CN107523640A - 一种ctDNA精准测序的扩增子文库构建方法 - Google Patents

一种ctDNA精准测序的扩增子文库构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种ctDNA精准测序的扩增子文库构建方法，包括以下步骤：S01：cfDNA随机连接再随机片段化并加接头建库；S02：cfDNA非靶向/靶向文库扩增。本发明解决了：（1）外源标签法需合成大量的标签序列成本较高的问题；（2）低丰度的cfDNA片段小且断裂位点随机分布条件下，设计目的基因的特征引物经常无法扩出目标序列的问题。

Description

一种ctDNA精准测序的扩增子文库构建方法
技术领域
本发明属于循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)高通量测序领域，特别涉及一种ctDNA精准测序的扩增子文库构建方法。
背景技术
cfDNA为外周血的血浆中的DNA，其中包含从人体各种组织脱落的DNA碎片，其长度峰值一般约166个碱基，与缠绕组蛋白DNA的长度相对应。cfDNA中包含了小部分来自肿瘤或肿瘤循环细胞（circulating tumor cell）的DNA碎片，即circulating tumor DNA(ctDNA)，其携带的信息与肿瘤细胞的遗传信息是一致的，包括突变、甲基化等可用于肿瘤分子诊断的信息。ctDNA用作肿瘤标记具有以下应用：1）鉴定肿瘤特异性的突变；2）检测肿瘤负荷以及肿瘤治疗之后的响应；3）检测微小残留病变以监测肿瘤的复发；4）原发肿瘤的早期诊断。针对cfDNA的分子诊断包括非靶向的全基因组或全外显子测序，主要应用于筛选与疾病或耐药性相关的新的基因突变；而ctDNA靶向测序则集中于癌症相关的基因突变热点的检测，特别是抑癌基因的突变。
然而，由于在血液中循环的DNA数量相对较少，而且ctDNA占血浆中提取的游离DNA（cfDNA）的比率也很小，这使得检测ctDNA的突变或甲基化标记有很大难度。因此，ctDNA在检测过程中往往需要借助PCR等方法进行富集扩增。但是，在ctDNA扩增过程经常会引入碱基错配的现象，PCR引入的碱基错误与本身就占很小比例的ctDNA的突变混起来，就使得ctDNA突变的检测更为复杂。为了解决这一问题，需要对所有的cfDNA碎片进行标记，目前常用加标签（UID）的方法来辨别PCR等实验过程引入的碱基错误，以实现ctDNA基因变化的精准判读。
(1) UID标签方法
如图１所示，safe-sequencing的UID法采用的是设计不同的特别标记（uniqueidentifier，UID），将不同的UID分配给不同的cfDNA片段，然后进行测序解读的方法。该方法检测突变的灵敏度理论上可达9×10-6。
(2) 双重测序法（Duplex sequencing）
这是一种在单端UID基础上改进的方法。如图２所示，随机的双链DNA特异标签加入到待测序列的两端，同一段标记序列扩增产生两种不同产物，在随后测序分析中提高扩增与测序错误的判别能力，增强测序数据的准确性。该方法对突变的检出灵敏度为１×10-７。
上述这些方法都是采用外源加入标签对cfDNA进行标记识别，而且都需要合成大量的标签序列，成本大大增加。
发明内容
本发明的目的在于提供一种ctDNA精准测序的扩增子文库构建方法。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种ctDNA精准测序的扩增子文库构建方法，包括以下步骤：
S01：cfDNA随机连接再随机片段化并加接头建库；
S02：cfDNA非靶向/靶向文库扩增。
进一步的，所述步骤S01具体为：抽提纯化cfDNA之后，对cfDNA进行质量检测，取经质检合格的cfDNA 10-30ng，采用连接酶连接3-5小时，然后采用磁珠对cfDNA进行纯化，溶解于8-12μL ddH2O，纯化的cfDNA连接产物加入片段化体系，于50-60°C反应5-10min，然后用磁珠纯化片段化产物，纯化产物溶于35-45μL ddH2O。
进一步的，在所述步骤S01之前还包括转座体的准备：将18-22μM的末端磷酸化的ME序列、8-12μM ME-A序列和8-12μM ME-B按1:1:1的体积混合，于93-98゜孵育12-18min后，室温自然冷却0.8-1.5小时，取1-3μL上述混合物，加0.8-1.2μL 10*tps缓冲液和6-8μLddH2O，于93-98゜孵育1-3min后以0.1°的降温速度降低至25°C，在25°C时加入0.8-1.2ul的tn5酶之后25°C静置30分钟。
进一步的，所述步骤S02的cfDNA非靶向文库扩增采用P5/P7接头扩增：
Primer1:AATGATACGGCGACCACCGA
Adaptor1：AATGATACGGCGACCACCGA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Primer2:CAAGCAGAAGACGGCATACGA
