KR20210098842A - 브릿지 증폭에 의한 클러스터 생성을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

브릿지 증폭에 의한 클러스터 생성을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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조나단 마크 부텔
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일루미나 케임브리지 리미티드
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Abstract

본 개시내용은 선형화 및 미사용 표면 프라이머의 제거에 사용되는 효소를 조합함으로써 단클론성 클러스터의 생성에 사용되는 단계들을 감소시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

Description

브릿지 증폭에 의한 클러스터 생성을 위한 방법 및 조성물
본 발명은, 무엇보다도 샘플로부터 서열 정보를 수득하는데 관여하는 단계들을 감소시키는 맥락에서, 서열분석을 위한 앰플리콘의 클러스터를 생성하기 위한 표적 핵산의 증폭에 관한 것이다.
차세대 서열분석(NGS) 기술은 단일 표적 핵산으로부터 생성된 앰플리콘의 단클론성 집단의 고도 병렬 서열분석에 의존한다. NGS 방법은 서열분석 속도 및 데이터 출력을 크게 증가시켜, 현재의 서열분석 플랫폼의 대량 샘플 처리량을 초래한다. 주형을 서열분석하기 위한 시간의 추가적인 감소는 매우 바람직하지만, 유용한 신호 대 잡음 비, 강도, 및 필터를 통과하는 클러스터들의 증가된 백분율을 유지하는 것이 필요하며, 이들 모두는 증가된 데이터 출력 및 데이터 품질에 기여한다. 주형을 서열분석하기 위한 시간을 감소시키는 것은 별도의 단계를 조합함으로써 달성될 수 있지만; 별도의 단계는 종종 비호환성으로 인해 조합될 수 없다. 예를 들어, 하나의 효소의 활성은 다른 효소의 생성물에 의해 억제될 수 있고, 따라서 별도의 단계에서 효소의 사용을 필요로 한다.
차세대 서열분석(NGS) 기술은 단일 표적 핵산으로부터 생성된 앰플리콘의 단클론성 집단의 고도 병렬 서열분석에 의존한다. 앰플리콘의 단클론성 집단을 생성하고 서열분석하기 위해 다수의 단계가 필요하며, 각 단계는 유용한 서열 데이터를 샘플로부터 수득할 수 있기 전에 요구되는 전체 시간을 추가한다. 예를 들어, 어레이의 증폭 부위에 존재하는 표적 핵산을 부착시킨 후 증폭시키는 것을 비롯하여, 앰플리콘의 단클론성 집단을 제조하기 위해 다수의 단계가 필요하다. 본 발명자들은, 단클론성 앰플리콘의 생산에 사용되는 2개의 별도의 단계가 조합될 수 있음을 발견하였다. 표준 통상적인 방법에서, 단클론성 앰플리콘의 생산 동안, 증폭 부위는 엑소뉴클레아제로 처리된 후, 소정의 위치에서 단일 뉴클레오타이드 갭을 선택적으로 생성하는 글리코실라제 효소로 별도의 단계에서 처리된다. 단일 뉴클레오타이드 갭을 생성하는 것은 또한 엑소뉴클레아제의 활성을 억제하는 구조, 3'-포스페이트를 생성하기 때문에, 상기 단계들은 그 순서로 수행된다. 예상치 못하게, 본 발명자들은, 엑소뉴클레아제 및 글리코실라제가 일차 메트릭(metric), 판독 품질, 이중 인덱싱, 또는 게놈 구축 메트릭에 대해 해로운 영향을 거의 또는 전혀 미치지 않으면서 하나의 단계로 조합될 수 있음을 발견하였다. 이는 두 단계가 동시에 수행되기 때문에 더 빠른 서열분석을 초래한다. 이는 또한 시약의 수 및 양을 감소시킴으로써 소비자에게 전체 비용을 감소시키는 이점을 갖는다.
조성물이 본 명세서에 제공된다. 일 구현예에서, 조성물은 우라실 DNA 글리코실라제, 엔도뉴클레아제, 및 3'에서 5' 단일 가닥 DNA 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 엑소뉴클레아제를 포함한다.
또한, 방법이 제공된다. 일 구현예에서, 방법은 서열분석 반응을 위한 핵산을 제조하기 위한 것이다. 상기 방법은 복수의 증폭 부위를 갖는 어레이를 제공하는 단계를 포함한다. 증폭 부위는 증폭 부위에 부착된 복수의 포획 핵산을 포함하되, 복수의 포획 핵산의 제1 집단은 절단 부위를 포함한다. 증폭 부위는 또한 복수의 클론 이중 가닥 변형 표적 핵산을 포함하되, 각각의 이중 가닥 표적 핵산의 두 가닥은 그의 5' 말단에서 포획 핵산에 부착되되, 하나의 가닥은 절단 부위를 포함하는 포획 핵산과 부착되고, 절단 부위는 각각의 이중가닥 분자의 이중 가닥 영역에 위치한다. 상기 방법은 또한 절단 부위에서 무염기성 부위를 생성하기 위한 적어도 하나의 효소 및 3'에서 5' 단일 가닥 DNA 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 엑소뉴클레아제를 포함하는 조성물과 상기 어레이를 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 절단은 절단 부위에서 일어나고, 상기 절단은 이중 가닥 표적 핵산의 하나의 가닥을 상기 증폭 부위에 부착된 제1 가닥 및 상기 증폭 부위에 부착되지 않은 제2 가닥으로 전환시키고, 유리 3' 말단을 포함하는 단일 가닥 포획 핵산은 엑소뉴클레아제에 의해 길이가 감소된다.
본 개시내용의 예시적인 구현예에 대한 다음의 상세한 설명은 다음의 도면과 함께 읽을 때 가장 잘 이해될 수 있다.
도 1a 내지 1d는 본원에 제시된 개시내용의 다양한 양태에 따른 서열분석을 위한 핵산을 제조하는 구현예의 개략도를 나타낸다.
도 2는 엑소뉴클레아제 I 활성에 대한 3'-포스페이트 및 DNA 글리코실라제의 효과를 도시한다. 좌측 패널은 플로우셀의 각 레인에서 DNA 글리코실라제 및 엑소뉴클레아제의 존재를 나타낸다. DNA 글리코실라제가 먼저 첨가된 후, 엑소뉴클레아제가 첨가되었다. 예외는 레인 4이고, 여기서 DNA 글리코실라제 및 엑소뉴클레아제는 동시에 첨가되었다. 중간 패널은 위에서 아래로 번호가 매겨진 레인 1 내지 8을 갖는 플로우셀을 나타내고, 레인 3 내지 5에서 신호가 없다. 우측 패널은 레인의 형광 결과를 나타내며, 레인 3 내지 5는 본질적으로 형광을 갖지 않는다.
도 3은 실시예 1 및 3에 기재된 바와 같은 서열분석 실행의 결과를 나타낸다.
개략적인 도면들은 반드시 축척에 맞는 것은 아니다. 도면들에서 사용된 유사한 번호들은 유사한 구성요소들, 단계들 등을 지칭한다. 그러나, 주어진 도면 내의 구성요소를 지칭하기 위한 번호의 사용은 동일한 번호로 표지된 또 다른 도면에서 구성요소들을 제한하도록 의도되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 또한, 구성요소들을 지칭하기 위한 상이한 번호들의 사용은 상이한 번호가 매겨진 구성요소들이 다른 번호가 매겨진 구성요소들과 동일하거나 유사할 수 없음을 나타내도록 의도되지 않는다.
정의
본 명세서에서 사용된 용어는 달리 명시되지 않는 한 관련 기술에서의 통상적인 의미를 취하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용된 여러 용어 및 이들의 의미는 아래에 제시된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "앰플리콘"은, 핵산과 관련하여 사용될 때, 핵산을 복제한 생성물을 의미하고, 여기서 생성물은 핵산의 뉴클레오타이드 서열의 적어도 일부와 동일하거나 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 앰플리콘은 주형으로서 핵산, 예를 들어 표적 핵산 또는 그의 앰플리콘을 사용하는 임의의 다양한 증폭 방법, 예를 들어 중합효소 연장, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 회전환 증폭 (RCA), 결찰 연장, 또는 결찰 연쇄 반응을 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다. 앰플리콘은 특정 뉴클레오타이드 서열의 단일 복제(예를 들어, 중합효소 연장 생성물) 또는 뉴클레오타이드 서열의 다중 복제(예를 들어, RCA의 연쇄체 생성물)을 갖는 핵산 분자일 수 있다. 표적 핵산의 제1 앰플리콘은 전형적으로 상보적 복제이다. 후속 앰플리콘은, 제1 앰플리콘의 생성 후에, 표적 핵산으로부터 또는 제1 앰플리콘으로부터 생성되는 복제이다. 후속 앰플리콘은 표적 핵산에 실질적으로 상보적이거나 표적 핵산과 실질적으로 동일한 서열을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "증폭 부위"는 하나 이상의 앰플리콘이 생성될 수 있는 어레이 내 또는 어레이 상의 부위를 지칭한다. 증폭 부위는 그 부위에서 생성되는 적어도 하나의 앰플리콘을 함유, 유지 또는 부착하도록 추가로 구성될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "어레이"는 상대 위치에 따라 서로 구별될 수 있는 부위들의 집단을 지칭한다. 어레이의 상이한 부위에 있는 상이한 분자는 어레이 내 부위의 위치에 따라 서로 구별될 수 있다. 어레이의 개별 부위는 특정 유형의 하나 이상의 분자를 포함할 수 있다. 예를 들어, 부위는 특정 서열을 갖는 단일 표적 핵산 분자를 포함할 수 있거나, 부위는 동일한 서열 (및/또는 그의 상보적 서열)을 갖는 여러 핵산 분자를 포함할 수 있다. 어레이의 부위들은 동일한 기판 상에 위치된 상이한 특징부들일 수 있다. 예시적 특징부들은 제한 없이, 기판 내의 웰들, 기판 내 또는 기판 상의 비드들(또는 다른 입자들), 기판으로부터의 돌출부들, 기판 상의 리지들 또는 기판 내의 채널들을 포함한다. 어레이의 부위는 각각 상이한 분자를 갖는 별개의 기판일 수 있다. 별개의 기판에 부착된 상이한 분자들은 기판들이 연관되는 표면 상의 기판들의 위치들에 따라 또는 액체 또는 겔 내의 기판들의 위치에 따라 식별될 수 있다. 별개의 기판들이 표면 상에 위치되는 예시적 어레이는, 제한 없이, 웰 내에 비드들을 갖는 어레이를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "용량"은, 부위 및 핵산 물질과 관련하여 사용될 때, 부위를 점유할 수 있는 핵산 물질, 예를 들어 표적 핵산으로부터 유래된 앰플리콘의 최대량을 의미한다. 예를 들어, 상기 용어는 특정 조건에서 그 부위를 점유할 수 있는 핵산 분자의 총 수를 지칭할 수 있다. 예를 들어, 핵산 물질의 총 질량 또는 특정 조건에서 부위를 점유할 수 있는 특정 뉴클레오타이드 서열의 복제의 총 수를 포함하는 다른 조치가 또한 사용될 수 있다. 전형적으로, 표적 핵산에 대한 부위의 용량은 표적 핵산의 앰플리콘에 대한 부위의 용량과 실질적으로 동등할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포획제"는 표적 분자(예를 들어, 표적 핵산)에 부착, 보유 또는 결합할 수 있는 물질, 화학물질, 분자 또는 그의 모이어티를 지칭한다. 예시적 포획제는, 제한 없이, 변형 표적 핵산의 적어도 일부(예를 들어, 범용 포획 결합 서열)에 상보적인 포획 핵산, 변형 표적 핵산(또는 이에 부착된 연결 모이어티)에 결합할 수 있는 수용체-리간드 결합 쌍의 구성원(예, 아비딘, 스트렙타비딘, 비오틴, 렉틴, 탄수화물, 핵산 결합 단백질, 에피토프, 항체 등), 또는 변형 표적 핵산(또는 그에 부착된 연결 모이어티)과 공유 결합을 형성할 수 있는 화학 시약을 포함한다. 일 구현예에서, 포획제는 핵산이다. 핵산 포획제는 또한 증폭 프라이머로서 사용될 수 있다.
용어 "P5" 및 "P7"은 핵산 포획제를 지칭할 때 사용될 수 있다. 용어 "P5' "(P5 프라임) 및 "P7'"(P7 프라임)"은 각각 P5 및 P7의 상보체를 지칭한다. 임의의 적합한 핵산 포획제가 본원에 제시된 방법에 사용될 수 있고, P5 및 P7의 사용이 단지 예시적 구현예라는 것이 이해될 것이다. 플로우셀에 대한 P5 및 P7과 같은 핵산 포획제의 사용은 WO 2007/010251, WO 2006/064199, WO 2005/065814, WO 2015/106941, WO 1998/044151 및 WO 2000/018957의 개시내용에 의해 예시된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 통상의 기술자는 핵산 포획제가 또한 증폭 프라이머로서 기능할 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 임의의 적합한 핵산 포획제는, 고정화되든 용액 내든, 정방향 증폭 프라이머로서 작용할 수 있고, 서열(예를 들어, 범용 포획 결합 서열)에 대한 혼성화 및 서열의 증폭을 위해 본원에 제시된 방법에 유용할 수 있다. 유사하게, 임의의 적합한 핵산 포획제는, 고정화되든 용액 내든, 역방향 증폭 프라이머로서 작용할 수 있고, 서열(예를 들어, 범용 포획 결합 서열)에 대한 혼성화 및 서열의 증폭을 위해 본원에 제시된 방법에 유용할 수 있다. 이용가능한 일반 지식 및 본 개시내용의 교시의 관점에서, 통상의 기술자는 본원에 제시된 바와 같은 표적 핵산의 포획 및 증폭에 적합한 서열을 설계 및 사용하는 방법을 이해할 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "범용 서열"은 2개 이상의 표적 핵산에 공통인 서열의 영역을 지칭하며, 여기서 분자는 또한 서로 상이한 서열의 영역을 갖는다. 분자의 집합체의 상이한 구성원에 존재하는 범용 서열은 범용 서열의 일부, 예를 들어, 범용 포획 결합 서열에 상보적인 포획 핵산의 집단을 사용하여 다수의 상이한 핵산의 포획을 허용할 수 있다. 범용 포획 결합 서열의 비제한적인 예는 P5 및 P7 프라이머와 동일하거나 상보적인 서열을 포함한다. 유사하게, 분자의 집합체의 상이한 구성원에 존재하는 범용 서열은 범용 서열의 일부, 예를 들어, 범용 프라이머 결합 부위에 상보적인 범용 프라이머의 집단을 사용하여 다수의 상이한 핵산의 복제 또는 증폭을 허용할 수 있다. 표적 핵산 분자는, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이, 상이한 표적 서열의 한쪽 또는 양쪽 말단에 (본원에서 어댑터로도 지칭된) 범용 어댑터를 부착하도록 변형될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "어댑터" 및 그의 유도체, 예를 들어 범용 어댑터는 일반적으로 표적 핵산에 결찰될 수 있는 임의의 선형 올리고뉴클레오타이드를 지칭한다. 일부 구현예에서, 어댑터는 샘플에 존재하는 임의의 표적 서열의 3' 말단 또는 5' 말단에 실질적으로 비상보적이다. 일부 구현예에서, 적합한 어댑터 길이는 약 10 내지 100 뉴클레오타이드, 약 12 내지 60 뉴클레오타이드 및 약 15 내지 50 뉴클레오타이드의 범위이다. 일반적으로, 어댑터는 뉴클레오타이드 및/또는 핵산의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 양태에서 어댑터는 하나 이상의 위치에서 하나 이상의 절단가능한 기를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 어댑터는 프라이머, 예를 들어 포획 핵산의 적어도 일부와 실질적으로 동일하거나 실질적으로 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 어댑터는 다운스트림 오류 정정, 식별, 또는 서열분석을 돕기 위해 인덱스 또는 태그로도 지칭되는 바코드를 포함할 수 있다. 용어 "어뎁터" 및 "어댑터"는 호환적으로 사용된다.
