CN103497241B

CN103497241B - 一种对虾抗病毒Argonaute蛋白及其编码cDNA和用途

Info

Publication number: CN103497241B
Application number: CN201310409881.8A
Authority: CN
Inventors: 江世贵; 杨丽诗; 李晓兰; 邱丽华; 黄建华
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2013-09-10
Filing date: 2013-09-10
Publication date: 2015-07-01
Anticipated expiration: 2033-09-10
Also published as: CN103497241A

Abstract

本发明公开了一种对虾抗病毒Argonaute蛋白及其基因序列和用途，对虾抗病毒Argonaute蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该基因在淋巴、血细胞等免疫组织高丰度表达，并在微生物感染特别是病毒感染具有重要功能，具有阻断病毒感染作用，该对虾抗病毒Argonaute蛋白及其基因可应用于对虾的病害控制及抗病生物技术育种。

Description

一种对虾抗病毒Argonaute蛋白及其编码cDNA和用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种对虾抗病毒Argonaute蛋白及其编码cDNA，以及该对虾抗病毒Argonaute蛋白及其编码cDNA在降低病毒感染对虾死亡率及在抗病育种中的用途。

背景技术

我国是养殖虾的主要生产国之一，2011年的海水养殖对虾产量达到230万吨，约占全球总产量的一半以上，在我国的水产业中具有举足轻重的作用。但养殖对虾时常暴发的疾病却造成巨大的经济损失。在过去的十几年里,对虾白斑综合征病毒(WSSV)等多种病毒引起的大规模流行病给世界各地的养虾业带来了毁灭性的打击。至今，白斑综合征病毒仍是对虾养殖业的头号威胁。此外，一些RNA病毒如桃拉病毒(TSV)、黄头病毒(YHV)等病毒病依然是对虾养殖业的重要威胁。

最近，通过研究致病机理开发的抗病蛋白及方法增强对虾免疫力和抗病力成为对虾病毒病防治的重要方向。病毒感染细胞后首先将自身的遗传物质进行大量复制，在此过程中，无论是DNA病毒还是RNA病毒均会产生转录的中间产物dsRNA。该dsRNA既可作为信使RNA（mRNA），又能作为病毒基因组的模板。mRNA翻译结构蛋白，装配内层衣壳后，病毒核酸进入，通过重复上述过程，最后获得了外层衣壳，并形成病毒粒子。宿主自身存在的古老的免疫机制，即基因沉默（RNAi）机制可有效干扰病毒复制过程。

基因沉默（RNAi）是生物体一种古老的防御机制。外源性的长dsRNA或内源性的微小RNA前microRNA（pre-miRNA)在生物体分别被Dicer酶剪切为siRNA或miRNA，诱导同源靶基因mRNA特异性降解，从而导致靶基因沉默。为了对抗及逃逸这种RNAi先天免疫，多种病毒编码了RNAi抑制蛋白，通过在RNA或蛋白质水平的作用来抑制RNAi通路。野田村病毒编码一种RNAi抑制蛋白B2，该蛋白可以通过直接作用于果蝇Dicer-2，抑制抗病毒siRNA产生及RNA沉默复合体（RISC）组装来逃逸宿主的免疫系统。此外，RNAi机制中的关键蛋白TRBP可抑制干扰素诱导的蛋白激酶活性，从而增强病毒的复制。因为这一关键作用，TRBP成为治疗HIV-1的新型靶标。因此，RNAi机制及其关键因子的功能和作用对宿主的病毒防御功能至关重要。

Argonaute蛋白是RNAi机制中RNA诱导沉默复合物(RISC复合物)的核心元件，能够结合非编码小分子RNA，控制蛋白质的合成，影响mRNA的稳定性甚至参与同Piwi蛋白相互作用的RNA的生产。小RNA通过与Argonaute蛋白结合，达到调控基因表达的目的。Argonaute蛋白在RNAi通路中发挥的重要作用包括在动植物中对靶mRNA进行切割或翻译水平的抑制以及在转录或转录后水平控制转座元件的移动等。通过增强RNAi通路关键因子的作用，提高宿主的免疫防御功能，从而对外源病毒具有显著防御作用。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种对虾抗病毒Argonaute蛋白。

