CN115820638B - 一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA及其应用 - Google Patents
一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA及其应用，涉及基因工程技术领域。本发明提供了一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA，是针对水禽源ARV的L2基因保守序列设计得到。经试验证实可知，所述外源性人工miRNA不仅能够抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制及增殖，而且能够作为一种新的基因治疗手段，应用于抗水禽源禽呼肠孤病毒新型药物的研制，同时也可以用于水禽源禽呼肠孤病毒致病机制的研究以及转基因动物的制备，从而减少水禽源禽呼肠孤病毒对养禽业造成的经济损失。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA及其应用。
背景技术
禽呼肠孤病毒(ARV)是一种分节段的双股RNA病毒，属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)正呼肠孤病毒属(Orthoreovirus)。ARV是全世界家禽疾病中最为重要的病原之一，ARV宿主广泛，能感染包括鸡鸭鹅在内的多种禽类，既能引发病毒性关节炎、发育迟缓综合征、腱鞘炎、运动障碍和跛足、脾炎、肝炎、心外膜炎等疾病，又能引起宿主免疫抑制，加剧其他病原的感染，是一类既可水平传播也能垂直传播的禽传染性疾病，可导致禽类养殖业巨额经济损失。
ARV基因组为线性分节段双链RNA(dsRNA)，大小约为23kb。根据电泳迁移率的不同，可将ARV的基因组分为L、M、S三组，共10个片段，ARV基因组可按节段大小分为大(L1～L3)、中(M1～M3)、小(S1～S4)三类，它们至少编码8种结构蛋白和4种非结构蛋白。通过对ARV所有基因节段构建遗传进化树分析，除了M2外，鸡源毒株和水禽源毒株分别形成两个独立的分支。
目前，国内外市场上已有多种ARV弱毒疫苗和灭活疫苗应用于ARV的预防，ARV毒株S1133和1733被用作灭活疫苗，而减毒活疫苗S1133被认为是最安全的可用疫苗之一，并被广泛使用。但临床上ARV的发生率仍居高不下，ARV的流行范围、流行趋势不断扩大，新出现的流行变异株也给ARV的防控带来更大的挑战。此外，ARV的基因型、血清型呈现多样性，不同血清型之间交叉保护作用不理想，随着ARV不断进化，传统疫苗对新出现的流行毒株保护效果不佳。并且S1133和1733毒株均属于鸡源ARV，与水禽ARV不属于一个分支，对水禽源呼肠孤病毒感染的保护作用较弱。目前只有针对番鸭ARV的CA株疫苗在市售，其针对其他水禽源ARV的保护作用有待考量。因此，探索新的针对该病的预防与控制技术具有较大的科学意义与应用价值。
RNAi作为生物机体古老而天然的细胞防御机制，特异性地降解细胞内与之同源序列，可令生物产生对内源寄生性核酸或外源病原体的致病性核酸的抵抗，同时还可调节细胞内编码基因的表达水平，自然被广泛地应用于抗病毒研究中，并取得了较大的进展，其可以特异地抑制病毒的生命周期中的各个阶段，包括病毒基因组的复制、转录、装配、出芽等。而amiRNA(artificial microRNA，amiRNA)由基于天然初级miRNA(pri-miRNA)的靶特异性siRNA插入物和支架组成。siRNA是在转录物中寻找互补序列的指南，而pri-miRNA支架确保了正确的加工和运输。细胞中siRNA成熟和siRNA水平的动态类似于内源性miRNAs的动态，因此，amiRNA比其他RNAi方式更安全。因此，如何利用miRNA解决水禽源ARV防疫困难的技术问题显得很有必要。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA，能够抑制水禽源禽呼肠孤病毒的复制及增殖。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA，所述外源性人工miRNA为双链核苷酸amiRNA-420、amiRNA-1107、amiRNA-1979或amiRNA-2863中的任意一种；
所述双链核苷酸amiRNA-420的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.1～2所示；
所述双链核苷酸amiRNA-1107的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.3～4所示；
所述双链核苷酸amiRNA-1979的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.5～6所示；
所述双链核苷酸amiRNA-2863的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.7～8所示。
优选的，所述外源性人工miRNA根据水禽源禽呼肠孤病毒的L2基因设计得到。
本发明提供了一种表达质粒，所述表达质粒包含上述外源性人工miRNA。
优选的，所述表达质粒的基础载体为pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述的外源性人工miRNA。
优选的，所述外源性人工miRNA为药物组合物中的活性成分。
本发明还提供了上述的外源性人工miRNA或上述的表达质粒在制备治疗水禽源禽呼肠孤病毒药物中的应用。
本发明还提供了上述的外源性人工miRNA或上述的表达质粒在制备治疗水禽源禽呼肠孤病毒生物制剂中的应用。
