CN109880891A

CN109880891A - 基于核酸酶偶联pcr原理富集低丰度dna突变的检测技术体系及应用

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Publication number: CN109880891A
Application number: CN201910324580.2A
Authority: CN
Inventors: 冯雁; 刘倩; 荀冠华; 郭翔; 李忠磊; 崇曰盛
Original assignee: Shanghai Jiaotong University
Current assignee: Jiaohong Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd.
Priority date: 2019-04-22
Filing date: 2019-04-22
Publication date: 2019-06-14
Anticipated expiration: 2039-04-22
Also published as: US20220119877A1; JP2022530483A; EP3998352A1; CN109880891B; JP7384459B2; WO2020215652A1; EP3998352A4

Abstract

本发明提供了一种基于核酸酶偶联PCR原理富集低丰度单核苷酸突变型基因的检测体系。具体地，本发明提供了一种提高目标核酸的相对丰度的方法，包括：(a)提供一核酸样本，含有目标核酸和非目标核酸，所述目标核酸在核酸样本中的丰度为F1a；(b)以核酸样本中的核酸为模板，在扩增‑切割反应体系中进行PCR和核酸切割反应，从而获得扩增‑切割反应产物；所述目标核酸在扩增‑切割反应产物中的丰度为F1b，F1b/F1a的比值≥10。本发明具有非侵入性、易操作、快速等优势，灵敏度可以达到0.01％，样本的DNA量可以低至aM级。

Description

基于核酸酶偶联PCR原理富集低丰度DNA突变的检测技术体系及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于核酸酶偶联PCR原理富集低丰度单核苷酸突变型基因(Single nucleotide variant，SNV)的检测体系。

背景技术

近年来“液体活检”的概念正在兴起，其基本思想为运用血液等体液样本替代肿瘤组织样本行病理学、分子生物学的检测，通过检测患者体液样本(主要是血液)中的肿瘤循环DNA来获取肿瘤基因突变信息已经成为一种趋势。与目前标准的组织活检相比，革命性的液体活检具有下列不可替代的优势：创伤小、可重复性、均化异质性、实时判断疗效，并随肿瘤的发展而动态调整治疗决策。因此，2015年MIT Technology Review发布的年度十大突破技术(Breakthrough Technologies2015)，ASCO年度进展(Clinical cancer advance2015)中对未来十年的期许，液体活检均榜上有名。通过检测ctDNA以追踪整个病程中肿瘤的特异性基因改变，对肿瘤筛查、诊断、疗效监测及预后判断等具有重要价值，同时可从中探索肿瘤转移复发及耐药的分子机制，识别新的靶向治疗位点等，因此ctDNA的检测已经成为肿瘤液体活检应用的三大热门方向之一。

在血液中存在着游离的小片段DNA(cell-free DNA,cfDNA)，它们来自死亡的细胞。通常死亡的细胞会被清除掉，因此cfDNA的含量是非常低的，通常一个健康人的1mL血浆中含25ng cfDNA。而癌症患者的cfDNA的含量高出正常几倍，其中一部分是ctDNA(circulating tumor DNA)。ctDNA的相对含量与肿瘤的负荷和对治疗的反应是相关的，可用于鉴定驱动基因、指导临床治疗、监测临床治疗效果及癌症复发、揭示治疗抗性以及检测疾病进展。在有些方面ctDNA方法的灵敏度甚至高传统的手段。例如，与传统的影像学检测相比，追踪早期乳腺癌患者术后血液中的肿瘤DNA，可以提前7.9个月发现乳腺癌复发。在肺癌、肠癌中检测cfDNA的KRAS突变对肺癌也有着重要的诊断价值。ctDNA在癌症早期就可以被检测到。因为cfDNA容易收集，在肺癌中已显示与组织中的变异高度一致，因此ctDNA的液体活检越来越受到关注。

循环肿瘤DNA虽然是一种很好的肿瘤组织替代样本，但是，由于循环肿瘤DNA含量稀少，检测循环肿瘤DNA需要极灵敏的技术。BEAMing扩增法的应用使得DNA检测技术灵敏度大大提高。2007年，该技术的开发者美国约翰霍普金斯大学的Bert Vogelstein和KennethKinzler对18名结直肠癌患者的循环肿瘤DNA进行了跟踪。研究显示，术后仍能检测到循环肿瘤DNA的患者，基本上都出现了复发，术后未检测到循环肿瘤DNA的患者，结直肠癌无复发，显示了循环肿瘤DNA良好地临床应用前景。BEAMing技术的灵敏度高，可以达到0.1％～0.01％，是一种比较理想的循环肿瘤DNA检测技术。但是由于其操作复杂，仪器昂贵，不适用于大规模临床推广。

目前稀有突变检测方法中，主要有作为“金标准”的基因测序。但是测序灵敏度有限，在大量野生型基因的背景下，测序仅能检测到含有20％的突变，会导致假阴性结果，而且耗时较长。相较于测序，变性高效液相色谱的灵敏度有所提高，但是需要PCR后处理，容易造成实验室污染，容易导致假阳性结果，特异性也有所限制，并且操作步骤繁杂，周期长。基于核酸杂交原理的检测方法，比如TaqMan探针，其选择性检测水平与测序法相当。扩增阻碍突变系统(ARMS)是常用的稀有突变检测方法，基于引物3'末端碱基对不同错配碱基的分辨能力特异性选择扩增突变型模板，但由于分辨能力有限导致选择性一般且不同类型的突变差异性较大。2011年Life technology公司开发出一种高选择性突变检测技术—cast PCR技术，该技术基于ARMS技术，采用MGB探针的高特异性进一步提高了反应的选择性。但是MGB探针合成难度较大，费用较高，不利于广泛应用。数字PCR是近年来出现的另一种高灵敏度检测的技术，这种技术最高也能达到0.01％的灵敏度，但是这种技术极易产生假阳性的结果。同样，高昂的设备和试剂价格、极高的实验操作要求也同样限制了其大规模推广。

因此，本领域迫切需要开发一种高特异性、高灵敏度低丰度突变DNA的富集及检测方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高特异性、高灵敏度低丰度突变DNA的富集及检测方法。