Adaptor2:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index] GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
BPCR反应：
体系 Primer1（10um/μl） 1μL
Primer2（10um/μl） 1μL
Adaptor1（0.5μm/ul） 1μL
Adaptor2（0.5μm/ul） 1μL
片段化DNA 20μL
Kapa HIFI mix 26μL
反应条件 1：补平 72度 3min
2：扩增 98度 20s
60度 30s
72度 3min
PCR扩增反应7-15个循环，产物总量约0.5~1μg，纯化后测序。
进一步的，所述步骤S02的cfDNA靶向文库扩增采用“P5/P7连接目标序列特征引物”,配合P7/P5接头引物进行目标序列的扩增：
Primer1:5’-AATGATACGGCGACCACCGA
上游特征引物：5’-AATGATACGGCGACCACCGA-[目标序列上游特征引物]-3’ +
Adaptor2: 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index] GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
Primer2: 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
或
Primer2: 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
下游特征引物：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index] GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT–[目标序列下游特征引物]-3’
Adaptor1：5’-AATGATACGGCGACCACCGA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Primer1:5’-AATGATACGGCGACCACCGA
BPCR反应：
体系 Primer1（10um/μL） 1μL
Primer2（10um/μL） 1μL
Adaptor1[上游特征引物]（0.5um/μL） 1μL
下游特片引物[Adaptor2]（0.5um/μL） 1μL
片段化DNA 20μL
Kapa HIFI mix 26μL
反应条件 1：补平 72度 3min
2：扩增 98度 20s
60度 30s
72度 3min
PCR扩增反应7－15个循环，产物总量约0.5~1μg，纯化后测序。
本发明的有益效果是：
1. 简化了cfDNA建库的操作流程，节约了生产成本。与UID方法及其衍生的方法相比，本发明省去了加外源UID的步骤，利用“随机连接+随机酶切”的方法，直接对ctDNA加上内源标记。不仅节约了外源标签的成本，也使操作更为简便。
2. 提高了ctDNA检出灵敏性和效率。血浆中的cfDNA含量较低，而ctDNA仅占cfDNA中的很小部分。ctDNA不仅浓度低，而且片段小，一般峰值在166bp左右。cfDNA模板过短及在基因组中分布的随机性降低了对其进行PCR扩增的效率，因此需要采用灵敏性更高的检测方法。本发明采用了目标序列单端特征引物与接头引物组合的方法，从目标位点的５’端和３’端分别扩增目标序列，理论上可以完全扩出任何存在于cfDNA中的目标短序列，大幅提高了扩增出ctDNA目标序列的机会，提高了ctDNA检出灵敏性。本发明解决了低丰度的cfDNA片段小且断裂位点随机分布条件下，设计目标序列的特征引物经常无法扩出目标序列的问题。
3. 提升数据判读的精准性。血浆中的cfDNA含量较低，而ctDNA仅占cfDNA中的很小部分。在高通量测序过程中，文库扩增过程常会引入非特异性扩增，导致后续测序数据分析时难以判断点位突变的准确性。因此，在cfDNA进行扩增前，对其进行标记，在序列分析时可结合标记cfDNA序列进行统计分析，排除扩增及测序过程引入的错误信息，提高基因突变检测的准确性。常见的办法为给cfDNA加上barcode，而本发明采用更为简便的方法，即，使cfDNA进行随机连接，再随机片段化建库，使随机相连的cfDNA互为标记，提高了基因测序结果分析的准确性。本发明通过内源性标签，理论上实现与外源标签一样的标记效果，通过比对具有相同接头序列的测序数据，能够区分扩增及测序带进的碱基错误，降低了测序结果的噪音，提高了测序结果判读的精准度。其次，本发明对目标序列的５’和３’双端序列的同时扩增，理论不仅提高了检出效率，同时也提高了目标区域测序结果的准确性。
附图说明
图1是现有技术UID法建库测序示意图。
