CN104968427A - 凝胶模式化的表面 - Google Patents

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Abstract

提供了一种阵列，所述阵列包括具有表面的固体支撑体，所述表面具有多个孔，所述孔含有凝胶材料，所述孔被表面上的空隙区彼此分开，所述空隙区将所述孔的每一个中的凝胶材料与其他多个孔中的凝胶材料分离；和所述凝胶材料中的靶标核酸的文库，其中所述孔的每一个中的凝胶材料包含所述文库的靶标核酸的单一物质。还提供了用于制备和使用阵列的方法。

Description

凝胶模式化的表面
相关申请的交叉引用
本申请要求2013年2月26日提交的美国临时申请号61/769,289和2013年3月6日提交的美国申请号13/787,396的权益。以上申请的每一个在此通过引用以其整体被并入。
背景
本公开内容一般涉及固相分析化学并且对用于高通量基因组分析的核酸阵列具有特定的适用性。
将人类遗传变异编目和将此变异与对疾病的敏感性相关联的任务坚持从基因组广泛测序方法学的发展中获益。此编目尝试为鉴定每一个人的基因组中的标志物带来希望，其将有助于医学专业人士确定该人对疾病的敏感性、对例如处方药物的特定治疗的响应性、对危险药物副作用的敏感性和其他医学上可操作的特征。编目尝试正在顺利进行中。这很大程度上是由于商业上可得的基因组测序方法学，该方法学是足够具有成本有效的以允许在研究环境中测试被评价的受试者。需要测序方法学的改进以加速编目尝试。此外，测序的相对高成本阻止了技术超越研究中心并进入诊所，其中医生可以获得一般人群中患者的序列。
测序方法学和用于实施其的系统利用复杂的技术集合。这些技术的一些中的改进已经显示提供大幅度成本降低。然而，难以预测哪些(如果有的话)对成本降低改进负有责任。考虑到测序系统中的技术之间的依赖性，甚至更加难以预测哪些可以被修改而对方法学或系统的整体性能没有不利影响。因此，对鉴定可以给诊所带来基因组研究的希望的改进存在需要，在诊所中生命可以被改善并且在许多情况下被拯救。本发明满足这种需要并且也提供相关优势。
概述
本公开内容提供了一种阵列，所述阵列包括具有表面的固体支撑体，所述表面具有多个孔，所述孔含有凝胶材料，所述孔被所述表面上的空隙区彼此分开，所述空隙区将所述孔的每一个中的凝胶材料与其他多个孔中的凝胶材料分离；和所述凝胶材料中的靶标核酸的文库，其中所述孔的每一个中的凝胶材料包含所述文库的靶标核酸的单一物质(species)。
在一些实施方案中，基底被配置为孔的阵列并且分析物是核酸。相应地，本公开内容提供了一种阵列，所述阵列包括具有表面的固体支撑体，所述表面具有多个孔，所述孔含有凝胶材料，所述孔被所述表面上的空隙区彼此分开，所述空隙区将所述孔的每一个中的凝胶材料与其他多个孔中的凝胶材料分离；和所述凝胶材料中的靶标核酸的文库，其中所述孔的每一个中的凝胶材料包含所述文库的靶标核酸的单一物质。
本公开内容还提供了制备基底的方法。所述方法可包括以下步骤：(a)提供具有平面表面的固体支撑体，其中所述平面表面被一个或更多个凹特征中断并且其中所述平面表面上的一个或更多个空隙区形成所述一个或更多个凹特征的边界；(b)用凝胶材料包被至少一部分固体支撑体，其中所述部分包括至少一个凹特征和至少一个空隙区；以及(c)抛光所述平面表面以从所述至少一个空隙区移除所述凝胶材料并且维持所述凝胶材料在至少一个凹特征中。
一种制备阵列的方法，所述方法可包括以下步骤：(a)提供具有表面的固体支撑体，所述表面具有多个孔，所述孔含有凝胶材料，所述孔被所述表面上的空隙区彼此分开，所述空隙区将所述孔的每一个中的凝胶材料与其他多个孔中的凝胶材料分离；(b)将靶标核酸的文库递送至所述固体支撑体的孔以产生具有附接至每一个孔中的凝胶材料的靶标核酸的单一物质的孔的阵列，其中所述阵列中的不同的孔具有来自所述文库的不同靶标核酸物质；以及(c)扩增附接至所述阵列的孔中的凝胶材料的所述靶标核酸以在所述阵列的孔的每一个处产生个体靶标核酸的克隆群体。
本公开内容还提供了检测分析物的方法。所述方法可包括以下步骤：(a)提供具有平面表面的固体支撑体，其中所述平面表面被一个或更多个凹特征中断，其中所述凹特征包含凝胶材料，其中所述平面表面上的一个或更多个空隙区形成所述一个或更多个凹特征的边界，所述空隙区基本上没有所述凝胶材料，并且其中所述凝胶材料被附接至或包含靶标分析物；(b)在其中所述靶标分析物与探针特异性相互作用的条件下将所述固体支撑体与所述探针接触；以及(c)检测所述固体支撑体以区分与一个或更多个探针相互作用的所述靶标分析物的至少一个子集。
在特定的实施方案中，核酸是被检测的分析物并且凹特征是孔。例如检测核酸的方法可包括以下步骤：(a)提供具有表面的固体支撑体和核酸的文库，所述表面具有多个孔，所述孔含有凝胶材料，所述孔被所述表面上的空隙区彼此分开，所述空隙区将所述孔的每一个中的凝胶材料与其他多个孔中的凝胶材料分离，所述文库的靶标核酸的单一物质被附接至所述孔的每一个中的凝胶材料；(b)将所述固体支撑体与结合至所述靶标核酸的至少一种探针接触；以及(c)检测所述固体支撑体以区分具有结合至所述至少一种探针的靶标核酸物质的孔。
本公开内容的组合物、设备和方法在本文就凝胶材料而言被示例。将被理解的是，凝胶材料是示例性的并且可以用其他有机材料来替代，所述其他有机材料包括，例如可以形成表面包被并且可以不必然被认为是凝胶自身的聚合物。本文列出的用于向表面应用凝胶材料、从空隙区移除凝胶材料、将分析物附接至凝胶材料、在分析或制备方法中使用获得的阵列等的方法可以通过用非凝胶材料替代凝胶材料容易地修改。
附图简述
图1显示了用于制备和使用DNA特征的模式化的阵列的方法的图解表示，其中每一个特征是具有被附接至DNA簇的凝胶材料的孔并且阵列在测序技术中被使用。
图2显示了来自被修改为具有凝胶材料而不是珠在孔中的BeadChip基底的图像。图A：抛光之前获得的明视野图像。图B-C：抛光之后和杂交至荧光标记的寡核苷酸之后获得的荧光图像。
图3显示图A中：利用光刻术和Cr硬掩膜与反应性离子蚀刻一起以制造基底中的凹特征的图解过程流；图B中，玻璃基底中的孔和基准(fiducial)部分的示例SEM图像；以及图C中，薄片(wafer)的图像、包括基准和孔的阵列的薄片的部分的图像、以及来自包括孔的阵列的部分的图像。
图4显示了纳米孔基底的高分辨率荧光显微镜图像，显示了基底用PAZAM包被并且用硅珠浆料抛光之后纳米孔基底上的模式化的凝胶特征。PAZAM用染料标记用于可视化目的。
图5显示了从具有模式化的簇的1.5μm孔距纳米孔基底的HiSeq测序循环获得的多色图像融合。图A：显示含有凝胶的孔中模式化的簇以及四个靶眼(bulls-eye)基准的视野的图像。图B：显示单个靶眼基准中颜色的混合(由于扩增子的混合的群体)的更高分辨率图像。
图6显示了图A中：用750nm孔距纳米孔基底运行的Hiseq测序中模式化的簇的多色融合；图B：显示阵列被排序并且簇正通过质量滤器的最邻近曲线(nearest neighbor curve)；以及图C：测序质量度量，显示以1,600,000簇/mm2的密度，成功通过质量滤器。
图7显示了克隆分数(Fraction clonal)对占据的分数(Fraction occupied)的图，具有针对泊松分布预计的曲线、针对理想克隆性和占据预计的直线、以及X代表从用具有含有凝胶的纳米孔的模式的基底的测序运行获得的平均量度。
详述
本公开内容提供了结构化的基底(structured substrate)、用于制备结构化的基底的方法和用于使用结构化的基底的方法。在特定的实施方案中，基底包括固体支撑体，所述固体支撑体具有含有凝胶材料(例如被凝胶材料包被)的凹区例如孔。凝胶材料可以转而被附接至感兴趣的分析物，例如核酸。在特定的实施方案中，含有凝胶的区是离散的，被缺少附接感兴趣的分析物的能力的空隙区分开。例如，空隙区可以缺少凝胶材料。可选地，空隙区中的凝胶材料可被灭活或以其他方式被修饰以缺少凹区中凝胶材料的活性或特征，例如支持分析物附接的能力。当在分析物上进行反应和/或检测分析物时，所得凝胶区的分离提供优势。示例性优势可以在分布在含有凝胶的孔中的靶标核酸的阵列的实例中来展示。这里，扩增反应可以使用核酸作为模板在结构化的基底上来实施以形成在凝胶中或凝胶上生长的核酸集群(colony)(例如阵列的核酸特征)。空隙区功能为限制用于集群生长的区域。由于由含有凝胶的孔创建的离散模式，所得阵列的个体特征可以相对容易地区分。相比于核酸的随机阵列，模式还可以提供提高特征的密度和降低用于图像配准的处理要求的益处。
用于制备模式化的核酸阵列的示例性过程显示在图1中。孔模式化的基底的侧面图被图解显示。孔具有1.5μm的孔距(中心距)并且在该实例中每一个孔的直径是0.5μm。孔模式化的基底可以用凝胶材料来包被使得材料进入孔并且包被空隙区。所得凝胶包被的基底可以被抛光以从空隙区移除凝胶材料，将凝胶材料留在孔中，从而形成凝胶模式化的基底。凝胶可以具有支持捕获DNA模板和扩增模板的功能。例如，在表面包被之前、表面包被之后和抛光之前或抛光之后，凝胶可以用寡核苷酸引物来接枝。引物可以具有捕获DNA模板和使用捕获的模板引发扩增的功能。所得DNA模式化的基底可以被例如在测序技术中分析。
模式化的含有凝胶的孔中的核酸阵列提供用于DNA测序的多种优势。相比随机阵列(即，具有随机的特征模式的阵列)的优势的实例包括提高的特征堆积的密度、增强的使用浓度不依赖的模板接种的特征密度的控制和调整、减少的用于图像配准的处理需求和提高的信号提取的容易性。另外的优势可以源于由每一个特征提供的核酸群体的空间限定。本公开内容的模式化的阵列的特征可以具有限制其中核酸集群将会生长(例如，经由簇扩增)的面积或体积的功能。缺乏面积或体积限制时，由于影响相对扩增速率的其序列中鸟嘌呤和胞嘧啶的百分含量(即，GC含量)的差异，一些核酸集群可以扩增至比其他的更大尺寸。对于本文列出的方法和组合物，个体特征的体积或面积可以被选择以阻止或最小化核酸集群尺寸的差异，所述核酸集群尺寸的差异否则由于被扩增的模板物质之间的GC含量不同，会从扩增反应发生。例如，特征的体积或面积可以是足够小以完成最快生长集群的生长同时允许较慢生长的集群在完成扩增反应后有效填充特征。
在特定的实施方案中，本公开内容提供了玻璃、硅、塑料或其他合适的固体支撑体上的具有模式化的、共价连接的凝胶例如聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺共丙烯酰胺)(PAZAM，参见，例如美国临时专利申请序列号61/753,833，其通过引用并入本文)的孔(例如微米孔和纳米孔)的制备。该过程创建了用于测序的凝胶垫(gel pad)，其经过运行大量循环的测序可以是稳定的。将聚合物共价连接至孔对在多种使用过程中结构化的基底的整个寿命期间维持凝胶在结构化的特征中是有益的。然而，在许多实施方案中，凝胶不需要被共价连接至孔。例如，在一些条件下，无硅烷丙烯酰胺(silane free acrylamide)(SFA，参见，例如美国专利申请公布号2011/00598651 A1，其通过引用并入本文)可以被用作凝胶材料，所述无硅烷丙烯酰胺未共价附接至结构化的基底的任何部分。
