CN108315424A - 甲状腺结节良恶性相关基因的pcr特异性引物、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物、检测试剂盒及检测方法。本发明的甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物的序列具如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：54所示。本发明公开的甲状腺结节良恶性相关基因与良性甲状腺结节和恶性甲状腺结节的病例的病理指标密切相关，能够作为生物标志物对甲状腺结节患者进行甲状腺结节良恶性的分类，为临床个体化干预治疗提供有效依据。本发明的PCR特异性引物、检测试剂盒和检测方法，能够同时检测多个样本多个甲状腺结节良恶性相关基因，有效提高检测效率、准确率，同时降低了成本、简化了操作步骤。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物、检测试剂盒及检测方法。
背景技术
甲状腺癌是指原发于甲状腺的一种常见恶性肿瘤，占头颈部肿瘤发病率的首位，近年来发病率呈上升趋势。2012年研究发现，女性甲状腺癌发病率已经跃升至女性易发肿瘤的第五位，NCI的SSER数据库的资料显示，1975年甲状腺癌的发病率为4.04/10万人口，到了2007年发病率增至11.99/10万人口。
目前，普遍存在对甲状腺结节的过度治疗现象。据一份长春地区的甲状腺手术统计，9216例行手术治疗的甲状腺结节，恶性肿瘤仅占约10％，而结节性甲状腺肿和腺瘤等良性结节占90％左右，由于甲状腺结节的发现率可高达19％～67％，不应当也不可能对每一个甲状腺结节的患者都进行手术。但是由于大多数医院超声和细胞学诊断水平不高，术前无法区别良恶性质，以至于有的医生对所有甲状腺结节患者都进行手术，这样不仅浪费了大量的医疗资源，还会对患者机体的外观和功能等造成不同程度的损伤。
传统的检测甲状腺结节良恶性的常见方法有甲状腺超声检查、甲状腺细针穿刺活检、基于芯片的肿瘤标志物检测等。甲状腺超声检查和细针穿刺活检的特异性较差，在区分滤泡状甲状腺瘤和滤泡状甲状腺癌时可能会导致错误判断，准确率不高，导致大量的不必要地被当作恶性疾病治疗的案例。基于芯片的肿瘤标志物检测主要是由芯片提供商提供芯片，存在技术成本高、操作复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析范围较狭窄、芯片需要特殊定制等问题。因此，现有技术还有待提高。
发明内容
基于此，有必要提供一种准确率高、使用方便的甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物、检测试剂盒及检测方法。
一种甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物，包括如下至少一个基因的扩增引物对：序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的BRAF基因的扩增引物对，序列如SEQID NO.3和SEQ ID NO.4所示的CSF1R基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示的DDR2基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的、或如SEQID NO.9和SEQ ID NO.10所示的、或如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的EGFR基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的EIF1AX基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的ERBB2基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.17和SEQID NO.18所示的FGFR3基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的GNA11基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的GNAS基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的HRAS基因的扩增引物对，序列如SEQ IDNO.25和SEQ ID NO.26所示的JAK3基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.27和SEQ IDNO.28所示的KIT基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的或如SEQID NO.31和SEQ ID NO.32所示的KRAS基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.33和SEQ IDNO.34所示的MAP2K1基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示的MET基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示的MLH1基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示的NOTCH1基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.42所示的NRAS基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.44所示的PIK3CA基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示的PTEN基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示的STK11基因的扩增引物对，序列如SEQID NO.49和SEQ ID NO.50所示的TERT基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.51和SEQ IDNO.52所示的TSHR基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54所示的TP53基因的扩增引物对。
在其中一个实施例中，所述甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物包括如下五组扩增引物对中的至少一组：
第一组包括如下基因的扩增引物对：EGFR基因、ERBB2基因、BRAF基因、HRAS基因、MET基因、GNA11基因及TERT基因；
第二组包括如下基因的扩增引物对：EGFR基因、ERBB2基因、BRAF基因、HRAS基因、NOTCH1基因、GNAS基因及TERT基因；
第三组包括如下基因的扩增引物对：EGFR基因、GNA11基因、NRAS基因、GNAS基因、KRAS基因、PTEN基因、NOTCH1基因、MET基因、BRAF基因、JAK3基因、KIT基因、HRAS基因及TERT基因；
第四组包括如下基因的扩增引物对：EGFR基因、GNA11基因、NRAS基因、GNAS基因、KRAS基因、ERBB2基因、EIF1AX基因、NOTCH1基因、MET基因、BRAF基因、JAK3基因、KIT基因及TERT基因；
第五组包括如下基因的扩增引物对：BRAF基因、EGFR基因、EIF1AX基因、ERBB2基因、FGFR3基因、GNA11基因、GNAS基因、JAK3基因、KIT基因、KRAS基因、MET基因、NOTCH1基因、NRAS基因、TERT基因、TP53基因及TSHR基因。
在其中一个实施例中，所述扩增引物对的引物经过硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰及5’反向dT修饰中的一种或多种修饰。
在其中一个实施例中，所述扩增引物对的Tm值为58℃～62℃。
在其中一个实施例中，所述扩增引物对的两条引物的5’端分别连接有长度为50～70bp的用于与通用引物完全互补的序列片段或与通用引物的3’端的部分序列互补的序列片段。
在其中一个实施例中，所述通用引物的序列如SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56所示。
一种甲状腺结节良恶性相关基因的检测试剂盒，包括上述任一实施例所述的甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物。
在其中一个实施例中，所述检测试剂盒还包括DNA提取试剂、PCR扩增缓冲液、通用引物对、DNA聚合酶及无核酸水中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述甲状腺结节良恶性相关基因的检测试剂盒还包括序列已知的人正常基因组DNA的质控品。
一种甲状腺结节良恶性相关基因的检测方法，包括如下步骤：
提取待测甲状腺结节样本的DNA；
使用上述任一实施例所述的甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物或上述任一实施例所述的甲状腺结节良恶性相关基因的检测试剂盒对提取的DNA样本进行PCR扩增；
对PCR扩增的产物进行测序分析。
在其中一个实施例中，是使用磁珠法提取待测甲状腺结节样本的DNA。
在其中一个实施例中，还包括对提取的待测甲状腺结节样本的DNA进行浓度和纯度测定的步骤，以及对PCR扩增的产物进行纯化和浓度测定的步骤。
在其中一个实施例中，所述PCR扩增的反应体系为：
所述酶混合物包括：高保真DNA聚合酶(终浓度为1.25U/反应)、PCR缓冲液(成分为50mM KCl、1.5mM MgCl2、10mM Tris-HCl，pH为8.3，用量为1×)、dNTP混合物(用量为200μM/种/反应)等。
在其中一个实施例中，所述PCR扩增的反应程序为：
98℃，激活20min；循环1次；98℃变性15s，65℃退火60min，72℃延伸60s，共6个循环；98℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸60s，共2个循环；98℃变性15s，72℃延伸60s，共28个循环；72℃延伸10min。
在其中一个实施例中，PCR扩增的目标区域可来源于同一个甲状腺结节良恶性相关基因，也可来源于不同的甲状腺结节良恶性相关基因，可以是但不限于甲状腺结节良恶性相关基因上的内部序列、基因的外部调控序列。所述基因内部序列，包括但不限于基因的内含子区域、外显子区域、同时含有内含子与外显子的区域。
进一步的，待测甲状腺结节样本可以是离体的外周血样品、细针穿刺活检样品或石蜡组织样品。
在其中一个实施例中，所述测序分析是使用Illumina公司的高通量测序平台对PCR扩增产物进行测序，再用统计学处理测序结果，对甲状腺结节良恶性相关基因的突变情况进行分析，分析结果可作为中间结果为临床诊断甲状腺结节良恶性提供辅助，可进一步结合其他结果验证是否患有甲状腺肿瘤。