图2是现有技术双重测序法（Duplex sequencing）建库测序示意图。
图3是本发明的主要操作流程示意图。
图4是本发明目标基因靶向文库扩增方法示意图。
具体实施方式
如图3所示，本发明提供一种ctDNA精准测序的扩增子文库构建方法，包括以下步骤：
S01：cfDNA随机连接再随机片段化并加接头建库；
S02：cfDNA非靶向/靶向文库扩增。所述步骤S01具体为：抽提纯化cfDNA之后，对cfDNA进行质量检测，取经质检合格的cfDNA 10-30ng，采用连接酶连接3-5小时，然后采用磁珠对cfDNA进行纯化，溶解于8-12μL ddH2O。纯化的cfDNA连接产物加入片段化体系，于50-60°C反应5-10min，然后用磁珠纯化片段化产物，纯化产物溶于35-45μL ddH2O。
在所述步骤S01之前还包括转座体的准备：将18-22μM的末端磷酸化的ME序列、8-12μM ME-A序列和8-12μM ME-B按1:1:1的体积混合，于93-98゜孵育12-18min后，室温自然冷却0.8-1.5小时，取1-3μL上述混合物，加0.8-1.2μL 10*tps缓冲液和6-8μL ddH2O，于93-98゜孵育1-3min后以0.1°的降温速度降低至25°C，在25°C时加入0.8-1.2ul的tn5酶之后25°C静置30分钟。
如图3所示，所述步骤S02的cfDNA非靶向文库扩增采用P5/P7接头扩增：
Primer1:AATGATACGGCGACCACCGA
Adaptor1：AATGATACGGCGACCACCGA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Primer2:CAAGCAGAAGACGGCATACGA
Adaptor2:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index] GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
BPCR反应：
体系 Primer1（10um/μl） 1μL
Primer2（10um/μl） 1μL
Adaptor1（0.5μm/ul） 1μL
Adaptor2（0.5μm/ul） 1μL
片段化DNA 20μL
Kapa HIFI mix 26μL
反应条件 1：补平 72度 3min
2：扩增 98度 20s
60度 30s
72度 3min
PCR扩增反应7－15个循环，产物总量约0.5~1μg，纯化后测序。
如图4所示，所述步骤S02的cfDNA靶向文库扩增采用“P5/P7连接目标序列特征引物”,配合P7/P5接头引物进行目标序列的扩增：
Primer1:5’-AATGATACGGCGACCACCGA
上游特征引物：5’-AATGATACGGCGACCACCGA-[目标序列上游特征引物]-3’ +
Adaptor2: 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index] GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
Primer2: 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
或
Primer2: 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
下游特征引物：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index] GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT–[目标序列下游特征引物]-3’
Adaptor1：5’-AATGATACGGCGACCACCGA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Primer1: 5’-AATGATACGGCGACCACCGA
BPCR反应：
体系 Primer1（10um/μL） 1μL
Primer2（10um/μL） 1μL
Adaptor1[上游特征引物]（0.5um/μL） 1μL
下游特片引物[Adaptor2]（0.5um/μL） 1μL
片段化DNA 20μL
Kapa HIFI mix 26μL
反应条件 1：补平 72度 3min
2：扩增 98度 20s
60度 30s
72度 3min
PCR扩增反应7－15个循环，产物总量约0.5~1μg，纯化后测序。
（1）cfDNA随机互连再随机片段化：通过cfDNA相互随机连接，再随机打断的方式，构建cfDNA文库。这解决了cfDNA因片段长度过短无法应用Tn5转座体在片段化同时加接头的问题。应用Tn5转座体具有在将DNA双链非选择性片段化的同时加上接头，是DNA文库构建的一种简便的方法。但是，cfDNA的长度集中在166bp左右，长度过小，不适于Tn5转座子的建库方法。本发明将cfDNA通过随机连接成长片段（>1kb），使cfDNA序列可应用Tn5转座子进行随机片段化（同时加接头）。