在特定的实施方案中，结构化的基底可以通过以下来制备：用孔(例如微米孔或纳米孔)模式化固体支撑材料、用凝胶材料(例如，PAZAM、SFA或其化学改性的变体例如SFA的叠氮化变体(叠氮SFA))包被模式化的支撑体以及抛光凝胶包被的支撑体，所述抛光例如经由化学或机械抛光，从而将凝胶保留在孔中但是从结构化的基底的表面上、孔之间的空隙区基本上移除或灭活所有凝胶。引物核酸可以被附接至凝胶材料。然后，靶标核酸(例如片段化的人类基因组)的溶液可以与抛光的基底接触使得个体靶标核酸将经由与附接至凝胶材料的引物的相互作用接种个体孔；然而，由于凝胶材料的缺乏或失活，靶标核酸将不会占据空隙区。靶标核酸的扩增将会被限制于孔，因为空隙区凝胶的缺乏或失活阻止生长中的核酸集群向外迁移。该过程是方便可制造的，是可扩展的(scalable)并且利用传统的微米或纳米制备方法。
在特定的实施方案中，基准标志物(fiducial marker)被包括在结构化的基底上以辅助识别和定位个体特征(例如，孔或其他含有凝胶的凹特征)。基准标志物对于具有空间有序的特征模式的结构化的基底是特别有用的，因为基准标志物提供用于其他特征的相对位置的参照点。基准标志物也可以被用于配准随机阵列的图像，但是固有的无序的簇可以被替代使用，例如如在商业测序平台上产生的随机阵列使用的，所述商业测序平台例如来自Illuminate，Inc.(San Diego，CA)的HiSeq、Genome Analyzer或MiSeq平台。基准标志物对于其中结构化的基底被重复检测以追踪随时间推移在个体特征处发生的变化的应用是尤其有益的。基准标志物允许通过经多重测序循环获得的连续图像追踪个体核酸簇，使得个体簇的序列可以被分开地确定。
本公开内容提供了具有凹区和空隙区的模式的基准标志物。用于基准标志物的示例性设计是一组具有两种或更多种以下的交替模式的同心圆：凹环、空隙环和孔的环或其他凹特征(例如“靶眼”)。在一些实施方案中，基准标志物的凹区含有凝胶材料，而空隙区则不含。凝胶在表面上的此不同定位可以使用本文列出的凝胶包被和抛光方法来实现。通常使用可以区分含有凝胶的区和空隙区的检测方法。在一些情况中，该区分可以基于凝胶区中特定分析物的存在，所述特定分析物不存在于空隙区。例如，在核酸阵列的情况中，基准标志物的含有凝胶的区可以含有经由被用于标记阵列上靶标核酸的相同方法被标记的核酸。因此，基准标志物可以使用用于制造分析物特征的相同方法来方便地制造。相应地，如果需要，基准标志物和分析物特征可以通过一个或更多个步骤同时制造。可以被用于本文中列出的结构化的基底和方法中的另一种有用的基准标志物是具有亚区的基准标志物，其中在一个亚区中孔(或其他凹特征)的模式相对于另一个亚区中的模式被旋转。这样的基准栅格可以被配置并用于图像配准，如美国序列号13/267,565中列出的，其通过引用并入本文。
作为另外的实例，珠可以被用作基准。珠可包括标记物例如，荧光团。在这种情况中，表面可以具有至少两种类型的孔(或其他凹特征)。相对大的孔可以容纳一个或更多个基准珠，而较小的孔，太小不含珠，仅具有凝胶材料。因此，较小的孔具有作为用于分析的分析特征的功能并且较大的、填充珠的孔具有作为基准的功能。作为孔的替代物，基准特征可以是通道，例如存在于以上示例的靶眼装置中的那些，并且通道可以具有容纳珠的尺寸。如此，若干珠可以被置于通道中以创建基准，例如以一串珠的外观形状。
模式化的阵列，用于其制造的方法和用于其使用的方法在本文就被用于附接感兴趣的分析物的凝胶材料而言被示例。将要理解的是，凝胶材料是示例性的并且可以用其他有机材料来替代，所述其他有机材料可以被用以介导分析物至表面上特征的定位。这样的有机材料包括例如，可以形成表面包被并且可以不必需被认为是凝胶自身的聚合物。特定的实例是由ATRP(原子转移自由基聚合)或表面引发的聚合过程形成的聚合物。本文列出的用于向表面应用凝胶材料、从空隙区移除凝胶材料、在分析或制备方法中使用获得的阵列等方法可以容易地被调整用于使用非凝胶材料。
除非另外指定，本文使用的术语将被理解为采用其在相关领域中的普通含义。本文使用的若干术语和其含义列在下面。
如本文使用的，术语“附接的”指的是两种事物被彼此连接(join)、扣紧、粘附、连接(connect)或结合的状态。例如，分析物例如核酸可以通过共价或非共价键被附接至材料，例如凝胶或固体支撑体。共价键的特征在于共享原子之间的电子对。非共价键是不包括共享电子对的化学键并且可包括，例如氢键、离子键、范德华力、亲水相互作用和疏水相互作用。
如本文使用的，术语“克隆群体(clonal population)”指的是关于特定核苷酸序列是相同的核酸群体。相同的序列通常是至少10个核苷酸长，但是可以是甚至更长，包括例如，至少50、100、250、500、1000或2500个核苷酸长。克隆群体可以来源于单一靶标核酸或模板核酸。克隆群体可包括至少2、5、10、100、1000或更多拷贝的靶标核苷酸序列。拷贝可以以单一核酸分子存在，例如作为多联体，或拷贝可以存在于不同的核酸分子上(即，克隆群体可包括至少2、5、10、100、1000或更多个具有相同靶标核苷酸序列的核酸分子)。通常，克隆群体中所有核酸将具有相同核苷酸序列。将要理解的是，忽略不计的量的污染核酸或突变(例如，由于扩增假象)可以发生在克隆群体中而不背离克隆性。因此，群体可以是至少80％、90％、95％或99％克隆的。在一些情况中100％纯克隆群体可以存在。
如本文使用的，术语“包被”，当用作动词时，预期意指提供表面上的层或覆盖物。表面的至少部分可以提供有层或覆盖物。在一些情况中，整个表面可以提供有层或覆盖物。在可选的情况中，仅部分表面将提供有层或覆盖物。术语“包被”，当用以描述表面和材料之间的关系时，预期意指材料作为表面上的层或覆盖物存在。材料可以密封表面，例如防止液体或气体与表面接触。然而，材料不需要形成密封。例如，材料对液体或气体、或液体或气体中携带的一种或更多种组分可以是多孔的。可包被表面的示例性材料包括，但不限于凝胶、聚合物、有机聚合物、液体、金属、第二表面、塑料、二氧化硅或气体。
如本文使用的，术语“凹特征”，当关于固体支撑体使用时，指的是固体支撑体中的凹处或凹陷。示例性凹特征包括，但不限于孔、凹陷、洞、凹穴、通道或槽。任选地，凹特征可以具有弯曲的横截面(在维度方面与固体支撑体的表面是正交的)；然而，具有一个或更多个线性部分、角度或拐角的横截面也是可能的。具有弯曲的和线性的部分的组合的横截面也是可能的。通常，凹特征不需要完全通过固体支撑体，例如相反，具有在基底中的底表面或点。
如本文使用的，术语“不同的”，当关于核酸使用时，意指核酸具有彼此不相同的核苷酸序列。两个或更多个核酸可以具有沿着其总长度不同的核苷酸序列。可选地，两个或更多个核酸可以具有沿着其长度的大部分不同的核苷酸序列。例如，两个或更多个核酸可以具有对于两个或更多个分子不同的靶标核苷酸序列部分，同时也具有两个或更多个分子上相同的通用序列部分。
如本文使用的，术语“每个”，当关于项目的集合使用时，预期标识集合中的个体项目但不必然指的是集合中的每一个项目。如果明确的公开内容或上下文清楚地另外表明，可以存在例外。
如本文使用的，术语“流体通路(fluidic access)”，当关于流体中分子和与流体接触的位点使用时，指的是分子移动进入或穿过流体以接触或进入位点的能力。该术语也可以指的是分子从位点分离或退出位点进入溶液的能力。当没有阻止分子进入位点、接触位点、从位点分离和/或退出位点的障碍时，流体通路可以发生。然而，流体通路被理解为存在，即使扩散被阻止、降低或改变，只要通路不被完全阻止。
如本文使用的，术语“凝胶材料”预期意指可渗透液体和气体的半刚性材料。通常，当液体被吸收时凝胶材料可以膨胀并且当液体通过干燥被移除时可以收缩。示例性的凝胶包括，但不限于具有胶态结构的那些，例如琼脂糖；例如明胶的聚合物网状结构；或例如聚丙烯酰胺、SFA(参见，例如美国专利申请公布号2011/0059865 A1，其通过引用并入本文)或PAZAM(参见，例如美国临时专利申请序列号61/753,833，其通过引用并入本文)的交联聚合物结构。特别有用的凝胶材料将符合其在其中驻留的孔或其他凹特征的形状。一些有用的凝胶材料可以(a)符合其在其中驻留的孔或其他凹特征的形状并且(b)具有大体上不超过其在其中驻留的孔或凹特征的体积的体积。
如本文使用的，术语“空隙区(interstitial region)”指的是基底中或表面上的将基底或表面的其他区域分开的区域。例如，空隙区可以将阵列的一个凹特征与阵列的另一个凹特征分开。彼此分开的两个区可以是离散的，彼此缺少接触。在另一个实例中，空隙区可以将特征的第一部分与特征的第二部分分开。在许多实施方案中，空隙区是连续的，而特征是离散的，例如在否则是连续的表面中的孔的阵列的情况下。由空隙区提供的分开可以是部分或完全分开。空隙区通常会具有不同于表面上特征的表面材料的表面材料。例如阵列的特征可以具有超过在空隙区存在的量或浓度的量或浓度的凝胶材料或分析物。在一些实施方案中，凝胶材料或分析物可以不在空隙区存在。
如本文使用的，术语“文库”，当关于分析物使用时，指的是具有不同化学组成的分析物的集合。通常，文库中的分析物将是具有种类或类别的一般特征或特性、但在一些方面另外不同的不同物质。例如，文库可包括在核苷酸序列方面不同的、但关于具有糖-磷酸骨架是相似的核酸物质。
如本文使用的，术语“核酸”和“核苷酸”预期与其在本领域中的使用是一致的并且包括天然存在的物质或其功能类似物。核酸的特别有用的功能类似物能够以序列特异性方式杂交核酸或能够被用作用于复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核酸通常具有含有磷酸二酯键的骨架。类似物结构可以具有替代的骨架连键，包括本领域中已知的多种骨架连键的任一种。天然存在的核酸通常具有脱氧核糖(例如，脱氧核糖核酸(DNA)中发现的)或核糖(例如核糖核酸(RNA)中发现的)。核酸可以含有具有本领域中已知的这些糖部分的多种类似物的任一种的核苷酸。核酸可包括天然或非天然核苷酸。关于这一点，天然脱氧核糖核酸可以具有选自由腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一种或更多种碱基并且核糖核酸可以具有选自由尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶或鸟嘌呤组成的组的一种或更多种碱基。可以被包括在核酸或核苷酸中的有用的非天然碱基是本领域中已知的。术语“探针”或“靶标”，当关于核酸使用时，预期作为在本文列出的方法或组合物的上下文中用于核酸的语义标识符并且除了另外明确表明的以外，不必然限制核酸的结构或功能。术语“探针”和“靶标”可以类似地被应用于其它分析物，例如蛋白质、小分子、细胞等等。
如本文使用的，术语“随机模式”，当关于表面上的孔使用时，意指表面上一个区中孔的子集的相对位置从表面上另一个区中孔的子集的位置是未知的或不可预测的。用于量度的子集通常将包括至少3个孔，但可包括至少4、5、6、10或更多个孔。随机模式通常不包括任何子模式的多个重复。术语可以被应用于除了孔以外的其他凹特征。
如本文使用的，术语“重复模式”，当关于表面上的孔使用时，意指表面上一个区中孔的子集的相对位置与表面上至少一个其他区中孔的子集的相对位置是相同的。因此，重复模式的一个区中孔的相对位置通常从重复模式的另一个区中孔的相对位置是可预测的。用于量度的子集将通常包括至少3个孔，但可包括至少4、5、6、10或更多个孔。示例性重复模式包括直线模式和六边形模式。重复模式可包括子模式的多个重复。该术语可以被应用于除了孔以外的其他凹特征。
