CN107586778B - 抑制甲型流感病毒复制的shRNA序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一段shRNA序列：GCTGGTCTGACTCACATAATG，将该序列退火后，插入siRNA表达质粒，转化大肠杆菌。经过克隆PCR筛选阳性克隆，保留菌种。扩增基因工程菌，提取纯化质粒。将该质粒转染MDCK细胞。然后以流感病毒感染该细胞，48小时后，收集细胞培养上清，提取总RNA，以RT‑PCT方法检测培养上清中的流感病毒含量。以该质粒与PEI复合物形式给予BALB/C小鼠雾化吸入，连续3天，每天30分钟。然后以流感病毒攻击该小鼠，3天后处死小鼠。取出肺脏制成组织匀浆，从组织匀浆中提取总RNA以RT‑PCT方法检测培养上清中的流感病毒含量。根据不同组流感病毒的含量可以确定该shRNA具有抑制流感病毒复制的作用。

Description

抑制甲型流感病毒复制的shRNA序列及其应用

技术领域

本发明涉及RNA干扰导致基因沉默技术，特别提供一种抑制甲型流感病毒复制的shRNA序列及其应用，在流感大规模流行时可以干预病毒对健康人群的感染以及抑制患病人群体内流感病毒的复制。

背景技术

甲型流感病毒是一种传染性最强的人类呼吸道疾病。在1918年流感病毒世界大流行期间，死于流感的人数超过20，000，000。该病毒的特点是：(1)通过空气飞沫传播，传播速度快。(2)由于病毒抗原不断变异，逃避免疫系统对病毒的防御作用，使新研制的流感疫苗失去作用。(3)定期产生新的病毒毒力株，在新型疫苗还未研制成功之前造成大流行。由于流感病毒寄居于细胞内，传统的抗病毒药物对于预防和治疗流感病毒感染的作用有限，而且抗病毒药物具有一定的毒副作用，以及出现耐药的病毒株，使其应用受到限制。因此，目前还没有有效的方法预防和治疗流感病毒感染，流感病毒对人类健康仍然是一种很大的和潜在的威胁。

RNA干扰(RNAi)是一种由短的双链RNA(又称为小干扰RNA)介导的翻译后基因沉默的形式。在该过程中，细胞的复合Dicer酶裂解双链RNA分子，产生长度为21-25核苷酸的双链的双连单位。这些小干扰RNA再导引RNA干扰诱导的沉默复合体(RISC)裂解与小干扰RNA序列一致的靶mRNA。许多研究证实小干扰RNA在转入到哺乳动物细胞内后可以明显地抑制基因表达。这些发现提出了一种可能性，即RNA干扰可能抑制病毒基因的表达并保护细胞免于病毒感染。

流感病毒是一种由8个片段组成的单链RNA病毒，其中血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)片段经常发生变异，是流感病毒变异的主要分子基础。而另外6个片段为M，NP，NS，PA，PB1，PB2.这6个片段为保守区域，其核苷酸序列相对稳定，是干扰RNA技术常用的靶序列。这6个片段在流感病毒的复制、病毒颗粒装配及感染健康细胞等过程中起重要作用。我们在对流感病毒测序的基础上，设计了针对流感病毒NP片段的小干扰RNA，以期通过RNA干扰技术抑制流感病毒在细胞水平以及动物水平的复制，达到预防和治疗流感病毒感染的目的。

发明内容

本发明根据RNA干扰的机理，在对流感病毒NP片段进行基因测序的基础上，设计了一段shRNA序列，该shRNA具有抑制流感病毒复制的作用。

本发明技术方案如下：

一种抑制甲型流感病毒复制的shRNA序列，其特征在于，shRNA序列为：GCTGGTCTGACTCACATAATG。

将该序列退火后，插入siRNA表达质粒，转化大肠杆菌。经过克隆PCR筛选阳性克隆，保留菌种。扩增基因工程菌，提取纯化质粒。将该质粒转染MDCK细胞。然后以流感病毒感染该细胞，48小时后，收集细胞培养上清，提取总RNA，以RT-PCT方法检测培养上清中的流感病毒含量。以该质粒与PEI复合物形式给予BALB/C小鼠雾化吸入，连续3天，每天30分钟。然后以流感病毒攻击该小鼠，3天后处死小鼠。取出肺脏制成组织匀浆，从组织匀浆中提取总RNA以RT-PCT方法检测培养上清中的流感病毒含量。根据不同组流感病毒的含量可以确定shRNA具有抑制流感病毒复制的作用。

