CN106555011A - 基因检测或基因分型的组合物及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测和/或基因分型的组合物及方法。具体而言，本发明涉及一种基因检测和/或基因分型的组合物及利用该组合物进行基因检测和/或基因分型的方法，具体涉及一种利用Argonaute酶和定位引物进行基因检测或基因分型的组合物及利用该组合物进行基因检测或基因分型的方法。本发明的组合物和方法克服了多重PCR、限制酶图谱等现有技术的缺陷，可以快速、简便地进行基因检测或基因分型。
Description
技术领域
本发明涉及一种基因检测或基因分型的组合物及利用该组合物进行基因检测或基因分型的方法，具体涉及一种利用Argonaute酶和定位引物进行基因检测或基因分型的组合物及利用该组合物进行基因检测或基因分型的方法。
背景技术
多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一个PCR反应体系里加上2对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理、反应试剂和操作过程与一般PCR相同。目前该技术已广泛应用于生物技术、检疫和医学检测等领域。然而，由于多重PCR的工作原理是在同一PCR反应体系里加入多对引物同时扩增多个DNA片段，因此同一反应体系中的多对引物易发生相互作用，如形成发卡结构、二聚体结构等。通常，多重PCR反应体系中多重引物的浓度较低，因为引物对和引物量越多，引物之间的相互作用就越明显，从而影响PCR的扩增效率。为此，在基于多重PCR的基因检测设计中，往往需要使用多管多体系检测，以降低单管的引物数量，减少多重引物复杂性对检测结果的影响。
而在产物分析方法中，每管检测不同类型的基因，产物片段大小存在明显差异，依据扩增产物所在反应管位置及片段大小来判断基因类型。这导致了该类检测方法复杂、繁琐，对操作人员的专业要求较高，难以推广。
除了多重PCR方法，本领域还有一种限制酶图谱(restriction map)分析方法：同一DNA用不同的限制酶进行切割，依据酶切片段的大小选择不同浓度的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶作为支持物进行电泳，同时加入标准DNA作为分子量参照物，经溴乙锭(EB)或硝酸银染色，在相应的光源下观察结果并拍摄记录电泳图谱，由此建立的位点图谱有助于对DNA的结构进行分析。限制性核酸内切酶分析技术是病原变异、毒株鉴别、分型及了解基因结构和进行流行病学研究的有效方法，对动物检疫有很重要的实用意义，尤其对区别进出境动物及动物产品携带的病毒是疫苗毒还是野毒，以及推论其是本地毒还是外来毒有很重要的意义。然而，限制性内切酶分析方法受限于限制性内切酶的数量是有限的，并且不同的限制性内切酶的反应条件也存在差异，这导致该分析方法的应用范围具有非常大的局限性。
Argonaute是迄今为止已鉴定出的若干个与RNAi有关的蛋白因子之一。在果蝇(Drosophila melanogaster)RNA诱导的沉默复合物(RISC)中，已知存在着称为Argonaute2(AGO2)的因子。AGO2蛋白的表达受到抑制时，RNAi效应缺失，也就是说AGO2是果蝇RNAi机制的必需因子。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性(slicer activity)，RNAi机制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主导。通过对RNA沉默机制的研究，人们发现了由不同的小RNA介导的RNA沉默通路，并鉴定了一系列参与RNA沉默通路的关键蛋白。其中，RISC核心成分Argonaute蛋白日益成为人们研究的焦点。研究发现在原核生物中不仅存在RNA干扰，还存在着DNA介导的DNA沉默现象。2014年1月，PNAS杂志发表题为“Structure-based cleavage mechanism of Thermus thermophilus Argonaute DNA guide strand-mediated DNA target cleavage”(Sheng G等人，Proc Natl Acad Sci U S A.2014 Jan14；111(2):652-7)的论文。该论文在结构生物学水平阐明了细菌的Argonaute蛋白指导导向DNA双链切割靶标DNA双链的机制。以上研究结果在分子生物学水平证明了细菌通过Argonaute干扰DNA来对抗转座子和可移动的遗传原件。
截至目前，尚未有利用DNA介导的DNA沉默现象来进行基因检测和/或基因分型的报道。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种基因检测和/或基因分型的组合物，包含下述组分：