如本文使用的，术语“分离”，当关于两个孔(或在两个其他特征)中的凝胶材料使用时，意指将在一个孔(或在一个特征)中的凝胶材料与其他孔(或在其他特征)中的凝胶材料分开或隔离(isolate)。因此，在第一个孔(或在第一个特征)中的凝胶材料不与其他孔(或在其他特征)中的凝胶材料直接接触。在一些实施方案中，在两个孔(或在两个特征)中的凝胶材料是间接接触的，例如经由接触两个孔(或特征)的溶液。可选地，两个孔(或在两个特征)中的凝胶材料甚至不间接接触。表面上的空隙区可以通过缺少凝胶材料将在两个孔(在两个特征)中的凝胶材料分离。在特定的实施方案中，凝胶材料在表面上可以是不连续的，在例如孔的凹特征存在，但在特征之间的空隙区不存在。
如本文使用的，术语“表面”预期意指固体支撑体或凝胶材料的外部或外层。表面可以与另外的材料接触，例如气体、液体、凝胶、聚合物、有机聚合物、相似或不同材料的第二表面、金属或涂层。表面或其区域可以基本上是平的。表面可以具有表面特征，例如孔、凹陷(pit)、通道、脊状突起(ridge)、凸起区、钉(peg)、桩(post)等等。
如本文使用的，术语“单一物质”意指特定种类的基本上一种和仅一种物质。该术语不必然预期限制代表存在的单一物质的数目。例如，各自具有相同核苷酸序列的核酸分子的群体包含核酸的单一物质。术语“单一”在该上下文中不预期排除不在相关种类内的其他事物的存在。例如，含有来自文库的靶标核酸的单一物质的孔可包括具有相同序列的多个核酸，将排除来自文库的其他靶标核酸，但不必然需要排除任何其他非核酸组分。将要理解的是，表观的单一物质群体可以具有少量的另一物质，所述另一物质以由本领域中技术人员认为对于群体的特定用途是污染或假象的可忽略的水平的水平存在。例如，如果当第一序列被检测时，具有第二序列的任何核酸分子的量是足够低以致是不可检测的或忽略的，则来源于具有第一序列的单一模板的核酸簇将被认为具有表观的单一物质。
如本文使用的，术语“固体支撑体”指的是在含水液体中不可溶的硬质基底。基底可以是非多孔的或多孔的。基底可以任选地能够吸收液体(例如由于多孔性)但是当吸收液体时，将通常是足够硬的使得基底基本上不膨胀并且当液体通过干燥被移除时基本上不收缩。非多孔固体支撑体通常对液体或气体是不可渗透的。固体支撑体可以任选地对被用以改性凝胶的化学物是惰性的。例如，固体支撑体可以对用以将分析物例如核酸附接至本文列出的方法中的凝胶的化学物是惰性的。示例性固体支撑体包括，但不限于玻璃和改性的或功能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯和苯乙烯与其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、TeflonTM、环烯烃、聚酰亚胺等)、尼龙、陶瓷、树脂、Zeonor、二氧化硅或基于二氧化硅的材料包括硅和改性的硅、碳、金属、无机玻璃、光学纤维束和聚合物。用于一些实施方案的特别有用的固体支撑体位于流通池(flow cell)设备中。示例性流通池在下面进一步详细列出。
如本文使用的，术语“孔”指的是被表面的空隙区完全围绕的具有表面开口的固体支撑体中离散的凹特征。孔可以具有其在表面中的开口的多种形状的任一种，包括但不限于圆形、椭圆形、方形、多边形、星形(具有任何数目的顶点)等。与表面正交地取得的孔的横截面可以是弯曲的、方形的、多边形的、双曲线的、圆锥形的、有角的等。
下面列出的和权利要求书中列举的实施方案可以鉴于以上定义来理解。
本公开内容提供了一种基底，所述基底包括具有表面的固体支撑体，表面具有至少一个凹特征，至少一个凹特征含有凝胶材料，表面上的至少一个空隙区形成至少一个凹特征的边界；以及凝胶材料中分析物的文库，其中孔的每一个中的凝胶材料包括文库的分析物的单一物质。
在一些实施方案中，基底被配置为孔的阵列并且分析物是核酸。相应地，本公开内容提供了一种阵列，所述阵列包括具有表面的固体支撑体，表面具有多个孔，孔含有凝胶材料，孔被表面上的空隙区彼此分开，空隙区将孔的每一个中的凝胶材料与其他多个孔中的凝胶材料分离；以及凝胶材料中靶标核酸的文库，其中孔的每一个中的凝胶材料包括文库的靶标核酸的单一物质。
本文列出的结构化的基底中使用的固体支撑体可以由本文例如以上定义中、下面实例中或紧接着列出的多种材料的任一种来制备。特别有用的材料是玻璃。其他合适的基底材料可包括聚合材料、塑料、硅、石英(熔融石英)、borofloat玻璃、二氧化硅、基于二氧化硅的材料、碳、金属、光学纤维或光学纤维束、蓝宝石、或塑料材料例如COC和环氧树脂。特定材料可以基于对于特定用途期望的特性来选择。例如，对期望的放射的波长可透射的材料可用于将利用期望的波长的放射的分析技术，例如本文列出的一种或更多种技术。相反地，可以期望选择不通过某种波长的放射(例如是不透明的、吸收性的或反射的)的材料。这可以用于形成结构化的基底制造期间被使用的遮罩，所述制造例如本文列出的方法；或被用于使用结构化的基底实施的化学反应或分析检测，例如本文列出的那些。可以被利用的材料的其他特性是对下游过程中使用的某些试剂是惰性的或反应性的，例如本文列出的那些；或在制造过程制造期间易于操作或降低成本，例如本文列出的那些。可以在本公开内容的结构化的基底或方法中被使用的材料的另外的实例描述在美国序列号13/661,524和美国专利申请公布号2012/0316086 A1，其中每一个通过引用并入本文。
在特定的实施方案中，基于溶胶凝胶(Sol-Gel)的基底可以被制备并被使用。基于溶胶凝胶的模式化可以通过包被刚性或柔性基底来完成，所述刚性或柔性基底例如玻璃、硅、塑料、金属或类似物，溶胶凝胶包被可以例如通过旋转包被、浸渍或喷雾包被实施。当被应用于基底时，溶胶凝胶可以以液体状态被提供并且可以含有光引发剂或热引发剂，所述光引发剂或热引发剂通过将溶胶凝胶暴露至光或热使能够固化(将液体变成凝胶)。用溶胶凝胶包被基底之后，并且在将材料固化之前，溶胶凝胶可以用具有单一或多个突出特征的模板(三维印记)来压印。模板可以由例如硅、玻璃(例如石英)、金属(例如镍)、塑料或聚合物(例如PDMS)来制备。印记向溶胶凝胶的压印可以通过将模板置于与溶胶凝胶接触来完成。当模板处于与溶胶凝胶接触时，溶胶凝胶重新分配以共形地围绕模板的结构。当模板处于与溶胶凝胶接触时，溶胶凝胶的重新分配可以通过向模板或基底应用的外力、或者通过模式化的模板的性质固有的毛细作用力来驱动。当模板处于与溶胶凝胶接触时，基底+溶胶凝胶+模板的堆叠可以被暴露至光或热以固化溶胶凝胶并且将在模板中的模式最初地锁定进入溶胶凝胶。该模式化过程照惯例称为纳米压印(nanoimprint lithography)。在溶胶凝胶固化后，模板可以从基底+溶胶凝胶堆叠被分离，并且模板可以被丢弃或重新使用以模式化用未固化的溶胶凝胶包被的另一个基底。具有固化的、模式化的溶胶凝胶的基底然后可以进入化学沉积过程，或如果纯的玻璃样表面是期望的，基底+模式化的溶胶凝胶堆叠可以通过将移除最初存在于溶胶凝胶中的有机材料的热过程(烧结)。这不是必需的，但可以使得基底成为纯SiO2材料，这在某些化学粘附方案中具有优势。
另一种产生模式化的基底的方法是使用塑料材料，例如COC或COP(例如Zeonor或Topas)并执行热压制过程以创建刻痕的阵列。该过程与纳米压印相似。塑料基底可以被安装在具有被温度控制的能力的卡盘(chuck)上。然后塑料基底可以被加热至使得塑料的外皮超过玻璃转换温度的温度。当基底处于提高的温度，模板被放置为与模板(例如石英、硅、聚合的或金属的)的硬接触。模板通常具有被施加以保证塑料完全共形地包被结构化的模板的外力。当在提高的温度下接触时，塑料自身重新分配以变成模板的负复型(negative replica)；例如，如果模板具有桩的阵列，则压制的塑料产生孔的阵列。当模板与塑料基底接触，基底的温度被降低因此将压制的模式锁进基底。
在基底上的凹特征可以具有多种形状的任一种。在表面上的形状方面，特征可以具有弯曲侧面、线性侧面、拐角或其组合。例如，特征可以是具有表面中的开口的孔，其是圆形的、椭圆的、方形的、多边形的、星形的(具有任何数目的顶点)或不规则形状的。特征可以是通道并且表面上的通道的形状可包括弯曲的、线性的、有角的或其组合的侧面。其他通道特征可以是线性的、蜿蜒的、矩形的、方形的、三角形的、圆形的、椭圆的、双曲线的或其组合。通道可以具有一个或更多个分支或拐角。通道可以连接表面上的两个点，其中一个或两个可以是基底的边缘。图3B和图3C显示了靶眼基准中示例性通道特征、以及靶眼基准中和围绕靶眼基准的孔。
凹特征的与表面正交取得的横截面的形状，可以具有弯曲的、线性的或两者组合的壁。因此，横截面的形状可以是圆形或椭圆(例如U形)的部分，或可以具有在拐角相遇的两个或更多个线性侧面(例如V形、方形、多边形或星形)。在横截面形状方面，凹特征的底部可以是较窄的、较宽的或与表面上的开口大致相同的。这些横截面的形状可以由其中凹特征是孔的情况来阐明，在该情况中，当孔具有圆柱形横截面时，表面中的开口将是与孔的底部大致相同的面积，而当孔具有圆锥形横截面时，孔的底部将具有与在表面上的开口的面积不同的面积(通常较小)。当然，尽管针对孔来阐明，横截面也可以应用于通道。
对于其中凹特征形成孔的实施方案，每一个孔可以具有能够限制液体的任何体积。例如，最小或最大体积可以被选择以适应通量(例如多重)、分辨率、分析物组成、或对基底的下游用途期望的分析物反应性。例如，体积可以是至少1×10-3μm3、1×10-2μm3、0.1μm3、1μm3、10μm3、100μm3或更大。可选地或另外地，体积可以是至多1×104μm3、1×103μm3、100μm3、10μm3、1μm3、0.1μm3或更小。将要理解的是，凝胶材料可以填充孔的所有或部分体积。个体孔中凝胶的体积可以大于以上指定的值、小于以上指定的值或在以上指定的值之间。
表面上由每一个孔开口占据的面积可以基于如以上对孔体积列出的那些的相似的标准来选择。例如表面上每一个孔开口的面积可以是至少1×10-3μm2、1×10-2μm2、0.1μm2、1μm2、10μm2、100μm2或更大。可选地或另外地，面积可以是至多1×103μm2、100μm2、10μm2、1μm2、0.1μm2、1×10-2μm2或更小。每个孔的深度可以是至少0.1μm、1μm、10μm、100μm或更大。可选地或另外地，深度可以是至多1×103μm、100μm、10μm、1μm、0.1μm或更小。
可以设想孔或其他凹特征的许多不同布局，包括规则的、重复的和不规则的模式。例如，孔可以被配置为六边形网格用于密堆积和改进的密度。其他布局可包括，例如直线(即矩形)布局、三角形布局等等。特定的布局，以及不同区域的布局之间的差异(如果使用)可以遵循美国专利号7,813,013和/或美国专利申请号13/267,565的教导，其中每一个通过引用被并入本文。多种晶体或多晶模式的任一种可以是有用的。
孔的模式可以根据孔的平均孔距(即，中心距)来表征。同样，模式可以是规则的使得围绕平均孔距的变异系数较小或模式可以是不规则的，在这种情况下变异系数可以是相对大的。在任一种情况中，平均孔距可以是，例如至少10nm、0.1μm、0.5μm、1μm、5μm、10μm、100μm或更多。可选地或另外地，平均孔距可以是，例如至多100μm、10μm、5μm、1μm、0.5μm、0.1μm或更小。当然，对于孔的特定模式的平均孔距可以是在选自以上范围的下限值之一和上限值之一之间。
