、每mm2约500万、每mm2约200万、每mm2约100万、每mm2约10万、每mm2约1,000、每mm2约100或更小。还应理解，支持物12上的位点16的密度可以在选自上文的范围的一个较低值和一个较高值之间。作为实例，高密度阵列可以被表征为具有被分隔开小于约15μm的位点16，中等密度阵列可以被表征为具有被分隔开约15μm至约30μm的位点16，并且低密度阵列可以被表征为具有被分隔开大于约30μm的位点16。
布局或图案也可以或可选择地根据平均间距(pitch)，即从位点16的中心到相邻间隙区域18的中心的间隔(中心到中心的间隔)来表征。图案可以是规则的，使得围绕平均间距的变异系数小，或者图案可以是非规则的，在这种情况下，变异系数可以是相对大的。在任一情况下，平均间距可以是例如至少约10nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或更大。可选择地或另外地，平均间距可以是例如至多约100μm、约10μm、约5μm、约1μm、约0.5μm、约0.1μm或更小。位点16的特定图案的平均间距可以在选自上文的范围的一个较低值和一个较高值之间。在实例中，位点16具有约1.5μm的间距(中心到中心的间隔)。
在一些实例中，位点16是孔16’，并且因此支持物12包括在其表面中的孔16’的阵列。孔16’(或具有不同的配置诸如形状、横截面等的其他位点16)可以使用多种技术来制造，包括例如光刻术、纳米压印光刻术、冲压技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术、印刷技术等。如本领域技术人员将理解的，使用的技术将取决于支持物12的组成和形状。
孔16’可以是微孔(具有至少一个微米尺度的尺寸，例如，约1μm至约1000μm)或纳米孔(具有至少一个纳米尺度的尺寸，例如，约1nm至约1000nm)。各个孔16’可以通过其体积、孔开口面积、深度和/或直径来表征。
各个孔16’可以具有能够限制液体的任何体积。最小体积或最大体积可以被选择，例如以适应对阵列10的下游使用所预期的吞吐量(例如，多重性)、分辨率、分析物组成或分析物反应性。例如，体积可以是至少约1×10-3μm3、约1×10-2μm3、约0.1μm3、约1μm3、约10μm3、约100μm3或更大。可选择地或另外地，体积可以是至多约1×104μm3、约1×103μm3、约100μm3、约10μm3、约1μm3、约0.1μm3或更小。应理解，凝胶材料24可以填充孔16’的全部或部分体积。在单独的孔16’中的凝胶材料24的体积可以大于上文指定的值、小于上文指定的值或在上文指定的值之间。
可以基于与上文关于孔体积阐述的标准类似的标准来选择由表面上的每个孔开口占据的面积。例如，用于表面上的各个孔开口的面积可以是至少约1×10-3μm2、约1×10-2μm2、约0.1μm2、约1μm2、约10μm2、约100μm2或更大。可选择地或另外地，面积可以是至多约1×103μm2、约100μm2、约10μm2、约1μm2、约0.1μm2、约1×10-2μm2或更小。
各个孔16’的深度可以是至少约0.1μm、约1μm、约10μm、约100μm或更大。可选择地或另外地，深度可以是至多约1×103μm、约100μm、约10μm、约1μm、约0.1μm或更小。
在一些情况下，各个孔16’的直径可以是至少约50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约10μm、约100μm或更大。可选择地或另外地，直径可以是至多约1×103μm、约100μm、约10μm、约1μm、约0.5μm、约0.1μm、约50nm或更小。
在形成的阵列10中，凝胶材料24位于各个离散孔16’中。将凝胶材料24定位在各个孔16’中可以通过以下来完成：首先用凝胶材料24涂覆支持物12的图案化表面，如图2B所示，并且然后例如经由化学或机械抛光至少从结构化支持物12的表面上孔16’之间的间隙区域18去除凝胶材料24。在一些实例中，凝胶材料可以通过不需要化学抛光或机械抛光的洗涤步骤从间隙区域去除。这些过程将凝胶材料24的至少一些保持在孔16’中，但从结构化支持物12的表面上孔16’之间的间隙区域18去除至少大体上所有凝胶材料24或使至少大体上所有凝胶材料24失活。照此，这些过程产生了用于测序的凝胶垫24’(图2D)，凝胶垫24’经具有大量循环的测序运行可以是稳定的。在其他实例中，凝胶材料24通过选择性沉积技术定位在各个孔16’中，该选择性沉积技术同样不需要化学抛光步骤或机械抛光步骤以从间隙区域去除凝胶材料。
特别有用的凝胶材料24将符合其所在的位点16的形状。一些有用的凝胶材料24既可以(a)符合其所在的位点16(例如，孔16’或其他凹形特征)的形状，并且(b)具有至少大体上不超过其所在的位点16的体积的体积。
合适的凝胶材料24的一个实例包括具有式(I)的重复单元的聚合物：
其中：
R1是H或任选地被取代的烷基；
RA选自由以下组成的组：叠氮基、任选地被取代的氨基、任选地被取代的烯基、任选地被取代的腙、任选地被取代的肼、羧基、羟基、任选地被取代的四唑、任选地被取代的四嗪、腈氧化物、硝酮和硫醇；R5选自由以下组成的组：H和任选地被取代的烷基；
各个-(CH2)p-可以任选地被取代；
p是在1至50的范围内的整数；
n是在1至50,000的范围内的整数；并且
m是在1至100,000的范围内的整数。
合适的如式(I)的聚合物在例如美国专利公布第2014/0079923A1号或第2015/0005447A1号中描述，这些文献各自通过引用以其整体并入本文。在式(I)的结构中，本领域普通技术人员将理解，“n”和“m”亚基是以随机顺序存在于整个聚合物中的重复亚基。
诸如式(I)的聚合物涂层的具体实例是在例如美国专利公布第2014/0079923A1号或第2015/0005447A1号中描述的聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺(PAZAM)，其包括下文示出的结构：
其中n是在1-20,000的范围内的整数，并且m是在1-100,000的范围内的整数。如同式(I)，本领域普通技术人员将认识到，“n”和“m”亚基是以随机顺序存在于整个聚合物结构中的重复单元。
式(I)聚合物或PAZAM聚合物的分子量可以在约10kDa至约1500kDa的范围内，或者在具体的实例中，可以是约312kDa。
在一些实例中，式(I)聚合物或PAZAM聚合物是直链聚合物。在一些其他实施方案中，式(I)聚合物或PAZAM聚合物是轻度交联的聚合物。在其他实例中，式(I)聚合物或PAZAM聚合物包括分支。其他合适的聚合物是SFA和用溴乙酰胺基团衍生的SFA(例如，BRAPA)的共聚物、或SFA和用叠氮基乙酰胺基团衍生的SFA的共聚物。
