ES2802405T3 - Métodos y matrices para producir y secuenciar agrupaciones monoclonales de ácido nucleico - Google Patents

Métodos y matrices para producir y secuenciar agrupaciones monoclonales de ácido nucleico Download PDF

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Abstract

Una micromatriz que comprende: a) un sustrato que comprende al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo; b) una primera capa que cubre al menos parcialmente la superficie interna del pocillo y que comprende al menos un primer par de cebadores de captura; y c) una segunda capa que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo, en donde el primer par de cebadores de captura en la primera capa está presente y es funcional en un ensayo de exclusión cinética (KEA) después de que se haya proporcionado la segunda capa.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y matrices para producir y secuenciar agrupaciones monoclonales de ácido nucleico
Campo
La presente descripción se refiere al campo de la biología molecular y más específicamente a métodos para capturar y amplificar polinucleótidos diana sobre una superficie sólida.
Antecedentes
La secuenciación de nueva generación ha permitido la secuenciación del genoma completo y el análisis del genoma completo. Los métodos de secuenciación de nueva generación a menudo se basan en la amplificación universal de fragmentos genómicos que primero están equipados con regiones de amplificación universal y a continuación son capturados indiscriminadamente por cebadores de captura universales sobre una superficie sólida. Los cebadores de captura universales median tanto la captura de polinucleótidos como la amplificación de puente, un elemento útil en los métodos de secuenciación de nueva generación (véanse, p. ej., los documentos WO 2011/025477 A1, US 2011/0172119 A1).
Si bien muchos métodos actuales pueden apoyar eficazmente la secuenciación de genomas completos, generalmente no permiten la captura dirigida de polinucleótidos específicos y, por lo tanto, generalmente no admiten, por ejemplo, la secuenciación dirigida de genomas parciales. Sin embargo, existe una creciente necesidad de métodos que faciliten la secuenciación dirigida, por ejemplo, de fracciones específicas de un exoma o transcriptoma de un organismo. Esta necesidad se debe en parte al coste, pero también a consideraciones de manejo de datos. El documento WO 2014/133905 describe una matriz utilizada en técnicas de secuenciación. El documento WO2015/095291 publicado el 25-06-2015 es un documento relevante de acuerdo con el Artículo 54(3) EPC y revela sustratos con superficies de nano-patrones y una capa funcionalizable.
Por lo tanto, existe la necesidad de nuevos métodos que permitan la secuenciación dirigida de nueva generación de genomas parciales. La presente descripción aborda esta necesidad proporcionando métodos para modificar cebadores de captura inmovilizados sobre una superficie. También se proporcionan las ventajas relacionadas. Compendio
En la presente memoria se proporcionan micromatrices y métodos para modificar cebadores de captura inmovilizados. En un aspecto, en la presente memoria se proporciona una micromatriz que incluye: a) un sustrato que incluye al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo; b) una primera capa que cubre la superficie interna del pocillo e incluye al menos un primer par de cebadores de captura; y c) una segunda capa que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo, en donde el primer par de cebadores de captura en la primera capa está presente y es funcional después de que se haya proporcionado la segunda capa.
En algunas realizaciones, el diámetro del pocillo es inferior a aproximadamente 1 gm.
En algunas realizaciones, el diámetro del pocillo es de aproximadamente 400 nm.
En algunas realizaciones, el al menos un primer par de cebadores de captura es una pluralidad de primeros pares de cebadores de captura.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un primer par de cebadores de captura incluyen una región de captura universal.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un primer par de cebadores de captura incluyen adicionalmente un sitio de unión al cebador de secuenciación (SBS).
En algunas realizaciones, la segunda capa incluye al menos un segundo par de cebadores de captura.
En algunas realizaciones, el al menos un segundo par de cebadores de captura es una pluralidad de segundos pares de cebadores de captura.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura están bloqueados en el extremo 3’.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura tienen terminación de 3’-fosfato.
En algunas realizaciones, los cebadores terminados en 3’-fosfato del al menos un segundo par de cebadores de captura incluyen una región de captura universal.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura no están bloqueados en el extremo 3’.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura incluyen una región de captura universal.
En algunas realizaciones, una pluralidad de cebadores de captura de la pluralidad de primeros pares de cebadores de captura está anclada a un polinucleótido diana.
En algunas realizaciones, la pluralidad de polinucleótidos diana forma una población monoclonal de polinucleótidos diana en el al menos un pocillo.
En algunas realizaciones, el al menos un pocillo incluye una pluralidad de pocillos y en donde dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos incluyen una población monoclonal de polinucleótidos diana.
En algunas realizaciones, los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos incluyen una población monoclonal del mismo polinucleótido diana.
En algunas realizaciones, los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos incluyen una población monoclonal de dos o más polinucleótidos diana diferentes.
En algunas realizaciones, el al menos un primer par de cebadores de captura es una pluralidad de primeros pares de cebadores de captura y el al menos un segundo par de cebadores de captura es una pluralidad de segundos pares de cebadores de captura, y en donde una pluralidad de cebadores de la pluralidad de primeros pares de cebadores de captura y la pluralidad de segundos pares de cebadores de captura están ancladas a una pluralidad de polinucleótidos diana.
En algunas realizaciones, la pluralidad de polinucleótidos diana forma una población monoclonal de polinucleótidos diana en el al menos un pocillo.
En algunas realizaciones, el al menos un pocillo es una pluralidad de pocillos y en donde dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos incluyen una población monoclonal de polinucleótidos diana.
En algunas realizaciones, los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos incluyen una población monoclonal del mismo polinucleótido diana.
En algunas realizaciones, los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos incluyen una población monoclonal de dos o más polinucleótidos diana diferentes.
En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona una micromatriz que incluye: a) un sustrato que incluye al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo; y b) una capa que cubre la superficie interna del pocillo e incluye al menos un primer par de cebadores de captura y al menos un segundo par de cebadores de captura.
En algunas realizaciones, la micromatriz de la reivindicación 38, en donde el diámetro del pocillo es de aproximadamente 1 pm o más.
En algunas realizaciones, el al menos un primer par de cebadores de captura es una pluralidad de primeros pares de cebadores de captura.
En algunas realizaciones, el al menos un segundo par de cebadores de captura es una pluralidad de segundos pares de cebadores de captura.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un primer par de cebadores de captura incluyen una región de captura universal.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura incluyen una región de captura universal y un SBS.
En algunas realizaciones, el al menos un primer par de cebadores de captura es una pluralidad de primeros pares de cebadores de captura y el al menos un segundo par de cebadores de captura es una pluralidad de segundos pares de cebadores de captura, y en donde una pluralidad de cebadores de la pluralidad de primeros pares de cebadores de captura y la pluralidad de segundos pares de cebadores de captura están ancladas a una pluralidad de polinucleótidos diana.
En algunas realizaciones, la pluralidad de polinucleótidos diana forma una población monoclonal de polinucleótidos diana en el al menos un pocillo.
En algunas realizaciones, el al menos un pocillo es una pluralidad de pocillos y en donde dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos incluyen una población monoclonal de polinucleótidos diana.
En algunas realizaciones, los dos o más pocilios de la pluralidad de pocilios incluyen cada uno una población monoclonal del mismo polinucleótido diana.
En algunas realizaciones, los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos incluyen una población monoclonal de dos o más polinucleótidos diana diferentes.
En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria un método para amplificar un ácido nucleico, que incluye: a) producir una primera capa sobre un sustrato, en donde el sustrato incluye al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo, en donde la primera capa cubre la superficie interna del pocillo; b) depositar al menos un primer par de cebadores de captura en la primera capa; c) producir una segunda capa sobre el sustrato que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo, en donde el primer par de cebadores de captura en la primera capa está presente y es funcional después de que se haya proporcionado la segunda capa; d) poner en contacto una muestra que incluye una pluralidad de polinucleótidos diana con el sustrato en condiciones suficientes para que un polinucleótido diana hibride con un cebador de captura del al menos un primer par de cebadores de captura, y e) realizar un primer ensayo de exclusión cinética (KEA) para producir una población clonal de amplicones a partir del polinucleótido diana dentro del pocillo, amplificando así el polinucleótido diana.
En algunas realizaciones, la muestra que incluye la pluralidad de polinucleótidos diana se pone en contacto con el sustrato en condiciones suficientes para que un único polinucleótido diana por pocillo hibride con un cebador de captura del al menos un primer par de cebadores de captura.
En algunas realizaciones, el primer KEA produce una población monoclonal de amplicones a partir de un único polinucleótido diana hibridado con un cebador de captura en al menos un pocillo.
En algunas realizaciones, el al menos un pocillo es una pluralidad de pocillos y se produce una población monoclonal de amplicones a partir de un único polinucleótido diana en dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos.
En algunas realizaciones, se produce una población monoclonal de amplicones a partir del mismo polinucleótido diana único en los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos.
En algunas realizaciones, se produce una población monoclonal de amplicones a partir de dos o más polinucleótidos diana únicos en los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos.
En algunas realizaciones, el al menos un primer par de cebadores de captura es una pluralidad de primeros pares de cebadores de captura.
En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente depositar al menos un segundo par de cebadores de captura en la segunda capa.
En algunas realizaciones, el al menos un segundo par de cebadores de captura es una pluralidad de segundos pares de cebadores de captura.
En algunas realizaciones, el al menos un segundo par de cebadores de captura se deposita antes de realizar el primer KEA.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un primer par de cebadores de captura incluyen una región de captura universal.
En algunas realizaciones, la pluralidad de polinucleótidos diana está flanqueada por una o más regiones de captura universal complementarias.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura están bloqueados en el extremo 3’.
En algunas realizaciones, los cebadores bloqueados en 3’ incluyen una región de captura universal.
En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente desbloquear los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura después de realizar el primer KEA.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura se desbloquean utilizando quinasa T4.
En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente realizar la amplificación de puente o un segundo KEA para aumentar la población clonal de amplicones de polinucleótidos diana.
En algunas realizaciones, los cebadores del primer par de cebadores de captura incluyen adicionalmente un SBS. En algunas realizaciones, la pluralidad de polinucleótidos diana está flanqueada por uno o más SBS complementarios. En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura se desbloquean en el extremo 3’.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores incluyen una región de captura universal.
En algunas realizaciones, el primer KEA se realiza durante un período de tiempo prolongado para aumentar la población clonal de amplicones más allá del al menos un pocillo.
En algunas realizaciones, el al menos un segundo par de cebadores de captura se deposita después de realizar el primer KEA.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un primer par de cebadores de captura y el al menos un segundo par de cebadores de captura incluyen una región de captura universal.
En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente realizar la amplificación de puente o un segundo KEA para aumentar la población clonal de amplicones de polinucleótidos diana más allá del al menos un pocillo.
En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria un método para amplificar un ácido nucleico, que incluye: a) producir una primera capa sobre un sustrato, en donde el sustrato incluye al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna de pocillo, en donde la primera la capa cubre al menos parcialmente la superficie interna del pocillo; b) depositar al menos un primer par de cebadores de captura en la primera capa, en donde el primer par de cebadores de captura incluye una pluralidad de primeros cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una pluralidad de segundos cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®; c) producir una segunda capa sobre el sustrato que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo; d) depositar al menos un segundo par de cebadores de captura en la segunda capa, en donde el segundo par de cebadores de captura está terminado en 3’-fosfato e incluye una pluralidad de primeros cebadores de captura que incluyen una porción 3' que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y un pluralidad de segundos cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®; e) poner en contacto una muestra que incluye una pluralidad de polinucleótidos diana con el sustrato en condiciones suficientes para que un único polinucleótido diana por pocillo hibride con un cebador del al menos un primer par de cebadores de captura, en donde los polinucleótidos diana están flanqueados por regiones cebadoras universales complementarias incluyendo cada una una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina®’ complementaria o una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®' complementaria; f) realizar un primer KEA para producir una población monoclonal de amplicones a partir del polinucleótido diana único dentro del al menos un pocillo, amplificando así el polinucleótido diana; g) poner en contacto el sustrato con una quinasa T4 para desbloquear los cebadores del segundo par de cebadores, y h) realizar la amplificación de puente o un segundo KEA para aumentar la población monoclonal de amplicones del polinucleótido diana único más allá del pocillo.
En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria un método para amplificar un ácido nucleico, que incluye: a) producir una primera capa sobre un sustrato, en donde el sustrato incluye al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo, en donde la primera capa cubre al menos parcialmente la superficie interna del pocillo; b) depositar al menos un primer par de cebadores de captura en la primera capa, en donde el primer par de cebadores de captura incluye una pluralidad de al menos un primer cebador de captura que incluye una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3 de Illumina® y una pluralidad de al menos un segundo cebador de captura que incluye una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS8 de Illumina®; c) producir una segunda capa sobre el sustrato que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo; d) depositar al menos un segundo par de cebadores de captura en la segunda capa, en donde el al menos un segundo par de cebadores de captura incluye una pluralidad de primeros cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una pluralidad de segundos cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos P7 de Illumina®; e) poner en contacto una muestra que incluye una pluralidad de polinucleótidos diana con el sustrato en condiciones suficientes para que un único polinucleótido diana por pocillo hibride con un cebador del al menos un primer par de cebadores de captura, en donde la pluralidad de polinucleótidos diana está flanqueada por un SBS complementario, cada uno de los cuales incluye una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3 de Illumina®' complementaria o una secuencia de nucleótidos SBS8 de Illumina®' complementaria, y f) realizar un KEA durante un tiempo prolongado para producir una población monoclonal de amplicones a partir del polinucleótido diana único dentro y fuera del al menos un pocillo, amplificando así el polinucleótido diana único dentro del pocillo y aumentando la población monoclonal de polinucleótidos diana más allá del al menos un pocillo.
En otro aspecto, en la presente memoria se proporciona un método para amplificar un ácido nucleico, que incluye: a) producir una primera capa sobre un sustrato, en donde el sustrato incluye al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo, en donde la primera capa cubre al menos parcialmente la superficie interna del pocillo; b) depositar al menos un primer par de cebadores de captura en la primera capa, en donde el primer par de cebadores incluye una pluralidad de primeros cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una pluralidad de segundos cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®; c) producir una segunda capa sobre el sustrato que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo; d) poner en contacto una muestra que incluye una pluralidad de polinucleótidos diana con el sustrato en condiciones suficientes para que un único polinucleótido diana por pocillo hibride con un cebador del al menos un primer par de cebadores de captura, en donde la pluralidad de polinucleótidos está flanqueada por regiones de cebadores universales complementarios que incluyen cada una una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina®’ complementaria o una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®’ complementaria ; e) realizar un primer KEA para producir una población monoclonal de amplicones a partir del polinucleótido diana único dentro del al menos un pocillo, amplificando así el polinucleótido diana; f) depositar al menos un segundo par de cebadores de captura en la segunda capa, en donde el al menos un segundo par de cebadores de captura incluye una pluralidad de primeros cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una pluralidad de segundos cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®, y g) realizar una amplificación de puente o un segundo KEA para aumentar la población monoclonal de amplicones del polinucleótido diana único.
En otro aspecto, se proporciona en la presente memoria un método para amplificar un ácido nucleico, que incluye: a) producir una capa sobre un sustrato, en donde el sustrato incluye al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo, en donde el pocillo tiene un diámetro de aproximadamente 1 gm o más y en donde la capa cubre al menos parcialmente la superficie interna del pocillo; b) depositar al menos un primer par de cebadores de captura y al menos un segundo par de cebadores de captura en la capa, en donde la densidad del cebador del al menos un primer par de cebadores de captura es mayor que la densidad del cebador del al menos el segundo par de cebadores; c) poner en contacto una muestra que incluye una pluralidad de polinucleótidos diana con el sustrato en condiciones suficientes para que un único polinucleótido diana por pocillo hibride con el segundo cebador, y d) realizar un KEA para producir una población monoclonal de amplicones a partir del polinucleótido diana único hibridado al segundo cebador dentro del pocillo, amplificando así el polinucleótido diana único.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, se proporciona en la presente memoria un método para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluye: a) poner en contacto un sustrato que incluye una pluralidad de cebadores de captura inmovilizados con una pluralidad de ácidos nucleicos molde en condiciones suficientes para que la hibridación produzca uno o más ácidos nucleicos molde inmovilizados, en donde la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados incluye una primera pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 5'-terminal Y y una segunda pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Z, y en donde cada ácido nucleico molde está flanqueado por las regiones de captura universal 5' terminal y 3’ terminal Y o Z e incluye uno o más sitios de restricción y la región de captura específica de la diana entre la región de captura universal 5' terminal y los uno o más sitios de restricción o entre la región de captura universal 3’-terminal y los uno o más sitios de restricción, y b) extender uno o más cebadores de captura inmovilizados para producir uno o más productos de extensión inmovilizados complementarios a uno o más ácidos nucleicos molde.
A continuación, el término "realización" se puede referir a realizaciones de la descripción fuera del alcance de la invención reivindicada o a realizaciones de la invención reivindicada. En algunas realizaciones, la región de captura específica de la diana de cada ácido nucleico molde se encuentra entre la región de captura universal 5' terminal y los uno o más sitios de restricción.
En algunas realizaciones, cada ácido nucleico molde incluye dos sitios de restricción y una región espaciadora entre los dos sitios de restricción.
En algunas realizaciones, los dos sitios de restricción son sitios SapI.
En algunas realizaciones, la región espaciadora incluye aproximadamente 150 bases.
En algunas realizaciones, el sustrato es una celda de flujo modelada que incluye una pluralidad de paneles.
En algunas realizaciones, cada panel incluye una primera pluralidad de cebadores de captura universales inmovilizados que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Y y una segunda pluralidad de cebadores de captura universales inmovilizados que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Z.
En algunas realizaciones, se produce un único producto de extensión inmovilizado por panel de la pluralidad de paneles.
En algunas realizaciones, el producto de extensión inmovilizado único producido por panel es complementario al mismo ácido nucleico molde en todos los paneles de la pluralidad de paneles.
En algunas realizaciones, el producto de extensión inmovilizado individual producido por panel es complementario a dos o más ácidos nucleicos molde diferentes en dos o más paneles de la pluralidad de paneles.
En algunas realizaciones, el producto de extensión inmovilizado único producido por panel es complementario a diferentes ácidos nucleicos molde en cada uno de al menos 1%, al menos 3%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de paneles de la pluralidad de paneles.
En algunas realizaciones, se produce un único producto de extensión inmovilizado en más de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 99% de los paneles.
En algunas realizaciones, se produce un único producto de extensión inmovilizado en menos de 100%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, o 1% de los paneles.
En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) los uno o más productos de extensión inmovilizados para producir una o más agrupaciones monoclonales de ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados.
En algunas realizaciones, la amplificación por PCR incluye la amplificación de puente o un KEA.
En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente poner en contacto las una o más agrupaciones monoclonales de ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados con una enzima de restricción para cortar los uno o más sitios de restricción en una pluralidad de ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos de doble hebra inmovilizados que incluyen una región de captura universal y una región de captura específica de la diana y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados de inmovilizados doble hebra.
En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente desnaturalizar térmicamente la pluralidad de cebadores de captura quiméricos de doble hebra inmovilizados y cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de doble hebra para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados de hebra sencilla y cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de hebra sencilla.
En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente poner en contacto la pluralidad de cebadores de captura quiméricos de doble hebra inmovilizados y cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de doble hebra con una exonucleasa de ácido desoxirribonucleico de doble hebra (ADNdh) 5'-3' para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados de hebra sencilla y cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de hebra sencilla.
En algunas realizaciones, el sustrato es una celda de flujo modelada que incluye una pluralidad de paneles.
En algunas realizaciones, cada panel incluye una primera pluralidad de cebadores de captura que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Y y una segunda pluralidad de cebadores de captura universales que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Z.
En algunas realizaciones, más de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de los cebadores de captura, que incluyen la región de captura universal 3’-terminal Y se convierte en cebadores de captura quiméricos inmovilizados de hebra sencilla en uno o más paneles de la pluralidad de paneles.
En algunas realizaciones, más de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de los cebadores de captura, que incluyen la región de captura universal 3’-terminal Z se convierte en cebadores de captura quiméricos inmovilizados de hebra sencilla en uno o más paneles de la pluralidad de paneles.
En algunas realizaciones, más de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de los cebadores de captura, que incluyen la región de captura universal 3’-terminal Y se convierte en cebadores de captura quiméricos inmovilizados de hebra sencilla y más de 1 %, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de los cebadores de captura, que incluyen la región de captura universal 3’-terminal Z, se convierte en cebadores de captura quiméricos inmovilizados de hebra sencilla en uno o más paneles de la pluralidad de paneles.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, se proporciona en la presente memoria un método para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluye: a) poner en contacto un sustrato que incluye una pluralidad de cebadores de captura inmovilizados con una pluralidad de ácidos nucleicos molde en condiciones suficientes para la hibridación para producir uno o más ácidos nucleicos molde inmovilizados, en donde la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados incluye una primera pluralidad de cebadores que incluyen una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® 3’-terminal y una segunda pluralidad de cebadores que incluyen una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina® 3’-terminal, y en donde cada ácido nucleico molde está flanqueado por una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina®’ complementario 3’-terminal y una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®' complementario 5'-terminal, e incluye dos sitios de restricción SapI, una región espaciadora entre los sitios de restricción SapI y una región de captura específica de la diana entre la secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina®’ complementario 3’-terminal y los sitios de restricción SapI; y b) extender uno o más cebadores de captura inmovilizados para producir uno o más productos de extensión inmovilizados complementarios a uno o más ácidos nucleicos molde; c) amplificar los uno o más productos de extensión inmovilizados mediante amplificación de puente o KEA para producir una o más agrupaciones monoclonales de ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados; d) poner en contacto las una o más agrupaciones monoclonales de ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados con SapI para cortar los dos sitios de restricción en una pluralidad de ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos de doble hebra inmovilizados, que incluyen la secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y la región de captura específica de la diana y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados de doble hebra inmovilizados, que incluyen la secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®, y e) opcionalmente, poner en contacto la pluralidad de cebadores de captura quiméricos de doble hebra inmovilizados y cebadores de captura universales regenerados de doble hebra inmovilizados con una ADNdh exonucleasa 5'-3' para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos de hebra sencilla inmovilizados y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados de hebra sencilla inmovilizados.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, se proporciona en la presente memoria un método para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluye: a) poner en contacto un sustrato que incluye una pluralidad de cebadores de captura inmovilizados con una pluralidad de ácidos nucleicos molde en condiciones suficientes para la hibridación para producir uno o más ácidos nucleicos molde inmovilizados, en donde la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados incluye una primera pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Y y una segunda pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Z, y en donde cada ácido nucleico molde está flanqueado por una región de captura universal 5'-terminal y 3’-terminal Y o Z e incluye uno o más sitios de restricción y una región de captura específica de la diana entre los uno o más sitios de restricción y la región de captura universal 3’-terminal; b) extender uno o más cebadores de captura inmovilizados para producir uno o más productos de extensión inmovilizados complementarios a uno o más ácidos nucleicos molde; c) amplificar los uno o más productos de extensión inmovilizados por PCR para producir una o más agrupaciones monoclonales de ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados; d) poner en contacto las una o más agrupaciones monoclonales de ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados con una enzima de restricción para cortar los uno o más sitios de restricción en una pluralidad de los ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados para producir una pluralidad cebadores de captura quiméricos de doble hebra inmovilizados que incluyen la región de captura universal Z y la región de captura específica de la diana y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados de doble hebra inmovilizados que incluyen la región de captura universal Y.
En algunas realizaciones, la amplificación de uno o más productos de extensión inmovilizados incluye la amplificación de puente o KEA.
En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente desnaturalizar la pluralidad de cebadores de captura quiméricos de doble hebra inmovilizados y la pluralidad de cebadores de captura universales regenerados de doble hebra inmovilizados para formar una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados de hebra sencilla y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de hebra sencilla.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico molde incluye adicionalmente un SBS entre la porción específica de la diana y la porción 3’.
En algunas realizaciones, la pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados incluye un sitio de restricción parcial 3’-terminal.
En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente eliminar el sitio de restricción parcial 3’-terminal de la pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados.
En algunas realizaciones, la pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados incluye un sitio de escisión predeterminado.
En algunas realizaciones, el sitio de escisión predeterminado incluye un conector diólico, una 8-oxoguanina (8-oxo-G), una base de uracilo, un ribonucleótido, un nucleótido metilado o un péptido.
En algunas realizaciones, la eliminación del sitio de restricción parcial incluye una escisión química no enzimática.
En algunas realizaciones, la escisión química no enzimática incluye un tratamiento con peryodato, un tratamiento con iones de metales de tierras raras, un tratamiento con álcali o una reacción fotoquímica.
En algunas realizaciones, la eliminación del sitio de restricción parcial 3’-terminal incluye una escisión enzimática.
En algunas realizaciones, la escisión enzimática incluye una escisión por uracilo-ADN glicosilasa, una escisión por endonucleasa, un tratamiento con ribonucleasa (ARNasa), una escisión por enzima de restricción o una escisión por proteasa.
En algunas realizaciones, la eliminación del sitio de restricción parcial 3’-terminal incluye la hibridación de un oligonucleótido complementario inverso al cebador de captura universal regenerado inmovilizado de hebra sencilla para formar una región de captura universal de doble hebra Y.
En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente hibridar un oligonucleótido complementario inverso con el cebador de captura quimérico inmovilizado de hebra sencilla para formar un cebador de captura quimérico inmovilizado de doble hebra.
En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente poner en contacto el sustrato con una nucleasa para eliminar el sitio de restricción parcial 3’-terminal.
En algunas realizaciones, la nucleasa es una exonucleasa I.
En algunas realizaciones, la región de captura específica de la diana 3’-terminal de los cebadores de captura quiméricos de doble hebra inmovilizados se trunca.
En algunas realizaciones, cada ácido nucleico molde incluye una región de captura universal 5'-terminal Y, una región de captura universal 3’-terminal Z, una porción central que incluye un primer y un segundo sitios de restricción y una región espaciadora entre el primer y el segundo sitios de restricción y una región de captura específica de la diana entre la porción central y la región de captura universal 3’-terminal Z.
En algunas realizaciones, cada ácido nucleico molde incluye adicionalmente un SBS entre la región específica de la diana y la región de captura universal 3’-terminal Z.
En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente: e) poner en contacto una muestra de ácido nucleico que incluye una pluralidad de polinucleótidos diana con al menos un cebador en condiciones suficientes para la hibridación, incluyendo dicho al menos un cebador un adaptador; f) amplificar por PCR dicha pluralidad de polinucleótidos diana para producir una pluralidad de amplicones; g) poner en contacto directamente una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados con dicha pluralidad de amplicones en condiciones suficientes para que la hibridación produzca una primera pluralidad de amplicones inmovilizados; h) extender la pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados para producir una pluralidad de productos de extensión inmovilizados complementarios a dichos polinucleótidos diana, e i) amplificar por PCR dicha pluralidad de productos de extensión inmovilizados para producir una segunda pluralidad de amplicones inmovilizados, en donde dicha población de amplicones inmovilizados incluye una uniformidad del 85% o más.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, se proporciona en la presente memoria un método para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluye: a) poner en contacto una pluralidad de cebadores de captura universales inmovilizados sobre un sustrato con una pluralidad de ácidos nucleicos molde en condiciones suficientes para que la hibridación produzca uno o más ácidos nucleicos molde inmovilizados, en donde la pluralidad de cebadores de captura universales incluye una primera pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Y y una segunda pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Z, en donde cada ácido nucleico molde incluye una región de captura universal 5'-terminal Y, una región de captura universal 3’-terminal Z, una región de captura específica de la diana, un sitio de restricción entre la región de captura universal 5'-terminal Y y la región de captura específica de la diana, y un SBS entre la región de captura universal 3’-terminal Z y la porción de captura específica de la diana; b) extender uno o más cebadores de captura universales para producir uno o más productos de extensión inmovilizados complementarios a uno o más ácidos nucleicos molde inmovilizados; c) amplificar los uno o más productos de extensión inmovilizados mediante amplificación de puente o KEA para producir uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados; d) poner en contacto las una o más agrupaciones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados con una enzima de restricción para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados que incluyen una región de captura universal Z y la región de captura específica de la diana y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados que incluyen una región de captura universal Y y un sitio de restricción parcial.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, se proporciona en la presente memoria un método para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluye: a) poner en contacto una pluralidad de cebadores de captura universales inmovilizados sobre un sustrato con una pluralidad de ácidos nucleicos molde en condiciones suficientes para que la hibridación produzca uno o más ácidos nucleicos molde inmovilizados, en donde la pluralidad de cebadores de captura universales incluye una primera pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Y y un primer sitio de escisión predeterminado y una segunda pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Z y una porción 5' que incluye un segundo sitio de escisión predeterminado, en donde cada ácido nucleico molde incluye una región de captura universal 5’-terminal Y, una región de captura universal 3’-terminal Z, una región de captura específica de la diana, un sitio de restricción entre la región de captura universal 5'-terminal Y y la región de captura específica de la diana, y un SBS entre la región de captura universal 3’-terminal Z y la región de captura específica de la diana; b) extender uno o más cebadores de captura universales para producir uno o más productos de extensión inmovilizados complementarios a uno o más ácidos nucleicos molde; c) amplificar los uno o más productos de extensión inmovilizados mediante amplificación de puente o KEA para producir uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados; d) poner en contacto los uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados con una enzima de restricción para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados que incluyen la región de captura universal Z y la región de captura específica de la diana y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados que incluyen región de captura universal Y y un sitio de restricción parcial; e) eliminar el sitio de restricción parcial de la pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados a través de la escisión en el primer sitio de escisión predeterminado.
En algunas realizaciones, el primer sitio de escisión predeterminado incluye una base de uracilo y el segundo sitio de escisión predeterminado incluye un conector diólico.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, se proporciona en la presente memoria un método para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluye: a) poner en contacto una pluralidad de cebadores de captura universales inmovilizados sobre un sustrato con una pluralidad de ácidos nucleicos molde en condiciones suficientes para que la hibridación produzca uno o más ácidos nucleicos molde inmovilizados, en donde la pluralidad de cebadores de captura universales incluye una primera pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Y y una segunda pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Z, en donde cada ácido nucleico molde incluye una región de captura universal 5'-terminal Y, una región de captura universal 3’-terminal Z, una porción central que incluye un primer y un segundo sitios de restricción y una región espaciadora entre el primer y el segundo sitios de restricción, y una región específica de la diana entre la porción central y la región de captura universal 3’-terminal Z; b) extender uno o más cebadores de captura universales de la pluralidad de cebadores de captura universales para producir uno o más productos de extensión inmovilizados complementarios a uno o más ácidos nucleicos molde; c) amplificar los uno o más productos de extensión inmovilizados mediante amplificación de puente o KEA para producir uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados, y d) poner en contacto los uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados con una enzima de restricción para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados que incluyen una región de captura universal Z y una región de captura específica de la diana y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados que incluyen una región de captura universal Y.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, se proporciona en la presente memoria un método para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluye: a) poner en contacto una pluralidad de cebadores de captura universales inmovilizados sobre un sustrato con una pluralidad de ácidos nucleicos molde en condiciones suficientes para que la hibridación produzca uno o más ácidos nucleicos molde inmovilizados, en donde la pluralidad de los cebadores de captura universales incluye la primera pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Y y una segunda pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Z, en donde cada ácido nucleico molde incluye una región de captura universal 5'-terminal Y, una región de captura universal 3’-terminal Z, una región de captura específica de la diana y un sitio de restricción entre la región de captura universal 5'-terminal Y y la región de captura específica de la diana; b) extender uno o más cebadores de captura universales de la pluralidad de cebadores de captura universales para producir uno o más productos de extensión inmovilizados complementarios a uno o más ácidos nucleicos molde; c) amplificar los uno o más productos de extensión inmovilizados mediante amplificación de puente o KEA para producir uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados; d) poner en contacto los uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados con una enzima de restricción para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados de doble hebra que incluyen una región de captura universal Z y una región de captura específica de la diana y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de doble hebra que incluyen una región de captura universal Y y un sitio de restricción parcial de hebra sencilla; e) desnaturalizar la pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados de doble hebra y la pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de doble hebra para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados de hebra sencilla y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de hebra sencilla; f) hibridar el oligonucleótido complementario inverso con la pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados de hebra sencilla y los cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de hebra sencilla para formar regiones de captura universales de doble hebra y regiones específicas de la diana de doble hebra, y g) poner en contacto la superficie con exonucleasa I para eliminar el sitio de restricción parcial de hebra sencilla de la pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de doble hebra.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, se proporciona en la presente memoria un método para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluye: a) poner en contacto una pluralidad de cebadores de captura universales inmovilizados sobre un sustrato con una pluralidad de ácidos nucleicos molde en condiciones suficientes para que la hibridación produzca uno o más ácidos nucleicos molde inmovilizados, en donde la pluralidad de cebadores de captura universales incluye una primera pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Y, y una segunda pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Z y una tercera pluralidad de cebadores que incluyen una región 3’-terminal X y una porción 5' que incluye un sitio de escisión predeterminado, en donde cada ácido nucleico molde incluye una región X terminal 5', una región de captura universal 3’-terminal Z, un región de captura específica de la diana y un sitio de restricción entre la región X y la región de captura específica de la diana; b) extender uno o más cebadores de captura universales para producir uno o más productos de extensión inmovilizados complementarios a uno o más ácidos nucleicos molde; c) amplificar los uno o más productos de extensión inmovilizados mediante amplificación de puente o KEA para producir uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados; d) poner en contacto los uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados con una enzima de restricción para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados que incluyen una región de captura universal Z y una región de captura específica de la diana y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados que incluyen un región X y un sitio de restricción parcial, y e) eliminar la pluralidad de cebadores de captura regenerados inmovilizados que incluyen la región X del sustrato a través de la escisión en el sitio de escisión predeterminado.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, se proporciona en la presente memoria un dímero oligonucleotídico que incluye un primer oligonucleótido que incluye una región de captura universal 5'-terminal Y o Z, un sitio de restricción y una región de dimerización 3’-terminal DR y un segundo oligonucleótido que incluye una región de captura universal 5'-terminal Y o Z y una región de dimerización 3’-terminal DR.