a)任选地，针对待测靶基因的一个或多个目标片段的引物、PCR反应体系，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个目标片段；
b)针对该靶基因的所述目标片段的定位引物和Argonaute酶及其反应体系；
其中定位引物是与靶基因目标片段中检测位点的双链分别互补的两条寡核苷酸，优选地，其本身全部或部分互补，并且其中a)的试剂与b)的试剂各自独立存在。
在一些实施方案中，定位引物是5'端磷酸化修饰的DNA或RNA，其长度为12bp～100bp，例如13、14、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100bp；优选地，定位引物为单链DNA，优选地，长度为20bp～50bp，例如20、25、30、35、40、45或50bp；和/或其中Argonaute酶来自于原核生物，优选地，来源于嗜热古细菌，优选地，来自嗜热菌(Thermus thermophiles)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)或超好热始原菌(Thermococcus kodakaraensis)。
在一些实施方案中，本发明的基因检测和/或基因分型的组合物还包括用于电泳以分离、鉴定定位切割产物的试剂，所述电泳包括琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰氨凝胶电泳或毛细管电泳。
在一些实施方案中，a)的反应体系缓冲液可以与b)的反应体系缓冲液相同或不同；和/或其中定位引物的浓度为100nM～1mM，优选浓度为500nM～500μM，例如500nM、1μM、5μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、100μM、200μM、300μM、400μM或500μM，切割酶与定位引物的摩尔浓度比为1:1～10，例如1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1：7、1:8、1:9或1:10；和/或其中b)的反应体系为：10mM～50mM Tris/HCl,pH 7～9，优选地20mM Tris/HCl,pH 8，25mM Tris/HCl,pH 8.2，15mM Tris/HCl,pH 8.2，以及选自Mg2+、Mn2+或Co2+的阳离子，优选地，Mg2+浓度为50μM以上，例如200μM、300μM、400μM、500μM，和/或Mn2+浓度为10μM以上，例如50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM，和/或Co2+浓度为200μM以上，例如300μM、500μM、800μM、1000μM。
在一些实施方案中，目标片段的长度为50-5000bp，优选地，100-1000bp，例如，100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000bp，和/或引物是一组或多组，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10组，和/或DNA聚合酶选自Taq酶、Pfu Taq酶和KOD Taq酶。
在一些实施方案中，本发明的基因检测和/或基因分型的组合物被配置为试剂盒。
本发明的第二方面涉及一种基因检测和/或基因分型的方法，其利用上述第一方面所述的基因检测和/或基因分型的组合物进行。
在一些实施方案中，利用a)进行PCR反应以复制和富集靶基因的一个或多个目标片段，所得产物与b)的试剂进行反应，优选地，产物与b)的试剂反应的时间为30秒-1小时，例如，30秒、40秒、50秒、60秒、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟或60分钟，优选地，产物与b)的试剂反应的温度为20～99.9℃，例如65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、98℃；和/或其中利用a)进行PCR反应的循环次数为5-50，该循环次数根据靶基因的多寡而定，靶基因的原始含量高，则相应减少循环次数。
在一些实施方案中，本发明所述的基因检测和/或基因分型的方法还包括最后的电泳过程，优选地，电泳是琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳，优选地，电泳的分辨率是一个碱基、不超过50个碱基的多个碱基，例如2、3、4、5、10、20、30、40或50个碱基的分辨率。
在一些实施方案中，本发明所述的基因检测和/或基因分型的方法用于病原体基因分型、基因多态性检测。