本发明的第二个目的是提供编码上述对虾抗病毒Argonaute蛋白的新cDNA。

本发明的第三个目的是提供含有上述cDNA的表达载体。

本发明的第四个目的是提供一种能与上述对虾抗病毒Argonaute蛋白特异性结合的抗体。

本发明的第五个目的是提供上述对虾抗病毒Argonaute蛋白的用途。

本发明的第六个目的是提供上述编码对虾抗病毒Argonaute蛋白cDNA的用途。

本发明提供的对虾抗病毒Argonaute蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明中，编码上述对虾抗病毒Argonaute蛋白的cDNA的核苷酸序列为如SEQ ID NO.1所示。

本发明通过在斑节对虾转录组中筛选获得Argonaute蛋白的部分序列，然后通过RACE技术克隆到斑节对虾Argonaute蛋白基因的全表达序列。对虾Argonaute蛋白基因全长2845bp，其开放阅读框长2616bp，包括106bp 5’-非编码区(5’-UTR)，起始于ATG，123bp 3’-非编码区(3’-UTR)，终止于TGA。该基因编码871个氨基酸组成的蛋白，分子量为99.5KDa。该基因在免疫器官中高表达，并在微生物感染早期具有重要功能，该基因可应用于对虾的病害控制。

本发明提供的表达载体含有上述的cDNA。

本发明的提供的与上述对虾抗病毒Argonaute蛋白特异性结合的抗体为重组Argonaute蛋白经动物免疫后制取所得。

本发明提供的对虾抗病毒Argonaute蛋白用途，具体涉及所述对虾抗病毒Argonaute蛋白在制备对虾抗病毒药物中的应用。

本发明提供的对虾抗病毒Argonaute蛋白cDNA的用途，具体地涉及，所述对虾抗病毒Argonaute蛋白的cDNA在制备对虾抗病毒药物中的应用；以及所述对虾抗病毒Argonaute蛋白的cDNA在虾类抗病育种中的应用，即利用Argonaute基因的多态性，开发与对虾抗病性状相关的单核苷酸多态性（SNP）标记位点，并利用该SNP位点作为辅助育种标记。

本发明从对虾样品中得到一个新的对虾抗病毒Argonaute蛋白基因的cDNA序列，本发明实验证明，该基因在对虾淋巴、血细胞等免疫组织中高丰度表达，并参与微生物感染后的免疫防御，对对虾病毒具有显著的阻断作用，可用于对虾病毒感染后的治疗以及对虾抗病毒药物的生产等。而Argonaute基因具有多态性，可开发与对虾抗病性状相关的单核苷酸多态性（SNP）标记位点，利用该SNP位点作为辅助育种标记，用于虾类抗病育种。

附图说明

图1是斑节对虾Argonaute蛋白基因在创伤弧菌、金黄色葡萄球菌、白斑综合征病毒（WSSV）刺激下的表达特征分析；

图2是斑节对虾Argonaute蛋白基因在病毒核酸类似物poly（I:C）及R848刺激下的表达特征分析；

图3是Argonaute blastP结果，含有DUF1785、PAZ及Piwi结构域；

图4是斑节对虾Argonaute蛋白基因在不同组织中的表达；

图5是斑节对虾Argonaute蛋白的免疫印迹结果；

其中，M：蛋白maker，1：Argonaute原核表达蛋白；

图6是斑节对虾Argonaute蛋白的表达及纯化情况；

其中，M：蛋白maker，1：原核表达菌，2.破碎沉淀，3.破碎沉淀，4.GST洗脱组分4，5.GST洗脱组分5；

图7是斑节对虾Argonaute抗体的抗病毒效果；

图8是斑节对虾Argonaute蛋白抗病毒效果。

具体实施方式

下面通过以下具体实施方式对本发明作进一步阐述。

1.总RNA的提取和肝胰腺全长cDNA文库构建

1.1总RNA的提取

取鲜活健康斑节对虾（体重约150g）在实验室内暂养3d后（水温约24℃，气泵充气），解剖虾体取出肝胰腺约100mg，放入1mL RLT Buffer(Qiagen,USA)中进行低温研磨，按照Qiagen Mini试剂盒使用说明提取总RNA，并使用DNase消化除去基因组。

1.2肝胰腺全长cDNA模板的制备

按照GeneRacer kit（Invitrogen，USA）制备全长cDNA模板。取3μg总RNA经过小牛碱性磷酸酶（CIP）反应去除RNA5’磷酸基团，经过烟草焦磷酸酶（TAP）去除RNA5’帽子结构，利用RNA连接酶连上GeneRacer^TM RNA Oligo，再利用GeneRacer^TM OligodT引物在逆转录酶Superscript III的作用下50℃反应60min，从而获得全长cDNA的模板。