孔的模式也可以根据确定的区域中孔的密度(即，孔的数目)来表征。例如，孔可以以约2,000,000个/mm2的密度存在。根据本文列出的制造方法，密度可以容易地被调整至不同密度，包括，例如至少100个/mm2、至少1,000个/mm2、至少100,000个/mm2、至少1,000,000个/mm2、至少2,000,000个/mm2、至少5,000,000个/mm2或更多的密度。可选地或另外地，密度可以被调整至不多于5,000,000个/mm2、不多于2,000,000个/mm2、不多于1,000,000个/mm2、不多于100,000个/mm2、不多于1,000个/mm2、不多于100个/mm2或更少。当然，基底上孔的密度可以是在选自以上范围的下限值之一和上限值之一之间。
在特定的实施方案中，使用凝胶材料。在一些情形中，形成凝胶(例如可聚合的)的材料以液体状态被提供至固体支撑体并且随后转化成凝胶。可聚合的材料的实例包括，而不限于，丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯、N-乙烯吡咯烷酮或其衍生物。这样的材料对于制备水凝胶是有用的。在一些实施方案中，可聚合的材料可包括形成共聚物的化合物的两种或更多种不同物质。例如，丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸羟乙酯、N-乙烯吡咯烷酮或其衍生物的两种或更多种不同物质可以起到聚合以形成共聚物水凝胶的共聚单体的功能。有用的水凝胶包括，但不限于无硅烷丙烯酰胺(SFA)聚合物(参见美国专利申请公布号2011/0059865A1，其通过引用被并入本文)、聚(N-(5-叠氮基乙酰胺基戊基)丙烯酰胺共丙烯酰胺(PAZAM，参见美国临时专利申请序列号61/753,833，其通过引用被并入本文)，从丙烯酰胺和丙烯酸或含有乙烯基团的丙烯酸形成的聚丙烯酰胺聚合物，如例如WO 00/31148中(通过引用并入本文)描述的；从形成[2+2]光-环加成反应的单体形成的聚丙烯酰胺聚合物，例如如WO 01/01143或WO 03/014392中(其中每一个通过引用并入本文)描述的；或美国专利号6,465,178、WO 01/62982或WO 00/53812(其中每一个通过引用并入本文)中描述的聚丙烯酰胺共聚物。这些凝胶材料的化学处理的变体也是有用的，例如使得与具有相应的反应基团的寡核苷酸反应的化学处理的SFA(例如叠氮解SFA以产生与5’或3’炔基修饰的寡核苷酸反应的叠氮SFA)。示例性水凝胶和可以被用以形成水凝胶的可聚合的材料被描述在例如美国序列号61/753,833或美国专利申请公布号2011/0059865A1，其中每一个通过引用并入本文。其他有用的凝胶是通过从液体至胶状的状态的温度依赖性变化形成的那些。实例包括，但不限于琼脂、琼脂糖或明胶。
在结构化的基底的表面上的孔或其他凹特征中的凝胶材料可以共价附接至表面。例如，PAZAM可使用美国序列号61/753,833中列出的(其通过引用被并入本文)表面材料和其他试剂共价附接至表面，并且如本文实施例部分中列出的。然而，凝胶材料不需要共价附接至孔或其他凹特征，如在下面实施例部分中针对SFA示例的。
一种或更多种分析物可以存在于凝胶材料中或凝胶材料上，所述凝胶材料存在于结构化的基底上。本公开内容的含有凝胶的基底对于检测分析物，或用于实施与分析物的合成反应是特别有用的。因此，将被检测、表征、修饰、合成等等的多种分析物的任一种可以存在于本文列出的凝胶材料中或存在于本文列出的凝胶材料上。示例性的分析物包括，但不限于核酸(例如，DNA、RNA或其类似物)、蛋白质、多糖、细胞、抗体、表位、受体、配体、酶(例如，激酶、磷酸酶或聚合酶)、小分子药物候选物或类似物。结构化的基底可包括来自分析物文库的多种不同物质。例如，物质可以是来自抗体文库的不同抗体、具有来自核酸文库的不同序列的核酸、具有来自蛋白质文库的不同结构和/或功能的蛋白质、来自小分子的组合文库的药物候选物等。
在一些实施方案中，分析物可以在结构化的基底上被分布使得它们为单独可分辨的。例如每种分析物的单一分子可以存在于结构化的基底的每一个含有凝胶的孔中。可选地，分析物可以作为集群或群体存在，使得个体分子不需要被分辨。集群或群体可以是关于仅含有分析物的单一物质(虽然以多个拷贝)相同的。以核酸为例，结构化的基底上的每个孔可包括核酸的集群或群体并且集群或群体中的每一个核酸可以具有相同核苷酸序列(单链或双链)。这样的集群可通过如本文其他地方进一步详细列出的簇扩增或桥式扩增来产生。靶标序列的多个重复段可以存在于单个核酸分子中，例如使用滚环扩增程序产生的多联体。因此，结构化的基底上的每个孔中的凝胶材料可以含有分析物的单一物质的拷贝。可选地，孔中的分析物的集群或群体可包括两种或更多种不同物质。例如，结构化的基底上的一个或更多个孔可以各自含有具有两种或更多种不同核酸物质(即，具有不同序列的核酸分子)的混合集群。混合集群中的两种或更多种核酸物质可以以不可忽略的量存在，例如允许多于一种核酸在混合集群中被检测到。
分析物可以被附接至凝胶材料。附接可以是共价的或非共价的。用于将核酸附接至凝胶的示例性方法和试剂被描述在例如美国专利申请公布号2011/0059865 A1或美国临时专利申请序列号61/753,833中，其中每一个通过引用被并入本文。分析物可以是核酸并且核酸可以通过其3’氧、5’氧或在沿着其长度的其他位置例如通过3’末端核苷酸的碱基部分、5’核苷酸的碱基部分、和/或分子中其他地方的一个或更多个碱基部分被附接至凝胶。附接的非共价模式包括，例如核酸和凝胶之间的离子相互作用、凝胶的孔中核酸的捕获(entrapment)、蛋白质-蛋白质相互作用、凝胶和/或核酸上受体和配体之间的结合以及其他已知模式。
在一些实施方案中，在从空隙区移除凝胶材料之前，被应用于表面的凝胶包被含有一种或更多种分析物。因此，凝胶材料可以存在于空隙区并且在空隙区的凝胶材料可以被附接至一种或更多种不同分析物。可选地，在从空隙区移除凝胶材料之后分析物被添加至凹特征中的凝胶材料。
本公开内容的结构化的基底可以在流通池(flow cell)中存在。示例性流通池、用于其制造的方法和用于其使用的方法被描述在美国专利申请公布号2010/0111768 A1或2012-0270305 A1中；或WO 05/065814，其中每一个通过引用被并入本文。流通池提供了用于放置阵列的便利的格式，所述阵列通过本公开内容的方法产生并经受合成测序(SBS)或包括循环中重复递送试剂的其他技术(例如具有重复或循环步骤的合成技术或检测技术)。示例性的检测方法在下面进一步详细列出。
在一些实施方案中，流通池或具有多个表面的其他容器被使用。具有多个表面的容器可以被使用使得仅单个表面具有含有凝胶的凹特征(例如，孔)。可选地，存在于容器中的两个或更多个表面可以具有含有凝胶的凹特征。流通池的一个或更多个表面可以选择性地被检测。例如，流通池的内部中的相对表面可以以使用本领域中已知的方法的聚焦辐射例如共聚焦技术来选择性处理。用于向容器(例如，流通池)的多个表面选择性引导辐射的有用的共聚焦技术和装置被描述在例如美国专利申请号2009/0272914 A1或美国专利号8,039,817中，其中每一个通过引用被并入本文。
本公开内容提供了制备基底的方法。方法可包括以下步骤：(a)提供具有平面表面的固体支撑体，其中平面表面被一个或更多个凹特征中断并且其中平面表面上的一个或更多个空隙区形成一个或更多个凹特征的边界；(b)用凝胶材料包被至少一部分固体支撑体，其中所述部分包含至少一个凹特征和至少一个空隙区；以及(c)抛光平面表面以从至少一个空隙区移除凝胶材料并且维持凝胶材料在至少一种凹特征中。
使用本领域中已知的多种技术的任一种，基底可以被制造以具有凹特征。在许多实施方案中，凹特征将是小的，大约纳米或微米尺寸。在这样的情形中，纳米制造或微米制造技术可以被使用。这些技术的实例被列在本文其他地方，例如下面的实施例II。另外的示例性纳米制造和微米制造技术被描述在美国序列号13/661,524和美国专利申请公布号2012/0316086A1中，其中每一个通过引用被并入本文。
一个或更多个凹特征例如孔，可以用预先形成的凝胶材料或用随后形成凝胶材料的液体来包被。前一方法的实例是使用旋转包被、浸渍、在正或负压力下的凝胶流、或列在美国临时专利申请序列号61/753,833(其通过引用被并入本文)中的技术，用预先形成的PAZAM包被基底。用预先形成的PAZAM包被孔的阵列被展示在下面实施例III中。应用随后形成凝胶材料的液体的实例是用液体形式的无硅烷丙烯酰胺和N-[5-(2-溴乙酰基)氨基戊基]丙烯酰胺(BRAPA)包被孔的阵列并且允许反应物通过聚合作用在表面上形成凝胶。以这种方式包被阵列展示在下面实施例I中并且可以使用如美国专利申请公布号2011/0059865 A1(其通过引用被并入本文)中列出的化学试剂和程序。例如，在一些实施方案中，当将含有孔的基底浸渍进入预先形成的凝胶材料时，凝胶材料可以选择性地填充孔并且抛光可以不是必需的。
在与固体支撑体接触之前或之后，分析物可被添加至凝胶材料。此外，分析物可以被添加至凝胶(即，在凝胶从其前体试剂形成之后)或分析物可以被添加至形成凝胶的试剂溶液(即，凝胶形成之前)。在一些实施方案中，多种分析物可以在凝胶形成之前被添加并且其他可以在凝胶形成之后被添加。在一个实例中，引物核酸被添加至形成凝胶的溶液并且然后溶液被允许形成凝胶(例如通过聚合作用，如对SFA和PAZAM发生的)。凝胶形成可以发生在固体支撑体上或凝胶可以预先形成并且然后包被至固体支撑体上。不论哪种方式，引物将被附接至存在于例如孔的凹特征中的凝胶。然后与引物互补的靶标核酸可以被添加至含有引物的凝胶，使得在凝胶材料已经被包被至固体支撑体上之后，靶标核酸被附接至凝胶(经由杂交)。靶标核酸的杂交可以任选地在抛光步骤已经被实施(抛光在下面进一步被详细描述)之后发生。前述的实例，描述了若干情形，其中核酸(具有作为引物或靶标的功能)在结构化的基底的制造的不同阶段被添加至凝胶。
在若干实施方案中，被附接至凝胶(或另外存在于凝胶中或凝胶上)的引物核酸可以被用于捕获和/或扩增模板核酸。引物可以是与通用接头序列杂交的通用引物，所述通用接头序列被附接至文库中不同靶标核酸(即，每个靶标核酸包括不同于文库中其他靶标核酸的靶标区并且文库中的若干靶标核酸具有相同通用接头序列)。在一些实施方案中，靶标核酸可以被附接至凝胶材料，并且引物(无论在溶液中或也被附接至凝胶)可以被用以扩增附接的靶标核酸(即，靶标核酸可以用作用于扩增的模板)。
