CN102559689B - 对虾补体1q结合蛋白及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对虾补体1q结合蛋白基因序列及其用途，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。还公开了含有上述对虾补体1q结合蛋白cDNA的表达载体，及利用上述表达载体制备的重组对虾补体1q结合蛋白及该重组对虾补体1q结合蛋白的制备方法，还公开了一种能与上述重组对虾补体1q结合蛋白特异性结合的抗体。还进一步公开了上述能与重组对虾补体1q结合蛋白特异性结合的抗体在制备虾类抗病或增强虾类免疫力药物中的应用。

Description

对虾补体1q结合蛋白及其用途

技术领域

本发明涉及一种对虾补体结合蛋白的基因序列，更具体涉及一种从斑节对虾肝胰腺cDNA文库中同源克隆出来一个补体1q结合蛋白基因的序列、氨基酸序列、时空表达图谱，本发明还涉及该基因的用途。

背景技术

补体系统的主要生理功能是促进吞噬和溶解靶细胞，消除外来抗原的侵害，是机体免疫防御机制的重要组成部分。补体被外来抗原激活通过两个途径：(1)经典途径，被IgM和IgG复合物或碳水化合物激活；和(2)替代途径，被非已表面分子或细菌内毒素激活。两个途径终极效果，是通过在细胞表面形成膜攻击复合物，从而导致补体的激活。补体C1q是经典激活途径中的起始成分之一，是各种补体分子中分子量最大(410kDa)的γ球蛋白。C1q通过其胶原区的肽链相互聚合，从而增强B细胞产生Ig的作用。

另一方面，在一些非免疫性因素的刺激下，补体系统的活化又可产生炎症反应，并影响凝血及纤溶系统，导致机体正常组织细胞的损伤。现已研究证明，补体的过度激活将导致多种疾病，例如急性胰腺炎、阿尔茨海默病、银屑病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、中风、心肌梗死、溶血性贫血、血液透析、多系统器官衰竭等(Sahu，Lambris et al.，2000)。因此抑制过度激活的补体级联反应，调节机能恢复动态平衡，对患此疾病获症状的人有所裨益。

补体1q结合蛋白是一种高度糖基化的蛋白，其特异性结合C1q胶原样结构域，调控补体1q的活性，从而抑制补体系统过度激活。同时，C1qBP是丝裂原蛋白酶的底物，是MAPK激酶级联反应的一部分，与细胞多种生理过程，如细胞生长、发育、分裂、死亡等密切相关。此外，某些病毒在进化过程中演变出利用补体1q进入宿主细胞的侵染策略。

因此，对补体1q结合蛋白的研究，将有助于了解多种生理活动。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种对虾补体1q结合蛋白的cDNA及由其编码的氨基酸。

本发明的第二个目的在于提供含有上述对虾补体1q结合蛋白的cDNA的表达载体。

本发明的第三个目的在于提供一种制备重组对虾补体1q结合蛋白的方法及由该方法制备的重组对虾补体1q结合蛋白。

本发明的第四个目的在于提供一种能与上述重组对虾补体1q结合蛋白特异性结合的抗体。

本发明的最后一个目的在于提供上述能与重组对虾补体1q结合蛋白特异性结合的抗体在制备虾类抗病或增强虾类免疫力药物中的应用及其在制备虾类生殖调控药物中的应用。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种对虾补体1q结合蛋白的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述对虾补体1q结合蛋白，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。其核苷酸和氨基酸序列的对照如SEQ ID NO.3所示。

本发明上述对虾补体1q结合蛋白(以下简称C1qBP)的cDNA，其具体通过如下方法获得：通过以近源物种C1qBP基因的CDS序列的保守区设计的兼并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到斑节对虾C1qBP基因的全表达序列。C1qBP又称p32，它与补体分子C1q的胶原样区结合，调控补体系统的经典途径。斑节对虾C1qBP基因包括120bp 5’-非翻译区序列，401bp 3’-非翻译区序列。该基因编码263个氨基酸组成的蛋白，分子量为29kd。该基因在卵巢和免疫器官中高表达，并被外源刺激诱导表达，可在制备虾类抗菌抗病毒，以及卵巢发育和生殖调控药物中的应用。