En algunas realizaciones, la DR 3’-terminal del primer oligonucleótido y la DR 3’-terminal del segundo oligonucleótido incluyen una región de captura específica de la diana.
En algunas realizaciones, la DR 3’-terminal del primer oligonucleótido y la DR 3’-terminal del segundo oligonucleótido incluyen un SBS.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, se proporciona en la presente memoria un método para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluye: a) poner en contacto un sustrato que incluye una pluralidad de cebadores de captura inmovilizados con una pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes en condiciones suficientes para que la hibridación produzca una pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes inmovilizados; b) extender dos o más de los cebadores de captura inmovilizados para producir una pluralidad de productos de extensión inmovilizados diferentes complementarios a dos o más de la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes inmovilizados; c) activar un producto de extensión inmovilizado de la pluralidad de productos de extensión inmovilizados diferentes, para formar un cebador de captura activado, y d) opcionalmente, amplificar el cebador de captura activado para producir una agrupación monoclonal de cebadores de captura modificados inmovilizados.
En algunas realizaciones, la activación de los productos de extensión inmovilizados incluye la activación dirigida. En algunas realizaciones, la activación dirigida incluye la etapa inicial de marcar la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes con una pluralidad de marcas diferentes para producir una pluralidad de ácidos nucleicos semilla marcados de manera diferente. En algunas realizaciones, la activación dirigida incluye adicionalmente formar una pluralidad de ácidos nucleicos semilla inmovilizados marcados de manera diferente. En algunas realizaciones, la activación dirigida incluye adicionalmente formar una pluralidad de productos de extensión inmovilizados marcados de manera diferente. En algunas realizaciones, la activación dirigida incluye adicionalmente poner en contacto la pluralidad de productos de extensión inmovilizados marcados de manera diferente con una o más moléculas desencadenantes específicas de la marca para activar un producto de extensión inmovilizado.
En algunas realizaciones, la etapa de marcaje inicial incluye el marcaje aleatorio de la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes. En algunas realizaciones, la etapa de marcaje inicial incluye el marcaje dirigido de la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes. En algunas realizaciones, el marcaje dirigido es marcaje específico de secuencia. En algunas realizaciones, la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes está marcada con menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, menos de 30, menos de 25, menos de 20, menos de 18, menos de 16, menos de 14, menos de 12, menos de 10, menos de 8, menos de 6, menos de 4 o menos de 2 marcas diferentes. En algunas realizaciones, la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes está marcada con 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4 o 2 marcas diferentes. En algunas realizaciones, la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes está marcada con 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, 60 o más, 80 o más, 90 o más, 100 o más, 150 o más, 200 o más, 250 o más, 300 o más, 400 o más, 500 o más, 600 o más, 700 o más, 800 o más, 900 o más, o 1.000 o más marcas diferentes. En algunas realizaciones, las diferentes marcas son diferentes cebadores que tienen diferentes secuencias de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la etapa de marcaje inicial incluye ligar una pluralidad de cebadores diferentes a la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes.
En algunas realizaciones, la molécula desencadenante es un ácido nucleico que incluye una región desencadenante. En algunas realizaciones, la región de desencadenante incluye una región de captura específica de la diana. En algunas realizaciones, la región desencadenante incluye una región de captura universal. En algunas realizaciones, la región de captura universal incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® o una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®. En algunas realizaciones, la molécula desencadenante es un cebador de captura inmovilizado. En algunas realizaciones, el cebador de captura inmovilizado es una pluralidad de cebadores de captura inmovilizados. En algunas realizaciones, la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados es una pluralidad de cebadores de captura diferentes. En algunas realizaciones, la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados es una pluralidad de los mismos cebadores de captura que tienen la misma secuencia de ácido nucleico. En algunas realizaciones, el cebador de captura inmovilizado incluye una región de captura específica de la diana.
En algunas realizaciones, la activación de un producto de extensión inmovilizado de la pluralidad de productos de extensión inmovilizados diferentes incluye la activación estocástica. En algunas realizaciones, la activación estocástica incluye poner en contacto el sustrato que tiene la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados con una pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes que tienen una estructura de horquilla para producir una pluralidad de ácidos nucleicos semilla inmovilizados diferentes que incluyen la estructura de horquilla. En algunas realizaciones, la activación estocástica incluye adicionalmente, extender dos o más de la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados para producir una pluralidad de productos de extensión inmovilizados diferentes que incluyen la estructura de horquilla. En algunas realizaciones, la activación estocástica incluye adicionalmente activar uno de la pluralidad de productos de extensión inmovilizados que incluyen la estructura de horquilla con un reactivo de escisión. En algunas realizaciones, uno o más ácidos nucleicos semilla diferentes de la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes incluyen una base escindible.
En algunas realizaciones, el reactivo de escisión es una nucleasa. En algunas realizaciones, la nucleasa es una endonucleasa. En algunas realizaciones, el reactivo de escisión está en una mezcla de reactivos de amplificación. En algunas realizaciones, el reactivo de escisión está presente cuando se amplifica la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados monoclonales activados.
En algunas realizaciones, la pluralidad de productos de extensión inmovilizados diferentes incluye una región de captura universal. En algunas realizaciones, la estructura de horquilla en la pluralidad de productos de extensión inmovilizados diferentes enmascara la región de captura universal.
En algunas realizaciones, la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes no incluye una región desencadenante. En algunas realizaciones, la activación estocástica incluye una etapa inicial de amplificación de uno de la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes con un cebador quimérico que incluye una región desencadenante. En algunas realizaciones, en la etapa inicial de amplificación de uno de la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes con un cebador quimérico, los uno o más ácidos nucleicos semilla están presentes en un exceso de más de 5 veces, más de 10 veces, más de 25 veces, más de 50 veces, más de 100 veces, más de 250 veces, más de 500 veces, más de 1.000 veces, más de 2.500 veces, más de 5.000 veces, más de 10.000 veces, más de 25.000 veces, más de 50.000 veces o más de 100.000 veces sobre el cebador quimérico. En algunas realizaciones, la región desencadenante incluye una región de captura específica de la diana. En algunas realizaciones, la región desencadenante incluye una región de captura universal. En algunas realizaciones, el cebador quimérico incluye una región desencadenante y un SBS.
En algunas realizaciones, la activación estocástica incluye a) poner en contacto un sustrato que tiene una pluralidad de cebadores de captura inmovilizados con una pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes en condiciones suficientes para que la hibridación produzca una pluralidad de ácidos nucleicos semilla inmovilizados diferentes, en donde cada una de los ácidos nucleicos semilla diferentes incluyen uno o más nucleótidos modificados. En algunas realizaciones, la activación estocástica incluye adicionalmente b) extender dos o más cebadores de captura inmovilizados para producir una pluralidad de productos de extensión inmovilizados diferentes complementarios a la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes inmovilizados, en donde cada uno de la pluralidad de productos de extensión inmovilizados diferentes incluye uno o más nucleótidos modificados. En algunas realizaciones, la activación estocástica incluye adicionalmente c) activar uno de la pluralidad de productos de extensión inmovilizados diferentes, para formar un cebador de captura activado, en donde el cebador de captura activado no incluye un nucleótido modificado. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado incluye una isoguanina (isoG) o una isocitosina (isoC).
En algunas realizaciones, la activación estocástica incluye poner en contacto el sustrato que tiene la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados con una pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes, cada uno con un reactivo de bloqueo unido en condiciones suficientes para que la hibridación produzca una pluralidad de ácidos nucleicos semilla inmovilizados diferentes, cada uno con el agente de bloqueo unido y poner en contacto al agente de bloqueo con un agente de desbloqueo. En algunas realizaciones, el agente de bloqueo es una proteína de unión a ácido nucleico y el agente de desbloqueo es una proteasa. En algunas realizaciones, el agente de bloqueo es una cuenta.
En algunas realizaciones, la amplificación del cebador de captura activado para producir una agrupación monoclonal de cebadores de captura modificados inmovilizados incluye KEA o amplificación de puente.
En algunas realizaciones, la superficie es una celda de flujo modelada que incluye una pluralidad de pocillos. En algunas realizaciones, los productos de extensión inmovilizados diferentes se forman en dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos. En algunas realizaciones, se forma un cebador de captura activado en cada uno de dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos. En algunas realizaciones, el cebador de captura activado se forma en cada uno de al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% de los pocillos de la pluralidad de pocillos. En algunas realizaciones, los cebadores de captura activados formados en cada uno de dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos son cebadores de captura activados diferentes en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de los pocillos. En algunas realizaciones, se forma una agrupación monoclonal de cebadores de captura modificados inmovilizados en cada uno de dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos. En algunas realizaciones, la agrupación monoclonal de cebadores de captura modificados inmovilizados se forma en cada uno de al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de los pocillos de la pluralidad de pocillos. En algunas realizaciones, la agrupación monoclonal de cebadores de captura modificados inmovilizados formados en cada uno de dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos son agrupaciones monoclonales diferentes de cebadores de captura modificados inmovilizados en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de los pocilios.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es un esquema que ilustra el método de la invención reivindicada para amplificar un ácido nucleico sobre un sustrato modelado mediante amplificación dual de agrupaciones modeladas. El sustrato modelado tiene una pluralidad de pocillos de 400 nm en un paso de 1,5 pm (1). La superficie modelada se cubre primero con una capa de poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida (PAZAM), a continuación se pule la superficie modelada para eliminar la capa de PAZAM de la superficie entre los pocillos, a la vez que se retiene la capa de PAZAM dentro de los pocillos, y se injertan cebadores de captura universales, p. ej., cebadores de captura universales P5 de Illumina® o P7 en la capa de PAZAM en los pocillos (2). La superficie modelada se cubre con una segunda capa de PAZAM o acrilamida libre de silano (SFA), tanto en los pocillos como sobre la superficie entre los pocillos (3). La segunda capa se injerta con cebadores de captura universales bloqueados en 3’, p. ej., cebadores Illumina® terminados con fosfato P5 o P7 (4). La superficie modelada se pone en contacto con una biblioteca de secuenciación que tiene una pluralidad de polinucleótidos diana flanqueados por regiones de captura universales, p. ej., P5 de Illumina® o P7, y se realiza un primer ensayo de exclusión cinética (KEA) para inicializar la siembra y producir una población clonal de amplicones a partir del polinucleótido diana dentro del pocillo (3). Los cebadores de captura universales bloqueados en 3’ se desbloquean, p. ej., desfosforilando los cebadores Illumina® terminados con fosfato P5 o P7 con quinasa T4 (6). Se realiza un segundo KEA o reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para aumentar la población clonal de amplicones de polinucleótidos diana más allá de los pocillos (7).
La FIG. 2 es un esquema que ilustra el método de la invención reivindicada para amplificar un ácido nucleico sobre un sustrato modelado mediante amplificación en una etapa con un cebador de captura. El sustrato modelado tiene una pluralidad de pocillos de 400 nm en un paso de 1,5 pm (1). La superficie modelada se cubre primero con una capa de PAZAM; a continuación se pule la superficie modelada para eliminar la capa de PAZAM de la superficie entre los pocillos, a la vez que se retiene la capa de PAZAM dentro de los pocillos, y los cebadores de captura quiméricos que tienen una región de captura universal y un sitio de unión al cebador de secuenciación (SBS), p. ej., los cebadores de captura P5 de Illumina®-SBS3 o P7-SBS8, se injertan en la capa de PAZAM en los pocillos (2). La superficie modelada se cubre con una segunda capa de PAZAM o acrilamida libre de silano (SFA), tanto en los pocillos como sobre la superficie entre los pocillos (3). La segunda capa se injertada con cebadores de captura universales, p. ej., cebadores P5 de Illumina® o P7 (4). La superficie modelada se pone en contacto con una biblioteca de secuenciación que tiene una pluralidad de polinucleótidos diana flanqueados con SBS, p. ej., SBS3 o SBS8 de Illumina® y se realiza un ensayo de exclusión cinética (KEA) para producir una población clonal de amplicones a partir del polinucleótido diana. La población clonal de los amplicones polinucleotídicos diana se produce inicialmente dentro del pocillo, utilizando los cebadores de captura quiméricos. Después de un tiempo de reacción de KEA prolongado o al cambiar a PCR de puente, la población clonal de amplicones se aumenta más allá del pocillo utilizando los cebadores de captura universales injertados en la segunda capa fuera de los pocillos.
La FIG. 3 es un esquema que ilustra el método de la invención reivindicada para amplificar un ácido nucleico sobre un sustrato modelado mediante amplificación-injerto-amplificación. El sustrato modelado tiene una pluralidad de pocillos de 400 nm en un paso de 1,5 pm (1). La superficie modelada se cubre primero con una capa de poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida (PAZAM), la superficie modelada se pule para eliminar la capa de PAZAM de la superficie entre los pocillos, a la vez que se retiene la capa de PAZAM dentro los pocillos y los cebadores de captura universales, p. ej., los cebadores de captura universales P5 de Illumina® o P7, se injertan en la capa de PAZAM en los pocillos (2). La superficie modelada se cubre con una segunda capa de PAZAM o acrilamida libre de silano (SFA), tanto en los pocillos como sobre la superficie entre los pocillos (3). La superficie modelada se pone en contacto con una biblioteca de secuenciación que tiene una pluralidad de polinucleótidos diana flanqueados por regiones de captura universales, p. ej., regiones P5 o P7 de Illumina® y se realiza un primer ensayo de exclusión cinética (KEA) para producir una población clonal de amplicones a partir del polinucleótido diana dentro del pocillo (4). La segunda capa se injerta con cebadores de captura universales, p. ej., cebadorse P5 o P7 de Illumina® (5). Se realiza un segundo KEA o PCR de puente para aumentar la población clonal de amplicones de polinucleótidos diana más allá del pocillo utilizando los cebadores de captura universales en la segunda capa fuera de los pocillos (6).
La FIG. 4 es un esquema que ilustra el método de la invención reivindicada para amplificar un ácido nucleico sobre un sustrato modelado utilizando cebadores mixtos en pocillos grandes. El sustrato modelado tiene una pluralidad de pocillos de 1,0 pm en un paso de 1,5 pm (1). La superficie modelada se cubre primero con una capa de PAZAM, la superficie modelada se pule para eliminar la capa de PAZAM de la superficie entre los pocillos, a la vez que se retiene la capa de PAZAM dentro de los pocillos y una mezcla de cebadores de captura universales, p. ej., cebadores de captura universales P5 o P7 de Illumina®, y cebadores de captura quiméricos que tienen una región de captura universal y un SBS, p. ej., cebadores de captura P5-SBS3 o P7-SBS8 de Illumina® se injertan en la capa de PAZAM en los pocillos; los cebadores de captura quiméricos se injertan a una densidad más baja y los cebadores de captura universales se injertan a una densidad más alta (2). La superficie modelada se pone en contacto con una biblioteca de secuenciación que tiene una pluralidad de polinucleótidos diana flanqueados por SBS, p. ej., SBS3 o SBS8 de Illumina®, y se realiza un KEA para producir una población clonal de amplicones a partir del polinucleótido diana dentro del pocillo (3).
La FIG. 5 muestra resultados ejemplares obtenidos con un método de injerto de cebadores de doble capa proporcionado en la presente memoria. El panel superior muestra los resultados obtenidos después de recubrir una celda de flujo modelada con una primera capa (PAZAM), pulir la superficie, depositar un primer cebador de captura (SBS3-P5) y sondear el primer cebador de captura con una sonda de oligonucleótidos de tetraclorofluoresceína (TET). El panel central muestra los resultados obtenidos después de recubrir adicionalmente la celda de flujo modelada del panel A con una segunda capa (SFA) y volver a sondear el primer cebador de captura con la sonda de oligonucleótidos TET. El panel inferior muestra los resultados obtenidos después de depositar adicionalmente un segundo cebador de captura (P5/P7) en la segunda capa y sondear el segundo cebador de captura con una sonda de oligonucleótidos TET.
La FIG. 6 muestra dibujos esquemáticos que ilustran estructuras de ácidos nucleicos molde ejemplares. Los ácidos nucleicos molde pueden estar flanqueados por regiones de captura universales en el extremo 3’ y/o 5'. Las regiones de captura universales pueden tener, p. ej., secuencias de los cebadores de captura universales P5 de Illumina® o P7. Los ácidos nucleicos molde pueden incluir adicionalmente una o más regiones de captura específicas de la diana ("Diana") y dos o más sitios de restricción (p. ej., sitios SapI, FIG. 6D) con una o más regiones espaciadoras que separan los dos o más sitios de restricción. Las regiones de captura específicas de la diana se pueden ubicar entre la región de captura universal 3’-terminal y un primer sitio de restricción (FIG. 6A), entre la región de captura universal 5’-terminal y un segundo sitio de restricción (FIG. 6B), o tanto entre la región de captura universal 3’-terminal y el primer sitio de restricción como entre la región de captura universal 5'-terminal y el segundo sitio de restricción (FIG. 6C).
La FIG. 7 muestra un esquema que ilustra un método proporcionado en la presente memoria para la modificación de un cebador de captura inmovilizado. La FIG. 7A ilustra un ácido nucleico molde que hibrida con un cebador de captura inmovilizado a través de una región de captura universal. La extensión del cebador de captura hibridada da como resultado la formación de un producto de extensión inmovilizado que es complementario al ácido nucleico molde. El extremo 3’ del producto de extensión puede hibridar con otro cebador de captura inmovilizado que tiene una región de captura universal 3’-terminal complementaria, formando así una estructura de puente. Una o más rondas de KEA dan como resultado la formación de una agrupación monoclonal de ácidos nucleicos molde inmovilizados. La FIG. 7B ilustra la escisión de los ácidos nucleicos molde inmovilizados con una enzima de restricción. La FIG. 7C ilustra los cebadores de captura quiméricos inmovilizados resultantes de la escisión por enzimas de restricción en la FIG. 7B. Los cebadores de captura quiméricos tienen cada uno una región de captura universal y una región de captura específica de la diana. La escisión por enzimas de restricción produce adicionalmente cebadores de captura universales regenerados inmovilizados. La FIG. 7D ilustra que, en una celda de flujo modelada, se puede producir una pluralidad de poblaciones monoclonales de cebadores de captura quiméricos, de modo que cada pocillo de la celda de flujo modelada tenga una población monoclonal de cebadores de captura quiméricos, por lo que todos los cebadores de captura quiméricos en la población tienen las mismas regiones de captura específicas de la diana. Diferentes pocillos de la celda de flujo modelada pueden tener poblaciones monoclonales de cebadores de captura quiméricos que tienen las mismas regiones de captura específicas de la diana o diferentes regiones de captura específicas de la diana.
La FIG. 8 muestra un esquema que ilustra un método ejemplar para la captura específica de la diana de polinucleótidos diana utilizando cebadores de captura modificados. La FIG. 8A ilustra la preparación de una biblioteca de secuenciación a partir de muestras de ADN. p. ej., una muestra de ADN genómico. En una reacción de PCR multiplexada, se produce enriquecimiento de polinucleótidos diana y se añaden adaptadores a un extremo de los polinucleótidos diana enriquecidos. La FIG. 8B ilustra una etapa para poner en contacto los polinucleótidos diana de la FIG. 8A con una celda de flujo de secuenciación de nueva generación (NGS) que tiene cebadores de captura quiméricos inmovilizados que incluyen regiones de captura universales y regiones de captura específicas de la diana. La FIG. 8C ilustra la extensión inicial de cebadores de captura quiméricos que hibridan con un polinucleótido diana para incorporar la secuencia complementaria del polinucleótido diana y sus secuencias adaptadoras. La FIG. 8C ilustra adicionalmente la amplificación de puente subsiguiente de los cebadores de captura extendidos.
La FIG. 9 muestra un gráfico que ilustra un desafío afrontado cuando se busca realizar una captura específica de la diana de polinucleótidos diana. Las FIG. 9A y B ilustran protocolos NGS que implican la captura inicial de polinucleótidos diana en una celda de flujo a través de sus regiones de captura universales terminales. La FIG. 9C ilustra un protocolo NGS que implica la captura inicial de un polinucleótido diana en una celda de flujo por un cebador de captura inmovilizado que tiene una región de captura específica de la diana.
La FIG. 10 muestra un gráfico que ilustra un método ejemplar para producir paneles de captura monoclonales en una celda de flujo modelada y para capturar y extender específicamente polinucleótidos diana de una manera específica de la diana y producir poblaciones monoclonales de los polinucleótidos diana en cada panel de la celda de flujo modelada.
La FIG. 11 muestra un gráfico que ilustra un método ejemplar proporcionado en la presente memoria para modificar un cebador de captura universal inmovilizado.
Las FIG. 12A y B muestran gráficos que ilustran un método ejemplar proporcionado en la presente memoria para modificar un cebador de captura universal inmovilizado.
La FIG. 13 muestra un gráfico que ilustra un método ejemplar proporcionado en la presente memoria para modificar un cebador de captura universal inmovilizado.
La FIG. 14 muestra un gráfico que ilustra un método ejemplar proporcionado en la presente memoria para modificar un cebador de captura universal inmovilizado.
La FIG. 15 muestra un gráfico que ilustra un método ejemplar proporcionado en la presente memoria para modificar un cebador de captura universal inmovilizado.
La FIG. 16 muestra un gráfico que ilustra un dímero ejemplar de ácidos nucleicos molde parciales. El dímero tiene un primer oligonucleótido que incluye una primera región de captura universal en su extremo 5' (P5), un sitio de restricción (SapI) (SEQ ID NO: 9 y 10) y una región de captura (CP) específica de la diana en su extremo 3’. El ácido nucleico molde dimérico tiene un segundo oligonucleótido que incluye una región de captura específica de la diana complementaria en su extremo 3’ (CP'), un sitio de unión al cebador de secuenciación (SBS) y una segunda región de captura universal en su extremo 5’ (P7)).
La FIG. 17 muestra un gráfico que ilustra los resultados de una simulación por ordenador para describir cómo la ocupación monoclonal de los pocillos sobre una celda de flujo modelada puede variar según las condiciones iniciales de siembra (p. ej., por % de sitios ocupados después de un solo ciclo de siembra, eje x) y el número de eventos de siembra (2 a 16 eventos modelados: rombos: 2 eventos; cuadrados: 3 eventos; triángulos: 4 eventos; cruces: 16 eventos).
La FIG. 18 muestra un gráfico que ilustra un método ejemplar proporcionado en la presente memoria para la activación dirigida de productos de extensión inmovilizados sobre una celda de flujo modelada utilizando moléculas desencadenantes solubles. Los productos de extensión inmovilizados diferentes están marcados como A, B y C.
La FIG. 19 muestra un gráfico que ilustra un método ejemplar proporcionado en la presente memoria para la activación dirigida de productos de extensión inmovilizados sobre una celda de flujo modelada utilizando moléculas desencadenantes inmovilizadas. Los productos de extensión inmovilizados diferentes están etiquetados como A, B y C. Los paneles de la celda de flujo modelada se han sembrado con tres moléculas con extremos diferentes y se inmovilizan pequeñas cantidades de un cebador quimérico P5/B' en cada panel. La molécula B puede hibridar con el extremo B' complementario del cebador quimérico, que puede extenderse y comenzar la amplificación del panel. Otros paneles pueden tener cebador quimérico con diferentes extremos. (p. ej., cebadores P5/A' o cebadores P5/C').
La FIG. 20 muestra un gráfico que ilustra un método ejemplar proporcionado en la presente memoria para la activación estocástica de productos de extensión inmovilizados utilizando horquillas escindibles.
La FIG. 21 muestra resultados ejemplares de un método proporcionado en la presente memoria para la activación estocástica de productos de extensión inmovilizados utilizando pequeñas cantidades de cebadores solubles que tienen secuencias desencadenantes para amplificar una pequeña fracción de ácidos nucleicos semilla que carecen de secuencias desencadenantes.
Descripción detallada
La tecnología de secuenciación de nueva generación (NGS) se basa en la secuenciación altamente paralela de polinucleótidos diana únicos inmovilizados sobre una superficie, o la secuenciación de poblaciones clonales de nucleótidos diana, que se produjeron a partir de los polinucleótidos diana únicos, p. ej., mediante amplificación de puente. La secuenciación de poblaciones clonales de polinucleótidos diana produce razones señal/ruido (SNR) mucho más altas que la secuenciación de polinucleótidos diana únicos, mejora la sensibilidad y la precisión de las reacciones de secuenciación, y permite el uso de ópticas de bajo coste en los aparatos de secuenciación.
La presente descripción se basa, en parte, en la comprensión de que la calidad de los datos y la economía de la NGS se pueden mejorar aún más aumentando el tamaño y la densidad de las poblaciones clonales inmovilizadas de polinucleótidos diana, lo que mejora aún más las SNR de las reacciones de secuenciación.
En la NGS, los polinucleótidos diana pueden ser capturados sobre un sustrato, p. ej., de una celda de flujo (FC), de modo que los polinucleótidos diana individuales se separen espacialmente entre sí y se puedan distinguir en ciclos posteriores de secuenciación. Los métodos de captura conocidos en la técnica son comúnmente de naturaleza aleatoria y dependen, al menos en parte, del control preciso de las condiciones experimentales para lograr la densidad óptima de polinucleótidos diana inmovilizados sobre el sustrato. Las condiciones inadecuadas pueden conducir al hacinamiento, de modo que los polinucleótidos diana individuales no son distinguibles o, como alternativa, pueden conducir a altas tasas de vacantes que pueden reducir la información obtenida por ronda de secuenciación, desperdiciando de ese modo costosos reactivos de secuenciación.
Recientemente, se han desarrollado celdas de flujo modeladas que permiten el crecimiento ordenado de poblaciones clonales de polinucleótidos diana inmovilizados que son más grandes que las poblaciones de polinucleótidos diana clonales en muchas celdas de flujo disponibles comercialmente y dispuestas a densidades más altas (véase, p. ej., el documento US 2013/0096034 A1; celdas de flujo modeladas Illumina® HiSeq-X10). Por ejemplo, algunas celdas de flujo modeladas presentan micromatrices que tienen nanopocillos de 400 nm de diámetro con un paso de 1,5 gm (véase, p. ej. FIG. 1.1). Cada nanopocillo se carga con un hidrogel y cebadores incluidos en el hidrogel (véase, p. ej. el documento US 2014/0079923 A1). La superficie que rodea los nanopocillos puede estar libre de cebadores, lo que limita el tamaño de las poblaciones clónales de polinucleótidos diana al tamaño de los nanopocillos, p. ej., 400 nm de diámetro.
En principio, un ensayo de exclusión cinética (KEA) permite la amplificación de un único polinucleótido diana por pocillo sobre una celda de flujo modelada y la producción de una población de polinucleótidos diana monoclonales en uno o más de los pocillos (véase, p. ej. el documento US 2013/0338042 A1). En un KEA, la tasa de amplificación del primer polinucleótido diana capturado dentro de un pocillo es mucho más rápida con respecto a tasas mucho más lentas de transporte y captura de polinucleótidos diana. El primer polinucleótido diana capturado en un pocillo se puede amplificar rápidamente y llenar todo el pocillo, evitando la captura de polinucleótidos diana adicionales en el mismo pocillo.
La presente descripción se basa, en parte, en la constatación de que la eficacia de un KEA con respecto a la producción de poblaciones de polinucleótidos diana monoclonales en nanopocillos de celdas de flujo modeladas disminuye a medida que aumenta el tamaño de los nanopocillos. La amplificación de un primer polinucleótido diana capturado y el llenado de un pocillo con una población monoclonal de polinucleótidos diana es más lenta en pocillos más grandes que en pocillos más pequeños, mientras que la captura de un segundo polinucleótido diana es más rápida en pocillos más grandes que en pocillos más pequeños. Por lo tanto, la probabilidad de que más de un polinucleótido diana sea capturado y amplificado dentro de un nanopocillo aumenta con el tamaño del nanopocillo. La calidad de los datos de secuenciación de un pocillo es óptima para poblaciones monoclonales de polinucleótidos diana. La calidad de los datos del pocillo disminuye a medida que aumenta la proporción de polinucleótidos diana distintos del primer polinucleótido diana inmovilizado.
Por lo tanto, se necesitan nuevos métodos para facilitar la producción de poblaciones de polinucleótidos diana monoclonales en grandes nanopocillos de celdas de flujo modeladas.
La descripción proporciona métodos y kits para modificar un cebador de captura inmovilizado. En una realización útil, la presente descripción permite la producción de poblaciones monoclonales de polinucleótidos diana en los pocillos de celdas de flujo modeladas. Específicamente, la presente descripción facilita la producción de poblaciones clonales de polinucleótidos diana que tienen un tamaño aumentado y que están dispuestas a densidades más altas que las poblaciones clonales de polinucleótidos diana producidas con métodos NGS comúnmente utilizados conocidos en la técnica. El método de la presente descripción facilita la recopilación de datos de NGS de alta calidad con rendimientos más altos, especialmente en aplicaciones dirigidas a la secuenciación dirigida de genomas parciales. Las SNR más altas logradas con los métodos de esta descripción pueden permitir el uso de óptica y aparatos de detección simples, reduciendo los costes de ensayo. La alta calidad de los datos y el rendimiento mejorado de las muestras pueden abrir un nuevo campo de aplicaciones para la NGS específica de la diana, p. ej., en el diagnóstico y pronóstico de enfermedades. Por lo tanto, se espera que esta descripción beneficie, p. ej., a pacientes que padecen enfermedades que implican mutaciones genéticas raras, tales como los pacientes con cáncer, al facilitar la detección temprana fiable de mutaciones genéticas raras. La detección temprana de la enfermedad se puede traducir en un mayor número de opciones de tratamiento y mejores resultados de tratamiento.
La presente descripción se basa adicionalmente, en parte, en la comprensión de que los pocillos de muchas celdas de flujo modeladas tienen pares de cebadores de captura universales, que permiten la amplificación de puente de ácidos nucleicos que tienen regiones de captura universales complementarias, pero que no habilitan la captura específica de la diana de polinucleótidos individuales de interés. Si bien un aspecto útil de las celdas de flujo modeladas es el aumento del rendimiento de las reacciones NGS debido a las altas densidades de características y al registro de agrupaciones más fácil debido a las ubicaciones conocidas de los paneles, un inconveniente de la celda de flujo modelada es la necesidad de sintetizar paneles (pocillos) monoclonales, donde una agrupación de ADN sobre un panel específico solo surge de una sola molécula de ADN. Los paneles policlonales hacen que las lecturas automáticas de bases sean difíciles, si no imposibles (bajo % PF).