本文列出的方法可以使用多种扩增技术的任一种。可以被使用的示例性技术包括，但不限于聚合酶链式反应(PCR)、滚环扩增(RCA)、多重置换扩增(MDA)或随机引物扩增(RPA)。在特定的实施方案中，用于扩增的一种或更多种引物可以被附接至凝胶材料。在PCR实施方案中，用于扩增的一种或两种引物可以被附接至凝胶材料。利用附接的引物的两种物质的格式通常称为桥式扩增，因为双链扩增子形成已经被拷贝的模板序列侧翼的两种附接的引物之间的桥样结构。可以被用于桥式扩增的示例性试剂和条件被描述在例如美国专利号5,641,658、美国专利公布号2012/0055100、美国专利号7,115,400、美国专利公布号2004/0096853、美国专利公布号2001/0002090、美国专利公布号2007/0128624和美国专利公布号2008/0009420中，其中每一个通过引用被并入本文。PCR扩增也可以以扩增引物之一附接至凝胶材料并且第二引物在溶液中来实施。使用一种固相附接的引物和溶液相引物的组合的示例性格式是乳液PCR，例如，如Dressman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:8817-8822(2003)、WO05/010145、或美国专利公布号2005/0130173或2005/0064460中描述的，其中每一个通过引用被并入本文。乳液PCR是该格式的示例并且将要理解的是，为了本文列出的方法的目的，乳液的使用是任选的，并且事实上对于多种实施方案不使用乳液。此外，引物不需要直接被附接至如ePCR参考文献中列出的固体支撑体并且而是可被附接至如本文中列出的凝胶材料。在一些固相PCR或桥式扩增格式中，靶标核酸可以被附接至凝胶材料并且被用作用于扩增的模板。
RCA技术可以被修改用于本公开内容的方法中。可以被用于RCA反应的示例性组分以及RCA藉以产生扩增子的原理被描述在例如Lizardi等人，Nat.Genet.19:225-232(1998)和美国专利申请公布号2007/0099208 A1中，其中每一个通过引用被并入本文。用于RCA的引物可以是在溶液中或被附接至凝胶材料。
MDA技术可以被修改用于本公开内容的方法。用于MDA的一些基本原理和有用的条件被描述在例如Dean等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA，99：5262-66(2002)；Lage等人，Genome Research 13:294-307(2003)；Walker等人，Molecular Methods for Virus Detection，Academic Press，Inc，1995；Walker等人，Nucl.Acids.Res，20:1691-96(1992)；美国专利号5,445,166、5,130,238和6,214,587中，其中每一个通过引用被并入本文。用于MDA的引物可以是在溶液中或被附接至凝胶材料。
在特定的实施方案中，以上示例的扩增技术的组合可以被使用。例如RCA和MDA可以被组合使用，其中RCA被用以在溶液中产生多联体扩增子(例如，使用溶液相引物)。然后，使用被附接至凝胶材料的引物，扩增子可以被用作用于MDA的模板。在该实例中，在组合的RCA和MDA步骤之后产生的扩增子将被附接至凝胶材料。扩增子通常将含有靶标核苷酸序列的多联体重复段。
扩增技术，例如以上示例的那些，可以被用以产生具有靶标核酸的多个拷贝的含有凝胶的特征。个体特征，例如孔，可以具有以单一分子多联体的形式的核苷酸序列的克隆群体，例如由RCA产生的那些，或以具有相同序列的许多核酸分子的形式，例如由桥式PCR产生的那些。通常具有扩增的靶标的若干拷贝的核酸将被附接至凝胶材料。
对于一些应用，个体的含有凝胶的孔(或其他凹特征)可以主要用来自第一靶标核酸的扩增子来填充并且也可以具有低水平的来自第二靶标核酸或来自扩增期间发生的自发突变的污染性扩增子。阵列可以具有一个或更多个扩增位点，所述一个或更多个扩增位点具有足够低水平的污染性扩增子以便对阵列的随后使用不会具有不可接受的影响。例如，当阵列将在检测应用中被使用时，可接受的污染水平将是不会以不可接受的方式影响检测技术的信噪比或分辨率的水平。相应地，表观的克隆性通常与通过本文列出的方法制备的阵列的特定使用或应用相关。对于特定应用的在个体孔或其他特征处可以是可接受的污染的示例性水平包括，但不限于至多0.1％、0.5％、1％、5％、10％或25％的污染性扩增子。阵列可包括具有这些示例性水平的污染性扩增子的一个或更多个孔或其他特征。例如，阵列中多至5％、10％、25％、50％、75％或甚至100％的特征可以具有一些污染性扩增子。
已经被包被在固体支撑体的表面上的凝胶材料可以共价地被附接至支撑体。如以上列出的，将分析物例如核酸附接至凝胶材料的步骤可以在结构化的基底的制造中的多种不同阶段被实施。因此，在将分析物附接至凝胶材料之前或之后，凝胶材料可以被附接至固体支撑体。将凝胶材料附接至固体支撑体可以使用任何有用的化学反应来实施，所述化学反应包括但不限于在美国临时专利序列号61/753,833(其通过应用被并入本文)中列出或展示在下面实施例III中的那些。将要理解的是，将凝胶材料附接至固体支撑体不是在所有实施方案中必需的。因此，抛光凝胶包被的支撑体或使用抛光的基底的随后的步骤可以对具有凝胶材料的基底实施，所述凝胶材料任选地，但不是必需地共价附接至凹特征，例如孔。
本文列出的方法可包括从固体支撑体的表面移除凝胶材料的步骤。被包被在固体支撑体上的凝胶材料可以使用多种技术的任一种从空隙区选择性地被移除。例如，凝胶材料可以通过机械抛光技术从具有凹特征和空隙区的固体支撑体移除。机械抛光可以通过向固体支撑体的表面应用研磨力来实施。示例性的方法包括用珠浆研磨、用纸张或衣物擦拭、刮擦等等。抛光的一个实例包括使用用3μm二氧化硅珠浆料(水中10％w/v)包被的不起毛(lintless)(洁净室等级)擦拭物(wipe)以移除空隙凝胶。抛光轮/研磨机也可以以这种浆料来使用。机械抛光也可以使用流体喷射或气体喷射以从空隙区移除凝胶来实现。
抛光可包括化学抛光，例如丙烯酰胺的水解或基于自由基的降解(例如，通过暴露至过氧化苯甲酰或稀释的过氧化氢，如描述在Kurenkov等人，Russian Journal of Applied Chemistry，75:1039-1050(2002)；Caulfied等人，Polym.44:1331-1337(2003)；和Caulfied等人，Chem.Rev.102:3067-3083(2002)中的)。
抛光还可包括化学和机械抛光方法的组合，其中含有颗粒的胶态悬浮液的化学浆料被用以机械剥离并且然后从空隙区化学溶解凝胶材料的已位移的部分。抛光或清除空隙区的其他方法包括基于粘合剂的技术，例如，其中对凝胶材料具有亲和力的刚性、平面粘合膜被包被在表面上，从而使得在空隙区中与凝胶材料紧密接触(例如，通过化学连接)的技术。这种粘合剂膜的机械移除/剥离将导致从空隙区机械移除凝胶材料，同时将凝胶材料留在凹特征中。
在另一个实例中，硫代磷酸盐接枝的SFA可以如以下地从表面上的空隙区被移除。水沾湿的Whatman擦拭物可蘸取氧化铝(～100mg，0.3μm)或钢珠。然后可以使用均匀压力、以小的同心圆将形成的浆料擦在固体支撑体的表面上。然后，清洁的水湿润的Whatman擦拭物可被用以移除表面上的浆料。本文用于从空隙区移除凝胶材料示例的机械的和化学的抛光方法也可以被用以在空隙区灭活凝胶材料，无论凝胶材料是否被移除。例如，凝胶材料可以关于附接至分析物例如核酸的能力或关于支持核酸扩增的能力被灭活。
制备阵列的方法可包括以下步骤：(a)提供具有表面的固体支撑体，所述表面含有多个孔，所述孔含有凝胶材料，所述孔被表面上的空隙区彼此分开，所述空隙区将孔的每一个中的凝胶材料与其他多个孔中的凝胶材料分离；(b)将靶标核酸的文库递送至固体支撑体的孔以产生具有附接至每一个孔中的凝胶材料的靶标核酸的单一物质的孔的阵列，其中阵列中的不同的孔具有来自文库的不同的靶标核酸物质；以及(c)扩增附接至阵列的孔中的凝胶材料的靶标核酸以在阵列的孔的每一个处产生个体靶标核酸的克隆群体。
在若干实施方案中，本文列出的结构化的基底提供了将来自混合物的多种不同分析物方便地递送至表面上的个体化的位置，从而形成阵列的优势。结构化的基底有助于将单一分析物从与基底接触的分析物的混合物选择性捕获在每一个单独的含有凝胶的孔(或其他凹特征)。结构化的基底上的含有凝胶的孔(或其他凹特征)的模式和装载的效率可以被调整至获得具有期望的特征的阵列，所述期望的特征例如分析物密度和关于具有单一分析物物质的每一个特征的纯度。例如，较高密度的孔可以被用以获得阵列上较高密度的分析物并且相反地较低密度的孔可以被用以获得阵列上较低密度的分析物。可选地或另外地，溶液中分析物的浓度或量可以被提高以获得阵列上较高密度的分析物或降低以获得阵列上较低密度的分析物。在每一个含有凝胶的孔(或其他凹特征)处分析物的平均纯度可以通过改变基底的特性或用于递送分析物的条件来调整，如下面进一步详细描述并展示在实施例部分中的。
在特定的实施方案中，孔(或其他凹特征)的尺寸或体积可以被调整以影响捕获的分析物的纯度。例如，孔可以具有仅容纳特定类型的单一分析物的凝胶材料的面积或体积，使得空间排阻阻止多于一种分析物分子被捕获或接种孔。空间排阻对于大分析物例如核酸可以是特别有用的。更具体地，孔(或其他凹特征)可以存在具有等于或小于将被接种在基底上的靶标核酸的排除体积的直径的面积的凝胶表面。靶标核酸的排除体积和其直径可以例如从靶标核酸的长度来确定。确定核酸的排除体积和排除体积的直径的方法被描述在例如美国专利号7,785,790；Rybenkov等人，Pro.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90:5307-5311(1993)；Zimmerman等人，J.Mol.Biol.222:599-620(1991)；或Sobel等人，Biopolymers 31:1559-1564(1991)中，其中每一个通过引用被并入本文。用于空间排阻的条件被列在美国序列号13/661,524和美国专利号7,785,790中，其中每一个通过引用被并入本文，并且可以被容易地用于本公开内容的结构化的基底。
将要理解的是，在一些实施方案中，孔(或其他凹特征)可以存在具有基本上大于将被转移至扩增位点的靶标核酸的排除体积的直径的面积的凝胶表面。因此，特征的面积可以是足够大的使得空间排阻不发生。
在一些实施方案中，例如以上列出的空间排阻实施方案，靶标核酸的文库在扩增过程开始之前可以被递送至固体支撑体的含有凝胶的孔(或其他凹特征)。例如，靶标核酸可以在以靶标核酸接种基底中的凝胶材料的条件下被递送至结构化的基底。基底可以任选地被洗涤以移除未接种凝胶的靶标核酸以及对于基底的随后处理或使用不期望的任何其他材料。扩增可包括本文之前列出的一种或更多种技术。
在可选的实施方案中，靶标核酸的文库可以被递送至固体支撑体的含有凝胶的孔(或其他凹特征)并且扩增过程可以与接种事件同时发生。例如，接种可以在利用动力学排阻的机制下发生，如在例如美国序列号61/715,478(其通过引用被并入本文)中描述的。当过程以足够快的速率发生时，动力学排阻可以发生以有效排除另一事件或过程发生。在含有凝胶的孔的阵列的情形中，孔可以用来自溶液的靶标核酸随机接种并且靶标核酸的拷贝可以在扩增过程中产生以填充接种的位点的每一个达最大限度。接种和扩增过程可以在其中扩增速率超过接种速率的条件下同时进行。如此，其中在已经被第一靶标核酸接种的位点制备拷贝的相对快速的速率将有效地排除第二核酸接种用于扩增的位点。类似地，动力学排阻可以利用用于制备靶标核酸的第一拷贝的相对慢的速率对用于制备靶标核酸或第一拷贝的随后拷贝的相对快速率。例如，由于在已经接种含有凝胶的孔的靶标核酸的第一拷贝的形成中的延迟(例如延迟的或慢激活)对随后的拷贝被制备以填充位点的相对快的速率，动力学排阻可发生。在该实例中，个体的含有凝胶的孔可以已经用若干不同靶标核酸(例如，若干靶标核酸可以在扩增之前存在于每一个位点)来接种。然而，针对任何给定靶标核酸的第一拷贝的形成可以被随机激活，使得第一拷贝的形成的平均速率相比于产生随后的拷贝的速率是相对慢的。在该情形中，尽管个体的含有凝胶的孔可以已经用若干不同靶标核酸来接种，但是动力学排阻将允许只有那些靶标核酸的一种被扩增。通常，含有凝胶的孔(或其他凹特征)可以用作美国序列号61/715,478(其通过引用被并入本文)中列出的方法中用于扩增的位点和阵列形成的位点。