本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：一种表达载体，所述的表达载体包含上述对虾补体1q结合蛋白的cDNA。

本发明的第三个目的是通过如下技术方案来实现的：一种制备重组对虾补体1q结合蛋白的方法，包括用上述表达载体转化寄主细胞，培养转化体，获得重组的对虾补体1q结合蛋白。

其中，本发明所述的寄主细胞是原核或真核细胞。优选为大肠杆菌。

本发明提供的一种重组对虾补体1q结合蛋白，包括用上述表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物获得重组的对虾补体1q结合蛋白的步骤的方法制备获得。

本发明的第四个目的是通过如下技术方案来实现的：一种能与上述重组对虾补体1q结合蛋白特异性结合的抗体。包括将上述DNA序列表达的原核或真核表达的重组蛋白，免疫鼠、鸡等实验动物获得多克隆或单克隆抗体。

本发明的最后一个目的是通过如下技术方案来实现的：重组对虾补体1q结合蛋白在制备虾类抗病毒或增强虾类免疫力药物中的应用。或上述重组对虾补体1q结合蛋白在制备虾类生殖调控药物中的应用。

本发明的有益效果是：本发明从对虾样品中得到一个新的对虾补体1q结合蛋白的cDNA序列，通过基因工程技术对其功能研究，发现该序列在真核或原核细胞中可以高效表达；本发明还将上述对虾补体1q结合蛋白的cDNA序列克隆到原核或真核表达载体上，转化大肠杆菌感受态细胞，通过阳性克隆子的诱导表达得到其重组蛋白，研究其性质发现，C1qBP基因在卵巢中特异性高表达，并受LPS刺激后上调，其多克隆抗体对白班综合症病毒具有阻断作用，揭示其可以作为虾类抗病或增强虾类免疫力药物使用，还对虾类的生殖调控具有良好作用。

附图说明

图1显示C1qBP的blastP结果，含有MAM33亚家族结构域；

图2a是雄性斑节对虾C1qBP的半定量分析，M：marker；1.肝胰腺；2.肠；3.鳃；4.淋巴；5.神经；6.胃；7.精巢；8.血细胞；

图2b是雌性斑节对虾C1qBP的半定量分析。M：marker；1.肝胰腺；2.肠；3.鳃；4.淋巴；5.神经；6.胃；7.卵巢；8.血细胞；

图3是C1qBP mRNA在斑节对虾性腺不同发育阶段中的表达，其中1.无节幼体；2.蚤状幼体；3.糠虾幼体；4.籽虾；5.7-8cm雌虾卵巢；6.10-12cm雌虾卵巢；7.I期卵巢；8.II期卵巢；9.III期卵巢；10.Ⅳ期卵巢；11.V期卵巢；12.7-8cm雄虾精巢；13.10-12cm雄虾精巢；14.14-15cm雄虾精巢；15.15-16cm雄虾精巢；16.18-20cm雄虾精巢；17.20cm雄虾精巢；

图4是斑节对虾C1qBP基因在LPS刺激下的表达特征分析；

图5是C1qBP在大肠杆菌中的融合表达蛋白，其中：M：蛋白marker；1.pET-C1qBP的E.coliBL21重组菌株，IPTG诱导表达；2.pET-32a(+)空载体的E.coli BL21菌株，IPTG诱导表达；

图6是Ni-NTA树脂亲和纯化的C1qBP原核表达蛋白，其中M：蛋白marker；1.pET-32a(+)空载体的E.coli BL21菌株，IPTG诱导表达；2.Ni-NTA树脂亲和纯化的pET-C1qBP，第二收集管；3.Ni-NTA树脂亲和纯化的pET-C1qBP，第三收集管；