본원에 정의된 바와 같이, "샘플" 및 그의 유도체는 그의 가장 넓은 의미로 사용되며, 표적 핵산을 포함하는 것으로 의심되는 임의의 시료, 배양물 등을 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 DNA, RNA, PNA, LNA, 키메라 또는 혼성 형태의 핵산을 포함한다. 샘플은 하나 이상의 핵산을 함유하는 임의의 생물학적, 임상적, 외과적, 농업적, 대기 또는 수중-기반 시료를 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 게놈 DNA, 신선한-동결 또는 포르말린-고정화된 파라핀-포매 핵산 시료와 같은 임의의 단리된 핵산 샘플을 포함한다. 또한, 샘플은 단일 개체, 유전적으로 관련된 구성원으로부터의 핵산 샘플의 집합체, 유전적으로 관련되지 않은 구성원으로부터의 핵산 샘플, 종양 샘플 및 정상 조직 샘플과 같은 단일 개체로부터 (정합된) 핵산 샘플, 또는 모계 대상체로부터 수득된 모계 및 태아 DNA와 같은 2개의 별개의 형태의 유전 물질을 함유하는 단일 공급원으로부터의 샘플, 또는 식물 또는 동물 DNA를 함유하는 샘플 중의 오염 박테리아 DNA의 존재로부터 유래될 수 있는 것으로 생각된다. 일부 구현예에서, 핵산 물질의 공급원은 예를 들어 신생아 스크리닝에 전형적으로 사용되는 신생아로부터 수득된 핵산을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "클론 집단" 및 "단클론 집단"은 호환적으로 사용되며, 특정 뉴클레오타이드 서열에 대해 균질한 핵산의 집단을 지칭한다. 균질한 서열은 전형적으로 적어도 10 뉴클레오타이드 길이이지만, 예를 들어 적어도 50, 적어도 100, 적어도 250, 적어도 500, 또는 적어도 1000 뉴클레오타이드 길이를 포함하여 더 길 수 있다. 클론 집단은 단일 표적 핵산으로부터 유래될 수 있다. 전형적으로, 클론 집단에서 모든 핵산은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 가질 것이다. (예를 들어, 증폭 인공물로 인한) 소수의 돌연변이가 클론형성능으로부터 벗어남 없이 클론 집단에서 발생할 수 있음이 이해될 것이다. 또한, (예를 들어, 증폭되지 않거나 제한된 정도로 증폭된 표적 핵산으로 인한) 소수의 상이한 표적 핵산이 클론형성능으로부터 벗어남 없이 클론 집단에서 발생할 수 있음이 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상이한"은, 핵산과 관련하여 사용될 때, 핵산이 서로 동일하지 않은 뉴클레오타이드 서열을 가짐을 의미한다. 2개 이상의 핵산은 그들의 전체 길이를 따라 상이한 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 2개 이상의 핵산은 그들의 길이의 실질적 부분을 따라 상이한 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 2개 이상의 핵산은 서로 상이한 표적 뉴클레오타이드 서열 부분을 가질 수 있고, 또한 서로 동일한 범용 서열 영역을 가질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상이한"은, 증폭 부위와 관련하여 사용될 때, 증폭 부위가 동일한 어레이 상의 별개의 별도 위치에 존재함을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유체 접근"은, 유체 내의 분자 및 유체와 접촉하는 부위를 참조하여 사용될 때, 분자가 부위와 접촉하거나 진입하도록 유체 내에서 또는 유체를 통해 이동하는 능력을 지칭한다. 상기 용어는 또한 부위로부터 분리되거나 빠져나와 용액에 들어가는 분자의 능력을 지칭할 수 있다. 유체 접근은 분자가 부위로 들어가는 것, 부위에 접촉하는 것, 부위로부터 분리되는 것 및/또는 부위를 빠져나가는 것을 방지하는 장벽이 없는 경우에 일어날 수 있다. 그러나, 유체 접근은 접근이 절대적으로 방지되지 않는 한 확산이 지연, 감소 또는 변경되는 경우에도 존재하는 것으로 이해된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이중 가닥"은, 핵산 분자와 관련하여 사용될 때, 핵산 분자 내의 실질적으로 모든 뉴클레오타이드가 상보적 뉴클레오타이드에 수소 결합된 것을 의미한다. 부분 이중 가닥 핵산은 상보적 뉴클레오타이드에 수소 결합된 그의 뉴클레오타이드의 적어도 10%, 적어도 25%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%를 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "각각"은, 항목들의 집합체와 관련하여 사용될 때, 집합체 내의 개별 항목을 식별하도록 의도되지만, 문맥이 명백하게 다른 것을 지시하지 않는 한 반드시 집합체 내의 모든 항목을 지칭하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "배제된 부피"는 다른 이러한 분자를 배제하기 위해 특정 분자에 의해 점유된 공간의 부피를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "간극 영역"은 기판 또는 표면의 다른 영역을 분리시키는 기판 내 또는 표면 상의 구역을 지칭한다. 예를 들어, 간극 영역은 어레이의 하나의 특징부를 어레이의 또 다른 특징부로부터 분리할 수 있다. 서로 분리된 2개의 영역은 서로 접촉하지 않고 이산될 수 있다. 또 다른 예에서, 간극 영역은 특징부의 제1 부분을 특징부의 제2 부분으로부터 분리할 수 있다. 간극 영역에 의해 제공되는 분리는 부분 또는 완전 분리일 수 있다. 간극 영역은 전형적으로 표면 상에서 특징부의 표면 재료와 상이한 표면 재료를 가질 것이다. 예를 들어, 어레이의 특징부는 간극 영역에 존재하는 양 또는 농도를 초과하는 포획제의 양 또는 농도를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 포획제는 간극 영역에 존재하지 않을 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "중합효소"는 당업계에서의 그의 용도와 일치하는 것으로 의도되며, 예를 들어, 주형 가닥으로서 핵산을 사용하여 핵산 분자의 상보적 복제물을 생성하는 효소를 포함한다. 전형적으로, DNA 중합효소는 주형 가닥에 결합하고, 이어서 주형 가닥 아래로 이동하여 핵산의 성장 가닥의 3' 말단에서 뉴클레오타이드를 유리 히드록실기에 순차적으로 첨가한다. DNA 중합효소는 전형적으로 DNA 주형으로부터 상보적 DNA 분자를 합성하고, RNA 중합효소는 전형적으로 DNA 주형으로부터 RNA 분자를 합성한다(전사). 중합효소는 프라이머로 불리는 짧은 RNA 또는 DNA 가닥을 사용하여 가닥 성장을 시작할 수 있다. 본원에 상세히 기재된 바와 같이, 중합효소는 증폭 동안 사용되어 클론 클러스터를 생성할 수 있고, 서열분석 반응 동안 사용되어 핵산의 서열을 결정할 수 있으며, 상이한 중합효소가 이들 각각의 양태에서 사용될 수 있다. 일부 중합효소는 이들이 쇄에 염기를 첨가하는 부위의 상류 가닥을 치환할 수 있다. 이러한 중합효소는 가닥 치환이라고 하며, 이는 중합효소에 의해 판독되는 주형 가닥으로부터 상보적 가닥을 제거하는 활성을 가짐을 의미한다. 가닥 치환 활성을 갖는 예시적 중합효소는, 제한 없이, Bsu (바실루스 서브틸리스), Bst (바실루스 스테아로써모필루스) 중합효소, 엑소-클레노우 중합효소 또는 서열분석 등급 T7 엑소-중합효소의 큰 단편을 포함한다. 일부 중합효소는 그 앞에서 가닥을 분해하여, 이를 그 뒤의 성장하는 쇄로 효과적으로 치환한다(5' 엑소뉴클레아제 활성). 일부 중합효소는 그들 뒤의 가닥을 분해하는 활성을 갖는다(3' 엑소뉴클레아제 활성). 일부 유용한 중합효소는 돌연변이 또는 기타 방법에 의해 3' 및/또는 5' 엑소뉴클레아제 활성을 감소시키거나 제거하도록 변형된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산"은 당업계에서의 그의 용도와 일치하는 것으로 의도되며, 천연 발생 핵산 및 그의 기능적 유사체를 포함한다. 특히 유용한 기능적 유사체는 서열 특이적 방식으로 핵산에 혼성화할 수 있거나, 특정 뉴클레오타이드 서열의 복제를 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 천연 발생 핵산은 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유하는 골격을 갖는다. 유사체 구조는 당해 분야에 알려진 다양한 것들 중 임의의 것을 포함하는 대체 백본 연결을 가질 수 있다. 천연 발생 핵산은 일반적으로 (예를 들어 데옥시리보핵산(DNA)에서 발견된) 데옥시리보스 당 또는 (예를 들어 리보핵산(RNA)에서 발견된) 리보스 당을 갖는다. 핵산은 당업계에 알려진 이들 당 모이어티의 다양한 유사체들 중 임의의 것을 함유할 수 있다. 핵산은 천연 또는 비-천연 염기를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 천연 데옥시리보핵산은 아데닌, 티민, 시토신 또는 구아닌으로부터 선택된 하나 이상의 염기를 가질 수 있고, 리보핵산은 우라실, 아데닌, 시토신 또는 구아닌으로부터 선택된 하나 이상의 염기를 가질 수 있다. 핵산에 포함될 수 있는 유용한 비-천연 염기는 당업계에 공지되어 있다. 용어 "표적"은, 핵산과 관련하여 사용될 때, 본원에 제시된 방법 또는 조성물의 맥락에서 핵산에 대한 의미론적 식별자로서 의도되며, 달리 명시적으로 지시되는 것 이상으로 핵산의 구조 또는 기능을 반드시 제한하지 않는다. 각 말단에 범용 서열, 예를 들어 각 말단에 범용 어댑터를 갖는 표적 핵산은 변형 표적 핵산으로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "수송"은 유체를 통한 분자의 이동을 지칭한다. 상기 용어는 분자의 농도 구배를 따른 분자의 이동(예를 들어, 수동 확산)과 같은 수동 수송을 포함할 수 있다. 상기 용어는 또한 분자들이 그들의 농도 구배를 따라 또는 그들의 농도 구배에 대항하여 이동할 수 있는 능동 수송을 포함할 수 있다. 따라서, 수송은 하나 이상의 분자를 원하는 방향으로 또는 증폭 부위와 같은 원하는 위치로 이동시키기 위해 에너지를 적용하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "속도"는, 수송, 증폭, 포획 또는 다른 화학적 공정과 관련하여 사용될 때, 화학적 동력학 및 생화학적 동력학에서의 그의 의미와 일치하는 것으로 의도된다. 2개의 공정에 대한 속도는 최대 속도(예를 들어, 포화시), 사전정상 상태 속도(예를 들어, 평형 전), 운동 속도 상수, 또는 당업계에 알려진 다른 측정과 비교될 수 있다. 특정 구현예에서, 특정 공정에 대한 속도는 공정의 완료를 위한 총 시간에 대해 결정될 수 있다. 예를 들어, 증폭 속도는 증폭이 완료되는데 걸리는 시간에 대해 결정될 수 있다. 그러나, 특정 공정에 대한 속도는 공정의 완료를 위한 총 시간에 대해 결정될 필요는 없다.
용어 "및/또는"은 열거된 요소들 중 하나 또는 모두 또는 열거된 요소들 중의 임의의 2개 이상의 조합을 의미한다.
단어 "바람직한" 및 "바람직하게는"은 특정 환경 하에서 특정 이점을 제공할 수 있는 본 발명의 구현예를 지칭한다. 그러나, 동일한 또는 다른 환경 하에서 다른 구현예가 또한 바람직할 수 있다. 또한, 하나 이상의 바람직한 구현예의 인용은 다른 구현예가 유용하지 않음을 암시하지 않으며, 본 발명의 범주로부터 다른 구현예를 배제하도록 의도되지 않는다.
용어 "포함하다" 및 이의 변형은 이들 용어가 상세한 설명 및 청구범위에서 나타나는 경우 제한적인 의미를 갖지 않는다.
구현예들이 본원에서 "포함하다", "포함한다", 또는 "포함하는" 등의 언어로 기술되는 경우, "~로 이루어지는" 및/또는 "본질적으로 ~로 이루어지는"의 관점에서 기술된 달리 유사한 구현예들이 또한 제공된다는 것이 이해된다.
달리 명시되지 않는 한, "하나", "그", 및 "적어도 하나"는 호환적으로 사용되며, 하나 또는 하나 초과를 의미한다.
핵산의 엑소뉴클레아제-매개된 소화와 같은, 사건이 발생하는데 "적합한" 조건, 또는 "적합한" 조건은 이러한 사건이 일어나는 것을 방해하지 않는 조건이다. 따라서, 이들 조건은 사건을 허용, 향상, 촉진 및/또는 이 사건에 도움이 된다.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물, 물품, 또는 핵산의 문맥에서 "제공하는"은 조성물, 물품, 또는 핵산의 제조, 조성물, 물품, 또는 핵산의 구매, 또는 화합물, 조성물, 물품, 핵산의 수득을 의미한다.
또한 본원에서, 종점에 의한 수치 범위의 인용은 그 범위 내에 포함되는 모든 수를 포함한다 (예를 들어, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함함).
본 명세서 전체에 걸쳐 "일 구현예", "구현예", "특정 구현예들", 또는 "일부 구현예들" 등에 대한 참조는 구현예와 관련하여 설명된 특정 특징부, 구성, 조성 또는 특징이 본 개시내용의 적어도 하나의 구현예에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 곳에서의 이러한 어구의 출현은 반드시 본 개시내용의 동일한 구현예를 지칭하는 것은 아니다. 또한, 특정 특징부, 구성, 조성 또는 특징은 하나 이상의 구현예에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.
본원의 설명에서, 특정 구현예들은 명확성을 위해 별개로 설명될 수 있다. 특정 구현예의 특징부들이 또 다른 구현예의 특징부들과 양립할 수 없다는 것을 달리 명백하게 명시하지 않는 한, 특정 구현예들은 하나 이상의 구현예들과 관련하여 본원에 설명된 양립가능한 특징부들의 조합을 포함할 수 있다.
별개의 단계들을 포함하는 본원에 개시된 임의의 방법에 대해, 단계들은 임의의 실현가능한 순서로 수행될 수 있다. 또한, 적절하게, 2 이상의 단계들의 임의의 조합이 동시에 수행될 수 있다.
본 발명의 상기 요약은 본 발명의 각각의 개시된 구현예 또는 모든 이행을 설명하고자 하는 것은 아니다. 하기 설명은 예시적인 구현예를 더욱 구체적으로 예시한다. 본원 전반에 걸쳐 여러 곳에서, 다양한 조합으로 사용될 수 있는 실시예의 목록을 통해 지침이 제공된다. 각각의 경우에, 인용된 목록은 단지 대표적인 그룹으로서 기능하며, 배타적인 목록으로서 해석되지 않아야 한다.
예시적인 구현예의 상세한 설명
본원에서는 핵산 서열분석과 관련된 방법 및 조성물이 제시된다. 본 개시내용은 서열분석 반응을 위한 핵산을 제조하는 단계, 클론 클러스터를 생성하는 단계, 및 표면 상에 핵산의 어레이를 제작하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 방법은 복수의 증폭 부위를 포함하는 어레이를 제공하는 단계를 포함한다. 각각의 증폭 부위는 복수의 이중 가닥 앰플리콘을 포함한다. 예를 들어, 도 1a에서, 증폭 부위(10)는 복수의 이중 가닥 앰플리콘(11) 중 하나의 구성원을 갖는 것으로 도시되어 있다.
복수의 포획 핵산은 증폭 부위의 표면에 부착된다. 포획 핵산의 적어도 2개의 집단이 존재하고, 일부 구현예에서 3개 이상의 집단이 존재한다. 포획 핵산의 적어도 하나의 집단은 절단 부위를 포함한다. 일 구현예에서, 절단 부위는 우라실 잔기를 포함한다. 각각의 이중 가닥 앰플리콘 분자는 브릿징된 구조이되, 이들은 그의 5' 말단에서 포획 핵산에 부착되고, 그의 3' 말단에서 어레이에 부착되지 않는다. 절단 부위는 각각의 이중 가닥 분자의 이중 가닥 영역에 위치한다. 예를 들어, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 포획 핵산의 2개 집단이 도시되어 있다. 한 집단은 각각의 앰플리콘의 한쪽 말단에 부착된 13 또는 증폭 부위(10)의 표면에 결합된 13'이지만 앰플리콘(11)에 부착되지 않은 것으로 나타난다. 포획 핵산의 제2 집단은 또한 각각의 앰플리콘의 다른 말단에 부착된 14 또는 증폭 부위(10)의 표면에 결합된 14'이지만 앰플리콘(11)에 부착되지 않은 것으로 나타난다. 또한, 도 1a에는 절단 부위(포획 핵산(13) 상의 X로 표시됨)가 도시되어 있다.
상기 방법은 어레이의 증폭 부위를 절단 부위에서 하나의 DNA 가닥을 절단하는 효소, 및 3'에서 5' 단일 가닥 DNA 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 엑소뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 엑소뉴클레아제는 유리 3'-OH 말단을 포함하는 단일 가닥 포획 핵산을 분해하도록 작용한다. 예를 들어, 도 1b에 도시된 바와 같이, 앰플리콘(11) 내의 절단 부위(X)는 절단되어 단축된 포획 핵산(13")을 남긴다. 부착되지 않은 포획 핵산(13', 14')은 증폭 부위(10)에 더 이상 존재하지 않는다.
일 구현예에서, 부착된 가닥의 서열은 가닥 치환 활성을 갖는 DNA 중합효소를 사용함으로써 결정될 수 있으며, 여기서 단축 포획 핵산(도 1b의 13")의 3' 말단은 DNA 합성의 개시를 위한 프라이머로서 사용된다. 일부 구현예에서, 절단 부위에서 하나의 DNA 가닥을 절단하는 효소는 단축 포획 핵산의 3' 말단을 변형시켜 3'-포스페이트에서 종결시킬 것이다. 3'-포스페이트는 서열분석 반응을 시작하기 전에 포스파타제에 의해 제거될 수 있다.
부착된 가닥을 서열분석하는 대신에, 방법은 또한 절단된 이중 가닥 앰플리콘을 변성 조건에 적용하여 어레이에 부착되지 않은 절단된 가닥의 부분(도 1b의 15')을 제거하는 것을 포함할 수 있다. 이는 고정된 단일 가닥 핵산을 초래한다. 예를 들어, 도 1c에 도시된 바와 같이, 부착되지 않은 DNA 가닥은 부착된 가닥(16)에 더 이상 혼성화되지 않고 손실되었다.
일 구현예에서, 고정된 단일 가닥 핵산은 단축된 포획 핵산(13")에 재어닐링될 수 있다. 예를 들어, 도 1d에 도시된 바와 같이, 부착된 DNA 스탠드(16)는 단축된 포획 핵산(13")에 재어닐링된다.
어레이
본 명세서에 제시된 방법에 사용되는 증폭 부위의 어레이는 하나 이상의 기판으로서 존재할 수 있다. 어레이에 사용될 수 있는 예시적인 유형의 기판 재료는 유리, 변형 유리, 기능화 유리, 무기 유리, 미소구체(예를 들어, 불활성 및/또는 자기 입자), 플라스틱, 다당류, 나일론, 니트로셀룰로오스, 세라믹, 수지, 실리카, 실리카계 재료, 탄소, 금속, 광섬유 또는 광섬유 다발, 중합체 및 멀티웰(예를 들면, 미세적정) 플레이트를 포함한다. 예시적인 플라스틱은 아크릴, 폴리스티렌, 스티렌과 다른 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄 및 TeflonTM을 포함한다. 예시적인 실리카계 물질은 규소 및 다양한 형태의 변형된 규소를 포함한다.