2.Argonaute蛋白基因cDNA全序列的克隆

2.1兼并引物设计依据，引物合成的方法

从GenBank中下载近源物种（如人、小鼠、斑马鱼、果蝇等）Argonaute蛋白同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成，得到以下引物序列：

F：5’-GACHGCVAANAGAAWGCTTA-3’

R：5’-TCTCWTGSCAGAANAGVCTC-3’

2.2Argonaute基因片段的获取

以近源物种Argonaute基因CDS序列的保守区设计的兼并引物，扩增片段大小约为1936 bp。Argonaute基因的部分序列如下：

GACAGCGAAA AGAATGCTTA TAGCATAAAT CCCAATCCGC AATTTGAAAT TGACATTTCC 60

ACCAAATTTG AGGTGGACAT TTCTGAAGAA TCGGGGAAAG TGACCAAGTA CAGTGTTAAA 120

ATGGAAGCTG TGCAGCGTGC CAACTTGCAA GAGTTCATGC AGGCGCTCAA GCACAAGCCA 180

GGCGAGAAGC AGAAAATAAT ACCCCAGAAA ATTAATCAGA TATTGGAAGT CATGTTGGGA 240

CATAACCCGA GTCTTCAGTT TGTAAAGGTT GGCCGAAACA ATAGACATAA CCCGAGTCTT 300

CAGTATGTAA AGGTTGGCCG AAACAATTTC TTCCCGATGG ATGGAGAGTT TGGCAAACCA 360

TATTACATTG GGGGAGGCAA GGAGGCTGTG ACCGGCTTCT TCAGCTCCCT ACGGCCTGCC 420

GCCTGGAAAG ATGGCTCTCT GCTGCTTAAC GTTGATGTTG CAAATACATC ATTCTACAAA 480

GAGCAACCTC TCCTTGATTT CCTGATGGAT TCGCTTCGCC TACATGAAAA GGACCTCAAC 540

CAGACCCTAA AACCCTTTCA CAAAAAGGCA CTCAAAAAAG AGCTGAAAAA CTTAAAGATC 600

CAGGTGACCC ATTCCCTTAT ACCAAGAACA TACAGAGTGA GAGACATTGG AGAACTTGGT 660

GCAGATCGCC AGACATTCAT GTTGACAAAC CCAGAAACCA ACAGGGAAGA AAAATGCACT 720

GTTATGAACT ATTTCTCCAT GCGCTACCAG ATGCGTCTGA GGTTCCCAAG GCTGAACTGT 780

CTGATGGTTG GACCACAAAA TAGAAGCATT TATGTTCCCA TGGAGGTCTG CAAGATAGTG 840

AAAGGGCAGA GAGTGCAGAA GAAGCTTAGT GAATATGAGA CGTCCCAGCT AATTCGTGCA 900

GCAGCTAAAC CACCATACGA GAGACTCAAC ACCATCCGAA ACATTGTTCG CACTGCCAAC 960

TTCTCTCAAG ATCCTCTGAT AAAAGCATTG GAATTCTCCA TAGCAGATCA ACCTATCAAC 1020

TTTGAGGGAC GAGTACTTTC TGCACCAGAT GTTCTGCTGA ACAGAGAGCA GAAGCCCAAA 1080

TTAGGTGTTT GGGACATCAG GGATCATTCC TTCTTCAATG GAGGAGTGCT CAAGTCATGG 1140

GCAGTTCTCA ATTATGACCC AAGAATGATA AATGAGCACA CATTAAACAA GTTTTTACTC 1200

CACCTCCAGG AAATGGGGAA AGAAAGAGGA ATGGTCATTG AAAAGCCTGC AGGAATAAAA 1260

AGCATTGGGC ATCCCTCACC AGAGGTTGAC ATTTTACAGG TGAAGAAAAG GTTACCTGAT 1320

GTGCAGTTGA TCTTCATTGT TCTCCCAAGG GATGGGGACA TTTATGCGCG CGTGAAGAAA 1380

ACGGGTGACA GAGATGTAGG CGTGGTAACC CAGTGCATAA AGAATCAGAA TGTGGCGAAG 1440

TGTGCTCCTT CCACAATCGG GAATCTTCTA CTCAAGATAA ATGCAAAGAT TGGTGGAACA 1500

AACAATGTCT TAGGACAGAG ATCAAGGCCT CTTGTTTTTG GTAAGCCCGT AATGATTATG 1560

GGTGCAGATG TGAATCACCC TCCTTCTGGT GACATTATGA CTCCTTCTGT CGCTGCGGTT 1620

GTTGGCTCAA TTGATCGTTT TGCATCGCAG TATGCTGTGG AAGTGCGCCA TCAGAAACAC 1680

CGCAAAGAGA TGATTCAAGA CTTGAAAGAC ATGACAAAGA ACCTCCTCAA AACATTTTAC 1740