作为对从混合物中将多种不同分析物递送至个体的含有凝胶的凹特征的替代选择，分析物可以从纯原液被离散地递送至个体特征。类似地，分析物可以通过离散递送合成构建模块在个体特征合成(例如，核苷酸前体可以按顺序地被递送以合成核酸)。用于递送纯分析物或用于在原位合成分析物的构建模块的示例性的方法包括，但不限于喷墨阵列布点和光刻阵列合成。有用的光刻术包括由Affymetrix(Santa Clara,CA)商业上使用以制造微阵列或美国专利号5,324,633、5,744,305、5,624,711、6,022,963、6,291,183和6,416,949中描述的那些，其中每一个通过引用被并入本文。喷墨布点技术(inkjet spotting technique)也是有用的，例如由Agilent(Santa Clara,CA)商业化的用于印刷SurePrintTM阵列或在美国专利号6,337,393、6,419,833、6,420,180或6,689,319中描述的那些。这样的方法可以被容易地修改以指导递送至本公开内容的含有凝胶的特征。
特定的凹特征中的凝胶材料不需要仅含有单一物质的分析物。相反，在一些实施方案中，凹特征可以在其中的凝胶中含有若干不同物质的分析物。实例通过图5中靶眼基准标志物来展示。基准标志物包括两个‘亮’环形通道，两个通道的每一个含有凝胶材料，并且每一个亮通道中的凝胶材料被附接至多个不同核酸集群。亮通道中的核酸集群通过用若干不同物质的靶标核酸接种每一个环来形成，所述若干不同物质的靶标核酸行使扩增程序中的模板的功能。基准标志物还包括两个‘暗’环形区。暗环通过空隙表面模式来形成。示例性靶眼通过以同心模式交替暗和亮环来形成。在图5的实例中，结构化的基底还包括含有凝胶的孔，所述含有凝胶的孔的每一个通常含有源自单一核酸靶标的克隆群体。孔存在于亮和暗环之间的环形带中。因此，基准具有空隙环、含有孔的带和通道环的交替的模式。相同扩增程序被用以同时生长孔中的克隆核酸集群和基准标志物中的混合的群体(参见下面实施例III)。具有环的交替的模式的基准的其他实例显示在图3B和图3C中。
本公开内容还提供了检测分析物的方法。所述方法可包括以下步骤：(a)提供具有平面表面的固体支撑体，其中平面表面被一个或更多个凹特征中断，其中凹特征包含凝胶材料，其中平面表面上的一个或更多个空隙区形成一个或更多个凹特征的边界，空隙区基本上没有凝胶材料，并且其中凝胶材料被附接至靶标分析物或包含靶标分析物；(b)在其中靶标分析物与探针特异性相互作用的情况下将固体支撑体与探针接触；以及(c)检测固体支撑体以区分与一种或更多种探针相互作用的靶标分析物的至少一个子集。
在特定的实施方案中，核酸是被检测的分析物并且凹特征是孔。例如，检测核酸的方法可包括以下步骤：(a)提供具有表面和核酸文库的固体支撑体，表面具有多个孔，孔含有凝胶材料，孔被表面上的空隙区彼此分开，空隙区将孔的每一个中的凝胶材料与其他多个孔中的凝胶材料分离，文库的靶标核酸的单一物质被附接至孔的每一个中的凝胶材料；(b)将固体支撑体与结合靶标核酸的至少一种探针接触；以及(c)检测固体支撑体以区分具有结合至至少一种探针的靶标核酸物质的孔。
本公开内容的含有核酸阵列的结构化的基底可以被用于多种目的的任一种。对于核酸的特别期望的用途是用作与具有互补序列的靶标核酸杂交的捕获探针。与捕获探针杂交的靶标核酸可例如经由被募集至捕获探针的标记物来检测。用于通过与捕获探针的杂交检测靶标核酸的方法是本领域中已知的并且包括例如，描述在美国专利号7,582,420、6,890,741、6,913,884或6,355,431或美国专利申请公布号2005/0053980 A1、2009/0186349 A1或2005/0181440 A1中的那些，其中每一个通过引用被并入本文。例如，标记物可以借助于捕获探针与具有标记物的靶标探针的杂交被募集至捕获探针。在另一个实例中，标记物可以通过将靶标探针与捕获探针杂交被募集至捕获探针，使得捕获探针可以通过对标记的寡核苷酸的连接作用(例如通过连接酶活性)或通过加入标记的核苷酸(例如通过聚合酶活性)来延伸。
核酸阵列还可以被用于测序程序，例如合成测序(SBS)技术。简要地，SBS可以通过将靶标核酸与一种或更多种标记的核苷酸、DNA聚合酶等接触来开始。其中引物使用靶标核酸作为模板来延伸的那些特征将掺入可以被检测的标记的核苷酸。任选地，标记的核苷酸可以另外包括可逆终止特性，所述可逆终止特性在核苷酸已经被添加至引物之后，终止另外的引物延伸。例如具有可逆终止子部分的核苷酸类似物可以被添加至引物，使得随后的延伸不发生，直到去封闭剂(deblocking agent)被递送以移除该部分。因此，对于使用可逆终止的实施方案，去封闭剂可以被递送至流通池(在检测发生之前或之后)。洗涤可以在多个递送步骤之间来实施。然后循环可以被重复n次以将引物延伸n个核苷酸，从而检测长度n的序列。可以容易地被调整以与由本公开内容的方法产生的阵列一起使用的示例性SBS程序、流体系统和检测平台被描述在例如Bentley等人，Nature，456:53-59(2008)；WO 04/018497；WO 91/06678；WO 07/123744；美国专利号7,057,026；7,329,492；7,211,414；7,315,019或7,405,281和美国专利申请公布号2008/0108082 A1，其中每一个通过引用被并入本文。
使用循环反应的其他测序程序可以被使用，例如焦磷酸测序。焦磷酸测序检测无机焦磷酸(PPi)随着特定核苷酸被掺入新生核酸链的释放(Ronaghi等人，Analytical Biochemistry 242(1)，84-9(1996)；Ronaghi，Gemome Res，11(1)，3-11(2001)；Ronaghi等人，Science，281(5375)，363(1998)；美国专利号6,210,891；6,258,568和6,274,320，其中每一个通过引用被并入本文)。在焦磷酸测序中，释放的PPi可以通过被ATP硫酸化酶转化为三磷酸腺苷(ATP)来检测，并且产生的ATP可以通过荧光素酶产生的光子来检测。因此，测序反应可以通过发光检测系统来监测。用于基于荧光的检测系统的激发放射源不是焦磷酸测序程序必需的。可以被用于将焦磷酸测序应用于本公开内容的阵列的有用的流体系统、检测器和程序被描述在例如WIPO专利申请序列号PCT/US11/57111、美国专利申请公布号2005/0191698 A1、美国专利号7,595,883和美国专利号7,244,559，其中每一个通过引用被并入本文。
连接测序(sequencing-by-ligation)也可以是有用的，包括例如描述在Shendure等人，Science，309:1728-1732(2005)；美国专利号5,599,675；和美国专利号5,750,341中的那些，其中每一个通过引用被并入本文。一些实施方案可包括杂交测序(sequencing-by-hybridization)程序，如在例如Bains等人，Journal of Theoretical Biology，135(3)，303-7(1988)；Drmanac等人，Nature Biotechnology，16，54-58(1998)；Fodor等人，Science，251(4995)，767-773(1995)；和WO 1989/10977中描述的，其中每一个通过引用被并入本文。在连接测序和杂交测序程序二者中，存在于含有凝胶的孔(或其他凹特征)的核酸经受寡核苷酸递送和检测的重复循环。如本文或本文引用的参考文献中列出的用于SBS方法的流体系统，可以容易地被调整用于递送用于连接测序或杂交测序程序的试剂。通常，寡核苷酸被荧光标记并且可以使用荧光检测器来检测，所述荧光检测器与本文或本文引用的参考文献中关于SBS程序描述的那些类似。
一些实施方案可以利用包括实时监测DNA聚合酶活性的方法。例如，核苷酸掺入可以通过含有荧光团的聚合酶和γ磷酸盐标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)反应或以零模式波导来检测。用于基于FRET的测序的技术和试剂被描述在例如Levene等人，Science，299，682-686(2003)；Lundquist等人，Opt.Lett，33，1026-1028(2008)；Korlach等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，105，1176-1181(2008)，其公开内容通过引用被并入本文。
一些SBS实施方案包括检测将核苷酸掺入延伸产物后释放的质子。例如，基于检测释放的质子的测序可以使用电子检测器和来自Ion Torrent(Guilford,CT,Life Technologies子公司)商业上可得的相关技术或描述在美国专利申请公布号2009/002608 A1、2009/0127589 A1、2010/0137143 A1、或2010/0282617 A1中的测序方法和系统，其中每一个通过引用被并入本文。在特定的实施方案中，被用以检测释放的质子的电子检测器可以被改良以包括孔并且孔可以含有如本文列出的凝胶材料。
对于本公开内容的阵列的另一个有用的应用是基因表达分析。基因表达可以使用RNA测序技术，例如称为数字RNA测序的那些来检测或定量。RNA测序技术可以使用本领域中已知的例如以上列出的那些测序方法学来实施。基因表达也可以使用杂交技术或使用多重测定来检测或定量，所述杂交技术通过与阵列的直接杂交来实施，所述多重测定的产物在阵列上被检测。本公开内容的阵列还可以被用以确定来自一个或更多个个体的基因组DNA样品的基因型。可以在本公开内容的阵列上实施的用于基于阵列的表达和基因分型分析的示例性方法被描述在美国专利号7,582,420、6,890,741、6,913,884或6,355,431或美国专利申请公布号2005/0053980 A1、2009/0186349 A1、或2005/0181440 A1，其中每一个通过引用被并入本文。
本公开内容的阵列的若干应用已经在以上总体检测的上下文中被示例，其中靶标核酸的多个拷贝存在于每一个特征并且被一起检测。在可选的实施方案中，单一核酸，无论靶标核酸或其扩增子，可以在每一个特征处被检测。例如，含有凝胶的孔(或其他凹特征)可以被配置以包含单一核酸分子，所述单一核酸分子具有将被检测的靶标核苷酸序列。多种单一分子检测技术的任一种可以被使用，包括例如对以上列出的总体检测技术的改良，以在提高的分辨率下或使用更灵敏的标记物检测位点。可以被使用的单一分子检测方法的其他实例被列在美国专利申请公布号2011/0312529 A1、美国序列号61/578,684和美国序列号61/540,714，其中每一个通过引用被并入本文。