合适的凝胶材料24的其他实例包括具有以下结构的那些：胶体结构，诸如琼脂糖；或聚合物网状结构，诸如明胶；或交联的聚合物结构，诸如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、无硅烷丙烯酰胺(SFA，参见，例如，美国专利公布第2011/0059865号，其通过引用以其整体并入本文)或叠氮化形式的SFA。合适的聚丙烯酰胺聚合物的实例可以由丙烯酰胺和丙烯酸或含有乙烯基基团的丙烯酸形成，如例如在WO 2000/031148(通过引用以其整体并入本文)中描述的，或者由形成[2+2]光环加成反应的单体形成，例如在WO 2001/001143或WO 2003/0014392(其各自通过引用以其整体并入本文)中描述的。
凝胶材料24可以是预形成的凝胶材料。预形成的凝胶材料可以使用旋涂、或浸渍、或在正压或负压下凝胶的流动、或在美国专利第9,012,022号中阐述的技术来涂覆，该专利通过引用以其整体并入本文。浸渍或浸涂可以是选择性沉积技术，这取决于所使用的支持物12和凝胶材料24。作为实例，将图案化支持物12浸入预形成的凝胶材料24中，并且凝胶材料24可以选择性地填充位点16(即，凝胶材料24不沉积在间隙区域18上)，并且抛光(或另一种去除过程)可以不是必需的。
预形成的聚合物或PAZAM可以使用旋涂、或浸渍、或在正压或负压下凝胶的流动、或美国专利第9,012,022号中阐述的技术来涂覆在图案化支持物12上。聚合物或PAZAM的附接还可以经由表面引发的原子转移自由基聚合(SI-ATRP)至硅烷化表面来发生。在该实例中，支持物12表面可以用APTS(甲氧基硅烷或乙氧基硅烷)预处理以将硅共价连接至表面上的一个或更多个氧原子(不旨在通过机制保持，各个硅可以结合至一个、两个或三个氧原子)。该化学处理的表面被烘烤以形成胺基团单层。胺基团然后与磺基-HSAB反应以形成叠氮基衍生物。在21℃用1J/cm2至30J/cm2的能量的UV活化产生了活性氮宾物质，该活性氮宾物质可以容易地与PAZAM进行多种插入反应。
用于将PAZAM涂覆在支持物12上的其他实例在美国专利公布第2014/0200158号(该专利通过引用以其整体并入本文)中描述，并且包括紫外(UV)介导的PAZAM单体与胺官能化的表面的连接，或涉及活性基团(丙烯酰氯或其他含烯烃或炔烃的分子)的热连接反应，随后沉积PAZAM并施加热。在一些实例中，表面用烯基基团或环烯基基团修饰，然后它们可以在诸如点击化学的条件下与叠氮基官能化的聚合物诸如PAZAM或包括叠氮基衍生的SFA的聚合物反应，以在修饰的表面和聚合物之间形成共价键。
在仍然其他实例中，PAZAM可以沉积在支持物12上，支持物12在其表面包括可以附接至PAZAM的官能团的硅烷或硅烷衍生物。例如，硅烷或硅烷衍生物可以包含可以共价附接至PAZAM的官能团的不饱和部分(例如，环烯烃、环炔烃、杂环烯烃、杂环炔烃、其被取代的变体及其组合)。环烯烃不饱和部分的实例包括降冰片烯、降冰片烯衍生物(例如，包含取代碳原子中的一个的氧或氮的(杂)降冰片烯)、反式环辛烯、反式环辛烯衍生物、反式环戊烯、反式环庚烯、反式环壬烯、双环[3.3.1]壬-1-烯、双环[4.3.1]癸-1(9)-烯、双环[4.2.1]壬-1(8)-烯以及双环[4.2.1]壬-1-烯。这些环烯烃中的任一种可以被取代，如在美国专利公布第2015/0005447号中描述的，该专利通过引用以其整体并入本文。降冰片烯衍生物的实例包括[(5-双环[2.2.1]庚-2-烯基)乙基]三甲氧基硅烷。环炔烃不饱和部分的实例包括环辛炔、环辛炔衍生物或双环壬炔(例如，双环[6.1.0]壬-4-炔或其衍生物、双环[6.1.0]壬-2-炔、或双环[6.1.0]壬-3-炔)。这些环炔烃也可以被取代，如在美国专利公布第2015/0005447号中描述的。
在这些实例中，PAZAM可以使用旋涂、或浸渍或浸涂、或在正压或负压下官能化分子的流动、或美国专利第9,012,022号中阐述的技术来沉积在硅烷化支持物12的表面上。为了沉积，PAZAM可以存在于溶液中(例如，乙醇和水的混合物)。在沉积之后，PAZAM溶液也可以暴露于固化过程以形成凝胶材料24。
凝胶材料24可以是随后形成凝胶材料24的液体。施加随后形成凝胶材料24的液体的实例是，用呈液体形式的无硅烷丙烯酰胺和N-[5-(2-溴乙酰基)氨基戊基]丙烯酰胺(BRAPA)涂覆位点16的阵列，并且允许试剂通过在表面上聚合以形成凝胶。另一个实例涉及用呈液体形式的PAZAM单体涂覆位点16的阵列，并且允许试剂通过在表面上聚合以形成凝胶。以该方式涂覆阵列可以使用如在美国专利公布第2011/0059865号中阐述的化学试剂和程序。
凝胶材料24可以共价连接至支持物12(在位点16处)，或可以不共价连接至支持物12。凝胶材料24与位点16的共价连接有助于在多种用途期间在阵列10的整个寿命中将凝胶保持在结构化位点16中。以下是可以在支持物12的一些实例上的PAZAM和硅烷或硅烷衍生物之间发生的反应的一些实例，这些反应导致共价连接。
当支持物12上的硅烷或硅烷衍生物包括降冰片烯或降冰片烯衍生物作为不饱和部分时，降冰片烯或降冰片烯衍生物可以：i)与PAZAM的叠氮化物/叠氮基基团进行1,3-偶极环加成反应；ii)与附接至PAZAM的四嗪基团进行偶联反应；与附接至PAZAM的腙基团进行环加成反应；与附接至PAZAM的四唑基团经历光点击反应；或者与附接至PAZAM的腈氧化物基团进行环加成。
当支持物12上的硅烷或硅烷衍生物包括环辛炔或环辛炔衍生物作为不饱和部分时，环辛炔或环辛炔衍生物可以：i)与PAZAM的叠氮化物/叠氮基进行应变促进的叠氮化物-炔烃1,3-环加成(SPAAC)反应，或ii)与附接至PAZAM的腈氧化物基团进行应变促进的炔烃-腈氧化物环加成反应。
当支持物12上的硅烷或硅烷衍生物包括双环壬炔作为不饱和部分时，由于双环环体系中的应变，双环壬炔可以与附接至PAZAM的叠氮化物或腈氧化物进行类似的SPAAC炔烃环加成。
如上文提及的并且在许多实例中，虽然提供了支持物12和凝胶材料24之间的共价连接的若干个实例，但凝胶材料24不需要共价连接至位点16。例如，无硅烷丙烯酰胺SFA未共价附接至支持物12的任何部分。
如上文提及的，图2C图示出了凝胶材料24从间隙区域18的去除。去除可以经由抛光来完成。抛光可以是机械处理过程和/或化学处理过程。