本发明所述shRNA序列的引物，其特征在于，引物序列如下：

上游引物序列NP-391-F：5’-CCGGGCTGGTCTGACTCACATAATGCTCGAGCATTATGTGAGTCAGACCAGCTTTTTTG-3’；

下游引物序列NP-391-R：5’-AATTCAAAAAAGCTGGTCTGACTCACATAATGCTCGAGCATTATGTGAGTCAGACCAGC-3’。

本发明所述shRNA序列可用于制备抑制甲型流感病毒复制的生物制剂。

本发明还提供一种防治流感的实验方法，其特征在于：根据human NP基因的转录本设计siRNA靶点，安排引物合成；将单链的引物退火成双链oligo序列，连接入双酶切线性化的RNA干扰载体，替换掉原来的ccdB毒性基因；菌落PCR筛选转化子，筛选的阳性克隆进行测序验证；测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提；具体步骤如下：

1)、干扰靶点设计和引物合成：

根据shRNA设计的一般原则，设计siRNA靶点，安排引物合成；

2)、引物退火形成带粘性末端的双链片段：

将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μM，互补单链各取30μl混合；然后将oligo混合物在水浴锅中95℃加热5min，然后水浴锅开盖置室温中自然冷却至室温，形成双链oligo片段；取1μl用于后续的连接反应，其余-20℃保存；

3)、线性化表达载体的制备：

用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应Buffer5μl，限制性内切酶各1μl，去离子水补足50μl，于37℃水浴锅中孵育2h以上；酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书；

4)、干扰片段连接入表达载体：

5)、感受态细胞的转化：

DH5α感受态细胞的转化；

6)、菌落PCR鉴定阳性转化子：

挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，取1μl做模板进行菌落PCR鉴定；

7)、阳性克隆送测序：

菌落鉴定得到的阳性克隆，进行测序验证；用Vector NTI软件比对测序结果，对测序结果进行分析；

8)、质粒小提：

经测序验证正确的阳性克隆，命名为pLKD-NP-391，安排质粒小提，具体步骤见试剂盒说明书。

附图说明

图1干扰载体pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA载体图谱。

图2表达载体经过Age I和EcoR I双酶切后的线性化(1.未酶切的干扰载体；2.经Age I和EcoR I双酶切的干扰载体；3.1kb DNA ladder Marker：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)。

图3NP-391菌落PCR鉴定图(1.阴性对照(水)，2.阴性对照(空载体质粒)；3.DL2,000DNA Marker：2kb，1kb，750bp，500bp，250bp，100bp，4-11.挑取的8个转化子)。

图4转染了干扰质粒和空质粒后的MDCK细胞表达绿色荧光蛋白(左：转染空质粒PLKD-007；右：转染干扰质粒PLKD-NP-391)

图5pLKD-NP-391干扰质粒抑制流感病毒的复制(#，p<0.01，和Control组相比；*，p<0.01，和Mock组相比；Mock组代表空质粒组)

图6绿色荧光蛋白在未转染质粒和转染了空质粒或干扰质粒的小鼠肺组织中的表达(**，p<0.01，和对照组相比)。

图7不同组小鼠肺组织冰冻切片中绿色荧光蛋白的表达(其中A.干扰质粒组；B.空质粒组；C.对照组)。

图8干扰质粒pLKD-NP-391抑制小鼠肺组织中流感病毒的复制(**，p<0.01，和对照组相比；#，p<0.05，和空质粒组相比)。

具体实施方式

实施例1

流感病毒NP片段shRNA表达质粒的构建、转化大肠杆菌及阳性克隆的筛选。

甲型流感病毒，A/Shanghai/N33(2008)/H1N1，提取病毒RNA，反转录成cDNA，委托生工(上海)生物技术有限公司进行DNA测序。测序结果如下：