所述高通量测序平台可以是但不限于Illumina HiSeq/MiSeq、Life IonTorrent/Proton平台或华大基因BGISEQ-500/50等测序平台。
现阶段对甲状腺结节良恶性的常见检测方法为甲状腺超声检查、甲状腺细针穿刺活检等，这些方法特异性较差，在区分滤泡状甲状腺瘤和滤泡状甲状腺癌时可能会导致错误结果，导致大量的不必要地被当作恶性疾病治疗，而且随着甲状腺超声检查的普及，甲状腺结节的发现率越来越高，提高检测水平或者使用新的有效的检测方法，避免不必要的手术显得尤为重要。本发明自主研发的基于高通量测序技术的针对甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物、检测试剂盒和检测方法中涉及的甲状腺结节良恶性相关基因已经过样本验证，可用于辅助检测甲状腺结节良恶性，检测结果可作为中间结果配合其他检测结果一起来判断是否患有甲状腺癌等疾病，有利于提高诊断甲状腺结节良恶性分型的准确率，有效避免甲状腺结节的过度治疗现象。
进一步，本发明通过对不同的甲状腺结节良恶性相关基因进行分析研究，并充分考虑检测时的敏感性和特异性，在对测序结果分析时，可以将多种不同的甲状腺结节良恶性相关基因的测序结果进行分组分析，相应地的，该PCR特异性引物需要至少含有多组基因组合中的至少一种组合所包括的扩增引物对。具体地，为权衡敏感性和特异性，第一组基因组合充分考虑了与恶性甲状腺结节相关的基因，选取的基因数量较少，但选取的基因与恶性甲状腺结节高度相关，可以提高检测的敏感性，配合其他检测结果，准确性更高，虽然相对的特异性可能会下降，但是由于恶性甲状腺结节在早期通过手术可以有效治愈，因此分组选取的第一组基因可以有效防止漏检。特别是其中的BRAF基因和TERT基因，其突变而导致的甲状腺结节被最终诊断为可疑恶性肿瘤或恶性肿瘤的概率非常高，因此，BRAF基因和TERT基因在五个组合中均有设置。第二组到第五组在第一组的基础上进一步优化更改并增加了部分基因，在保证敏感性不会显著降低的前提下，可以提高特异性，减少将良性甲状腺结节归类为恶性的概率，进一步有利于减少不必要的甲状腺结节手术。同时由于不同基因突变在不同样本中的检出率不一致，本发明通过五组不完全相同的基因，可以提高样本的检出率。
本发明提供的PCR特异性引物是针对甲状腺结节良恶性相关基因的热点突变设计的引物，结构稳定，检测位点多，能够用一次PCR扩增反应捕获和扩增多个样本多个甲状腺结节良恶性相关基因，包括点突变、短片段插入缺失等体细胞突变，有效提高检测效率和准确率，同时具有降低成本、简化操作步骤等优点。
本发明的检测方法可以进一步采用磁珠纯化核酸的方式，省去了传统建库中的离心柱式纯化，操作简单；其次，本发明针对高通量测序技术设计的引物只需要一轮PCR，通过选取温度梯度、时间梯度、循环数，经过大量正交实验，优化PCR反应程序，将样品传统建库的两次扩增融合在一个PCR反应体系进行，且本发明所用的特异性引物直接在目标基因链中捕获目标区域并进行扩增，不需要对目标基因进行截断修饰等处理，节省了检测时间和成本。
并且，本发明利用高通量基因测序技术突破传统检测技术的限制，提高了检测灵敏度，即使是低丰度的突变基因也可检测出来，进而评估甲状腺结节的良恶性，准确对甲状腺结节进行分类，可以减少不必要的手术。
附图说明
图1为目标基因建库PCR扩增的原理示意图。
图2为检测甲状腺结节良恶性相关基因的检测方法流程示意图。
图3为引物特异性验证结果图，从左至右的各泳道中的条带依次为M、N、P、1至9，其中，M：Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-3：1-3号外周血样品验证；4-6：4-6号细针穿刺样品验证；7-9：7-9号石蜡组织样品验证。
图4为引物灵敏度验证结果图，从左至右的各泳道中的条带依次为M、N、P、1至9，其中，M：Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-3：1号外周血样品三种模板浓度灵敏度验证；4-6：4号细针穿刺细胞样品三种模板浓度灵敏度验证；7-9：7号石蜡组织样品三种模板浓度灵敏度验证。
图5为引物重复性验证结果，从左至右的各泳道中的条带依次为M、N、P、1至9，其中，M：Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-3：实验员A检测2号外周血样品、5号细针穿刺组织样品、8号石蜡组织样品验证结果；4-6：实验员B检测2号外周血样品、5号细针穿刺组织样品、8号石蜡组织样品验证结果；7-9：实验员C检测2号外周血样品、5号细针穿刺组织样品、8号石蜡组织样品验证结果。
图6为引物浓度优化验证结果，从左至右的各泳道中的条带依次为M、N、P、1至18，其中，M：Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-18：3号外周血样品、6号细针穿刺细胞样品、9号石蜡组织样品分别检测引物0.2μM/0.2nM、0.4μM/0.2nM、0.2μM/1nM、0.4μM/1nM、0.2μM/2nM、0.4μM/2nM六组组合共18个验证结果。
图7为PCR反应条件优化验证结果，从左至右的各泳道中的条带依次为M、N、P、1至18，其中，M：Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-18：3号外周血样品、6号细针穿刺细胞样品、9号石蜡组织样品分别检测酶激活时间/退火温度10min/55℃、20min/55℃、10min/60℃、20min/60℃、10min/65℃、20min/65℃六组组合共18个验证结果。