ACAACCACGA AATTCAAGCC TGAGCGGATT GTGATGTATC GTGATGGTGT CAGCGATTCG 1800

CAGTTTCTGG AGGTGTTAGT GTTTGAGATG AAGGCCATGA GGCAGGCATG CACGGAGTTG 1860

GAGGCAGATT ACCAGCCAGC CATTACCTTC CTGGTCGTCC AAAAGCGACA CCACACGAGG 1920

CTCTTCTGCC AAGAGA 1936

以上述合成的cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，反应体系为：10xPCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl₂ 3μL，10mmol/L dNTP 2μL，10nmol/L引物F和R各2μL，Taq酶1.25U，用超纯水将反应体系补充至50μL。反应条件为：1个循环,94℃变性5min；35个循环：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s；1个循环，72℃延伸10min，4℃保温。所扩增的PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pGEM-T载体（Promega，USA）中，转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经兼并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行测序。

2.2Argonaute全长cDNA的获得

根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物。利用cDNA末端快速扩增（Rapid Amplification of cDNA ends,RACE）技术对目的基因的3ˊ和5ˊ末端进行PCR扩增。依据序列合成以下引物：

5’RACE引物：5’-CCCGATTCTTCAGAAATGTCCACC-3’

3’RACE引物：5’-GCAGATTACCAGCCAGCCATTACC-3’

采用上述合成的全长cDNA为模板，按照GeneRacer^TM Kit（Invitrogen,USA）进行5’RACE PCR扩增。第一次反应体积为20ul，反应条件为个94℃变性2min；5个循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；25个循环：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。利用5’RACE巢式引物5’-AGAGGAGGCCGAGGAACTTCAGG-3’和3’RACE巢式引物5’-ACCAGGTCCGTCTCCATCCCCACA-3’进行巢式PCR，反应体积为50ul，反应条件为94℃变性2min；30个循环：94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。5’RACE和3’RACE PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，分别亚克隆至pGEM-T载体，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行测序，所获片段拼接获得全长cDNA为2845bp。

2.2Argonaute的生物信息学分析

用Blast（http://www.ncbi.nim.nih.gov/）进行同源性分析，结果如表1所示，该基因与日本对虾、凡那滨对虾、红鳍东方鲀等的Argonaute蛋白有高度同源性，揭示该基因是Argonaute基因。利用DNAstar等工具进行生物信息学分析，揭示开放读码框为2616个核苷酸，5’UTR为106bp，3’UTR为123bp，3’UTR存在mRNA快速降解信号ATTTA。推测编码一个871个氨基酸的蛋白，分子量大小为99.5kDa、等电点为9.57。。利用SMART在线生物信息学分析该蛋白含有三个保守结构域，包括一个DUF1785结构域(188-246aa)，一个PAZ结构域（PiWi-Argonaute-Zwille domain,255-388aa)，一个Piwi结构域（Piwi-likesuperfamily Domain，528-828aa)（图3）。

表1 Argonaute基因的blast分析结果

3.荧光定量PCR检测Argonaute mRNA在不同组织的分布

提取了斑节对虾的不同组织（包括鳃、肝胰腺、卵巢、血细胞、肠、胃、眼柄、肌肉、淋巴、心脏、精巢、表皮、神经、脑）的RNA。总RNA的提取方法见前所述。取不同组织总RNA 1μg与反转录引物（Oligo-（dT）₁₈接头引物）1μL(10pmol/L)混合，70℃加热5min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5mmol/LdNTP混合液，Ribonuclease Inhibitor，M-MLV反转录酶（Promega，USA），反应体系为25μL。反应过程为42℃60min，70℃15min，稀释1倍后作为模板使用。根据Argonaute基因的全cDNA长设计荧光定量PCR引物：