机械抛光可以通过向固体支持物12的表面(其上具有凝胶材料24)施加磨蚀力来进行。示例性方法包括用珠的浆料磨蚀、用片材或布擦拭、刮擦等等。将理解，用于抛光的珠可以是球形的或可以不是球形的，并且可以具有不规则形状、多边形形状、卵形形状、细长形状、圆柱形状等。珠的表面可以是光滑的或粗糙的。多种颗粒中的任一种可以用作用于抛光的珠。抛光的一个实例包括使用涂覆有3μm二氧化硅珠浆料(在水中10％w/v)的无绒(洁净室级)擦拭物从间隙区域18去除凝胶材料24。抛光轮/研磨机还可以与该浆料或另一种浆料一起使用。
机械抛光的仍然另一个实例还可以使用流体喷射或气体(例如，空气或惰性气体诸如氩气或氮气)喷射以从间隙区域18去除凝胶来实现。
还可以使用化学抛光技术，诸如丙烯酰胺的水解或基于自由基的降解(例如经由暴露于过氧化苯甲酰或稀释的过氧化氢)。在该形式的抛光期间，化学物质可以以固态、液态、气态或等离子态提供。因此，在一些实例中，等离子体抛光可以是有用的。
抛光还可以涉及化学抛光方法和机械抛光方法的组合，其中使用包含颗粒的胶体悬浮液的化学浆料以从间隙区域18机械剥离并且然后化学溶解凝胶材料24的移位部分。在实例中，化学机械抛光系统，例如，晶片抛光机包括Strasbaugh ViPRR II或其他合适的抛光头，可以用于从间隙区域18去除凝胶材料24，而不有害地影响在那些区域18处的下面的支持物12。这种类型的抛光系统可以与先前描述的二氧化硅珠浆料一起使用，或与更温和的化学浆料一起使用。在实例中，温和的化学浆料是包含选自由以下组成的组的研磨颗粒的碱性的水性浆料：碳酸钙(CaCO3)和聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)。CaCO3的平均粒度可以在约15nm至约5μm的范围内，并且在一个实例中是约700nm。除了CaCO3之外，碱性的水性浆料还可以包括缓冲剂、螯合剂、表面活性剂和/或分散剂。缓冲剂的实例包括tris碱(即，三(羟甲基)氨基甲烷)，其可以存在于具有约9的pH的溶液中。螯合剂的实例是乙二胺四乙酸(EDTA)，其可以存在于具有约8的pH的溶液中。表面活性剂的实例是十二烷基硫酸钠。可以使用具有不同分子量的聚丙烯酸盐分散剂。分散剂的实例是聚(丙烯酸钠盐)。
抛光或清洁间隙区域18的其他方法包括基于粘合剂的技术，例如，其中施加对凝胶材料24具有亲和力的刚性的平面的粘合剂膜，从而与间隙区域18中的凝胶材料24形成紧密接触(例如，经由化学连接(linkage))的技术。该粘合剂膜的机械除去/剥离将导致凝胶材料24从间隙区域18机械去除，同时将凝胶材料24留在位点16。
在一个实例中，硫代磷酸酯接枝的SFA可以按照以下从支持物12表面上的间隙区域18去除：将水润湿的Whatman擦拭物可以轻擦至氧化铝(～100mg，0.3um)或钢珠内，并且然后可以将形成的浆料使用均匀的压力以小同心圆擦拭在支持物(其上具有硫代磷酸酯接枝的SFA)的表面上，并且然后可以使用洁净的水润湿的Whatman擦拭物来从表面上去除浆料和硫代磷酸酯接枝的SFA。
本文例示的用于从间隙区域18去除凝胶材料24的机械抛光方法和化学抛光方法还可以用于使间隙区域18处的凝胶材料失活，无论凝胶材料24是否被去除。例如，凝胶材料24可以在附接测序引物20和非测序实体22的能力方面失活。
在凝胶材料24被定位在各个孔16’中之后，测序引物20和非测序实体22被接枝至凝胶材料24。在一些实例中，引物20可以在非测序实体22接枝至凝胶材料24之前或之后被接枝。在其他实例中，引物20和非测序实体22被共接枝至凝胶材料24。
顺序接枝可以通过将支持物12(在位点16中具有凝胶材料24)暴露于包含测序引物20的溶液或混合物并孵育，并且然后暴露于包含非测序实体22的溶液或混合物并孵育来完成。可选择地，顺序接枝可以通过将支持物12(在位点16中具有凝胶材料24)暴露于包含非测序实体22的溶液或混合物并孵育，并且然后暴露于包含测序引物20的溶液或混合物并孵育来完成。
共接枝可以通过将支持物12(在位点16中具有凝胶材料24)暴露于包含测序引物20和非测序实体22的溶液或混合物并且然后孵育来完成。支持物12暴露于该溶液或混合物可以通过将测序引物20和非测序实体22的混合物沉积在支持物12上来完成。在一个实例中，溶液或混合物可以流过凝胶材料24涂覆的支持物12(在图2C中示出)。
在任何接枝实例中，孵育在预定的温度发生，该预定的温度部分地取决于所使用的测序引物20和非测序实体22。作为实例，孵育可以在从室温(即，约25℃)至约60℃的范围内的温度完成。
此外在任何接枝实例中，溶液可以包含测序引物20和/或非测序实体22、水、缓冲剂和催化剂。非测序实体22与测序引物20的摩尔比在约0.25:1至约5:1的范围内，无论存在于相同的溶液/混合物中还是不同的溶液/混合物中。
合适的测序引物20的实例包括正向扩增引物或反向扩增引物。合适的测序引物20的实例包括P5引物或P7引物。P5引物和P7引物在由Illumina Inc.销售的商业流动池的表面上使用，以用于在
仪器平台、
仪器平台、
仪器平台、
仪器平台和Genome
仪器平台上测序。P5引物和P7引物序列包括以下：
P5：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGA(dU)CTACAC(SEQ.ID NO.1)
P7：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT(SEQ.ID NO.2)
其中G*是8-氧代鸟嘌呤。
任选地，P5引物和P7引物中的一个或两个可以包括聚T尾。聚T尾通常位于序列的5’末端，但在一些情况下可以位于3’末端。聚T序列可以包含任何数目的T核苷酸，例如，2个至20个。
P5引物和P7引物以及其他测序引物20可以在5’末端处用能够与凝胶材料24的官能团反应的基团修饰。合适的官能团的一个实例是双环[6.1.0]壬-4-炔(BCN)，其可以与凝胶材料24的叠氮化物反应。其他示例性封端的引物包括四嗪封端的引物、降冰片烯封端的引物、炔烃封端的引物、氨基封端的引物、环氧基或缩水甘油基封端的引物、硫代磷酸酯封端的引物和三唑啉二酮封端的引物。在一些实施方案中，封端的引物包括炔烃封端的引物。在其他实施方案中，封端的引物包括硫代磷酸酯封端的引物。本领域技术人员将理解如何设计和使用适合用于捕获和扩增如本文呈现的核酸的测序引物20。
合适的非测序实体22的实例包括非功能性引物、聚合物链、肽和/或荧光增强剂。
如上文提及的，非功能性引物是将不参与DNA或RNA合成的呈其如接枝的形式的任何单链核酸序列。实例包括聚T序列或聚A序列。