특정 실시예에서, 기판은 웰, 튜브, 채널, 큐벳, 페트리 플레이트, 병 등과 같은 용기의 내부 또는 일부일 수 있다. 특히 유용한 용기는, 예를 들어 US 특허 번호 8,241,573 또는 문헌 [Bentley 등, Nature 456:53-59 (2008)]에 기재된 바와 같은 유동-셀이다. 예시적인 유동-셀은 Illumina, Inc.( San Diego, Calif.)로부터 상업적으로 입수가능한 것들이다. 다른 특히 유용한 용기는 다중웰 플레이트 또는 미세적정 플레이트 내의 웰이다.
일부 구현예에서, 어레이의 증폭 부위는 표면 상의 특징부로서 구성될 수 있다. 특징부는 임의의 다양한 원하는 포맷으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 부위는 웰(well), 피트(pit), 채널, 리지(ridge), 융기된 영역, 페그(peg), 포스트(post) 등일 수 있다. 일 구현예에서, 증폭 부위는 비드를 함유할 수 있다. 그러나, 특정 구현예에서, 부위는 비드 또는 입자를 함유할 필요는 없다. 예시적인 부위는 454 LifeSciences(Roche의 자회사, Basel Switzerland) 또는 Ion Torrent(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA의 자회사)에 의해 판매되는 상업적 서열분석 플랫폼에 사용되는 기판에 존재하는 웰을 포함한다. 웰을 갖는 다른 기판들은, 예를 들어, 에칭된 광섬유들 및 미국 특허 번호 6,266,459; 미국 특허 번호 6,355,431; 미국 특허 번호 6,770,441; 미국 특허 번호 6,859,570; 미국 특허 번호 6,210,891; 미국 특허 번호 6,258,568; 미국 특허 번호 6,274,320; 미국 특허 번호 8,262,900; 미국 특허 번호 7,948,015; 미국 특허 공개 번호 2010/0137143; 미국 특허 번호 8,349,167, 또는 PCT 공개 번호 WO 00/63437에 기재된 다른 기판들을 포함한다. 몇몇 경우에, 기판은 웰에서 비드를 사용하는 용도에 대한 이들 참고문헌에 예시되어 있다. 웰-함유 기판은 본 발명의 방법 또는 조성물에서 비드와 함께 또는 비드 없이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 기판의 웰은 미국 특허 번호 9,512,422에서 제시된 바와 같은 겔 물질(비드를 갖거나 갖지 않음)을 포함할 수 있다.
어레이의 증폭 부위는 유리, 플라스틱 또는 본 명세서에 예시된 다른 물질과 같은 비금속 표면 상의 금속 특징부일 수 있다. 금속층은 습식 플라즈마 에칭, 건식 플라즈마 에칭, 원자층 증착, 이온 빔 에칭, 화학적 기상 증착, 진공 스퍼터링 등과 같은 당업계에 알려진 방법을 사용하여 표면 상에 증착될 수 있다. 예를 들어, FlexAL®, OpAL®, Ionfab 300Plus®, 또는 Optofab 3000® systems (Oxford Instruments, UK)을 포함하는 임의의 다양한 상업용 기구가 적절하게 사용될 수 있다. 금속층은 또한 문헌 [Thornton, Ann. Rev. Mater. Sci. 7:239-60 (1977)]에 제시된 바와 같이 e-빔 증발 또는 스퍼터링에 의해 증착될 수 있다. 본 명세서에 예시된 것들과 같은 금속층 증착 기술들은 포토리소그래피 기술과 결합되어 표면 상에 금속 영역 또는 패치들을 생성할 수 있다. 금속 층 증착 기술들 및 포토리소그래피 기술들을 결합하기 위한 예시적인 방법들은 미국 특허 번호 8,778,848 및 미국 특허 번호 8,895,249에 제공된다.
특징부의 어레이는 스폿들 또는 패치들의 그리드로서 나타날 수 있다. 특징부는 반복 패턴 또는 불규칙한 비반복 패턴으로 위치될 수 있다. 특히 유용한 패턴은 육각형 패턴, 직선 패턴, 격자 패턴, 반사 대칭을 갖는 패턴, 회전 대칭을 가지는 패턴 등이다. 비대칭 패턴이 또한 유용할 수 있다. 피치는 서로 다른 쌍의 가장 가까운 이웃 특징부 사이에서 동일할 수 있거나, 피치는 상이한 쌍의 가장 인접한 특징부 사이에서 달라질 수 있다. 특정 구현예들에서, 어레이의 특징부는 각각 약 100 nm2, 250 nm2, 500 nm2, 1 μm2, 2.5 μm2, 5 μm2, 10 μm2, 100 μm2, 또는 500 μm2 초과인 큰 면적을 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 어레이의 특징부는 각각 약 1 mm2, 500 μm2, 100 μm2, 25 μm2, 10 μm2, 5 μm2, 1 μm2, 500 nm2, 또는 100 nm2 미만인 작은 면적을 가질 수 있다. 실제로, 영역은 위에서 예시된 것들로부터 선택된 상한과 하한 사이의 범위에 있는 크기를 가질 수 있다.
표면 상에 특징부의 어레이를 포함하는 구현예에 대해, 특징부는 별개의 것일 수 있고, 간극 영역에 의해 분리된다. 특징부의 크기 및/또는 영역 사이의 간격은 어레이가 고밀도, 중밀도 또는 저밀도일 수 있도록 달라질 수 있다. 고밀도 어레이는 약 15 μm 미만으로 분리된 영역을 갖는 것을 특징으로 한다. 중밀도 어레이는 약 15 내지 30 μm로 분리된 영역을 갖는 반면, 저밀도 어레이는 30μm 초과로 분리된 영역을 갖는다. 본 개시에서 유용한 어레이는 100 μm, 50 μm, 10 μm, 5 μm, 1 μm, 또는 0.5 μm 미만으로 분리된 영역을 가질 수 있다
특정 구현예에서, 어레이는 비드 또는 다른 입자의 집합을 포함할 수 있다. 입자는 용액 중에 현탁될 수 있거나, 또는 기판의 표면 상에 위치될 수 있다. 용액 중의 비드 어레이의 예는 Luminex (Austin, TX, USA)에 의해 상업화된 것들이다. 표면 상에 위치한 비드를 갖는 어레이의 예는, 비드가 웰들, 예컨대 BeadChip 어레이 (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) 또는 454 LifeSciences(Roche의 자회사, Basel, Switzerland) 또는 Ion Torrent (Life Technologies의 자회사, Carlsbad, CA USA)로부터 서열분석 플랫폼에서 사용된 기판에 위치한 것을 포함한다. 표면 상에 위치된 비드를 갖는 다른 어레이는 미국 특허 번호 6,266,459; 미국 특허 번호 6,355,431; 미국 특허 번호 6,770,441; 미국 특허 번호 6,859,570; 미국 특허 번호 6,210,891; 미국 특허 번호 6,258,568; 미국 특허 번호 6,274,320; 미국 특허 공개 번호 2009/0026082 A1; 미국 특허 공개 번호 2009/0127589 A1; 미국 특허 공개 번호 2010/0137143 A1; 미국 특허 공개 번호 2010/0282617 A1; 또는 PCT 공개 번호 WO 00/63437에 기재되어 있다. 상기 참조문헌 중 몇몇은 어레이 기판 내에 또는 상에 비드를 로딩하기 전에 표적 핵산을 비드에 부착시키는 방법을 기재한다. 그러나, 비드는 증폭 프라이머를 포함하도록 제조될 수 있고, 이어서 비드는 어레이를 로딩하기 위해 사용될 수 있으며, 이에 의해 본 명세서에 제시된 방법에 사용하기 위한 증폭 부위를 형성한다는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 앞서 제시된 바와 같이, 기판은 비드 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 증폭 프라이머는 웰 또는 웰 내의 겔 물질에 직접 부착될 수 있다. 따라서, 참조문헌은 본 명세서에 제시된 방법 및 조성물에 사용하기 위해 변형될 수 있는 물질, 조성물 또는 장치의 예시이다.
어레이의 증폭 부위는 표적 핵산에 결합할 수 있는 복수의 포획제를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 포획제는 포획 핵산을 포함한다. 포획 핵산의 뉴클레오타이드 서열은 표적 핵산의 범용 서열에 대해 상보적이다. 일부 구현예에서, 포획 핵산은 또한 표적 핵산의 증폭을 위한 프라이머로서 기능할 수 있다. 일부 구현예에서, 포획 핵산의 한 집단은 P5 프라이머 또는 그의 보체를 포함한다. 일부 구현예에서, 증폭 부위는 또한 복수의 제2 포획 핵산을 포함하고, 이 제2 포획 핵산은 P7 프라이머 또는 그의 보체를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 포획 핵산은 절단 부위를 포함할 수 있다. 포획 핵산 내의 절단 부위는 본 명세서에서 보다 상세히 설명된다.
특정 구현예에서, 포획제, 예컨대 포획 핵산은 증폭 부위에 부착될 수 있다. 예를 들어, 포획제는 어레이의 특징부의 표면에 부착될 수 있다. 부착은 비드, 입자 또는 겔과 같은 중간 구조를 통해 이루어질 수 있다. 겔을 통한 어레이에의 포획 핵산의 부착의 예는 미국 특허 번호 8,895,249에 개시되어 있으며, Illumina Inc. (San Diego, CA, USA)로부터 상업적으로 입수가능하거나 WO 2008/093098에 기술되어 있는 플로우 셀(flow cell)에 의해 추가로 예시된다. 본 명세서에 기재된 방법 및 장치에 사용될 수 있는 예시적인 겔은 콜로이드성 구조를 갖는 것들, 예컨대 아가로스; 중합체 메쉬 구조, 예컨대 젤라틴; 또는 가교결합된 중합체 구조, 예컨대 폴리아크릴아미드, SFA (예를 들어, US 특허 출원 공개 번호 2011/0059865 A1 참조) 또는 PAZAM (예를 들어, 미국 가특허 출원 시리즈 번호 61/753,833 및 미국 특허 번호 9,012,022 참조)을 비제한적으로 포함한다. 비드를 통한 부착은 상기 설명 및 본 명세서에서 이전에 설명된 인용된 참조문헌에 예시된 바와 같이 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 어레이 기판의 표면 상의 특징부는 인접하지 않고, 표면의 간극 영역에 의해 분리된다. 어레이의 특징부에 비해 포획제의 양 또는 농도가 실질적으로 더 낮은 간극 영역이 유리하다. 포획제가 없는 간극 영역이 특히 유리하다. 예를 들어, 간극 영역에서의 포획 모이어티의 상대적으로 적은 양 또는 부재는 표적 핵산, 및 후속적으로 생성된 클러스터의 원하는 특징부에 대한 국재화를 선호한다. 특정 구현예에서, 특징부는 표면 내의 오목한 특징부(예를 들어, 웰)일 수 있으며, 특징부는 겔 재료를 함유할 수 있다. 겔-함유 특징부는, 겔이 실질적으로 부재하거나, 존재하는 경우 겔이 핵산의 국재화를 실질적으로 지지할 수 없는 표면 상의 간극 영역에 의해 서로 분리될 수 있다. 웰과 같은 겔 함유 특징부를 갖는 기판의 제조 및 사용 방법 및 조성물은 미국 가출원 번호 61/769,289에 기재되어 있다.
표적 핵산
본 명세서에 기재된 방법에 사용되는 어레이는 이중 가닥 변형 표적 핵산을 포함한다. 용어 "표적 핵산", "표적 단편", "표적 핵산 단편, "표적 분자" 및 "표적 핵산 분자"는 그의 뉴클레오타이드 서열의 확인이 요망되는 핵산 분자를 지칭하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 표적 핵산은 본질적으로 알려진 또는 알려지지 않은 서열의 임의의 핵산일 수 있다. 예를 들어, 이는 게놈 DNA 또는 cDNA의 단편일 수 있다. 서열분석은 표적 분자의 전체 또는 일부의 서열을 결정할 수 있다. 표적은 무작위로 단편화된 일차 핵산 샘플로부터 유래될 수 있다. 일 구현예에서, 표적은 각각의 표적 단편의 말단에 범용 증폭 서열, 예를 들어, 범용 어댑터에 존재하는 서열의 배치에 의해 증폭에 적합한 주형으로 가공될 수 있다. 각 말단에 범용 어댑터를 갖는 표적 핵산은 "변형 표적 핵산"으로 지칭될 수 있다. 범용 어댑터는 본 명세서에 상술된다.
일차 핵산 샘플은 샘플로부터 이중 가닥 DNA (dsDNA) 형태 (예를 들어, 게놈 DNA 단편, PCR 및 증폭 생성물 등)로 기원할 수 있거나, 또는 샘플로부터 단일 가닥 형태로, DNA 또는 RNA로서 기원하고, dsDNA 형태로 전환될 수 있었다. 예로서, mRNA 분자는 당업계에 잘 알려진 표준 기술을 사용하여 본 명세서에 기재된 방법에 사용하기에 적합한 이중 가닥 cDNA로 복제될 수 있다. 일차 핵산 샘플로부터의 폴리뉴클레오타이드 분자의 정확한 서열은 일반적으로 본 개시내용에 중요하지 않으며, 알려지거나 알려지지 않을 수 있다.
일 구현예에서, 일차 핵산 샘플로부터의 일차 폴리뉴클레오타이드 분자는 DNA 분자이다. 보다 구체적으로, 일차 폴리뉴클레오타이드 분자는 유기체의 전체 유전적 보체를 나타내고, 인트론 및 엑손 서열, 뿐만 아니라 비-코딩 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서 서열을 모두 포함하는 게놈 DNA 분자이다. 일 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 게놈 DNA의 특정 하위세트, 예를 들어 특정 염색체가 사용될 수 있다. 더욱 더 구체적으로, 일차 폴리뉴클레오타이드 분자의 서열은 알려져 있지 않다. 더욱 더 구체적으로, 일차 폴리뉴클레오타이드 분자는 인간 게놈 DNA 분자이다. DNA 표적 단편은 임의의 무작위 단편화 공정 전 또는 후에, 및 범용 어댑터 서열의 결찰 전 또는 이후에 화학적으로 또는 효소적으로 처리될 수 있다
핵산 샘플은 게놈 DNA(gDNA)와 같은 고분자량 물질을 포함할 수 있다. 샘플은 포르말린-고정된 파라핀-포매 또는 보관된 DNA 샘플로부터 수득된 핵산 분자와 같은 저분자량 물질을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 저분자량 물질은 효소적으로 또는 기계적으로 단편화된 DNA를 포함한다. 샘플은 무세포 순환 DNA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 생검, 종양, 스크래핑, 면봉, 혈액, 점액, 소변, 혈장, 정액, 모발, 레이저 포획 미세-절개, 외과적 절제, 및 다른 임상 또는 실험실에서 수득된 샘플로부터 수득된 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 역학, 농업, 법의학 또는 병원성 샘플일 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 인간 또는 포유동물 공급원과 같은 동물로부터 수득된 핵산 분자를 포함할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 샘플은 비-포유동물 공급원, 예컨대 식물, 박테리아, 바이러스, 또는 진균으로부터 수득된 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 분자의 공급원은 보관된 또는 멸종 샘플 또는 종일 수 있다.
또한, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물은 법의학적 샘플로부터의 분해 및/또는 단편화된 게놈 DNA와 같은 저품질 핵산 분자를 갖는 핵산 샘플을 증폭하는데 유용할 수 있다. 일 구현예에서, 법의학적 샘플들은 범죄 현장으로부터, 실종자의 DNA 데이터베이스로부터, 법의학적 조사와 연관된 실험실로부터, 또는 법 집행 기관들, 하나 이상의 군사 서비스들, 또는 임의의 그러한 인원들에 의해 수득된 법의학적 샘플들로부터 수득된 핵산들을 포함할 수 있다. 핵산 샘플은 정제된 샘플, 또는 예를 들어 타액, 혈액 또는 다른 체액으로 함침될 수 있는 협측 면봉, 종이, 직물 또는 다른 기질로부터 유래된, 용해물을 함유하는 미정제 DNA일 수 있다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 핵산 샘플은 소량의 또는 단편화된 DNA 부분, 예컨대 게놈 DNA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 혈액, 가래, 혈장, 정액, 소변 및 혈청을 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 체액에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 모발, 피부, 조직 샘플, 부검, 또는 피해자의 잔류액으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 표적 서열을 포함하는 핵산은 사망한 동물 또는 인간으로부터 수득될 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 비-인간 DNA, 예컨대 미생물, 식물 또는 곤충학적 DNA로부터 수득된 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 서열 또는 증폭된 표적 서열은 인간 식별의 목적에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 설명된 방법은 법의학적 샘플의 특성들을 식별하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 하나 이상의 표적 특이적 프라이머 또는 알려진 프라이머 설계 기준을 사용하여 설계된 하나 이상의 표적 특이적 프라이머를 사용하는 인간 확인 방법에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 적어도 하나의 표적 서열을 함유하는 법의학적 또는 인간 확인 샘플은 알려진 프라이머 기준을 사용하여 임의의 하나 이상의 표적-특이적 프라이머를 사용하여 증폭될 수 있다.
생물학적 샘플의 공급원의 추가의 비제한적인 예는 전체 유기체 뿐만 아니라 환자로부터 수득된 샘플을 포함할 수 있다. 생물학적 샘플은 임의의 생물학적 유체 또는 조직으로부터 수득될 수 있고, 액체 유체 및 조직, 고형 조직, 및 건조, 냉동 및 고정 형태와 같은 보존된 형태를 포함하는 다양한 형태일 수 있다. 샘플은 임의의 생물학적 조직, 세포 또는 유체일 수 있다. 이러한 샘플은 객담, 혈액, 혈청, 혈장, 혈액 세포 (예를 들어, 백혈구), 복수액, 소변, 타액, 눈물, 객 담, 질액 (배출), 의료 절차 동안 수득된 세정 (예를 들면, 생검, 내시경 검사 또는 수술 동안 수득된 골반 또는 다른 세정), 조직, 유두 분비액, 코어 또는 미세 바늘 생검 샘플, 세포 함유 체액, 유리 부유 핵산, 복막액, 및 흉수, 또는 이들의 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 생물학적 샘플은 또한 조직학적 목적을 위해 취해진 냉동 또는 고정 섹션과 같은 조직의 섹션 또는 미세-분리된 세포 또는 이의 세포외 부분을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플, 예컨대 전혈 샘플일 수 있다. 또 다른 예에서, 샘플은 가공되지 않은 건조된 혈액 점 샘플이다. 또 다른 예에서, 샘플은 포르말린-고정 파라핀-포매 샘플이다. 또 다른 예에서, 샘플은 타액 샘플이다. 또 다른 예에서, 샘플은 건조된 타액 점 샘플이다.