将要理解的是，本公开内容的含有凝胶的基底(例如已经由本文列出的方法产生的)不需要被用于检测方法。相反，结构化的基底可以被用以储存核酸文库。相应地，结构化的基底可以以将核酸保存在其中的状态被储存。例如，具有被附接至核酸的含有凝胶的孔的基底可以以干燥的状态、冷冻的状态(例如在液氮中)或在保护核酸的溶液中被储存。可选地或另外地，结构化的基底可以被用以复制核酸文库。例如，具有被附接至核酸的含有凝胶的孔的基底可以被用以创建来自阵列上一个或更多个孔的复制扩增子。
下面的实施例预期阐明但不限制本发明。
实施例I
用无硅烷丙烯酰胺包被的多孔基底
本实施例展示了用无硅烷丙烯酰胺(SFA)包被纳米孔基底，随后用硫代磷酸接枝引物并且执行将凝胶接枝的引物与互补的荧光寡核苷酸的杂交以证实功能化方法的成功。
通常用于制造BeadChip的芯片基底从Illumina(San Diego，CA)获得。芯片由硅或Zeonor(Zeon Corp.，Tokyo，Japan)制成，具有以具有1.5μm的孔距的六边形模式排列的0.5μm的孔，但孔不含有珠。芯片用如下面列出的和图1中图解的凝胶垫来模式化。
芯片被封装在垫圈密封的室中并且氧气通过以用于形成SFA的流体试剂置换来移除。SFA在室中的芯片上聚合。用于形成SFA的试剂和用于聚合的条件另外如在美国专利申请公布号2011/0059865 A1中描述的，其通过引用被并入本文。密封的室被用以将聚合的混合物放置与芯片直接接触并以确保完全消除空气，因为SFA的自由基聚合是空气敏感过程。在聚合之后，引物如美国专利申请公布号2011/0059865 A1中列出的以及如以下的被接枝至密封室中的SFA聚合物。将含有引物的溶液牵引穿过BeadChip的聚合物包被的表面并且然后将混合物在65℃孵育1.25h(将完全密封的组件置于大烘箱中)。
该方法给出均一包被的基底。样品图像显示在图2的图A中。为了创建离散聚合物区，将位于基底上的孔之间的‘过量’的聚合物使用机械抛光技术移除，所述机械抛光技术利用DI水中氧化铝纳米颗粒(300nm直径)的浆料。10wt.％的3微米二氧化硅颗粒(Kisker Biotech GmbH,Steinfurt,Germany)的浆料也可以被使用。将表面使用不起毛的光学薄纸用纳米颗粒浆料手动擦洗。洗涤以移除浆料和聚合物残渣之后，将荧光标记的探针的溶液与芯片杂交。使用荧光显微镜捕获的图像显示，该方法能够产生具有清洁空隙区的聚合物特征(图2，图B至C)。
这些结果表明，与缺少来自空隙区的信号形成对比，在凝胶填充的孔处的荧光强度是空间离散的。这些结果也展示了，凝胶模式化可以使用具有纳米制备的孔的基底上非共价地附接的凝胶材料来实现。
实施例II
制造具有含有凝胶的纳米孔的基底
多种技术可以被用以制造结构化的阵列，所述阵列随后可用凝胶材料装载。
该过程可以以空白基底/薄片开始并且将模式通过微米或纳米制造技术引入基底。基底/薄片的材料可以是传统的硅、玻璃、塑料、COC或多种可以被结构化的材料的任一种。用于将模式化引入基底的示例性技术包括光刻技术、纳米压印技术、将结构压制进入基于塑料/COC的材料和塑料或COC在具有模式化于其中的结构的母模(master mold)中的注塑成型。基于光刻术的方法通常将包括使用以分档器或光刻机模式化的光刻胶，用将存在于标线/光罩上的模式转移进入光刻胶的放射物暴露，并且然后将抗蚀剂显影以在基底的顶部产生结构化的膜(光刻胶)。结构化的抗蚀剂潜在地是可以被用于随后凝胶包被的最终基底或抗蚀剂中的模式可以通过接下来的处理被转移进入基底。接下来的过程步骤将通常包括反应性离子蚀刻(基于等离子体的蚀刻)或湿蚀刻(基于化学的)过程。如果模式被转移进入基底，模式化的光刻胶随后被移除以产生用于随后凝胶包被的模式化的基底。可以期望的是在光刻胶下使用材料例如铬或钛(一种金属)的牺牲膜(sacrificial film)，并且首先将光刻胶中的模式转移至金属膜并且然后使用该膜作为模式藉以被转移进入基底的硬罩。模式转移进入基底后，膜被移除并且因此被认为是对制备过程牺牲的。如果纳米压印被使用，压印的光刻胶可以是牺牲材料并且类似地被用作中间工具以将模式化的抗蚀剂转移进入基底或抗蚀剂的变化形式可以被使用，使得压印的抗蚀剂用作随后包被步骤的输入。模式化之后会保持的抗蚀剂的实例将是基于溶胶凝胶的材料。
表示结构化的基底如何可以被制备的图示法显示在图3中并且描述在下面。模式化的基底的图像以多种放大水平显示在图3B和图3C中。
测序基底/流通池上化学特异性凝胶垫的创建可包括本实施例中之前列出的一种或更多种纳米制造技术。然后，该过程可任选地包括一个或更多个化学处理步骤，例如硅烷化以允许随后通过硅烷将凝胶聚合物与基底连接。然后使用化学/机械抛光(CMP)以移除基底表面上的所有空隙聚合物。抛光过程将以自上而下的方式移除材料并且因为基底中的结构化的特征有效偏离来自阵列的空隙区的平面，所以抛光将在移除结构化的特征之前从空隙区移除聚合物。如果抛光过程在最优时间之后被停止，结构将保持聚合物包被并且空隙区将缺少聚合物。然后用引物接枝模式化的凝胶垫基底，在凝胶垫处接种靶标核酸并且将靶标核酸用作用于在凝胶垫处创建核酸簇的模板。
实施例III
用PAZAM包被的多孔基底
本实施例显示了含有凝胶的孔的阵列的制造、孔中核酸簇的扩增和簇中核酸的测序。
基底按照以下制造。使用纳米压印制造纳米孔基底(400nm直径、1.5μm孔距、300nm深的孔)。使用化学气相沉积，将氨基硅烷(APTES或APTMS)单层/多层沉积在基底的整个表面上。接下来，通过加入1ml的NHS丙烯酸酯溶液至表面，将以100mM浓度的丙烯酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(Aldrich PN 8060)的1×磷酸盐缓冲的盐水(pH 7.4)溶液与氨基硅烷表面反应，将其用薄的玻璃盖玻片覆盖并且允许反应在室温进行1小时。然后通过旋转包被500μl的水中2wt.％PAZAM溶液至新形成的丙烯酰胺功能化表面上，将聚合物(PAZAM)应用至表面。PAZAM如在美国临时专利申请序列号61/753,833中描述的合成，其通过引用被并入本文。在60℃随后加热PAZAM包被的基底1小时导致聚合物和表面之间的共价连接。通过用水中10wt％的3μm SiO2微颗粒浆料抛光表面，将空隙共价连接的聚合物移除。在以上程序中，Janeway表面(MeCN中具有DIPEA的丙烯酰氯)可代替氨基硅烷包被的表面使用。
然后用引物接枝模式化的聚合物基底，如美国临时专利申请序列号61/753,833(其通过引用被并入本文)中描述的。接来下，将接枝的引物的染料标记的(Cy5)反向互补物以1×PBS缓冲溶液中20μM的互补物浓度暴露至表面，并且然后用以喷瓶应用的50ml 1PBS缓冲液洗涤表面。用设置在Cy5扫描通道并使用450的PMT设置的FLA 9500Typhoon成像仪将基底上标记的互补物成像。还用高分辨率显微镜将基底上标记的互补物成像，显示聚合物/引物的模式化，没有空隙聚合物/引物的剩余(图4)。然后用PhiX DNA接种基底，并且使簇生长，如在美国序列号61/715,478中描述的，其通过引用被并入本文。
在HiSeq 2000(Illumina,Inc.,San Diego,CA)上测序包含含有簇的基底的流通池。使用提取模式化的测序簇(刚性配准)的位置的算法，成功给出高质量测序度量(图5和图6)。测序结果显示，占据对克隆性出人意料地高于对标准泊松分布预计的。具体地，如通过图7中“X”表明的，测序运行的平均占据对克隆性量度，是在泊松曲线边界以上并且紧密地接近理想克隆分数的线。
遍及本申请参考了多种出版物、专利或专利申请。这些出版物的公开内容在此通过引用以其整体被并入本申请，以便更详细描述本发明从属的领域的状态。
本文术语“包含”预期是开放式的，不仅仅包括列举的要素，还包含任何另外的要素。
尽管本发明已经关于以上提供的实例被描述，应该理解的是，多种修改可以被做出，而不背离本发明。相应地，本发明仅被权利要求书限制。

Claims (96)

1.一种阵列，包括
包含表面的固体支撑体，所述表面包含多个孔，所述孔含有凝胶材料，所述孔被所述表面上的空隙区彼此分开，所述空隙区将所述孔的每一个中的凝胶材料与其他多个孔中的凝胶材料分离；和
在所述凝胶材料中的靶标核酸的文库，其中所述孔的每一个中的凝胶材料包含所述文库的靶标核酸的表观的单一物质。
2.如权利要求1所述的阵列，其中所述孔的每一个的体积是至多1000μm3。
3.如权利要求1所述的阵列，其中所述孔的每一个中的凝胶体积是至多1000μm3。
4.如权利要求1所述的阵列，其中所述孔的每一个包含在所述表面中的至多100μm2的开口。
5.如权利要求1至4中任一项所述的阵列，其中所述多个孔形成具有重复模式的阵列。
6.如权利要求5所述的阵列，其中所述模式中的孔具有不多于5微米的孔距。
7.如权利要求1至4中任一项所述的阵列，其中所述多个孔形成具有随机模式的阵列。
8.如权利要求1至7中任一项所述的阵列，其中所述凝胶包含水凝胶。
9.如权利要求1至7中任一项所述的阵列，其中所述凝胶包含SFA或PAZAM。
10.如权利要求1至9中任一项所述的阵列，其中所述孔的每一个中的凝胶材料包含所述文库中的靶标核酸的单一物质。
11.如权利要求10所述的阵列，其中所述单一物质的多个拷贝在所述孔的每一个中形成核酸分子的克隆群体。
12.如权利要求10所述的阵列，其中所述单一物质的多个拷贝在核酸分子中作为多联体重复段存在。
13.如权利要求1至10中任一项所述的阵列，其中所述单一物质在所述孔的每一个中作为不多于单一核酸分子存在。
14.如权利要求13所述的阵列，其中所述单一核酸分子包含两条互补链。
15.如权利要求1至13中任一项所述的阵列，其中所述表面包含每mm2至少1,000个孔的密度。
16.如权利要求1至15中任一项所述的阵列，其中所述凝胶材料共价附接至所述孔的表面。
17.一种制备基底的方法，所述方法包括
(a)提供包含平面表面的固体支撑体，其中所述平面表面被一个或更多个凹特征中断并且其中所述平面表面上的一个或更多个空隙区形成所述一个或更多个凹特征的边界；
(b)用凝胶材料包被所述固体支撑体的至少一部分，其中所述部分包含至少一个凹特征和至少一个空隙区；以及
(c)抛光所述平面表面以从所述至少一个空隙区移除所述凝胶材料并且维持所述凝胶材料在所述至少一个凹特征中。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述凹特征包含被所述空隙区围绕的孔。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述孔的每一个的体积是至多1000μm3。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述孔的每一个中的凝胶体积是至多1000μm3。
21.如权利要求18所述的方法，其中所述孔的每一个包含具有在所述表面中的至多100μm2的开口的开口。
22.如权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述孔形成具有重复模式的阵列。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述模式中的孔具有不多于5μm的孔距。
24.如权利要求18至22中任一项所述的方法，其中多个孔形成具有随机模式的阵列。