聚合物链的实例包括树状聚合物(例如，聚(酰氨基)胺或PAMAM)、聚右旋糖酐、甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(PCA)、聚(乙二醇)(PEG，即聚(环氧乙烷)或PEO)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚-L-赖氨酸(PLL)、甲基丙烯酸炔丙酯(PMA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚(乙二醇)丙烯酸酯(POEGA)、聚(丙烯亚胺)(PPI，其是树状聚合物核心)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酸(PAA)以及聚(trolox酯)。
这些聚合物链材料各自可以用作间隔物，以在附接至凝胶材料24的测序引物20之间产生额外的间隔。这些聚合物链材料的一些还具有可以增加凝胶材料24的亲水性和限制凝胶材料24上的非特异性结合的性质。该聚合物链材料的实例包括PEG。在本文公开的实例中，PEG具有在约0.5KDa至约10KDa的范围内的分子量。其他聚合物链材料也是多功能的，例如，聚(trolox酯)可以是间隔物并且可以是抗氧化剂。
聚合物链包括可以与凝胶材料24的基团反应的官能团，或者被修饰为包括可以与凝胶材料24的基团反应的官能团。这样的官能团的实例包括炔烃、降冰片基、无铜点击部分(例如，二苯并环辛炔(DIBO)或其他)和硫醇。炔、降冰片基和无铜点击部分可以经由点击反应与PAZAM的叠氮化物反应。硫醇可以与SFA反应。包含所列出的官能团中的一个的聚合物链材料的实例是PMA，其包括炔烃。修饰的聚合物链的实例包括炔烃封端的PEG、炔烃封端的PMMA、降冰片基封端的PMMA、硫醇封端的PNIPAM、炔烃封端的PVA、硫醇封端的PVA、炔烃封端的PAA以及硫醇封端的PAA。
在一些实例中，所描述的聚合物链可以被接枝至凝胶材料24作为非测序实体22。
在其他实例中，所描述的聚合物链可以是将荧光增强剂诸如三重态猝灭剂、抗氧化剂或FRET供体附接至凝胶材料24的接头分子。例如，聚合物链可以在一个末端处用炔烃封端以附接至凝胶材料24，并且在另一个末端处用官能团(例如，硫醇、胺、醛或羧酸)封端以附接至三重态猝灭剂、抗氧化剂或FRET供体。
合适的三重态猝灭剂的实例选自由以下组成的组：环辛基四烯(COT)、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Hoffmann-La Roche AG))和硝基苄基醇(NBA)。合适的抗氧化剂的实例选自由以下组成的组：抗坏血酸盐、谷胱甘肽、没食子酸、儿茶素、Trolox和维生素E。所附接的FRET供体用全功能核苷酸(FFN)(在测序中检测、在合成测序(SBS)中掺入的染料)被定制或选择成具有最佳的光谱重叠和FRET效率。FRET供体的实例选自由以下组成的组：具有绿色发光染料(在测序工作流程中掺入核苷酸)的FRET的供体染料和具有红色发光染料(在测序工作流程中掺入核苷酸)的FRET的供体染料。具有绿色发光全功能核苷酸(FFN)的FRET的供体染料的具体实例包括
(花青染料，Jackson ImmunoResearchLaboratories,Inc.)、Alexa
染料(例如，488)(ThermoFisher Scientific)和Atto染料(例如，465、488和490)(Atto-Tec)；并且具有红色发光FFN的FRET的供体染料的具体实例包括
(花青染料，Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.)、Alexa
染料(例如，546、555、568和594)(ThermoFisher Scientific)和Atto染料(例如，532)(Atto-Tec)。FRET供体可以适合用于一种或两种涉及542nm、550nm、565nm(吸收波长)和/或罗丹明6G的染料合成测序配置。
在这些其他实例中，聚合物链和所附接的荧光增强剂一起构成非测序实体22。在这些其他实例中，聚合物链的另一个末端(例如，与附接至凝胶材料24的末端相对的末端)包含可以并入荧光增强剂的基团或与荧光增强剂的基团反应的官能团，或者被修饰为包含可以并入荧光增强剂的基团或与荧光增强剂的基团反应的官能团。这样的官能团的实例包括硫醇、胺、醛和羧酸。也可以使用可以将荧光增强剂附接至聚合物链的其他官能团。
作为实例，维生素E可以缀合至PAA，并且谷胱甘肽、抗坏血酸、没食子酸或儿茶素可以缀合至PEG或PMMA。
作为其他实例，FRET供体可以缀合至具有炔烃基团或用炔烃基团修饰的任何聚合物链。
非测序实体的仍然另一个实例是肽。
如接枝的测序引物20和非测序实体22在图2D和图3中示出。接枝的非测序实体22与接枝的测序引物20的摩尔比在约0.25:1至约5:1的范围内。在另一个实例中，接枝的非测序实体22与接枝的测序引物20的摩尔比在约0.5:1至约2:1的范围内。如接枝的非测序实体22将不参与随后进行的测序技术，而是在位点16中分隔开测序引物20，并且可以为位点16提供额外的功能。
本文公开的阵列10可以用于多种测序方法或技术，包括通常被称为合成测序(SBS)、连接测序、焦磷酸测序等的技术。利用这些技术中的任一种，由于凝胶材料24和附接的测序引物20存在于位点16中并且不存在于间隙区域18上，扩增将限于不同的位点16。
简言之，合成测序(SBS)反应可以在诸如来自Illumina(San Diego,CA)的
或
测序仪系统的系统上运行。将一组待测序的靶DNA分子与结合的测序引物20杂交(而不与非测序实体22杂交)，并且然后通过桥式扩增(bridge amplification)或动力学排除扩增(kinetic exclusion amplification)来扩增。变性留下了锚定至凝胶材料24的单链模板，并且产生了几百万密集的双链DNA的簇(即，聚簇产生)。进行测序反应，并且在一些实例中，测序引物20和非测序实体22(以及包含在扩增步骤期间被延伸以包括靶DNA的拷贝的引物的扩增子，)然后从凝胶材料24释放，使得表面在未来的测序反应中可重复使用。因此，可以重复以下步骤的一个或更多个：将测序引物20和非测序实体22附接至凝胶材料24、将靶DNA分子与测序引物20杂交、桥式扩增、对靶DNA测序，以及去除测序引物20和非测序实体22和扩增子。可以进行一次或更多次重复。
为了进一步说明本公开内容，本文给出了实施例。应理解，这些实施例为了说明的目的而被提供，并且不应被解释为限制本公开内容的范围。
实施例
实施例1
在从Illumina,Inc可获得的流动池的孔中，将测序引物(例如，具有聚T尾的P5/P7)与非测序引物(即，5’-己炔-TTT，被称为NSP)接枝。非测序引物与测序引物的摩尔比在样品之间不同。对于两个对照样品，使用测序引物，而没有非测序引物。