La presente descripción se basa adicionalmente, en parte, en la comprensión de que los protocolos NGS que implican la captura específica de la diana de polinucleótidos diana pueden producir datos de secuenciación de menor calidad que los protocolos NGS que implican la captura de polinucleótidos diana utilizando regiones de captura universales. Véase, p. ej., la FIG.9. Las FIG. 9A y B ilustran un protocolo NGS que implica la captura inicial de polinucleótidos diana sobre una celda de flujo a través de regiones de captura universales. La FIG. 9C ilustra aspectos de un protocolo NGS que implica la captura inicial de un polinucleótido diana por un cebador de captura específico de la diana inmovilizado. Debido a que en muchas celdas de flujo de NGS, los cebadores de captura inmovilizados con regiones de captura específicas de la diana son mucho menos frecuentes que los cebadores de captura universales inmovilizados (para permitir la amplificación de puente eficaz de los polinucleótidos diana capturados y la separación de las agrupaciones de polinucleótidos diana) y debido a que los polinucleótidos diana específicos pueden ser raros, p. ej., en una población de fragmentos de ADN genómico, las tasas de siembra específicas de la diana pueden ser mucho más lentas que las tasas de siembra basadas en regiones de captura universales. Por lo tanto, la reacción secundaria competitiva y los eventos de amplificación irregulares pueden ocurrir con mayor probabilidad al intentar la captura específica de la diana que en los protocolos que dependen de la captura universal, lo que en última instancia puede reducir la calidad de los datos de las reacciones de secuenciación NGS que siguen a la captura específica de la diana.
En la presente memoria se proporcionan métodos para modificar cebadores (p. ej., universales) de captura en pocillos individuales de una celda de flujo modelada de modo que los polinucleótidos individuales de interés puedan ser capturados de manera específica de la diana en uno o más pocillos de la celda de flujo modelada. En algunas realizaciones de los métodos proporcionados en la presente memoria, se producen paneles de captura monoclonales que tienen poblaciones monoclonales de alta densidad de cebadores de captura con regiones de captura específicas de la diana. En algunas realizaciones, los paneles de captura monoclonales pueden aumentar las tasas de siembra específicas de las dianas de polinucleótidos diana y suprimir las reacciones secundarias competidoras y los eventos de amplificación irregulares, mejorando así la calidad de los datos de NGS. Se muestra una ilustración ejemplar de un método proporcionado en la presente memoria, p. ej., en la FIG. 10. La amplificación de puente de los polinucleótidos de interés capturados de manera específica de la diana se puede utilizar a continuación para formar poblaciones monoclonales de amplicones de polinucleótidos diana en uno o más pocillos de la celda de flujo modelada. De acuerdo con los métodos proporcionados en la presente memoria, los ácidos nucleicos molde únicos que incluyen secuencias de captura específicas de la diana se pueden sembrar inicialmente sobre paneles individuales de una celda de flujo modelada a través de sus regiones de captura universales y la posterior amplificación de los ácidos nucleicos molde únicos excluye los ácidos nucleicos molde adicionales de los mismos paneles, lo que da como resultado la formación de paneles de captura monoclonales.
Se debe observar que, como se emplea en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", “una”, “el” y "la" incluyen referencias plurales a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un biomarcador" incluye una mezcla de dos o más biomarcadores, y similares.
Se pretende que el término "aproximadamente", particularmente en referencia a una cantidad dada, abarque desviaciones de más o menos cinco por ciento.
Como se emplean en la presente memoria, se pretende que los términos "incluye", "que incluye", "contiene", "que contiene" y cualquier variación de los mismos, abarquen una inclusión no exclusiva, de modo que un procedimiento, método, producto por procedimiento o composición de materia que incluye, o contiene un elemento o una lista de elementos no incluye solo esos elementos sino que puede incluir otros elementos que no están expresamente enumerados o son inherentes a tal procedimiento, método o producto por procedimiento o composición de materia.
Como se emplea en la presente memoria, se pretende que el término "sustrato" signifique un soporte sólido. El término incluye cualquier material que pueda servir como base sólida o semisólida para la creación de elementos tales como pocillos para el depósito de biopolímeros, incluidos ácidos nucleicos, polipéptidos y/u otros polímeros. Un sustrato se modifica, por ejemplo, o se puede modificar para acomodar la unión de biopolímeros mediante una variedad de métodos bien conocidos por los expertos en la materia. Los tipos ejemplares de materiales sustrato incluyen vidrio, vidrio modificado, vidrio funcionalizado, vidrios inorgánicos, microesferas, incluidas partículas inertes y/o magnéticas, plásticos, polisacáridos, nailon, nitrocelulosa, cerámica, resinas, sílice, materiales a base de sílice, carbono, metales, una fibra óptica o haces de fibra óptica, una variedad de polímeros distintos de los ilustrados anteriormente y placas de microtitulación de múltiples pocillos. Los tipos específicos de plásticos ejemplares incluyen acrílicos, poliestireno, copolímeros de estireno y otros materiales, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos y Teflon™. Los tipos específicos de materiales con una base de sílice ejemplares incluyen silicio y diversas formas de silicio modificado.
Los expertos en la técnica sabrán o comprenderán que la composición y la geometría de un sustrato pueden variar según el uso previsto y las preferencias del usuario. Por lo tanto, aunque los sustratos planos tales como portaobjetos, chips o obleas se ilustran en la presente memoria en referencia a micromatrices como ilustración, dadas las enseñanzas y la orientación proporcionadas en la presente memoria, los expertos en la técnica comprenderán que también se puede utilizar una amplia variedad de otros sustratos ilustrados en la presente memoria o bien conocidos en la técnica en los métodos y/o micromatrices de la invención.
En algunas realizaciones, el soporte sólido incluye una superficie modelada. Una "superficie modelada" se refiere a una disposición de diferentes regiones en o sobre una capa expuesta de un soporte sólido. Por ejemplo, una o más de las regiones pueden ser elementos donde están presentes uno o más cebadores de amplificación. Los elementos pueden estar separados por regiones intersticiales donde los cebadores de amplificación no están presentes. En algunas realizaciones, el patrón puede ser un formato x-y de elementos que están en filas y columnas. En algunas realizaciones, el patrón puede ser una disposición repetitiva de elementos y/o regiones intersticiales. En algunas realizaciones, el patrón puede ser una disposición aleatoria de elementos y/o regiones intersticiales. Las superficies modeladas ejemplares que se pueden utilizar en los métodos y composiciones expuestos en la presente memoria se describen en la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2013/116153 A1 o la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2012/0316086 A1.
En algunas realizaciones, el soporte sólido incluye una matriz de pocillos o depresiones en una superficie. Este se puede fabricar como se conoce generalmente en la técnica utilizando una variedad de mecanismos, que incluyen, pero no se limitan a, fotolitografía, técnicas de estampado, técnicas de moldeo y técnicas de micrograbado. Como apreciarán los expertos en la técnica, el mecanismo utilizado dependerá de la composición y la forma del sustrato de la matriz.
Los elementos sobre una superficie modelada pueden ser pocillos en una matriz de pocillos (p. ej., micropocillos o nanopocillos) sobre vidrio, silicio, plástico u otros soportes sólidos adecuados con gel modelado, unido covalentemente, tal como poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida) (PAZAM, véase, p. ej. la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2014/079923. El procedimiento crea paneles de gel utilizados para la secuenciación que pueden ser estables a lo largo de las rondas de secuenciación con una gran cantidad de ciclos. La unión covalente del polímero a los pocillos es útil para mantener el gel en los elementos estructuradas durante toda la vida útil del sustrato estructurado durante una variedad de usos. Sin embargo, en muchas realizaciones, no es necesario que el gel esté unido covalentemente a los pocillos. Por ejemplo, en algunas condiciones, se puede utilizar como material de gel acrilamida libre de silano (SFA, véase, p. ej. la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2011/0059865 Al) que no está unido covalentemente a ninguna parte del sustrato estructurado.
En realizaciones particulares, se puede preparar un sustrato estructurado modelando un material de soporte sólido con pocillos (p. ej., micropocillos o nanopocillos), recubriendo el soporte modelado con un material de gel (p. ej., PAZAM, SFA o variantes químicamente modificadas de los mismos, tal como la versión azidolizada de SFA (azido-SFA)) y puliendo el soporte recubierto de gel, por ejemplo mediante pulido químico o mecánico, reteniendo así el gel en los pocillos pero eliminando o inactivando sustancialmente todo el gel de las regiones intersticiales sobre la superficie del sustrato estructurado entre los pocillos. Los ácidos nucleicos cebadores se pueden unir al material de gel. A continuación, se puede poner en contacto una solución de ácidos nucleicos diana (p. ej., un genoma humano fragmentado) con el sustrato pulido de manera que los ácidos nucleicos diana individuales sembrarán pocillos individuales mediante interacciones con cebadores unidos al material de gel; sin embargo, los ácidos nucleicos diana no ocuparán las regiones intersticiales debido a la ausencia o inactividad del material de gel. La amplificación de los ácidos nucleicos diana estará confinada a los pocillos puesto que la ausencia o inactividad del gel en las regiones intersticiales evita la migración hacia el exterior de la colonia de ácido nucleico en crecimiento. El procedimiento es convenientemente manufacturable, es escalable y utiliza métodos convencionales de micro- o nano-fabricación.
Un sustrato modelado puede incluir, por ejemplo, pocillos grabados al ácido en un portaobjetos o chip. El patrón de los grabados al ácido y la geometría de los pocillos puede adoptar una variedad de formas y tamaños diferentes siempre que tales elementos sean físicamente o funcionalmente separables entre sí. Los sustratos particularmente útiles que tienen tales elementos estructurales son sustratos modelados que pueden seleccionar el tamaño de las partículas del soporte sólido tales como microesferas. Un sustrato modelado ejemplar que tiene estas características es el sustrato grabado al ácido utilizado en conexión con la tecnología BeadArray (Illumina, Inc., San Diego, California). Otros ejemplos, se describen en la Patente de Estados Unidos Núm. Núm. 6.770.441.
Como se emplea en la presente memoria, se pretende que el término "inmovilizado" cuando se utiliza en referencia a un ácido nucleico signifique una unión directa o indirecta a un soporte sólido mediante uno o varios enlaces covalentes o no covalentes. Se puede utilizar la unión covalente, pero todo lo que se requiere es que los ácidos nucleicos permanezcan estacionarios o unidos a un soporte en condiciones en las que se pretende utilizar el soporte, por ejemplo, en aplicaciones que requieren amplificación y/o secuenciación de ácido nucleico. Los oligonucleótidos que se utilizarán como cebadores de captura o cebadores de amplificación se pueden inmovilizar de modo que esté disponible un extremo 3’ para la extensión enzimática y al menos una parte de la secuencia sea capaz de hibridar con una secuencia complementaria. La inmovilización puede ocurrir por hibridación a un oligonucleótido unido a la superficie, en cuyo caso el oligonucleótido o polinucleótido inmovilizados pueden estar en la orientación 3’-5'. Alternativamente, la inmovilización puede ocurrir por medios distintos de la hibridación de emparejamiento de bases, tales como la unión covalente expuesta anteriormente.
Como se utiliza en la presente memoria, el término "matriz" se refiere a una población de sitios que pueden diferenciarse entre sí según la ubicación relativa. Las diferentes moléculas que están en diferentes sitios de una matriz se pueden diferenciar entre sí según las ubicaciones de los sitios en la matriz. Un sitio individual de una matriz puede incluir una o más moléculas de un tipo particular. Por ejemplo, un sitio puede incluir una molécula de ácido nucleico diana única que tiene una secuencia particular o un sitio puede incluir varias moléculas de ácido nucleico que tienen la misma secuencia (y/o secuencia complementaria de la misma). Los sitios de una matriz pueden tener diferentes elementos ubicados en el mismo sustrato. Los elementos ejemplares incluyen, sin limitación, pocillos en un sustrato, cuentas (u otras partículas) en o sobre un sustrato, proyecciones desde un sustrato, crestas sobre un sustrato o canales en un sustrato. Los sitios de una matriz pueden ser sustratos separados, cada uno con una molécula diferente. Se pueden identificar diferentes moléculas unidas a sustratos separados según las ubicaciones de los sustratos sobre una superficie a la que están asociados los sustratos o según las ubicaciones de los sustratos en un líquido o gel. Las matrices ejemplares en las que se ubican sustratos separados sobre una superficie incluyen, sin limitación, aquellas que tienen cuentas en los pocillos.
Como se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "pluralidad" signifique una población de dos o más miembros diferentes. Las pluralidades pueden tener un tamaño que varíe de pequeño, mediano, grande a muy grande. El tamaño de una pequeña pluralidad puede variar, por ejemplo, desde unos pocos miembros hasta decenas de miembros. Las pluralidades de tamaño mediano pueden variar, por ejemplo, de decenas de miembros a aproximadamente 100 miembros o cientos de miembros. Las pluralidades grandes pueden variar, por ejemplo, desde aproximadamente cientos de miembros hasta aproximadamente 1000 miembros, hasta miles de miembros y hasta decenas de miles de miembros. Las pluralidades muy grandes pueden variar, por ejemplo, de decenas de miles de miembros a aproximadamente cientos de miles, un millón, millones, decenas de millones y hasta o más de cientos de millones de miembros. Por lo tanto, una pluralidad puede tener un tamaño que varíe de dos a más de cien millones de miembros, así como todos los tamaños, medidos por el número de miembros, entre y mayores que los intervalos ejemplares anteriores. Un número ejemplar de elementos dentro de una micromatriz incluye una pluralidad de aproximadamente 500.000 o más elementos discretos dentro de 1,28 cm2. Las pluralidades de ácidos nucleicos ejemplares incluyen, por ejemplo, poblaciones de aproximadamente 1 x 105, 5 x 105 y 1 x 106 o más especies diferentes de ácido nucleico. En consecuencia, se pretende que la definición del término incluya todos los valores enteros mayores que dos. Se puede establecer un límite superior de una pluralidad, por ejemplo, mediante la diversidad teórica de secuencias de nucleótidos en una muestra de ácido nucleico.
Como se emplea en la presente memoria, se pretende que el término "ácido nucleico" signifique un ácido ribonucleico o desoxirribonucleico o análogo del mismo, que incluye un analito de ácido nucleico presentado en cualquier contexto; por ejemplo, una sonda, diana o cebador. Las formas particulares de los ácidos nucleicos incluyen todos los tipos de ácidos nucleicos que se encuentran en un organismo, así como los ácidos nucleicos sintéticos, tales como los polinucleótidos producidos por síntesis química. Los ejemplos particulares de ácidos nucleicos que son aplicables para el análisis mediante la incorporación a micromatrices producidos por los métodos de la invención incluyen ADN genómico (ADNg), etiquetas de secuencia expresada (EST), ARN mensajero copiado por ADN (ADNc), ARN mensajero copiado por ARN (ARNc), ADN mitocondrial o genoma, ARN, ARN mensajero (ARNm) y/u otras poblaciones de ARN. Los fragmentos y/o porciones de estos ácidos nucleicos ejemplares también se incluyen en el significado del término como se emplea en la presente memoria.
Como se empela en la presente memoria, el término "de doble hebra", cuando se utiliza en referencia a una molécula de ácido nucleico, significa que sustancialmente todos los nucleótidos en la molécula de ácido nucleico están unidos por hidrógeno a un nucleótido complementario. Un ácido nucleico parcialmente de doble hebra puede tener al menos 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o 95% de sus nucleótidos unidos por hidrógeno a un nucleótido complementario.
Como se emplea en la presente memoria, el término "de hebra sencilla", cuando se utiliza en referencia a una molécula de ácido nucleico, significa que esencialmente ninguno de los nucleótidos en la molécula de ácido nucleico está unido por hidrógeno a un nucleótido complementario.
Como se emplea en la presente memoria, se pretende que el término "polinucleótido diana" signifique un polinucleótido que es objeto de un análisis o acción. El análisis o acción incluyen someter el polinucleótido a copia, amplificación, secuenciación y/u otro procedimiento para la interrogación de ácido nucleico. Un polinucleótido diana puede incluir secuencias de nucleótidos adicionales a la secuencia diana que se debe a analizar. Por ejemplo, un polinucleótido diana puede incluir uno o más adaptadores, incluido un adaptador que funciona como un sitio de unión de cebador, que flanquea una secuencia de polinucleótidos diana que se debe analizar. Un polinucleótido diana hibridado a un oligonucleótido de captura o cebador de captura puede contener nucleótidos que se extienden más allá del extremo 5’ o 3’ del oligonucleótido de captura de tal manera que no todo el polinucleótido diana sea susceptible de extensión. En realizaciones particulares, como se expone con más detalle a continuación, una pluralidad de polinucleótidos diana incluye diferentes especies que difieren en sus secuencias polinucleotídicas diana pero tienen adaptadores que son iguales para dos o más de las diferentes especies. Los dos adaptadores que pueden flanquear una secuencia de polinucleótidos diana particular pueden tener la misma secuencia o los dos adaptadores pueden tener secuencias diferentes. Por consiguiente, una pluralidad de polinucleótidos diana diferentes puede tener la misma secuencia de adaptador o dos secuencias de adaptador diferentes en cada extremo de la secuencia del polinucleótido diana. Por lo tanto, las especies en una pluralidad de polinucleótidos diana pueden incluir regiones de secuencia conocida que flanquean regiones de secuencia desconocida que se evaluarán, por ejemplo, mediante secuenciación. En los casos en que los polinucleótidos diana llevan un adaptador en un único extremo, el adaptador se puede ubicar en el extremo 3’ o en el extremo 5' del polinucleótido diana. Los polinucleótidos diana se pueden utilizar sin ningún adaptador, en cuyo caso una secuencia de unión al cebador puede provenir directamente de una secuencia encontrada en el polinucleótido diana.
Como se emplea en la presente memoria, se pretende que el término "cebadores de captura" signifique un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que es capaz de reasociarse específicamente con una secuencia de polinucleótidos de hebra sencilla que se debe analizar o someter a una interrogación de ácido nucleico en las condiciones encontradas en una etapa de reasociación de cebadores de, por ejemplo, una reacción de amplificación o secuenciación. Los términos "ácido nucleico", "polinucleótido" y "oligonucleótido" se utilizan indistintamente en la presente memoria. No se pretende que los diferentes términos denoten ninguna diferencia particular en tamaño, secuencia u otra propiedad a menos que se indique específicamente lo contrario. Para mayor claridad de la descripción, los términos se pueden utilizar para distinguir una especie de ácido nucleico de otra cuando se describe un método o composición particular que incluye varias especies de ácido nucleico.
Como se emplea en la presente memoria, se pretende que el término "diana específica" cuando se utiliza en referencia a un cebador de captura u otro oligonucleótido signifique un cebador de captura u otro oligonucleótido que incluye una secuencia de nucleótidos específica para una secuencia de polinucleótidos diana, es decir, una secuencia de nucleótidos capaz de reasociarse selectivamente a una región de identificación de un polinucleótido diana. Los cebadores de captura específicos de la diana pueden tener una sola especie de oligonucleótido, o pueden incluir dos o más especies con diferentes secuencias. Por lo tanto, los cebadores de captura específicos de la diana pueden ser dos o más secuencias, que incluyen 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más secuencias diferentes. Los oligonucleótidos de captura específicos de la diana pueden incluir una secuencia de cebador de captura específica de la diana y una secuencia de cebador de captura universal. Otras secuencias tales como secuencias de cebadores de secuenciación y similares también se pueden incluir en un cebador de captura específico de la diana.
En comparación, se pretende que el término "universal" cuando se utiliza en referencia a un cebador de captura u otra secuencia de oligonucleótidos signifique un cebador de captura u otro oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos común entre una pluralidad de cebadores de captura. Una secuencia común puede ser, por ejemplo, una secuencia complementaria a la misma secuencia del adaptador. Los cebadores de captura universales son aplicables para interrogar una pluralidad de polinucleótidos diferentes sin distinguir necesariamente las diferentes especies, mientras que los cebadores de captura específicos de la diana son aplicables para distinguir las diferentes especies.
Como se emplea en la presente memoria, el término "amplicón", cuando se utiliza en referencia a un ácido nucleico, significa el producto del copiado del ácido nucleico, en donde el producto tiene una secuencia de nucleótidos que es igual o complementaria a al menos una porción de la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico. Se puede producir un amplicón mediante cualquiera de una variedad de métodos de amplificación que utilizan el ácido nucleico, o un amplicón del mismo, como molde que incluye, por ejemplo, extensión por polimerasa, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación de círculo rodante (RCA), extensión por ligación, o reacción en cadena por ligación. Un amplicón puede ser una molécula de ácido nucleico que tiene una sola copia de una secuencia de nucleótidos particular (p. ej. un producto de PCR) o copias múltiples de la secuencia de nucleótidos (p. ej. un producto concatamérico de RCA). Un primer amplicón de un ácido nucleico diana puede ser una copia complementaria. Los amplicones posteriores son copias que se crean, después de la generación del primer amplicón, a partir del ácido nucleico diana o a partir del primer amplicón. Un amplicón posterior puede tener una secuencia que sea sustancialmente complementaria al ácido nucleico diana o sustancialmente idéntica al ácido nucleico diana.
El número de copias de moldes o amplicones que se puede producir se puede modular mediante la modificación apropiada de la reacción de amplificación, que incluye, por ejemplo, la variación del número de ciclos de amplificación ejecutados, utilización de polimerasas de procesividad variable en la reacción de amplificación y/o variación de la duración de tiempo en que se ejecuta la reacción de amplificación, así como la modificación de otras condiciones conocidas en la técnica para influir en el rendimiento de amplificación. El número de copias de un molde de ácido nucleico puede ser de al menos 1, 10, 100, 200, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 y 10.000 copias, y puede variar dependiendo de la aplicación particular.
Como se emplea en la presente memoria, el término "población clonal" se refiere a una población de ácidos nucleicos que es homogénea con respecto a una secuencia de nucleótidos particular. La secuencia homogénea puede tener al menos 10 nucleótidos de longitud o más, por ejemplo, al menos 50, 100, 250, 500 o 1000 nucleótidos de longitud. Una población clonal se puede obtener a partir de un solo ácido nucleico diana o ácido nucleico molde. Esencialmente, todos los ácidos nucleicos en una población clonal tienen la misma secuencia de nucleótidos. Se entenderá que se puede producir un pequeño número de mutaciones (p. ej. debido a artefactos de amplificación) en una población clonal sin apartarse de la clonalidad.
Como se emplea en la presente memoria, se pretende que el término "cada uno", cuando se utiliza en referencia a una colección de artículos, identifique un artículo individual en la colección, pero no se refiera necesariamente a cada artículo de la colección a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Como se emplea en la presente memoria, se pretende que el término "directamente" cuando se utiliza en referencia a una capa que cubre la superficie de un sustrato signifique que la capa cubre la superficie del sustrato sin una capa intermedia significativa, tal como, p. ej., una capa adhesiva. Las capas que cubren directamente una superficie se pueden fijar a esta superficie a través de cualquier interacción química o física, incluidos enlaces covalentes o adhesión no covalente.
En la presente memoria se proporcionan micromatrices, métodos y kits para amplificar un ácido nucleico inmovilizado sobre un sustrato, y métodos para modificar un cebador de captura inmovilizado.
Los métodos proporcionados en la presente memoria pueden implicar una captura inicial e inmovilización de un único polinucleótido diana por pocillo o elemento de una celda de flujo modelada utilizando un primer par de cebadores de captura en una primera capa en el pocillo o elemento. La captura del polinucleótido diana inicial puede estar seguida de una amplificación inicial del polinucleótido diana único para producir una población monoclonal de amplicones polinucleotídicos diana dentro del pocillo o elemento, p. ej., por KEA. Véanse, p. ej., las FIG. 1-4. La población monoclonal de los amplicones polinucleotídicos diana se puede aumentar posteriormente más allá de los límites del pocillo o elemento, p. ej., por KEA o PCR, para aumentar el brillo, la intensidad de la señal o la SNR de la característica o pocillo en una reacción de secuenciación posterior.
La ampliación de una población monoclonal de amplicones de polinucleótidos diana más allá del pocillo o la característica se puede lograr, de acuerdo con los métodos proporcionados en la presente memoria, p. ej., injertando cebadores universales bloqueados en 3’ en una segunda capa que rodea el pocillo o elemento que contienen la población monoclonal de amplicones polinucleotídicos diana. Véanse, p. ej., las FIG. 1.4 y 1.5. El aumento del amplicón se puede producir, p. ej., por PCR o KEA después de desproteger los cebadores universales bloqueados en 3’.
Véanse, p. ej., las FIG. 1.6 y 1.7.
En algunos métodos proporcionados en la presente memoria, la captura inicial de un polinucleótido diana dentro de un pocillo o elemento se produce mediante el uso de cebadores de captura que reconocen polinucleótidos diana como miembros de una biblioteca de polinucleótidos (p. ej., cebadores SBS3 o SBS8). Véanse, p. ej., las FIG. 2.2 y 2.6. El aumento posterior de los amplicones polinucleotídicos diana monoclonales se produce utilizando cebadores de captura universales (p. ej., cebadores P5 o P7) que se injertan en una capa que rodea el pocillo o elemento y que reconocen los polinucleótidos diana del amplicón polinucleotídico diana monoclonal. Véanse, p. ej., las FIG. 2.4 y 2.6.
En algún método proporcionado en la presente memoria, la captura inicial de un polinucleótido diana dentro de un pocillo o elemento se produce utilizando un primer par de cebadores de captura ubicado en una primera capa dentro del pocillo o elemento y está seguido de la amplificación del polinucleótido diana capturado dentro del pocillo para producir una población monoclonal de amplicones de polinucleótidos diana. Véanse, p. ej., las FIG.3.1-3.4. Posteriormente, se injerta un segundo par de cebadores de captura en una capa que rodea el pocillo y el aumento de la población monoclonal de amplicones polinucleotídicos diana se logra por PCR o KEA utilizando el segundo par de cebadores de captura. Véanse, p. ej., las FIG. 3.5 y 3.6.
En algunos métodos proporcionados en la presente memoria, la captura inicial de un polinucleótido diana, su amplificación y el aumento de las poblaciones resultantes de amplicones polinucleotídicos diana se produce dentro de pocillos o características ampliados de una celda de flujo modelada (p. ej., > 1,0 pm de diámetro) que contiene mezclas de cebadores de captura universales (p. ej., cebadores P5 y P7) y cebadores de captura que reconocen polinucleótidos diana de una biblioteca de polinucleótidos (p. ej., cebadores P5-SBS3 y P7-SBS8). Véase, p. ej., la FIG.4.
Los métodos proporcionados en la presente memoria pueden aumentar el rendimiento, la sensibilidad y la calidad de los datos de una reacción de NGS específica de la diana al permitir la producción de poblaciones monoclonales aumentadas de amplicones polinucleotídicos diana a altas densidades sobre celdas de flujo modeladas. Los métodos proporcionados en la presente memoria pueden aumentar el rendimiento, la sensibilidad y la calidad de los datos (p. ej., tasas más bajas de errores de secuenciación) de las reacciones de secuenciación y permitir el uso de óptica relativamente simple y aparatos económicos.
Las micromatrices proporcionadas en la presente memoria incluyen un sustrato con uno o más pocillos y una o más capas que cubren la superficie interna de los pocillos y/o la superficie que rodea los pocillos.
Algunas micromatrices proporcionadas en la presente memoria tienen una pluralidad de pocillos, cada uno con una población monoclonal de polinucleótidos diana inmovilizados. Véanse, p. ej., las FIG. 1.5, 2.6, 3.4 y 4.3. Diferentes pocillos de la pluralidad de pocillos pueden tener poblaciones monoclonales de los mismos polinucleótidos diana o de polinucleótidos diana diferentes.
Algunas micromatrices proporcionadas en la presente memoria tienen una o más capas y uno o más pares de cebadores de captura en cada una de las una o más capas. Véanse, p. ej., FIG. 1.2, 1.4, 2.2, 2.4, 3.2, 3.3 y 4.2. Estas micromatrices permiten la formación de poblaciones monoclonales de polinucleótidos diana inmovilizados en los pocillos de las micromatrices. Véanse, p. ej., las FIG. 1.5, 2.6, 3.4 y 4.3. Algunas micromatrices tienen pocillos dimensionados (p. ej., el diámetro del pocillo es <1 pm) para facilitar la amplificación de exclusión cinética (KEA) de polinucleótidos diana inmovilizados y la formación de poblaciones monoclonales de los polinucleótidos diana inmovilizados dentro de los confines de los pocillos. Véanse, p. ej., las FIG. 1.5, 2.6 (panel central) y 3.4. Las micromatrices pueden permitir adicionalmente el aumento de las poblaciones de polinucleótidos diana monoclonales más allá de los límites de los pocillos en una segunda etapa de amplificación. Véanse, p. ej., las FIG. 1.7, 2.6 (panel inferior) y 3.6. Otras micromatrices que permiten la formación de poblaciones monoclonales de polinucleótidos diana tienen pocillos ampliados (p. ej., el diámetro del pocillo es >1 pm) que no favorecen la exclusión cinética. Véase, p. ej., la FIG 4. En algunas realizaciones, los pocillos ampliados que no favorecen la exclusión cinética tienen al menos dos pares de cebadores de captura (p. ej., un par de cebadores de captura P5/P7). Véase, p. ej., FIG 4.2.
En algunas realizaciones, la amplificación isotérmica se puede realizar utilizando amplificación de exclusión cinética (KEA), también denominada amplificación de exclusión (ExAmp). Se puede preparar una biblioteca de ácido nucleico de la presente descripción utilizando un método que incluye una etapa en la que se hace reaccionar un reactivo de amplificación para producir una pluralidad de sitios de amplificación que incluyen cada uno una población de amplicones sustancialmente clonal de un ácido nucleico diana individual que ha sembrado el sitio. En algunas realizaciones, la reacción de amplificación continúa hasta que se genera un número suficiente de amplicones para completar la capacidad del sitio de amplificación respectivo. Completar un sitio ya sembrado hasta su capacidad de esta manera inhibe el desembarco y la amplificación de los ácidos nucleicos diana en el sitio, produciendo así una población clonal de amplicones en el sitio. En algunas realizaciones, se puede lograr la clonalidad aparente incluso si un sitio de amplificación no se completa hasta su capacidad antes de que un segundo ácido nucleico diana llegue al sitio. En algunas condiciones, la amplificación de un primer ácido nucleico diana puede llegar a un punto en el que se realiza un número suficiente de copias para superar o sobrepasar eficazmente la producción de copias a partir de un segundo ácido nucleico diana que se transporta al sitio. Por ejemplo, en una realización que utiliza un procedimiento de amplificación de puente en un elemento circular que tiene menos de 500 nm de diámetro, se ha determinado que después de 14 ciclos de amplificación exponencial para un primer ácido nucleico diana, la contaminación de un segundo ácido nucleico diana en el mismo sitio producirá un número insuficiente de amplicones contaminantes que afectará negativamente al análisis de secuenciación por síntesis en una plataforma de secuenciación Illumina.
Como se demuestra en el ejemplo anterior, los sitios de amplificación en una matriz pueden ser, pero no son necesariamente, completamente clonales en realizaciones particulares. Más bien, para algunas aplicaciones, un sitio de amplificación individual puede estar predominantemente poblado con amplicones de un primer ácido nucleico diana y también puede tener un bajo nivel de amplicones contaminantes de un segundo ácido nucleico diana. Una matriz puede tener uno o más sitios de amplificación que tienen un bajo nivel de amplicones contaminantes siempre que el nivel de contaminación no tenga un impacto inaceptable sobre un uso posterior de la matriz. Por ejemplo, cuando la matriz se va a utilizar en una aplicación de detección, un nivel aceptable de contaminación sería un nivel que no afecte a la señal/ruido o la resolución de la técnica de detección de una manera inaceptable. En consecuencia, la clonalidad aparente generalmente será relevante para un uso o aplicación particulares de una matriz realizada por los métodos establecidos en la presente memoria. Los niveles ejemplares de contaminación que pueden ser aceptables en un sitio de amplificación individual para aplicaciones particulares incluyen, pero no se limitan a, como máximo, amplicones contaminantes a 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10% o 25%. Una matriz puede incluir uno o más sitios de amplificación que tengan estos niveles ejemplares de amplicones contaminantes. Por ejemplo, hasta 5%, 10%, 25%, 50%, 75% o incluso el 100% de los sitios de amplificación en una matriz pueden tener algunos amplicones contaminantes. Se entenderá que en una matriz u otra colección de sitios, al menos 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% o más de los sitios pueden ser clonales o aparentemente clonales.
En algunas realizaciones, la exclusión cinética puede ocurrir cuando se produce un procedimiento a una tasa suficientemente rápida para excluir eficazmente que ocurra otro evento o procedimiento. Tómese, por ejemplo, la creación de una matriz de ácido nucleico donde los sitios de la matriz se siembran aleatoriamente con ácidos nucleicos diana a partir de una solución y se generan copias del ácido nucleico diana en un procedimiento de amplificación para completar cada uno de los sitios sembrados hasta su capacidad. De acuerdo con los métodos de exclusión cinética de la presente descripción, los procedimientos de siembra y amplificación pueden proseguir simultáneamente en condiciones en las que la tasa de amplificación excede la tasa de siembra. Como tal, la tasa relativamente rápida a la que se producen copias en un sitio que ha sido sembrado por un primer ácido nucleico diana excluirá eficazmente la siembra con un segundo ácido nucleico en el sitio para la amplificación. Los métodos de amplificación de exclusión cinética se pueden realizar como se describe en detalle en la descripción de la Publicación de la Solicitud de Estados Unidos Núm. 2013/0338042.