图7是C1qBP原核蛋白的免疫印迹结果，使用pET-C1qBP多克隆抗体进行免疫印迹；

图8是重组C1qBP(5mg/ml)以及重组C1qBP抗体对对虾的阻断效果图。

具体实施方式

下面通过以下具体实施方式对本发明作进一步阐述，但是本发明的内容完全不局限于此。

1.总RNA的提取和肝胰腺全长cDNA文库构建

1.1总RNA的提取

取鲜活健康斑节对虾(体重约150g)在实验室内暂养3d后(水温约24℃，气泵充气)，解剖虾体取出肝胰腺约100mg，放入1mL RLT Buffer(Qiagen，USA)中进行低温研磨，按照Qiagen Mini试剂盒使用说明提取总RNA，并使用DNase消化除去基因组。

1.2肝胰腺全长cDNA模板的制备

按照GeneRacer kit(Invitrogen，USA)制备全长cDNA模板。取3μg总RNA经过小牛碱性磷酸酶(CIP)反应去除RNA 5’磷酸基团，经过烟草焦磷酸酶(TAP)去除RNA 5’帽子结构，利用RNA连接酶连上GeneRacer^TM RNA Oligo，再利用GeneRacer^TM OligodT引物在逆转录酶Superscript III的作用下50℃反应60min，从而获得全长cDNA的模板。

2.补体1q结合蛋白基因cDNA全序列的克隆

2.1兼并引物设计依据，引物合成的方法

从GenBank中下载近源物种(如人、小鼠、斑马鱼、果蝇等)C1qBP同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成，得到以下引物序列：

F：5’-GCCDCCCNGA CKCGVACT-3’

R：5’-CTGANCGTAHAAAGMATNCTBGTA-3。

2.2C1qBP基因片段的获取

以近源物种C1qBP基因CDS序列的保守区设计的兼并引物，扩增片段大小约为819bp。

GCCGCCCGGA CTCGCACTCC TCTAATTCAA ACAGTTTCCA GGACCAATTA CCTGCGACTA  60

TGAGTGCCAT CAGCCGTGCT ATGTACCGCC TTCAAGGCTC TCTGCTGCCG GGGGTCATGG  120

GCATCCGGGG TGTCGTGGCG CCGTCCCGAA ACCTGACGAG GAACTTGGTG GTGATGTGCT  180

CCAACGCCGG TCACGGCCGC CGCACGCCGC TCCGGTCTTC CACGCTGTGC TCCTGCGGCT  240

GCGGGATCCA CGGCATGCAC ACGAGAGGAG ATAGAGAGTT GGTAGAATTT CTACAAGAGG  300

AAATATTGGC TGAGAAGAAA ACAATGGCCA GTGGTGTTCC TTCACATATA GATGATTTCA  360

AAGTTAGTGT TAATGATGCA GAGGTTACTC TTACAAAGAA CTTCCATGAT GAGGTCATTG  420

CCATCAGCCT CAACGTGAAT CACACAGTAG ACACTGAAGC CCCTGCTGAG TTGAGCCAAG  480

ACCAGTCTGA AGGAGAGCTC AAGAGTCGTC CCAGCTTTGA AGTTGATATC AAGGTTGGCT  540

CGAAAACCCT GTCCTTCACG TGCTCTTACT CAGGACCAAG TGACATTACA GAAGGTCAAG  600

ACCAGGTTGA GGATGCTTTT GGTATCAACG AACTTACCAT GTATGAGGGC GAATGGAATG  660

AAGAAGTCTA CTGTGTTTCT GGAGATATTT TGGATGGCAT GATGTATGAT CTTTTAATGA  720

ACATGTTGGA AGAGAGAGGA GTCACAAATG AGTTTGCAGA GAAATTGAGC AATCTCTGCT  780

CTGACTACGA GCATTCTTTA TACGTTCAGT TACTTCAAA                         819

C1qBP基因的部分序列

以上述合成的cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，反应体系为：10x PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl₂3μL，10mmol/L dNTP 2μL，10nmol/L引物F和R各2μL，Taq酶1.25U，用超纯水将反应体系补充至50μL。反应条件为：1个循环，94℃变性5min；35个循环：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。所扩增的PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pGEM-T载体(Promega，USA)中，转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经兼并引物PCR检测后，将具有插入片段的质粒DNA用M13通用引物进行测序。