（2）cfDNA之间互为内源标签：利用cfDNA片段互为内源标记，辨别扩增子建库测序过程引入的错误，提高ctDNA测序结果的精准度。cfDNA在经过随机连接与随机打断成200~300bp长度片段后，两端会连上其他cfDNA序列，由于这些cfDNA在基因组内不属连续序列，因此被用于相互之间的文库特异标签，起到内源性标记的作用，提高了基因测序结果分析的准确性。
（3）用目标序列特征引物+接头引物的方法来富集cfDNA短片段基因：应用接头序列引物与目标序列的单端特征引物，实现对目标区域进行扩增富集，解决了因cfDNA模板长度短而导致的目标序列扩增效率低的问题，提高目标序列的深度测序效率。cfDNA不仅丰度低，而且长度短，扩增目标基因时设计的引物对经常由于没法两端均落在cfDNA上面无法扩出产物，因此在以cfDNA为模板进行PCR扩增目标基因时经常效率很低。虽然设计引物进尽量缩短产物的长度可以提高扩出效率，但也减少了所获得的序列信息。本发明组合了接头引物与目标序列的特征引物，在cfDNA接上接头之后，使用目标区域（如突变热点位点）上下游两端的特征引物，分别接头序列引物组合，提高了目标序列的扩增效率。解决了用cfDNA扩增目标基因效率低的问题。
具体实施例一：
S01： cfDNA随机连接再随机片段化并加接头建库；
抽提纯化cfDNA之后，应用安捷伦2100或同类仪器对cfDNA进行质量检测，合格的样品其主峰应分布166bp附近。取经质检合格的cfDNA 10ng，采用T4连接酶连接5小时，然后采用磁珠对cfDNA进行纯化，溶解于8μL ddH2O；通过片段大小的分布判断连接效果。
取8ng上述随机相连的cfDNA，加入Tn5转座体片段化体系（5*lm裂解缓冲液6μL，tn5 转座子11μL，10ng连接的cfDNA，ddH2O补充到30ul），于60°C反应10min，然后用磁珠纯化片段化产物，纯化产物溶于35μL ddH2O。
在所述cfDNA随机片段化并加接头之前还包括转座体的准备：将18μM的末端磷酸化的ME序列（5’-[phos] CTGTCTCTTATACACATCT-3’）、8μM ME-A序列（5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT AGATGTGTATAAGAGACAG）和8μM ME-B(5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGATGTGTATAAGAGACAG)按1:1:1的体积混合，于98゜孵育18min后，室温自然冷却1.5小时，取1μL上述混合物，加0.8μL 10*tps缓冲液和6μLddH2O，于98゜孵育3min后以0.1°的降温速度降低至25°C，在25°C时加入0.8ul的tn5酶之后25°C静置30分钟。
具体实施例二：
S01：cfDNA随机连接再随机片段化并加接头建库；
抽提纯化cfDNA之后，应用安捷伦2100或同类仪器对cfDNA进行质量检测，合格的样品其主峰应分布166bp附近。取经质检合格的cfDNA 30ng，采用T4连接酶连接3小时，然后采用磁珠对cfDNA进行纯化，溶解于12μL ddH2O；通过片段大小的分布判断连接效果。
取12ng上述随机相连的cfDNA，加入Tn5转座体片段化体系（5*lm裂解缓冲液6μL，tn5 转座子11μL，10ng连接的cfDNA，ddH2O补充到30ul），于50°C反应5min，然后用磁珠纯化片段化产物，纯化产物溶于45μL ddH2O。
在所述cfDNA随机片段化并加接头之前还包括转座体的准备：将22μM的末端磷酸化的ME序列（5’-[phos] CTGTCTCTTATACACATCT-3’）、12μM ME-A序列（5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT AGATGTGTATAAGAGACAG）和12μM ME-B(5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGATGTGTATAAGAGACAG)按1:1:1的体积混合，于93゜孵育12min后，室温自然冷却0.8小时，取3μL上述混合物，加1.2μL 10*tps缓冲液和8μLddH2O，于93゜孵育1min后以0.1°的降温速度降低至25°C，在25°C时加入1.2ul的tn5酶之后25°C静置30分钟。
具体实施例三：
S01：cfDNA随机连接再随机片段化并加接头建库；
抽提纯化cfDNA之后，应用安捷伦2100或同类仪器对cfDNA进行质量检测，合格的样品其主峰应分布166bp附近。取经质检合格的cfDNA 20ng，采用T4连接酶连接4小时，然后采用磁珠对cfDNA进行纯化，溶解于10μL ddH2O；通过片段大小的分布判断连接效果。