La exclusión cinética puede explotar una tasa relativamente lenta para iniciar la amplificación (p. ej., una tasa lenta para preparar una primera copia de un ácido nucleico diana) frente a una tasa relativamente rápida para preparar copias posteriores del ácido nucleico diana (o de la primera copia del ácido nucleico diana). En el ejemplo del párrafo anterior, la exclusión cinética ocurre debido a la tasa relativamente lenta de siembra de ácido nucleico diana (p. ej., difusión o transporte relativamente lentos) frente a la tasa relativamente rápida a la que se produce la amplificación para completar el sitio con copias del ácido nucleico semilla. En otra realización ejemplar, la exclusión cinética puede ocurrir debido a un retraso en la formación de una primera copia de un ácido nucleico diana que ha sembrado un sitio (p. ej., activación retardada o lenta) frente a la tasa relativamente rápida a la que se realizan copias posteriores para completar el sitio. En este ejemplo, un sitio individual puede haber sido sembrado con varios ácidos nucleicos diana diferentes (p. ej., varios ácidos nucleicos diana pueden estar presentes en cada sitio antes de la amplificación). Sin embargo, la formación de la primera copia para cualquier ácido nucleico diana dado se puede activar aleatoriamente, de modo que la tasa promedio de formación de la primera copia sea relativamente lenta en comparación con la tasa a la que se generan las copias posteriores. En este caso, aunque un sitio individual puede haber sido sembrado con varios ácidos nucleicos diana diferentes, la exclusión cinética permitirá que solo uno de esos ácidos nucleicos diana se amplifique. Más específicamente, una vez que se ha activado un primer ácido nucleico diana para la amplificación, el sitio se completará rápidamente hasta su capacidad con sus copias, evitando así que se produzcan copias de un segundo ácido nucleico diana en el sitio.
Un reactivo de amplificación puede incluir adicionalmente componentes que facilitan la formación de amplicones y, en algunos casos, aumentan la tasa de formación de amplicones. Un ejemplo es una recombinasa. La recombinasa puede facilitar la formación de amplicones al permitir la invasión/extensión repetida. Más específicamente, la recombinasa puede facilitar la invasión de un ácido nucleico diana por la polimerasa y la extensión de un cebador por la polimerasa utilizando el ácido nucleico diana como molde para la formación de amplicones. Este procedimiento puede repetirse como una reacción en cadena donde los amplicones producidos a partir de cada ronda de invasión/extensión sirven como moldes en una ronda posterior. El procedimiento puede ocurrir más rápidamente que la PCR convencional ya que no se requiere un ciclo de desnaturalización (p. ej., por calentamiento o desnaturalización química). Como tal, la amplificación facilitada por recombinasa puede llevarse a cabo isotérmicamente. Generalmente es deseable incluir ATP u otros nucleótidos (o en algunos casos análogos no hidrolizables de los mismos) en un reactivo de amplificación facilitada por recombinasa para facilitar la amplificación. Una mezcla de recombinasa y proteína de unión de hebra sencilla (SSB) es particularmente útil ya que la SSB puede facilitar adicionalmente la amplificación. Las formulaciones ejemplares para la amplificación facilitada por recombinasa incluyen las comercializadas como kits TwistAmp de TwistDx (Cambridge, Reino Unido). Los componentes útiles del reactivo de amplificación facilitada por recombinasa y las condiciones de reacción se exponen en los documentos US 5.223.414 y US 7.399.590.
Otro ejemplo de un componente que se puede incluir en un reactivo de amplificación para facilitar la formación de amplicones y, en algunos casos, para aumentar la tasa de formación de amplicones es una helicasa. La helicasa puede facilitar la formación de amplicones al permitir una reacción en cadena de formación de amplicones. El procedimiento puede ocurrir más rápidamente que la PCR convencional ya que no se requiere un ciclo de desnaturalización (p. ej., por calentamiento o desnaturalización química). Como tal, la amplificación facilitada por helicasa se puede llevar a cabo isotérmicamente. Una mezcla de helicasa y proteína de unión de hebra sencilla (SSB) es particularmente útil ya que la SSB puede facilitar adicionalmente la amplificación. Las formulaciones ejemplares para la amplificación facilitada por helicasa incluyen las comercializadas como kits IsoAmp de Biohelix (Beverly, MA). Adicionalmente, se describen ejemplos de formulaciones útiles que incluyen una proteína helicasa en los documentos US 7.399.590 y US 7.829.284.
Otro ejemplo más de un componente que se puede incluir en un reactivo de amplificación para facilitar la formación de amplicones y, en algunos casos, aumentar la tasa de formación de amplicones es una proteína de unión al origen.
En un aspecto, en la presente memoria se proporcionan micromatrices que incluyen a) un sustrato que incluye al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo; b) una primera capa que cubre al menos parcialmente la superficie interna del pocillo y que incluye al menos un primer par de cebadores de captura; y c) una segunda capa que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo en donde el primer par de cebadores de captura está presente y es funcional en un ensayo de exclusión cinética después de que se haya proporcionado la segunda capa.
En algunas micromatrices, el tamaño del pocillo (p. ej., diámetro) se selecciona en un intervalo que favorece la amplificación de exclusión cinética (KEA) y la formación de poblaciones monoclonales de polinucleótidos específicos de la diana dentro de un pocillo. Se describe la amplificación de exclusión cinética de las bibliotecas de ácido nucleico, p. ej., en la Publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2013/0338042. Por ejemplo, el tamaño del pocillo (p. ej., diámetro) puede variar entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 1 pm, entre aproximadamente 50 nm y aproximadamente 800 nm, entre aproximadamente 70 nm y aproximadamente 600 nm, o entre 100 nm y aproximadamente 400 nm. En algunas realizaciones, el pocillo tiene un diámetro de aproximadamente 400 nm. Véase, p. ej., la FIG. 1. 1. En algunas realizaciones, el pocillo tiene un diámetro de menos de aproximadamente 1 pm. Las micromatrices ejemplares incluyen las micromatrices en las celdas de flujo modeladas Illumina® HiSeq-X10.
En otro aspecto, en la presente memoria se proporcionan micromatrices, que incluyen a) un sustrato que incluye al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo, en donde el diámetro del pocillo es de aproximadamente 1 pm o más; y b) una capa que cubre la superficie interna del pocillo e incluye al menos un primer par de cebadores de captura y al menos un segundo par de cebadores de captura.
Las micromatrices proporcionadas en la presente memoria se pueden producir, p. ej., como se describe en la Publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2013/0096034.
En algunas micromatrices, el pocillo puede tener un diámetro de entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 10 pm, entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 8 pm, entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 6 pm, entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 4 pm, o entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 2 pm. En algunas realizaciones, el pocillo tiene un diámetro de aproximadamente 1,5 pm. Véase, p. ej., la FIG.4.1. En algunas realizaciones, el pocillo tiene un diámetro de más de aproximadamente 1 pm. Véase, p. ej., la FIG.4.1.
El sustrato puede se puede preparar a partir de cualquier material conocido en la técnica que sea útil para la producción de micromatrices de ácido nucleico. Por ejemplo, el sustrato puede ser silicio u otra sílice o silicatos, vidrio, plásticos, polisacáridos, nailon, resinas de nitrocelulosa, carbono y metales u otro soporte sólido. Se proporcionan materiales sustrato ejemplares en la Publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2013/0096034.
Una micromatriz puede tener dos o más pocillos (una pluralidad de pocillos). Los pocillos de una pluralidad de pocillos pueden estar espaciados a la misma distancia o a diferentes distancias. La separación de los pocillos se puede expresar, p. ej., como la distancia interespacial entre dos pocillos o como el "paso", que incluye la distancia interespacial entre dos pocillos y el diámetro de un pocillo. Véase, p. ej., la FIG. 1.1 (la distancia interespacial entre dos pocillos es de 700 nm; el paso es de 1,5 pm).
En algunas realizaciones, la micromatriz tiene entre aproximadamente 100.000 y aproximadamente 5.000.000 pocillos/mm2, entre aproximadamente 250.000 y aproximadamente 4.500.000 pocillos/mm2, entre aproximadamente 500.000 y aproximadamente 4.000.000 pocillos/mm2, entre aproximadamente 750.000 y aproximadamente 3.500.000 pocillos/mm2, entre aproximadamente 1.000.000 y aproximadamente 3.000.000 pocillos/mm2, entre aproximadamente 1.250.000 y aproximadamente 2.500.000 pocillos/mm2, entre aproximadamente 1.500.000 y aproximadamente 2.500.000 pocillos/mm2, entre aproximadamente 1.750.000 y aproximadamente 2.250.000 pocillos/mm2, o entre aproximadamente 2.000.000 y aproximadamente 2.250.000 pocillos/mm2. En algunas realizaciones, la micromatriz tiene aproximadamente 2.100.000 pocillos/mm2 (p. ej., celdas de flujo modeladas Illumina® HiSeq).
En algunas realizaciones, la micromatriz tiene entre aproximadamente 10.000 y aproximadamente 1.000.000 de pocillos/mm2, entre aproximadamente 50.000 y aproximadamente 900.000 pocillos/mm2, entre aproximadamente 100.000 y aproximadamente 800.000 pocillos/mm2, entre aproximadamente 200.000 y aproximadamente 700.000 pocillos/mm2, entre aproximadamente 300.000 y aproximadamente 600.000 pocillos/mm2, o entre aproximadamente 400.000 y aproximadamente 500.000 pocillos/mm2. En algunas realizaciones, la micromatriz tiene aproximadamente 450.000 pocillos/mm2 (p. ej., celdas de flujo modeladas Illumina® NextSeq).
Los pocillos de las micromatrices se pueden espaciar para optimizar la densidad del pocillo, a la vez que se permite su resolución óptica robusta. Por ejemplo, dos pocillos de una pluralidad de pocillos pueden estar espaciados a una distancia interespacial de entre aproximadamente 10 nm y 10 pm, entre aproximadamente 50 nm y 8 pm, entre aproximadamente 100 nm y aproximadamente 6 pm, entre aproximadamente 200 nm y aproximadamente 4 pm, entre aproximadamente 300 nm y aproximadamente 2 pm, entre aproximadamente 400 nm y aproximadamente 1 pm, entre aproximadamente 500 nm y aproximadamente 900 nm, o entre aproximadamente 600 nm y aproximadamente 800 nm. En algunas realizaciones, dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos están espaciados a una distancia de aproximadamente 700 nm. Véase, p. ej., la FIG.1.1. En algunas realizaciones, dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos están espaciados a una distancia de menos de aproximadamente 1 pm. En algunas realizaciones, dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos están espaciados a una distancia de más de aproximadamente 1 pm.
Dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos pueden disponerse en un paso de entre aproximadamente 10 nm y 10 pm, entre aproximadamente 50 nm y 8 pm, entre aproximadamente 100 nm y aproximadamente 6 pm, entre aproximadamente 500 nm y aproximadamente 4 pm, o entre aproximadamente 1 pm y aproximadamente 2 pm. En algunas realizaciones, dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos están dispuestos en un paso de aproximadamente 1,5 pm. Véase, p. ej., la FIG.1.1. En algunas realizaciones, dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos están dispuestos en un paso de menos de aproximadamente 1 pm. En algunas realizaciones, dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos están espaciados en un paso de más de aproximadamente 1 pm.
Las micromatrices proporcionadas en la presente memoria incluyen una o más capas. Por ejemplo, una micromatriz puede incluir una sola capa, una primera y una segunda capas, una primera, segunda y tercera capas, y así sucesivamente.
Una primera capa puede cubrir la superficie interna del pocillo. La primera capa no cubre la superficie que rodea el pocillo. La primera capa puede cubrir la superficie interna del pocillo en su totalidad, incluyendo, p. ej., la superficie de las paredes del pocillo y la superficie en el fondo del pocillo. En algunas realizaciones, la primera capa cubre solo parcialmente la superficie interna del pocillo. Por ejemplo, la primera capa puede cubrir solo la superficie en el fondo del pocillo, pero no la superficie de las paredes del pocillo. La primera capa puede cubrir la superficie interna de todos los pocillos de una pluralidad de pocillos o solo de una fracción de pocillos de la pluralidad de pocillos. Por ejemplo, la primera capa puede cubrir la superficie interna de menos de 100%, menos de 99%, menos de 95%, menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55%, menos de 50%, menos de 45%, menos de 40%, menos de 35%, menos de 30%, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10%, menos de 5%, menos de 2% o menos de 1% de los pocillos de la pluralidad de pocillos. En otro ejemplo, la primera capa puede cubrir la superficie interna de más de 1%, más de 2%, más de 5%, más de 10%, más de 15%, más de 20%, más de 25%, más de 30%, más de 35%, más de 40%, más de 45%, más de 50%, más de 55%, más de 60%, más de 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95% o más de 99% de los pocillos de la pluralidad de pocillos. La primera capa puede cubrir la superficie del sustrato, incluida la superficie interna del pocillo, directa o indirectamente, p. ej., a través de una o más capas intermedias. Se pueden utilizar una o más capas intermedias, por ejemplo, para mejorar la adhesión de la primera capa al sustrato, p. ej., a la superficie interna del pocillo.
Una segunda capa cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo. La segunda capa puede cubrir la superficie que rodea todos los pocillos de una pluralidad de pocillos o solo de una fracción de los pocillos de la pluralidad de pocillos. Por ejemplo, la segunda capa puede cubrir la superficie que rodea menos de 100%, menos de 99%, menos de 95%, menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55%, menos de 50%, menos de 45%, menos de 40%, menos de 35%, menos de 30%, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10%, menos de 5%, menos de 2% o menos de 1% de los pocillos de la pluralidad de pocillos. En otro ejemplo, la primera capa puede cubrir la superficie que rodea más de 1%, más de 2%, más de 5%, más de 10%, más de 15%, más de 20%, más de 25%, más de 30%, más de 35%, más de 40%, más de 45%, más de 50%, más de 55%, más de 60%, más de 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95% o más de 99% de los pocillos de la pluralidad de pocillos. La segunda capa puede cubrir la primera capa y/o la superficie que rodea los pocillos directa o indirectamente, p. ej., a través de una o más capas intermedias. Se pueden utilizar una o más capas intermedias, por ejemplo, para mejorar la adhesión entre la segunda capa y la primera capa y/o entre la segunda capa y el sustrato que rodea el pocillo.
Una capa puede incluir cualquier material conocido en la técnica que pueda depositarse sobre una superficie, que tenga afinidad por los ácidos nucleicos y sea útil para el depósito de un ácido nucleico, tal como un cebador. Los recubrimientos poliméricos útiles para el depósito de ácidos nucleicos son bien conocidos en la técnica. Algunos recubrimientos poliméricos útiles para el depósito de ácidos nucleicos se describen en la Publicación de Patente de Estados Unidos Núm. 2014/0079923 A1. Los recubrimientos poliméricos ejemplares incluyen poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida (PAZAM) y acrilamida libre de silano (SFA).
En algunas realizaciones, una capa incluye un recubrimiento polimérico. En algunas realizaciones, el recubrimiento polimérico en una capa incluye PAZAM. En algunas realizaciones, el recubrimiento polimérico en una primera capa incluye PAZAM o SFA. En algunas realizaciones, el recubrimiento polimérico en una segunda capa incluye PAZAM o SFA.
Una capa puede incluir uno o más cebadores de captura. Por ejemplo, una capa puede incluir un cebador de captura único, un primer y un segundo cebadores de captura, un primer, segundo y tercer, cebadores de captura y así sucesivamente.
Pueden estar presentes dos o más cebadores de captura en un pocillo en cualquier razón. Por ejemplo, un primer cebador de captura y un segundo cebador de captura pueden estar presentes en cantidades aproximadamente iguales o en cualquier otra proporción, p. ej., razón molar. Un pocillo puede tener más de 1,1x, más de 1,2x, más de 1,3x, más de 1,4x, más de 1,5x, más de 2,0x, más de 2,5x, más de 3,0x, más de 5,0x, más de 15x, más de 20x, más de 20x, más de 25x, más de 30x, más de 50x, más de 100x, más de 300x, más de 500x o más de 1.000x en exceso de un primer cebador de captura sobre un segundo cebador de captura. Los diferentes pocillos en una micromatriz pueden tener la misma razón de los dos o más cebadores de captura o una razón diferente.
Un cebador de captura puede incluir una o más regiones de captura. Una región de captura puede incluir, p. ej., una región de captura universal, un sitio de unión al cebador de secuenciación (SBS), una región de captura específica de la diana, un sitio de escisión predeterminado, tal como un sitio de restricción y una región conectora, p. ej., una región conectora que separa dos o más sitios de restricción. Algunos cebadores de captura pueden incluir, p. ej., una región de captura universal y un SBS. Otros cebadores de captura pueden incluir una región de captura universal y una región de captura específica de la diana. Un cebador de captura se puede bloquear en el extremo 3’ (bloqueado en 3’) o no bloqueado en el extremo 3’ (no bloqueado en 3’). Un cebador con extremos 3’ bloqueado puede estar, p. ej., terminado en 3’-fosfato. Algunos cebadores con extremos 3’ bloqueados se pueden desbloquearse. El desbloqueo se puede producir ocurrir en una reacción enzimática o una reacción química. La reacción enzimática puede estar mediada, p. ej., por una quinasa o una fosfatasa. Por ejemplo, un cebador terminado en 3’-fosfato puede ser desbloqueado por una quinasa, como la quinasa T4.
Una región de captura universal puede incluir, p. ej., una región que tiene la secuencia de un cebador de captura universal Illumina® o una región que hibrida específicamente con un cebador de captura universal Illumina®. Los cebadores de captura Universal Illumina® incluyen, p. ej., P55'-AATGATACGGCGACCACCGA-3’ ((SEQ ID NO: 1)) o P7 (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’ (SEQ ID nO: 2)), o fragmentos de los mismos. Una región que hibrida específicamente con un cebador de captura universal Illumina® puede incluir, p. ej., el complemento inverso de la secuencia del cebador de captura P5 de Illumina® ("anti-P5": 5'-TCGGTGGTCGCCGTATCATT-3’ (SEQ ID NO: 3) o P7 ("anti-P7": 5'-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’ (SEQ ID NO: 4)), o fragmentos de los mismos.
Un SBS puede incluir, p. ej., una región que tiene la secuencia de un cebador de secuenciación Illumina®, o un fragmento del mismo, o una región que hibrida específicamente con un cebador de secuenciación Illumina®, o un fragmento del mismo. Los cebadores de secuenciación Illumina® incluyen, p. ej., SBS3 (5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’ (SEQ ID NO: 5)) o SBS8 (5'-CGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT-3’ (SEQ ID NO: 6)). Una región que hibrida específicamente con un cebador de secuenciación Illumina®, o un fragmento del mismo, puede incluir, p. ej., el complemento inverso de la secuencia del cebador de secuenciación SBS3 de Illumina® ("anti-SBS3": 5'-AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT-3’ (SEQ ID NO: 7)) o SBS8 ("anti-SBS8": 5'-AGATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAGACCG SEQ ID NO: 8)), o fragmentos de los mismos.
Un cebador de captura puede tener cualquier combinación de regiones, p. ej., cualquier combinación de regiones de los cebadores P5, P7, SBS3 o SBS8 de Illumina®, o fragmentos de las mismas, incluidas combinaciones tales como P5-SBS3 y P7-SBS8, o fragmentos de las mismas.
Un cebador de captura puede incluir un sitio de escisión predeterminado (no aleatorio). Se describen posibles sitios de escisión predeterminados, p. ej., en la Patente de Estados Unidos Núm. 8.715.966 B2. La escisión en sitios predeterminados puede ocurrir, p. ej., como escisión enzimática o escisión no enzimática, tal como la escisión química. La escisión enzimática en un sitio predeterminado, tal como los sitios de restricción, puede estar mediada, p. ej., por una enzima de restricción, tal como una endonucleasa de restricción. En algunas realizaciones, un sitio de escisión predeterminado en un cebador puede incluir una base de uracilo. La escisión puede ocurrir a través del tratamiento del cebador que contiene uracilo con una uracilo ADN glicosilasa, para formar un sitio abásico en el cebador, seguido del tratamiento con una endonucleasa, calor o álcali, para escindir el cebador en el sitio abásico. En algunas realizaciones, el sitio de escisión predeterminado incluye un conector diólico, que se puede escindir por tratamiento con peryodato. En algunas realizaciones, el sitio de escisión predeterminado incluye una 8-oxo-guanina.
El sitio de escisión predeterminado puede incluir un sitio de restricción enzimática. Se puede utilizar cualquier enzima de restricción o cualquier sitio de restricción enzimática conocido por un experto en la técnica en un método o composición proporcionados en la presente memoria. Por ejemplo, la endonucleasa de restricción puede ser una enzima Tipo I (EC 3.1.21.3), una enzima Tipo II (EC 3.1.21.4), una enzima Tipo III (EC 3.1.21.5) o una enzima Tipo IV (EC 3.1. 21.5). Las endonucleasas de restricción pueden incluir, por ejemplo, sin limitación, Alu I, Ava I, Bam HI, Bgl II, Eco P15 I, Eco RI, Eco RII, Eco RV, Hae III, Hga I, Hha I, Hind III, Hinf I, Hpa I, Kpn I, Mbo I, Not I, Pst I, Pvu II, Sac I, Sal I, SapI, Sau 3A, Sca I, Sma I, Spe I, Sph I, Sst I, Stu I, Taq I, Xba I o Xma I. La endonucleasa de restricción puede ser una enzima de restricción recombinante. Las enzimas de restricción recombinantes pueden incluir, sin limitación, proteínas de fusión que incluyen un dominio de unión al ADN natural o modificado genéticamente (p. ej., dominios de dedo cinc, dominios efectores TAL) y un dominio de nucleasa (p. ej., el dominio de escisión de la enzima de restricción Tipo IIS Fokl).
En algunas realizaciones, el sitio de reconocimiento de enzimas de restricción incluye un sitio SapI ("5'-GCTCTTCNvNNN-3' (SEQ ID NO: 9). Véase, p. ej., la FIG.6D.
La enzima de restricción se puede obtener a partir de cualquier organismo que exprese la biomolécula respectiva, incluidos eucariotas (p. ej., plantas, insectos, mamíferos) y procariotas. En ciertas realizaciones, la biomolécula se obtiene a partir de eubacterias (p. ej., gram positivas, gram negativas), arqueobacterias, levadura, hongos, algas. Los procariotas pueden incluir, por ejemplo, sin limitación Arthrobacter luteus, Anabaena variabilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus globigii, Escherichia coli RY 13, Escherichia coli R245, Haemophilus aegyptius, haemolyticus, Haemophilus influenzae R d, Haemophilus gallinarum, Haemophilus parainfluenzae, Klebsiella pneumoniae, Moraxella bovis, Nocardia otitidis, Proteus vulgaris, Providencia stuartii, Serratia marcescens, Sphaerotilus natans, Staphylococcus aureus, Streptomyces achromogenes, Streptomyces albus G, Streptomyces caespitosus, Streptomyces stanford, Streptomyces tuberdidicus, Streptomyces phaechromogenes, Themophilus aquaticus, Xhantomonas badrii, o Xhantomonas malvacearum.
La enzima de restricción puede ser una forma de tipo salvaje o mutante. La enzima de restricción puede ser una biomolécula recombinante.
En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente poner en contacto un cebador de captura que incluye un sitio de restricción parcial con una nucleasa, en donde la nucleasa elimina el sitio de restricción parcial. En algunas realizaciones, la nucleasa es una exonucleasa. En algunas realizaciones, la exonucleasa es la exonucleasa I.
Un cebador de captura puede incluir un par de cebadores de captura. Por ejemplo, el primer cebador de captura puede ser un primer par de cebadores de captura, que incluye un primer cebador de captura del primer par de cebadores de captura y un segundo cebador del primer par de cebadores de captura. En otro ejemplo, el segundo cebador de captura puede ser un segundo par de cebadores de captura, que incluye un primer cebador de captura del segundo par de cebadores de captura y un segundo cebador de captura del segundo par de cebadores de captura.
Los cebadores de captura de un par de cebadores de captura pueden incluir cualquier región de captura o cualquier combinación de regiones de captura. Por ejemplo, el primer cebador de un par de cebadores de captura puede incluir una primera región de captura universal y el segundo cebador del par de cebadores de captura puede incluir una segunda región de captura universal. Los cebadores del par de cebadores de captura pueden incluir adicionalmente un SBS. Por ejemplo, el primer cebador del par de cebadores de captura puede incluir una primera región del cebador de captura universal y un primer SBS y el segundo cebador del par de cebadores de captura puede incluir una segunda región de captura universal y un segundo SBS.
En algunas realizaciones, el primer cebador de un par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y el segundo cebador del par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®. Véase, p. ej., la FIG. 1.2.
En algunas realizaciones, el primer cebador de un par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3 de Illumina®, y el segundo cebador del par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS8 de Illumina®. Véase, p. ej., la FIG. 2.2.
En otro ejemplo, el primer cebador de captura de un primer par de cebadores de captura puede incluir una primera región de captura universal, el segundo cebador de captura del primer par de cebadores de captura puede incluir una segunda región de captura universal, el primer cebador de captura de un segundo par de cebadores de captura puede incluir una primera región de cebador de captura universal y un primer SBS, y el segundo cebador de captura del segundo par de cebadores de captura puede incluir una segunda región de captura universal y un segundo SBS.
En algunas realizaciones, el primer cebador de captura de un primer par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina®, el segundo cebador de captura del primer par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®, el primer cebador de captura de una segundo par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3 de Illumina®, y el segundo cebador de captura del segundo par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS8 de Illumina®. Véase, p. ej., la FIG.4.2.
Los pares de cebadores de captura pueden incluir un solo par de cebadores de captura o una pluralidad de pares de cebadores de captura. Por ejemplo, el primer par de cebadores de captura puede ser una pluralidad de primeros pares de cebadores de captura. En algunas realizaciones, el primer par de cebadores de captura es al menos un par de cebadores de captura. En otro ejemplo, el segundo par de cebadores de captura puede ser una pluralidad de segundos pares de cebadores de captura. En algunas realizaciones, el segundo par de cebadores de captura es al menos un par de cebadores de captura.
Los cebadores de captura pueden incluir un solo cebador de captura o una pluralidad de cebadores de captura.
El primer y el segundo cebadores de captura de un par de cebadores de captura pueden ser cada uno una pluralidad de cebadores de captura. Por ejemplo, el primer cebador de captura de un par de cebadores de captura puede ser una pluralidad de primeros cebadores de captura. En otro ejemplo, el segundo cebador de captura de un par de cebadores de captura puede ser una pluralidad de segundos cebadores de captura.
En algunas realizaciones, el primer cebador de captura de un primer par de cebadores de captura incluye una pluralidad de primeros cebadores de captura del primer par de cebadores de captura. En algunas realizaciones, el segundo cebador de captura del primer par de cebadores de captura incluye una pluralidad de segundos cebadores de captura del primer par de cebadores de captura. En algunas realizaciones, el primer cebador de captura del segundo par de cebadores de captura incluye una pluralidad de primeros cebadores de captura del segundo par de cebadores de captura. En algunas realizaciones, el segundo cebador de captura del segundo par de cebadores de captura incluye una pluralidad de segundos cebadores de captura del segundo par de cebadores de captura.
En algunas realizaciones, el al menos un primer par de cebadores de captura es una pluralidad de primeros pares de cebadores de captura.
En algunas realizaciones, la segunda capa incluye al menos un segundo par de cebadores de captura. En algunas realizaciones, el al menos un segundo par de cebadores de captura es una pluralidad de segundos pares de cebadores de captura.
Algunas micromatrices proporcionadas en la presente memoria pueden capturar polinucleótidos diana en bibliotecas de secuenciación de ADN que están flanqueadas por regiones de captura universales. Estas micromatrices pueden tener un primer cebador de captura en la primera capa que tiene una región de captura universal y que está desbloqueada en sus extremos 3’. Algunos de estas micromatrices tienen una segunda capa con un segundo cebador de captura que tiene la misma región de captura universal que el cebador en la primera capa y que está bloqueada en 3’. Véase, p. ej., la FIG.1.4. Algunas otras de estas micromatrices no tienen segundo cebador de captura y/o no tienen una segunda capa. Véanse, p. ej., las FIG. 3.2 y 3.3.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un primer par de cebadores de captura incluyen una región de captura universal. En algunas realizaciones, el primer cebador del al menos un primer par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y el segundo cebador del al menos un primer par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®.
En algunas realizaciones, la segunda capa incluye al menos un segundo par de cebadores de captura. En algunas realizaciones, el al menos un segundo par de cebadores de captura es una pluralidad de segundos pares de cebadores de captura.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura están bloqueados en el extremo 3’. En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura están terminados en 3’-fosfato. En algunas realizaciones, los cebadores terminados en 3’-fosfato del al menos un segundo par de cebadores de captura incluyen una región de captura universal. En algunas realizaciones, el primer cebador del al menos un segundo par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y el segundo cebador del al menos un segundo par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®.
Algunas micromatrices proporcionadas en la presente memoria pueden capturar polinucleótidos diana en bibliotecas de secuenciación de ADN que están flanqueadas por regiones SBS. Véase, p. ej., la FIG. 2.2. Estas micromatrices pueden tener un cebador de captura en su primera capa que tiene una región de captura universal combinada con un SBS. La segunda capa puede tener un cebador de captura que tiene una región de captura universal y que está desbloqueada en 3’. En algunas realizaciones, las bibliotecas de secuenciación de ADN pueden incluir polinucleótidos diana flanqueados por secuencias de nucleótidos P5-SBS3 y/o P7-SBS8, o fragmentos de las mismas. En algunas realizaciones, los fragmentos de las secuencias de nucleótidos P5-SBS3 y/o P7-SBS8 pueden ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25 o más nucleótidos más cortos que las secuencias de nucleótidos P5-SBS3 y/o P7-SBS8 completas.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un primer par de cebadores de captura incluyen adicionalmente un SBS. En algunas realizaciones, el primer cebador de al menos un primer par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3 de Illumina®, y el segundo cebador del al menos un primer par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS8 de Illumina®.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura no están bloqueados en el extremo 3’. En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura incluyen una región de captura universal. En alguna realización, el primer cebador del al menos un segundo par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y el segundo cebador del al menos un segundo par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®.
Algunas micromatrices proporcionadas en la presente memoria tienen una pluralidad de pocillos, por lo que cada pocillo de la pluralidad de pocillos tiene una población monoclonal de polinucleótidos diana inmovilizados. Los polinucleótidos diana inmovilizados se pueden unir a cualquier cebador de captura, que incluye, p. ej., cualquier cebador de captura del al menos un primer par de cebadores de captura o cualquier cebador de captura del al menos un segundo par de cebadores de captura. Los polinucleótidos diana se pueden unir a algunos o todos los cebadores de captura dentro de un pocillo. Cualquier número de pocillos de una micromatriz puede tener poblaciones monoclonales de polinucleótidos diana, incluidos un pocillo, algunos pocillos o todos los pocillos.
Algunas poblaciones monoclonales de polinucleótidos diana pueden consistir esencialmente en amplicones de un único polinucleótido diana. Algunas poblaciones monoclonales de polinucleótidos diana pueden incluir pequeñas fracciones de uno o más polinucleótidos adicionales. Por ejemplo, algunas poblaciones monoclonales de polinucleótidos diana pueden incluir amplicones de un único polinucleótido diana predominante y una pequeña fracción de menos de 30%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10%, menos de 5%, menos de 3%, menos de 2% o menos de 1% de otros polinucleótidos.
Los polinucleótidos diana se pueden unir a algunos o todos los cebadores de captura dentro de un pocillo. Por ejemplo, los polinucleótidos diana se pueden unir a más de 0,5%, más de 1%, más de 2%, más de 3%, más de 5%, más de 10%, más de 15%, más de 20%, más de 25%, más de 30%, más de 35%, más de 40%, más de 45%, más de 50%, más de 55%, más de 60%, más de 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, más de 98%, más de 99%, más de 99,9%, más de 99,99% o 100% de cebadores de captura dentro de un pocillo.
En algunas micromatrices, más de 1%, más de 2%, más de 3%, más de 5%, más de 10%, más de 15%, más de 20%, más de 25%, más de 30%, más de 35%, más de 40%, más de 45%, más de 50%, más de 55%, más de 60%, más de 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, más de 98% o más de 99% de los pocillos tienen una población monoclonal de polinucleótidos diana inmovilizados.