图8为甲状腺结节良恶性相关基因的检测试剂盒适用样品验证中所用样品的基因组电泳图，从左至右的各泳道中的条带依次为M、1、2、3、4、5、6、7、8、9，其中，M：Marker；1-3：10-12号外周血样品基因组条带；4-6：13-15号细针穿刺组织样品基因组条带；7-9：16-18号石蜡组织样品基因组条带。
图9为甲状腺结节良恶性相关基因的检测试剂盒适用样品验证结果，从左至右的各泳道中的条带依次为M、N、P、1、2、3、4、5、6、7、8、9，其中，M：Marker；N：阴性对照；P：阳性对照；1-3：10-12号外周血样品验证结果；4-6：13-15号细针穿刺组织样品验证结果；7-9：16-18号石蜡组织样品验证结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1一种基于高通量测序技术的甲状腺结节良恶性相关基因的多重PCR特异性引物、检测试剂盒及检测方法
1、引物的设计
本实施例涉及的甲状腺结节良恶性相关基因序列选自于UCSC(University ofCalifornia Santa Cruz，加州大学圣克鲁兹分校)数据库，依据相关基因序列进行热点突变引物设计，设计范围包含了甲状腺结节良恶性相关基因中的突变热点。
如图1所示，本实施例对甲状腺结节良恶性相关基因的热点突变进行的引物设计共27对，每对PCR特异性引物扩增目标区域大小为100-150bp，扩增产物大小为250-300bp，覆盖范围广、结构稳定、检测位点多。
具体地，27对扩增引物对为如下表1中24个基因的扩增引物对：
表1
在本实施例中，扩增引物对的两条引物的5’端分别连接有长度为50～70bp的用于与通用引物完全互补的序列片段或与通用引物的3’端的部分序列互补的序列片段。通用引物对的两条引物的序列如SEQ ID NO.55(5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’)和SEQ ID NO.56(5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACATCACGATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’)所示。
本实施例的PCR特异引物设计时引进特异性修饰，修饰后的引物不易被核酸酶降解，且具有相对均一的Tm值，统一设计为60℃左右(±2℃)。本实施例的特异性引物在多重扩增时表现出很好的特异性、稳定性及均一性，同时不存在非特异扩增。具体地，引物特异修饰方法为硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰、5’反向dT修饰中的一种或几种。硫代修饰后的引物序列寡核苷酸链上带双键的氧原子被硫原子取代的衍生物，能够抵抗核酸酶的降解，增强引物稳定性；脱氧尿嘧啶修饰后的引物寡核苷酸序列中每个脱氧胸腺嘧啶被脱氧尿嘧啶替代，可以增长双链溶解温度1.7℃，从而增加双链的稳定性；5’反向dT修饰后的引物寡核苷酸序列5’末端含有反向dT，从而形成交联，形成的交联可以抑制在DNA聚合酶延伸过程中的外切核酸酶的降解作用。
进一步，本实施例的PCR特异性引物在确保PCR扩增特异性的同时还能保证其扩增效率。
2、甲状腺结节良恶性相关基因的检测试剂盒
本实施例的甲状腺结节良恶性相关基因的检测试剂盒，主要包括：
上述PCR特异性引物：用于扩增待测样品核酸中的多个目标区域，扩增范围至少覆盖目标基因的热点突变区域。优选的，多种扩增引物对混合在一起构成引物混合物。
通用引物：用于在文库构建过程中，对特异引物扩增目标区域的扩增产物进行再次扩增，对不同待测样品的测序文库进行标记，进而区分不同样品，序列如SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56所示。
PCR反应液：包括酶混合物、无核酸酶水。其中，酶混合物包括高保真DNA聚合酶(用量为1.25U/反应)、PCR Buffer(成分为50mM KCl、1.5mM MgCl2、10mM Tris-HCl，pH为8.3，用量为1×)、dNTP混合物(用量为200μM/种/反应)。
质控品：人正常基因组DNA，来源于正常人全血样本。
3、基于高通量测序技术甲状腺结节良恶性相关基因的检测方法
如图2所示，本实施例的检测方法包括以下步骤：
步骤S11：利用纳米级超顺磁性羧基磁珠在不同盐浓度及疏水环境下与核酸分子可逆吸附的原理，特异吸附核酸分子，通过后续地洗涤及洗脱步骤，获得高纯度的核酸样本，使用Qubit或NanoDrop进行浓度及纯度的测定，根据测定的核酸样本浓度结果，使用10mM Tris将核酸样本稀释至50-250ng/μL，优选的50-100ng/μL作为扩增建库的起始浓度。使用1％琼脂糖凝胶电泳40min，对稀释后核酸的质量进行评估，根据琼脂糖凝胶电泳结果的均一性及完整性判断提取核酸的质量，核酸完整性好或发生轻微降解不影响建库效果。所提取的核酸浓度、纯度测定及1％琼脂糖凝胶电泳检测合格后入组并分别进行标记。所述样本合格的标准为核酸浓度＞50ng/μL，OD260/OD280＝1.7-2.0，1％琼脂糖凝胶电泳检测样品条带完整、均一，无明显拖尾。
步骤S12：用本实施例的PCR特异性引物或试剂盒对S11中待测样品核酸中的易感基因目标区域进行一次PCR扩增，收集扩增产物，扩增产物片段长度为特异引物扩增片段与通用引物之和。
PCR扩增的反应体系为：特异引物混合物2μL、通用引物2μL、模板/质控品200ng、酶混合物12.5μL、无核酸酶水将体积补足至25μL。
PCR扩增的反应程序为：