在本发明的第一方面，提供了一种提高目标核酸的相对丰度的方法，包括步骤：

(a)提供一核酸样本，所述的核酸样本含有第一核酸和第二核酸，其中，所述的第一核酸为所述目标核酸，而所述的第二核酸为非目标核酸，

并且，所述目标核酸在所述的核酸样本中的丰度为F1a；

(b)对所述核酸样本中的核酸为模板，在扩增-切割反应体系中进行聚合酶链反应(PCR)和核酸切割反应，从而获得扩增-切割反应产物；

其中，所述的核酸切割反应用于特异性切割非目标核酸，但不切割所述目的核酸；

并且，所述的扩增-切割反应体系含有(i)进行PCR反应所需的试剂和(ii)进行核酸切割反应所需的试剂；

其中，所述目标核酸在所述的扩增-切割反应产物中的丰度为F1b，

其中，F1b/F1a的比值≥10。

在另一优选例中，所述的目标核酸和非目标核酸仅相差一个碱基。

在另一优选例中，当1％≤F1a≤10％时，F1b/F1a的比值≥10，当0.1％≤F1a≤0.5％时，F1b/F1a的比值≥100，当F1a≤0.1％时，F1b/F1a的比值≥200。

在另一优选例中，所述的核酸样本包括直接加热裂解的核酸样本、直接裂解酶蛋白酶处理的核酸样本、经过抽提的核酸样本、经PCR预扩增的核酸样本或任意含核酸的样品。

在另一优选例中，所述的经PCR预扩增的核酸样本是经1-30个，较佳地10-20个，更佳地15-30循环的PCR扩增产物。

在另一优选例中，所述的目标核酸为含突变的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的突变选自下组：核苷酸的插入、缺失、取代、或其组合。

在另一优选例中，所述的突变包括SNV。

在另一优选例中，所述的非目标核酸(或第二核酸)为野生型核苷酸序列、高丰度的核苷酸序列、或其组合。

在另一优选例中，所述的非目标核酸在所述的核酸样本中的丰度为F2a。

在另一优选例中，F1a+F2a＝100％。

在另一优选例中，所述的F2a/F1a的比值≥20，较佳地≥50，更佳地≥100，最佳地≥1000或≥5000。

在另一优选例中，所述的非目标核酸在所述的扩增-切割反应产物中的丰度为F2b。

在另一优选例中，F1b+F2b＝100％。

在另一优选例中，所述的F1b/F2b≥0.5，较佳地≥1，更佳地≥2，最佳地≥3或≥5。

在另一优选例中，所述的F1b/F1a的比值≥200，较佳地≥500，更佳地≥1000，最佳地≥2000或≥5000或更高。

在另一优选例中，F1a≤0.5％，较佳地≤0.2％，更佳地≤0.1％，最佳地≤0.01％。

在另一优选例中，F1b≥10％，较佳地≥30％，更佳地≥50％，最佳地≤70％。

在另一优选例中，所述的“进行PCR反应所需的试剂”包括：DNA聚合酶。

在另一优选例中，所述的“进行PCR反应所需的试剂”还包括：dNTP、，1-5Mm Mg²⁺,PCR缓冲液。

在另一优选例中，所述的“进行核酸切割反应所需的试剂”包括：核酸切割工具酶和引导DNA(gDNA)。

在另一优选例中，核酸切割工具酶为高温稳定的双链DNA切割工具酶。

在另一优选例中，所述核酸切割工具酶选自但不限于以下来自嗜热微生物(≥60℃)的Argonaute蛋白及其突变体：PfAgo(Pyrococcus furiosus Ago)、MfAgo(Methanocaldococcus fervens Ago)、TcAgo(Thermogladius calderae Ago)、TfAgo(Thermus filiformis Ago)、AaAgo(Aquifex aeolicus Ago)等。

在另一优选例中，所述核酸切割工具酶为PfAgo。

在另一优选例中，所述的gDNA与所述核酸切割工具酶形成复合物，并且所述复合物特异性切割非目标核酸。

在另一优选例中，所述的gDNA与目标核酸(即第一核酸)的靶定区域的核酸序列形成第一互补结合区；并且所述的gDNA还与非目标核酸(即第二核酸)的靶定区域的核酸序列形成第二互补结合区。

在另一优选例中，在第一互补结合区中含有至少2个不匹配的碱基对。

在另一优选例中，在第二互补结合区中含有0或1个不匹配的碱基对。

在另一优选例中，在第二互补结合区中含有1个不匹配的碱基对。

在另一优选例中，在第一互补结合区中含有至少2个不匹配的碱基对，从而导致所述复合物不切割所述目标核酸；而在第二互补结合区中含有1个不匹配的碱基对，从而导致所述复合物切割所述非目标核酸。

在另一优选例中，目标核酸(即第一核酸)的靶定区域与非目标核酸(即第二核酸)的靶定区域是相对应的。

在另一优选例中，所述的gDNA的长度为15-30nt。

在另一优选例中，在所述gDNA的第7位和/或第10位为错配碱基，所述错配碱基在第一互补结合区和第二互补结合区均用于形成不匹配的碱基对。

在另一优选例中，所述gDNA的第2-8位为“seed region”区，第10、11为PfAgo剪切关键位点。

在另一优选例中，所述核酸切割工具酶和gDNAs的比例(摩尔比)为1：2～1：20。

在另一优选例中，在扩增-切割反应体系中，所述的核酸切割工具酶为30nM,DNA聚合酶为耐高温聚合酶，较佳的为Taq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、PfuDNA聚合酶、Phusion DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶等，更佳的2X PCR Precision^TMMasterMix。

在另一优选例中，在扩增-切割反应体系中，作为模板的核酸的数量为0.1-100nM。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(c)对所述扩增-切割反应产物进行检测，从而测定所述目标核酸的存在与否和/或数量。

在另一优选例中，步骤(c)中的检测包括定量检测、定性检测、或其组合。

在另一优选例中，所述的定量检测选自下组：q-PCR、ddPCR、化学发光法、高分辨率熔解曲线法、桑格测序、NGS等。

在另一优选例中，所述的第一核酸包括n种不同的核酸序列，其中n为≥1的正整数。

在另一优选例中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100或更大。

在另一优选例中，n为2-1000，较佳地3-100，更佳地3-50。

在另一优选例中，在步骤(b)中，进行C个“高温变性-延伸”循环，其中C为≥5。

在另一优选例中，所述的高温变性的温度对应于PCR反应的DNA双链的解链温度和所述核酸切割工具酶的切割温度。

在另一优选例中，所述的高温变性的温度为85-95℃。

在另一优选例中，所述的C为5-35。

在另一优选例中，所述方法是非诊断性和非治疗性的。

在另一优选例中，所述的核酸样本包括来自试样的核酸，其中所述试样选自下组：血液、细胞、血清、唾液、体液、血浆、尿液、前列腺液、支气管灌洗液、脑脊液、胃液、胆汁、淋巴液、腹腔液及粪便等或其组合。