本发明还提供了上述的外源性人工miRNA或上述的表达质粒在制备抗禽呼肠孤病毒转基因细胞系中的应用。
本发明还提供了上述的外源性人工miRNA或上述的表达质粒在制备抗禽呼肠孤病毒转基因水禽中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA，其是针对水禽源ARV L2基因的保守序列设计人工miRNA，用人工miRNA表达载体转染Vero细胞，在优化转染效率的基础上，经50％组织细胞感染剂量(TCID50)以及real-time PCR检测人工miRNA对病毒基因及其复制的抑制效果，从而筛选能有效抑制水禽源ARV的人工miRNA。本发明所述的外源性人工miRNA对水禽源ARV的复制和增殖具有良好的抑制效果，不仅可作为抗水禽源ARV的新型生物制剂进行开发，而且可用于抗病水禽品系培育，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为人工miRNA表达载体结构示意图。
图2为人工miRNA转染48h时的转染效率；其中，A为amiRNA-420，B为amiRNA-902，C为amiRNA-1000，D为amiRNA-1107，E为amiRNA-1433，F为amiRNA-1835，G为amiRNA-1979，H为amiRNA-2222，I为amiRNA-2303，J为amiRNA-2774，K为amiRNA-2804，L为amiRNA-2863，M为amiRNA-neg，N为正常细胞。
图3为ARV-SD-2021-1株ARV感染miRNA表达细胞中L2基因的real-time PCR检测；其中，纵坐标为每组ARV L2基因扩增产物相对含量，横坐标为针对水禽源ARV L2基因不同位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞。
图4为ARV-SD-2021-1株ARV感染miRNA表达细胞中的ARV病毒滴度检测；其中，纵坐标代表病毒滴度TCID50，横坐标为针对水禽源ARV L2基因不同位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞。
具体实施方式
本发明提供了一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA，所述外源性人工miRNA为双链核苷酸amiRNA-420、amiRNA-1107、amiRNA-1979或amiRNA-2863中的任意一种；
所述双链核苷酸amiRNA-420的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.1～2所示；
所述双链核苷酸amiRNA-1107的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.3～4所示；
所述双链核苷酸amiRNA-1979的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.5～6所示；
所述双链核苷酸amiRNA-2863的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.7～8所示。
本发明中，所述外源性人工miRNA优选的根据水禽源禽呼肠孤病毒的L2基因设计得到。
本发明提供了一种表达质粒，所述表达质粒包含上述外源性人工miRNA。本发明中，所述表达质粒的基础载体优选为pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体。在本发明的具体实施例中，所述pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体优选的由美国Invitrogen life technologies公司购买。
本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述的外源性人工miRNA。本发明中，所述外源性人工miRNA为药物组合物中的活性成分。
本发明还提供了上述的外源性人工miRNA、上述的表达质粒在制备治疗水禽源禽呼肠孤病毒药物中的应用。
本发明还提供了上述的外源性人工miRNA、上述的表达质粒在制备治疗水禽源禽呼肠孤病毒生物制剂中的应用。
本发明还提供了上述的外源性人工miRNA、上述的表达质粒在制备抗禽呼肠孤病毒转基因细胞系中的应用。
本发明还提供了上述的外源性人工miRNA、上述的表达质粒在制备抗禽呼肠孤病毒转基因水禽中的应用。
在本发明的具体实施例中，所述ARV-SD-2021-1由本实验室分离保存，GenBank登录号为OP056172。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
1、miRNA RNAi设计
根据NCBI网站现有的水禽源ARV所有毒株L2基因的序列，进行序列比对，选择水禽源ARV不同毒株L2基因之间保守的部位，如表下1。
表1水禽源ARV L2基因目标序列
2、双链寡核苷酸合成与克隆
根据人工miRNA的设计原则，设计针对水禽源ARV的人工miRNA序列，并构建人工miRNA表达质粒双链寡核苷酸序列，如表2。
表2用于人工miRNA表达的双链寡核苷酸序列
将表2序列送北京擎科公司进行单链寡核苷酸(oligo)合成。