2.3C1qBP全长cDNA的获得

根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物。利用cDNA末端快速扩增(RapidAmplification of cDNA ends，RACE)技术对目的基因的3′和5′末端进行PCR扩增。

依据序列合成5’RACE引物5’-CGCCCTCATACATGGTAAGTTCGT-3’和3’-RACE引物5’-CTCCGGTCTTCCACGCTGTGCT-3’，采用上述合成的全长cDNA为模板，按照GeneRacer^TM Kit(Invitrogen，USA)进行5’RACE PCR扩增。第一次反应体积为20μl，反应条件为个94℃变性2min；5个循环：94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；25个循环：94℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸1min；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。利用5’RACE巢式引物5’-AGCCGCAGGAGCACAGCGTGGAA-3’和3’RACE巢式引物5’-CTGCTGAGTTGAGCCAAGACCAGTCTGA-3’进行巢式PCR，反应体积为50μl，反应条件为94℃变性2min；30个循环：94℃变性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，亚克隆PGEM-T载体，T7、SP6进行测序反应获得约5’RACE片段301bp(图2)以及3’RACE片段787bp的核酸序列(图3)，拼接后获得全长cDNA为1310bp(图5)。

TTTTTGGGTA TTTATTTAGG ACATCGTGTG CATCTCACGT GTACGAGAGG TTACAGGGAC  60

CGCCGCCCGT ACTCGCACTC CTCTAATTCA AACAGTTTCC AGGACCAATT ACCTGCGACT  120

ATGAGTGCCA TCAGCCGTGC TATGTACCGC CTTCAAGGCT CTCTGCTGCC GGGGGTCATG  180

GGCATCCGGG GTGTCGTGGC GCCGTCCCGA AACCTGACGA GGAACTTGGT GGTGATGTGC  240

TCCAACGCCG GTCACGGCCG CCGCACGCCG CTCCGGTCTT CCACGCTGTG CTCCTGCGGC  300

T                                                                  301

5’RACE获得序列

CTGCTGAGTT GAGCCAAGAC CAGTCTGAAG GAGAGCTCAA GAGTCGTCCC AGCTTTGAAG  60

TTGATATCAA GGTTGGCTCG AAAACCCTGT CCTTCACGTG CTCTTACTCA GGACCAAGTG  120

ACATTACAGA AGGTCAAGAC CAGGTTGAGG ATGCTTTTGG TATCAACGAA CTTACCATGT  180

ATGAGGGCGA ATGGAATGAA GAAGTCTACT GTGTTTCTGG AGATATTTTG GATGGCATGA  240

TGTATGATCT TTTAATGAAC ATGTTGGAAG AGAGAGGAGT CACAAATGAR TTTGCAGAGA  300

AATTGAGCAA TCTCTGCTCT GACTACGAGC ATTCTTTATA CGTTCAGTTA CTTCAAAAAG  360

TGCAGGACTT CGTCAAGAGG AAATAAGTGA GAAACTCTTG AACTGACAAC AAATCACCAC  420

AGTATCATCA AGCCCAAGAT TTCAAGTGAA TGGATGGTCT GCCTTGCAAA AGTAACCATT  480

TATGTTCCAT TCTGAGTAGA AATGTAACAG ATATTTCTTG TATTGGATAT ATCTAGGGCT  540

GTTCATTTTC TTTTTTTCTT TTTTATATAT AGTTACATAA AAATGAAGAT TTTGATCATT  600

AATAAAAAAT TGCTAACTTT TTATATGTTT ACAGTTTGTT CTGTTGTATA GCTTATAATA  660

TTTATCACTT AATGGTATCG TCTTTGCAAA AGGCAAGACA CTGTAAGTAA TATGTACAGA  720

AGAAGTCTAG GTTGAATGGC CTTGACTATC TCTTAATATA TAACAAAGAT GGAAAAAAAA  780

AAAAAAA                                                            787

3’RACE获得序列

2.4C1qBP的生物信息学分析

C1qBP的blast分析结果

用Blast(http://www.ncbi.nim.nih.gov/)进行同源性分析，结果如图4所示，该基因与伊蚊、蜱虫、小鼠等的C1qBP蛋白有高度同源性，揭示该基因是C1qBP基因。利用DNAstar等工具进行生物信息学分析，揭示起始密码ATG位于121-123核苷酸，终止密码子位于907-909核苷酸，开放读码框为789个核苷酸，推测编码一个263个氨基酸的蛋白(图5)。5’UTR为120bp，3’UTR为388bp，3’UTR存在典型的加尾信号AATAAA(图5)。利用SignalIP软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析该蛋白在1-22氨基酸为信号肽序列，并且在