在本发明的第二方面，提供了一种扩增-切割反应体系，所述反应体系用于对一核酸样本同时进行聚合酶链反应(PCR)和核酸切割反应，从而获得扩增-切割反应产物；

其中，所述的核酸样本含有第一核酸和第二核酸，其中，所述的第一核酸为所述目标核酸，而所述的第二核酸为非目标核酸；

所述的核酸切割反应用于特异性切割非目标核酸，但不切割所述目的核酸；

所述的扩增-切割反应体系含有(i)进行PCR反应所需的试剂和(ii)进行核酸切割反应所需的试剂。

在另一优选例中，所述的扩增-切割反应体系不含有或含有所述的核酸样本。

在另一优选例中，所述扩增-切割反应体系中，Mn离子的浓度为0.1-1mM。

在另一优选例中，所述扩增-切割反应体系中，Mg离子的浓度为1-3mM。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明技术方案的原理图。

图2显示了gDNA对单链DNA(ssDNA)底物和双链DNA(dsDNA)底物的识别和PfAgo-gDNA复合物的剪切机制。

图3显示了PfAgo-gDNA复合物对ssDNA、dsDNA以及在PCR工作体系下对dsDNA的SNV的区分剪切。图3A-不同正、反向gDNA组合下PfAgo-gDNA复合物对野生型和突变型ssDNA底物的区分剪切；图3B-在优选地正、反向gDNA组合下PfAgo-gDNA复合物对野生型和突变型dsDNA底物的区分剪切；图3C-优选地正、反向gDNA组合下PfAgo-gDNA复合物在PCR体系下对野生型和突变型dsDNA底物的区分剪切及对突变型dsDNA的富集作用。

图4显示了PfAgo-gDNA复合物对KRAS-G12D低丰度突变型dsDNA底物富集条件优化，10nM 1.0％突变比例下最适PfAgo蛋白工作浓度。

图5显示了双TaqMan探针法检测KRAS-G12D低丰度突变型DNA底物的标准曲线。

图6显示了PfAgo-gDNA复合物对KRAS-G12D低丰度突变型DNA(0.1％、0.01％)底物高灵敏度检测。

图7显示了PfAgo-gDNA复合物对EGFR-delE746-A750低丰度突变型DNA(0.1％、0.01％)底物高灵敏度检测及优选富集结果。

图8显示了PfAgo-gDNA复合物对KRAS-G12D、PIK3CA-E545K和EGFR-delE746-A750三重低丰度突变型DNA(0.01％)底物高灵敏度检测及优选富集结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次开发了一种灵敏度高、特异性好、通量高的低丰度突变DNA的富集及检测方法。本发明技术体系整体分为PCR预扩增、Ago-PCR富集、目标基因定量检测三步。首先，对不同来源的样品进行前处理，获取含低丰度目标基因的核酸样品后进行PCR预扩增提高目标基因的摩尔浓度以满足Ago-PCR富集所需的样本初始量。其次，对低丰度突变DNA进行特异性富集和扩增，即将所述正、反向gDNAs、PfAgo蛋白、PCR扩增体系与预扩增PCR产物按比例配制低丰度突变DNA富集体系，富集体系在特定条件进行边扩增边富集反应。PfAgo在gDNAs引导下对野生型DNA进行特异性剪切，从而抑制其扩增，以此达到富集低丰度突变型DNA的目的。最后，上述体系中富集的目标产物可联合多终端检测设备和方法，如q-PCR、NGS、化学发光法、高分辨率熔解曲线法、桑格测序、ddPCR等，以此定量检测目标基因突变情况。本发明具有非侵入性、易操作、快速等优势，灵敏度可以达到0.01％，样本的DNA量可以低至aM级，能更好地进行人液态活检中低丰度突变基因的检测，本发明技术可广泛应用于涉及核酸检测的分子诊断各个领域，如肿瘤液态活检，感染性疾病如重大传染性和病原体感染性疾病(病毒、病原菌)检测领域等领域。在此基础上完成了本发明。

“A-STAR”检测技术

本发明的核心在于开发了具有单点核酸识别特异性的高温稳定性的新型核酸切割工具酶PfAgo，并偶联PCR反应实现边切割-边扩增的过程，建立“A-STAR(Ago-mediatedSpecific Target detection)”技术，原理细节如下：在PCR每一个循环的高温变性步骤，dsDNA变性解链为ssDNA，在此温度下PfAgo在特异设计一对gDNA指引下分别对一对解链野生型基因ssDNA切割，即此过程可专一性剪切野生型基因，而保留突变型基因；在随后的PCR退火步骤，设计的引物位于目标核酸SNV位点的上、下游至少20nt，因此非选择性结合野生型基因及突变基因；在随后的的PCR延伸步骤，由于野生型基因在突变位点处已被剪切，无法作为模板进行延伸，而突变型基因保留原长因此可以作为模板进行扩增。由于此PfAgo高温特异性切割与PCR扩增偶联的反应可在常规PCR(20-35个循环)的每个循环中执行，实现边切割-边扩增从而高效富集低丰度突变型基因。技术优势在于：1)高温区分剪切，操作方便；2)gDNA序列配对靶标序列，具有高特异性；3)可针对任何靶标序列设计，无序列偏好性；4)单个酶对多个核酸靶标实现多重检测；5)可结合多终端检测技术。

“边PCR边剪切”的偶联反应

在本发明中，在采用PfAgo-gDNA复合物进行“边PCR边剪切”的偶联反应时，可以采用相应切割酶和相应扩增酶的合适条件下进行所述反应，只要该条件下所述的切割酶和扩增酶能够发挥其相应功能。