98℃，激活20min；循环1次；98℃变性15s，65℃退火60min，72℃延伸60s，共6个循环；98℃变性15s，65℃退火30s，72℃延伸60s，共2个循环；98℃变性15s，72℃延伸60s，共28个循环；72℃延伸10min。
当待测甲状腺结节良恶性相关基因有多个时，同一待测样品的不同甲状腺结节良恶性相关基因的扩增可同时进行或部分同时进行。在具体的实验过程中，可根据需要选用上述任一种基因组合的方案进行。若分别进行扩增时，需要保证用于构建测序文库的扩增产物的量是一致的。当待测样品有多个时，不同样品的甲状腺结节良恶性相关基因的扩增必须分别进行。
步骤S13：利用纯化磁珠分别对各样品的建库产物进行纯化，去除PCR产物中剩余的引物及dNTP等，回收扩增产物，进行浓度、纯度测定及1％琼脂糖凝胶电泳检测样品质量，所述样本合格的标准为核酸浓度＞2ng/μL，OD260/OD280＝1.7-2.0，1％琼脂糖凝胶电泳检测样品条带完整、均一，无明显拖尾。将所有合格核酸样品(不超过96个)浓度分别稀释至2nmol/L，并等体积混样，统一上机测序。
对照试验：
阳性对照反应体系包括：特异引物混合物2μL；通用引物2μL；酶混合物12.5μL；质控品200ng；无核酸酶水将体积补足至25μL。阳性对照用于检查反应体系的扩增能力是否正常和样本是否异常。
阴性对照反应体系包括：特异引物混合物2μL；通用引物2μL；酶混合物12.5μL；无核酸酶水将体积补足至25μL。阴性对照用于检查反应体系是否存在核酸物质污染。
阳性对照和阴性对照的反应程序同步骤S12的扩增反应程序。
实施例2引物特异性验证
利用实施例1中步骤S11方法从外周血样品(编号：1-3)、细针穿刺样品(编号：4-6)、石蜡组织样品(编号：7-9)中提取核酸，进行浓度、纯度测定后，取合格样品使用10mMTris将每例样品稀释至100ng/μL，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测每例样品质量(合格标准同实施例1中步骤S11)，合格后入组并分别进行标记。利用实施例1中步骤S12方法对上述9例合格样本进行扩增，上样量为各2μL，扩增后产物纯化后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(合格标准同实施例1中步骤S13步骤)，9例样本使用甲状腺结节良恶性相关基因特异引物扩增及检测方法进行检测。对照试验同实施例1，检测方法与样本检测方法相同。
检测结果见图3，检测结果表明，阴性对照除残留引物外，无任何非特异条带，说明反应体系是无污染；阳性对照条带明亮，大小正确，说明反应体系的扩增能力正常。9例样本最终扩增产物主要集中在300bp，无其他非特异性条带，与预期设计相符，同时引物二聚体含量极少，且引物二聚体大小与扩增目标片段差异明显。由此可以看出，本实施例的PCR特异性扩增引物及检测方法能突破传统方法产生大量引物二聚体的限制，增强了引物特异性。
实施例3引物检测灵敏度验证
利用实施例1中步骤S11方法从质检合格的外周血样品(编号：1)、细针穿刺样品(编号：4)、石蜡组织样品(编号：7)提取样品核酸进行引物检测灵敏度验证。每例样品起始浓度为100ng/μL，按照5倍、10倍、20倍浓度梯度稀释，稀释后每例样品浓度分别为20ng/μL、10ng/μL和5ng/μL，并分别进行样品名称及浓度标记。利用实施例1中步骤S12方法对上述9例合格稀释样本进行扩增，上样量为各2μL，9例样本使用甲状腺结节良恶性相关基因特异引物扩增及检测方法进行检测。对照试验同实施例1，检测方法与样本检测方法相同。
检测结果见图4，检测结果表明，阴性对照除残留引物外，无任何非特异条带，说明反应体系是无污染；阳性对照条带明亮，大小正确，说明反应体系的扩增能力正常。9例样本最终扩增产物主要集中在300bp，无其他非特异性条带，与预期设计相符，引物二聚体含量极少，且引物二聚体大小与扩增目标片段差异明显，易分辨。同时，即使模板含量低至10ng，依然能够成功扩增出目标条带，由此可以看出，本实施例的PCR特异性扩增引物及检测方法能突破传统方法的限制，提高了检测灵敏度。
实施例4引物检测重复性验证
利用实施例1中步骤S11方法从质检合格的全血样品(编号：2)、细针穿刺组织(编号：5)、石蜡组织样品(编号：8)提取样品核酸进行引物检测重复性验证。由3名不同的操作员在3个不同的实验室平台按照实施例1中步骤S12方法对上述3例样品分别进行扩增，上样量为各2μL，3例样本使用甲状腺结节良恶性相关基因特异引物由不同操作员在不同实验室得到的9个扩增及检测方法进行检测。对照试验同实施例1，检测方法与样本检测方法相同。
检测结果见图5，检测结果表明，阴性对照除残留引物外，无任何非特异条带，说明反应体系是无污染；阳性对照条带明亮，大小正确，说明反应体系的扩增能力正常。3例样品共9个最终扩增产物主要集中在300bp，无其他非特异性条带，与预期设计相符，同时引物二聚体含量极少，且引物二聚体大小与扩增目标片段差异明显。同时，不同的操作员及不同的实验平台检测结果无明显差异。由此可以看出，本实施例的PCR特异性扩增引物及检测方法重复性好。
实施例5引物浓度优化验证
利用实施例1中步骤S11方法从质检合格的全血样品(编号：3)、细针穿刺组织(编号：6)、石蜡组织样品(编号：9)提取样品核酸稀释至100ng/μL后进行引物浓度优化验证。利用实施例1中步骤S12方法对上述3例合格样本进行扩增，根据特异引物与通用引物在扩增体系中的循环数的不同，设置特异引物浓度为0.2nM、1nM、2nM，设置通用引物浓度为0.2μM、0.4μM。核酸样品上样量为各2μL，扩增后产物纯化后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(合格标准同实施例1中步骤S13步骤)，3例样本使用不同浓度的特异、通用引物扩增及检测方法进行检测。对照试验同实施例1，检测方法与样本检测方法相同。