Argonaute-F1：5’-TTCTGTCGCTGCGGTTGTTGG-3’

Argonaute-R1：5’-TCTTTGCGGTGTTTCTGATGGC-3’

扩增Argonaute基因同时选用EF-1α作为内参基因，引物序列：

EF-F2：5’-AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT-3’

EF-R2：5’-CGTGGTGCATCTCCACAGACT-3’

荧光定量PCR反应体系为20μL，包含10μL的2×SYBR Green Real-time PCRMaster Mix（TaKaRa，Japan），1μL cDNA模板，2μL引物和7μL的双蒸水，以蒸馏水代替模板作为阴性对照,每个样品设置3个重复，反应参数为95℃预变性10s，然后95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。实验数据采用相对CT法进行数据分析。结果见图4，Argonaute基因在淋巴中的表达量最高，其次为血细胞，在眼柄中的表达量则最低，几乎不可见，在其他组织中的表达量则呈中等水平（图4）。斑节对虾Argonaute基因在免疫组织的高表达预示其在免疫应激过程发挥重要作用。

4.荧光定量PCR检测Argonaute mRNA在不同刺激物的表达

健康斑节对虾（7～12g）注射50μl灭活的金黄色葡萄球菌、创伤弧菌、白斑综合征病毒悬液，细菌终浓度为2×10⁶细胞/尾，病毒最终稀释度为5×10^-4，于第二腹节肌肉向心注射，病毒类似物实验组分别用dsRNA类似物poly(I:C)以及ssRNA类似物R848（Invivogen）接种，注射终浓度为600μg/ml。注射后3h，6h，9h，12h，24h，48h取斑节对虾肝胰腺每种刺激物每个时间点均取3尾，同时取3尾0h即未被注射任何物质的斑节对虾的肝胰腺组织作为空白对照。剪碎后置于RNAlater中保存，并带回实验室分析。

总RNA抽提方法、cDNA逆转录以及荧光定量PCR方法见前所述。结果见图1，肝胰腺Argonaute基因可被金黄色葡萄球菌和WSSV诱导表达。金黄色葡萄球菌和WSSV注射后，均诱导PmAgo2的表达量上调，在注射后9h达到其表达峰值，并在12-48h均保持在较高的表达水平。创伤弧菌组的Argonaute表达量变化不大。说明Argonaute基因可能参与了斑节对虾对金黄色葡萄球菌和白斑综合征病毒（WSSV）感染的免疫防御过程。

为进一步研究病毒微生物对PmAgo2基因的表达模式的影响，实验分别将斑节对虾注射dsRNA poly（I:C）和ssRNA R848，模仿由病毒核酸引起的感染。实验结果显示(图2)，两种核酸都能显著诱导Argonaute基因表达。poly(I:C)在刺激后6-48h后均保持显著上调水平（为0h的4.5-4.9倍，P<0.05）。R484在刺激3h后即明显上调，并在6h达到其表达峰值（为0h的10.9倍，P<0.05），在12-24h有所降低，在48h又恢复高表达（为0h的8.4倍，P<0.05）。该实验说明了Argonaute基因可能参与了病毒核酸引起的机体免疫反应。说明Argonaute基因及RNAi通路在抗病毒感染、降解病毒核酸方面具有显著作用。

5．Argonaute融合蛋白的制备

以基因开放阅读框的核苷酸序列与pGEX-4T-1载体制备成表达质粒，挑单克隆至对数期，加入终浓度为0.8mM的IPTG在37℃诱导表达3-6h。所获重组表达蛋白利用谷胱甘肽S转移酶（GST）标签抗体进行免疫印迹，确认所获重组蛋白约60KD（图5）。使用GST Bind^TM Resin(Merck，USA)，按照说明书的方法对pGEX-4T-Argonaute蛋白进行洗脱和纯化（图6）。

6．Argonaute基因编码蛋白的多克隆抗体制备

将纯化蛋白（约100-200μg）与3ml完全弗氏佐剂充分混匀孵化，在小鼠皮下多点注射，共注射8只小鼠，每只小鼠注射约50μg蛋白。第一次注射3周后加强免疫3次。加强注射剂量为10-20μg蛋白，使用不完全弗氏佐剂进行乳化。每次注射间隔10天。第4次注射后将小鼠拔除眼球取血，将鼠血于37℃静置1h后，4000rpm离心10min，吸取上层多抗血清，分装保存于-80℃。图5显示所制备的多克隆抗体可特异性识别Argonaute蛋白。