本发明的研究表明，对于通过所述偶联反应来富集突变型dsDNA信号，一些关键因素主要包括以下几个方面：

①富集反应体系中初始模板浓度：野生型(wild type,wt)和突变型(mutanttype,mut)总浓度(nM～fM))：优选为0.1-100nM。

②富集反应体系中初始PfAgo蛋白浓度：优选为20-100nM；

③94℃PfAgo-gDNA复合物前处理时间(Pre-processing time(分钟))：优选为3-10分钟；

④富集反应体系中初始gDNAs浓度：优选为200-2000nM；

⑤PfAgo蛋白与gDNAs间摩尔浓度比例：优选为1：5～1：20；

⑥富集PCR的循环数循环：优选为10-30；

在本发明的一个实施例中，以KRAS-G12D野生和突变片段为底物，对所述因素进行了实验，参数可见表A。

表A

表PfAgo gDNAs-PCR偶联反应关键影响因素及参数

本发明的主要优点包括：

1)本发明方法只需少量检测样本，具有很高的检测灵敏度和准确率；

2)本发明所述的低丰度突变基因的快速检测技术可以面向疾病早期痕量核酸标志物检测、疾病驱动基因动态监测以及某些疾病的预后评估等领域；

3)本发明方法还可向感染性疾病，如重大传染性和病原体感染性疾病检测领域拓展应用，做到预测、预防等积极主动管理。

4)本发明方法还可向突变基因相关的遗传代谢病筛查，做到预测及提早治疗等积极主动管理。

5)本发明方法还可向妇产类疾病筛查，产检，新生儿遗传代谢病筛查，做到预测及提早治疗等有效措施。

6)本发明方法还可拓展易感基因检测，提早预测微量的病变风险，在疾病发生之前采取有效的预防措施，最大限度降低患病可能。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1.

引物及检测探针设计

引物设计遵循原则：引物要求:①引物序列避免一连串的碱基,特别是一连串的G；②Tm一般要求在50～60℃；③(G+C)％的比例控制在28％～80％；④引物3′端的最后5个碱基不可以有超过2个(G+C)；⑤下游引物位置越靠近探针越好，且片段能重叠，扩增片段在75～150bp为佳。

检测探针设计遵循的原则：检测探针与目标基因特异性地结合，其结合位点在目标基因的任意区域。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC等，3′端标记有淬灭基团(Quencher,Q)。探针设计要求：①探针5′末端不能是G；②探针长度不应小于13bp；③避免一连串的重复碱基序列；④Tm为65～70℃，引物与对应的探针理论退火温度差异最好在5～10℃；⑤要求待检测的SNV位点最好位于探针中间，并尽量靠近3′端。如果在SNV的这段序列中没有合适的探针能达到要求的Tm值，3′端可以引入淬灭基团BHQ等。

在具体实施方案中，优选地，针对不同循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)设计的用于SNV突变或片段缺失突变扩增的特异性引物对，目标基因包括KRAS-G12D、PIK3CA-E545K、EGFR-delE746-A750、NRAS-A59T等多个肿瘤突变基因及其对应的野生型基因，其分别对应表7组号的引物对。

本发明提供针对不同目标基因设计的用于SNV突变或片段缺失突变富集的正、反向gDNAs及目标基因扩增所需引物，以及特异性检测探针，其包括类似表1中4组目标基因富集及扩增的寡核苷酸序列。

实施例2.

寡核苷酸gDNAs设计及优化

本方法对低丰度突变型目标基因的富集的核心原理在于：一方面通过对gDNAs 5'末端的磷酸化修饰显著提高了PfAgo-gDNA复合物对核酸底物的亲和力。同时本方法在建立之初发现在gDNA上存在一个种子区域，PfAgo-gDNA复合物与底物相互作用的特异性是由gDNAs中的种子序列决定的。本方法通过探索gDNAs种子区域不同位置(第二至第十五位的核苷酸)，不同核苷酸(碱基)对提高PfAgo-gDNA复合物特异性靶向结合靶DNA底物的作用及其规律，分析归纳了用于识别单核苷酸变异的gDNAs种子区域的设计规律，具体如下：

gDNAs设计遵循的原则：正、反向寡核苷酸gDNAs序列要绝对保守。所述gDNAs种子区域在靶向ss DNA时跨越gDNA的第二至第十五位的核苷酸。其特点与其他Agos报道的种子区域相似，第3、第6、第7、第9位、第10位、第11位的核苷酸对PfAgo-gDNA复合物结合靶ssDNA底物的特异性影响最大。因此，在gDNA设计时首先对gDNAs种子区域影响底物特异性的关键核酸及其位置进行优化，以提高PfAgo-gDNA复合物对单链DNA底物的特异性。根据目标基因野生型与突变型核苷酸的碱基差异，通过在gDNA的第2-15位上引入若干(2个以上)碱基替换(permutations)这种编程方式以区分仅有单个核苷酸差异的ssDNA底物。

其次，在双链DNA底物的特异性识别方面可根据PfAgo-gDNA复合物对单链DNA底物的特异性分布规律，选择合适的正、反向gDNAs，检验双gDNA混合条件下PfAgo-gDNA复合物区分仅有单个核苷酸差异底物的能力。针对特定核酸底物筛选具有高度特异性的PfAgo-gDNA复合物-用于后续低丰度DNA突变的富集。

所述特异性的寡核苷酸gDNA，其特征还包括：5'端，3'端都带有磷酸基团修饰；gDNA长度(≥15nt)，mismatch位置，gDNA上引入的错配位点及数目对PfAgo-gDNA复合物特异性识别核酸底物的影响。

优选地，当寡核苷酸gDNA上的5'端，3'端均为磷酸化修饰，同时gDNA引入的额外错配位点位于gDNA的第7、10、11时，该酶具有很好区分仅有单个核苷酸差异底物的能力，展示对野生型DNA的高特异性剪切，即可以很好的区分野生型和突变型目的基因。

在具体实施方案中，优选地，针对不同循环肿瘤DNA(Circulating tumor DNA,ctDNA)设计的用于SNV突变或片段缺失突变富集的特异性寡核苷酸gDNAs，包括KRAS-G12D、PIK3CA-E545K、EGFR-delE746-A750、NRAS-A59T等多个肿瘤突变基因对应的野生型基因，其分别对应表6中不同的gDNAs对。

实施例3.