표적 핵산이 유래될 수 있는 예시적인 생물학적 샘플은 예를 들어 진핵생물, 예를 들어 포유동물, 예컨대 설치류, 마우스, 랫트, 토끼, 기니아 피그, 유제류, 말, 양, 돼지, 염소, 소, 고양이, 개, 영장류, 인간 또는 비-인간 영장류; 식물, 예컨대 아라비돕시스 탈리아나, 옥수수, 수수, 귀리, 밀, 쌀, 카놀라, 또는 대두; 조류, 예컨대 클라마이도모나스 레인하르티이; 선충 예컨대 카에노르하브디티스 엘레간스; 곤충, 예컨대 드로소필라 멜라노가스테르, 모기, 초파리, 꿀벌 또는 거미; 어류, 예컨대 제브라피쉬; 파충류; 양서류, 예컨대 개구리 또는 제노푸스 라에비스; 딕티오스텔리움 디스코이데움; 진균, 예컨대 주폐포자충, 타키푸가 루브리페스, 효모, 예컨대 사카라모이세스 세레비지아에 또는 쉬조사카로마이세스 폼베; 또는 플라스모디엄 팔시파럼으로부터의 샘플을 포함한다. 표적 핵산은 또한 원핵생물, 예컨대 박테리아, 에스케리치아 콜라이, 스타필로코쿠스 또는 마이코플라스마 뉴모니아에; 아카에온; 바이러스 예컨대 간염 C 바이러스 또는 인간 면역결핍 바이러스; 또는 바이로이드로부터 유래될 수 있다. 표적 핵산은 유기체의 균질한 배양물 또는 집단으로부터, 또는 대안적으로 예를 들어 공동체 또는 생태계에서 여러 상이한 유기체의 수집물로부터 유래될 수 있다.
무작위 단편화는 효소적, 화학적 또는 기계적 방법에 의해 비-정렬된 방식으로 일차 핵산 샘플로부터 폴리뉴클레오타이드 분자를 단편화하는 것을 지칭한다. 이러한 단편화 방법은 당업계에 알려져 있고, 표준 방법을 사용한다 (Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, third edition). 일 구현예에서, 단편화는 종종 태그멘테이션(tagmentation)으로 지칭되는 프로세스를 사용하여 달성될 수 있다. 태그멘테이션은 트랜스포솜 복합체를 사용하고, 단일 단계 단편화 및 결찰로 조합하여 범용 어댑터를 첨가한다 (Gunderson 등, WO 2016/130704). 명확성을 위해, 이러한 더 작은 단편의 특이적 PCR 증폭을 통해 더 큰 조각의 핵산의 더 작은 단편을 생성하는 것은 더 큰 조각의 핵산 서열이 온전하게 유지되기 때문에(즉, PCR 증폭에 의해 단편화되지 않기 때문에) 더 큰 조각의 핵산을 단편화하는 것과 동등하지 않다. 더욱이, 무작위 단편화는 브레이크(break)를 포함하고/하거나 둘러싸는 뉴클레오타이드의 서열 동일성 또는 위치에 관계없이 단편을 생성하도록 설계된다. 보다 특히, 무작위 단편화는 약 50개의 염기쌍 내지 약 1500개의 염기쌍 길이, 보다 더 특히 50 내지 700개의 염기쌍, 보다 더욱 특히 50 내지 400개의 염기쌍 길이의 단편을 생성하기 위한 분무 또는 초음파처리와 같은 기계적 수단에 의한 것이다. 가장 특히, 상기 방법은 50 내지 150개의 염기쌍 길이의 더 작은 단편을 생성하는데 사용된다.
기계적 수단 (예를 들어, 분무화, 초음파처리, 및 하이드로전단)에 의한 폴리뉴클레오타이드 분자의 단편화는 뭉툭한 말단 및 3'- 및 5'-돌출 말단의 불균질 혼합물을 갖는 단편을 생성한다. 따라서, 당업계에 알려진 방법 또는 키트(예컨대, 루시겐 DNA 종결자 말단 복구 키트)를 사용하여 단편 말단을 복구하여, 예를 들어 클로닝 벡터의 뭉툭한 부위로의 삽입에 최적인 말단을 생성하는 것이 바람직하다. 특정 구현예에서, 핵산 집단의 단편 말단은 뭉툭한 말단이다. 보다 구체적으로, 단편 말단은 뭉툭한 말단이고 인산화된다. 포스페이트 모이어티는, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하는 효소 처리를 통해 도입될 수 있다.
표적 핵산의 집단은 본 명세서에 기재된 방법 또는 조성물의 특정 적용에 요구되거나 적절한 평균 가닥 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 평균 가닥 길이는 약 100,000개의 뉴클레오타이드, 50,000개의 뉴클레오타이드, 10,000개의 뉴클레오타이드, 5,000개의 뉴클레오타이드, 1,000개의 뉴클레오타이드, 500개의 뉴클레오타이드는 100개의 뉴클레오타이드 또는 50개의 뉴클레오타이드 미만일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 평균 가닥 길이는 약 10개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드, 500개의 뉴클레오타이드는 1,000개의 뉴클레오타이드, 5,000개의 뉴클레오타이드, 10,000개의 뉴클레오타이드, 50,000개의 뉴클레오타이드 또는 100,000개의 뉴클레오타이드 초과일 수 있다. 표적 핵산의 집단에 대한 평균 가닥 길이는 본 명세서에 기재된 최대값과 최소값 사이의 범위일 수 있다. 증폭 부위에서 생성된 (또는 달리 본원에서 제조되거나 사용된) 앰플리콘은 상기 예시된 것으로부터 선택된 상한과 하한 사이의 범위에 있는 평균 가닥 길이를 가질 수 있음이 이해될 것이다.
일부 경우에, 표적 핵산의 집단은 조건 하에 생성되거나, 그렇지 않으면 그 구성원에 대해 최대 길이를 갖도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법의 하나 이상의 단계에서 사용되거나 특정 조성물에 존재하는 구성원에 대한 최대 길이는 100,000 개 미만의 뉴클레오타이드, 50,000 개 미만의 뉴클레오타이드, 10,000 개 미만의 뉴클레오타이드, 5,000 개 미만의 뉴클레오타이드, 1,000 개 미만의 뉴클레오타이드, 500 개 미만의 뉴클레오타이드, 100 개 미만의 뉴클레오타이드, 또는 50개 미만의 뉴클레오타이드일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 표적 핵산의 집단은 조건 하에 생성되거나, 그렇지 않으면 그 구성원에 대해 최소 길이를 갖도록 구성될 수도 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법의 하나 이상의 단계에서 사용되거나 특정 조성물에 존재하는 구성원에 대한 최소 길이는 10개 초과의 뉴클레오타이드, 50개 초과의 뉴클레오타이드, 100개 초과의 뉴클레오타이드, 500개 초과의 뉴클레오타이드, 1,000개 초과의 뉴클레오타이드, 5,000개 초과의 뉴클레오타이드, 10,000개 미만의 뉴클레오타이드, 50,000개 초과의 뉴클레오타이드, 또는 100,000개 초과의 뉴클레오타이드일 수 있다. 집단에서 표적 핵산에 대한 최대 및 최소 가닥 길이는 상기 기재된 최대 및 최소값 사이의 범위일 수 있다. 증폭 부위에서 생성된 (또는 달리 본원에서 제조되거나 사용된) 앰플리콘은 상기 예시된 상한과 하한 사이의 범위에서 최대 및/또는 최소 가닥 길이를 가질 수 있음이 이해될 것이다.
특정 구현예에서, 표적 단편 서열은, 예를 들어, DNA 분자, 예를 들면, PCR 생성물의 3' 말단에 단일 데옥시뉴클레오타이드, 예를 들어 데옥시아데노신(A)을 부가하는 비-주형-의존성 말단 전이효소 활성을 갖는 Taq 중합효소 또는 클레노우 엑소(Klenow exo) 마이너스 중합효소와 같은 특정 유형의 DNA 중합효소의 활성에 의해 단일 오버행 뉴클레오타이드로 제조된다. 이러한 효소는 단일 뉴클레오타이드 'A'를 이중 가닥 표적 단편의 각 가닥의 뭉툭한 말단 3' 말단에 첨가하는데 사용될 수 있다. 따라서, 'A'는 Taq 또는 클레노우 엑소 마이너스 중합효소와의 반응에 의해 이중 가닥 표적 단편의 각각의 말단 복구된 가닥의 3' 말단에 첨가될 수 있는 반면, 범용 어댑터 폴리뉴클레오타이드 작제물은 범용 어댑터의 이중 가닥 핵산의 각각의 영역의 3' 말단에 존재하는 상용성 'T' 오버행을 갖는 T-구조일 수 있다. 이러한 말단 변형은 또한 각 말단에서 범용 어댑터를 갖는 표적 핵산의 형성을 향한 편향이 존재하도록 벡터 및 표적 모두의 자가-결찰을 방지한다.
일부 경우에, 이러한 공급원으로부터 유래된 표적 핵산은 본 명세서의 방법 또는 조성물에 사용하기 전에 증폭될 수 있다. 중합효소 연쇄 반응(PCR), 회전환 증폭(RCA), 다중 변위 증폭(MDA) 또는 랜덤 프라임 증폭(RPA)을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 다양한 알려진 증폭 기술이 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법 또는 조성물에 사용하기 전의 표적 핵산의 증폭은 선택적임이 이해될 것이다. 이와 같이, 표적 핵산은 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물의 일부 구현예에서 사용하기 전에 증폭되지 않을 것이다. 표적 핵산은 임의로 합성 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 합성 핵산은 천연 DNA 또는 RNA 조성물을 가질 수 있거나 또는 이의 유사체일 수 있다.
범용 어댑터
본 명세서에 기재된 방법 또는 조성물에 사용되는 표적 핵산은 각 말단에 부착된 범용 어댑터를 포함한다. 각 말단에 범용 어댑터를 갖는 표적 핵산은 "변형 표적 핵산"으로 지칭될 수 있다. 본 명세서에 기재된 방법에서 사용되는 표적 핵산의 각 말단에 범용 어댑터를 부착시키는 방법은 통상의 기술자에게 알려져 있다. 부착은 결찰을 사용하는 표준 라이브러리 제조 기술을 통해 (미국 특허 공개 번호 2018/0305753), 또는. 전위효소 복합체를 사용하는 태그멘테이션을 통해 (Gunderson 등, WO 2016/130704) 이루어질 수 있다.
일 구현예에서, 샘플, 예를 들어, 단편화된 샘플로부터의 이중 가닥 표적 핵산은 먼저 동일한 범용 어댑터 분자 ("미스매치 어댑터", 이의 일반적인 특징은 하기에 정의되고, 문헌[Gormley 등, 미국 특허 7,741,463] 및 문헌 [Bignell 등, 미국 특허 번호 8,053,192]에 추가로 기재됨)를 이중 가닥 표적 핵산의 5' 및 3' 말단에 결찰시킴으로써 처리된다. 일 구현예에서, 범용 어댑터는 후속 서열분석을 위해 표적 핵산을 어레이 상에 고정시키는데 필요한 범용 포획 결합 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, PCR 단계는 고정화 및 서열분석 전에 표적 핵산의 각 말단에 존재하는 범용 어댑터를 추가로 변형시키는데 사용된다. 예를 들어, 초기 프라이머 연장 반응은 각각의 개별 표적 핵산의 두 가닥에 대해 상보적인 연장 생성물이 형성되고 범용 포획 결합 서열을 첨가하는 범용 프라이머 결합 부위를 사용하여 수행된다. 생성된 프라이머 연장 생성물, 및 임의로 이의 증폭된 복제물은 고정되고 이어서 서열분석될 수 있는 변형 표적 핵산의 라이브러리를 집합적으로 제공한다. 용어 "라이브러리"는 그의 3' 및 5' 말단에 알려진 공통 서열을 함유하는 표적 핵산의 수집을 지칭하고, 또한 3' 및 5' 변형된 라이브러리로서 지칭될 수 있다.
본 개시내용의 방법에 사용되는 범용 어댑터는 "미스매치" 어댑터로 지칭되는데, 그 이유는 본 명세서에서 상세히 설명되는 바와 같이, 어댑터가 서열 미스매치 영역을 포함하기 때문이며, 즉, 어댑터는 완전히 상보적인 폴리뉴클레오타이드 가닥을 어닐링함으로써 형성되지 않기 때문이다.
본 명세서에 사용하기 위한 미스매치 어댑터는 2개의 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드 가닥을 어닐링하여 2개의 가닥이 어닐링될 때, 이중 가닥 핵산의 영역으로도 언급되는 적어도 하나의 이중 가닥 영역, 및 단일 가닥 비-상보성 핵산 가닥의 영역으로도 언급되는 적어도 하나의 매칭되지 않은 단일 가닥 영역을 제공함으로써 형성된다.
범용 어댑터의 이중 가닥 영역은 2개의 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오타이드 가닥을 어닐링함으로써 형성된, 전형적으로 5개 이상의 연속적인 염기 쌍을 포함하는 짧은 이중 가닥 영역이다. 이 용어는, 2개의 가닥이 어닐링되는 핵산의 이중 가닥 영역을 지칭하고, 임의의 특정 구조적 형태를 암시하지 않는다.
이중 가닥 영역이 기능의 손실 없이 가능한 한 짧은 것이 일반적으로 유리하다. 이와 관련하여, "기능"은 효소-촉매된 핵산 결찰 반응을 위한 표준 반응 조건 하에 안정한 이중체를 형성하는 이중가닥 영역의 능력을 지칭하며, 이는 통상의 기술자에게 잘 알려져 있을 것이며 (예를 들어, 효소에 적합한 결찰 완충액에서 4℃ 내지 25℃ 범위의 온도에서 인큐베이션), 따라서 범용 어댑터를 형성하는 2개의 가닥은 표적 분자에 대한 범용 어댑터의 결찰 동안 부분적으로 어닐링된 채로 유지될 것이다. 이중 가닥 영역이 프라이머 연장 또는 PCR 반응의 어닐링 단계에서 전형적으로 사용되는 조건 하에 반드시 안정할 필요는 없다.
범용 어댑터의 이중 가닥 영역은 전형적으로 결찰에 사용되는 모든 범용 어댑터에서 동일하다. 범용 어댑터가 각각의 표적 분자의 양 말단에 결찰되기 때문에, 변형 표적 핵산은 범용 어댑터의 이중 가닥 영역으로부터 유래된 상보적 서열에 의해 측접될 것이다. 이중 가닥 영역, 및 이에 따라 변형 표적 핵산 작제물에서 그로부터 유래된 상보적 서열이 길수록, 변형 표적 핵산의 작제물이 프라이머 연장 및/또는 PCR에 사용된 어닐링 조건 하에 내부 자기 상보성의 이들 영역에서 그 자체로 접히고 염기쌍을 형성할 수 있다. 따라서, 이 효과를 감소시키기 위해 이중 가닥 영역의 길이가 20개 이하, 15개 이하 또는 10개 이하의 염기쌍을 갖는 일반적으로 바람직하다.이중 가닥 영역의 안정성은 표준 왓슨-크릭 염기쌍보다 더 강한 염기쌍을 나타내는 비-천연 뉴클레오타이드의 봉입에 의해 증가될 수 있고, 따라서 그의 길이는 잠재적으로 감소될 수 있다.
일 구현예에서, 범용 어댑터의 2개의 가닥은 이중 가닥 영역에서 100% 상보적이다. 2개의 가닥이 표준 결찰 조건 하에 안정한 이중체를 형성할 수 있다면, 하나 이상의 뉴클레오타이드 미스매치가 이중가닥 영역 내에서 허용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
본 명세서에 사용하기 위한 범용 어댑터는 일반적으로 어댑터의 '결찰가능한' 말단, 예를 들어 결찰 반응에서 이중 가닥 표적 핵산에 연결된 말단을 형성하는 이중 가닥 영역을 포함할 것이다. 범용 어댑터의 결찰가능한 말단은 뭉툭할 수 있거나, 또는 다른 구현예에서, 하나 이상의 뉴클레오타이드의 짧은 5' 또는 3' 오버행이 결찰을 용이하게 하고/촉진하기 위해 존재할 수 있다. 범용 어댑터의 결찰가능한 말단에 있는 5' 말단 뉴클레오타이드는 전형적으로 인산화되어 표적 폴리뉴클레오타이드 상의 3' 하이드록실 기에 대한 포스포디에스테르 연결을 가능하게 한다.
용어 '매칭되지 않은 영역'은 범용 어댑터의 영역, 즉 단일 가닥 비-상보적 핵산 가닥의 영역을 지칭하며, 상기 범용 어댑터를 형성하는 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥의 서열은, 2개의 가닥이 프라이머 연장 또는 PCR 반응을 위한 표준 어닐링 조건 하에 서로 완전히 어닐링할 수 없도록 하는 정도의 비상보성을 나타낸다. 매칭되지 않은 영역(들)은 효소-촉매된 결찰 반응을 위한 표준 반응 조건 하에 어느 정도의 어닐링을 나타낼 수 있으며, 단, 2개의 가닥은 증폭 반응에서 어닐링 조건 하에 단일 가닥 형태로 복귀한다.