将每对单链寡核苷酸进行退火，反应体系为：正链DNA oligo(200μM)5μL，负链DNAoligo(200μM)5μL，10X Oligo Annealing Buffer 2μL(100mM Tris-Hcl pH 8.0，500mMNacl，10mM EDTA)，去离子水8μL。将反应体系在94℃孵育5min，然后缓慢冷却到室温使其退火。将双链寡核苷酸克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体(图1)。其中，按5’→3’顺序说明如下：Top链中初始的5个核苷酸序列(TGCTG)来自于miRNA-155，即一个内源性的microRNA。Bottom链中5’端提供了4个核苷酸的悬挂序列与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒载体线性结构的4个核苷酸悬尾相对应，可结合成双链结构。Top链后面的反向互补的21个核苷酸序列(即为成熟的miRNA序列)，当被转录后它将针对靶序列，因此设计时需与目标RNA互补。
将连接反应产物转化到DH5α感受态细胞，而后进行阳性质粒的筛选，挑选单克隆菌落扩增培养，提取质粒，首先将提取的阳性质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定正确的质粒，使用EmGFP正向测序引物和miRNA反向测序引物送南京擎科生物科技有限公司测序，测序正确的质粒分别命名为amiRNA-420、amiRNA-902、amiRNA-1000、amiRNA-1107、amiRNA-1433、amiRNA-1835、amiRNA-1979、amiRNA-2222、amiRNA-2303、amiRNA-2774、amiRNA-2804、amiRNA-2863。
3、将构建好的质粒瞬时转染vero细胞：
在转染前一天，将vero细胞消化下来，按4×105个/孔接种到6孔细胞板中。当细胞密度达70％～80％时转染，每种质粒重复转染2-3孔；将细胞分为amiRNA-420、amiRNA-902、amiRNA-1000、amiRNA-1107、amiRNA-1433、amiRNA-1835、amiRNA-1979、amiRNA-2222、amiRNA-2303、amiRNA-2774、amiRNA-2804amiRNA-2863转染组和空载转染对照组，以LipofectamineTM3000作为转染试剂进行质粒转染。继续培养24h、48h、72h后观察其转染效率，结果如图2。
可以看出，在感染后48h其转染效率最高。
实施例2
水禽源ARV复制抑制效果检测：
在转染效率最高的时候用水禽源ARV毒株感染细胞，感染指数MOI＝1。于感染后48h收集细胞。收集的细胞按照RNA提取试剂盒(诺唯赞生物科技公司)提取细胞总RNA，利用HiScript Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(诺唯赞生物科技公司)反转录得到cDNA。以18S基因为内参，按照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix(诺唯赞生物科技公司)说明书，进行水禽源ARV L2基因相对荧光定量RT-PCR检测。内参18S上下游引物序列为：
18S上游引物：5’-TCAGATACCGTCGTAGTTCC-3’(SEQ ID NO.37)；
18S下游引物：5’-TTCCGTCAATTCCTTTAAGTT-3’(SEQ ID NO.38)；
L2基因特异引物序列为：5’-GGGTTTGATGATGCTACT-3’(SEQ ID NO.39)和5’-GGGTGATGAAATATGGC-3’(SEQ ID NO.40)。
20μL PCR反应体系为：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10μL，上下游引物各0.4μL，反转录得到的cDNA模板1μL，ddH2O 8.2μL。扩增程序95℃，预变性30s；95℃5s，60℃34s，40个循环；95℃15s，60℃60s，95℃15s。
PCR产物通过7500real-time PCR System软件进行各组间L2基因相对表达量的分析。同时设置18s基因作为内参基因，每组做3个重复，得到结果如图3。其中，横坐标中amiRNA-420代表针对水禽源ARV L2基因420位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-902代表针对水禽源ARV L2基因902位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-1000代表针对水禽源ARV L2基因1000位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-1107代表针对水禽源ARV L2基因1107位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-1433代表针对水禽源ARV L2基因1433位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-1835代表针对水禽源ARV L2基因1835位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-1979代表针对水禽源ARV L2基因1979位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-2222代表针对水禽源ARV L2基因2222位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-2303代表针对水禽源ARV L2基因2303位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-2774代表针对水禽源ARV L2基因2774位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-2804代表针对水禽源ARV L2基因2804位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-2863代表针对水禽源ARV L2基因2863位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-neg代表空载转染细胞对照；VC代表未转染细胞接毒对照；C代表未转染细胞未接毒对照。