PfAgo-gDNA复合物对ssDNA、dsDNA的区分剪切

在本实施例，主要测试PfAgo-gDNA复合物在普通PCR反应缓冲液以及其它成分下是否依然对ssDNA、dsDNA以及在PCR工作体系下对dsDNA存在良好的区分剪切能力。

3.1方法

本实施例中涉及的各组分及工作条件主要包括：2×PCR Taq Master Mix，正、反向引物、正、反向gDNAs、PfAgo、MnCl₂、模板(纯野生、纯突变、以及野生和突变各一半)等，如表8所示。

表8以25μL体系为例，PfAgo富集反应体系组分及配制顺序。

表8中各组分的说明如下：

2×PCR Taq Master Mix反应液由2×PCR缓冲液、dNTPs和热启动酶配制而成。2×PCR缓冲液：KCl，(NH₄)₂SO₄，3mM MgCl₂，Tris-HCl,pH值8.3(25℃)。dNTPs包括dATP,dGTP,dCTP和dTTP，在反应体系中终浓度为0.4mM。热启动酶是使用浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶，在反应体系中终浓度0.1-0.5U/μL。2×PCR Taq Master Mix反应液来自abm生物科技公司(货号：G013)。

正、反向引物使用表6中与各目标基因对应的，优选后的引物。

正、反向gDNAs使用表5中与各目标基因对应的，优选后的gDNAs对。

前期纯化后保存的PfAgo母液浓度在5μM，实际使用时需提前在冰浴条件下使用配制好的Reaction Buffer对其稀释：先将5μMPfAgo母液)稀释至1μM，然后用ReactionBuffer稀释至0.3μM。Reaction Buffer组分：15mM Tris-Cl,250mM NaCl,pH 8.0。

模板中ssDNA和dsDNA分别为60nt的KRAS-G12D ssDNA野生型和突变型片段，以及620bp的KRAS-G12D dsDNA野生型和突变型片段。

PfAgo-gDNA复合物对60nt的KRAS-G12D ssDNA野生型和突变型片段剪切的反应条件：95℃15分钟后缓慢降温至10℃保温。

PfAgo-gDNA复合物对620bp的KRAS-G12D dsDNA野生型和突变型片段剪切反应及PCR工作程序：

PfAgo富集体系PCR反应程序包括：

3.2结果

如图3所示。PfAgo-gDNA复合物对ssDNA，dsDNA以及在PCR工作体系下对dsDNA的SNV的区分剪切。

实施例4.

PfAgo-gDNA复合物对突变型dsDNA的富集

在本实施例中，测试PfAgo-gDNA复合物在PCR体系下对野生型和突变型dsDNA底物的区分剪切及对突变型dsDNA的富集情况。

4.1方法

按照本发明中描述的低丰度突变型DNA富集体系的实验步骤，首先针对KRAS-G12D基因片段的序列特征，设计、筛选特异性的扩增引物、gDNAs和检测探针。具体见表2序列。

gDNAs、引物均由上海生工生物工程有限公司合成。KRAS基因gDNAs 5'端设有磷酸化修饰。

以KRAS-G12D野生和突变片段为底物，分析PfAgo-gDNA复合物用于边PCR边剪切时影响突变型dsDNA信号富集的关键因素。具体参数见表A。

本实施例优化了PfAgo-gDNA复合物在PCR体系下对野生型和突变型dsDNA底物的区分剪切及对突变型dsDNA的富集条件。本实施例中涉及的各组分及工作条件主要包括：2×PCR Taq Master Mix，正、反向引物、正、反向gDNAs、PfAgo、MnCl₂、模板(10nM 1.0％mutKRAS-G12D)等，如表8所示。

正、反向引物使用表7中与各目标基因对应的，优选后的引物。

正、反向gDNAs使用表6中与各目标基因对应的，优选后的gDNAs对。

前期纯化后保存的PfAgo母液浓度在5μM，实际使用时需提前在冰浴条件下使用配制好的Reaction Buffer对其稀释：先将5μMPfAgo母液稀释至1μM,然后在用ReactionBuffer稀释至0.3μM。Reaction Buffer反应缓冲液1组分：15mM Tris-Cl,250mM NaCl,pH8.0。

模板：人为配制的10nM 1.0％mut KRAS-G12D样品，采用李记生物公司销售的Pikogreen dsDNA定量试剂盒(超敏)(兼容Qubit 3.0)对配制样品进行定量。

PfAgo对10nM 1.0％mut KRAS-G12D突变基因的富集PCR反应程序包括：

PfAgo-gDNA复合物在PCR体系下对KRAS-G12D野生型和突变型dsDNA底物的区分剪切及对突变型dsDNA的富集条件经优化后，检测结果如图4所示。PfAgo-gDNA复合物在PCR体系下对10nM 1.0％mut KRAS-G12D样品中突变型片段DNA的富集条件，优选的是：PfAgo浓度在20～100nM区间；gDNAs浓度在200～1000nM区间；PfAgo：gDNAs浓度比例在1:10～1:20区间；94℃PfAgo-gDNA复合物前处理时间为3分钟～5分钟；富集PCR的循环数在10～30循环为宜。

4.2结果

PfAgo-gDNA复合物在PCR体系下，可对KRAS-G12D野生型和突变型dsDNA底物的区分剪切，从而实现对突变型dsDNA的富集。

如图4所示，富集反应处理后的样品经一代测序(Sanger测序)后，结果显示在KRAS-G12D(gGt/gAt)突变点位置1.0％mut KRAS-G12D样品处理后突变点A碱基有明显凸起峰，即低丰度突变1.0％mut KRAS-G12D DNA得到了明显的富集。富集倍数F1b/F1a为约78。

实施例5.

对低丰度肿瘤基因KRAS-G12D突变基因的富集和检测

5.1方法

一种低丰度肿瘤基因KRAS-G12D突变基因(0.1％mut、0.01％mut)的检测方法。按照本发明中描述的低丰度突变型DNA检测体系的实验步骤，首先针对KRAS-G12D基因片段的序列特征，设计、筛选特异性的扩增引物、gDNAs和检测探针。具体见表2序列。

gDNAs、引物及探针均由上海生工生物工程有限公司合成。KRAS基因gDNAs 5'端设有磷酸化修饰；G12D突变型探针的核苷酸序列5'端设有FAM荧光标记，3'端修饰淬灭基团BHQ1；KRAS野生型基因探针的核苷酸序列5'端设有VIC荧光标记，3'端修饰淬灭基团BHQ1。

本方法采对来源于HORIZON DISCOVERY公司的horizon reference standards标准品进行了验证分析，标准品中KRAS-G12D Expected Allelic Frequency(AF％)突变等位基因频率(AF％)分别为5％mut，1％mut,0.1％mut,0.01％mut和100％wt。采用了0.1％mut,0.01％mut标准品对此发明描述的低丰度突变型DNA的富集和检测方法的灵敏度和特异性进行了验证。