Diferentes pocillos pueden tener poblaciones monoclonales del mismo polinucleótido diana o de polinucleótidos diana diferentes. En algunas micromatrices, más de 1%, más de 2%, más de 3%, más de 5%, más de 10%, más de 15%, más de 20%, más de 25%, más de 30%, más de 35%, más de 40%, más de 45%, más de 50%, más de 55%, más de 60%, más de 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, más de 98% o más de 99% de los pocillos tienen poblaciones monoclonales del mismo polinucleótido diana inmovilizado. En algunas micromatrices, más de 1%, más de 2%, más de 3%, más de 5%, más de 10%, más de 15%, más de 20%, más de 25%, más de 30%, más de 35%, más de 40%, más de 45%, más de 50%, más de 55%, más de 60%, más de 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, más de 98%, más de 99%, más de 99,9% o más de 99,99% de los pocillos tienen poblaciones monoclonales de diferentes polinucleótidos diana inmovilizados. En algunas micromatrices, más de 1, más de 3, más de 30, más de 100, más de 300, más de 1.000, más de 3.000, más de 10.000 o más de 30.000 pocillos tienen cada uno una población monoclonal de un polinucleótido diana inmovilizado diferente.
En algunas realizaciones, una pluralidad de cebadores de captura del al menos un primer par de cebadores de captura está unida a un polinucleótido diana. En algunas realizaciones, la pluralidad de polinucleótidos diana forma una población monoclonal de polinucleótidos diana en el al menos un pocillo. En algunas realizaciones, el al menos un pocillo incluye una pluralidad de pocillos y en donde dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos incluyen una población monoclonal de polinucleótidos diana. En algunas realizaciones, los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos incluyen una población monoclonal del mismo polinucleótido diana. En algunas realizaciones, los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos incluyen una población monoclonal de dos o más polinucleótidos diana diferentes.
En algunas realizaciones, el al menos un primer par de cebadores de captura es una pluralidad de primeros pares de cebadores de captura y el al menos un segundo par de cebadores de captura es una pluralidad de segundos pares de cebadores de captura, y en donde una pluralidad de cebadores de la pluralidad de primeros pares de cebadores de captura y la pluralidad de segundos pares de cebadores de captura están unidos a una pluralidad de polinucleótidos diana. En algunas realizaciones, la pluralidad de polinucleótidos diana forma una población monoclonal de polinucleótidos diana en el al menos un pocillo. En algunas realizaciones, el al menos un pocillo es una pluralidad de pocillos y en donde dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos incluyen una población monoclonal de polinucleótidos diana. En algunas realizaciones, los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos incluyen una población monoclonal del mismo polinucleótido diana. En algunas realizaciones, los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos incluyen una población monoclonal de dos o más polinucleótidos diana diferentes.
Los métodos proporcionados en la presente memoria para amplificar un ácido nucleico permiten la formación de una población monoclonal ampliada del polinucleótido diana inmovilizado en un pocillo, tal como un pocillo de una micromatriz. Algunos métodos implican un procedimiento de amplificación de dos etapas. Véanse, p. ej., las FIG. 1-3. En este procedimiento de dos etapas, primero se captura un polinucleótido diana en un pocillo bien dimensionado para favorecer el KEA y se realiza un KEA para producir una población monoclonal de polinucleótidos diana inmovilizados dentro de los confines del pocillo. Se puede capturar y amplificar un solo polinucleótido diana dentro del pocillo. En una segunda etapa, la población monoclonal de polinucleótidos diana se aumenta más allá de los límites del pocilio, p. ej., mediante amplificación de puente o un segundo KEA.
En otro aspecto, en la presente memoria se proporcionan métodos para amplificar un ácido nucleico, que incluyen a) producir una primera capa sobre un sustrato, en donde el sustrato incluye al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo, en donde la primera capa cubre la superficie interna del pocillo; b) depositar al menos un primer par de cebadores de captura en la primera capa; c) producir una segunda capa sobre el sustrato que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo; d) poner en contacto una muestra que incluye una pluralidad de polinucleótidos diana con el sustrato en condiciones suficientes para que un polinucleótido diana hibride con un cebador de captura del al menos un primer par de cebadores de captura, y e) realizar un primer KEA para producir una población monoclonal de amplicones del polinucleótido diana dentro del pocillo, amplificando así el polinucleótido diana. Se encuentra una ilustración ejemplar de tales métodos, p. ej., en la FIG. 1.
En algunas realizaciones, la muestra que incluye la pluralidad de polinucleótidos diana se pone en contacto con el sustrato en condiciones suficientes para que un único polinucleótido diana por pocillo hibride con un cebador de captura del al menos un primer par de cebadores de captura.
En algunas realizaciones, el primer KEA produce una población monoclonal de amplicones a partir de un único polinucleótido diana hibridado con un cebador de captura en al menos un pocillo. En algunas realizaciones, el al menos un pocillo es una pluralidad de pocillos y la población monoclonal de amplicones se produce a partir de un único polinucleótido diana en dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos. Los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos pueden incluir, p. ej., más de 1%, más de 2%, más de 3%, más de 5%, más de 10%, más de 15%, más de 20%, más de 25%, más de 30%, más de 35%, más de 40%, más de 45%, más de 50%, más de 55%, más de 60%, más de 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95%, más de 98%, más de 99%, más de 99,9%, más de 99,99% o 100% de pocillos de una micromatriz.
En algunas realizaciones, la población monoclonal de amplicones se produce a partir del mismo polinucleótido diana único en los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos. En algunas realizaciones, la población monoclonal de amplicones se produce a partir de dos o más polinucleótidos diana únicos en los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos. Los dos o más polinucleótidos diana únicos pueden incluir, p. ej., al menos 2, al menos 3, al menos 5, al menos 10, al menos 30, al menos 100, al menos 300, al menos 1.000, al menos 3.000, al menos 10.000, al menos 30.000 o al menos 100.000 polinucleótidos diana únicos.
Se puede utilizar cualquier muestra que se sospecha que contiene un polinucleótido diana de interés. La muestra puede incluir una biblioteca de secuenciación de ADN. Se puede obtener la biblioteca de secuenciación de ADN, p. ej., a partir de muestras de tejido sólido o biopsias líquidas. Se pueden obtener muestras de tejido sólido o biopsia líquida, p. ej., a partir de sujetos enfermos o sujetos sanos. Los sujetos enfermos pueden incluir, p. ej., pacientes con cáncer o pacientes que padecen enfermedades genéticas. Los sujetos sanos pueden incluir, p. ej., sujetos en un grupo de control negativo de un ensayo clínico o sujetos sospechosos de estar en riesgo de sufrir una enfermedad. Los sujetos o pacientes pueden incluir seres humanos o animales, incluidos, p. ej., cualquier animal mamífero (p. ej., mono, simio, rata, ratón, hámster, gato, perro, caballo, vaca, oveja y similares).
En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente depositar al menos un segundo par de cebadores de captura en la segunda capa.
En algunas realizaciones, el al menos un segundo par de cebadores de captura se deposita antes de realizar el primer KEA.
En algunos métodos proporcionados en la presente memoria, se produce una primera capa en los pocillos de una micromatriz y se deposita un primer par de cebadores de captura universales en la primera capa. Véanse, p. ej., las FIG. 1.1 y 1.2. Se produce una segunda capa que cubre la primera capa y la superficie de la micromatriz que rodea el pocillo y se deposita un segundo par de cebadores de captura universales en la segunda capa, teniendo el segundo par de cebadores las mismas regiones de captura universales que el primer par, pero estando bloqueado en 3’. Véanse, p. ej., las FIG. 1.3 y 1.4. Los polinucleótidos diana con regiones de cebador universal flanqueantes en los extremos 3’ y/o 5' se capturan en los pocillos, los cebadores de captura desbloqueados del primer par se extienden y una primera ronda de KEA da como resultado la formación de poblaciones monoclonales de polinucleótidos diana dentro de los pocillos. Véase, p. ej., la FIG. 1.5. El segundo par de cebadores de captura universales se desbloquea y sigue una segunda ronda de KEA o amplificación de puente para aumentar las poblaciones monoclonales de polinucleótidos diana más allá de los confines de los pocillos. Véanse, p. ej., las FIG. 1.6 y 1.7.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un primer par de cebadores de captura incluyen una región de captura universal. En algunas realizaciones, el primer cebador de captura del al menos un primer par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y el segundo cebador de captura del al menos un primer par de cebadores de captura incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®. En algunas realizaciones, la pluralidad de polinucleótidos diana está flanqueada por una o más regiones de captura universales.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura están bloqueados en el extremo 3’. En algunas realizaciones, la región de captura universal incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® o una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®. En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente desbloquear los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura después de realizar el primer KEA. En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura se desbloquean utilizando quinasa T4. En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente realizar la amplificación de puente o un segundo KEA para aumentar la población monoclonal de amplicones de polinucleótidos diana.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura se desbloquean en el extremo 3’.
En otro aspecto proporcionado en la presente memoria, se encuentran métodos para amplificar un ácido nucleico, que incluyen a) producir una primera capa sobre un sustrato, en donde el sustrato incluye al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo, en donde la primera capa al menos cubre parcialmente la superficie interna del pocillo; b) depositar al menos un primer par de cebadores de captura en la primera capa, en donde el primer par de cebadores de captura incluye una pluralidad de primeros cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una pluralidad de segundos cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®; c) producir una segunda capa sobre el sustrato que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo; d) depositar al menos un segundo par de cebadores de captura en la segunda capa, en donde el segundo par de cebadores de captura está terminado en 3’-fosfato e incluye una pluralidad de primeros cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una pluralidad de segundos cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®; e) poner en contacto una muestra que incluye una pluralidad de polinucleótidos diana con el sustrato en condiciones suficientes para que un único polinucleótido diana por pocillo hibride con un cebador del al menos un primer par de cebadores de captura, en donde los polinucleótidos diana están flanqueados por regiones cebadoras universales incluyendo cada una una secuencia de nucleótidos del cebador P5’ de Illumina® o una secuencia de nucleótidos del cebador P7’ de Illumina®; f) realizar un primer KEA para producir una población monoclonal de amplicones a partir del polinucleótido diana único dentro del al menos un pocillo, amplificando así el polinucleótido diana; g) poner en contacto el sustrato con una quinasa T4 para desbloquear los cebadores del segundo par de cebadores, y h) realizar la amplificación de puente o un segundo KEA para aumentar la población monoclonal de amplicones del polinucleótido diana único más allá del pocillo. Se encuentra una ilustración ejemplar de tales métodos, p. ej., en la FIG. 1.
En otro aspecto, en la presente memoria se proporcionan métodos para amplificar un ácido nucleico, que incluyen a) producir una primera capa sobre un sustrato, en donde el sustrato incluye al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo, en donde la primera capa cubre la superficie interna del pocillo; b) depositar al menos un primer par de cebadores de captura en la primera capa; c) producir una segunda capa sobre el sustrato que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo; d) poner en contacto una muestra que incluye una pluralidad de polinucleótidos diana con el sustrato en condiciones suficientes para que un polinucleótido diana hibride con un cebador de captura del al menos un primer par de cebadores de captura, y e) realizar un primer KEA para producir una población monoclonal de amplicones del polinucleótido diana dentro del pocillo, amplificando así el polinucleótido diana.
En algunas realizaciones, se produce una primera capa en los pocillos de una micromatriz y se deposita un primer par de cebadores de captura en la primera capa. Véanse, p. ej., las FIG. 2.1 y 2.2. El cebador de captura del primer par de cebadores de captura puede incluir una región de captura universal y un SBS. Se produce una segunda capa que cubre la primera capa y la superficie de la micromatriz que rodea el pocillo y se deposita un segundo par de cebadores de captura en la segunda capa. Los cebadores de captura del segundo par pueden desbloquearse e incluir la misma región de captura universal que los cebadores de captura del primer par. Véanse, p. ej., las FIG. 2.3 y 2.4. Los polinucleótidos diana con regiones SBS flanqueantes se capturan en los pocillos, los cebadores de captura del primer par se extienden y una primera ronda de KEA da como resultado la formación de poblaciones monoclonales de polinucleótidos diana dentro de los pocillos. Véase, p. ej., la FIG. 1.6 (panel superior y panel central). Se permite que el KEA continúe y el KEA mantenido aumenta las poblaciones monoclonales de polinucleótidos diana más allá de los pocillos, utilizando el segundo par de cebadores de captura en la segunda capa. Véase, p. ej., la FIG.2.6 (panel inferior).
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores incluyen una región de captura universal. En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un primer par de cebadores de captura incluyen adicionalmente un SBS. En algunas realizaciones, el primer cebador del al menos un primer par de cebadores incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3 de Illumina® y el segundo cebador del al menos un primer par de cebadores incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS8 de Illumina®. En algunas realizaciones, la pluralidad de polinucleótidos diana está flanqueada por uno o más SBS.
En algunas realizaciones, el primer KEA se realiza durante un período de tiempo prolongado para aumentar la población clonal de amplicones más allá del al menos un pocillo.
En otro aspecto proporcionado en la presente memoria, se presentan métodos para amplificar un ácido nucleico, que incluyen a) producir una primera capa sobre un sustrato, en donde el sustrato incluye al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo, en donde la primera capa cubre al menos parcialmente la superficie interna del pocillo; b) depositar al menos un primer par de cebadores de captura en la primera capa, en donde el primer par de cebadores de captura incluye una pluralidad de al menos un primer cebador de captura que incluye una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3 de Illumina® y una pluralidad de al menos un segundo cebador de captura que incluye una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS8 de Illumina®; c) producir una segunda capa sobre el sustrato que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo; d) depositar al menos un segundo par de cebadores de captura en la segunda capa, en donde el al menos un segundo par de cebadores de captura incluye una pluralidad de primeros cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una pluralidad de segundos cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos P7 de Illumina®; e) poner en contacto una muestra que incluye una pluralidad de polinucleótidos diana con el sustrato en condiciones suficientes para que un único polinucleótido diana por pocillo hibride con un cebador del al menos un primer par de cebadores de captura, en donde la pluralidad de polinucleótidos diana está flanqueada por un SBS, incluyendo cada uno una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3’ de Illumina® o una secuencia de nucleótidos SBS8’ de Illumina®, y f) realizar un KEA durante un período prolongado de tiempo para producir una población monoclonal de amplicones a partir del polinucleótido diana único dentro y fuera del al menos un pocillo, amplificando así el polinucleótido diana único dentro del pocillo y aumentando la población monoclonal de polinucleótidos diana más allá del al menos un pocillo. Se encuentra una ilustración ejemplar de tales métodos, p. ej., en la FIG. 2.
En algunos métodos proporcionados en la presente memoria, se produce una primera capa en los pocillos de una micromatriz y se deposita un primer par de cebadores de captura en la primera capa. Véanse, p. ej., las FIG. 3.1 y 3.2. El cebador de captura del primer par de cebadores de captura incluye una región de captura universal. Se produce una segunda capa que cubre la primera capa y la superficie de la micromatriz que rodea el pocillo. Véase, p. ej., la FIG. 3.2. Los polinucleótidos diana con regiones de captura universales flanqueantes se capturan en los pocillos, los cebadores de captura del primer par se extienden y una primera ronda de KEA da como resultado la formación de poblaciones monoclonales de polinucleótidos diana dentro de los pocillos. Véase, p. ej., la FIG. 3.4. Un segundo par de cebadores de captura se deposita en la segunda capa. Los cebadores de captura del segundo par pueden desbloquearse e incluir la misma región de captura universal que los cebadores de captura del primer par. Véase, p. ej., la FIG. 3.5. Se lleva a cabo un segundo KEA o amplificación de puente para aumentar las poblaciones monoclonales de polinucleótidos diana más allá de los pocillos utilizando el segundo par de cebadores de captura en la segunda capa. Véase, p. ej., la FIG. 3.6.
En algunas realizaciones, el al menos un segundo par de cebadores de captura se deposita después de realizar el primer KEA. En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un primer par de cebadores de captura y el al menos un segundo par de cebadores de captura incluyen una región de captura universal. En algunas realizaciones, la región de captura universal incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® o una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®. En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente realizar la amplificación de puente o un segundo KEA para aumentar la población clonal de amplicones de polinucleótidos diana más allá del al menos un pocillo.
En otro aspecto, se proporcionan en la presente memoria métodos para amplificar un ácido nucleico, que incluyen a) producir una primera capa sobre un sustrato, en donde el sustrato incluye al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo, en donde la primera capa cubre al menos parcialmente la superficie interna del pocillo; b) depositar al menos un primer par de cebadores de captura en la primera capa, en donde el primer par de cebadores incluye una pluralidad de primeros cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una pluralidad de segundos cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®; d) producir una segunda capa sobre el sustrato que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo; d) poner en contacto una muestra que incluye una pluralidad de polinucleótidos diana con el sustrato en condiciones suficientes para que un único polinucleótido diana por pocillo hibride con un cebador del al menos un primer par de cebadores de captura, en donde la pluralidad de polinucleótidos está flanqueada por regiones cebadoras universales que incluyen cada una una secuencia de nucleótidos del cebador P5’ de Illumina® o una secuencia de nucleótidos del cebador P7’ de Illumina®; e) realizar un primer KEA para producir una población monoclonal de amplicones a partir del polinucleótido diana único dentro del al menos un pocillo, amplificando así el polinucleótido diana; f) depositar al menos un segundo par de cebadores de captura en la segunda capa, en donde el al menos un segundo par de cebadores de captura incluye una pluralidad de primeros cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una pluralidad de segundos cebadores de captura que incluyen una porción 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®, y g) realizar una amplificación de puente o un segundo KEA para aumentar la población monoclonal de amplicones del polinucleótido diana único. Se encuentra una ilustración ejemplar de tales métodos, p. ej., en la FIG. 3.
Los métodos proporcionados en la presente memoria pueden aumentar una población monoclonal de polinucleótidos diana inmovilizados en más de 5%, más de 10%, más de 15%, más de 20%, más de 25%, más de 30%, más de 35%, más de 40%, más de 45%, más de 50%, más de 55%, más de 60%, más de 65%, más de 70%, más de 75%, más de 80%, más de 85%, más de 90%, más de 95% o más de 100%. Se pueden medir el tamaño y el aumento de la población monoclonal. p. ej., ya sea en términos del diámetro de la población monoclonal, en términos del número de amplicones de polinucleótidos diana dentro de la población monoclonal, o en términos de la intensidad de señal relativa generada por la población monoclonal durante una reacción de secuenciación.
En algunas realizaciones, los métodos proporcionados en la presente memoria implican un procedimiento de amplificación de una etapa en un pocillo más grande, que está dimensionado para no favorecer el KEA. Véase, p. ej., la FIG. 4. El pocillo ampliado puede contener un cebador de captura de baja abundancia para capturar un polinucleótido diana de una biblioteca de secuenciación de ADN y un cebador de captura de alta abundancia para amplificar el polinucleótido diana capturado, produciendo así poblaciones monoclonales de polinucleótidos diana inmovilizados dentro de los confines del pocillo más grande.
En otro aspecto, en la presente memoria se proporcionan métodos para amplificar un ácido nucleico, que incluyen a) producir una capa sobre un sustrato, en donde el sustrato incluye al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo, en donde la capa cubre al menos parcialmente la superficie interna del pocillo; b) depositar al menos un primer par de cebadores de captura y al menos un segundo par de cebadores de captura en la capa, en donde la densidad del cebador del al menos un primer par de cebadores de captura es mayor que la densidad del cebador del al menos el segundo par de cebadores; c) poner en contacto una muestra que incluye una pluralidad de polinucleótidos diana con el sustrato en condiciones suficientes para que un único polinucleótido diana por pocillo hibride con el segundo cebador, y d) realizar un KEA para producir una población monoclonal de amplicones a partir del polinucleótido diana único hibridado al segundo cebador dentro del pocillo, amplificando así el polinucleótido diana único. Se encuentra una ilustración ejemplar de tales métodos, p. ej., en la FIG. 4.
En algunas realizaciones, el pocillo tiene un diámetro de aproximadamente 1 pm. En algunas realizaciones, el pocillo tiene un diámetro de aproximadamente 1 pm o más. En algunas realizaciones, el pocillo tiene un diámetro de aproximadamente 1 pm o menos.
En algunas realizaciones, las condiciones suficientes para que un único polinucleótido diana por pocillo hibride con el segundo cebador incluyen una baja concentración de polinucleótidos diana o de una biblioteca de secuenciación de ADN. En algunas realizaciones, las condiciones suficientes para que un polinucleótido diana único por pocillo hibride con el segundo cebador incluyen la amplificación rápida del primer polinucleótido diana capturado por KEA. La amplificación rápida del primer polinucleótido diana capturado por KEA puede evitar que un segundo polinucleótido diana hibride con un cebador de captura en el mismo pocillo que el primer polinucleótido diana capturado.
En algunas realizaciones, la pluralidad de polinucleótidos diana está flanqueada por SBS, cada uno de los cuales incluye una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3’ de Illumina® o una secuencia de nucleótidos del cebador SBS8’ de Illumina®.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un primer par de cebadores de captura incluyen una región de captura universal. En algunas realizaciones, el al menos un primer par de cebadores de captura incluye una pluralidad de primeros cebadores de captura que incluyen una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una pluralidad de segundos cebadores de captura que incluyen una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®.
En algunas realizaciones, los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura incluyen una región de captura universal y un SBS. En algunas realizaciones, al menos un segundo par de cebadores de captura incluye una pluralidad de primeros cebadores de captura que incluyen una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3 de Illumina® y una segunda pluralidad de cebadores de captura que incluyen una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS8 de Illumina®.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, se proporcionan en la presente memoria métodos para la modificación de un cebador de captura que está inmovilizado sobre un sustrato. Específicamente, los métodos proporcionados en la presente memoria permiten la modificación de un cebador de captura universal en el pocillo de una celda de flujo modelada para producir cebadores de captura específicos de polinucleótidos diana monoclonales en uno o más pocillos de una celda de flujo modelada y para producir pocillos o paneles de captura específica de nucleótidos diana monoclonales en una celda de flujo modelada. Véase, p. ej., la FIG. 10. Los métodos pueden implicar la amplificación de exclusión (por KEA) de bibliotecas de ácido nucleico molde sobre celdas de flujo modeladas. Se muestran ilustraciones ejemplares de algunos métodos proporcionados en la presente memoria, p. ej., en las FIG. 6 y 7. Cada ácido nucleico molde puede incluir una o más regiones de captura específicas de la diana. Véase, p. ej., la FIG. 6. A-d. La amplificación por exclusión de una biblioteca de ácido nucleico molde en una celda de flujo modelada da como resultado la formación de poblaciones monoclonales de amplicones de ácido nucleico molde en uno o más pocillos o paneles de una celda de flujo modelada. Véase, p. ej., la FIG. 7A. El procesamiento adicional de las poblaciones monoclonales de amplicones de ácido nucleico molde, p. ej., utilizando una enzima de restricción, puede producir cebadores de captura quiméricos que incluyen una región de captura universal y una región de captura específica de la diana, y cebadores de captura universales regenerados. Véase, p. ej., la FIG. 7. B-C. En algunas realizaciones, se forma una pluralidad de pocillos o paneles específicos de la diana monoclonal en una celda de flujo modelada, de modo que diferentes pocillos o paneles pueden capturar de manera específica de la diana diferentes polinucleótidos diana de interés. Véase, p. ej., la FIG. 7. D.
Los métodos proporcionados en la presente memoria pueden implicar hibridar un ácido nucleico molde con un cebador de captura inmovilizado. Véase, p. ej., la FIG. 7A. El ácido nucleico molde puede incluir una región de captura universal flanqueante en su extremo 3’ y/o extremo 5', una región de captura específica de la diana y uno o más sitios de restricción. Véanse, p. ej., las FIG. 6A-D. El ácido nucleico molde puede hibridar con un cebador de captura inmovilizado a través de una o más de las regiones de captura universales flanqueantes del molde y la región de captura universal 3’-terminal del cebador. Véase, p. ej., la FIG. 7A.
En algunas realizaciones, una pluralidad de ácidos nucleicos molde hibrida con una pluralidad de cebadores de captura inmovilizados. La pluralidad de ácidos nucleicos molde puede incluir una pluralidad del mismo ácido nucleico molde y/o una pluralidad de ácidos nucleicos molde diferentes. Se pueden distinguir diferentes ácidos nucleicos molde entre sí, p. ej., por tener regiones de captura específicas de la diana diferentes o por tener la misma región de captura específica de la diana en diferentes ubicaciones.
Cuando hibridan los ácidos nucleicos molde con cebadores de captura inmovilizados sobre una celda de flujo modelada, las condiciones de hibridación se pueden ajustar de modo que solo un único ácido nucleico molde por panel hibride con un cebador de captura inmovilizado en el panel. La hibridación de un solo ácido nucleico molde por panel puede ocurrir en uno o más paneles en la celda de flujo modelada. Dos o más paneles de la celda de flujo modelada pueden hibridar cada uno con ácidos nucleicos molde únicos que tienen la misma secuencia de ácido nucleico (p. ej., la misma secuencia de captura específica de la diana) o diferentes secuencias de ácido nucleico (p. ej., diferentes secuencias de captura específicas de la diana).
Un cebador de captura hibridado con un ácido nucleico diana se extiende para formar un producto de extensión inmovilizado que es complementario al ácido nucleico molde. En una celda de flujo modelada, uno o más paneles solo pueden tener un único producto de extensión. Dos o más paneles en una celda de flujo modelada pueden tener productos de extensión únicos que tienen la misma secuencia de ácido nucleico o diferentes secuencias de ácido nucleico. Se pueden distinguir diferentes productos de extensión, p. ej., al tener diferentes regiones de captura específicas de la diana o al tener las mismas regiones de captura específicas de la diana en diferentes ubicaciones.
El extremo 3’ de un producto de extensión puede hibridar con un cebador de captura inmovilizado no extendido a través de su región de captura universal complementaria 3’-terminal, formando así una estructura de puente. Se llevan a cabo una o más rondas de amplificación de puente para formar una agrupación monoclonal de ácidos nucleicos molde inmovilizados a partir de un único producto de extensión por panel. Los diferentes paneles en una celda de flujo modelada pueden tener agrupaciones monoclonales del mismo ácido nucleico molde inmovilizado o de diferentes ácidos nucleicos molde inmovilizados.
Los ácidos nucleicos molde inmovilizados se pueden escindir con una enzima de restricción para producir cebadores de captura quiméricos inmovilizados y cebadores de captura universales regenerados. Véase, p. ej., la FIG.7B-C. Los cebadores de captura quiméricos tienen cada uno una región de captura y una región de captura específica de la diana. En una celda de flujo modelada, uno o más paneles tienen cada uno una pluralidad de cebadores de captura quiméricos que son iguales. Véase, p. ej., la FIG. 7C. Dos o más paneles en una celda de flujo modelada pueden tener una pluralidad de cebadores de captura quiméricos que son los mismos cebadores de captura quiméricos o cebadores de captura quiméricos diferentes. Véase, p. ej., la FIG. 7D. Se pueden distinguir diferentes cebadores de captura quiméricos, p. ej., al tener diferentes regiones de captura específicas de la diana. Los cebadores de captura universales regenerados pueden tener extremos 3’ terminales con regiones de captura universales truncadas o extensiones de nucleótidos. Algunas extensiones de nucleótidos pueden incluir sitios de restricción parcial.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, esta descripción proporciona métodos para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluyen a) poner en contacto un sustrato que incluye una pluralidad de cebadores de captura inmovilizados con al menos un ácido nucleico molde en condiciones suficientes para que la hibridación produzca al menos un ácido nucleico molde inmovilizado, en donde la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados incluye una primera pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Y y una segunda pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Z, y en donde cada ácido nucleico molde está flanqueado por una región de captura universal 5’-terminal y 3’-terminal Y o Z e incluye uno o más sitios de restricción y una región de captura específica de la diana entre la región de captura universal 5’-terminal y los una o más sitios de restricción o entre la región de captura universal 3’-terminal y los uno o más sitios de restricción, y b) extender el al menos un cebador de captura inmovilizado hibridado con el ácido nucleico molde para producir al menos un producto de extensión inmovilizado complementario al al menos un ácido nucleico molde.
En algunas realizaciones, las regiones de captura universales Y y/o Z de un ácido nucleico molde pueden incluir secuencias de ácido nucleico que son las mismas que las secuencias de ácido nucleico en las regiones de captura universales de los cebadores de captura inmovilizados.
En algunas realizaciones, las regiones de captura universales Y y/o Z de un ácido nucleico molde pueden incluir secuencias de ácido nucleico que son complementarias a las secuencias de ácido nucleico en las regiones de captura universales de los cebadores de captura inmovilizados.
En algunas realizaciones, una primera región de captura universal Y o Z de un ácido nucleico molde puede incluir una secuencia de ácido nucleico que es complementaria a las secuencias de ácido nucleico en la región de captura universal de un primer cebador de captura inmovilizado y una segunda región de captura universal Y o Z del ácido nucleico molde puede incluir una secuencia de ácido nucleico que es la misma que las secuencias de ácido nucleico en la región de captura universal de un segundo cebador de captura inmovilizado.
Las regiones de captura universales Y o Z pueden tener la misma secuencia de ácido nucleico o diferentes secuencias de ácido nucleico. La región de captura universal Y puede estar en el extremo 3’ o en el extremo 5' de un ácido nucleico molde. La región de captura universal Z puede estar en el extremo 3’ o en el extremo 5' de un ácido nucleico molde. Las regiones de captura universales Y o Z pueden incluir cualquier región de captura universal.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico molde tiene una primera región de captura universal en su extremo 3’ o extremo 5' que incluye la secuencia de ácido nucleico de una región de captura universal de un primer cebador de captura inmovilizado y una segunda región de captura universal en el extremo opuesto (3’ o 5') de la primera región de captura universal, por lo que la segunda región de captura universal incluye una secuencia de ácido nucleico complementaria a la región de captura universal de un segundo cebador de captura inmovilizado.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico molde incluye una primera región de captura universal Y en su extremo 5’ que incluye la secuencia de nucleótidos de la región de captura universal Y' de un primer cebador de captura inmovilizado y una segunda región de captura universal Z' en su extremo 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la región de captura universal Z de un segundo cebador de captura inmovilizado.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico molde incluye una primera región de captura universal Z en su extremo 5’ que incluye la secuencia de nucleótidos de la región de captura universal Z' de un primer cebador de captura inmovilizado y una segunda región de captura universal Y' en su extremo 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la región de captura universal Y de un segundo cebador de captura inmovilizado.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico molde incluye una primera región de captura universal Y' en su extremo 5' que incluye la secuencia de nucleótidos de la región de captura universal Y de un primer cebador de captura inmovilizado y una segunda región de captura universal Z en su extremo 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la región de captura universal Z' de un segundo cebador de captura inmovilizado.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico molde incluye una primera región de captura universal Z' en su extremo 5' que incluye la secuencia de nucleótidos de la región de captura universal Z de un primer cebador de captura inmovilizado y una segunda región de captura universal Y en su extremo 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de la región de captura universal Y' de un segundo cebador de captura inmovilizado.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico molde incluye una primera región de captura universal en su extremo 5’ que incluye la secuencia de nucleótidos de un cebador P7 de Illumina® y una segunda región de captura universal en su extremo 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de un cebador P5 de Illumina®. Véase, p. ej., la FIG. 7A.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico molde incluye una primera región de captura universal en su extremo 3’ que incluye la secuencia de nucleótidos de un cebador P7 de Illumina® y una segunda región de captura universal en su extremo 5' que incluye una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de un cebador P5 de Illumina®.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico molde incluye una primera región de captura universal en su extremo 5’ que incluye la secuencia de nucleótidos de un cebador P5 de Illumina® y una segunda región de captura universal en su extremo 3’ que incluye una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de un cebador P7 de Illumina®.
En algunas realizaciones, el ácido nucleico molde incluye una primera región de captura universal en su extremo 3’ que incluye la secuencia de nucleótidos de un cebador P5 de Illumina® y una segunda región de captura universal en su extremo 5' que incluye una secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos de un cebador P7 de Illumina®.
Un ácido nucleico molde puede tener una o más regiones de captura específicas de la diana. Una región de captura específica de la diana puede tener una secuencia de captura específica de la diana de más de 8, más de 10, más de 12, más de 14, más de 16, más de 16, más de 18, más de 20, más de 22, más de 24, más de 26, más de 28 o más de 30 ácidos nucleicos. Algunas regiones de captura específicas de la diana tienen una secuencia de captura específica de la diana de entre 10 y 20 ácidos nucleicos. En algunos ácidos nucleicos molde, las una o más regiones de captura específicas de la diana pueden ubicarse entre la región de captura universal 3’-terminal y un sitio de restricción o entre la región de captura universal 5'-terminal y un sitio de restricción. Véase, p. ej., la FIG. 6A y B.