'매칭되지 않은 영역'은 이중 가닥 영역(들)을 형성하는 동일한 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥의 상이한 부분에 의해 제공되는 것으로 이해되어야 한다. 어댑터 작제물 내의 미스매치는 하나의 가닥이 다른 가닥보다 더 긴 형태를 취할 수 있어서, 가닥 중 하나 상에 단일 가닥 영역, 또는 2개의 가닥이 혼성화하지 않도록 선택된 서열이 존재하여, 두 가닥 상에 단일 가닥 영역을 형성한다. 미스매치는 또한 '버블(bubble)'의 형태를 취할 수 있으며, 범용 어댑터 작제물(들)의 양 말단은 서로 혼성화하여 이중체를 형성할 수 있지만, 중심 영역은 그렇지 않다. 매칭되지 않은 영역을 형성하는 가닥(들)의 부분은 동일한 2개의 가닥의 다른 부분이 어닐링되어 하나 이상의 이중 가닥 영역을 형성하는 조건 하에 어닐링되지 않는다. 의심의 여지를 피하기 위해, 표적 서열에 대한 결찰을 후속적으로 수행하는 폴리뉴클레오타이드 이중체의 3' 말단에서의 단일 가닥 또는 단일 염기 오버행은 본 개시내용의 문맥에서 '매칭되지 않은 영역'을 구성하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
매칭되지 않은 영역의 길이에 대한 하한은 전형적으로 기능, 예를 들어 i) 프라이머 연장, PCR 및/또는 서열분석을 위한 프라이머의 결합 (예를 들어, 프라이머의 범용 프라이머 결합 부위에의 결합), 또는 ii) 변형 표적 핵산의 표면에의 고정화를 위한 포획 핵산에 대한 범용 포획 결합 서열의 결합에 대한 적합한 서열을 제공할 필요성에 의해 결정될 것이다. 이론적으로, 일반적으로, 예를 들어 결찰 단계 후 변형 표적 핵산 작제물로부터 결합되지 않은 범용 어댑터의 분리를 용이하게 하기 위해 범용 어댑터 전체 길이를 최소화하는 것이 유리하다는 것을 제외하고는, 매칭되지 않은 영역의 길이에 대한 상한은 없다. 따라서, 매칭되지 않은 영역은 그 길이가 50개 미만, 40개 미만 또는 30개 미만 혹은 25개 미만의 연속적인 뉴클레오타이드이어야 하는 것이 일반적으로 바람직하다.
단일 가닥 비-상보적 핵산 가닥의 영역은 3' 말단에 적어도 하나의 범용 포획 결합 서열을 포함한다. 범용 어댑터의 3' 말단은 어레이의 증폭 부위에 존재하는 포획 핵산에 혼성화될 범용 포획 결합 서열을 포함한다. 선택적으로, 범용 어댑터의 5' 말단은 표적 핵산의 각 말단에 부착된 제2 범용 포획 결합 서열을 포함하고, 상기 제2 범용 포획 결합 서열은 어레이의 증폭 부위에 존재하는 상이한 포획 핵산에 혼성화할 것이다.
단일 가닥 비-상보적 핵산 가닥의 영역은 전형적으로 또한 적어도 하나의 범용 프라이머 결합 부위를 포함한다. 범용 프라이머 결합 부위는 범용 어댑터에 결찰된 표적 핵산의 증폭 및/또는 서열분석에 사용될 수 있는 범용 서열이다.
단일 가닥 비-상보적 핵산 가닥의 영역은 또한 적어도 하나의 인덱스를 포함할 수 있다. 인덱스는 어레이 상의 특정 표적 핵산의 공급원의 마커 특징으로서 사용될 수 있다(미국 특허 번호 8,053,192). 일반적으로, 인덱스는 라이브러리 제조 단계의 일부로서 표적 핵산에 첨가되는 범용 어댑터의 일부인 뉴클레오타이드의 합성 서열이다. 따라서, 인덱스는 특정 샘플의 표적 분자 각각에 부착된 핵산 서열이며, 이의 존재는 표적 분자가 단리되는 샘플 또는 공급원을 나타내거나 이를 확인하는데 사용된다. 일 구현예에서, 이중 인덱스 시스템이 사용될 수 있다. 이중 인덱스 시스템에서, 표적 핵산에 부착된 범용 어댑터는 2개의 상이한 인덱스 서열을 포함한다(미국 특허 공개 번호 2018/0305750, 미국 특허 공개 번호 2018/0305751, 미국 특허 공개 번호 2018/0305752, 및 미국 특허 공개 번호 2018/0305753).
바람직하게는, 인덱스는 최대 20개의 뉴클레오타이드 길이, 더욱 바람직하게는 1 내지 10개의 뉴클레오타이드 길이 및 가장 바람직하게는 4 내지 6개의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 4개의 뉴클레오타이드 인덱스는 동일한 어레이 상에서 256개의 샘플을 멀티플렉싱의 가능성을 제공하며, 6개의 염기 인덱스는 4096개의 샘플이 동일한 어레이에서 처리될 수 있게 한다.
일 구현예에서, 범용 포획 결합 서열은 이중 가닥 표적 단편에 결찰될 때 범용 어댑터의 일부이고, 다른 구현예에서 범용 프라이머 연장 결합 부위는, 범용 어댑터가 이중 가닥 표적 단편에 결찰된 후에 범용 어댑터에 첨가된다. 첨가는 PCR과 같은 증폭-기반 방법을 포함하는 통상적인 방법을 사용하여 달성될 수 있다.
범용 어댑터의 정확한 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 본 개시내용에 중요하지 않으며, 예를 들어 범용 포획 결합 서열 및 특정 세트의 범용 증폭 프라이머 및/또는 서열분석 프라이머에 대한 결합 부위를 제공하기 위해 원하는 서열 요소가 궁극적으로 복수의 상이한 변형 표적 핵산의 공통 서열에 포함되도록 사용자에 의해 선택될 수 있다. 추가의 서열 요소는, 예를 들어 라이브러리 내의 표적 핵산의 서열분석, 인덱스의 서열분석, 또는 예를 들어 고형 지지체 상의 라이브러리 내의 상기 표적 핵산의 증폭으로부터 유래된 생성물에 궁극적으로 사용될 서열분석 프라이머를 위한 결합 부위를 제공하기 위해 포함될 수 있다.
범용 어댑터의 정확한 뉴클레오타이드 서열이 일반적으로 본 개시내용에 비-제한적이지만, 매칭되지 않은 영역 내의 개별 가닥의 서열은 개별 가닥이 표준 어닐링 조건 하에 자기-어닐링, 헤어핀 구조의 형성 등을 초래할 수 있는 임의의 내부 자기-상보성을 나타내지 않도록 되어야 한다. 매칭되지 않은 영역에서 가닥의 자기-어닐링은 이러한 가닥에 대한 증폭 프라이머의 특이적 결합을 방지하거나 감소시킬 수 있기 때문에 회피되어야 한다.
미스매칭된 어댑터는 바람직하게는 DNA의 2개의 가닥으로부터 형성되지만, 포스포디에스테르 및 비-포스포디에스테르 골격 연결의 혼합물에 의해 연결된 천연 및 비-천연 뉴클레오타이드 (예를 들어, 하나 이상의 리보뉴클레오타이드)의 혼합물을 포함할 수 있다.
범용 어댑터의 결찰 및 증폭
결찰 방법은 당업계에 알려져 있고 표준 방법을 사용한다. 이러한 방법은 DNA 리가제와 같은 리가제 효소를 사용하여, 이 경우, 범용 어댑터 및 이중 가닥 표적 핵산의 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥의 말단의 결합을 달성하거나 촉매하여, 공유 결합이 형성된다. 범용 어댑터는 표적 단편 상에 존재하는 3'-OH에 대한 결찰을 용이하게 하기 위해 5'-포스페이트 모이어티를 함유할 수 있다. 이중 가닥 표적 핵산은 5'-포스페이트 모이어티를 함유하고, 전단 공정으로부터 잔류하거나, 또는 효소 처리 단계를 사용하여 첨가되고, 말단 복구되고, 선택적으로 오버행 염기 또는 염기들에 의해 연장되어 결찰에 적합한 3'-OH를 제공한다. 이 문맥에서, 결합은 이전에 공유 결합되지 않은 폴리뉴클레오타이드 가닥의 공유 결합을 의미한다. 본 발명의 특정 양태에서, 이러한 결합은 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥 사이의 포스포디에스테르 결합의 형성에 의해 일어나지만, 다른 공유 결합 수단 (예를 들어, 비-포스포디에스테르 골격 결합)이 사용될 수 있다.
본원에 논의된 바와 같이, 일 구현예에서, 결찰에 사용되는 범용 어댑터는 완전하며, 범용 포획 결합 서열 및 다른 범용 서열, 예를 들어, 범용 프라이머 결합 부위 및 인덱스 서열을 포함한다. 생성된 복수의 변형 표적 핵산은 서열분석을 위한 고정된 샘플을 제조하는데 사용될 수 있다.
또한, 본원에 논의된 바와 같이, 일 구현예에서, 결찰에 사용되는 범용 어댑터는 범용 프라이머 결합 부위 및 인덱스 서열을 포함하고, 범용 포획 결합 서열을 포함하지 않는다. 생성된 복수의 변형 표적 핵산은 특이적 서열, 예컨대 범용 포획 결합 서열을 포함하도록 추가로 변형될 수 있다. 이중 가닥 표적 단편에 결찰된 범용 프라이머에 특이적 서열, 예컨대 범용 포획 결합 서열을 첨가하는 방법은 증폭-기반 방법, 예컨대 PCR을 포함하고, 당업계에 알려져 있고, 예를 들어, Bignell 등 (US 8,053,192) 및 Gunderson 등 (WO2016/130704)에 기재되어 있다.
범용 어댑터가 변형된 구현예에서, 증폭 반응이 준비된다. 증폭 반응의 내용물은 통상의 기술자에게 알려져 있고, 적절한 기질 (예컨대, dNTP), 효소 (예를 들어, DNA 중합효소) 및 증폭 반응에 필요한 완충제 성분을 포함한다. 일반적으로, 증폭 반응은 증폭 반응의 각 사이클의 프라이머 어닐링 단계에서 직면하는 조건 하에 증폭될 폴리뉴클레오타이드 서열의 일부, 예를 들어, 변형 표적 핵산에 특이적으로 어닐링할 수 있는, 종종 "정방향" 및 "역방향" 프라이머(프라이머 올리고뉴클레오타이드)로 표시되는 적어도 2개의 증폭 프라이머를 필요로 한다. 프라이머가 제1 증폭 사이클에서 변형 표적 핵산에 어닐링하지 않는 임의의 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 경우, 이러한 서열은 증폭 생성물로 복제될 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 범용 포획 결합 서열, 예를 들어 변형 표적 핵산에 어닐링하지 않는 서열을 갖는 프라이머의 사용에서, 범용 포획 결합 서열은 생성된 앰플리콘 내로 혼입될 것이다.
증폭 프라이머는 일반적으로 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 구조이다. 이들은 또한 천연 및 비-천연 염기 및 또한 천연 또는 비-천연 골격 결합의 혼합물을 함유할 수 있으며, 단 임의의 비-천연 변형은 프라이머로서의 기능을 배제하지 않으며 - 이는 증폭 반응의 조건 동안 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥에 어닐링하고 주형 가닥에 대해 상보적인 새로운 폴리뉴클레오타이드 가닥의 합성을 위한 개시점으로서 작용하는 능력으로서 정의된다. 프라이머는 추가로 비-뉴클레오타이드 화학적 변형, 예를 들어 엑소뉴클레아제 내성을 증가시키기 위해 포스포로티오에이트를 포함할 수 있으며, 단, 변형은 프라이머 기능을 방해하지 않는다.
클러스터를 생성하기 위한 증폭
이중 가닥 앰플리콘의 클론 집단 (클러스터로도 지칭됨)을 포함하는 각각의 증폭 부위를 포함하는 어레이는 통상의 기술자에게 알려진 방법을 사용하여 생산될 수 있다. 일 구현예에서, 등온 증폭 방법이 사용되며, 상기 부위를 씨딩한 개별 표적 핵산으로부터 이중 가닥 앰플리콘의 클론 집단을 생산하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 증폭 반응은 충분한 수의 앰플리콘이 생성되어 각각의 증폭 부위의 용량을 채울 때까지 진행된다. 이러한 방식으로 이미 씨딩된 부위를 용량까지 채우는 것은 후속 표적 핵산이 부위에서 착지하는 것을 배제함으로써, 부위에서 앰플리콘의 클론 집단을 생산한다. 따라서, 일부 구현예에서 증폭 부위의 용량을 채우기 위해 앰플리콘이 생성되는 속도는 개별 표적 핵산이 개별 증폭 부위로 수송되는 속도를 초과하는 것이 바람직하다.
일부 구현예에서, 증폭 방법은 고상 증폭, 폴로니 증폭, 콜로니 증폭, 에멀젼 PCR, 비드 RCA, 표면 RCA 또는 표면 SDA를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 용액 중 유리 DNA 분자의 증폭을 초래하거나 DNA 분자의 한쪽 말단에 의해서만 적합한 매트릭스에 결박된 증폭 방법이 사용된다. 일부 구현예에서, 두 PCR 프라이머가 표면에 부착되는 브릿지(bridge) PCR에 의존하는 방법 (예를 들어, WO 2000/018957, 미국 특허 번호 7,972,820; 미국 특허 번호 7,790,418 및 문헌 [Adessi 등, Nucleic Acids Research (2000): 28(20): E87] 참조)이 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 동일한 앰플리콘의 공간적 클러스터링을 유지하는 다중 증폭을 지칭하는 "중합효소 콜로니 기술", 또는 "폴로니"를 생성할 수 있다. (Harvard Molecular Technology Group and Lipper Center for Computational Genetics website 참조). 이들은, 예를 들어, 인 시츄 폴로니 (Mitra and Church, Nucleic Acid Research 27, e34, Dec. 15, 1999), 인시츄(in situ) 회전환 증폭(RCA) (Lizardi 등, Nature Genetics 19, 225, July 1998), 브릿지 PCR(미국 특허 번호 5,641,658), 피코티터 PCR (Leamon 등, Electrophoresis 24, 3769, November 2003), 및 에멀젼 PCR (Dressman 등, PNAS 100, 8817, July 22, 2003)을 포함한다. 일부 구현예에서, 동역학적 배제에 의존하는 방법이 사용되며, 재조합효소-촉진 증폭 및 등온 조건은 라이브러리를 증폭시킨다 (미국 특허 번호 9,309,502, 미국 특허 번호 8,895,249, 미국 특허 번호 8,071,308).
일부 구현예에서, 명백한 클론형성능은, 제2 표적 핵산이 부위에서 증폭을 시작하기 전에 증폭 부위가 용량까지 채워지지 않는 경우에도, 달성될 수 있다. 일부 조건 하에서, 제1 표적 핵산의 증폭은, 부위로 수송되는 제2 표적 핵산으로부터의 복제물의 생성을 효과적으로 능가하거나 압도하기에 충분한 수의 복제물이 만들어지는 지점으로 진행될 수 있다. 예를 들어, 직경이 500 nm 미만인 원형 특징부에 대한 브릿지 증폭 공정을 사용하는 구현예에서, 제1 표적 핵산에 대한 지수 증폭의 14회 사이클 후, 동일한 부위에서의 제2 표적 핵산으로부터의 오염은 Illumina 서열분석 플랫폼 상의 합성에 의한 서열분석에 악영향을 미치기에 불충분한 수의 오염 앰플리콘을 생성할 것으로 결정되었다.
어레이 내의 증폭 부위는 모든 구현예에서 완전히 클론일 필요는 없다. 오히려, 일부 적용의 경우, 개별 증폭 부위는 주로 제1 표적 핵산으로부터의 앰플리콘으로 채워질 수 있고, 또한 제2 표적 핵산으로부터 낮은 수준의 오염 앰플리콘을 가질 수 있다. 어레이는, 오염 수준이 어레이의 후속 사용에 대해 허용되지 않는 영향을 미치지 않는 한 오염 앰플리콘의 수준이 낮은 하나 이상의 증폭 부위를 가질 수 있다. 예를 들어, 어레이가 검출 적용에서 사용될 때, 허용가능한 오염 수준은 허용할 수 없는 방식으로 검출 기술의 신호 대 잡음 또는 해상도에 영향을 미치지 않는 수준일 것이다. 따라서, 명백한 클론형성능은 일반적으로 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 어레이의 특정 용도 또는 적용과 관련될 것이다. 특정 적용을 위한 개별 증폭 부위에서 허용가능할 수 있는 예시적인 오염 수준은 최대 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10% 또는 25% 오염 앰플리콘을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 어레이는 이러한 예시적인 수준의 오염 앰플리콘을 갖는 하나 이상의 증폭 부위를 포함할 수 있다. 예를 들어, 어레이 내의 증폭 부위의 최대 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 심지어 100%는 일부 오염 앰플리콘을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 방법에 유용한 어레이의 제조 방법은, 증폭이 일어날 때 표적 핵산이 증폭 부위로 (예를 들어, 확산을 통해) 수송되는 조건 하에 수행될 수 있다. 따라서, 일부 증폭 방법은 후속 앰플리콘 형성에 비해 상대적으로 느린 수송 속도 및 상대적으로 느린 제1 앰플리콘의 생산 둘 모두를 이용할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 증폭 반응은, 표적 핵산이 (i) 제1 앰플리콘의 생산, 및 (ii) 어레이의 다른 부위에서의 후속 앰플리콘의 생산과 동시에 용액으로부터 증폭 부위로 수송되도록 수행될 수 있다. 특정 구현예에서, 후속 앰플리콘이 증폭 부위에서 생성되는 평균 속도는, 표적 핵산이 용액으로부터 증폭 부위로 수송되는 평균 속도를 초과할 수 있다. 일부 경우에, 충분한 수의 앰플리콘이 개별 증폭 부위에서 단일 표적 핵산으로부터 생성되어 각각의 증폭 부위의 용량을 채울 수 있다. 각각의 증폭 부위의 용량을 채우기 위해 앰플리콘이 생성되는 속도는, 예를 들어, 개별 표적 핵산이 용액으로부터 증폭 부위로 수송되는 속도를 초과할 수 있다.
본 명세서에서 "증폭 시약"으로 지칭되는, 증폭 부위에서 표적 핵산을 증폭시키기 위한 조성물은 전형적으로 증폭 부위에서의 표적 핵산의 복제물을 신속하게 제조할 수 있다. 본 개시내용의 방법에 사용되는 증폭 시약은 일반적으로 중합효소 및 뉴클레오타이드 트리포스페이트 (NTP)를 포함할 것이다. 당업계에 알려진 임의의 다양한 중합효소가 사용될 수 있지만, 일부 구현예에서 엑소뉴클레아제 음성인 중합효소를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 본 발명의 구현예에서 사용하기에 적합한 핵산 중합효소의 예는 DNA 중합효소 (예컨대 Klenow 단편, T4 DNA 중합효소, Bst (바실러스 스테아로써모필루스) 중합효소), 열안정성 DNA 중합효소 (예컨대 Taq, Vent, Deep Vent, Pfu, Tfl, 및 9°N DNA 중합효소) 뿐만 아니라 그것의 유전자 변형된 유도체 (TaqGold, VENTexo, Pfu exo)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 증폭 시약은 또한 재조합효소-촉진 증폭을 위한 재조합효소, 보조 단백질, 및 단일 가닥 DNA 결합 (SSB) 단백질을 포함할 수 있다
NTP는 DNA 복제물이 만들어지는 구현예에서 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트(dNTP)일 수 있다, 전형적으로, 4종의 천연 종인 dATP, dTTP, dGTP 및 dCTP가 DNA 증폭 시약에 존재할 것이지만; 원한다면 유사체가 사용될 수 있다. NTP는 RNA 복제물이 만들어지는 구현예에서 리보뉴클레오타이드 트리포스페이트 (rNTP)일 수 있다. 전형적으로, 4종의 천연 종인 rATP, rUTP, rGTP 및 rCTP가 RNA 증폭 시약에 존재할 것이지만; 원한다면 유사체가 사용될 수 있다. NTP는 형광 또는 방사성 기로 변형될 수 있다. 핵산의 검출가능성 및/또는 기능적 다양성을 증가시키기 위해, 매우 다양한 합성적으로 변형된 핵산이 화학적 및 생물학적 방법을 위해 개발되었다. 이들 기능화된/변형된 분자(예를 들어, 뉴클레오타이드 유사체)는 천연 중합 효소와 충분히 상용성이어서, 천연 대응물의 염기 짝짓기 및 복제 특성을 유지할 수 있다.
증폭 용액의 다른 성분은 중합효소의 선택에 따라서 첨가되고, 이들은 본질적으로 각 중합효소의 활성을 지지하는데 효과적인 것으로 당업계에 알려진 화합물에 상응한다. 디메틸 설폭사이드 (DMSO), 소 혈청 알부민 (BSA), 폴리-에틸렌 글라이콜 (PEG), 베타인, Triton X-100, 변성제 (예를 들어, 포름아미드), 또는 MgCl2와 같은 화합물의 농도는 최적 증폭을 갖는 것이 중요한 것으로 선행 기술에 널리 알려져 있고, 따라서 조작자는 하기에 제시된 실시예 및 일반적으로 이용가능한 지식에 기초하여 본 개시내용의 방법에 대한 이러한 농도를 용이하게 조정할 수 있다.
증폭 반응이 일어나는 속도는 증폭 반응의 하나 이상의 활성 성분의 농도 또는 양을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 중합효소, 뉴클레오타이드 트리포스페이트, 또는 프라이머의 양 또는 농도. 일부 경우에, 양 또는 농도가 증가된 (또는 달리 본 명세서에 기재된 방법에서 조작된) 증폭 반응의 하나 이상의 활성 성분은 증폭 반응의 비핵산 성분이다.
증폭 속도는 또한 온도를 조정함으로써 본 명세서에 기재된 방법에서 증가될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 증폭 부위에서의 증폭 속도는 부위(들)에서의 온도를, 변성 또는 다른 부작용으로 인해 반응 속도가 감소되는 최대 온도까지 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 최적 또는 원하는 온도는 사용 중인 증폭 성분의 알려진 특성으로부터 또는 주어진 증폭 반응 혼합물에 대해 경험적으로 결정될 수 있다. 이러한 조정은 프라이머 용융 온도(Tm)의 선험적 예측에 기초하여 또는 경험적으로 이루어질 수 있다. 특정 구현예에서, 증폭 반응의 온도는 적어도 35℃ 내지 70℃ 이하이다. 예를 들어, 증폭 반응은 적어도 35℃ 내지 42℃ 이하, 또는 적어도 57℃ 내지 63℃ 이하일 수 있다.
증폭 반응이 일어나는 속도는 하나 이상의 증폭 시약의 활성을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들어, 중합효소의 연장 속도를 증가시키는 보조인자를 중합효소가 사용 중인 반응에 첨가할 수 있다. 일부 구현예에서, 금속 보조인자, 예컨대 마그네슘, 아연 또는 망간이 중합효소 반응에 첨가될 수 있거나 베타인이 첨가될 수 있다.
서열분석을 위한 고정된 샘플의 제조
브릿징 증폭의 결과는 증폭 부위에서 클론 "브릿징된" 증폭 생성물의 집단이다. 앰플리콘 산의 양쪽 가닥은 5' 말단에서 증폭 부위의 표면 상에 고정화되고, 여기서 이러한 부착은 포획 핵산의 원래 부착으로부터 유래된다(예를 들어, 이중 가닥 앰플리콘(11)이 "브릿징된" 배향으로 묘사된 도 1a 참조). 증폭 부위 내의 앰플리콘은 클론일 것이고, 단일 표적 핵산의 증폭으로부터, 또는 본원에 기재된 바와 같은 허용가능한 수준의 또 다른 앰플리콘으로 유래될 것이다.
다수의 미사용된 포획 핵산은, 브릿징된 이중 가닥 앰플리콘의 가닥 각각의 유리 3'-말단에 더하여, 브릿징된 증폭 생성물의 클론 클러스터를 형성하기 위해 증폭 후 증폭 부위의 표면 상에 남아 있다. 미사용된 포획 핵산의 존재는 증가된 노이즈에 기여할 수 있고, 따라서 전형적으로 뉴클레아제가 미사용된 포획 핵산을 소화시키기에 적합한 조건 하에서 어레이를 뉴클레아제와 접촉시킴으로써 제거된다. 일 구현예에서, 뉴클레아제는 엑소뉴클레아제, 예컨대 3'에서 5' 단일 가닥 DNA 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 엑소뉴클레아제이다. 이러한 엑소뉴클레아제의 예는 엑소뉴클리아제 I이다. 뉴클레아제 처리 후, 어레이를 세정하여 증폭 부위로부터 뉴클레아제 및 생성된 뉴클레오타이드 및/또는 핵산을 제거한다.
서열분석을 용이하게 하기 위해, 이중 가닥 브릿징된 구조의 가닥 중 하나는 표면으로부터 선택적으로 제거되어 나머지 고정화된 가닥에 대한 서열분석 프라이머의 효율적인 혼성화를 가능하게 할 수 있다. 특정 가닥의 선택적 제거는 본원에서 "선형화"로 지칭된다. 선형화에 적합한 방법의 예는 본원에 기재되고 출원 번호 WO 2007/010251 및 미국 특허 출원 공개 2012/0309634에 더욱 상세히 기재된다.
일 구현예에서, 선형화는 브릿징된 이중 가닥 앰플리콘의 하나의 가닥을 절단하고, 이어서 증폭 부위 표면에 더 이상 부착되지 않은 가닥을 제거하는 조건을 생성된 구조에 가함으로써 달성된다. 절단은 절단 부위를 포함하는 포획 핵산의 사용을 통해 달성될 수 있다. 절단 부위는 전형적으로 브릿징된 구조의 하나의 가닥의 상당 부분이 증폭 부위의 표면에서 유리되고 - 더 이상 고정화되지 않고 - 제거 단계 후에 손실되기 쉬운 위치에 있다. 예를 들어, 도 1b에 도시된 바와 같이, 앰플리콘(11) 내의 절단 부위 X는 절단되어 단축된 포획 핵산(13'')를 남긴다. 브릿징된 구조의 하나의 가닥(16)은 그의 5' 말단에서 증폭 부위(10)에 고정화된 채로 남아있고, 다른 가닥(15')는 X에서의 절단으로 인해 더 이상 고정화되지 않는다. 일 구현예에서, 가닥(16)의 3' 말단은 단축 포획 핵산(13")의 상보적 염기에 어닐링된 채로 남아있으며, 이에 의해 선형화 후 브릿지 구조를 유지한다. 브릿지 구조를 유지하는 가닥(16)의 3' 말단과 단축된 포획 핵산(13") 사이의 상보적 염기의 수는 만연한 조건에 따라 달라지며, 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 절단 부위는 뉴클레오타이드를 제거하고 무염기성 부위를 만들기 위해 처리된다. "무염기성 부위"는 염기 성분이 제거된 핵산 내의 뉴클레오타이드 위치이다. 무염기성 부위는 인공 조건 하에서 또는 효소의 작용에 의해 화학적으로 형성될 수 있다. 일단 형성되면, 무염기성 부위는 (예를 들어, 엔도뉴클레아제 또는 다른 단일 가닥 절단 효소로의 처리, 열 또는 알칼리에의 노출에 의해) 절단되어, 핵산의 부위-특이적 절단을 위한 수단을 제공할 수 있다.
일 구현예에서, 무염기성 부위는 고정화된 앰플리콘의 하나의 가닥 상의 예정된 위치에서 생성될 수 있다. 이는, 예를 들어, 예정된 위치에 특정 뉴클레오타이드를 혼입시킴으로써 달성될 수 있다.
일 구현예에서, 데옥시우리딘(U)은 증폭 부위의 표면에 부착된 포획 핵산들 중 하나에 혼입된다. 이어서, 효소 우라실 DNA 글리코실라제(UDG)는 사용되어 우라실 염기를 제거하여, 하나의 가닥 상에 무염기성 부위를 생성할 수 있다. 이어서, 무염기성 부위를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 가닥은 엔도뉴클레아제(예를 들어, DNA 글리코실라제-리아제 엔도뉴클레아제 VIII), 열 또는 알칼리로의 처리에 의해 무염기성 부위에서 절단될 수 있다. 특정 구현예에서, New Englad Biolabs (NEB #M5505S)로부터 이용가능한 USER 시약은 고정화된 우라실 염기에서 단일 뉴클레오타이드 갭의 생성에 사용된다. 일 구현예에서, 증폭 부위는 적절한 글리코실라제 및 하나 이상의 적절한 엔도뉴클레아제를 함유하는 혼합물에, 전형적으로 적어도 약 2:1의 활성비로 노출된다. 엔도뉴클레아제 효소에 의한 처리는 절단 부위에서 3'-포스페이트 모이어티를 발생시키고, 이는 적합한 포스파타제, 예컨대 알칼리성 포스파타아제로 제거될 수 있다. 예를 들어, 도 1b에 도시된 바와 같이, 절단 부위 X가 USER 시약을 사용하여 생성되는 경우, 단축된 포획 핵산(13")는 3'-포스페이트 기로 종결할 것이다.
일 구현예에서, 8-옥소-구아닌은 증폭 부위의 표면에 부착된 포획 핵산들 중 하나에 혼입된다. 이어서, 효소 FPG 글리코실라제는 사용되어 8-옥소-구아닌 염기를 제거하여, 하나의 가닥 상에 무염기성 부위를 생성할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 데옥시이노신은 증폭 부위의 표면에 부착된 포획 핵산들 중 하나에 혼입되고, 이어서 효소 AlkA 글리코실라제는 사용되어 데옥시이노신 염기를 제거하여, 하나의 가닥 상에 무염기성 부위를 생성할 수 있다.
이 방법의 이점은 절단된 가닥 상에 유리 3' 포스페이트 기를 방출시키는 옵션을 포함하며, 이는 포스파타제 처리 후에 상보적 가닥의 영역을 서열분석(예를 들어, 도 1b의 가닥(16)의 영역을 서열분석)하기 위한 개시점을 제공할 수 있다. 절단 반응이, DNA에서 자연적으로 발생하지 않지만, 그렇지 않으면 서열 맥락에 독립적인 잔기, 예를 들어, 데옥시우리딘을 필요로 하기 때문에, 단지 하나의 비-천연 염기가 포함되면 이중체에서 원치 않는 위치에 다른 곳에서 발생하는 글리코실라제-매개된 절단의 가능성은 없다. 우라실에 대한 UDG의 작용에 의해 생성된 고정화된 앰플리콘의 이중 가닥 섹션에서의 무염기성 부위의 절단에 의해 얻어진 또 다른 이점은 절단으로 형성된 유리 3' 히드록실기에서 개시하는 합성에 의한 서열분석 반응에 혼입된 제1 염기가 항상 T일 것이라는 점이다. 그 결과, 서열분석 주형을 생성하기 위해 이런 식으로 절단되는 어레이의 상이한 증폭 부위에 모든 클론 클러스터의 경우 전체 어레이에 걸쳐 범용으로 혼입되는 제1 염기는 T일 것이다. 이것은 서열분석 실행의 시작에서 개별 클러스터 강도에 대한 서열-독립적 검정을 제공할 수 있다.
엑소뉴클레아제 첨가 및 선형화의 단계는 반드시 별도의 단계인 것으로 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 엔도뉴클레아제 효소에 의한 처리는 절단 부위에서 3'-포스페이트 모이어티를 발생시키고, 3' 포스페이트의 존재는 엑소뉴클레아제 I의 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다 (Lehman and Nussbaum, 1964, J. Biol. Chem., 239: 2628-2636). 본 발명자들은 엑소뉴클레아제 및 선형화 단계 둘 모두가 효소를 조합함으로써 동시에 일어날 수 있다는 예상치 못한 놀라운 발견을 하였다. 이들 두 단계를 하나의 단계로 감소시키는 것은 두 단계가 현재 동시에 수행됨에 따라 더 빠른 서열분석 실행을 초래한다. 또한, 두 단계의 결합은 주요 메트릭스, 판독 품질, 이중 인덱싱 또는 게놈 구축 메트릭스에 해로운 영향을 미치지 않는다.
무염기성 부위 생성 및 절단은 더 이상 표면에 고정화되지 않은 가닥 상의 유리 5'-말단을 초래한다(예를 들어, 도 1b에 도시된 바와 같이, 브릿징된 구조의 하나의 가닥(16)은 그의 5' 말단에서 증폭 부위(10)에 고정화된 채로 유지되고, 다른 가닥(15')는 X에서의 절단으로 인해 더 이상 고정화되지 않는다). 이러한 가닥은 증폭 부위를 적합한 조건에 노출시킴으로써 표면으로부터 완전히 제거될 수 있다. 일 구현예에서, 제거는 변성에 의한 것이다. 변성은, 예를 들어 화학적 변성을 사용하여, 열적으로 또는 등온적으로 수행될 수 있다. 화학적 변성제는 요소, 수산화물, 또는 포름아미드 또는 다른 유사한 시약일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 제거는 람다 또는 T7 엑소뉴클레아제와 같은 5'-3' 활성을 갖는 엑소뉴클레아제로의 처리에 의해 달성될 수 있다. 부착되지 않은 가닥의 제거는 중합효소에 대한 주형으로서 작용할 수 있는 남아있는 단일 가닥을 초래한다.
임의로, 증폭 부위에서 핵산의 3' 말단은 복구된다. 엑소뉴클레아제는 선형화 후 핵산의 3' 말단에서 뉴클레오타이드의 일부를 제거할 수 있다. 한정하려는 의도 없이, 3' 말단이 약간 "호흡"되어 소수의 뉴클레오타이드가 단일 가닥이 되고 소화를 위해 엑소뉴클레아제에 이용가능할 수 있다. 복구는 뉴클레오타이드를 DNA 중합효소, 예컨대 브릿징 증폭에 사용된 DNA 중합효소에 노출시킴으로써 달성될 수 있다.
부착되지 않은 가닥의 제거는 선택적이다. 일 구현예에서, 무염기성 부위의 생성 후에 남아있는 3'-포스페이트 기는 제거되어 절단된 포획 핵산(도 1b, 단축된 포획 핵산(13"))의 말단에 3'-히드록실 기를 남긴다. 이러한 포획 핵산은 가닥 치환 활성을 갖는 중합효소에 대한 프라이머로서 사용될 수 있다. 중합효소가 주형으로서 고정화된 가닥(도 1b, 가닥(16))을 사용하여 상보적 가닥을 합성할 때, 이는 부착되지 않은 가닥(도 1b, 가닥(15'))을 치환한다.
조성물
본원에 기재된 증폭 클러스터링 방법 동안 또는 그 이후에, 상이한 조성물은 생성될 수 있다. 일 구현예에서, 조성물은 글리코실라제, 엔도뉴클레아제, 및 엑소뉴클레아제를 포함한다. 일 구현예에서, 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클리아제 I과 같은 3'에서 5' 단일 가닥 DNA 엑소뉴클레아제 활성을 갖는다. 일 구현예에서, 조성물에 존재할 수 있는 글리코실라제의 하나의 유형은 우라실 DNA 글리코실라제이고, 엔도뉴클레아제는 DNA 글리코실라제-리아제 엔도뉴클레아제 VIII이다. 일 구현예에서, 조성물에 존재할 수 있는 글리코실라제의 하나의 유형은 FPG 글리코실라제이고, 엔도뉴클레아제는 DNA 글리코실라제-리아제 엔도뉴클레아제 VIII이다. 일 구현예에서, 조성물에 존재할 수 있는 글리코실라제의 하나의 유형은 AlkA 글리코실라제이고, 엔도뉴클레아제는 DNA 글리코실라제-리아제 엔도뉴클레아제 VIII이다. 조성물은 우라실 절단 부위, 8-옥소-구아닌 절단 부위, 또는 데옥시이노신 절단 부위를 포함하는 이중 가닥 DNA 기질을 포함할 수 있다. 조성물은 무염기성 부위를 포함하는 이중 가닥 DNA 기질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 이중 가닥 DNA 기질을 갖는 조성물은 단일 가닥 영역을 포함할 수 있고, 여기서 우라실 절단 부위 및 무염기성 부위는 이중 가닥 영역에 존재한다. 또한, 복수의 증폭 부위를 포함하는 어레이가 제공되며, 여기서 각각의 증폭 부위는 증폭 부위에 부착된 복수의 이중 가닥 DNA 기질을 포함한다.