25.如权利要求18至24中任一项所述的方法，其中所述表面包含每mm2至少1,000个孔的密度。
26.如权利要求17至24中任一项所述的方法，其中所述包被包括将所述固体支撑体与预先形成的凝胶材料接触。
27.如权利要求17至24中任一项所述的方法，其中所述包被包括将所述固体支撑体与随后形成所述凝胶材料的液体接触。
28.如权利要求17至27中任一项所述的方法，其中所述凝胶材料包含水凝胶。
29.如权利要求17至27中任一项所述的方法，其中所述凝胶材料包含SFA或PAZAM。
30.如权利要求17至29中任一项所述的方法，其中所述凝胶材料被进一步附接至核酸。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述核酸包含扩增引物。
32.如权利要求30或31所述的方法，其中所述核酸包含模板核酸并且所述方法还包括扩增所述凹特征中的凝胶材料中的所述模板核酸。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述扩增产生所述模板核酸的多个拷贝以形成核酸分子的克隆群体。
34.如权利要求32所述的方法，其中所述扩增产生所述模板核酸的多个拷贝以形成核酸分子的多联体重复段。
35.如权利要求18至34中任一项所述的方法，所述方法还包括将所述凝胶材料共价附接至所述孔的表面。
36.如权利要求17至35中任一项所述的方法，其中所述抛光包括用珠浆机械磨损。
37.如权利要求17至36中任一项所述的方法，其中所述抛光包括通过擦拭或刮削所述固体支撑体的表面的机械磨损。
38.如权利要求17至37中任一项所述的方法，其中所述抛光包括化学抛光。
39.如权利要求17至38中任一项所述的方法，其中所述凝胶材料被进一步附接至蛋白质。
40.一种制备阵列的方法，所述方法包括
(a)提供包含表面的固体支撑体，所述表面包含多个孔，所述孔含有凝胶材料，所述孔被所述表面上的空隙区彼此分开，所述空隙区将所述孔的每一个中的凝胶材料与其他多个孔中的凝胶材料分离；
(b)将靶标核酸的文库递送至所述固体支撑体的孔以产生具有附接至每一个孔中的凝胶材料的靶标核酸的单一物质的孔的阵列，其中所述阵列中不同的孔包含来自所述文库的不同靶标核酸物质；以及
(c)扩增附接至所述阵列的孔中的凝胶材料的所述靶标核酸以在所述阵列的孔的每一个处产生个体靶标核酸的克隆群体。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述孔的每一个中的凝胶体积是至多1000μm3。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述孔的每一个包含具有在表面中的至多100μm2的开口的开口。
43.如权利要求40所述的方法，其中所述多个孔在所述表面上形成重复模式。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述模式中的孔具有不多于5μm的孔距。
45.如权利要求40所述的方法，其中所述多个孔在所述表面上形成随机模式。
46.如权利要求40所述的方法，其中所述凝胶包含水凝胶。
47.如权利要求40所述的方法，其中所述凝胶包含SFA或PAZAM。
48.如权利要求40所述的方法，其中所述表面包含每mm2至少1,000个孔的密度。
49.如权利要求40所述的方法，其中所述凝胶材料被共价附接至所述孔的表面。
50.如权利要求40至49中任一项所述的方法，其中步骤(a)中所述固体支撑体的提供包括
(i)提供包含平面表面的所述固体支撑体，所述表面包含多个孔，所述孔被所述表面上的空隙区彼此分开；
(ii)用所述凝胶材料包被所述孔和所述空隙区；以及
(iii)抛光所述平面表面以从至少一个空隙区移除所述凝胶材料并且维持所述凝胶材料在所述孔中。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述包被包括将所述固体支撑体与预先形成的凝胶材料接触。
52.如权利要求50或51所述的方法，其中所述包被包括将所述固体支撑体与随后形成所述凝胶材料的液体接触。
53.如权利要求50至52中任一项所述的方法，其中所述抛光包括用珠浆机械磨损。
54.如权利要求50至53中任一项所述的方法，其中所述抛光包括通过擦拭或刮削所述固体支撑体的表面的机械磨损。
55.如权利要求50至54中任一项所述的方法，其中所述抛光包括化学抛光。
56.如权利要求40至55中任一项所述的方法，其中步骤(b)在步骤(c)之前发生。
57.如权利要求40至55中任一项所述的方法，其中步骤(b)和步骤(c)同时发生。
58.如权利要求40至57中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的所述递送包括提供所述文库作为流体中靶标核酸的混合物以及将所述流体与所述固体支撑体接触，据此所述靶标核酸具有对所述孔和所述空隙区的流体通路。
59.如权利要求40至58中任一项所述的方法，其中所述扩增包括固相聚合酶链式反应(PCR)、多重置换扩增(MDA)或滚环扩增(RCA)。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述扩增包括至少一种引物物质的聚合酶延伸，所述至少一种引物物质被附接至所述孔中的凝胶材料。
61.如权利要求40至58中任一项所述的方法，其中所述扩增包括使用至少两种引物物质的桥式扩增，所述至少两种引物物质被附接至所述孔中的凝胶材料。
62.如权利要求40至61中任一项所述的方法，其中所述克隆群体各自包括来自所述文库的靶标核酸的至少1000个拷贝。
63.一种检测核酸的方法，所述方法包括
(a)提供包含表面的固体支撑体和核酸的文库，所述表面包含多个孔，所述孔包含凝胶材料，所述孔被所述表面上的空隙区彼此分开，所述空隙区将所述孔的每一个中的凝胶材料与所述其他多个孔中的凝胶材料分离，所述文库的靶标核酸的单一物质被附接至所述孔的每一个中的凝胶材料；
(b)将所述固体支撑体与结合至所述靶标核酸的至少一种探针接触；以及
(c)检测所述固体支撑体以区分具有结合至所述至少一种探针的靶标核酸物质的孔。
64.如权利要求63所述的方法，其中所述孔的每一个中的凝胶体积是至多1000μm3。
65.如权利要求63所述的方法，其中所述孔的每一个包含具有在表面中的至多100μm2的开口的开口。
66.如权利要求63所述的方法，其中所述多个孔在所述表面上形成重复模式。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述模式中的孔具有不多于5微米的孔距。
68.如权利要求63所述的方法，其中所述多个孔在所述表面上形成随机模式。
69.如权利要求63所述的方法，其中所述凝胶包含水凝胶。
70.如权利要求63所述的方法，其中所述凝胶包含SFA或PAZAM。
71.如权利要求63所述的方法，其中所述表面包含每mm2至少1,000个孔的密度。
72.如权利要求63所述的方法，其中所述凝胶材料被共价附接至所述孔的表面。
73.如权利要求63至72中任一项所述的方法，其中步骤(a)中所述固体支撑体的提供包括
(i)提供包含平面表面的所述固体支撑体，所述表面包含多个孔，所述孔被所述表面上的空隙区彼此分开；
(ii)用所述凝胶材料包被所述孔和所述空隙区；以及
(iii)抛光所述平面表面以从至少一个空隙区移除所述凝胶材料并且维持所述凝胶材料在所述孔中。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述包被包括将所述固体支撑体与预先形成的凝胶材料接触。
75.如权利要求73或74所述的方法，其中所述包被包括将所述固体支撑体与随后形成所述凝胶材料的液体接触。
76.如权利要求73至75中任一项所述的方法，其中所述抛光包括用珠浆机械磨损。
77.如权利要求73至76中任一项所述的方法，其中所述抛光包括通过擦拭或刮削所述固体支撑体的表面的机械磨损。
78.如权利要求73至77中任一项所述的方法，其中所述抛光包括化学抛光。
79.如权利要求73至77中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的所述提供还包括
(iv)在将所述文库的靶标核酸的单一物质附接至所述孔的每一个中的凝胶材料的条件下，将靶标核酸的所述文库递送至所述固体支撑体的孔；以及
(v)扩增附接至所述阵列的孔中的凝胶材料的所述靶标核酸以在所述阵列的孔的每一个处产生个体靶标核酸的克隆群体。
80.如权利要求79所述的方法，其中步骤(iv)在步骤(v)之前发生。
81.如权利要求79所述的方法，其中步骤(iv)和步骤(v)同时发生。
82.如权利要求79至81中任一项所述的方法，其中步骤(iv)中的所述递送包括提供所述文库作为流体中所述靶标核酸的混合物以及将所述流体与所述固体支撑体接触，据此所述靶标核酸具有对所述孔和所述空隙区的流体通路。
83.如权利要求79至82中任一项所述的方法，其中所述扩增包括固相聚合酶链式反应(PCR)、多重置换扩增(MDA)或滚环扩增(RCA)。
84.如权利要求83所述的方法，其中所述扩增使用被附接至所述孔中的凝胶材料的至少一种引物物质。
85.如权利要求79至82中任一项所述的方法，其中所述扩增包括使用至少两种引物物质的桥式扩增，所述至少两种引物物质被附接至所述孔中的凝胶材料。
86.如权利要求79至85中任一项所述的方法，其中所述克隆群体各自包括来自所述文库的靶标核酸的至少1000个拷贝。
87.如权利要求63至86中任一项所述的方法，其中所述至少一种探针包括与至少一种所述靶标核酸的至少一部分互补的至少一种核酸。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述至少一种探针包括步骤(c)中检测的荧光标记物。
89.如权利要求87所述的方法，其中所述至少一种探针还包括聚合酶和核苷酸。
90.如权利要求89所述的方法，其中步骤(c)中的所述检测包括检测所述核苷酸向所述探针或向所述靶标核酸的掺入。
91.如权利要求89所述的方法，其中步骤(c)中的所述检测包括合成测序程序。
92.如权利要求63至权利要求91中任一项所述的方法，其中步骤(b)和(c)在测序程序中重复若干次。
93.如权利要求63至权利要求91中任一项所述的方法，其中所述探针包括结合蛋白质的核酸。
94.如权利要求63至权利要求93中任一项所述的方法，其中所述检测选自由光学检测、电学检测和热学检测组成的组。
95.如权利要求94所述的方法，其中所述光学检测选自由荧光、发光、化学发光、吸光度和荧光共振能量转移组成的组。
96.一种检测分析物的方法，所述方法包括
(a)提供包含平面表面的固体支撑体，
其中所述平面表面被一个或更多个凹特征中断，
其中所述凹特征包含凝胶材料，
其中所述平面表面上的一个或更多个空隙区形成所述一个或更多个凹特征的边界，所述空隙区基本上没有所述凝胶材料，并且
其中所述凝胶材料包含靶标分析物；
(b)在其中所述靶标分析物与探针特异性相互作用的条件下将所述固体支撑体与所述探针接触；以及
(c)检测所述固体支撑体以区分与一个或更多个所述探针相互作用的所述靶标分析物的至少一个子集。
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