Un ácido nucleico molde puede tener dos o más regiones de captura específicas de la diana. Véase, p. ej., la FIG. 6C. Las dos o más regiones de captura específicas de la diana pueden ser las mismas regiones de captura específicas de la diana o diferentes regiones de captura específicas de la diana. Algunos ácidos nucleicos molde tienen una primera y una segunda regiones de captura específicas de la diana. Una primera región de captura específica de la diana se puede ubicar entre la región de captura universal 3’-terminal y un primer sitio de restricción y una segunda región de captura específica de la diana se puede ubicar entre la región de captura universal 5'-terminal y un segundo sitio de restricción. La primera y segunda regiones de captura específicas de la diana pueden ser las mismas regiones de captura específicas de la diana o diferentes regiones de captura específicas de la diana.
En algunas realizaciones, el al menos un ácido nucleico molde incluye dos sitios de restricción y una región espaciadora entre los dos sitios de restricción. En algunas realizaciones, los dos sitios de restricción son sitios de restricción SapI. En algunas realizaciones, la región espaciadora incluye aproximadamente 150 bases.
El al menos un ácido nucleico molde puede ser una pluralidad de ácidos nucleicos molde. La pluralidad de ácidos nucleicos molde puede ser una pluralidad de los mismos ácidos nucleicos molde o una pluralidad de ácidos nucleicos molde diferentes. En algunos métodos, el al menos un ácido nucleico molde incluye una pluralidad de más de 2, más de 3, más de 5, más de 8, más de 10, más de 15, más de 20, más de 30, más de 100, más de 300, más de 1.000, más de 3.000, más de 10.000, más de 30.000, más de 100.000, más de 300.000 o más de 1.000.000 de ácidos nucleicos molde diferentes. Cada uno de los diferentes ácidos nucleicos de molde puede ser una pluralidad de ácidos nucleicos de molde, que son iguales.
Un ácido nucleico molde puede tener uno o más sitios de restricción. Algunos ácidos nucleicos molde tienen dos o más sitios de restricción. Los dos o más sitios de restricción pueden ser los mismos sitios de restricción o diferentes sitios de restricción. Algunos ácidos nucleicos molde pueden tener uno o más sitios de restricción SapI. Algunos ácidos nucleicos molde tienen sitios de restricción que incluyen una secuencia de ácido nucleico 5'-GCTCTTC-3’ o una secuencia de nucleótidos 5'-GAAGACG-3’. Algunos ácidos nucleicos molde tienen sitios de restricción que incluyen una secuencia de ácido nucleico 5'-GCTCTTCN/NNN-3’ o una secuencia de ácido nucleico 5'-N/NNNGAAGACG-3’. Véase, p. ej., la FIG. 6D.
Dos o más sitios de restricción de un ácido nucleico molde pueden estar opcionalmente separados por una región espaciadora. La longitud de la región espaciadora se puede optimizar para facilitar la hibridación del ácido nucleico molde a dos cebadores de captura inmovilizados a través de sus regiones de captura universales flanqueantes y para facilitar la formación de puentes. Véanse, p. ej., las FIG. 6A y 7A. La longitud de la región espaciadora puede ser de más de 3, más de 5, más de 8, más de 10, más de 15, más de 20, más de 25, más de 50, más de 75, más de, 100, más de 125, más de 150, más de 175, más de 200, más de 225 o más de 250 ácidos nucleicos. Algunos ácidos nucleicos molde tienen regiones espaciadoras de aproximadamente 150 ácidos nucleicos.
Un ácido nucleico molde puede incluir una o más regiones adicionales, tales como un SBS. Se pueden ubicar regiones adicionales en cualquier lugar del ácido nucleico molde. Por ejemplo, el SBS se puede ubicar, p. ej., entre una región específica de la diana y la región de captura universal 3’-terminal. Algunos ácidos nucleicos molde pueden incluir dos o más SBS.
En algunas realizaciones, el sustrato es una celda de flujo modelada que incluye una pluralidad de paneles. Véanse, p. ej., las FIG. 7A-C. En algunas realizaciones, la pluralidad de paneles son una pluralidad de pocillos dispuestos como una micromatriz. Algunas celdas de flujo modeladas pueden tener más de 3, más de 10, más de 30, más de 100, más de 300, más de 1.000, más de 3.000, más de 10.000, más de 30.000, más de 100.000, más de 300.000, o más de 1.000.000 de paneles. En algunas realizaciones, cada panel de la pluralidad de paneles incluye una primera pluralidad de cebadores de captura universales inmovilizados que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Y y una segunda pluralidad de cebadores de captura universales inmovilizados que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Z. Véase, p. ej., la FIG. 7A.
En algunas realizaciones, un único ácido nucleico molde por panel hibrida con un único cebador de captura por panel en uno o más paneles en la pluralidad de paneles. Véase, p. ej., la FIG. 10. En dos o más paneles de la pluralidad de paneles, los ácidos nucleicos molde individuales que hibridan con los cebadores de captura individuales en cada uno de los dos o más paneles pueden ser ácidos nucleicos molde que incluyen la misma región de captura específica de la diana o diferentes regiones de captura específicas de la diana.
El cebador de captura único hibridado con un ácido nucleico molde único se puede extender, p. ej., por polimerización de ADN, para formar un único producto de extensión inmovilizado que es complementario al ácido nucleico molde. En una celda de flujo modelada, uno o más paneles pueden tener cada uno solamente un único producto de extensión inmovilizado. En dos o más paneles de la celda de flujo modelada, los productos de extensión inmovilizados únicos pueden incluir la misma región de captura específica de la diana o diferentes regiones de captura específicas de la diana.
En algunas realizaciones, se produce un único producto de extensión inmovilizado por panel en uno o más paneles de una pluralidad de paneles de una celda de flujo modelada. Véase, p. ej., la FIG. 10. En algunas realizaciones, en una pluralidad de paneles, los productos de extensión inmovilizados individuales por panel son complementarios al mismo ácido nucleico molde. En algunas realizaciones, en una pluralidad de paneles, los productos de extensión inmovilizados únicos por panel son complementarios a dos o más ácidos nucleicos molde diferentes. En algunas realizaciones, los productos de extensión inmovilizados únicos por panel son complementarios a diferentes ácidos nucleicos molde en al menos 1%, al menos 3%, al menos 5%, al menos 10%, al menos 20%, al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de paneles de la pluralidad de paneles. En algunas realizaciones, los productos de extensión inmovilizados únicos por panel se producen en más de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o 99% de los paneles de la pluralidad de paneles. En algunas realizaciones, los productos de extensión inmovilizados únicos por panel se producen en menos de 100%, 95%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, o 1% de paneles de la pluralidad de paneles.
En algunas realizaciones, los métodos incluyen adicionalmente amplificar mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) el al menos un producto de extensión inmovilizado para producir al menos una agrupación monoclonal de ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados. Una agrupación monoclonal de ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados incluye una pluralidad de ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados. Por ejemplo, una agrupación monoclonal puede incluir más de 3, más de 10, más de 30, más de 100, más de 300, más de 1.000, más de 3.000, más de 10.000, más de 30.000, más de 100.000, más de 300.000, o más de 1.000.000 de ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados.
En los métodos proporcionados en la presente memoria, la amplificación por PCR puede incluir la amplificación de puente o KEA. Véase, p. ej., la FIG. 8C.
Las FIG. 11-15 ilustran realizaciones ejemplares de métodos para convertir agrupaciones monoclonales de ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados para formar cebadores de captura modificados que incluyen regiones de captura específicas de la diana. Se muestran las conversiones de pares individuales de ácidos nucleicos molde de doble hebra.
La FIG. 11 ilustra un método ejemplar para procesar un ácido nucleico molde de doble hebra inmovilizado que incluye un único sitio de restricción SapI. El ácido nucleico molde incluye adicionalmente regiones de captura universales en el extremo 3’ (P7'; complementario a la secuencia del cebador P7 de Illumina®) y el extremo 5’ (P5; incluida la secuencia del cebador P5 de Illumina®), una región de captura específica de la diana (CP) y un sitio de unión al cebador de secuenciación (SBS). La digestión con SapI del ácido nucleico molde de doble hebra inmovilizado de la FIG. 11 da como resultado la formación de un cebador de captura quimérico de doble hebra inmovilizado que incluye una región de captura universal (P7) y una región de captura específica de la diana (CP), y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados de doble hebra inmovilizados que incluyen una región de captura universal y un sitio de restricción SapI parcial (NCTTCTCG). La desnaturalización de los cebadores de captura de doble hebra da como resultado la formación de cebadores de captura de hebra sencilla listos para la biblioteca. Los cebadores de captura listos para la biblioteca de la FIG. 11 se pueden utilizar para secuenciar polinucleótidos diana a partir de bibliotecas de secuenciación que incluyen regiones de captura universales modificadas que tienen una secuencia de nucleótidos P5 y un sitio de restricción SapI parcial.
La FIG. 12 ilustra un método ejemplar para procesar un ácido nucleico molde de doble hebra inmovilizado que se formó utilizando un cebador de captura P7 de Illumina® inmovilizado, mediante el cual el cebador de captura P7 de Illumina® inmovilizado incluye un sitio de escisión predeterminado (U; 8oG). La digestión con SapI del ácido nucleico molde de doble hebra inmovilizado de la FIG. 12 da como resultado la formación de un cebador de captura quimérico de doble hebra inmovilizado que incluye una región de captura universal (P7) y una región de captura específica de la diana (CP), y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados de doble hebra inmovilizados que incluyen una región de captura universal, un sitio de restricción SapI parcial (NCTTCTCG) y un sitio de escisión predeterminado (U; 8oG). Véase la Figura 12A. El sitio de restricción SapI parcial se puede eliminar del cebador de captura universal regenerado escindiendo el cebador en su sitio de escisión predeterminado. Véase la FIG. 12B. La desnaturalización de los cebadores de captura de doble hebra da como resultado la formación de cebadores de captura de hebra sencilla listos para la biblioteca. Los cebadores de captura listos para la biblioteca de la FIG. 12B se pueden utilizar para secuenciar polinucleótidos diana a partir de bibliotecas de secuenciación que incluyen regiones de captura universales que tienen una secuencia de nucleótidos P5 (y ningún sitio de restricción SapI parcial).
La FIG. 13 ilustra un método ejemplar para procesar un ácido nucleico molde de doble hebra inmovilizado que incluye dos sitios de restricción SapI. La digestión con SapI del ácido nucleico molde de doble hebra inmovilizado de la FIG.
13 da como resultado la formación de un cebador de captura quimérico de doble hebra inmovilizado que incluye una región de captura universal (P7) y una región de captura específica de la diana (CP), y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de doble hebra. La desnaturalización de los cebadores de captura de doble hebra da como resultado la formación de cebadores de captura de hebra sencilla listos para la biblioteca. En el método de la FIG. 13, la digestión con SapI del ácido nucleico molde de doble hebra inmovilizado elimina un nucleótido de la región de captura específica de la diana del cebador de captura quimérico inmovilizado de hebra sencilla. Los cebadores de captura listos para la biblioteca de la FIG. 12B se pueden utilizar para secuenciar polinucleótidos diana a partir de bibliotecas de secuenciación que incluyen regiones de captura universales que tienen una secuencia de nucleótidos P5 (y ningún sitio de restricción SapI parcial).
La FIG. 14 ilustra un método ejemplar para procesar un ácido nucleico molde de doble hebra inmovilizado que incluye un sitio de restricción SapI. La digestión con SapI del ácido nucleico molde de doble hebra inmovilizado de la FIG. 14 da como resultado la formación de un cebador de captura quimérico de doble hebra inmovilizado que incluye una región de captura universal (P7) y una región de captura específica de la diana (CP), y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de doble hebra que incluyen una región de captura universal (P5) y un sitio de restricción SapI parcial (NCTTCTCG). La desnaturalización de los cebadores de captura de doble hebra da como resultado la formación de cebadores de captura de hebra sencilla. Para eliminar el sitio de restricción SapI parcial de los cebadores de captura universales regenerados de hebra sencilla, los cebadores de captura quiméricos y las regiones de captura universales de los cebadores de captura universales regenerados se pueden hibridar con oligonucleótidos complementarios para formar regiones de ADN de doble hebra, a la vez que dejan en forma de hebra sencilla el sitio de restricción parcial de los cebadores de captura regenerados. Los sitios de restricción parcial de hebra sencilla se pueden eliminar mediante tratamiento con una exonucleasa, tal como la exonucleasa I. Los oligonucleótidos complementarios se pueden eliminar, p. ej., por desnaturalización (p. ej., química o térmica) para formar cebadores de captura listos para bibliotecas de hebra sencilla. Los cebadores de captura listos para la biblioteca de la FIG. 14 se pueden utilizar para secuenciar polinucleótidos diana a partir de bibliotecas de secuenciación que incluyen regiones de captura universales que tienen una secuencia de nucleótidos P5 (y ningún sitio de restricción SapI parcial).
La FIG. 15 ilustra un método ejemplar para procesar un ácido nucleico molde de doble hebra inmovilizado que incluye un sitio de restricción SapI y una región de captura universal PX. La celda de flujo de la FIG. 15 incluye tres cebadores de captura universales inmovilizados que incluyen cebadores de captura P5 y P7 de Illumina® y el cebador de captura universal PX, que incluye un sitio de escisión predeterminado (diol). Los ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados de la FIG. 15 implican cebadores de captura P7 de Illumina® y cebadores de captura universales PX. La digestión con SapI del ácido nucleico molde de doble hebra inmovilizado de la FIG. 16 da como resultado la formación de un cebador de captura quimérico de doble hebra inmovilizado que incluye una región de captura universal (P7) y una región de captura específica de la diana (CP), y una pluralidad de cebadores de captura universales inmovilizados de doble hebra PX que incluyen un sitio de restricción SapI parcial (NCTTCTCG). La desnaturalización de los cebadores de captura de doble hebra da como resultado la formación de cebadores de captura de hebra sencilla. Los cebadores de captura universales inmovilizados de doble hebra PX que incluyen el sitio de restricción SapI parcial (NCTTCTCG) se pueden retirar de la celda de flujo de la FIG. 15 a través de la escisión en el sitio de escisión predeterminado. Los cebadores de captura listos para la biblioteca de la FIG. 15 incluyen un cebador de captura quimérico que incluye una región de captura universal (P7) y una región de captura específica de la diana (CP) y un cebador de captura P5 de Illumina®. Los cebadores de captura listos para la biblioteca de la FIG. 15 se pueden utilizar para secuenciar polinucleótidos diana a partir de bibliotecas de secuenciación que incluyen regiones de captura universales que tienen una secuencia de nucleótidos P5 (y ningún sitio de restricción SapI parcial).
En algunas realizaciones, los métodos incluyen adicionalmente poner en contacto la al menos una agrupación monoclonal de ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados con al menos una enzima de restricción para cortar los uno o más sitios de restricción en los ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos de doble hebra inmovilizados que incluyen una región de captura universal y una región de captura específica de la diana, y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de doble hebra. Véanse, p. ej., las FIG. 7B y C.
Los ácidos nucleicos molde de doble hebra se pueden poner en contacto con una o más enzimas de restricción diferentes. En algunos métodos, los ácidos nucleicos molde de doble hebra se ponen en contacto con 2, 3, 4, 5 o más enzimas de restricción diferentes. En algunas realizaciones, la al menos una enzima de restricción incluye SapI.
En los cebadores de captura quiméricos de doble hebra y los cebadores de captura universales regenerados, una hebra está unida covalentemente a la superficie, mientras que la otra hebra no está unida covalentemente a la superficie. Los métodos pueden incluir una etapa de separación de las dos hebras de cebadores de captura quiméricos de hebra sencilla y cebadores de captura universales regenerados que están unidos covalentemente a la superficie. Las hebras se pueden separar, p. ej., por desnaturalización, tal como desnaturalización térmica o química, o por degradación enzimática. Véanse, p. ej., las FIG. 11-15. La degradación enzimática puede incluir productos digeridos con nucleasa. Por ejemplo, los cebadores de doble hebra se pueden tratar con una exonucleasa, tal como la ADNdh exonucleasa 5’ - 3’ (p. ej., exonucleasa T7), que digiere específicamente hebras de nucleótidos en ADN de doble hebra en una dirección 5’ ^ 3’. Véase, p. ej., la FIG. 14. La unión a la superficie protege el extremo 5’ de las hebras unidas covalentemente en los cebadores de captura quiméricos de doble hebra y los cebadores de captura universales regenerados a partir de la digestión con ADNdh exonucleasa 5'-3’, mientras que la hebra no unida covalentemente a la superficie se digiere.
En algunas realizaciones, los métodos incluyen adicionalmente desnaturalizar la pluralidad de cebadores de captura quiméricos de doble hebra inmovilizados y la pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de doble hebra para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados de hebra sencilla y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de hebra sencilla. La desnaturalización puede incluir, p. ej., desnaturalización térmica o desnaturalización química, o combinaciones de las mismas. Véanse, p. ej., las FIG. 10 y 11.
En algunas realizaciones, los métodos incluyen adicionalmente poner en contacto la pluralidad de cebadores de captura quiméricos de doble hebra inmovilizados y la pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de doble hebra con una exonucleasa de ácido desoxirribonucleico de doble hebra (ADNdh) 5'-3’ para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados de hebra sencilla y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de hebra sencilla.
En algunas realizaciones, el sustrato es una celda de flujo modelada que incluye una pluralidad de paneles. En algunas realizaciones, la pluralidad de paneles es una pluralidad de pocillos dispuestos en una micromatriz. En algunas realizaciones, uno o más paneles de la pluralidad de paneles incluyen una primera pluralidad de cebadores de captura que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Y y una segunda pluralidad de cebadores de captura universales que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Z. En algunas realizaciones, más de 1%, más de 5%, más de 10%, más de 20%, más de 30%, más de 40%, más de 50%, más de 60%, más de 70%, más de 80%, más de 90%, más de 95%, más de 99%, más de 99,9% o más de 99,99% de los cebadores de captura, que incluyen la región de captura universal 3’-terminal Y, se convierte en cebadores de captura quiméricos inmovilizados de hebra sencilla en uno o más paneles de la pluralidad de paneles. En algunas realizaciones, más de 1%, más de 5%, más de 10%, más de 20%, más de 30%, más de 40%, más de 50%, más de 60%, más de 70%, más de 80%, más de 90%, más de 95% más de 99%, más de 99,9% o más de 99,99% de los cebadores de captura, que incluyen la región de captura universal 3’-terminal Z se convierte en cebadores de captura quiméricos inmovilizados de hebra sencilla en uno o más paneles de la pluralidad de paneles. En algunas realizaciones, más de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% de los cebadores de captura, que incluyen la región de captura universal 3’-terminal Y se convierte en cebadores de captura quiméricos inmovilizados de hebra sencilla y más de 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, el 95% o el 99% de los cebadores de captura, que incluyen la región de captura universal 3’-terminal Z, se convierte en cebadores de captura quiméricos inmovilizados de hebra sencilla en uno o más paneles de la pluralidad de paneles.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, en la presente memoria se proporcionan métodos para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluyen a) poner en contacto un sustrato que incluye una pluralidad de cebadores de captura inmovilizados con al menos un ácido nucleico molde en condiciones suficientes para que la hibridación produzca al menos un ácido nucleico molde inmovilizado, en donde la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados incluye una primera pluralidad de cebadores que incluyen una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® 3’-terminal y una segunda pluralidad de cebadores que incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®, 3’-terminal y en donde cada ácido nucleico molde está flanqueado por una secuencia 3’-terminal complementaria a la secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una secuencia 5'-terminal complementaria a la secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®, e incluye dos sitios de restricción SapI, un región espaciadora entre los sitios de restricción SapI y una región de captura específica de la diana entre la secuencia 3’-terminal complementaria a la secuencia de nucleótidos del cebador P5’ de Illumina® y los sitios de restricción SapI; y b) extender al menos un cebador de captura inmovilizado hibridado con al menos un ácido nucleico molde inmovilizado para producir al menos un producto de extensión inmovilizado complementario a al menos uno de los ácidos nucleicos molde; c) amplificar el al menos un producto de extensión inmovilizado mediante amplificación de puente o KEA para producir al menos una agrupación monoclonal de ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados; d) poner en contacto la al menos una agrupación monoclonal de los ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados con SapI para cortar los dos sitios de restricción en los ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos de doble hebra inmovilizados que incluyen la secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y la región de captura específica de la diana y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados de doble hebra inmovilizados, que incluyen la secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®, y e) opcionalmente, poner en contacto la pluralidad de cebadores de captura quiméricos de doble hebra inmovilizados y la pluralidad de cebadores de captura universales regenerados de doble hebra inmovilizados con una ADNdh exonucleasa 5'-3’ para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos de hebra sencilla inmovilizados y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados de hebra sencilla inmovilizados. Se muestra una ilustración ejemplar de este método, p. ej., en la FIG. 7.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, en la presente memoria se proporcionan métodos para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluyen a) poner en contacto un sustrato que incluye una pluralidad de cebadores de captura inmovilizados con al menos un ácido nucleico molde en condiciones suficientes para que la hibridación produzca al menos un ácido nucleico molde inmovilizado, en donde la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados incluye una primera pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Y y una segunda pluralidad de cebadores incluye una región de captura universal 3’-terminal Z, y en donde el al menos un ácido nucleico molde está flanqueado por una región de captura universal 5’-terminal y 3’-terminal Y o Z e incluye uno o más sitios de restricción y una región de captura específica de la diana entre los uno o más sitios de restricción y la región de captura universal 3’-terminal; b) extender al menos un cebador de captura inmovilizado hibridado con al menos un ácido nucleico molde para producir al menos un producto de extensión inmovilizado complementario al al menos un ácido nucleico molde; c) amplificar el al menos un producto de extensión inmovilizado por PCR para producir al menos una agrupación monoclonal de ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados; d) poner en contacto la al menos una agrupación monoclonal de ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados con una enzima de restricción para cortar los uno o más sitios de restricción en los ácidos nucleicos molde de doble hebra inmovilizados para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos de doble hebra inmovilizados que incluyen la región de captura universal Z y la región de captura específica de la diana y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados de doble hebra inmovilizados que incluyen la región de captura universal Y. Véase, p. ej., la FIG. 7A.
En algunas realizaciones, la pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados incluye un sitio de restricción parcial 3’-terminal. En algunas realizaciones, los métodos incluyen eliminar el sitio de restricción parcial 3’-terminal de una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados. Véanse, p. ej., las FIG. 12-15.
En algunas realizaciones, la pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados incluye un sitio de escisión predeterminado. En algunas realizaciones, el sitio de escisión predeterminado incluye un conector diólico, una 8-oxoguanina (8-oxo-G), una base de uracilo, un ribonucleótido, un nucleótido metilado o un péptido. Véanse, p. ej., las FIG. 12A y B.
En algunas realizaciones, la eliminación del sitio de restricción parcial incluye una escisión química no enzimática. En algunas realizaciones, la escisión química no enzimática incluye un tratamiento con peryodato, un tratamiento con iones de metales de tierras raras, un tratamiento con álcali o una reacción fotoquímica.
En algunas realizaciones, la eliminación del sitio de restricción parcial 3’-terminal incluye una escisión enzimática. En algunas realizaciones, la escisión enzimática incluye una escisión por uracilo-ADN glicosilasa, una escisión por endonucleasa, un tratamiento con ribonucleasa (ARNasa), una escisión con enzima de restricción o una escisión por proteasa. Véase, p. ej., la FIG. 12.
En algunas realizaciones, la eliminación del sitio de restricción parcial 3’-terminal incluye hibridar un oligonucleótido complementario inverso con un cebador de captura universal regenerado inmovilizado de hebra sencilla para formar una región de captura universal de doble hebra Y. En algunas realizaciones, los métodos incluyen adicionalmente hibridar un oligonucleótido complementario inverso con un cebador de captura quimérico inmovilizado de hebra sencilla para formar un cebador de captura quimérico inmovilizado de doble hebra. En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente poner en contacto el sustrato con una nucleasa para eliminar el sitio de restricción parcial 3’-terminal. En algunas realizaciones, la nucleasa es una exonucleasa. En algunas realizaciones, la exonucleasa es la exonucleasa I. Véase, p. ej., la FIG.14.
En algunas realizaciones, los cebadores de captura quiméricos inmovilizados de regiones de captura específicas de la diana 3’-terminales están truncados. Véase, p. ej., la realización ejemplar mostrada en la FIG. 13.
En algunas realizaciones, el al menos un ácido nucleico molde incluye una región de captura universal 5'-terminal Y, una región de captura universal 3’-terminal Z, una porción central que incluye un primer y un segundo sitios de restricción y una región espaciadora entre el primer y el segundo sitios de restricción, y una región de captura específica de la diana entre la porción central y la región de captura universal 3’-terminal Z. En algunas realizaciones, el al menos un ácido nucleico molde incluye adicionalmente un SBS entre la región específica de la diana y la región de captura universal 3’-terminal Z. Véase, p. ej., la FIG.13.
En algunas realizaciones, el método incluye adicionalmente e) poner en contacto una muestra de ácido nucleico que incluye una pluralidad de polinucleótidos diana con al menos un cebador en condiciones suficientes para la hibridación, conteniendo dicho al menos un cebador un adaptador; f) amplificar por PCR dicha pluralidad de polinucleótidos diana para producir una pluralidad de amplicones; g) poner en contacto directamente una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados con dicha pluralidad de amplicones en condiciones suficientes para que la hibridación produzca una primera pluralidad de amplicones inmovilizados; h) extender la pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados para producir una pluralidad de productos de extensión inmovilizados complementarios a dichos polinucleótidos diana, e i) amplificar por PCR dicha pluralidad de productos de extensión inmovilizados para producir una segunda pluralidad de amplicones inmovilizados, en donde dicha población de amplicones inmovilizados incluye una uniformidad de 50% o más. En algunas realizaciones, dicha población de amplicones inmovilizados incluye una uniformidad de 55% o más, 60% o más, 65% o más, 70% o más, 75% o más, 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más, 98% o más o 99% o más. En algunas realizaciones, la uniformidad incluye 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91,92, 93, 94 o 95 o más.
La uniformidad de los amplicones inmovilizados (también conocida como uniformidad de agrupación) se puede determinar, p. ej., como se describe en la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 61/928.368.
En algunas realizaciones, el adaptador incluye una región de captura universal Y o Z.
En algunas realizaciones, el adaptador incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® o una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, se proporciona en la presente memoria un método para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluye a) poner en contacto una pluralidad de cebadores de captura universales inmovilizados sobre un sustrato con una pluralidad de ácidos nucleicos molde en condiciones suficientes para que la hibridación produzca uno o más ácidos nucleicos molde inmovilizados, en donde la pluralidad de cebadores de captura universales incluye una primera pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Y y una segunda pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Z, en donde cada ácido nucleico molde incluye una región de captura universal 5'-terminal Y, una región de captura universal 3’-terminal Z, una región de captura específica de la diana, un sitio de restricción entre la región de captura universal 5'-terminal Y y la región de captura específica de la diana, y un SBS entre la región de captura universal 3’-terminal Z y la porción de captura específica de la diana; b) extender uno o más cebadores de captura universales para producir uno o más productos de extensión inmovilizados complementarios a uno o más ácidos nucleicos molde inmovilizados; c) amplificar los uno o más productos de extensión inmovilizados mediante amplificación de puente o KEA para producir uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados; d) poner en contacto las una o más agrupaciones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados con una enzima de restricción para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados que incluyen una región de captura universal Z y la región de captura específica de la diana y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados que incluyen un región de captura universal Y y un sitio de restricción parcial. Se muestra una ilustración ejemplar de este método, p. ej., en la FIG. 11.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, se proporciona en la presente memoria un método para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluye a) poner en contacto una pluralidad de cebadores de captura universales inmovilizados sobre un sustrato con una pluralidad de ácidos nucleicos molde en condiciones suficientes para que la hibridación produzca uno o más ácidos nucleicos molde inmovilizados, en donde la pluralidad de cebadores de captura universales incluye una primera pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Y y un primer sitio de escisión predeterminado y una segunda pluralidad de cebadores que incluyen un región de captura universal 3’-terminal Z y una porción 5’ que incluye un segundo sitio de escisión predeterminado, en donde cada ácido nucleico molde incluye una región de captura universal 5' terminal Y, una región de captura universal 3’ terminal Z, una región de captura específica de la diana, un sitio de restricción entre la región de captura universal 5'-terminal Y y la región de captura específica de la diana, y un SBS entre la región de captura universal 3’-terminal Z y la región de captura específica de la diana; b) extender uno o más cebadores de captura universales para producir uno o más productos de extensión inmovilizados complementarios a uno o más ácidos nucleicos molde; c) amplificar los uno o más productos de extensión inmovilizados mediante amplificación de puente o KEA para producir uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados; d) poner en contacto los uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados con una enzima de restricción para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados, que incluyen la región de captura universal Z y la región de captura específica de la diana, y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados que incluyen la región de captura universal Y y un sitio de restricción parcial; e) eliminar el sitio de restricción parcial de la pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados a través de la escisión en el primer sitio de escisión predeterminado. Véanse, p. ej., las FIG. 12A y B. En algunas realizaciones, la región de captura universal Y incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y la región de captura universal Z incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®. En algunas realizaciones, el primer sitio de escisión predeterminado incluye una base de uracilo y el segundo sitio de escisión predeterminado incluye un conector diólico. Se muestra una ilustración ejemplar de este método, p. ej., en las FIG. 12A y B.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, se proporciona en la presente memoria un método para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluye a) poner en contacto una pluralidad de cebadores de captura universales inmovilizados sobre un sustrato con una pluralidad de ácidos nucleicos molde en condiciones suficientes para que la hibridación produzca uno o más ácidos nucleicos molde inmovilizados, en donde la pluralidad de cebadores de captura universales incluye una primera pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Y y una segunda pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Z, en donde cada ácido nucleico molde incluye una región de captura universal 5'-terminal Y, una región de captura universal 3’-terminal Z, una porción central que incluye un primer y un segundo sitios de restricción y una región espaciadora entre el primer y el segundo sitios de restricción, y una región específica de la diana entre la porción central y la región de captura universal 3’-terminal Z; b) extender uno o más cebadores de captura universales de la pluralidad de cebadores de captura universales para producir uno o más productos de extensión inmovilizados complementarios a uno o más ácidos nucleicos molde; c) amplificar los uno o más productos de extensión inmovilizados mediante amplificación de puente o KEA para producir uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados, y d) poner en contacto los uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados con una enzima de restricción para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados que incluyen una región de captura universal Z y una región de captura específica de la diana y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados que incluyen una región de captura universal Y. Se muestra una ilustración ejemplar de este método, p. ej., en la FIG. 13.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, se proporciona en la presente memoria un método para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluye a) poner en contacto una pluralidad de cebadores de captura universales inmovilizados sobre un sustrato con una pluralidad de ácidos nucleicos molde en condiciones suficientes para que la hibridación produzca uno o más ácidos nucleicos molde inmovilizados, en donde la pluralidad de los cebadores de captura universales incluye una primera pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Y y una segunda pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Z, en donde cada ácido nucleico molde incluye una región de captura universal 5'-terminal Y, una región de captura universal 3’-terminal Z, una región de captura específica de la diana y un sitio de restricción entre la región de captura universal 5'-terminal Y y la región de captura específica de la diana; b) extender uno o más cebadores de captura universales de la pluralidad de cebadores de captura universales para producir uno o más productos de extensión inmovilizados complementarios a uno o más ácidos nucleicos molde; c) amplificar los uno o más productos de extensión inmovilizados mediante amplificación de puente o KEA para producir uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados; d) poner en contacto los uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados con una enzima de restricción para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados de doble hebra que incluyen una región de captura universal Z y una región de captura específica de la diana y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de doble hebra que incluyen una región de captura universal Y y un sitio de restricción parcial de hebra sencilla; e) desnaturalizar la pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados de doble hebra y la pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de doble hebra para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados de hebra sencilla y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de hebra sencilla; f) hibridar el oligonucleótido complementario inverso con la pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados de hebra sencilla y los cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de hebra sencilla para formar regiones de captura universales de doble hebra y regiones específicas de la diana de doble hebra, y g) poner en contacto las superficie con exonucleasa I para eliminar el sitio de restricción parcial de hebra sencilla de la pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados de doble hebra. Se muestra una ilustración ejemplar de este método, p. ej., en la FIG. 14.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, se proporciona en la presente memoria un método para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluye a) poner en contacto una pluralidad de cebadores de captura universales inmovilizados sobre un sustrato con una pluralidad de ácidos nucleicos molde en condiciones suficientes para que la hibridación produzca uno o más ácidos nucleicos molde inmovilizados, en donde la pluralidad de cebadores de captura universales incluye una primera pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Y, y una segunda pluralidad de cebadores que incluyen una región de captura universal 3’-terminal Z y una tercera pluralidad de cebadores que incluyen una región 3’-terminal X y una porción 5' que incluye un sitio de escisión predeterminado, en donde cada ácido nucleico molde incluye una región 5’-terminal X, una región de captura universal 3’-terminal Z, una región de captura específica de la diana y un sitio de restricción entre la región X y la región de captura específica de la diana; b) extender uno o más cebadores de captura universales para producir uno o más productos de extensión inmovilizados complementarios a uno o más ácidos nucleicos molde; c) amplificar los uno o más productos de extensión inmovilizados mediante amplificación de puente o KEA para producir uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados; d) poner en contacto los uno o más amplicones monoclonales de los productos de extensión inmovilizados con una enzima de restricción para producir una pluralidad de cebadores de captura quiméricos inmovilizados que incluyen una región de captura universal Z y una región de captura específica de la diana y una pluralidad de cebadores de captura universales regenerados inmovilizados que incluyen un región X y un sitio de restricción parcial, y e) eliminar la pluralidad de cebadores de captura regenerados inmovilizados que incluyen la región X del sustrato a través de la escisión en el sitio de escisión predeterminado. Véase, p. ej., la FIG. 15. En algunas realizaciones, la región de captura universal Y incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y la región de captura universal Z incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®. En algunas realizaciones, el sitio de escisión predeterminado incluye un conector diólico. Se muestra una ilustración ejemplar de este método, p. ej., en la FIG. 15.