检测结果见图6，检测结果表明，阴性对照除残留引物外，无任何非特异条带，说明反应体系是无污染；阳性对照条带明亮，大小正确，说明反应体系的扩增能力正常。3例样品检测结果一致，特异引物为0.2nM时，最终扩增产物主要集中在300bp，无其他非特异性条带，与预期设计相符，同时引物二聚体含量极少，而特异引物为1和2nM时，引物二聚体含量显著增加。通用引物浓度为0.2μM或0.4μM对扩增效果影响不明显。根据扩增效果与成本考虑，本实施例的PCR特异引物浓度优选地为0.2nM、通用引物为0.2μM。
实施例6PCR反应条件优化验证
利用实施例1中步骤S11方法从质检合格的全血样品(编号：3)、细针穿刺组织(编号：6)、石蜡组织样品(编号：9)提取样品核酸稀释至100ng/μL后进行PCR反应条件优化验证。利用实施例1中步骤S12方法对上述3例合格样本进行扩增，根据酶激活时间及PCR退火温度对PCR效果的影响显著，设置酶激活时间为10min，20min，设置PCR退火温度为55℃、60℃、65℃。核酸样品上样量为各2μL，扩增后产物纯化后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测(合格标准同实施例1中步骤S13步骤)，3例样本使用不同酶激活时间及PCR退火温度进行检测。对照试验同实施例1，检测方法与样本检测方法相同。
检测结果见图7，检测结果表明，阴性对照除残留引物外，无任何非特异条带，说明反应体系是无污染；阳性对照条带明亮，大小正确，说明反应体系的扩增能力正常。3例样品检测结果一致，酶激活时间为20min、退火温度为65℃时，最终扩增产物主要集中在300bp，无其他非特异性条带，与预期设计相符，同时引物二聚体含量极少，效果最优。而10min酶激活时间明显扩增效率低，60℃和55℃的退火温度引物特异性差，二聚体明显增多。根据扩增效果与成本考虑，本实施例的PCR反应酶激活时间为20min、PCR退火温度为65℃。
实施例7甲状腺结节良恶性相关基因的检测试剂盒适用样品验证
利用实施例1中步骤S11方法从外周血样本(编号：10-12)、细针穿刺样本(编号：13-15)、石蜡组织样本(编号：16-18)中提取核酸，进行浓度、纯度测定后，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测每例样本质量，电泳结果见图8，电泳显示外周血样本(编号：10-12)基因组条带完好，细针穿刺样本(编号：13-15)基因组条带显示有部分降解，而石蜡组织样本(编号：16-18)基因组条带显示均有严重的降解。利用实施例1中步骤S12方法对上述9例样本进行扩增，上样量为各2μL，扩增后产物纯化后进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。9例样本使用甲状腺结节良恶性相关基因特异引物扩增及检测方法进行检测。对照试验同实施例1，检测方法与样本检测方法相同。
检测结果见图9，电泳检测结果显明，阴性对照除残留引物外，无任何非特异条带，说明反应体系是无污染；阳性对照条带明亮，大小正确，说明反应体系的扩增能力正常。9例样本最终扩增产物主要集中在300bp，其中外周血样本和细针穿刺样本的扩增产物无其他非特异性条带，与预期设计相符，同时，基因组严重降解的石蜡组织样本也可以扩增出条带，尽管扩增产物有部分拖尾。由此可以看出，本实施例的甲状腺结节良恶性相关基因的检测试剂盒可检测的样本类型广，对于降解严重的石蜡组织样本也可以扩增出目标条带，这主要是我们考虑到了样本的降解情况，将引物扩增目标区域大小设计为100-150bp，这有利于引物捕获短片段，提高样本的建库成功率，能充分利用珍贵的样本或保存较长时间的石蜡组织样本中的基因组信息。
实施例8甲状腺结节良恶性相关基因的验证
步骤S81：临床样本收集和临床资料整理
选择2016年3月至2017年8月于广东省人民医院进行甲状腺结节细针穿刺(FNA)的191例患者(本研究经广东省人民医院伦理委员会批准，且征得所有患者知情同意)，共有219枚结节，记录这些患者的彩超病理结果，对这些结节的细针穿刺样本进行收集，进行细胞病理检查并记录结果。其中男性54例共64结节，女性137例共155结节，年龄20-69岁，平均年龄为45岁。FNA标本结果按照中国2010年发布的甲状腺病理细胞学Bethesda报告系统(TBSRTC)6个诊断标准判定，包括Ⅰ类标本无法判断或不满意(40枚)；Ⅱ类良性(68枚)；Ⅲ类意义不明的细胞非典型性病变(36枚)；Ⅳ类滤泡性肿瘤或可疑滤泡性肿瘤(10枚)；Ⅴ类可疑恶性肿瘤(37枚)；Ⅵ类恶性肿瘤(28枚)。
步骤S82：验证样本的筛选
从步骤S81收集的临床甲状腺结节细针穿刺样本中的Ⅱ类良性样本和Ⅴ类可疑恶性肿瘤样本中使用计算机随机选取50例。整理随机选取的样本的详细病理资料，整理结果显示Ⅱ类良性样本有26例，年龄39～61岁，Ⅴ类可疑恶性肿瘤样本有24例，年龄35～66岁。
步骤S83：甲状腺结节样本的DNA提取
参照广州奇辉生物科技有限公司商品化的细胞DNA提取试剂盒(cat.no.M1603S)说明书提取各甲状腺结节样本中的DNA，将提取的DNA置于-20℃冰箱中保存待用。
步骤S84：测序样本文库构建
按照实施例1中基于高通量测序技术检测甲状腺结节良恶性相关基因的方法进行测序样本文库构建。
步骤S85：对样本文库进行测序
使用illumina公司的Hiseq X高通量测序平台对样本文库进行测序，测序读长为150bp*2，测序结果要求平均测序深度大于100达95％，对不合格样本进行重测序。