对于每个样品制备混合物。混合物包含超纯水、缓冲剂和过量的催化剂(例如，CuSO4(20mM–200mM)、抗坏血酸盐(20mM-200mM)和五甲基二亚乙基三胺(PMDTA)(105mM–1050mM))。测序引物的浓度为约1μM。各个样品中的催化剂的总量是相同的。非测序引物(NSP)与测序引物(P5/P7)的摩尔比在表1中示出。
表1
将各混合物应用至各自的流动池泳道，并且在约60℃孵育。洗涤流动池以去除未结合的引物。
将包含缓冲剂和TET寡核苷酸(即，具有与P5/P7引物互补的序列的染料标记的寡核苷酸)的四氯荧光素(TET)混合物应用至流动池泳道，以将表面测序引物染色。TET可以与表面上的P5/P7引物杂交；过量的TET可以被洗去，并且所附接的染料浓度(在强度方面)可以使用扫描仪器诸如Typhoon扫描仪(General Electric)通过荧光检测来测量。根据强度数据，可以确定空间分布和引物密度。结果在图4中示出。结果指示，在摩尔比低于10:1的情况下，具有非测序引物的测序引物接枝与没有非测序引物的测序引物接枝相当。
实施例2
在从Illumina,Inc可获得的流动池的孔中，将测序引物(例如，具有聚T尾的P5/P7)与非测序引物(即，5’-己炔-TTT)接枝。非测序引物与测序引物的摩尔比在样品之间不同。对于一个对照样品，使用测序引物，而没有非测序引物。
对于每个样品制备混合物。混合物包含超纯水、缓冲剂和过量的催化剂(例如，CuSO4(20mM–200mM)、抗坏血酸盐(20mM-200mM)和五甲基二亚乙基三胺(PMDTA)(105mM–1050mM))。P5/P7测序引物的浓度为约1μM。对于混合物中的一些，催化剂的总量是不同的。非测序引物与测序引物的摩尔比和催化剂量的变化在表2中示出。
表2
*X＝所有三种催化剂的基本量
将各混合物应用至各自的流动池泳道，并且在约60℃孵育。洗涤流动池以去除未结合的引物。
将流动池暴露以杂交，以用于成像、聚簇和测序。测量读段2C1A强度，并且这些结果在图5中示出。这些结果说明，在没有过量的催化剂的情况下，具有非测序引物的测序引物接枝可以增加测序强度。
实施例3
将具有聚T尾的P5/P7测序引物与作为非测序实体的聚合物链(被称为非测序聚合物链或NSPS)接枝至从Illumina Inc可获得的两个流动池。聚合物链是PEG-炔烃，并且PEG炔烃的分子量在样品之间不同。非测序聚合物链与测序引物的摩尔比也在样品之间不同。对于四个对照样品，使用没有非测序聚合物链的测序引物。
制备了两种混合物。测序引物混合物包含超纯水、缓冲剂和过量的催化剂(例如，CuSO4(20mM–200mM)、抗坏血酸盐(20mM-200mM)和五甲基二亚乙基三胺(PMDTA)(105mM–1050mM))。P5/P7测序引物的浓度为约1μM。使用新制备的PEG-炔烃溶液(例如，将不同分子量的PEG-炔烃溶解在水中)。
在有或没有期望摩尔比的非测序聚合物链溶液的一种的情况下，将测序引物混合物应用至各自的流动池泳道，如表3所示。表3还指示了在每个泳道中使用的PEG-炔烃分子量。将流动池在约60℃孵育，并且洗涤以去除未结合的材料。
表3
将流动池暴露以杂交，以用于成像、聚簇和测序。收集测序数据，并且图6A(流动池1)和图6B(流动池2)示出了通过过滤器的簇的百分比(通过过滤器％(PF))的结果，并且图7A(流动池1)和图7B(流动池2)示出了垫跳跃(PH)的结果。通过过滤器％(PF)是用于描述通过纯净度阈值(chastitythreshold)并且用于进一步处理和分析测序数据的簇的度量。垫跳跃％是描述位于独特簇附近的重复簇的量的度量。较高的通过过滤器％和较低的垫跳跃％导致用于测序数据的独特簇的收率增加。这些结果说明具有较低分子量的PEG-炔烃(即，KDa>10)的测序引物接枝与不具有任何PEG-炔烃的测序引物接枝相当。照此，聚合物链非测序实体的引入不会有害地影响测序结果，并且可以增加流动池孔中的凝胶材料的亲水性，限制非特异性结合等。
补充注释
应认识到，前述概念的所有组合(假设这样的概念不相互不一致)被预期为本文公开的创造性主题的一部分。特别地，出现在本公开内容的结尾处的所要求保护的主题的所有组合被预期为本文公开的创造性主题的一部分。还应认识到，也可以出现在通过引用并入的任何公开内容中的本文中明确使用的术语应符合与在本文公开的特定概念最一致的含义。
本说明书中所引用的全部出版物、专利以及专利申请据此通过引用以其整体并入。
贯穿本说明书对“一个实例”、“另一个实例”、“实例”等的提及意指结合该实例描述的特定要素(例如，特征、结构和/或特性)被包括在本文描述的至少一个实例中，并且可以存在于或可以不存在于其他实例中。此外，应理解，除非上下文另外清楚地指出，否则对于任何实例描述的要素可以在各种实例中以任何合适的方式组合。
应理解，本文提供的范围包括所陈述的范围和在所陈述的范围内的任何值或子范围。例如，约0.5KDa至小于约10KDa的范围应被解释为不仅包括约0.5KDa至小于约10KDa的明确列举的限值，而且包括单个值，诸如约0.8KDa、约3.25KDa、约5KDa、约7.5KDa等，以及子范围，诸如约4.25KDa至约9KDa、约5.4KDa至约7.75KDa等。此外，当利用“约”和/或“大体上”来描述值时，它们意在涵盖与所陈述的值的微小变化(高达+/-10％)。
虽然已经详细描述了若干个实例，但应理解，可以修改所公开的实例。因此，前述描述应被认为是非限制性的。
本发明还涉及以下项目：
1.一种阵列，包括：
支持物，所述支持物包括多于一个离散孔；
位于各个所述离散孔中的凝胶材料；
被接枝至所述凝胶材料的测序引物；以及
被接枝至所述凝胶材料的非测序实体；
所述测序引物和所述非测序实体各自呈其如接枝的形式。
2.如项目1中定义的阵列，其中所述非测序实体选自由以下组成的组：树状聚合物、聚右旋糖酐、甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、聚(乙二醇)、聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、甲基丙烯酸炔丙酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(乙二醇)丙烯酸酯、聚(丙烯亚胺)、聚(乙烯醇)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酸、聚(trolox酯)、肽和非功能性引物。
3.如项目2中定义的阵列，其中所述非测序实体是所述非功能性引物，并且其中所述非功能性引物是聚T或聚A。