本实施例的低丰度KRAS基因突变检测的具体检测步骤如下：

5.1.1、PCR预扩增反应

本实施例的KRAS基因预扩增反应体系包括：

以50μL PCR预扩增体系为例，对标准品中0.1％mut,0.01％mut样品分别预扩增。预扩增的体系配制如下：

反应体系的体积可以是25.0μL，在配制时将50.0μL反应体系中的组分减半即可。

本实施例的KRAS基因预扩增反应PCR条件如下：

PCR程序：94℃3分钟；10-30循环循环(94℃10s,55℃30s,72℃20s)，72℃1分钟。

预扩增后可对终产物进行TaqMan-qPCR初步定量，以确定是否满足下步富集体系中所需的target浓度。

5.1.2、PfAgo-gDNA复合物对预扩增产物中低丰度KRAS-G12D突变基因的富集。

本实施例采用优化后的PfAgo-gDNA复合物对KRAS-G12D突变型基因的富集条件，优选的是：PfAgo浓度为20～100nM，gDNAs浓度为200-2000nM，；PfAgo：gDNAs浓度比例为1：5～1:20，94℃PfAgo-gDNA复合物前处理时间为1～5分钟，富集PCR的循环数在10～30循环。

本实施例中涉及的各组分及工作条件主要包括：2X PCR Precision^TMMasterMix,，正、反向引物、正、反向gDNAs、PfAgo、MnCl₂、Standard Target(0.1％mut,0.01％mut)等，如表8所示。

正、反向gDNAs使用表6中与各目标基因对应的，优选后的gDNAs对。前期纯化后保存的PfAgo母液浓度在5μM，实际使用时需提前在冰浴条件下使用配制好的ReactionBuffer对其稀释：先将5μM PfAgo母液稀释至1μM,然后在用Reaction Buffer稀释至0.3μM。Reaction Buffer组分：15mM Tris-Cl,250mM NaCl,pH 8.0。

PfAgo对标准品0.1％mut,0.01％mut KRAS-G12D突变基因预扩增产物的富集PCR反应程序包括：

5.1.3、KRAS-G12D突变基因富集后野生型和突变型DNA产物的检测。

本发明中涉及的富集后产物检测可采取多种方式，如Sanger测序定性分析、二代测序定量分析、TaqMan荧光定量PCR法定量分析、荧光法实时检测、高分辨率熔解曲线法定量分析等。在本实施例中分别采用了Sanger测序定性分析和TaqMan荧光定量PCR法定量分析两种方法对富集产物进行分析。

本实施例样品富集反应处理后经一代测序(Sanger测序)结果如图6B所示。结果显示在KRAS-G12D(gGt/gAt)突变点位置0.1％mut和0.01％mut KRAS-G12D样品处理后突变点A碱基有明显凸起峰，即低丰度突变0.1％mut和0.01％mut KRAS-G12D DNA得到了明显的富集。

采用TaqMan荧光定量PCR法定量分析前，本发明人首先设计并测定了双TaqMan探针法检测KRAS-G12D低丰度突变型DNA(0.01％)底物的标准曲线。标准曲线如图5所示。

本实施例的KRAS-G12D基因标准曲线测定方法包括：

标准曲线测定前各组分按以下顺序配制：

①模板(野生型：突变型等于1：1)：158bp wt/mut KRAS G12D 10.0pM线性梯度稀释至(10.0pM、1.0pM、100fM、10fM、1.0fM、100aM、10aM、1.0aM、ddH₂O)

②双探针：SEQ ID No.109(10μM)；SEQ ID No.110(10μM)

③引物对：SEQ ID No.107(10μM)；SEQ ID No.108(10μM)

TaqMan-qPCR检测体系条件如下：以20μL体系为例,

TaqMan-qPCR程序如下：

标准曲线如图5所示。标准曲线测定结果分析：

①双探针的野生:突变母液按1:1比例配制，10.0pM梯度稀释的标准样品检测得到野生信号(图5A)重复性良好，每个浓度下设置3个重复。图5A最右侧曲线为ddH₂O的野生探针的信号，结合ddH₂O的野生探针的信号可得到该野生型探针信号阈值应在9000作用较为合适，此时CT_ddH2O约为37-39，而样品最低浓度aM级CT在38左右，具体见图5C标准曲线部分。

②双探针野生:突变母液按1:1比例配制，10.0pM梯度稀释的标准样品检测得到突变信号(图5B)重复性良好，每个浓度下设置3个重复。图5B最右侧曲线为ddH₂O的突变探针的信号，结合ddH₂O的野生探针的信号可得到该野生型探针信号阈值应在9000作用较为合适，此时CT_ddH2O约为38-40，而样品最低浓度aM级CT在37左右，具体见图5D标准曲线部分。

标准曲线测定完毕后即对本实施例的KRAS-G12D富集样品进行TaqMan荧光定量PCR法定量分析。

富集样品测定前各组分按以下顺序配制：

TaqMan-qPCR检测体系条件如下：以20μL体系为例,

TaqMan-qPCR程序如下：

5.2结果

如图6A所示。在KRAS-G12D(gGt/gAt)突变点位置0.1％mut KRAS-G12D样品处理后突变型占比提高至83％(富集倍数F1b/F1a为830)，0.01％mut KRAS-G12D样品处理后突变型占比提高至78％(富集倍数F1b/F1a为7800)。即低丰度突变0.1％mut和0.01％mut KRAS-G12D DNA得到了极其明显的富集。

实施例6.

低丰度肿瘤基因EGFR delE746-A750片段缺失型突变基因的富集和检测

在本实施例中，对低丰度肿瘤基因EGFR delE746-A750片段缺失型突变基因(0.1％mut、0.01％mut)进行富集和检测。

6.1方法

按照本发明中描述的低丰度片段缺失型突变DNA检测体系的实验步骤(同实施例5)，首先针对EGFR delE746-A750基因片段的序列特征，设计、筛选特异性的扩增引物、gDNAs和检测探针。具体见表4序列。

gDNAs、引物及探针均由上海生工生物工程有限公司合成。EGFR基因gDNAs 5'端设有磷酸化修饰；delE746-A750突变型探针的核苷酸序列5'端设有VIC荧光标记，3'端修饰淬灭基团BHQ1；EGFR野生型基因探针的核苷酸序列5'端设有FAM荧光标记，3'端修饰淬灭基团BHQ2。

本方法采对来源于HORIZON DISCOVERY公司的horizon reference standards标准品进行了验证分析，标准品中EGFR delE746-A750Expected Allelic Frequency(AF％)突变等位基因频率(AF％)分别为5％mut，1％mut,0.1％mut,0.01％mut和100％wt。采用了0.1％mut,0.01％mut标准品对此发明描述的低丰度突变型DNA的富集和检测方法的灵敏度和特异性进行了验证。