Los ácidos nucleicos molde proporcionados en la presente memoria se pueden producir mediante cualquier método conocido por un experto en la técnica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos molde se pueden producir mediante síntesis de oligonucleótidos en su forma completa, p. ej., como se ilustra en las FIG. 6A-C.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, se proporcionan en la presente memoria métodos para producir un ácido nucleico molde proporcionado en la presente memoria, que incluyen la producción de dos o más ácidos nucleicos molde parciales, p. ej., como se ilustra en la FIG. 16. En algunas realizaciones, los dos o más ácidos nucleicos molde parciales son un par de ácidos nucleicos molde parciales que pueden hibridar parcialmente entre sí para formar un dímero de ácidos nucleicos molde parciales. En algunas realizaciones, los métodos incluyen extender los ácidos nucleicos molde parciales en un dímero de ácidos nucleicos molde parciales para formar un dímero de ácidos nucleicos molde completos.
En otro aspecto, en la presente memoria se proporcionan pares de ácidos nucleicos molde parciales que pueden hibridar parcialmente entre sí para formar un dímero de ácidos nucleicos molde parciales. Un primer ácido nucleico molde parcial en un par puede hibridar parcialmente con menos de 90%, menos de 80%, menos de 70%, menos de 60%, menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, o menos de 10% de la secuencia de ácido nucleico de un segundo ácido nucleico molde parcial. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos molde parciales en un par pueden hibridar parcialmente entre sí en sus extremos 3’. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos molde parciales en un par pueden hibridar entre sí en su región de captura específica de la diana.
En algunas realizaciones, un dímero de ácidos nucleicos molde parciales incluye un primer ácido nucleico molde parcial que incluye una región de captura universal 5'-terminal Y o Z, un sitio de restricción y una región de dimerización 3’-terminal DR y un segundo ácido nucleico molde parcial que incluye una región de captura universal 5'-terminal Y o Z y una región de dimerización 3’-terminal DR, en donde la DR 3’-terminal del primer ácido nucleico molde parcial y la DR 3’ terminal de los segundos ácidos nucleicos molde parciales hibridan entre sí. En algunas realizaciones, las DR 3’-terminales del primer y segundo ácidos nucleicos molde parciales incluyen una región de captura específica de la diana. En algunas realizaciones, las DR 3’-terminales del primer y segundo ácidos nucleicos molde parciales incluyen un sitio de unión al cebador de secuenciación (SBS). En algunas realizaciones, las DR 3’-terminales del primer y segundo ácidos nucleicos molde parciales incluyen un sitio de restricción (p. ej., un sitio de restricción SapI).
En algunas realizaciones, un dímero de ácidos nucleicos molde parciales incluye un primer ácido nucleico molde parcial que incluye una primera región de captura universal en su extremo 5’ (P5), un sitio de restricción (SapI) y una región de captura específica de la diana (CP) en su extremo 3’. En algunas realizaciones, el dímero de los ácidos nucleicos molde parciales tiene un segundo ácido nucleico molde parcial que incluye una región de captura específica de la diana complementaria en su extremo 3’ (CP'), un sitio de unión al cebador de secuenciación (SBS) y una segunda región de captura universal en su extremo 5’ (P7). Véase, p. ej., la FIG. 16.
El KEA puede permitir la producción de agrupaciones de ácidos nucleicos diana monoclonales (p. ej., amplicones de ácidos nucleicos diana) sobre un área de superficie, p. ej., sobre una panel en una celda de flujo modelada, mediante la amplificación rápida de un único ácido nucleico diana que se 'siembra' en el área de la superficie antes de que cualquier ácido nucleico diana adicional se pueda sembrar en la misma área y el KEA puede lograr una densidad de agrupaciones de ácidos nucleicos monoclonales que excede el límite de Poisson. Típicamente, en el KEA, la tasa de siembra del ácido nucleico diana es mucho más baja que la tasa de amplificación de ácido nucleico diana, y durante la siembra de polinucleótidos diana está típicamente presente una maquinaria de amplificación. Esta descripción se basa, en parte, en la comprensión de que estas características pueden hacer que el KEA sea incompatible con una serie de métodos de preparación de bibliotecas de secuenciación comúnmente utilizados que tienen requisitos competitivos para los reactivos en la celda de flujo o para la tasa de suministro de moléculas únicas a la superficie.
Esta descripción se basa adicionalmente, en parte, en la comprensión de que los problemas mencionados anteriormente se pueden evitar separando la siembra del ácido nucleico diana de la amplificación del ácido nucleico diana o separando la preparación de la muestra y la siembra del ácido nucleico diana de la amplificación del ácido nucleico diana. Por ejemplo, en una realización de los métodos proporcionados en la presente memoria, inicialmente se realiza un método de siembra de ácido nucleico diana conocido en la técnica a una densidad de carga de ácido nucleico diana que da como resultado la ocupación con ácido nucleico diana policlonal de un área de superficie (p. ej., una panel o pocillo de una celda de flujo modelada). Bajo las condiciones elegidas de siembra de ácido nucleico diana, una pequeña fracción de elementos de superficie (p. ej., los cebadores de captura universales) hibrida con un ácido nucleico diana (p. ej., un polinucleótido diana o un ácido nucleico molde). Bajo las condiciones experimentales elegidas, el evento de siembra en sí mismo no se puede utilizar eficazmente como desencadenante para la amplificación de ácidos nucleicos y la formación de agrupaciones monoclonales. En una etapa del método separada, se introduce un desencadenante separado para activar los ácidos nucleicos diana a una tasa que es mucho más baja que la tasa de amplificación para garantizar que en la mayoría de los casos solo uno de varios ácidos nucleicos diana sembrados se amplifique para formar agrupaciones monoclonales de ácidos nucleicos diana p. ej., en los pocillos o paneles de una celda de flujo modelada.
Esta descripción se basa adicionalmente, en parte, en la comprensión de que la activación de los ácidos nucleicos diana se puede desencadenar en un procedimiento dirigido (véanse, p. ej. las FIG. 17-19) o en un procedimiento estocástico (véanse, p. ej. las FIG. 20-21). En un procedimiento dirigido, los ácidos nucleicos diana pueden, p. ej., incluir diferentes subgrupos que se pueden activar de forma individual e independiente. En un procedimiento estocástico, se pueden activar aleatoriamente diferentes ácidos nucleicos diana y se pueden elegir las condiciones de activación de modo que la activación aleatoria de los ácidos nucleicos diana ocurra con una frecuencia baja.
En un ejemplo de un procedimiento de activación dirigida, se pueden unir diferentes ácidos nucleicos diana a diferentes marcas para distinguir diferentes subgrupos de ácidos nucleicos diana, en donde cada miembro del ácido nucleico diana porta el mismo tipo de marca. El marcaje del ácido nucleico diana puede realizarse al azar, p. ej., mediante marcaje por perdigonada (p. ej., código de barras), o el marcaje puede ser dirigido (p. ej., marcaje específico de secuencia).
La FIG. 18 ilustra partes de un método ejemplar proporcionado en la presente memoria que utiliza la activación dirigida de ácidos nucleicos diana. En una primera etapa, se sembraron diferentes subgrupos de ácidos nucleicos diana que portaban diferentes marcas A, B, C en un panel (p. ej., panel 1) de una celda de flujo modelada. Las moléculas desencadenantes específicas de la marca se utilizan en una etapa separada para activar subgrupos específicos de los ácidos nucleicos diana. En algunas realizaciones, las marcas específicas de ácido nucleico diana pueden ser secuencias de ácido nucleico específicas del ácido nucleico diana y las moléculas desencadenantes específicas de la marca pueden ser cebadores de ácidos nucleicos que incluyen secuencias de ácido nucleico específicas de la diana complementarias. Las moléculas desencadenantes específicas de la marca pueden ser, p. ej., cebadores de ácidos nucleicos solubles como se muestra en la FIG. 18. En algunas realizaciones, las moléculas desencadenantes específicas de la marca se pueden inmovilizar a su vez sobre la superficie, p. ej., como se muestra en la FIG. 19. En algunas realizaciones, las moléculas desencadenantes específicas de la marca están presentes en la superficie a concentraciones mucho más bajas que los ácidos nucleicos diana sembrados. En algunas realizaciones, las moléculas desencadenantes solubles o inmovilizadas pueden ser cebadores quiméricos, que, p. ej., incluyen una región de captura universal y una región de captura específica de la diana (p. ej., P5/B' en la FIG. 19).
La FIG. 20 ilustra una realización ejemplar de un método proporcionado en la presente memoria que implica la activación estocástica de ácidos nucleicos diana. En este ejemplo, los ácidos nucleicos diana sembrados incluyen una estructura de horquilla que enmascara una región de captura universal P5 e incluyen adicionalmente una base escindible. Se puede lograr la activación estocástica del ácido nucleico diana, p. ej., mediante un producto digerido con endonucleasa de las estructuras de horquilla y el enmascaramiento de la región de captura universal.
En otra realización de un método proporcionado en la presente memoria que implica la activación estocástica de ácidos nucleicos diana, los ácidos nucleicos diana se pueden sembrar con un agente de bloqueo unido (p. ej., una proteína o una cuenta). La activación estocástica de los ácidos nucleicos diana sembrados individuales se puede lograr mediante la adición posterior de un agente de desbloqueo (p. ej., una proteasa).
En otra realización de un método proporcionado en la presente memoria que implica la activación estocástica de ácidos nucleicos diana, los ácidos nucleicos diana sembrados pueden incluir un nucleótido no natural (p. ej., que tiene una base de isoguanina o isocitosina). La activación estocástica de los ácidos nucleicos diana individuales se puede lograr en el KEA "incorporando erróneamente" los nucleótidos naturales en los amplicones de ácido nucleico diana en lugar de los nucleótidos que no se producen naturalmente. Los nucleótidos de origen natural típicamente se emparejan con los nucleótidos de origen no natural de los ácidos nucleicos diana solo con baja eficacia y baja frecuencia.
En otros métodos ejemplares que implican la activación estocástica de ácidos nucleicos diana, los ácidos nucleicos diana, p. ej., en una biblioteca de secuenciación, inicialmente carecen de una secuencia desencadenante. En una etapa inicial, se pueden añadir secuencias desencadenantes a los ácidos nucleicos diana individuales en un procedimiento estocástico al incluir un nivel bajo de un cebador quimérico en el KEA que incluye tanto la secuencia desencadenante (p. ej., una secuencia P5) como una secuencia complementaria a un ácido nucleico diana (p. ej., una secuencia SBS3). El ácido nucleico diana individual que tiene la secuencia desencadenante añadida (p. ej., P5), se puede sembrar a continuación, p. ej., en el pocillo de una celda de flujo modelada, y se puede someter a amplificación para formar un grupo monoclonal. Véase, p. ej., la FIG. 21 y el Ejemplo 2.
En otro aspecto, fuera del alcance de la invención reivindicada, la presente memoria proporciona un método para modificar un cebador de captura inmovilizado que incluye: a) poner en contacto un sustrato que tiene una pluralidad de cebadores de captura inmovilizados con una pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes en condiciones suficientes para que la hibridación produzca una pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes inmovilizados; b) extender dos o más de la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados para producir una pluralidad de productos de extensión inmovilizados diferentes complementarios a dos o más de la pluralidad de ácidos nucleicos semilla inmovilizados diferentes; c) activar un producto de extensión inmovilizado de la pluralidad de productos de extensión inmovilizados diferentes, para formar un cebador de captura activado, y d) opcionalmente, amplificar el cebador de captura activado para producir una agrupación monoclonal de cebadores de captura modificados inmovilizados.
En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos semilla incluyen un ácido nucleico diana, p. ej., en una biblioteca de secuenciación de ADN o en ADN genómico. En algunas realizaciones, los ácidos nucleicos semilla incluyen un ácido nucleico molde proporcionado en la presente memoria. En algunas realizaciones, el ácido nucleico diana es un ARN o un ácido nucleico que incluye uno o más ácidos xenonucleicos.
La activación de un producto de extensión inmovilizado puede ser una activación dirigida, en la que no todos los productos de extensión inmovilizados tienen la misma probabilidad de activarse. La activación puede dirigirse a un subgrupo predeterminado de productos de extensión inmovilizados que tienen más probabilidades de ser activados que otros subgrupos de cebadores de extensión inmovilizados. En otras realizaciones, la activación de un producto de extensión inmovilizado es una activación estocástica, en donde algunos productos de extensión inmovilizados se activan antes que otros productos de extensión inmovilizados, pero en donde no puede predeterminarse, p. ej., basándose en una característica estructural o funcional en los productos de extensión inmovilizados, cuales productos de extensión inmovilizados en una pluralidad de productos de extensión inmovilizados se activan antes y cuales se activan más tarde.
En algunas realizaciones, la activación de un producto de extensión inmovilizado de la pluralidad de productos de extensión inmovilizados diferentes incluye la activación dirigida. En algunas realizaciones, la activación dirigida incluye la etapa inicial de marcaje de la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes con una pluralidad de marcas diferentes para producir una pluralidad de ácidos nucleicos semilla marcados de manera diferente. En algunas realizaciones, la activación dirigida incluye adicionalmente formar una pluralidad de ácidos nucleicos semilla inmovilizados marcados de manera diferente. En algunas realizaciones, la activación dirigida incluye adicionalmente formar una pluralidad de productos de extensión inmovilizados marcados de manera diferente. En algunas realizaciones, la activación dirigida incluye adicionalmente poner en contacto la pluralidad de productos de extensión inmovilizados marcados de manera diferente con una o más moléculas desencadenantes específicas de la marca para activar un producto de extensión inmovilizado.
En algunas realizaciones, la etapa de marcaje inicial incluye el marcaje aleatorio de la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes. En algunas realizaciones, la etapa de marcaje inicial incluye el marcaje dirigido de la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes. En algunas realizaciones, el marcaje dirigido es un marcaje específico de la secuencia. En algunas realizaciones, la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes está marcada con menos de 50, menos de 45, menos de 40, menos de 35, menos de 30, menos de 25, menos de 20, menos de 18, menos de 16, menos de 14, menos de 12, menos de 10, menos de 8, menos de 6, menos de 4 o menos de 2 marcas diferentes. En algunas realizaciones, la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes está marcada con 20, 18, 16, 14, 12, 10, 8, 6, 4 o 2 marcas diferentes. En algunas realizaciones, la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes está marcada con 10 o más, 20 o más, 30 o más, 40 o más, 50 o más, 60 o más, 80 o más, 90 o más, 100 o más, 150 o más, 200 o más, 250 o más, 300 o más, 400 o más, 500 o más, 600 o más, 700 o más, 800 o más, 900 o más, o 1.000 o más marcas diferentes. En algunas realizaciones, las diferentes marcas son diferentes cebadores que tienen diferentes secuencias de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la etapa de marcaje inicial incluye ligar una pluralidad de cebadores diferentes a la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes. En algunas realizaciones, cada ácido nucleico semilla de la pluralidad de ácidos nucleicos semilla está marcado con una marca única. En algunas realizaciones, dos o más ácidos nucleicos semilla diferentes de la pluralidad de ácidos nucleicos semilla se marcan con la misma marca (véase, p. ej. la FIG. 21; SBS3 como marca).
En algunas realizaciones, la molécula desencadenante es un ácido nucleico que incluye una región desencadenante. En algunas realizaciones, la región desencadenante incluye una región de captura específica de la diana. En algunas realizaciones, la región desencadenante incluye una región de captura universal. En algunas realizaciones, la región de captura universal incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® o una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®. En algunas realizaciones, la molécula desencadenante es un ácido nucleico soluble. En algunas realizaciones, la molécula desencadenante es un cebador de captura inmovilizado. En algunas realizaciones, el cebador de captura inmovilizado es una pluralidad de cebadores de captura inmovilizados. En algunas realizaciones, la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados es una pluralidad de cebadores de captura diferentes. En algunas realizaciones, la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados es una pluralidad de los mismos cebadores de captura. En algunas realizaciones, el cebador de captura inmovilizado incluye una región de captura específica de la diana. En algunas realizaciones, el cebador de captura inmovilizado incluye una región de captura universal. En algunas realizaciones, la región de captura universal incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® o una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®.
En algunas realizaciones, la activación de un producto de extensión inmovilizado de la pluralidad de productos de extensión inmovilizados diferentes incluye la activación estocástica. En algunas realizaciones, la activación estocástica incluye poner en contacto el sustrato que tiene la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados con una pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes que tienen una estructura de horquilla para producir una pluralidad de ácidos nucleicos semilla inmovilizados diferentes que incluyen la estructura de horquilla. Véase, p. ej., la FIG. 20. En algunas realizaciones, la activación estocástica incluye, adicionalmente, extender dos o más de la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados para producir una pluralidad de productos de extensión inmovilizados diferentes que incluyen la estructura de horquilla. En algunas realizaciones, la activación estocástica incluye adicionalmente activar uno de la pluralidad de productos de extensión inmovilizados que incluyen la estructura de horquilla con un reactivo de escisión. En algunas realizaciones, el reactivo de escisión es una nucleasa. En algunas realizaciones, la nucleasa es una endonucleasa. En algunas realizaciones, la endonucleasa es una endonucleasa de corte. En algunas realizaciones, el reactivo de escisión comprende la mezcla USER™ (New England Biolabs, Ipswich, MA) o la proteína Fpg (p. ej., de E. coli). En algunas realizaciones, uno o más ácidos nucleicos semilla diferentes de la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes incluyen una base escindible. En algunas realizaciones, la base escindible es uracilo u 8-oxoguanina (8-oxo-dG).
En algunas realizaciones, la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes no incluye una región desencadenante y la activación estocástica incluye una etapa inicial de amplificación de uno de la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes con un cebador quimérico que incluye una región desencadenante.
En algunas realizaciones, en la etapa inicial de amplificación de uno de la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes, la pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes está presente en más de 5 veces, más de 10 veces, más de 25 veces, más de 50 veces, más de 100 veces, más de 250 veces, más de 500 veces, más de 1.000 veces, más de 2.500 veces, más de 5.000 veces, más de 10.000 veces, más de 25.000, más de 50.000 veces, o más de 100.000 veces en exceso sobre el cebador quimérico, que incluye la región desencadenante.
En algunas realizaciones, la región desencadenante incluye una región de captura específica de la diana. En algunas realizaciones, la región desencadenante incluye una región de captura universal. En algunas realizaciones, el cebador quimérico incluye una región desencadenante y un SBS. En algunas realizaciones, la región desencadenante incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® o una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina® y el SBS incluye una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3 de Illumina® o una secuencia de nucleótidos del cebador SBS8 de Illumina®. En algunas realizaciones, el cebador quimérico incluye una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3 de Illumina® o una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS8 de Illumina®.
En algunas realizaciones, la activación estocástica incluye a) poner en contacto un sustrato que tiene una pluralidad de cebadores de captura inmovilizados con una pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes en condiciones suficientes para que la hibridación produzca una pluralidad de ácidos nucleicos semilla inmovilizados diferentes, en donde cada uno de los ácidos nucleicos semilla diferentes incluyen uno o más nucleótidos modificados. En algunas realizaciones, la activación estocástica incluye adicionalmente b) extender dos o más cebadores de captura inmovilizados para producir una pluralidad de productos de extensión inmovilizados diferentes complementarios a la pluralidad de ácidos nucleicos semilla inmovilizados diferentes, en donde cada uno de la pluralidad de productos de extensión inmovilizados diferentes incluye uno o más nucleótidos modificados. En algunas realizaciones, la activación estocástica incluye adicionalmente c) activar uno de la pluralidad de productos de extensión inmovilizados diferentes, para formar un cebador de captura activado, en donde el cebador de captura activado no incluye un nucleótido modificado. En algunas realizaciones, el nucleótido modificado incluye una isoguanina (isoG) o una isocitosina (isoC). Sin desear estar limitados por la teoría, el procedimiento de activación estocástica que utiliza nucleótidos modificados se puede realizar bajo condiciones, en las que la activación estocástica se basa en la diferente tasa de incorporación de nucleótidos modificados mucho más baja durante la síntesis de un ácido nucleico en comparación con los nucleótidos de origen natural. El procedimiento de activación estocástica se puede modificar adicionalmente ajustando las concentraciones de los nucleótidos modificados. Por ejemplo, la tasa de incorporación de nucleótidos modificados en una hebra de ácido nucleico en crecimiento se puede reducir adicionalmente disminuyendo la concentración de los nucleótidos modificados en la reacción de síntesis.
En algunas realizaciones, la activación estocástica incluye poner en contacto el sustrato que tiene la pluralidad de cebadores de captura inmovilizados con una pluralidad de ácidos nucleicos semilla diferentes que incluye un reactivo de bloqueo unido a un extremo de cada uno de los ácidos nucleicos semilla en condiciones suficientes para que la hibridación produzca una pluralidad de ácidos nucleicos semilla inmovilizados diferentes, que incluye el agente de bloqueo y poner en contacto el agente de bloqueo con un agente de desbloqueo. En algunas realizaciones, el agente de desbloqueo es una proteasa (p. ej., proteinasa K). En algunas realizaciones, el agente de desbloqueo incluye un detergente o agente caotrópico (p. ej., ADN o desnaturalizante de proteínas). En algunas realizaciones, el agente de bloqueo es una proteína de unión a ácido nucleico. En algunas realizaciones, el agente de bloqueo es una cuenta (p. ej., una cuenta recubierta con estreptavidina o anti-DIG, o una cuenta de agarosa o polímero). En algunas realizaciones, el agente de bloqueo incluye una partícula viral, p. ej., un bacteriófago, un par receptor-co-receptor, o una combinación de una molécula hidrófoba y una partícula hidrófoba. En algunas realizaciones, el agente de bloqueo incluye un nucleótido biotinilado. En algunas realizaciones, el agente de bloqueo incluye estreptavidina.
En algunas realizaciones, la amplificación del cebador de captura activado para producir una agrupación monoclonal de cebadores de captura modificados inmovilizados incluye KEA o amplificación de puente. En algunas realizaciones, la amplificación del cebador de captura activado para producir una agrupación monoclonal de cebadores de captura modificados inmovilizados incluye la síntesis de ADN utilizando protocolos “Wildfire” (p. ej., Wildfire Paired End Sequencing) o amplificación por círculo rodante.
En algunas realizaciones, la superficie es una celda de flujo modelada que incluye una pluralidad de pocillos. En algunas realizaciones, los productos de extensión inmovilizados diferentes se forman en dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos. En algunas realizaciones, se forma un cebador de captura activado en cada uno de dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos. En algunas realizaciones, el cebador de captura activado se forma en cada uno de al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95%, o al menos 99% de los pocillos de la pluralidad de pocillos. En algunas realizaciones, los cebadores de captura activados formados en cada uno de dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos son cebadores de captura activados diferentes en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de los pocillos. En algunas realizaciones, se forma una agrupación monoclonal de cebadores de captura modificados inmovilizados en cada uno de dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos. En algunas realizaciones, la agrupación monoclonal de cebadores de captura modificados inmovilizados se forma en cada uno de al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de los pocillos de la pluralidad de pocillos. En algunas realizaciones, la agrupación monoclonal de cebadores de captura modificados inmovilizados formados en cada uno de dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos son agrupaciones monoclonales diferentes de cebadores de captura modificados inmovilizados en al menos 5%, al menos 10%, al menos 15%, al menos 20%, al menos 25%, al menos 30%, al menos 35%, al menos 40%, al menos 45%, al menos 50%, al menos 55%, al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 99% de los pocillos.
Los métodos descritos en la presente memoria se pueden utilizar junto con una variedad de técnicas de secuenciación de ácido nucleico. Las técnicas particularmente aplicables son aquellas en las que los ácidos nucleicos se unen en ubicaciones fijas en una matriz de manera que sus posiciones relativas no cambian y en donde se generan imágenes de la matriz repetidamente. Las realizaciones en las que se obtienen imágenes en diferentes canales de color, por ejemplo, coincidiendo con diferentes marcas utilizadas para distinguir un tipo de base de nucleótidos de otro, son particularmente aplicables. En algunas realizaciones, el procedimiento para determinar la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico diana puede ser un procedimiento automatizado. Las realizaciones preferidas incluyen técnicas de secuenciación por síntesis (''SBS'').
Las técnicas de SBS pueden implicar la extensión enzimática de una cadena de ácido nucleico naciente a través de la adición iterativa de nucleótidos contra una hebra molde. En los métodos de SBS conocidos en la técnica, se puede proporcionar un monómero de nucleótido único a un nucleótido diana en presencia de una polimerasa en cada suministro. Sin embargo, en los métodos descritos en la presente memoria, se puede proporcionar más de un tipo de monómero de nucleótidos a un ácido nucleico diana en presencia de una polimerasa en un suministro.
La SBS puede utilizar monómeros de nucleótidos que tienen un radical terminador o aquellos que carecen de cualquier radical terminador. Los métodos que utilizan monómeros de nucleótidos que carecen de terminadores incluyen, por ejemplo, pirosecuenciación y secuenciación utilizando nucleótidos marcados en Y-fosfato, como se expone con más detalle a continuación. En los métodos que utilizan monómeros de nucleótidos que carecen de terminadores, el número de nucleótidos añadidos en cada ciclo puede ser variable y dependiente de la secuencia molde y del modo de suministro de nucleótidos. Para las técnicas de SBS que utilizan monómeros de nucleótidos que tienen un radical terminador, el terminador puede ser eficazmente irreversible en las condiciones de secuenciación utilizadas, como es el caso de la secuenciación de Sanger que utiliza didesoxinucleótidos, o el terminador puede ser reversible, como es el caso de los métodos de secuenciación desarrollados por Solexa (ahora Illumina, Inc.).
Las técnicas de SBS pueden utilizar monómeros de nucleótidos que tienen un radical marcador o aquellos que carecen de un radical marcador. En consecuencia, los eventos de incorporación se pueden detectar en función de una característica de la marca, tal como la fluorescencia de la marca; una característica del monómero de nucleótidos tal como el peso molecular o la carga; un subproducto de la incorporación del nucleótido, tal como la liberación de pirofosfato; o similar. En realizaciones, cuando dos o más nucleótidos diferentes están presentes en un reactivo de secuenciación, los diferentes nucleótidos se pueden distinguir entre sí, o alternativamente, los dos o más marcas diferentes pueden ser indistinguibles bajo las técnicas de detección que se estén utilizando. Por ejemplo, los diferentes nucleótidos presentes en un reactivo de secuenciación pueden tener diferentes marcas y se pueden distinguir utilizando ópticas apropiadas como se ilustra mediante los métodos de secuenciación desarrollados por Solexa (ahora Illumina, Inc.).
Las realizaciones preferidas incluyen técnicas de pirosecuenciación. La pirosecuenciación detecta la liberación de pirofosfato inorgánico (PPi) a medida que se incorporan nucleótidos concretos en la cadena naciente (Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M. y Nyren, P. (1996) "Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release". Analytical Biochemistry 242(1), 84-9; Ronaghi, M. (2001) "Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing". Genome Res. 11(1), 3-11; Ronaghi, M., Uhlen, M. y Nyren, P. (1998) "A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science 281(5375), 363; Patente de Estados Unidos Núm. 6.210.891; Patente de Estados Unidos Núm. 6.258.568 y Patente de Estados Unidos Núm. 6.274.320). En la pirosecuenciación, el PPi liberado se puede detectar al convertirse inmediatamente en trifosfato de adenosina (ATP) por la ATP sulfurilasa, y el nivel de ATP generado se detecta a través de fotones producidos por la luciferasa. Los ácidos nucleicos que se van a secuenciar se pueden unir a los elementos de una matriz y se puede obtener una imagen de la matriz para capturar las señales quimioluminiscentes que se producen debido a la incorporación de nucleótidos en los elementos de la matriz. Se puede obtener una imagen después de que la matriz se trate con un tipo de nucleótido concreto (p. ej., A, T, C o G). Las imágenes obtenidas después de la adición de cada tipo de nucleótido serán diferentes con respecto a qué elementos de la matriz se detecten. Estas diferencias en la imagen reflejan el contenido de secuencias diferentes de los elementos de la matriz. Sin embargo, las ubicaciones relativas de cada elemento permanecerán sin cambios en las imágenes. Las imágenes se pueden almacenar, procesar y analizar utilizando los métodos establecidos en la presente memoria. Por ejemplo, las imágenes obtenidas después del tratamiento de la matriz con cada tipo de nucleótido diferente se pueden manejar de la misma manera que se ilustra en la presente memoria para imágenes obtenidas de diferentes canales de detección para métodos de secuenciación basados en terminadores reversibles.
En otro tipo ejemplar de SBS, la secuenciación del ciclo se lleva a cabo mediante la adición gradual de nucleótidos terminadores reversibles que contienen, por ejemplo, una marca de colorante escindible o fotodecolorable como se describe, por ejemplo, en el documento WO 04/018497 y la Patente de Estados Unidos Núm. 7.057.026. Este enfoque está siendo comercializado por Solexa (ahora Illumina Inc.), y también se describe en los documentos WO 91/06678 y WO 07/123.744. La disponibilidad de terminadores marcados con fluorescencia en los que la terminación se puede invertir y la marca fluorescente escindir facilita la secuenciación eficaz de terminación reversible cíclica (TRC). Las polimerasas también pueden ser diseñadas conjuntamente para incorporar y extenderse eficazmente a partir de estos nucleótidos modificados.
Preferiblemente en realizaciones de secuenciación basadas en terminadores reversibles, las marcas no inhiben sustancialmente la extensión en condiciones de reacción de SBS. Sin embargo, las marcas de detección pueden ser eliminables, por ejemplo, por escisión o degradación. Las imágenes se pueden capturar después de la incorporación de marcas a elementos de ácido nucleico ordenados. En realizaciones particulares, cada ciclo implica el suministro simultáneo de cuatro tipos diferentes de nucleótidos a la matriz y cada tipo de nucleótido tiene una marca espectralmente distinta. A continuación, se pueden obtener cuatro imágenes, cada una utilizando un canal de detección que es selectivo para una de las cuatro marcas diferentes. Alternativamente, se pueden añadir diferentes tipos de nucleótidos secuencialmente y se puede obtener una imagen de la matriz entre cada etapa de adición. En tales realizaciones, cada imagen mostrará elementos de ácido nucleico que tienen nucleótidos incorporados de un tipo concreto. Diferentes elementos estarán presentes o ausentes en las diferentes imágenes debido al diferente contenido de secuencia de cada elemento. Sin embargo, la posición relativa de los elementos permanecerá sin cambios en las imágenes. Las imágenes obtenidas de tales métodos reversibles de terminador-SBS se pueden almacenar, procesar y analizar cómo se establece en la presente memoria. Después de la etapa de captura de la imagen, se pueden eliminar las marcas y se pueden eliminar los radicales terminadores reversibles para los ciclos posteriores de adición y detección de nucleótidos. La eliminación de las marcas después de que se hayan detectado en un ciclo particular y antes de un ciclo posterior, puede proporcionar la ventaja de reducir la señal de fondo y la diafonía entre ciclos. A continuación, se exponen ejemplos de marcas y métodos de eliminación útiles.