根据测序结果，设计shRNA序列：GCTGGTCTGACTCACATAATG

设计病毒载体构建框架和DNA引物片段。

表1病毒载体构建框架

DNA引物片段：

NP-391-F CcggGCTGGTCTGACTCACATAATGCTCGAGCATTATGTGAGTCAGACCAGCTTTTTTg

NP-391-R aattcaaaaaaGCTGGTCTGACTCACATAATGCTCGAGCATTATGTGAGTCAGACCAGC

表达载体：慢病毒载体(pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA)。通过分子生物学手段将该干扰片段构建入慢病毒载体(pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA)的U6启动子下游，该载体可以实现在干扰目的基因的同时表达绿色荧光蛋白EGFP和puromycin抗性基因，前者便于观察载体工作状态，后者方便筛选目的基因干扰的稳定细胞株。shRNA作为RNA干扰的一种方法，是利用人源和鼠源的U6和H1等RNA聚合酶Ⅲ(polⅢ)启动子转录短的干扰RNA(siRNA，19-21个核苷酸的RNA 双链)的DNA分子。细胞内转录的shRNA被加工后掺入RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，引导核酸酶降解靶RNA。

所选用的干扰载体pLKD-CMV-G&PR-U6-shRNA载体图谱如图1所示。用Age I和EcoRI酶切切去U6启动子下游的ccdB毒性基因，插入待构建的shRNA序列。

实验步骤

根据human NP基因的转录本设计siRNA靶点，安排引物合成。将单链的引物退火成双链oligo序列，连接入双酶切线性化的RNA干扰载体，替换掉原来的ccdB毒性基因。菌落PCR筛选转化子，筛选的阳性克隆进行测序验证。测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提。实验共分以下8个主要步骤：

1.干扰靶点设计和引物合成：

根据shRNA设计的一般原则，设计siRNA靶点，安排引物合成。

2.引物退火形成带粘性末端的双链片段：

将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μM，互补单链各取30μl混合。然后将oligo混合物在水浴锅中95℃加热5min，然后水浴锅开盖置室温中自然冷却至室温，形成双链oligo片段。取1μl用于后续的连接反应，其余-20℃保存。

3.线性化表达载体的制备：

用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应Buffer5μl，限制性内切酶各1μl，去离子水补足50μl，于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书。

4.干扰片段连接入表达载体：

表2连接反应体系

于16℃连接过夜。

说明：阳性对照所加的退火的双链oligo是以前退火好的且验证好用的片段，和连接组所加的退火的双链oligo长度一样，但序列无关。

5.感受态细胞的转化：

DH5α感受态细胞的转化，详见《精编分子生物学实验指南》。

6.菌落PCR鉴定阳性转化子：

挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，取1μl做模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下：

PCR反应条件

PCR反应液组成

7.阳性克隆送测序：

菌落鉴定得到的阳性克隆，送测序公司进行测序验证。用Vector NTI软件比对测序结果，对测序结果进行分析。

8.质粒小提：

经测序验证正确的阳性克隆，命名为pLKD-NP-391，安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

实验结果

1)表达载体的线性化：

用Age I和EcoR I对表达载体进行双酶切得到312bp的ccdB基因和8.2kb的载体片段，酶切图谱如图2所示。

从图2可以看出，Age I和EcoR I双酶切后，载体片段为8.2kb，将该区域的琼脂糖凝胶切下，回收该片段，用于连接shRNA片段。

2)菌落PCR鉴定阳性克隆：

用菌落PCR鉴定转化子，正向引物hU6-F2：TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG位于人U6启动子序列中，反向引物pY-SEQR：CTATTAATAACTAATGCATGGC位于CMV启动子的5’序列，阳性克隆得到332bp的片段，阴性对照得到586bp的片段。

图3为NP-391菌落PCR鉴定图，从图3可以看出，阴性对照(水)未扩增出任何条带，阴性对照(空载体质粒)为586bp片段，阳性克隆为332bp的片段。说明shRNA片段已经插入到表达质粒中。

3)测序结果分析：

NP-391测序结果：

NNNGNGNNNTATTTGACTGTAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGCTGGTCTGACTCACATAATGCTCGAGCATTATGTGAGTCAGACCAGCTTTTTTGAATTCGGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTNNNCACCCTCGTGACCACCCNGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACNCNTNNGCAGCACGACTTTCTTCAAGTCCGCCAATGNCGAAGGCCTNACGTTCCAAGAA