78-159氨基酸存在典型的MAM33结构域(附图1)，揭示其属于线粒体基质蛋白家族成员。

TTT TTG GGT ATT TAT TTA GGA CAT CGT GTG CAT CTC ACG TGT ACG AGA  48

GGT TAC AGG GAC CGC CGC CCG TAC TCG CAC TCC TCT AAT TCA AAC AGT  96

TTC CAG GAC CAA TTA CCT GCG ACT ATG AGT GCC ATC AGC CGT GCT ATG  144

                                Met Ser Ala Ile Ser Arg Ala Met

                                                5

TAC CGC CTT CAA GGC TCT CTG CTG CCG GGG GTC ATG GGC ATC CGG GGT  192

Try Arg Leu Gln Gly Ser Leu Leu Pro Gly Val Met Gly Ile Arg Gly

    10                   15                  20

GTC GTG GCG CCG TCC CGA AAC CTG ACG AGG AAC TTG GTG GTG ATG TGC  240

Val Val Ala Pro Ser Arg Asn Leu Thr Arg Asn Leu Val Val Met Cys

25                  30                  35                  40

TCC AAC GCC GGT CAC GGC CGC CGC ACG CCG CTC CGG TCT TCC ACG CTG  288

Ser Asn Ala Gly Thr Gly Arg Arg Thr Pro Leu Arg Ser Ser Thr Leu

                 45                  50                  55

TGC TCC TGC GGC TGC GGG ATC CAC GGC ATG CAC ACG AGA GGA GAT AGA  336

Cys Ser Cys Gly Cys Gly Ile Thr Gly Met His Thr Arg Gly Asp Arg

            60                  65                  70

GAG TTG GTA GAA TTT CTA CAA GAG GAA ATA TTG GCT GAG AAG AAA ACA  384

Glu Leu Val Glu Phe Leu Gln Glu Glu Ile Leu Ala Glu Lys Lys Thr

         75                  80                  85

ATG GCC AGT GGT GTT CCT TCA CAT ATA GAT GAT TTC AAA GTT AGT GTT  432

Met Ala Ser Gly Val Pro Ser His Ile Asp Asp Phe Lys Val Ser Val

    90                  95                  100

AAT GAT GCA GAG GTT ACT CTT ACA AAG AAC TTC CAT GAT GAG GTC ATT  480

Asn Asp Ala Glu Val Thr Leu Thr Lys Asn Phe His Asp Glu Val Ile

105                 110                 115                 120

GCC ATC AGC CTC AAC GTG AAT CAC ACA GTA GAC ACT GAA GCC CCT GCT  528

Ala Ile Ser Leu Asn Val Asn His Thr Val Asp Thr Glu Ala Pro Ala

                125                 130                 135

TTT GAA GTT GAT ATC AAG GTT GGC TCG AAA ACC CTG TCC TTC ACG TGC    576

Glu Leu Ser Gln Asp Gln Ser Glu Gly Glu Leu Lys Ser Arg Pro Ser

            140                 145                 150

TTT GAA GTT GAT ATC AAG GTT GGC TCG AAA ACC CTG TCC TTC ACG TGC    624

Phe Glu Val Asp Ile Lys Val Gly Ser Lys Thr Leu Ser Phe Thr Cys