서열분석에서의 용도/서열분석의 방법
본원에 제시된 방법에 의해 생성되고 증폭 부위에서 증폭된 및 선형화된 앰플리콘을 포함하는 본 개시내용의 어레이는 임의의 다양한 적용에 사용될 수 있다. 특히 유용한 적용은 핵산 서열분석이다. 하나의 예는 합성에 의한 서열분석(SBS)이다. SBS에서, 핵산 주형(예를 들어, 표적 핵산 또는 그의 앰플리콘)을 따른 핵산 프라이머의 연장은 모니터링되어 주형 내의 뉴클레오타이드의 서열을 결정한다. 기저 화학 공정은 중합(예를 들어, 중합효소 효소에 의해 촉매화됨)일 수 있다. 특정 중합효소-기반 SBS 구현예에서, 형광 표지된 뉴클레오타이드는 주형 의존적 방식으로 프라이머에 첨가되어서 (이로써 프라이머를 연장시켜서), 프라이머에 첨가된 뉴클레오타이드의 순서 및 유형의 검출이 사용되어 주형의 서열을 결정할 수 있다. 본원에 제시된 어레이의 상이한 부위들에서 복수의 상이한 주형들은 상이한 주형들에 대해 발생하는 사건들이 어레이에서 그들의 위치로 인해 구별될 수 있는 조건들 하에서 SBS 기술에 적용될 수 있다.
플로우 셀은 본 개시내용의 방법에 의해 생성되고, SBS 또는 주기적으로 시약의 반복 전달을 포함하는 다른 검출 기술에 적용되는 어레이를 수용하기 위한 편리한 양식을 제공한다. 예를 들어, 제1 SBS 사이클을 개시하기 위해, 하나 이상의 표지된 뉴클레오타이드, DNA 중합효소 등은 핵산 주형의 어레이를 수용하는 플로우 셀 내로/플로우 셀을 통해 유동될 수 있다. 프라이머 연장에 의해 표지된 뉴클레오타이드가 혼입되는 어레이의 그들 부위는 검출될 수 있다. 임의로, 뉴클레오타이드는 일단 뉴클레오타이드가 프라이머에 첨가되면 추가 프라이머 연장을 종결시키는 가역적 종결 특성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 가역적 종결자 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드 유사체는 프라이머에 첨가될 수 있어서, 탈블로킹제가 전달되어 모이어티를 제거할 때까지 후속 연장이 일어날 수 없다. 따라서, 가역적 종결을 사용하는 구현예의 경우, 탈블로킹 시약은 (검출이 일어나기 전 또는 후에) 플로우 셀로 전달될 수 있다. 세정은 다양한 전달 단계들 사이에 수행될 수 있다. 이어서, 사이클은 n회 반복되어 프라이머를 n개의 뉴클레오타이드만큼 연장시킬 수 있고, 이로써 길이 n의 서열을 검출할 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해 생성된 어레이와 함께 사용하기 위해 용이하게 적응될 수 있는 예시적 SBS 절차, 유체 시스템 및 검출 플랫폼은, 예를 들어, 문헌 [Bentley 등, Nature 456:53-59 (2008)], WO 04/018497; 미국 특허 번호 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; 미국 특허 번호 7,329,492; 미국 특허 번호 7,211,414; 미국 특허 번호 7,315,019; 미국 특허 번호 7,405,281, 및 미국 특허 번호 8,343,746에 기재되어 있다.
사이클 반응을 사용하는 다른 서열분석 절차, 예컨대 파이로서열분석은 사용될 수 있다. 파이로서열분석은 특정 뉴클레오타이드가 신생 핵산 가닥에 혼입될 때 무기 파이로포스페이트(PPi)의 방출을 검출한다(Ronaghi, 등, Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaguhi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi 등 Science 281(5375), 363(1998); 미국 특허 번호 6,210,891; 미국 특허 번호 6,258,568 및 미국 특허 번호 6,274,320). 파이로서열분석에서, 방출된 PPi는 ATP 설퍼릴라제에 의해 아데노신 트리포스페이트(ATP)로 즉시 전환됨으로써 검출될 수 있고, 생성된 ATP의 수준은 루시퍼라제-생성 광자를 통해 검출될 수 있다. 따라서, 서열분석 반응은 발광 검출 시스템을 통해 모니터링될 수 있다. 형광-기반 검출 시스템에 사용되는 여기 방사선원은 파이로서열분석 절차에 필요하지 않다. 본 개시내용의 어레이에 파이로서열분석의 적용에 사용될 수 있는 유용한 유체 시스템, 검출기 및 절차는, 예를 들어, WIPO 공개 특허 출원 2012/058096, US 2005/0191698 A1, 미국 특허 번호 7,595,883 및 미국 특허 번호 7,244,559에 기재되어 있다.
예를 들어, 문헌 [Shendure 등 Science 309:1728-1732 (2005)]; 미국 특허 번호 5,599,675; 및 미국 특허 번호 5,750,341에 기재된 것들을 포함하여 결찰에 의한 서열분석 반응은 또한 유용하다. 일부 구현예는 예를 들어 문헌 [Bains 등, Journal of Theoretical Biology 135(3), 303-7 (1988)]; 문헌 [Drmanac 등, Nature Biotechnology 16, 54-58 (1998)]; 문헌 [Fodor 등; Science 251(4995), 767-773 (1995)]; 및 WO 1989/10977에 기재된 바와 같은 혼성화에 의한 서열분석 절차를 포함할 수 있다. 결찰에 의한 서열분석 및 혼성화에 의한 서열분석의 두 가지 절차에서, 어레이의 부위에 존재하는 주형 핵산 (예를 들어, 표적 핵산 또는 그의 앰플리콘)은 올리고뉴클레오타이드 전달 및 검출의 반복된 사이클에 적용된다. 본원에 제시되거나 본원에 인용된 참조문헌에 기재된 바와 같은 SBS 방법을 위한 유체 시스템은 결찰에 의한 서열분석 또는 혼성화에 의한 서열분석 절차를 위한 시약의 전달에 용이하게 적응될 수 있다. 전형적으로, 올리고뉴클레오타이드는 형광 표지되고, 본원의 SBS 절차와 관련하여 또는 본원에 인용된 참조문헌에 기재된 것들과 유사한 형광 검출기를 사용하여 검출될 수 있다.
일부 구현예는 DNA 중합효소 활성의 실시간 모니터링을 수반하는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 혼입은 형광단-함유 중합효소와 γ-포스페이트-표지된 뉴클레오타이드 사이의 형광 공명 에너지 전달(FRET) 상호작용을 통해, 또는 제로모드 도파관(ZMW)을 사용하여 검출될 수 있다. FRET-기반 서열분석을 위한 기술 및 시약은, 예를 들어, 문헌 [Levene 등 Science 299, 682-686 (2003)]; 문헌 [Lundquist 등 Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008)]; 문헌 [Korlach 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)]에 기재되어 있다.
일부 SBS 구현예는 연장 생성물로의 뉴클레오타이드의 혼입시 방출된 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 양성자의 검출에 기초한 서열분석은 전기 검출기 및 이온 토렌트(Ion Torrent)(미국 코네티컷주 길포드 소재의 라이프 테크놀로지스 서브시디어리(Life Technologies subsidiary))로부터 상업적으로 이용가능한 관련 기술, 또는 US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1, US 2010/0137143 A1; 또는 US 2010/082617 A1에 기재된 서열분석 방법 및 시스템을 사용할 수 있다. 표적 핵산을 증폭시키기 위하여 본원에 제시된 방법은 양성자를 검출하는데 사용된 기질에 용이하게 적용될 수 있다. 더욱 구체적으로, 본원에 제시된 방법은 양성자를 검출하는데 사용되는 어레이의 부위에서 앰플리콘의 클론 집단을 생성하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 본원에 제시된 방법에 의해 생성된 본 개시내용의 어레이에 대한 유용한 적용은 유전자 발현 분석이다. 유전자 발현은 RNA 서열분석 기술, 예컨대 디지털 RNA 서열분석으로 지칭된 것을 사용하여 검출되거나 정량화될 수 있다. RNA 서열분석 기술은 상기 제시된 것과 같은 당업계에 알려진 서열분석 방법론을 사용하여 수행될 수 있다. 유전자 발현은 또한 어레이에 대한 직접 혼성화에 의해 수행된 혼성화 기술을 사용하여 또는 다중 검정을 사용하여 검출되거나 정량화될 수 있으며, 이의 생성물은 어레이 상에서 검출된다. 예를 들어, 본원에 제시된 방법에 의해 생성된 본 개시내용의 어레이는 또한 하나 이상의 개체로부터의 게놈 DNA 샘플에 대한 유전자형을 결정하는데 사용될 수 있다. 본 개시내용의 어레이 상에서 수행될 수 있는 어레이-기반 발현 및 유전자형 분석을 위한 예시적 방법은 미국 특허 번호 7,582,420; 6,890,741; 6,913,884 또는 6,355,431 또는 미국 특허 공개 번호 2005/0053980 A1; 2009/0186349 A1 또는 US 2005/0181440 A1에 기재되어 있다.
본원에 제시된 방법에 의해 생성된 어레이에 대한 또 다른 유용한 적용은 단일-세포 서열분석이다. 인덱싱 방법과 조합되는 경우, 단일 세포 서열분석은 수천개의 단일 세포에서 활성 조절 요소의 프로파일을 생성하기 위해 염색질 접근성 분석에서 사용될 수 있고, 단일 세포 전체 게놈 라이브러리는 생성될 수 있다. 본 개시내용의 어레이 상에서 수행될 수 있는 단일-세포 서열분석에 대한 예는 미국 공개 특허 출원 2018/0023119 A1, 미국 가출원 일련 번호 62/673,023 및 일련 번호 62/680,259에 기재되어 있다.
본원에 제시된 방법들의 이점은 이들이 임의의 다양한 핵산 라이브러리로부터 어레이의 신속하고 효율적인 생성을 제공한다는 것이다. 따라서, 본 개시내용은 본원에 제시된 하나 이상의 방법을 사용하여 어레이를 제조할 수 있고, 추가로 본원에 제시된 것들과 같은 당업계에 알려진 기술을 사용하여 어레이 상의 핵산을 검출할 수 있는 통합 시스템을 제공한다. 따라서, 본 발명의 통합 시스템은 펌프, 밸브, 저장소, 유체 라인 등과 같은 증폭 부위의 어레이에 증폭 시약을 전달할 수 있는 유체 성분을 포함할 수 있다. 특히 유용한 유체 성분은 플로우셀이다. 플로우셀은 본 개시내용의 어레이를 생성하고 어레이를 검출하기 위해 통합 시스템에서 구성 및/또는 사용될 수 있다. 예시적 플로우 셀은, 예를 들어, US 2010/0111768 A1 및 미국 특허 번호 8,951,781에 기재되어 있다. 플로우셀에 대해 예시된 바와 같이, 통합 시스템의 하나 이상의 유체 성분은 증폭 방법 및 검출 방법에 사용될 수 있다. 핵산 서열분석 구현예를 예로서 취하면, 통합 시스템의 유체 성분들 중 하나 이상은 본원에 제시된 증폭 방법 및 본원에 제시된 것들과 같은 서열분석 방법에서 서열분석 시약의 전달에 사용될 수 있다. 대안적으로, 통합 시스템은 증폭 방법을 수행하고 검출 방법을 수행하기 위해 별도의 유체 시스템을 포함할 수 있다. 핵산의 어레이를 생성할 수 있고 또한 핵산의 서열을 결정할 수 있는 통합 서열분석 시스템의 예는, 제한 없이, Illumina, Inc.(San Diego, CA)로부터의 MiSeqTM, HiSeq2500TM, NextSeqTM, MiniSeqTM, NovaSeqTM 및 iSeqTM 서열분석 플랫폼, 및 미국 특허 번호 8,951,781에 기재된 장치를 포함한다. 이러한 장치는 본원에 제시된 안내에 따라 어레이를 형성하도록 변형될 수 있다.
본원에 제시된 방법을 수행할 수 있는 시스템은 검출 장치와 통합될 필요는 없다. 오히려, 독립형 시스템 또는 다른 장치들과 통합된 시스템도 가능하다. 통합 시스템의 맥락에서 상기 예시된 것들과 유사한 유체 성분들은 이러한 구현예들에서 사용될 수 있다.
검출 능력과 통합되든 아니든, 본원에 제시된 방법을 수행할 수 있는 시스템은, 본원에 제시된 방법, 기술 또는 공정의 하나 이상의 단계를 수행하기 위한 명령어들의 세트를 실행할 수 있는 시스템 제어기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 명령어는 브릿지 증폭 조건 하에서 어레이를 생성하기 위한 단계의 수행을 지시할 수 있다. 임의로, 상기 명령어는 본원에 앞서 제시된 방법을 사용하여 핵산을 검출하는 단계의 수행을 추가로 지시할 수 있다. 유용한 시스템 제어기는 임의의 프로세서-기반 또는 마이크로프로세서-기반 시스템을 포함할 수 있으며, 이는 마이크로제어기들, 축소 명령 세트 컴퓨터 (RISC), 주문형 반도체 (ASIC), 필드 프로그래머블 게이트 어레이 (FPGA), 논리 회로, 및 본원에 기재된 기능들을 실행할 수 있는 임의의 다른 회로 또는 프로세서를 포함한다. 시스템 제어기를 위한 명령어들의 세트는 소프트웨어 프로그램의 형태일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "소프트웨어" 및 "펌웨어"는 호환적이고, RAM 메모리, ROM 메모리, EPROM 메모리, EEPROM 메모리, 및 비휘발성 RAM (NVRAM) 메모리를 포함하는, 컴퓨터에 의한 실행을 위해 메모리에 저장된 임의의 컴퓨터 프로그램을 포함한다. 소프트웨어는 시스템 소프트웨어 또는 애플리케이션 소프트웨어와 같은 다양한 형태일 수 있다. 또한, 소프트웨어는 개별 프로그램들의 집합, 또는 더 큰 프로그램 내의 프로그램 모듈 또는 프로그램 모듈의 일부의 형태일 수 있다. 소프트웨어는 또한 객체-지향 프로그래밍의 형태로 모듈러 프로그래밍을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본원에 제시된 방법에 의해 생성된 본 개시내용의 어레이가 검출 방법에 사용될 필요가 없다는 것은 이해될 것이다. 오히려, 어레이는 핵산 라이브러리를 저장하는데 사용될 수 있다. 따라서, 어레이는 그 안의 핵산을 보존하는 상태로 저장될 수 있다. 예를 들어, 어레이는 건조 상태로, 동결 상태 (예를 들어, 액체 질소로), 또는 핵산을 보호하는 용액으로 저장될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 어레이는 핵산 라이브러리를 복제하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 어레이는 어레이 상의 하나 이상의 부위로부터 복제 앰플리콘을 생성하는 데 사용될 수 있다.
이제 도 1a를 참조하면, 복수의 이중 가닥 앰플리콘(11) 중 하나의 구성원을 갖는 증폭 부위(10)의 개략도가 도시되어 있다. 도시된 이중 가닥 앰플리콘(11)은 제1 가닥(15) 및 제2 가닥(16)을 포함한다. 또한, 포획 핵산의 두 집단은 도시된다. 제1 집단은 제1 가닥(15)의 한쪽 말단에 부착된 것(13), 또는 증폭 부위(10)의 표면에 결합된 것(13') 어느 한쪽으로 나타난다. 포획 핵산의 제2 집단은 또한 제2 가닥(16)의 한쪽 말단에 부착된 것(14), 또는 증폭 부위(10)의 표면에 결합된 것(14') 어느 한쪽으로 나타난다. 또한, 도 1a에는 (포획 핵산(13) 상의 X로 마킹된) 절단 부위가 도시되어 있다. 일 구현예에서, 포획 핵산(13)은 P5 포획 핵산을 포함할 수 있고, 다른 포획 핵산(14)는 P7 포획 핵산을 포함할 수 있다.
도 1b는 제1 가닥에 부착된 포획 핵산(13)에서 절단 부위 X의 절단을 도시한다. 포획 핵산(13)의 절단은 (i) 단축된 가닥(15') 및 (ii) 단축된 포획 핵산(13")를 초래한다. 단축된 가닥(15')는 더 이상 증폭 부위(10)에 부착되지 않는다. 단축된 포획 핵산(13")는 3' 포스페이트로 끝날 수 있다. 도시된 구현예에서, 가닥(16)의 3' 말단에 존재하는 뉴클레오타이드는 단축된 포획 핵산 13"의 3' 말단에 존재하는 뉴클레오타이드로 어닐링된 채로 유지된다. 부착되지 않은 포획 핵산(13') 및 (14')는 엑소뉴클레아제 I과 같은 엑소뉴클리아제의 작용으로 인해 증폭 부위(10)에 더 이상 존재하지 않는다.
도 1c는 도 1b의 앰플리콘을 변성 조건에 노출시킨 결과를 도시한다. 증폭 부위(10)에 부착되지 않은 단축된 가닥(15')는 가닥(16)으로부터 제거되고, 가닥(16)의 3' 말단에서의 뉴클레오타이드는 단축된 포획 핵산(13")의 3' 말단에 존재하는 뉴클레오타이드에 어닐링되지 않는다.
도 1d는 재어닐링의 결과를 도시한다. 부착된 가닥(16)은 단축된 포획 핵산(13")에 재어닐링된다.
예시적인 구현예
구현예 1.
우라실 DNA 글리코실라제,
엔도뉴클레아제, 및
3'에서 5' 단일 가닥 DNA 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 엑소뉴클레아제
를 포함하는, 조성물.
구현예 2.
구현예 1에 있어서, 상기 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 I인, 조성물.
구현예 3.
구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 DNA 글리코실라제-리아제 엔도뉴클레아제 VIII인, 조성물.