菌落鉴定得到的阳性克隆，经过测序验证，确定shRNA序列已经插入表达质粒中。

实施例2

流感病毒干扰质粒pLKD-NP-391抑制流感病毒在MDCK细胞中的复制。

1.质粒小提：

按照Promega公司Wizard Plus Minipreps DNA Purification System试剂盒说明书进行。

2.质粒转染MDCK细胞：

MDCK细胞是Madin–Darby犬肾细胞系，是研究流感病毒感染最常用的工具细胞。将MDCK细胞复苏后，培养于含有热灭活的10％FCS，2mM L-谷氨酰胺，100单位青霉素/ml和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中，传代2-3代后，接种于24孔细胞培养板中，接种密度为5×10⁴/孔。37℃，5％CO₂，饱和湿度下培养24小时。当细胞层达到60％-70％融合时，分别以干扰质粒pLKD-NP-391和空质粒pLKD-007转染MDCK细胞，操作步骤见Life technologies公司的Lipofectamine 3000试剂盒说明书。24小时后，在荧光显微镜下观察转染效率。

3.质粒转染细胞的筛选：

转染后24小时，经荧光显微镜下观察证实转染成功后，将细胞培养上清吸出，以无菌的PBS洗细胞3次，加入含有2.5μg/ml飘柔霉素的流感病毒维持培养基(含有2mM L-谷氨酰胺，100单位青霉素/ml和100μg/ml链霉素，0.2％BSA，25mM HEPES的DMEM培养基)培养48小时，以杀死未被转染质粒的细胞。

4.流感病毒感染MDCK细胞：

吸出培养上清，以PBS洗细胞3次，加入1ml含有2μg/ml TPCK(苯甲磺酰-苯丙氨酸氯甲基酮)-胰蛋白酶和5×10⁷TCID₅₀的H1N1的流感病毒维持培养基，37℃，5％CO₂，饱和湿度下培养2小时。然后，吸出培养上清，以PBS洗细胞3次，加入流感病毒维持培养基，培养48小时。

5.提取流感病毒RNA：

吸取细胞培养上清，离心10分钟，3000转/分钟。取上清液，以

ViralRNA/DNA Kits(Life technology)试剂盒提取流感病毒RNA。

6.qRT-PCR检测流感病毒：

流感病毒RNA被反转录成cDNA，按Prime Script^TM RT Master kit(Takara，Biotechnology Co.，Ltd)试剂盒说明书操作。PCR引物序列如表3：

表3使用的引物

PCR反应条件为：95℃，2min，接下来为95℃，10s；55℃，10s；68℃，30s，共40个循环。每个实验组做3个复孔。

实验结果：

图4为转染了干扰质粒和空质粒后的MDCK细胞表达绿色荧光蛋白，从图4可以看出，空质粒PLKD-007和干扰质粒PLKD-NP-391分别转染MDCK细胞后，表达绿色荧光蛋白。

图5表现pLKD-NP-391干扰质粒抑制流感病毒的复制，从图5中可以看出，干扰质粒PLKD-NP-391显著抑制流感病毒在MDCK细胞中的复制。

实施例3

流感病毒干扰质粒pLKD-NP-391抑制流感病毒在小鼠体内的复制。

1.质粒大提：以爱思进生物技术(杭州)有限公司的AxyPrep无内毒素质粒大量试剂盒提取干扰质粒和空质粒。操作步骤按照公司提供的试剂盒说明书。

2.实验动物与分组：BALB/C小鼠，30只。雌性，6-8周龄。随机分为对照组，空质粒组和干扰质粒组，每组10只。

3.质粒转染动物：PLKD-NP-391和PLKD-007(空质粒)分别以氮/磷重量比为15:1的比例与PEI(聚醚酰亚胺)室温充分混合20分钟。以PARIBOY雾化器分别雾化PEI/PLKD-NP-391或PEI/PLKD-007复合物。气雾剂被排入一个封闭的装有10只小鼠的塑料盒中。在雾化盒中的小鼠每天接受剂量为2毫克的PEI/PLKD-NP-391或PEI/PLKD-007的气雾剂30分钟，连续3天。对照组小鼠不做任何处理。

4.以流感病毒感染动物：最后一次雾化吸入质粒气雾剂后24小时，以异氟烷麻醉各组小鼠，鼻内滴入50μl含有5×10⁶TCID₅₀的H1N1流感病毒。

5.提取流感病毒RNA：在小鼠感染流感病毒后48小时，将各组小鼠处死。取右肺肺叶，制作组织匀浆。以TRIzol(Life Technologies)试剂提取组织匀浆中的总RNA，操作步骤按照试剂盒说明书。

6.qRT-PCR检测流感病毒：流感病毒RNA被反转录成cDNA，按Prime Script^TM RTMaster kit(Takara，Biotechnology Co.，Ltd)试剂盒说明书操作。PCR引物序列如表4：