        155                 160                 165

TCT TAC TCA GGA CCA AGT GAC ATT ACA GAA GGT CAA GAC CAG GTT GAG    672

Ser Tyr Ser Gly Pro Ser Asp Leu Thr Glu Gly Gln Asp Gln Val Glu

    170                 175                 180

GAT GCT TTT GGT ATC AAC GAA CTT ACC ATG TAT GAG GGC GAA TGG AAT    720

Asp Ala Phe Gly Ile Asn Glu Leu Thr Met Tyr Glu Gly Glu Trp Asn

185                 190                 195                 200

GAA GAA GTC TAC TGT GTT TCT GGA GAT ATT TTG GAT GGC ATG ATG TAT    768

Glu Glu Val Tyr Cys Val Ser Gly Asp Ile Leu Asp Gly Met Met Tyr

                205                 210                 215

GAT CTT TTA ATG AAC ATG TTG GAA GAG AGA GGA GTC ACA AAT GAR TTT    816

Asp Leu Leu Met Asn Met Leu Glu Glu Arg Gly Val Thr Asn Glu Phe

            220                 225                 230

GCA GAG AAA TTG AGC AAT CTC TGC TCT GAC TAC GAG CAT TCT TTA TAC    864

Ala Glu Lys Leu Ser Asn Leu Cys Ser Asp Tyr Glu His Ser Leu Tyr

        235                 240                 245

GTT CAG TTA CTT CAA AAA GTG CAG GAC TTC GTC AAG AGG AAA TAA GTG    912

Val Gln Leu Leu Gln Lys Val Gln Asp Phe Val Lys Arg Lys *

    250                 255                 260

AGA AAC TCT TGA ACT GAC AAC AAA TCA CCA CAG TAT CAT CAA GCC CAA  960

GAT TTC AAG TGA ATG GAT GGT CTG CCT TGC AAA AGT AAC CAT TTA TGT  1008

TCC ATT CTG AGT AGA AAT GTA ACA GAT ATT TCT TGT ATT GGA TAT ATC  1056

TAG GGC TGT TCA TTT TCT TTT TTT CTT TTT TAT ATA TAG TTA CAT AAA  1104

AAT GAA GAT TTT GAT CAT TAA TAA AAA ATT GCT AAC TTT TTA TAT GTT  1152

TAC AGT TTG TTC TGT TGT ATA GCT TAT AAT ATT TAT CAC TTA ATG GTA  1200

TCG TCT TTG CAA AAG GCA AGA CAC TGT AAG TAA TAT GTA CAG AAG AAG  1248

TCT AGG TTG AAT GGC CTT GAC TAT CTC TTA ATA TAT AAC AAA GAT GGA  1296

AAA AAA AAA AAA AA                                               1310。

C1qBP的核苷酸序列和推测的氨基酸序列

3.PCR检测C1qBP mRNA在雌雄斑节对虾不同组织的分布

提取了雌雄斑节对虾的不同组织(包括肝胰腺、肠、鳃、淋巴、神经、胃、精巢、卵巢、血细胞)的RNA。总RNA的提取方法见前所述。取不同组织总RNA1μg与反转录引物(Oligo-(dT)₁₈接头引物)1μL(10pmol/L)混合，70℃加热5min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5mmol/L dNTP混合液，Ribonuclease Inhibitor，M-MLV反转录酶(Promega，USA)，反应体系为25μL。反应过程为42℃60min，70℃15min，稀释1倍后作为模板使用。