取10ng上述随机相连的cfDNA，加入Tn5转座体片段化体系（5*lm裂解缓冲液6μL，tn5 转座子11μL，10ng连接的cfDNA，ddH2O补充到30ul），于55°C反应8min，然后用磁珠纯化片段化产物，纯化产物溶于40μL ddH2O。
在所述cfDNA随机片段化并加接头之前还包括转座体的准备：将20μM的末端磷酸化的ME序列（5’-[phos] CTGTCTCTTATACACATCT-3’）、10μM ME-A序列（5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT AGATGTGTATAAGAGACAG）和10μM ME-B(5’-GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGATGTGTATAAGAGACAG)按1:1:1的体积混合，于95゜孵育15min后，室温自然冷却1小时，取2μL上述混合物，加1μL 10*tps缓冲液和7μL ddH2O，于95゜孵育2min后以0.1°的降温速度降低至25°C，在25°C时加入1ul的tn5酶之后25°C静置30分钟。
S02：cfDNA文库扩增：
cfDNA文库扩增分为两类，一类是非靶向的全部cfDNA扩增，另一类为靶向序列文库扩增，分别如图3与图4所示。前者用带P5、P7接头序列的引物进行扩增即可。后者需结合目标序列的特征序列与P7/P5末端引物进行配对扩增。
如图3所示，所述步骤S02的cfDNA非靶向文库扩增采用P5/P7接头扩增：
Primer1:AATGATACGGCGACCACCGA
Adaptor1：AATGATACGGCGACCACCGA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Primer2:CAAGCAGAAGACGGCATACGA
Adaptor2:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index] GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
BPCR反应：
体系 Primer1（10um/μl） 1μL
Primer2（10um/μl） 1μL
Adaptor1（0.5μm/ul） 1μL
Adaptor2（0.5μm/ul） 1μL
片段化DNA 20μL
Kapa HIFI mix 26μL
反应条件 1：补平 72度 3min
2：扩增 98度 20s
60度 30s
72度 3min
PCR扩增反应7－15个循环，产物总量约0.5~1μg，纯化后测序。
如图4所示，所述步骤S02的cfDNA靶向文库扩增采用“P5/P7连接目标序列特征引物”,配合P7/P5接头引物进行目标序列的扩增：
Primer1:5’-AATGATACGGCGACCACCGA
上游特征引物：5’-AATGATACGGCGACCACCGA-[目标序列上游特征引物]-3’ +
Adaptor2: 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index] GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
Primer2: 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
或
Primer2: 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
下游特征引物：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index] GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT–[目标序列下游特征引物]-3’
Adaptor1：5’-AATGATACGGCGACCACCGA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Primer1: 5’-AATGATACGGCGACCACCGA
BPCR反应：
体系 Primer1（10um/μL） 1μL
Primer2（10um/μL） 1μL
Adaptor1[上游特征引物]（0.5um/μL） 1μL
下游特片引物[Adaptor2]（0.5um/μL） 1μL
片段化DNA 20μL
Kapa HIFI mix 26μL
反应条件 1：补平 72度 3min
2：扩增 98度 20s
60度 30s
72度 3min
PCR扩增反应7－15个循环，产物总量约0.5~1μg，纯化后测序。
上述实施例和图式并非限定本发明的产品形态和式样，任何所属技术领域的普通技术人员对其所做的适当变化或修饰，皆应视为不脱离本发明的专利范畴。

Claims (5)