本实施例的低丰度EGFR delE746-A750片段缺失型突变基因检测的具体检测步骤如下：

6.1.1、PCR预扩增反应

本实施例的EGFR delE746-A750基因预扩增反应体系包括：

本实施例的EGFR delE746-A750基因预扩增反应PCR条件如下：

PCR程序：94℃3分钟；10-30循环(94℃10s,55℃30s,72℃20s)，72℃1分钟。

6.1.2、PfAgo-gDNA复合物对预扩增产物中低丰度EGFR delE746-A750突变基因的富集。

本实施例采用优化后的PfAgo-gDNA复合物对EGFR delE746-A750突变型基因的富集条件，优选的是：PfAgo浓度为20～80nM，gDNAs浓度为800nM，；PfAgo：gDNAs浓度比例为1：5～1:20，94℃PfAgo-gDNA复合物前处理时间为3分钟，富集PCR的循环数在10～30循环。

本实施例中涉及的各组分及工作条件主要包括：2×PCR Taq Master Mix，正、反向引物、正、反向gDNAs、PfAgo、MnCl₂、Standard Target(0.1％mut,0.01％mut)等，如表8所示。

前期纯化后保存的PfAgo母液浓度在5μM，实际使用时需提前在冰浴条件下使用配制好的Reaction Buffer对其稀释：先将5μMPfAgo母液稀释至1μM，然后用Reaction Buffer稀释至0.3μM。

Reaction Buffer组分：15mM Tris-Cl,250mM NaCl,pH 8.0。

PfAgo对标准品0.1％MUT,0.01％MUT EGFR delE746-A750突变基因预扩增产物的富集PCR反应程序包括：

6.1.3、EGFR delE746-A750突变基因富集后野生型和突变型DNA产物的检测。

在本实施例中采用了Sanger测序定性分析。

6.2结果

结果如图7所示。在EGFR delE746-A750(fragment deletion)突变位置0.1％mut和0.01％mut样品处理后显示丰富的缺失片段的碱基序列，即低丰度突变0.1％mut和0.01％mut EGFR delE746-A750DNA得到了明显的富集，富集倍数F1b/F1a分别约为800、7400。

实施例7

三重低丰度突变的富集和检测

在本实施例中，对于多重(三重)低丰度(0.01％mut)肿瘤基因KRAS-G12D、PIK3CA-E545K及EGFR-delE746-A750突变基因(0.1％mut、0.01％mut)进行富集和检测。

7.1方法

按照本发明中描述的低丰度突变型DNA检测体系的实验步骤，首先针对肿瘤突变基因片段的序列特征，设计、筛选特异性的扩增引物、gDNAs和检测探针。具体见表1、表2及表3的序列。

gDNAs、引物及探针均由上海生工生物工程有限公司合成。gDNAs 5'端设有磷酸化修饰；探针的核苷酸序列5'端设有不同荧光标记，3'端修饰淬灭基团BHQ。

本方法采对来源于HORIZON DISCOVERY公司的horizon reference standards标准品进行了验证分析，标准品中还有上述3种肿瘤基因Expected Allelic Frequency(AF％)突变等位基因频率(AF％)分别为0.01％mut和100％wt。我们采用了0.01％mut标准品对此发明描述的三重低丰度突变型DNA的富集和检测方法的灵敏度和特异性进行了验证。

本实施例的三重低丰度肿瘤基因突变检测的具体检测步骤如下：

7.1.1、PCR预扩增反应

本实施例的肿瘤基因预扩增反应体系包括：

以50μL PCR预扩增体系为例，对标准品中0.01％MUT样品分别预扩增。预扩增的体系配制如下：

2X PCR Precision^TMMaster Mix：25.0μL

正向引物(10μM):1.25μL(SEQ ID No.3、SEQ ID No.13、SEQ ID No.23)

反向引物(10μM):1.25μL(SEQ ID No.4、SEQ ID No.14、SEQ ID No.24)

标准品(0.1％mut,0.01％mut):1-2μL

dd H₂O:XXμL

本实施例的三重低丰度肿瘤基因预扩增反应PCR条件如下：

PCR程序：94℃3分钟；24-30循环(94℃30s,55℃30s,72℃20s)；72℃1分钟。

7.1.2、PfAgo-gDNA复合物对预扩增产物中三重低丰度肿瘤突变基因的富集。

本实施例采用优化后的PfAgo-gDNA复合物对KRAS-G12D、PIK3CA-E545K及EGFR-delE746-A750突变型基因的富集条件，优选的是：PfAgo浓度为10～800nM，gDNAs浓度为100～4000nM；PfAgo：gDNAs浓度比例为1：5～1:20，94℃PfAgo-gDNA复合物前处理时间为3分钟，富集PCR的循环数在10～30循环。

本实施例中涉及的各组分及工作条件主要包括：2X PCR Precision^TMMasterMix，正、反向引物、正、反向gDNAs、PfAgo、MnCl₂、Standard Target(0.01％mut)等，如表8所示。

前期纯化后保存的PfAgo母液浓度在5μM，实际使用时需提前在冰浴条件下使用配制好的Reaction Buffer对其稀释：先将5μM PfAgo母液)稀释至1μM，然后用ReactionBuffer稀释至0.3μM。

Reaction Buffer组分：15mM Tris-Cl,250mM NaCl,pH 8.0。

PfAgo对标准品0.01％mut KRAS-G12D突变基因预扩增产物的富集PCR反应程序包括：

7.1.3、KRAS-G12D、PIK3CA-E545K及EGFR-delE746-A750突变基因富集后野生型和突变型DNA产物的检测。

本发明中涉及的富集后产物检测可采取多种方式，如Sanger测序定性分析、二代测序定量分析、TaqMan荧光定量PCR法定量分析、荧光法实时检测、高分辨率熔解曲线法定量分析等。在本实施例中采用了TaqMan荧光定量PCR法定量分析法对富集产物进行分析。

采用TaqMan荧光定量PCR法定量分析前，我们首先设计并测定了双TaqMan探针法分别检测KRAS-G12D、PIK3CA-E545K及EGFR-delE746-A750低丰度突变型DNA底物的标准曲线。

标准曲线测定完毕后即对本实施例的KRAS-G12D、PIK3CA-E545K及EGFR-delE746-A750富集样品进行TaqMan荧光定量PCR法定量分析。

富集样品测定前各组分按以下顺序配制：

TaqMan-qPCR检测体系条件如下：以20μL体系为例,

TaqMan-qPCR程序如下：

7.2结果

如图8所示，在KRAS-G12D、PIK3CA-E545K及EGFR-delE746-A750突变位置0.01％mut样品处理后突变型占比KRAS-G12D、EGFR-delE746-A750及PIK3CA-E545K分别提高至79％、79％、41％。即三重低丰度突变0.01％mut肿瘤基因也得到了明显的富集，富集倍数F1b/F1a分别为约7900、7900和4100。