PCR反应使用半定量引物C1qBP-F1(5’-GAACTTGGTGGTGATGTG-3’)和C1qBP-R1(5’-CGTATAAAGAATGCTCGTAG-3’)扩增C1qBP基因，扩增看家基因EF-1α(EF-F15’-ATGGTTGTCAACTTTGCCCC-3’，EF-R15’-TTGACCTCCTTGATCACACC-3’)作为内参，以上述合成的cDNA作为模板。PCR反应条件为94℃变性2min；x个循环(C1qBP为30个循环，EF-1α为26个循环)：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪扫描成像，结果见附图2a和2b，可见在多种组织中均有表达，但在神经中没有表达，在肝胰腺、鳃、淋巴、血细胞等免疫组织和细胞中高丰度表达，同时卵巢表达量显著高于精巢。

4.PCR检测C1qBP mRNA在性腺不同发育阶段的表达

提取不同发育阶段的斑节虾，即无节幼体、蚤状幼体、糠虾幼体、籽虾，以及体长为7-20cm的雌雄斑节对虾性腺进行总RNA抽提。不同时期精巢按照体长进行取样，卵巢按照I期、II期、III期、IV期、V期(分别为卵原细胞期、染色质核仁期、周边核仁期、卵黄囊期、成熟期)进行取样。总RNA的提取方法、第一链cDNA逆转录和RT-PCR方法与前述相同。

结果见附图3，可见在无节幼体至籽虾阶段该基因表达量低或不表达，随着性腺发育成熟开始有所表达。该基因在不同发育阶段的卵巢表达量都较高，而在不同发育阶段精巢中表达量均较低。再次印证了该基因是卵巢特异性表达的基因。

5.荧光定量PCR检测C1qBPmRNA在不同刺激物的表达

LPS是多数真核生物天然免疫系统的有效刺激剂。LPS诱导表达的基因往往被认为参加了宿主抗菌的天然免疫过程。为确认C1qBP是否参与这一过程，进行了LPS刺激表达实验。

健康斑节对虾按照5μg/g的剂量注射50μl LPS，对照组注射50μL PBS缓冲液(NaCl137mM，KCl 2.7mM，Na₂HPO₄10mM，KH₂PO₄2mM，pH 7.4)，于第二腹节处向心注射。注射后0-24h取肝胰腺，剪碎后置于RNAlater中保存，并带回实验室分析。

总RNA抽提方法和cDNA逆转录方法见前所述。根据C1qBP基因的全cDNA长设计荧光定量PCR引，C1qBP-F2(5’-CTCAACGTGAATCACACAGTAGACACT-3’)，C1qBP-R2(5’-ACTTCAAAGCTGGGACGACTCT-3’)，同时选用EF-1α作为内参基因，引物序列EF-F2(5’-AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT-3’)，EF-R2(5’-CGTGGTGCATCTCCACAGACT-3’)。荧光定量PCR反应体系为20μL，包含10μL的2×SYBR Green Real-time PCR Master Mix(TaKaRa，Japanese)，1μL cDNA模板，2μL引物和7μL的双蒸水，以蒸馏水代替模板作为阴性对照，每个样品设置3个重复，反应参数为95℃预变性10s，然后95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。实验数据采用相对CT法进行数据分析。结果见附图4，C1qBP在注射后3h开始上调，到6h达到表达高峰，表达量显著高于对照组，随着时间推移，表达量逐渐回落。说明C1qBP受LPS刺激后上调，是急性表达蛋白。