4.如项目2中定义的阵列，其中所述非测序实体是具有在约0.5KDa至约10KDa的范围内的分子量的聚(乙二醇)。
5.如项目1或项目2中任一项中定义的阵列，其中所述非测序实体通过末端官能团被接枝至所述凝胶材料，所述末端官能团选自由以下组成的组：炔烃、降冰片基、无铜点击部分和硫醇。
6.如项目1或项目5中任一项中定义的阵列，其中所述非测序实体包括接头和结合至所述接头的三重态猝灭剂或抗氧化剂。
7.如项目6中定义的阵列，其中：
所述接头选自由以下组成的组：树状聚合物、聚右旋糖酐、甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、聚(乙二醇)、聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、甲基丙烯酸炔丙酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(乙二醇)丙烯酸酯、聚(丙烯亚胺)、聚(乙烯醇)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酸和聚(trolox酯)；并且
以下中的一项：
所述三重态猝灭剂选自由以下组成的组：环辛基四烯(COT)、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸)和硝基苄基醇(NBA)；或
所述抗氧化剂选自由以下组成的组：抗坏血酸盐、谷胱甘肽、没食子酸、儿茶素、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸)和维生素E。
8.如项目1或项目5中任一项中定义的阵列，其中所述非测序实体包括接头和结合至所述接头的荧光共振能量转移(FRET)供体。
9.如项目8中定义的阵列，其中：
所述接头选自由以下组成的组：树状聚合物、聚右旋糖酐、甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、聚(乙二醇)、聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、甲基丙烯酸炔丙酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(乙二醇)丙烯酸酯、聚(丙烯亚胺)、聚(乙烯醇)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酸和聚(trolox酯)；并且
所述FRET供体选自由以下组成的组：具有绿色发光染料的FRET的供体染料和具有红色发光染料的FRET的供体染料。
10.如前述项目中任一项中定义的阵列，其中所述非测序实体与所述测序引物的摩尔比在从约0.25:1至约5:1的范围内。
11.如前述项目中任一项中定义的阵列，其中：
凝胶材料包含式(I)的重复单元：
其中：
R1是H或任选地被取代的烷基；
RA选自由以下组成的组：叠氮基、任选地被取代的氨基、任选地被取代的烯基、任选地被取代的腙、任选地被取代的肼、羧基、羟基、任选地被取代的四唑、任选地被取代的四嗪、腈氧化物、硝酮和硫醇；
R5选自由以下组成的组：H和任选地被取代的烷基；
各个-(CH2)p-能够任选地被取代；
p是在1至50的范围内的整数；
n是在1至50,000的范围内的整数；并且
m是在1至100,000的范围内的整数。
12.一种阵列，包括：
支持物，所述支持物包括多于一个离散孔；
位于各个所述离散孔中的凝胶材料；
被接枝至所述凝胶材料的测序引物；以及
被接枝至所述凝胶材料的间隔物，所述间隔物选自由以下组成的组：树状聚合物、聚右旋糖酐、甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、聚(乙二醇)、聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、甲基丙烯酸炔丙酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(乙二醇)丙烯酸酯、聚(丙烯亚胺)、聚(乙烯醇)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酸、聚(trolox酯)及其组合。
13.如项目12中定义的阵列，还包括结合至所述间隔物的三重态猝灭剂、抗氧化剂或荧光共振能量转移(FRET)供体。
14.如项目13中定义的阵列，其中：
所述三重态猝灭剂结合至所述间隔物；并且
所述三重态猝灭剂选自由以下组成的组：环辛基四烯(COT)、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸)和硝基苄基醇(NBA)。
15.如项目13中定义的阵列，其中：
所述抗氧化剂结合至所述间隔物；并且
所述抗氧化剂选自由以下组成的组：抗坏血酸盐、谷胱甘肽、没食子酸、儿茶素、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸)和维生素E。
16.如项目13中定义的阵列，其中：
所述FRET供体结合至所述间隔物；并且
所述FRET供体选自由以下组成的组：具有绿色发光染料的FRET的供体染料和具有红色发光染料的FRET的供体染料。
17.如项目12-16中任一项中定义的阵列，其中所述间隔物与所述测序引物的摩尔比在约0.25:1至约5:1的范围内。
18.如项目12-17中任一项中定义的阵列，其中所述间隔物通过末端官能团接枝至所述凝胶材料，所述末端官能团选自由以下组成的组：炔烃、降冰片基、无铜点击部分和硫醇。
19.一种方法，包括：
将凝胶材料定位在支持物的多于一个离散孔的各个孔中；
将测序引物接枝至所述凝胶材料；以及
将非测序实体接枝至所述凝胶材料。
20.如项目19中定义的方法，其中在所述非测序实体被接枝至所述凝胶材料之前或之后，所述测序引物被接枝至所述凝胶材料。
21.如项目19中定义的方法，其中所述测序引物和所述非测序实体被共接枝至所述凝胶材料。
22.如项目21中定义的方法，其中共接枝通过以下来完成：
将所述测序引物和所述非测序实体的混合物沉积到其上具有所述凝胶材料的所述支持物上；以及
在预定的温度孵育所述支持物。
23.如项目19-22中任一项中定义的方法，其中：
所述非测序实体选自由以下组成的组：树状聚合物、聚右旋糖酐、甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、聚(乙二醇)、聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、甲基丙烯酸炔丙酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙二醇)丙烯酸酯、聚(丙烯亚胺)、聚(乙烯醇)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酸、聚(trolox酯)、肽和非功能性引物；并且