En realizaciones particulares, algunos o todos los monómeros de nucleótidos pueden incluir terminadores reversibles. En tales realizaciones, los terminadores reversibles/fluoros escindibles pueden incluir flúor unido al radical ribosa a través de una conexión éster 3’ (Metzker, Genome Res. 15:1767-1776 (2005)). Otros enfoques han separado la química del terminador de la escisión de la marca de fluorescencia (Ruparel et al., Proc Natl Acad Sci USA 102:5932-7 (2005)). Ruparel et al describieron el desarrollo de terminadores reversibles que utilizaban un pequeño grupo alilo 3’ para bloquear la extensión, pero que podían desbloquearse fácilmente mediante un tratamiento corto con un catalizador de paladio. El fluoróforo se unió a la base a través de un conector fotoescindible que podría ser fácilmente escindido por una exposición de 30 segundos a la luz UV de longitud de onda larga. Por lo tanto, la reducción con disulfuro o la fotoescisión se pueden utilizar como un conector escindible. Otro enfoque para la terminación reversible es el uso de la terminación natural que se produce después de la colocación de un colorante voluminoso sobre un dNTP. La presencia de un colorante voluminoso cargado sobre el dNTP puede actuar como un terminador eficaz a través del impedimento estérico y/o electrostático. La presencia de un evento de incorporación evita nuevas incorporaciones a menos que se elimine el colorante. La escisión del colorante elimina el flúor y revierte eficazmente la terminación. También se describen ejemplos de nucleótidos modificados en la Patente de Estados Unidos Núm.
7.427.673 y la Patente de Estados Unidos Núm. 7.057.026.
Los sistemas y métodos de SBS ejemplares adicionales que se pueden utilizar con los métodos y sistemas descritos en la presente memoria se describen en la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm.
2007/0166705, la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2006/0188901, la Patente de Estados Unidos Núm. 7.057.026, la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2006/0240439, la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2006/0281109, la Publicación PCT Núm. WO 05/065814, la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2005/0100900, la Publicación PCT Núm. WO 06/064199, la Publicación PCT Núm. WO 07/010.251, la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2012/0270305 y la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2013/0260372.
Algunas realizaciones pueden utilizar la detección de cuatro nucleótidos diferentes utilizando menos de cuatro marcadores diferentes. Por ejemplo, la SBS se puede realizar utilizando los métodos y sistemas descritos en la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2013/0079232. Como primer ejemplo, se puede detectar un par de tipos de nucleótidos a la misma longitud de onda, pero distinguir en función de una diferencia de intensidad para un miembro del par en comparación con el otro, o en función de un cambio en un miembro del par (p. ej., mediante modificación química, modificación fotoquímica o modificación física) que hace que la señal aparente aparezca o desaparezca en comparación con la señal detectada para el otro miembro del par. Como segundo ejemplo, se pueden detectar tres de cuatro tipos diferentes de nucleótidos en condiciones particulares, mientras que un cuarto tipo de nucleótido carece de un marcador que sea detectable en esas condiciones, o se detecte mínimamente en esas condiciones (p. ej., detección mínima debido a fluorescencia de fondo, etc). La incorporación de los primeros tres tipos de nucleótidos a un ácido nucleico se puede determinar en función de la presencia de sus respectivas señales y la incorporación del cuarto tipo de nucleótido al ácido nucleico se puede determinar basándose en la ausencia o detección mínima de cualquier señal. Como tercer ejemplo, un tipo de nucleótido puede incluir marcas que se detectan en dos canales diferentes, mientras que otros tipos de nucleótidos se detectan en no más de uno de los canales. Las tres configuraciones ejemplares mencionadas anteriormente no se consideran mutuamente excluyentes y se pueden utilizar en diferentes combinaciones. Una realización ejemplar que combina los tres ejemplos, es un método SBS basado en fluorescencia que utiliza un primer tipo de nucleótido que se detecta en un primer canal (p. ej., dATP que tiene una marca que se detecta en el primer canal cuando es excitada por una primera longitud de onda de excitación), un segundo tipo de nucleótido que se detecta en un segundo canal (p. ej., dCTP que tiene una marca que se detecta en el segundo canal cuando es excitada con una segunda longitud de onda de excitación), un tercer tipo de nucleótido que se detecta tanto en el primer canal como en el segundo (p. ej., dTTP que tiene al menos una marca que se detecta en ambos canales cuando es excitada por la primera y/o la segunda longitudes de onda de excitación) y un cuarto tipo de nucleótido que carece de una marca que no se detecta, o se detecta mínimamente, en cualquiera de los canales (p. ej., dGTP que no tiene marca).
Adicionalmente, como se describe en la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2013/0079232, los datos de secuenciación se pueden obtener utilizando un solo canal. En los llamados enfoques de secuenciación de un colorante, el primer tipo de nucleótido se marca, pero la marca se elimina después de que se genere la primera imagen, y el segundo tipo de nucleótido se marca solo después de que se genere una primera imagen. El tercer tipo de nucleótido conserva su marca tanto en la primera como en la segunda imágenes, y el cuarto tipo de nucleótido permanece sin marcar en ambas imágenes.
Algunas realizaciones pueden utilizar secuenciación mediante técnicas de ligación. Tales técnicas utilizan ADN ligasa para incorporar oligonucleótidos e identificar la incorporación de tales oligonucleótidos. Los oligonucleótidos pueden tener diferentes marcas que están correlacionadas con la identidad de un nucleótido particular en una secuencia con la que hibridan los oligonucleótidos. Al igual que con otros métodos de SBS, se pueden obtener imágenes después del tratamiento de una matriz de elementos de ácido nucleico con los reactivos de secuenciación marcados. Cada imagen mostrará elementos de ácido nucleico que han incorporado marcas de un tipo particular. Los diferentes elementos estarán presentes o ausentes en las diferentes imágenes debido al contenido de secuencia diferente de cada elemento, pero la posición relativa de los elementos permanecerá sin cambios en las imágenes. Las imágenes obtenidas de los métodos de secuenciación basados en la ligación se pueden almacenar, procesar y analizar cómo se establece en la presente memoria. Los sistemas y métodos de SBS ejemplares que se pueden utilizar con los métodos y sistemas descritos en la presente memoria se describen en Patente de Estados Unidos Núm.6.969.488, la Patente de Estados Unidos Núm.6.172.218 y la Patente de Estados Unidos Núm.6.306.597.
Algunas realizaciones pueden utilizar secuenciación de nanoporos (Deamer, D. W. y Akeson, M. "Nanopores and nucleic acids: prospects for ultrarapid sequencing". Trends Biotechnol.18, 147-151 (2000); Deamer, D. y D. Branton, "Caracterizaron of nucleic acids by nanopore analysis". Acc. Chem Res.35:817-825 (2002); Li, J., M. Gershow, D. Stein, E. Brandin y J. A. Golovchenko, " DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope" Nat. Mater.2:611 -615 (2003)). En tales realizaciones, el ácido nucleico diana pasa a través de un nanoporo. El nanoporo puede ser un poro sintético o una proteína de membrana biológica, como la a-hemolisina. A medida que el ácido nucleico diana pasa a través del nanoporo, cada par de bases puede identificarse midiendo las fluctuaciones en la conductancia eléctrica del poro. (Patente de Estados Unidos Núm.7.001.792; Soni, G. V. y Meller, "A. Progress toward ultrafast DNA sequencing usid dolid-state nanopores". Clin. Chem 53, 1996-2001 (2007); Healy, K. "Nanopore-based single-molecule DnA analysis". Nanomed 2, 459-481 (2007); Cockroft, S. L., Chu, J., Amorin, M. y Ghadiri, M. R. "A single-molecule nanopore device detects DNA polymerase activity with single nucleotide resolution". J. Am. Chem Soc.
130, 818-820 (2008)). Los datos obtenidos de la secuenciación de nanoporos se pueden almacenar, procesar y analizar cómo se expone en la presente memoria. En particular, los datos se pueden tratar como una imagen de acuerdo con el tratamiento ejemplar de imágenes ópticas y otras imágenes que se expone en la presente memoria.
Algunas realizaciones pueden utilizar métodos que implican el seguimiento en tiempo real de la actividad de la ADN polimerasa. Las incorporaciones de nucleótidos se pueden detectar a través de interacciones de transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) entre una polimerasa que contiene fluoróforo y nucleótidos marcados con Y-fosfato como se describe, por ejemplo, en Patente de Estados Unidos Núm.7.329.492 y Patente de Estados Unidos Núm.7.211.414 o las incorporaciones de nucleótidos se pueden detectar con guías de onda en modo cero como se describe, por ejemplo, en Patente de Estados Unidos Núm.7.315.019 y el uso de análogos de nucleótidos fluorescentes y polimerasas modificadas genéticamente como se describe, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Núm. 7.405.281 y en la Publicación de la Solicitud de Patente de Estados Unidos Núm. 2008/0108082. La iluminación se puede restringir a un volumen a escala de zeptolitros alrededor de una polimerasa fijada a la superficie de manera que se pueda observar la incorporación de nucleótidos marcados con fluorescencia con un fondo bajo (Levene, M. J. et al. "Zero-mode wave guides for single-molecule analysis at high concentrations". Science 299, 682­ 686 (2003); Lundquist, P. M. et al. "Paralel confocal detection of single molecules in real time". Opt. Lett.33, 1026­ 1028 (2008); Korlach, J. et al. "Selective aluminum passivation for targeted immovilization of single DNA Polymerase molecules in zero-mode wave guide nano structures". Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 105, 1176-1181 (2008)). Las imágenes obtenidas de tales métodos se pueden almacenar, procesar y analizar cómo se establece en la presente memoria.
Algunas realizaciones de SBS incluyen la detección de un protón liberado tras la incorporación de un nucleótido a un producto de extensión. Por ejemplo, la secuenciación basada en la detección de protones liberados puede utilizar un detector eléctrico y técnicas asociadas que están disponibles comercialmente en Ion Torrent (Guilford, CT, una subsidiaria de Life Technologies) o los métodos y sistemas de secuenciación descritos en los documentos US 2009/0026082 A1; US 2009/0127589 A1; US 2010/0137143 A1; o US 2010/0282617 A1. Los métodos establecidos en la presente memoria para amplificar ácidos nucleicos diana utilizando exclusión cinética se pueden aplicar fácilmente a sustratos utilizados para detectar protones. Más específicamente, los métodos establecidos en la presente memoria se pueden utilizar para producir poblaciones clonales de amplicones que se utilizan para detectar protones.
Los métodos de SBS anteriores se pueden llevar a cabo ventajosamente en formatos multiplex de manera que se manipulen simultáneamente múltiples ácidos nucleicos diana diferentes. En realizaciones particulares, se pueden tratar diferentes ácidos nucleicos diana en un recipiente de reacción común o sobre una superficie de un sustrato particular. Esto permite el suministro conveniente de reactivos de secuenciación, la eliminación de reactivos que no han reaccionado y la detección de eventos de incorporación de manera múltiple. En realizaciones que utilizan ácidos nucleicos diana unidos a la superficie, los ácidos nucleicos diana pueden estar en un formato de matriz. En un formato de matriz, los ácidos nucleicos diana se pueden unir a una superficie de una manera espacialmente distinguible. Los ácidos nucleicos diana se pueden unir mediante anclaje covalente directo, anclaje a una cuenta u otra partícula o unión a una polimerasa u otra molécula que está anclada a la superficie. La matriz puede incluir una copia única de un ácido nucleico diana en cada sitio (también denominado elemento) o múltiples copias que tienen la misma secuencia pueden estar presentes en cada sitio o elemento. Se pueden producir copias múltiples por métodos de amplificación tales como amplificación de puente o PCR en emulsión como se describe con más detalle a continuación.
Los métodos expuestos en la presente memoria pueden utilizar matrices que tienen elementos a cualquiera de una variedad de densidades que incluyen, por ejemplo, al menos aproximadamente 10 elementos/cm2, 100 elementos/cm2, 500 elementos/cm2, 1.000 elementos/cm2, 5.000 elementos/cm2, 10.000 elementos/cm2, 50.000 elementos/cm2, 100.000 elementos/cm2, 1.000.000 elementos/cm2, 5.000.000 elementos/cm2, o más alta.
Una ventaja de los métodos expuestos en la presente memoria es que proporcionan una detección rápida y eficaz de una pluralidad de ácidos nucleicos diana en paralelo. Por consiguiente, la presente descripción proporciona sistemas integrados capaces de preparar y detectar ácidos nucleicos utilizando mecanismos conocidos en la técnica tales como los ilustrados anteriormente. Por lo tanto, un sistema integrado de la presente descripción puede incluir componentes fluidos capaces de suministrar reactivos de amplificación y/o reactivos de secuenciación a uno o más fragmentos de ADN inmovilizados, incluyendo el sistema componentes tales como bombas, válvulas, depósitos, líneas de fluido y similares. Una celda de flujo se puede configurar y/o utilizar en un sistema integrado para la detección de ácidos nucleicos diana. Las celdas de flujo ejemplares se describen, por ejemplo, en los documentos US 2010/0111768 A1 y Publicación de la Solicitud de Estados Unidos Núm. 2012/270305. Como se ilustra para las celdas de flujo, se pueden utilizar uno o más de los componentes fluidos de un sistema integrado para un método de amplificación y para un método de detección. Tomando una realización de secuenciación de ácido nucleico como ejemplo, se pueden utilizar uno o más de los componentes fluidos de un sistema integrado para un método de amplificación establecido en la presente memoria y para el suministro de reactivos de secuenciación en un método de secuenciación tal como los ilustrados anteriormente. Alternativamente, un sistema integrado puede incluir sistemas de fluidos separados para llevar a cabo métodos de amplificación y llevar a cabo métodos de detección. Los ejemplos de sistemas de secuenciación integrados que son capaces de crear ácidos nucleicos amplificados y también determinar la secuencia de los ácidos nucleicos incluyen, sin limitación, la plataforma MiSeq™ (Illumina, Inc., San Diego, CA) y los dispositivos descritos en la Publicación de la Solicitud Núm. 2012/270305.
La presente descripción se refiere adicionalmente a kits para modificar un cebador de captura inmovilizado. En algunas realizaciones, los kits incluyen a) un ácido nucleico molde proporcionado en la presente memoria, y b) una celda de flujo modelada que tiene dos o más pocillos, en donde los dos o más pocillos tienen un par de cebadores de captura universales. En algunas realizaciones, el kit incluye adicionalmente una enzima de restricción. En algunas realizaciones, la enzima de restricción es SapI. En algunas realizaciones, los kits incluyen adicionalmente instrucciones para utilizar los componentes del kit para la modificación de un cebador de captura inmovilizado. En algunas realizaciones, los kits incluyen adicionalmente una o más mezclas de analitos de control, p. ej., dos o más analitos de control para su uso para someter a prueba el kit.
Los siguientes ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, no de limitación.
Ejemplos
Ejemplo 1: Injerto de cebador de doble capa
Este ejemplo describe un experimento que implica el depósito de una primera y una segunda capa sobre una celda de flujo modelada y el depósito de un primer cebador en la primera capa y el depósito de un segundo cebador en la segunda celda de flujo.
Se aplicó como recubrimiento una primera capa (PAZAM) sobre celdas de flujo modeladas que tenían pocillos de 400 nm separados por 700 nm, sustancialmente como se describe en las Publicaciones de Patente de EE. UU. US 2014/0079923 A1 y US 2013/0096034 A1. Después del pulido, se depositó un primer cebador de captura en la primera capa, incluyendo el primer cebador una secuencia de cebador P5 de Illumina® y una secuencia del cebador SBS3 de Illumina®. La hibridación con un oligonucleótido marcado con tetracloro-fluoresceína ("hibridación TET-oligo") mostró un patrón rectangular, lo que demuestra que el cebador P5-SBS3 se depositó específicamente dentro de los nanopocillos. Véase también, la FIG. 5 (panel superior).
Se aplicó como recubrimiento una segunda capa (SFA) sobre la primera capa en los nanopocillos y sobre la superficie de la celda de flujo que rodea los pocillos. La hibridación TET-oligo mostró un patrón rectangular, lo que demuestra que el primer cebador de captura en la primera capa todavía estaba presente y era funcional después de depositar la segunda capa. Véase también, la FIG.5 (panel central).
Se depositó un segundo cebador, en forma del par de cebadores de captura P5 y P7 de Illumina®, en la segunda capa. La hibridación TET-oligo demostró que el segundo cebador se depositó con éxito no solo en los pocillos, sino a través de la segunda capa, incluida la superficie que rodea los pocillos.
Este experimento demuestra que las celdas de flujo modeladas se pueden recubrir con al menos dos capas que incluyen diferentes cebadores de captura. Se depositó un primer cebador de captura en una primera capa dentro de los pocillos de la celda de flujo modelada. Se depositó un segundo cebador de captura en la segunda capa, sobre la superficie que rodea los pocillos. El primer y segundo cebadores hibridaron con sondas oligonucleotídicas específicas.
Ejemplo 2: Activación Estocástica de la Amplificación de Ácido Nucleico Diana
Este ejemplo describe un experimento que implica la activación estocástica de ácidos nucleicos diana utilizando un cebador quimérico en KEA que incluye una secuencia desencadenante y una secuencia específica del ácido nucleico diana combinadas con ácidos nucleicos diana que carecen de la secuencia desencadenante. En este ejemplo, la secuencia de cebador de captura universal Illumina P5 se utilizó como una secuencia desencadenante y la secuencia SBS3 de Illumina se utilizó como una secuencia específica de ácido nucleico diana (P5/SBS3).

Claims (17)

REIVINDICACIONES
1. Una micromatriz que comprende:
a) un sustrato que comprende al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo;
b) una primera capa que cubre al menos parcialmente la superficie interna del pocillo y que comprende al menos un primer par de cebadores de captura; y
c) una segunda capa que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo, en donde el primer par de cebadores de captura en la primera capa está presente y es funcional en un ensayo de exclusión cinética (KEA) después de que se haya proporcionado la segunda capa.
2. La micromatriz de la reivindicación 1, en donde al menos uno de
(i) la primera capa no cubre la superficie que rodea el pocillo,
(ii) al menos un pocillo es una pluralidad de pocillos, opcionalmente en donde la pluralidad de pocillos está espaciada a un paso de aproximadamente 700 nm, (iii) el diámetro del pocillo es menor que aproximadamente 1 pm, opcionalmente en donde el diámetro del pocillo está entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 900 nm,
(iv) la primera capa comprende un recubrimiento polimérico, opcionalmente en donde el recubrimiento polimérico comprende poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida (PAZAM),
(v) la segunda capa comprende un recubrimiento polimérico, opcionalmente en donde el recubrimiento polimérico comprende PAZAM o acrilamida libre de silano (SFA),
(vi) el al menos un primer par de cebadores de captura es una pluralidad de primeros pares de cebadores de captura, y
(vii) los cebadores del al menos un primer par de cebadores de captura comprenden una región de captura universal, opcionalmente en donde el primer cebador del al menos un primer par de cebadores de captura comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y el segundo cebador del al menos un primer par de cebadores de captura comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®, opcionalmente en donde los cebadores del al menos un primer par de cebadores de captura comprenden adicionalmente un sitio de unión al cebador de secuenciación (SBS), opcionalmente en donde el primer cebador del al menos una primer par de cebadores de captura comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3 de Illumina®, y el segundo cebador del al menos un primer par cebador de captura comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS8 de Illumina®.
3. La micromatriz de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la segunda capa comprende al menos un segundo par de cebadores de captura.
4. La micromatriz de la reivindicación 3, en donde el al menos un segundo par de cebadores de captura es una pluralidad de segundos pares de cebadores de captura, opcionalmente, en donde los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura están bloqueados en el extremo 3’, opcionalmente en donde los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura están terminados en 3’-fosfato, opcionalmente en donde los cebadores terminados en 3’-fosfato del al menos un segundo par de cebadores de captura comprenden una región de captura universal, opcionalmente en donde el primer cebador del al menos un segundo par de cebadores de captura comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y el segundo cebador del al menos un segundo par de cebadores de captura comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®.
5. La micromatriz de la reivindicación 3 o 4, en donde los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura no están bloqueados en el extremo 3’, opcionalmente en donde los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura comprenden una región de captura universal, opcionalmente en donde el primer cebador del al menos un segundo par de cebadores de captura comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y el segundo cebador del al menos un segundo par de cebadores de captura comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®.
6. La micromatriz de las reivindicaciones 2 a 5, en donde una pluralidad de cebadores de captura de la pluralidad de primeros pares de cebadores de captura están unidos cada uno a un polinucleótido diana, opcionalmente en donde la pluralidad de polinucleótidos diana forma una población monoclonal de polinucleótidos diana en el al menos un pocillo, opcionalmente en donde el al menos un pocillo comprende una pluralidad de pocillos y en donde dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos comprenden una población monoclonal de polinucleótidos diana, opcionalmente (a) en donde los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos comprenden una población monoclonal del mismo polinucleótido diana (b) los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos comprenden una población monoclonal de dos o más polinucleótidos diana diferentes.
7. La micromatriz de las reivindicaciones 3 a 6, en donde el al menos un primer par de cebadores de captura es una pluralidad de primeros pares de cebadores de captura y el al menos un segundo par de cebadores de captura es una pluralidad de segundos pares de cebadores de captura, y en donde una pluralidad de cebadores de la pluralidad de primeros pares de cebadores de captura y la pluralidad de segundos pares de cebadores de captura están unidas a una pluralidad de polinucleótidos diana, opcionalmente en donde la pluralidad de polinucleótidos diana forma una población monoclonal de polinucleótidos diana en el al menos un pocillo, opcionalmente en donde el al menos un pocillo es una pluralidad de pocillos y en donde dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos comprenden una población monoclonal de polinucleótidos diana en donde (i) los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos comprenden una población monoclonal del mismo polinucleótido diana, o
(ii) los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos comprenden una población monoclonal de dos o más polinucleótidos diana diferentes.
8. Un método para amplificar un ácido nucleico, que comprende:
a) producir una primera capa sobre un sustrato, en donde el sustrato comprende al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y cubre al menos parcialmente una superficie interna del pocillo, en donde la primera capa cubre la superficie interna del pocillo;
b) depositar al menos un primer par de cebadores de captura en la primera capa;
c) producir una segunda capa sobre el sustrato que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo en donde el primer par de cebadores de captura en la primera capa está presente y es funcional después de que se haya proporcionado la segunda capa;
d) poner en contacto una muestra que comprende una pluralidad de polinucleótidos diana con el sustrato en condiciones suficientes para que un polinucleótido diana hibride con un cebador de captura del al menos un primer par de cebadores de captura, y
e) realizar un primer ensayo de exclusión cinética (KEA) para producir una población clonal de amplicones a partir del polinucleótido diana dentro del pocillo, amplificando así el polinucleótido diana.
9. El método de la reivindicación 8, en donde la muestra que comprende la pluralidad de polinucleótidos diana se pone en contacto con el sustrato en condiciones suficientes para que un único polinucleótido diana por pocillo hibride con un cebador de captura del al menos un primer par de cebadores de captura, opcionalmente en donde el primer KEA produce una población monoclonal de amplicones a partir de un único polinucleótido diana hibridado con un cebador de captura en al menos un pocillo, opcionalmente en donde el al menos un pocillo es una pluralidad de pocillos y en donde se produce una población monoclonal de amplicones a partir de un único polinucleótido diana en dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos, opcionalmente (i) en donde se produce una población monoclonal de amplicones a partir del mismo polinucleótido diana único en los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos, o (ii) se produce una población monoclonal de amplicones a partir de dos o más polinucleótidos diana únicos en los dos o más pocillos de la pluralidad de pocillos.
10. El método de las reivindicaciones 8 o 9, en donde la primera capa no cubre la superficie que rodea el pocillo.
11. El método de las reivindicaciones 8 a 10, en donde al menos uno de (i) el diámetro del pocillo es inferior a aproximadamente 1 pm, (ii) el al menos un pocillo es una pluralidad de pocillos, (iii) la primera capa comprende un recubrimiento polimérico, opcionalmente en donde el recubrimiento polimérico comprende poli(N-(5-azidoacetamidilpentil)acrilamida-co-acrilamida (PAZAM), (iv) la segunda capa comprende un recubrimiento polimérico, opcionalmente el recubrimiento polimérico comprende PAZAM o SFA, y (v) el al menos un primer par de cebadores de captura es una pluralidad de primeros pares de cebadores de captura.
12. El método de las reivindicaciones 8 a 11, que comprende adicionalmente depositar al menos un segundo par de cebadores de captura en la segunda capa.
13. El método de la reivindicación 12, en donde el al menos un segundo par de cebadores de captura es una pluralidad de segundos pares de cebadores de captura, opcionalmente en donde el al menos un segundo par de cebadores de captura se deposita antes de realizar el primer KEA.
14. El método de las reivindicaciones 8 a 13, en donde (i) los cebadores del al menos un primer par de cebadores de captura comprenden una región de captura universal, opcionalmente en donde el primer cebador de captura del al menos un primer par de cebadores de captura comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y el segundo cebador de captura del al menos un primer par de cebadores de captura comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®,
(ii) la pluralidad de polinucleótidos diana está flanqueada por una o más regiones de captura universales complementarias, opcionalmente en donde los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura están bloqueados en el extremo 3’, opcionalmente en donde los cebadores bloqueados en 3’ comprenden una región de captura universal, opcionalmente en donde la región de captura universal comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® o una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®, comprendiendo opcionalmente de manera adicional desbloquear los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura después de realizar el primer KEA, opcionalmente en donde los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura se desbloquean utilizando quinasa T4,
(iii) comprendiendo adicionalmente realizar la amplificación de puente o un segundo KEA para aumentar la población clonal de amplicones de polinucleótidos diana, opcionalmente en donde los cebadores del primer par de cebadores de captura comprenden adicionalmente un SBS, opcionalmente en donde el primer cebador del al menos un primer par de cebadores comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3 de Illumina® y el segundo cebador del al menos un primer par de cebadores comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS8 de Illumina®, opcionalmente en donde la pluralidad de los polinucleótidos diana está flanqueada por uno o más SBS complementarios,
(iv) en donde los cebadores del al menos un segundo par de cebadores de captura están desbloqueados en el extremo 3’, opcionalmente en donde los cebadores del al menos un segundo par de cebadores comprenden una región de captura universal, opcionalmente en donde la región de captura universal comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina ® una secuencia de nucleótidos cebador P7 de Illumina®, opcionalmente en donde el primer KEA se realiza durante un período prolongado de tiempo para aumentar la población clonal de amplicones más allá del al menos un pocillo,
(v) en donde el al menos un segundo par de cebadores de captura se deposita después de realizar el primer KEA, opcionalmente en donde los cebadores del al menos un primer par de cebadores de captura y el al menos un segundo par de cebadores de captura comprenden una región de captura universal, opcionalmente en donde la región de captura universal comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® o una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®, que opcionalmente comprende de manera adicional realizar la amplificación de puente o un segundo KEA para aumentar la población clonal de amplicones de polinucleótidos diana más allá del al menos un pocillo.
15. Un método para amplificar un ácido nucleico, que comprende:
a) producir una primera capa sobre un sustrato, en donde el sustrato comprende al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo, en donde la primera capa cubre al menos parcialmente la superficie interna del pocillo;
b) depositar al menos un primer par de cebadores de captura en la primera capa, en donde el primer par de cebadores de captura comprende una pluralidad de primeros cebadores de captura que comprenden una porción 3’ que comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una pluralidad de segundos cebadores de captura que comprenden un porción 3’ que comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®;
c) producir una segunda capa sobre el sustrato que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo;
d) depositar al menos un segundo par de cebadores de captura en la segunda capa, en donde el segundo par de cebadores de captura está terminado en 3’-fosfato y comprende una pluralidad de primeros cebadores de captura que comprenden una porción 3’ que comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y un pluralidad de segundos cebadores de captura que comprenden una porción 3’ que comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®;
e) poner en contacto una muestra que comprende una pluralidad de polinucleótidos diana con el sustrato en condiciones suficientes para que un único polinucleótido diana por pocillo hibride con un cebador del al menos un primer par de cebadores de captura, en donde los polinucleótidos diana están flanqueados por regiones cebadoras universales complementarias que comprenden cada una una secuencia de nucleótidos del cebador P5’ de Illumina® complementaria o una secuencia de nucleótidos del cebador cebador P7’ de Illumina® complementaria;
f) realizar un primer KEA para producir una población monoclonal de amplicones a partir del polinucleótido diana único dentro del al menos un pocillo, amplificando así el polinucleótido diana;
g) poner en contacto el sustrato con una quinasa T4 para desbloquear los cebadores del segundo par de cebadores, y
h) realizar la amplificación de puente o un segundo KEA para aumentar la población monoclonal de amplicones del polinucleótido diana único más allá del pocillo.
16. Un método para amplificar un ácido nucleico, que comprende:
a) producir una primera capa sobre un sustrato, en donde el sustrato comprende al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo y una superficie interna del pocillo, en donde la primera capa cubre al menos parcialmente la superficie interna del pocillo;
b) depositar al menos un primer par de cebadores de captura en la primera capa, en donde el primer par de cebadores de captura comprende una pluralidad de primeros cebadores de captura que comprenden una porción 3’ que comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3 de Illumina® y una pluralidad de segundos cebadores de captura que comprenden una porción 3’ que comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina® y una secuencia de nucleótidos del cebador SBS8 de Illumina®;
c) producir una segunda capa sobre el sustrato que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo;
d) depositar al menos un segundo par de cebadores de captura en la segunda capa, en donde el al menos un segundo par de cebadores de captura comprende una pluralidad de primeros cebadores de captura que comprenden una porción 3’ que comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una pluralidad de segundos cebadores de captura que comprenden una porción 3’ que comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®;
e) poner en contacto una muestra que comprende una pluralidad de polinucleótidos diana con el sustrato en condiciones suficientes para que un único polinucleótido diana por pocillo hibride con un cebador del al menos un primer par de cebadores de captura, en donde la pluralidad de polinucleótidos diana está flanqueada por un SBS complementario, cada uno de los cuales comprende una secuencia de nucleótidos del cebador SBS3’ de Illumina® complementario o una secuencia de nucleótidos del cebador SBS8’ de Illumina® complementario, y
f) realizar un KEA durante un tiempo prolongado para producir una población monoclonal de amplicones a partir del polinucleótido diana único dentro y fuera del al menos un pocillo, amplificando así el polinucleótido diana único dentro del pocillo y aumentando la población monoclonal de polinucleótidos diana más allá del al menos un pocillo .
17. Un método para amplificar un ácido nucleico, que comprende:
a) producir una primera capa sobre un sustrato, en donde el sustrato comprende al menos un pocillo, una superficie que rodea el pocillo, y una superficie interna del pocillo, en donde la primera capa cubre al menos parcialmente la superficie interna del pocillo;
b) depositar al menos un primer par de cebadores de captura en la primera capa, en donde el primer par de cebadores comprende una pluralidad de primeros cebadores de captura que comprenden una porción 3’ que comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una pluralidad de segundos cebadores de captura que comprenden una porción 3’ que comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®;
c) producir una segunda capa sobre el sustrato que cubre la primera capa y la superficie que rodea el pocillo;
d) poner en contacto una muestra que comprende una pluralidad de polinucleótidos diana con el sustrato en condiciones suficientes para que un único polinucleótido diana por pocillo hibride con un cebador del al menos un primer par de cebadores de captura, en donde la pluralidad de polinucleótidos está flanqueada por regiones de cebadores universales complementarios que comprenden cada una una secuencia de nucleótidos del cebador P5’ de Illumina® complementaria o una secuencia de nucleótidos del cebador P7’ de Illumina®’ complementaria;
e) realizar un primer KEA para producir una población monoclonal de amplicones a partir del polinucleótido diana único dentro del al menos un pocillo, amplificando así el polinucleótido diana;
f) depositar al menos un segundo par de cebadores de captura en la segunda capa, en donde el al menos un segundo par de cebadores de captura comprende una pluralidad de primeros cebadores de captura que comprenden una porción 3’ que comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P5 de Illumina® y una pluralidad de segundos cebadores de captura que comprenden una porción 3’ que comprende una secuencia de nucleótidos del cebador P7 de Illumina®, y
g) realizar la amplificación de puente o un segundo KEA para aumentar la población monoclonal de amplicones del polinucleótido diana único.
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