7.Argonaute蛋白抗体对促进对虾病毒感染的作用

将所获Argonaute抗体（2μg/g）接种5组斑节对虾成体，每组18-20尾。对照组一注射磷酸缓冲液（PBS）。注射免疫物后24h，接种5×10³copies/mL浓度白斑综合症病毒（WSSV）肌肉悬液或桃拉病毒（TSV）或两种病毒混合悬液50ul，对照组二注射磷酸缓冲液（PBS）24h后接种两种病毒混合悬液的混合物50ul，以后每隔6h记录死亡情况。

结果显示，对照组一均无死亡对虾。对照组二在第一天开始死亡，在5天时死亡率达到100%（图7）。使用Argonaute抗体被动免疫后，所有组别都呈现加速死亡的效果。注射TSV和两种病毒混合悬液的组别死亡规律相似，均在第一天达到30%以上的死亡率，第三天呈现死亡高峰，上升到80%左右，第5天时死亡率达到94%以上（图7）。单独注射WSSV组别在第一、二天即到死亡高峰，死亡率达70%，第5天时死亡率达80%（图7）。说明体内Argonaute蛋白被抗体中和、封闭后，虾体免疫力显著下降，病毒感染加剧。

8.Argonaute蛋白对病毒感染对虾病毒的阻断作用

将纯化的对虾Argonaute蛋白（2μg/g）接种斑节对虾成体，每组18-20尾。对照组注射磷酸缓冲液（PBS）。注射免疫物后24h，接种5×10³copies/mL浓度白斑综合症病毒（WSSV）肌肉悬液及桃拉病毒（TSV）混合悬液50ul。

结果显示，注射对虾蛋白Argonaute蛋白后，显著抑制对虾死亡，死亡时间推迟到第二天，第三天时死亡率较对照组降低了33%，第五天时死亡率为62%，较对照组100%的死亡率降低了近40%，具有显著的阻断效果（图8）。说明Argonaute蛋白具有显著抗病毒的效果，其体外重组蛋白有望开发为虾类抗病毒药物。

9.Argonaute蛋白基因在对虾抗病育种中的应用

利用Argonaute基因的多态性，开发与对虾抗病性状相关的单核苷酸多态性（SNP）标记位点，并利用该SNP位点作为辅助育种标记，具体方法如下：用剪刀剪取对虾肌肉组织25mg，利用Omega Bio-Tek Inc.E.Z.N.A.Mollusk DNA试剂盒提取养殖家系亲本DNA。利用Argonaute基因上的SNP相关引物和HRM方法对样品进行SNP分型。PCR反应在7500Fast Real-time PCR System(Applied Biosystems Inc.)上进行，反应条件为95℃预变性5分钟，然后95℃变性30秒，55℃退火延伸1分钟，进行40个循环。PCR反应结束后，样品从65℃到95℃缓慢升温，进行熔解曲线分析。熔解曲线结果用ABI公司提供的High Resolution Melting Analysis 2.0分析软件进行分型。筛选获得对虾抗病家系亲本，培育具有抗病性状的对虾新品系，提高对虾养殖的成活率，增加经济效益。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims

1.一种对虾抗病毒Argonaute蛋白，其特征在于，其氨基酸序列为：

2.编码权利要求1所述对虾抗病毒Argonaute蛋白的cDNA，其开放阅读框长2616bp的，编码871氨基酸，5’非编码区长106bp，起始于ATG，3’非编码区长123bp，终止于TGA，有mRNA快速降解信号ATTTA，其核苷酸序列为：

3.包含权利要求2所述cDNA的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，为pGEX-4T-Argonaute。

5.一种与权利要求1所述对虾抗病毒Argonaute蛋白特异性结合的抗体。

6.权利要求1所述对虾抗病毒Argonaute蛋白在制备对虾抗病毒药物中的应用。

7.权利要求2所述对虾抗病毒Argonaute蛋白的cDNA在制备对虾抗病毒药物中的应用。

8.权利要求2所述对虾抗病毒Argonaute蛋白的cDNA在对虾抗病育种中的应用。