所述非测序实体通过末端官能团被接枝至所述凝胶材料，所述末端官能团选自由以下组成的组：炔烃、降冰片基、无铜点击部分和硫醇。
24.如项目19-23中任一项中定义的方法，其中：
凝胶材料包含式(I)的重复单元：
其中：
R1是H或任选地被取代的烷基；
RA选自由以下组成的组：叠氮基、任选地被取代的氨基、任选地被取代的烯基、任选地被取代的腙、任选地被取代的肼、羧基、羟基、任选地被取代的四唑、任选地被取代的四嗪、腈氧化物、硝酮和硫醇；
R5选自由以下组成的组：H和任选地被取代的烷基；
各个-(CH2)p-能够任选地被取代；
p是在1至50的范围内的整数；
n是在1至50,000的范围内的整数；并且
m是在1至100,000的范围内的整数。
序列表
<110> 伊鲁米那股份有限公司
<120> 包括测序引物和非测序实体的阵列
<130> IP-1486-PCT
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物_结合
<400> 1
aatgatacgg cgaccaccga gaductacac 30
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<220>
<223> 引物_结合
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> 8-氧代鸟嘌呤
<400> 2
caagcagaag acggcatacg anat 24
Claims (28)
1.一种阵列，包括：
支持物，所述支持物包括多于一个离散孔；
位于各个所述离散孔中的凝胶材料；
被直接且单独地接枝至所述凝胶材料的测序引物；以及
被直接且单独地接枝至所述凝胶材料的非测序实体；
所述测序引物和所述非测序实体各自单独地呈其如接枝的形式，所述非测序实体充当测序引物之间的间隔物，并且选自由以下组成的组：聚右旋糖酐、甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、聚(乙二醇)、聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、甲基丙烯酸炔丙酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(乙二醇)丙烯酸酯、聚(丙烯亚胺)、聚(乙烯醇)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酸、聚(trolox酯)、肽和非功能性引物，所述非功能性引物不参与DNA或RNA合成的任何单链核酸序列。
2.如权利要求1中定义的阵列，其中所述非测序实体是所述非功能性引物，并且其中所述非功能性引物是聚T或聚A。
3.如权利要求1中定义的阵列，其中所述非测序实体是具有在0.5KDa至10KDa的范围内的分子量的聚(乙二醇)。
4.如权利要求1中定义的阵列，其中所述非测序实体通过末端官能团被接枝至所述凝胶材料，所述末端官能团选自由以下组成的组：炔烃、降冰片基、无铜点击部分和硫醇。
5.如权利要求1或权利要求4中定义的阵列，其中所述非测序实体包括接头和结合至所述接头的三重态猝灭剂或抗氧化剂。
6.如权利要求5中定义的阵列，其中：
所述接头选自由以下组成的组：聚右旋糖酐、甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、聚(乙二醇)、聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、甲基丙烯酸炔丙酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(乙二醇)丙烯酸酯、聚(丙烯亚胺)、聚(乙烯醇)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酸和聚(trolox酯)；并且
以下中的一项：
所述三重态猝灭剂选自由以下组成的组：环辛基四烯(COT)、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸)和硝基苄基醇(NBA)；或
所述抗氧化剂选自由以下组成的组：抗坏血酸盐、谷胱甘肽、没食子酸、儿茶素、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸)和维生素E。
7.如权利要求1或权利要求4中定义的阵列，其中所述非测序实体包括接头和结合至所述接头的荧光共振能量转移(FRET)供体。
8.如权利要求7中定义的阵列，其中：
所述接头选自由以下组成的组：聚右旋糖酐、甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、聚(乙二醇)、聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、甲基丙烯酸炔丙酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(乙二醇)丙烯酸酯、聚(丙烯亚胺)、聚(乙烯醇)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酸和聚(trolox酯)；并且
所述FRET供体选自由以下组成的组：具有绿色发光染料的FRET的供体染料和具有红色发光染料的FRET的供体染料。
9.如权利要求1-4、6和8中任一项中定义的阵列，其中所述非测序实体与所述测序引物的摩尔比在从0.25:1至5:1的范围内。
10.如权利要求5中定义的阵列，其中所述非测序实体与所述测序引物的摩尔比在从0.25:1至5:1的范围内。
11.如权利要求7中定义的阵列，其中所述非测序实体与所述测序引物的摩尔比在从0.25:1至5:1的范围内。
12.如权利要求1-4、6、8和10-11中任一项中定义的阵列，其中：
凝胶材料包含式(I)的重复单元：
其中：
R1是H或任选地被取代的烷基；
RA选自由以下组成的组：叠氮基、任选地被取代的氨基、任选地被取代的烯基、任选地被取代的腙、任选地被取代的肼、羧基、羟基、任选地被取代的四唑、任选地被取代的四嗪、腈氧化物、硝酮和硫醇；
R5选自由以下组成的组：H和任选地被取代的烷基；
各个-(CH2)p-能够任选地被取代；