6.C1qBP融合蛋白的制备

以cDNA作为模板，利用PCR扩增C1qBP的部分开放读码框(1-210Aa)，PCR引物为PETC-F：5’-ATGAATTCATGAGTGCCATCAGCCGTGCTA-3’；PETC-R：5’-ACCTCGAGAAGATCTCCAGAAACACA-3’；PCR条件为94℃2min，94℃30s，50℃，30s，72℃，1min，共30循环。PCR产物经EcoRI，XhoI酶切后亚克隆到pET-32a质粒，质粒经测序确认无误后，转化到大肠杆菌BL21细胞，挑取单克隆培养至对数期，加入终浓度为0.4mM的IPTG在37℃诱导表达3-6h。附图5显示pET-C1qBP诱导表达为一个约43kD的融合蛋白，除去约21KD的标签蛋白，C1qBP 1-210Aa的原核表达蛋白约22KD，与预测的分子量一致。

利用融合表达蛋白的6个组氨酸标签，使用Ni-NTA+树脂和His Bind Purification Kit(Novagen，USA)对pET-C1qBP进行亲和层析纯化。纯化流程见Novagen试剂盒说明书。附图6显示His纯化效果较好，纯化的pET-C1qBP融合蛋白约43KD。

7.C1qBP基因编码蛋白的多克隆抗体制备

将纯化蛋白割胶回收(约100-200μg)，与3ml完全弗氏佐剂充分混匀孵化，在小鼠皮下多点注射，共注射8只小鼠，每只小鼠注射约50μg蛋白。第一次注射3周后加强免疫3次。加强注射剂量为10-20μg蛋白，使用不完全弗氏佐剂进行乳化。每次注射间隔10天。第4次注射后将小鼠拔除眼球取血，将鼠血于37℃静置1h后，4000rpm离心10min，吸取上层多抗血清，分装保存于-80℃。附图7显示使用制备的多克隆抗体，可特异性的识别C1qBP原核蛋白。

8.重组C1qBP抗体对白斑综合症病毒的阻断作用

将纯化获得重组C1qBP(5mg/ml)以及重组C1qBP抗体(用PBS磷酸缓冲液1∶10稀释)分别接种斑节对虾成体，每组15-16尾。对照组一注射小鼠血清(用PBS 1∶10稀释)，对照组二注射磷酸缓冲液(PBS)。注射免疫物后12h，接种10^-5浓度白斑综合症病毒(WSSV)肌肉悬液，以后每隔6h记录死亡情况。结果显示，对照组一和对照组二死亡规律相似，均在12天时累积死亡率达100％(图8)；使用重组C1qBP抗体进行被动免疫，5天后较对照组死亡时间延迟，死亡率降低至80％，具有一定的阻断效果(图8)。相应的，注射重组C1qBP具有加速发病的效果，斑节对虾发病时间提前2-3天，累积死亡率达93％(图8)。

9.C1qBP基因在酵母中的表达

将C1qBP基因的开放读码框的核苷酸序列与pGAPZA和pGAP αB表达载体制备成真核表达质粒，并转入克隆菌株DH5α。将表达质粒用限制性内切酶BspI消化，浓缩线性化DNA片段后，电转化毕赤酵母，在Zeocin抗性平板上筛选出重组克隆，并在3ml YPD(100μg/ml)Zeocin培养，48h后分别取菌体和上清于12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。筛选出游特异蛋白表达的克隆。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种对虾补体1q结合蛋白的cDNA，其特征是：它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种对虾补体1q结合蛋白，其特征是：它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3．一种表达载体，其特征是：所述的表达载体包含权利要求1所述的对虾补体1q结合蛋白的cDNA。

4．一种制备重组对虾补体1q结合蛋白的方法，其特征是：包括用权利要求3所述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，获得重组的对虾补体1q结合蛋白。

5．根据权利要求4所述的方法，其特征是：所述的寄主细胞是原核或真核细胞。

6．一种重组对虾补体1q结合蛋白，其特征是：包括用权利要求3所述的表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物获得重组的对虾补体1q结合蛋白的步骤的方法制备，寄主细胞是大肠杆菌。

7．一种能与权利要求6中所述的重组对虾补体1q结合蛋白特异性结合的抗体。

8．权利要求7所述的能与重组对虾补体1q结合蛋白特异性结合的抗体在制备增强虾类对白斑综合症病毒免疫力药物中的应用。

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