根据图3可以看出，在ARV感染后48h，amiRNA-420、amiRNA-1107瞬时转染vero细胞的ARVL2基因表达与空载转染细胞对照组、未转染接毒对照组相比具有显著抑制效果，其中amiRNA-420的抑制效果最好。
在ARV感染后48h收集细胞上清，在vero细胞上进行病毒TCID50测定，得到结果如图4。其中，横坐标中amiRNA-420代表针对水禽源ARV L2基因420位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-902代表针对水禽源ARV L2基因902位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-1000代表针对水禽源ARV L2基因1000位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-1107代表针对水禽源ARV L2基因1107位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-1433代表针对水禽源ARV L2基因1433位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-1835代表针对水禽源ARV L2基因1835位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-1979代表针对水禽源ARV L2基因1979位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-2222代表针对水禽源ARV L2基因2222位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-2303代表针对水禽源ARV L2基因2303位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-2774代表针对水禽源ARV L2基因2774位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-2804代表针对水禽源ARV L2基因2804位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-2863代表针对水禽源ARV L2基因2863位点为起始位点的人工miRNA表达载体转染细胞；amiRNA-neg代表空载转染细胞对照VC代表未转染细胞接毒对照；C代表未转染细胞未接毒对照。
可以看出，在ARV-SD-2021-1毒株感染细胞感染48h后，amiRNA-420、amiRNA-1979、amiRNA-2863对ARV的抑制作用相较空载对照组、未转染接毒组有显著差异，其TCID50分别为10-4.5、10-4.711、10-4.571，而空载对照组TCID50为10-6.375，未转染接毒对照组为10-6.625，即amiRNA-420的抑制效果最好。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种抑制水禽源禽呼肠孤病毒复制的外源性人工miRNA，其特征在于，所述外源性人工miRNA为双链核苷酸amiRNA-420、amiRNA-1107、amiRNA-1979或amiRNA-2863中的任意一种；
所述双链核苷酸amiRNA-420的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.1～2所示；
所述双链核苷酸amiRNA-1107的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.3～4所示；
所述双链核苷酸amiRNA-1979的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.5～6所示；
所述双链核苷酸amiRNA-2863的正义链和反义链序列分别如SEQ ID NO.7～8所示。
2.一种表达质粒，其特征在于，所述表达质粒包含权利要求1所述外源性人工miRNA。
3.根据权利要求2所述的表达质粒，其特征在于，所述表达质粒的基础载体为pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的外源性人工miRNA。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述外源性人工miRNA为药物组合物中的活性成分。
6.权利要求1所述的外源性人工miRNA或权利要求2-3任意一项所述的表达质粒在制备治疗水禽源禽呼肠孤病毒药物中的应用。
7.权利要求1所述的外源性人工miRNA或权利要求2-3任意一项所述的表达质粒在制备治疗水禽源禽呼肠孤病毒生物制剂中的应用。
8.权利要求1所述的外源性人工miRNA或权利要求2-3任意一项所述的表达质粒在制备抗禽呼肠孤病毒转基因细胞系中的应用。
9.权利要求1所述的外源性人工miRNA或权利要求2-3任意一项所述的表达质粒在制备抗禽呼肠孤病毒转基因水禽中的应用。
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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