步骤S86：测序结果分析
对测序结果序列进行BWA(version 0.7.12)比对，samtools(version 0.1.19)转换sam文件为bam文件，freebayes(version 1.1.0)进行突变分析，结合甲状腺结节良恶性相关基因组合，判断每个甲状腺结节样本的良恶性。依据判断的结果和验证样本的临床病例资料，应用统计学得出5组基因组合的敏感性和特异性分析，如表2所示，证明这五种基因组合可用于甲状腺结节良恶性的诊断中，其中组合1准确性最低为79％，最高为组合5，达到了86％的准确性。
表2
| 基因组合 | 敏感性 | 特异性 | 阳性预测 | 阴性预测 | 准确性 |
| 组合1 | 97％ | 49％ | 0.76 | 0.90 | 0.79 |
| 组合2 | 77％ | 95％ | 0.96 | 0.71 | 0.84 |
| 组合3 | 81％ | 95％ | 0.96 | 0.74 | 0.86 |
| 组合4 | 81％ | 92％ | 0.94 | 0.74 | 0.85 |
| 组合5 | 85％ | 86％ | 0.91 | 0.78 | 0.86 |
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广东省人民医院（广东省医学科学院）
广州奇辉生物科技有限公司
<120> 甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物、检测试剂盒及检测方法
<160> 56
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agcctcaatt cttaccatcc aca 23
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atttcttcat gaagacctca cagt 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtttgtggga ggggagagtg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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gtaacgtagg gtgtgccgtc 20
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<212> DNA
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
tacctcgctt agtgctccct 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
atctactggg acggaacagc 20
<210> 55
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58
<210> 56
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gatcggaaga gcacacgtct gaactccagt cacatcacga tctcgtatgc cgtcttctgc 60
ttg 63
Claims (10)
1.一种甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物，其特征在于，包括如下至少一个基因的扩增引物对：序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的BRAF基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的CSF1R基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的DDR2基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示的、或如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的、或如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的EGFR基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的EIF1AX基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示的ERBB2基因的扩增引物对，序列如SEQ IDNO.17和SEQ ID NO.18所示的FGFR3基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.19和SEQ IDNO.20所示的GNA11基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的GNAS基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的HRAS基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26所示的JAK3基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28所示的KIT基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30所示的或如SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32所示的KRAS基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34所示的MAP2K1基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.36所示的MET基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.38所示的MLH1基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.40所示的NOTCH1基因的扩增引物对，序列如SEQID NO.41和SEQ ID NO.42所示的NRAS基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.43和SEQ IDNO.44所示的PIK3CA基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.45和SEQ ID NO.46所示的PTEN基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示的STK11基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50所示的TERT基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.51和SEQ ID NO.52所示的TSHR基因的扩增引物对，序列如SEQ ID NO.53和SEQ ID NO.54所示的TP53基因的扩增引物对。
2.如权利要求1所述的甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物，其特征在于，包括如下五组扩增引物对中的至少一组：
第一组包括如下基因的扩增引物对：EGFR基因、ERBB2基因、BRAF基因、HRAS基因、MET基因、GNA11基因及TERT基因；
第二组包括如下基因的扩增引物对：EGFR基因、ERBB2基因、BRAF基因、HRAS基因、NOTCH1基因、GNAS基因及TERT基因；
第三组包括如下基因的扩增引物对：EGFR基因、GNA11基因、NRAS基因、GNAS基因、KRAS基因、PTEN基因、NOTCH1基因、MET基因、BRAF基因、JAK3基因、KIT基因、HRAS基因及TERT基因；
第四组包括如下基因的扩增引物对：EGFR基因、GNA11基因、NRAS基因、GNAS基因、KRAS基因、ERBB2基因、EIF1AX基因、NOTCH1基因、MET基因、BRAF基因、JAK3基因、KIT基因及TERT基因；
第五组包括如下基因的扩增引物对：BRAF基因、EGFR基因、EIF1AX基因、ERBB2基因、FGFR3基因、GNA11基因、GNAS基因、JAK3基因、KIT基因、KRAS基因、MET基因、NOTCH1基因、NRAS基因、TERT基因、TP53基因及TSHR基因。
3.如权利要求1或2所述的甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物，其特征在于，所述扩增引物对的引物经过硫代修饰、脱氧尿嘧啶修饰及5’反向dT修饰中的一种或多种修饰。
4.如权利要求1或2所述的甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物，其特征在于，所述扩增引物对的Tm值为58℃～62℃。
5.如权利要求1或2所述的甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物，其特征在于，所述扩增引物对的两条引物的5’端分别连接有长度为50～70bp的用于与通用引物完全互补的序列片段或与通用引物的3’端的部分序列互补的序列片段。
6.如权利要求5所述的甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物，其特征在于，所述通用引物的序列如SEQ ID NO.55和SEQ ID NO.56所示。
7.一种甲状腺结节良恶性相关基因的检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～6中任一项所述的甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物。
8.如权利要求7所述的甲状腺结节良恶性相关基因的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括DNA提取试剂、PCR扩增缓冲液、通用引物对、DNA聚合酶及无核酸水中的至少一种。
9.如权利要求8所述的甲状腺结节良恶性相关基因的检测试剂盒，其特征在于，还包括序列已知的人正常基因组DNA的质控品。
10.一种甲状腺结节良恶性相关基因的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
提取待测甲状腺结节样本的DNA；
使用如权利要求1～6中任一项所述的甲状腺结节良恶性相关基因的PCR特异性引物或如权利要求7～9中任一项所述的甲状腺结节良恶性相关基因的检测试剂盒对提取的DNA样本进行PCR扩增；
对PCR扩增的产物进行测序分析。
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