表4使用的引物

PCR反应条件为：95℃，2min，接下来为95℃，10s；55℃，10s；68℃，30s，共40个循环。

7.肺组织冰冻切片观察绿色荧光蛋白表达：切除各组小鼠的左肺叶，制作冰冻切片。在荧光显微镜下观察肺组织的荧光。

图6为绿色荧光蛋白在未转染质粒和转染了空质粒或干扰质粒的小鼠肺组织中的表达，从图6中可以看出，未转染质粒的对照组小鼠肺组织绿色荧光蛋白表达量极低，基本在基线水平，转染了空质粒和干扰质粒的小鼠肺组织绿色荧光蛋白表达量显著高于对照组。

图7为不同组小鼠肺组织冰冻切片中绿色荧光蛋白的表达，从图7中可以看出，空质粒组(B)和干扰质粒组(A)小鼠的肺组织中有绿色荧光蛋白表达，而对照组(C)小鼠肺组织中未见绿色荧光蛋白表达。

图8为干扰质粒pLKD-NP-391抑制小鼠肺组织中流感病毒的复制，从图8中可以看出，干扰质粒pLKD-NP-391可以明显地抑制小鼠肺组织中流感病毒的复制。

上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种抑制甲型流感病毒A/Shanghai/N33(2008)/H1N1复制的shRNA序列，其特征在于，shRNA序列为：GCTGGTCTGACTCACATAATG。

2.一种用于制备权利要求1所述shRNA序列的引物，其特征在于，引物序列如下：

上游引物序列NP-391-F：5’-CCGGGCTGGTCTGACTCACATAATGCTCGAGCATTATGTGAGTCAGACCAGCTTTTTTG-3’；

下游引物序列NP-391-R：5’-AATTCAAAAAAGCTGGTCTGACTCACATAATGCTCGAGCATTATGTGAGTCAGACCAGC-3’。

3.一种采用权利要求1所述shRNA序列制备的抑制甲型流感病毒A/Shanghai/N33(2008)/H1N1复制的质粒。

4.一种权利要求1所述shRNA序列在制备用于预防甲型流感病毒A/Shanghai/N33(2008)/H1N1感染药物中的用途，其特征在于：

根据human NP基因的转录本设计siRNA靶点，该靶点的序列为：GCTGGTCTGACTCACATAATG；

安排引物合成，所述引物序列如下：

上游引物序列NP-391-F：5’-CCGGGCTGGTCTGACTCACATAATGCTCGAGCATTATGTGAGTCAGACCAGCTTTTTTG-3’；

下游引物序列NP-391-R：5’-AATTCAAAAAAGCTGGTCTGACTCACATAATGCTCGAGCATTATGTGAGTCAGACCAGC-3’；

将单链的引物退火成双链oligo序列，连接入双酶切线性化的RNA干扰载体，替换掉原来的ccdB毒性基因；菌落PCR筛选转化子，筛选的阳性克隆进行测序验证；测序验证正确的克隆，进行高纯度质粒抽提。

5.按照权利要求4所述用途，其特征在于，具体步骤如下：

1)、干扰靶点设计和引物合成：

根据shRNA设计的一般原则，设计siRNA靶点，安排引物合成；

2)、引物退火形成带粘性末端的双链片段：

将合成好的oligo用oligo annealing buffer溶解成20μM，互补单链各取30μl混合；然后将oligo混合物在水浴锅中95℃加热5min，然后水浴锅开盖置室温中自然冷却至室温，形成双链oligo片段；取1μl用于后续的连接反应，其余-20℃保存；

3)、线性化表达载体的制备：

用限制性内切酶对表达载体进行酶切，酶切反应体系为：质粒2μg，10x反应Buffer 5μl，限制性内切酶各1μl，去离子水补足50μl，于37℃水浴锅中孵育2h以上；酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果，并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来，用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收，具体步骤参考试剂盒说明书；

4)、干扰片段连接入表达载体：

5)、感受态细胞的转化：

DH5α感受态细胞的转化；

6)、菌落PCR鉴定阳性转化子：

挑取平板上长出的转化子重悬于10μl LB培养液中，取1μl做模板进行菌落PCR鉴定；

7)、阳性克隆送测序：

菌落鉴定得到的阳性克隆，进行测序验证；用Vector NTI软件比对测序结果，对测序结果进行分析；

8)、质粒小提：

经测序验证正确的阳性克隆，命名为pLKD-NP-391，安排质粒小提，具体步骤见试剂盒说明书。

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