1.一种ctDNA精准测序的扩增子文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S01：cfDNA随机连接再随机片段化并加接头建库；
S02：cfDNA非靶向/靶向文库扩增。
2.根据权利要求1所述的一种ctDNA精准测序的扩增子文库构建方法，其特征在于，所述步骤S01具体为：抽提纯化cfDNA之后，对cfDNA进行质量检测，取经质检合格的cfDNA 10-30ng，采用连接酶连接3-5小时，然后采用磁珠对cfDNA进行纯化，溶解于8-12μL ddH2O，纯化的cfDNA连接产物加入片段化体系，于50-60°C反应5-10min，然后用磁珠纯化片段化产物，纯化产物溶于35-45μL ddH2O。
3.根据权利要求2所述的一种ctDNA精准测序的扩增子文库构建方法，其特征在于，在所述步骤S01之前还包括转座体的准备：将18-22μM的末端磷酸化的ME序列、8-12μM ME-A序列和8-12μM ME-B按1:1:1的体积混合，于93-98゜孵育12-18min后，室温自然冷却0.8-1.5小时，取1-3μL上述混合物，加0.8-1.2μL 10*tps缓冲液和6-8μL ddH2O，于93-98゜孵育1-3min后以0.1°的降温速度降低至25°C，在25°C时加入0.8-1.2ul的tn5酶之后25°C静置30分钟。
4.根据权利要求1所述的一种ctDNA精准测序的扩增子文库构建方法，其特征在于，所述步骤S02的cfDNA非靶向文库扩增采用P5/P7接头扩增：
Primer1:AATGATACGGCGACCACCGA
Adaptor1：AATGATACGGCGACCACCGA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Primer2:CAAGCAGAAGACGGCATACGA
Adaptor2:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index] GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
BPCR反应：
体系 Primer1（10um/μl） 1μL
Primer2（10um/μl） 1μL
Adaptor1（0.5μm/ul） 1μL
Adaptor2（0.5μm/ul） 1μL
片段化DNA 20μL
Kapa HIFI mix 26μL
反应条件 1：补平 72度 3min
2：扩增 98度 20s
60度 30s
72度 3min
PCR扩增反应7-15个循环，产物总量约0.5~1μg，纯化后测序。
5.根据权利要求1所述的一种ctDNA精准测序的扩增子文库构建方法，其特征在于，所述步骤S02的cfDNA靶向文库扩增采用“P5/P7连接目标序列特征引物”,配合P7/P5接头引物进行目标序列的扩增：
Primer1:5’-AATGATACGGCGACCACCGA
上游特征引物：5’-AATGATACGGCGACCACCGA-[目标序列上游特征引物]-3’ +
Adaptor2: 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index] GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’
Primer2: 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
或
Primer2: 5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA
下游特征引物：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[index] GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT–[目标序列下游特征引物]-3’
Adaptor1：5’-AATGATACGGCGACCACCGA ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Primer1: 5’-AATGATACGGCGACCACCGA
BPCR反应：
体系 Primer1（10um/μL） 1μL
Primer2（10um/μL） 1μL
Adaptor1[上游特征引物]（0.5um/μL） 1μL
下游特片引物[Adaptor2]（0.5um/μL） 1μL
片段化DNA 20μL
Kapa HIFI mix 26μL
反应条件 1：补平 72度 3min
2：扩增 98度 20s
60度 30s
72度 3min
PCR扩增反应7－15个循环，产物总量约0.5~1μg，纯化后测序。
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