表1

表2

F:正向引物；R:反向引物；P:TaqMan-MGB探针；GF:Guide Forward DNA；GR:GuideReverse DNA

表3

表4

表5

表6

表7

表8.PfAgo富集反应25μL体系组分及配制顺序

加样顺序	组分	体积
			1	2×PCR Taq Master Mix	12.5μL
2	dd H<sub>2</sub>O	3.75μL
			3	FW/RV primer(10μM)	各0.5μL
4	MnCl<sub>2</sub>(10mM)	1.25μL
			5	Template	2μL
6	Ago(XX nM)	XμL
			7	gDNA mix	XμL

注：以上样品在体系配制时请遵循先后顺序添加。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

以上所述的具体实施例，对本发明的解决的技术问题、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 上海交通大学

<120> 基于核酸酶偶联PCR原理富集低丰度DNA突变的检测技术体系及应用

<130> P2019-0250

<160> 40

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 158

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gtgacatgtt ctaatatagt cacattttca ttatttttat tataaggcct gctgaaaatg 60

actgaatata aacttgtggt agttggagct ggtggcgtag gcaagagtgc cttgacgata 120

cagctaattc agaatcattt tgtggacgaa tatgatcc 158

<210> 2

<211> 158

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gtgacatgtt ctaatatagt cacattttca ttatttttat tataaggcct gctgaaaatg 60

actgaatata aacttgtggt agttggagct gatggcgtag gcaagagtgc cttgacgata 120

cagctaattc agaatcattt tgtggacgaa tatgatcc 158

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gtgacatgtt ctaatatagt c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggatcatatt cgtccacaaa 20

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tttggagcta gtggcg 16

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tctacgccac aagctc 16

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aggcctgctg aaaatgactg 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctgtatcgt caaggcactc t 21

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttggagctgg tggcgta 17

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttggagctga tggcgta 17

<210> 11

<211> 139

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagacaatga attaagggaa aatgacaaag aacagctcaa agcaatttct acacgagatc 60

ctctctctga aatcactgag caggagaaag attttctatg gagtcacagg taagtgctaa 120

aatggagatt ctctgtttc 139

<210> 12

<211> 139

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gagacaatga attaagggaa aatgacaaag aacagctcaa agcaatttct acacgagatc 60

ctctctctga aatcactaag caggagaaag attttctatg gagtcacagg taagtgctaa 120

aatggagatt ctctgtttc 139

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gagacaatga attaagggaa 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gaaacagaga atctccatt 19

<210> 15

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tgaaatcacc gagcag 16

<210> 16

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ttctcctgcg cagtga 16

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaacagctca aagcaatttc tacac 25

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agcacttacc tgtgactcca tag 23

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctgaaatcac tgagcagga 19

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tctgaaatca ctaagcagga 20

<210> 21

<211> 157

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ctgtcatagg gactctggat cccagaaggt gagaaagtta aaattcccgt cgctatcaag 60

gaattaagag aagcaacatc tccgaaagcc aacaaggaaa tcctcgatgt gagtttctgc 120

tttgctgtgt gggggtccat ggctctgaac ctcaggc 157

<210> 22

<211> 142

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ctgtcatagg gactctggat cccagaaggt gagaaagtta aaattcccgt cgctatcaaa 60

acatctccga aagccaacaa ggaaatcctc gatgtgagtt tctgctttgc tgtgtggggg 120

tccatggctc tgaacctcag gc 142

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ctgtcatagg gactctggat 20

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gcctgaggtt cagagccat 19

<210> 25

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

taaggaatta agagaa 16

<210> 26

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ttgcttctct taatt 15

<210> 27

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ccagaaggtg agaaagtta 19

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tcgaggattt ccttgttg 18

<210> 29

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

cttctcttaa ttccttgata gcgacgg 27

<210> 30

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cgctatcaaa acatctccga aagcc 25

<210> 31

<211> 154

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ccaggattct tacagaaaac aagtggttat agatggtgaa acctgtttgt tggacatact 60

ggatacagct ggacaagaag agtacagtgc catgagagac caatacatga ggacaggcga 120

aggcttcctc tgtgtatttg ccatcaataa tagc 154

<210> 32

<211> 154

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ccaggattct tacagaaaac aagtggttat agatggtgaa acctgtttgt tggacatact 60

ggatacagct ggaaaagaag agtacagtgc catgagagac caatacatga ggacaggcga 120

aggcttcctc tgtgtatttg ccatcaataa tagc 154

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

ccaggattct tacagaaaac aagt 24

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gctattattg atggcaaata cacag 25

<210> 35

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ttggatacag ttggac 16

<210> 36

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

tcttgtccat ctgtat 16

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gatggtgaaa cctgtttgtt gga 23

<210> 38

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

tcgcctgtcc tcatgtattg g 21

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ctggatacag ctggacaa 18

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

tactggatac aactggacaa 20

Claims

1.一种提高目标核酸的相对丰度的方法，其特征在于，包括步骤：

并且，所述目标核酸在所述的核酸样本中的丰度为F1a；

其中，F1b/F1a的比值≥10。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目标核酸和非目标核酸仅相差一个碱基。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目标核酸为含突变的核苷酸序列。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸切割工具酶选自但不限于以下来自嗜热微生物(≥60℃)的Argonaute蛋白(Ago)及其突变体：PfAgo(Pyrococcus furiosusAgo)、MfAgo(Methanocaldococcus fervens Ago)、TcAgo(Thermogladius calderae Ago)、TfAgo(Thermus filiformis Ago)、AaAgo(Aquifex aeolicus Ago)等。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的guide DNA与目标核酸(即第一核酸)的靶定区域的核酸序列形成第一互补结合区；并且所述的gDNA还与非目标核酸(即第二核酸)的靶定区域的核酸序列形成第二互补结合区。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸切割工具酶和gDNAs的比例(摩尔比)为1：2～1：20。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一核酸包括n种不同的核酸序列，其中n为≥1的正整数。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(b)中，进行C个“高温变性-延伸”循环，其中C为≥5。

10.一种扩增-切割反应体系，其特征在于，所述反应体系用于对一核酸样本同时进行聚合酶链反应(PCR)和核酸切割反应，从而获得扩增-切割反应产物；