p是在1至50的范围内的整数；
n是在1至50,000的范围内的整数；并且
m是在1至100,000的范围内的整数。
13.如权利要求5中定义的阵列，其中：
凝胶材料包含式(I)的重复单元：
其中：
R1是H或任选地被取代的烷基；
RA选自由以下组成的组：叠氮基、任选地被取代的氨基、任选地被取代的烯基、任选地被取代的腙、任选地被取代的肼、羧基、羟基、任选地被取代的四唑、任选地被取代的四嗪、腈氧化物、硝酮和硫醇；
R5选自由以下组成的组：H和任选地被取代的烷基；
各个-(CH2)p-能够任选地被取代；
p是在1至50的范围内的整数；
n是在1至50,000的范围内的整数；并且
m是在1至100,000的范围内的整数。
14.如权利要求7中定义的阵列，其中：
凝胶材料包含式(I)的重复单元：
其中：
R1是H或任选地被取代的烷基；
RA选自由以下组成的组：叠氮基、任选地被取代的氨基、任选地被取代的烯基、任选地被取代的腙、任选地被取代的肼、羧基、羟基、任选地被取代的四唑、任选地被取代的四嗪、腈氧化物、硝酮和硫醇；
R5选自由以下组成的组：H和任选地被取代的烷基；
各个-(CH2)p-能够任选地被取代；
p是在1至50的范围内的整数；
n是在1至50,000的范围内的整数；并且
m是在1至100,000的范围内的整数。
15.如权利要求9中定义的阵列，其中：
凝胶材料包含式(I)的重复单元：
其中：
R1是H或任选地被取代的烷基；
RA选自由以下组成的组：叠氮基、任选地被取代的氨基、任选地被取代的烯基、任选地被取代的腙、任选地被取代的肼、羧基、羟基、任选地被取代的四唑、任选地被取代的四嗪、腈氧化物、硝酮和硫醇；
R5选自由以下组成的组：H和任选地被取代的烷基；
各个-(CH2)p-能够任选地被取代；
p是在1至50的范围内的整数；
n是在1至50,000的范围内的整数；并且
m是在1至100,000的范围内的整数。
16.一种阵列，包括：
支持物，所述支持物包括多于一个离散孔；
位于各个所述离散孔中的凝胶材料；
被直接且单独地接枝至所述凝胶材料的测序引物；以及
被直接且单独地接枝至所述凝胶材料的间隔物，所述间隔物间隔开所述测序引物，并选自由以下组成的组：聚右旋糖酐、甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、聚(乙二醇)、聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、甲基丙烯酸炔丙酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)、聚(乙二醇)丙烯酸酯、聚(丙烯亚胺)、聚(乙烯醇)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酸和聚(trolox酯)。
17.如权利要求16中定义的阵列，还包括结合至所述间隔物的三重态猝灭剂、抗氧化剂或荧光共振能量转移(FRET)供体。
18.如权利要求17中定义的阵列，其中：
所述三重态猝灭剂结合至所述间隔物；并且
所述三重态猝灭剂选自由以下组成的组：环辛基四烯(COT)、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸)和硝基苄基醇(NBA)。
19.如权利要求17中定义的阵列，其中：
所述抗氧化剂结合至所述间隔物；并且
所述抗氧化剂选自由以下组成的组：抗坏血酸盐、谷胱甘肽、没食子酸、儿茶素、Trolox(6-羟基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸)和维生素E。
20.如权利要求17中定义的阵列，其中：
所述FRET供体结合至所述间隔物；并且
所述FRET供体选自由以下组成的组：具有绿色发光染料的FRET的供体染料和具有红色发光染料的FRET的供体染料。
21.如权利要求16-20中任一项中定义的阵列，其中所述间隔物与所述测序引物的摩尔比在0.25:1至5:1的范围内。
22.如权利要求16-20中任一项中定义的阵列，其中所述间隔物通过末端官能团接枝至所述凝胶材料，所述末端官能团选自由以下组成的组：炔烃、降冰片基、无铜点击部分和硫醇。
23.如权利要求21中定义的阵列，其中所述间隔物通过末端官能团接枝至所述凝胶材料，所述末端官能团选自由以下组成的组：炔烃、降冰片基、无铜点击部分和硫醇。
24.一种方法，包括：
将凝胶材料定位在支持物的多于一个离散孔的各个孔中；
将测序引物直接且单独地接枝至所述凝胶材料；以及
将非测序实体直接且单独地接枝至所述凝胶材料，
所述非测序实体充当测序引物之间的间隔物，并且选自由以下组成的组：聚右旋糖酐、甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、聚(乙二醇)、聚(乙烯亚胺)、聚-L-赖氨酸、甲基丙烯酸炔丙酯、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(乙二醇)丙烯酸酯、聚(丙烯亚胺)、聚(乙烯醇)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚丙烯酸、聚(trolox酯)、肽和非功能性引物，所述非功能性引物不参与DNA或RNA合成的任何单链核酸序列；并且
所述非测序实体通过末端官能团被接枝至所述凝胶材料，所述末端官能团选自由以下组成的组：炔烃、降冰片基、无铜点击部分和硫醇。
25.如权利要求24中定义的方法，其中在所述非测序实体被接枝至所述凝胶材料之前或之后，所述测序引物被接枝至所述凝胶材料。
26.如权利要求24中定义的方法，其中所述测序引物和所述非测序实体被共接枝至所述凝胶材料。
27.如权利要求26中定义的方法，其中共接枝通过以下来完成：
将所述测序引物和所述非测序实体的混合物沉积到其上具有所述凝胶材料的所述支持物上；以及
在预定的温度孵育所述支持物。
28.如权利要求24-27中任一项中定义的方法，其中：
凝胶材料包含式(I)的重复单元：
其中：
R1是H或任选地被取代的烷基；
RA选自由以下组成的组：叠氮基、任选地被取代的氨基、任选地被取代的烯基、任选地被取代的腙、任选地被取代的肼、羧基、羟基、任选地被取代的四唑、任选地被取代的四嗪、腈氧化物、硝酮和硫醇；
R5选自由以下组成的组：H和任选地被取代的烷基；
各个-(CH2)p-能够任选地被取代；
p是在1至50的范围内的整数；
n是在1至50,000的范围内的整数；并且
m是在1至100,000的范围内的整数。
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