구현예 4.
구현예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 우라실 절단 부위를 포함하는 이중 가닥 DNA 기질을 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 5.
구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 무염기성 부위를 포함하는 이중 가닥 DNA 기질을 추가로 포함하는, 조성물.
구현예 6.
구현예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 이중 가닥 DNA 기질은 단일 가닥 영역을 포함하고, 상기 우라실 절단 부위 및 무염기성 부위는 이중 가닥 영역에 존재하는, 조성물.
구현예 7.
구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 복수의 증폭 부위를 포함하는 어레이를 추가로 포함하고, 여기서 각각의 증폭 부위는 증폭 부위에 부착된 복수의 이중 가닥 DNA 기질을 포함하는, 조성물.
구현예 8.
(a) 복수의 증폭 부위를 포함하는 어레이를 제공하는 단계로서, 상기 증폭 부위는,
(i) 증폭 부위에 부착된 복수의 포획 핵산으로서,
복수의 포획 핵산의 제1 집단은 절단 부위를 포함하는, 복수의 포획 핵산, 및
(ii) 복수의 클론 이중 가닥 변형 표적 핵산으로서,
각각의 이중 가닥 표적 핵산의 양 가닥은 5' 말단에서 포획 핵산에 부착되고,
하나의 가닥은 절단 부위를 포함하는 포획 핵산에 부착되고,
절단 부위는 각각의 이중 가닥 분자의 이중 가닥 영역에 위치하는, 복수의 클론 이중 가닥 변형 표적 핵산
을 포함하는 단계;
(b) 절단 부위에서 무염기성 부위를 생성하기 위한 적어도 하나의 효소 및 3'에서 5' 단일 가닥 DNA 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 엑소뉴클레아제를 포함하는 조성물과 상기 어레이를 접촉시키는 단계로서,
절단은 절단 부위에서 일어나고,
상기 절단은 이중 가닥 표적 핵산의 하나의 가닥을 증폭 부위에 부착된 제1 가닥 및 상기 증폭 부위에 부착되지 않은 제2 가닥으로 전환시키고;
유리 3' 말단을 포함하는 단일 가닥 포획 핵산은 엑소뉴클레아제에 의해 길이가 감소되는, 단계
를 포함하는, 서열분석 반응을 위한 핵산의 제조 방법.
구현예 9.
구현예 8에 있어서, 상기 절단 부위에서 무염기성 부위를 생성하기 위한 적어도 하나의 효소는 우라실 DNA 글리코실라제 및 엔도뉴클레아제를 포함하는 것인, 방법.
구현예 10.
구현예 8 또는 구현예 9에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 DNA 글리코실라제-리아제 엔도뉴클레아제 VIII인, 방법.
구현예 11.
구현예 8 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 상기 어레이로부터 절단 부위에서 무염기성 부위를 생성하기 위한 적어도 하나의 효소 및 엑소뉴클레아제를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
구현예 12.
구현예 8 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 절단된 이중 가닥 표적 핵산을 증폭 부위에 부착되지 않은 제2 가닥을 제거하는 조건에 적용하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
구현예 13.
구현예 8 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 제2 가닥을 제거하는 조건은 변성제를 포함하고, 여기서 변성제는 포획 핵산의 제2 집단에 공유적으로 부착된 표적 핵산을 포함하는 고정된 단일 가닥 핵산을 생성하고, 포획 핵산의 제2 집단은 증폭 부위에 부착되는 것인, 방법.
구현예 14.
구현예 8 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 변성제는 포름아미드를 포함하는 것인, 방법.
구현예 15.
구현예 8 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 고정된 단일 가닥 핵산을 포획 핵산의 제1 집단의 구성원에 재어닐링하여 고정된 부분 단일 가닥 핵산을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
구현예 16.
구현예 8 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 절단 부위는 각각의 이중 가닥 표적 핵산의 이중 가닥 영역의 포획 핵산 영역에 위치하는 것인, 방법.
구현예 17.
구현예 8 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 절단 부위는 우라실을 포함하고, 무염기성 부위는 우라실 DNA 글리코실라제에 의해 생성되고, 무염기성 부위는 엔도뉴클레아제에 의해 절단되는 것인, 방법.
구현예 18.
구현예 8 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 I인, 방법.
구현예 19.
구현예 8 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 서열분석 프라이머를 구현예 13의 고정된 단일 가닥 핵산 또는 구현예 15의 고정된 부분 단일 가닥 핵산의 단일 가닥 영역에 혼성화하여 서열분석 반응을 위한 단일 가닥 핵산을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
구현예 20.
구현예 8 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 서열분석 반응을 수행하여 고정된 단일 가닥 핵산 또는 고정된 부분 단일 가닥 핵산의 적어도 하나의 영역의 서열을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
구현예 21.
구현예 8 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 서열분석 반응은 합성에 의한 서열분석을 포함하는 것인, 방법.
구현예 22.
구현예 8 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 어레이는 포획 핵산을 증폭 프라이머로서 사용하여 복수의 표적 핵산을 증폭시킴으로써 생성되는 것인, 방법.
구현예 23.
구현예 8 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 증폭은 배제 증폭을 포함하는 것인, 방법.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 예시된다. 특정 실시예, 물질, 양 및 절차는 본 명세서에 제시된 바와 같은 본 발명의 범위 및 사상에 따라 광범위하게 해석되어야 한다.
실시예 1
일반 검정 방법 및 조건
달리 언급되지 않는 한, 이는 본 명세서에 기재된 실시예에 사용된 일반적인 검정 조건을 기재한다.
cBot(ILMN) 상의 v2.5 HiSeqX 플로우셀(ILMN)을 사용하여 실험을 실행하였다. 도 2에 대해, 플로우셀을 효소 활성을 시험하기 위한 기질로서 P5 및 P7 표면 프라이머를 사용하여 클러스터의 증폭 없이 사용하였다. 실험 동안 다양한 효소 혼합물을 플로우셀 내로 펌핑하고 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 엑소뉴클레아제 I 및 USER 효소는 모두 New England Biolabs에 의해 공급되었다. 인큐베이션 후, 플로우셀 레인을 HT2 세정 완충액 (Illumina)으로 세정한 후, HT1 혼성화 완충액 (Illumina)에서 형광단 TET-표지 P5' 및 P7' 올리고의 혼성화를 통해 표면 프라이머의 존재 또는 부재를 결정하였다. 형광 신호를 Typhoon 플랫베드 이미저 (GE Healthcare Life Sciences) 상에서 스캐닝함으로써 검출하였다.
도 3에 대해, 클러스터 시딩 및 증폭을 변성된 DNA 주형(인간 TruSeq Nano 라이브러리)을 ExAmp 혼합물 중 300 pM의 최종 농도로 혼합함으로써 달성하였고, 이것을 플로우셀 내로 펌핑하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 플로우셀의 상이한 레인을 차트에 상세히 설명된 바와 같이 효소 및 처리의 상이한 조합으로 처리하였다. "복구(repair)"는 엑소뉴클레아제 단계 동안 니블링(nibble)될 수 있는 가닥의 말단을 채우기 위해 보통 수행되는 3 사이클의 브릿지 증폭을 지칭한다. "USERExo"는 USER과 ExoI의 조합된 혼합물을 지칭한다. 이들 단계 후, 클러스터를 서열분석 프라이머와 혼성화시키고 표준 방법 및 시약 (ILMN)을 사용하여 HiSeqX 상에서 서열분석하였다.
실시예 2
엑소뉴클레아제 및 선형화 반응은 조합될 수 있다
게놈 서열분석에 사용될 수 있는 클러스터를 생성하기 위한 표준 방법은 표적 핵산을 클러스터에 혼성화시키는 단계, 상기 표적 핵산을 증폭시키는 단계 및 이어서 과량의 유리 표면 프라이머를 제거하기 위해 엑소뉴클레아제 I로 클러스터를 처리하는 단계를 포함한다. 별도의 단계에서, 고정된 가닥은 이중 가닥 DNA (dsDNA)의 특정 영역에 단일 뉴클레오타이드 갭을 생성함으로써 선형화되어 서열분석을 위한 주형을 생산한다. 본 발명자들은 엑소뉴클레아제 및 선형화 단계가 조합될 수 있는지 여부를 시험하였다. 부착된 표면 프라이머를 갖는 증폭 부위를 갖는 플로우셀의 레인을 엑소뉴클레아제 1, dsDNA의 특정 영역에 단일 뉴클레오타이드 갭을 생성하는 효소 (우라실 DNA 글리코실라제 및 DNA 글리코실라제-리아제 엔도뉴클레아제 VIII의 조합), 또는 이 둘의 조합으로 처리하였다.
도 2는 미처리(레인 1 및 8) 또는 우라실 DNA 글리코실라제 및 DNA 글리코실라제-리아제 엔도뉴클레아제 VIII에 의한 처리(레인 2)는 표면 프라이머의 손실을 초래하지 않지만, 엑소뉴클레아제 I에 의한 처리(레인 5)는 본질적으로 모든 표면 프라이머들의 손실을 초래함을 도시한다. 우라실 DNA 글리코실라제 및 DNA 글리코실라제-리아제 엔도뉴클레아제 VIII에 의한 처리 후 엑소뉴클레아제 I에 의한 처리(레인 3) 및 우라실 DNA 글리코실라제 및 DNA 글리코실라제-리아제 엔도뉴클레아제 VIII과 조합된 엑소뉴클레아제 혼합물에 의한 처리(레인 4)는 본질적으로 모든 표면 프라이머의 손실을 초래하였다. 이는, 우라실 DNA 글리코실라제 및 DNA 글리코실라제-리아제 엔도뉴클레아제 VIII의 조합으로 dsDNA를 처리하면 3' 포스페이트가 생성되고, 3' 포스페이트의 존재가 엑소뉴클레아제 I의 활성을 억제하는 것으로 알려져 있기 때문에 예상치 못한 놀라운 것이었다(Lehman 및 Nussbaum, 1964, J. Biol. Chem., 239: 2628-2636).
실시예 3
동시 엑소뉴클레아제 처리 및 선형화는 서열분석에 유용한 주형을 생성한다
DNA 글리코실라제 및 엑소뉴클레아제의 동시 사용이 서열분석 척도에 대해 임의의 유해한 효과를 갖는지를 결정하기 위해, DNA 글리코실라제 및 엑소뉴클레아제의 상이한 조합을 사용하여 생성된 클러스터를 함유하는 플로우셀 상에서 서열분석을 실행하였다. 각 실행의 품질 점수는 4차례로 결정되었고 도 3에 도시되어 있다. 예상한 바와 같이, P5 프라이머의 론(lawn)과의 서열 반응을 포함하는 표준 레인 (엑소뉴클레아제가 없고 복구가 없음)은 중간-50s에서 Q30 값을 가졌다 (도 3의 화살표 참조). 모든 다른 레인은 대략 동등하고, 단일 단계에서 DNA 글리코실라제 및 엑소뉴클레아제를 사용하는 반응은 대략 93%의 Q30을 갖는 최상의 R2 판독을 초래하였다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 공보, 및 전자적으로 이용가능한 자료 (예를 들어, GenBank 및 RefSeq에서의 뉴클레오타이드 서열 제출, 및 SwissProt, PIR, PRF, PDB에서의 아미노산 서열 제출 및 Genbank 및 Refseq에서의 주석이 달린 코딩 영역으로부터의 번역 포함)의 완전한 개시내용은 그 전문이 참고로 포함된다. 공보에서 참조된 보충 자료 (예컨대 보충 표, 보충 도면, 보충 자료 및 방법, 및/또는 보충 실험 데이터)도 마찬가지로 그 전문이 참조로 포함된다. 본원의 개시내용과 본 명세서에 참조로서 통합된 임의의 문서의 개시내용(들) 사이에 임의의 불일치가 존재하는 경우, 본원의 개시를 우선할 것이다. 전술한 상세한 설명 및 실시예은 단지 이해의 명확성을 위해 제공되었다. 이로부터 불필요한 제한이 이해되어서는 안 된다. 본 발명은 도시되고 기재된 정확한 세부 사항으로 제한되지 않으며, 통상의 기술자에게 명백한 변형이 청구범위에 의해 정의된 본 발명 내에 포함될 것이다.
달리 지시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 사용된 성분의 양, 분자량 등을 표현하는 모든 수는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 반대로 지시되지 않는 한, 명세서 및 특허청구범위에 제시된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 수득하고자 하는 목적하는 특성에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 적어도, 그리고 청구범위에 대한 등가물을 제한하기 위한 시도로서가 아니라, 각각의 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 숫자의 수를 고려하여 그리고 통상의 반올림 기법을 적용함으로써 해석되어야 한다.
본 발명의 넓은 범위를 기술하는 수치 범위 및 파라미터가 근사치임에도 불구하고, 특정 실시예에 제시된 수치는 가능한 한 정확하게 보고된다. 그러나, 모든 수치는 본질적으로 각각의 시험 측정에서 발견되는 표준 편차로부터 필연적으로 기인하는 범위를 포함한다.
모든 표제들은 독자의 편의를 위한 것이며, 별도로 명시되지 않는 한 표제에 이어지는 텍스트의 의미를 제한하는 데 사용되지 않아야 한다.

Claims (23)

  1. 우라실 DNA 글리코실라제,
    엔도뉴클레아제, 및
    3'에서 5' 단일 가닥 DNA 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 엑소뉴클레아제
    를 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 I인, 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 DNA 글리코실라제-리아제 엔도뉴클레아제 VIII인, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 우라실 절단 부위를 포함하는 이중 가닥 DNA 기질을 추가로 포함하는, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 무염기성 부위를 포함하는 이중 가닥 DNA 기질을 추가로 포함하는, 조성물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 이중 가닥 DNA 기질은 단일 가닥 영역을 포함하고, 상기 우라실 절단 부위 및 무염기성 부위는 이중 가닥 영역에 존재하는, 조성물.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 증폭 부위를 포함하는 어레이를 추가로 포함하고, 여기서 각각의 증폭 부위는 증폭 부위에 부착된 복수의 이중 가닥 DNA 기질을 포함하는, 조성물.
  8. (a) 복수의 증폭 부위를 포함하는 어레이를 제공하는 단계로서, 상기 증폭 부위는,
    (i) 증폭 부위에 부착된 복수의 포획 핵산으로서,
    복수의 포획 핵산의 제1 집단은 절단 부위를 포함하는, 복수의 포획 핵산, 및
    (ii) 복수의 클론 이중 가닥 변형 표적 핵산으로서,
    각각의 이중 가닥 표적 핵산의 양 가닥은 5' 말단에서 포획 핵산에 부착되고,
    하나의 가닥은 절단 부위를 포함하는 포획 핵산에 부착되고,
    절단 부위는 각각의 이중 가닥 분자의 이중 가닥 영역에 위치하는, 복수의 클론 이중 가닥 변형 표적 핵산
    을 포함하는 단계;
    (b) 절단 부위에서 무염기성 부위를 생성하기 위한 적어도 하나의 효소 및 3'에서 5' 단일 가닥 DNA 엑소뉴클레아제 활성을 포함하는 엑소뉴클레아제를 포함하는 조성물과 상기 어레이를 접촉시키는 단계로서,
    절단은 절단 부위에서 일어나고,
    상기 절단은 이중 가닥 표적 핵산의 하나의 가닥을 증폭 부위에 부착된 제1 가닥 및 상기 증폭 부위에 부착되지 않은 제2 가닥으로 전환시키고;
    유리 3' 말단을 포함하는 단일 가닥 포획 핵산은 엑소뉴클레아제에 의해 길이가 감소되는, 단계
    를 포함하는, 서열분석 반응을 위한 핵산의 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 절단 부위에서 무염기성 부위를 생성하기 위한 적어도 하나의 효소는 우라실 DNA 글리코실라제 및 엔도뉴클레아제를 포함하는 것인, 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 DNA 글리코실라제-리아제 엔도뉴클레아제 VIII인, 방법.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어레이로부터 절단 부위에서 무염기성 부위를 생성하기 위한 적어도 하나의 효소 및 엑소뉴클레아제를 제거하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 절단된 이중 가닥 표적 핵산을 증폭 부위에 부착되지 않은 제2 가닥을 제거하는 조건에 적용하는 것을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 제2 가닥을 제거하는 조건은 변성제를 포함하고, 여기서 변성제는 포획 핵산의 제2 집단에 공유적으로 부착된 표적 핵산을 포함하는 고정된 단일 가닥 핵산을 생성하고, 포획 핵산의 제2 집단은 증폭 부위에 부착되는 것인, 방법.
  14. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변성제는 포름아미드를 포함하는 것인, 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고정된 단일 가닥 핵산을 포획 핵산의 제1 집단의 구성원에 재어닐링하여 고정된 부분 단일 가닥 핵산을 생성하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  16. 제8항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 부위는 각각의 이중 가닥 표적 핵산의 이중 가닥 영역의 포획 핵산 영역에 위치하는 것인, 방법.
  17. 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 절단 부위는 우라실을 포함하고, 무염기성 부위는 우라실 DNA 글리코실라제에 의해 생성되고, 무염기성 부위는 엔도뉴클레아제에 의해 절단되는 것인, 방법.
  18. 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 I인, 방법.
  19. 제13항 또는 제15항에 있어서, 서열분석 프라이머를 제13항의 고정된 단일 가닥 핵산 또는 제15항의 고정된 부분 단일 가닥 핵산의 단일 가닥 영역에 혼성화하여 서열분석 반응을 위한 단일 가닥 핵산을 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 서열분석 반응을 수행하여 고정된 단일 가닥 핵산 또는 고정된 부분 단일 가닥 핵산의 적어도 하나의 영역의 서열을 결정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
  21. 제19항에 있어서, 상기 서열분석 반응은 합성에 의한 서열분석을 포함하는 것인, 방법.
  22. 제8항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 어레이는 포획 핵산을 증폭 프라이머로서 사용하여 복수의 표적 핵산을 증폭시킴으로써 생성되는 것인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 증폭은 배제 증폭을 포함하는 것인, 방법.
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