换言之，本发明基于Argonaute的DNA干扰机制，利用DNA的定位切割解决了限制性内切酶分析方法受限于限制性内切酶的问题，与PCR及电泳结合时，解决了多重PCR引物重数受限的问题。
本发明的方法首先使用目标富集引物进行PCR，以富集检测目标基因，目标富集引物一般位于检查目标基因的外侧，如果是病原体基因，目标富集引物还应考虑设置在序列保守区。为了缩短反应时间同时保证PCR的质量，100-1000bp大小的基因片段是较好的选择。PCR方法则是常规的方法，所选择的DNA聚合酶可以是Taq酶，Pfu Taq酶，KOD Taq酶等。为了缩短反应时间，快速的DNA聚合酶是更好的选择。目标富集引物可以是一组或多组。
向PCR反应产物加入定位引物和切割酶复合物以特异性切割扩增的PCR产物。切割酶可以与5’端磷酸化修饰的单链DNA复合，然后切割与其复合DNA序列互补的DNA靶标。定位引物和切割酶是预先混合的混合物，混合比例可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。切割反应的缓冲液环境可以是与PCR反应同样的环境，也可以根据PCR反应缓冲液的组分情况，单独设置切割反应的缓冲液，两者混合后进行反应，混合比例可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。反应时间可以是30秒到1小时。
然后电泳上述定位切割的产物。所述电泳可以是普通琼脂糖电泳、聚丙烯酰氨凝胶电泳，也可以是毛细管电泳。不同的电泳具有不同的片段分辨率，需要与上述的PCR目标富集引物和定位引物所决定的结果片段大小进行匹配。如切割后的核酸片段大小差异在20bp或以上，可以选择任一种电泳方法，如果该核酸片段的大小差异在20bp或以下，则应选择聚丙烯酰氨凝胶电泳或更大分辨率的毛细管电泳。通过定位切割获得的核酸片段产物的电泳图谱特点，检测目标基因或对基因进行分型。
本发明将上述三个过程组合在一起，解决了为解决同样问题时使用多重PCR技术所遇到的多重引物设计难题。与之相比，本发明无需进行多重引物设计，仅需设计复制和富集过程引物和定位引物。本发明的组合物和方法克服了多重PCR、限制酶图谱等现有技术的缺陷，可以快速、简便地进行基因检测或基因分型。
附图说明
图1：示出了本发明的检测过程示意图。
图2：示出了适用的定位引物长度的测定结果。75℃反应1h，PCR产物大小为200bp，切割产物约为120bp和80bp。其中泳道1为DNA分子量标记，泳道2-12为各个定位引物长度，泳道13为对照。
图3：示出了适用的定位引物浓度的测定结果。75℃反应1h，PCR产物大小为200bp，切割产物约为120bp和80bp。其中泳道1-6分别为定位引物的各个浓度。
图4：示出了适用的特异性切割反应温度的测定结果。75℃反应1h，PCR产物大小为200bp，切割产物约为120bp和80bp。其中泳道1-5分别为各个特异性切割反应温度。
图5：示出了适用的切割反应缓冲液中的Mg2+浓度的测定结果。75℃反应1h，PCR产物大小为200bp，切割产物约为120bp和80bp。其中泳道1-10分别为各个Mg2+浓度。
图6：示出了适用的切割反应缓冲液中的Mn2+浓度的测定结果。75℃反应1h，PCR产物大小为200bp，切割产物约为120bp和80bp。其中泳道1-10分别为各个Mn2+浓度。
图7：示出了适用的切割反应缓冲液中的Co2+浓度的测定结果。75℃反应1h，PCR产物大小为200bp，切割产物约为120bp和80bp。其中泳道1-9分别为各个Co2+浓度。
图8：示出了各个温度反应5分钟的效率比较。反应5分钟，PCR产物大小为200bp，切割产物约为120bp和80bp。
具体实施方式
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人士一般理解的相同意义。
本发明的基因检测和/或基因分型的组合物或方法利用常规的PCR过程来富集靶基因的目标片段，利用Argonaute酶和定位引物复合物的定位切割过程来特异性切割目标片段，并利用电泳过程来分离和鉴定定位切割反应的产物，如果目标片段被切割并产生相应大小的片段，则表明存在所述靶基因，如果不能切割，则表明不存在所述靶基因。
其中的PCR过程是指聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，其为该领域技术人员熟知的常规技术手段。本发明所使用的PCR过程为本领域通用的PCR过程，作用为将靶基因的一段或多段合适目标片段进行复制和富集。因此，相应的目标富集引物及相应的PCR反应体系和反应条件都是常规的，可以由本领域技术人员利用本领域的现有知识及常规技术手段容易地确定并实施。值得注意的是，本发明的PCR过程不是必需的，因为本发明的靶基因可以是已经扩增过的基因产物，或者其原始浓度本身已经足够高，无需利用PCR反应进行富集。
定位切割过程是利用定位引物和切割酶复合物对靶基因上目标片段进行特异性切割。本发明使用的定位引物和切割酶是DNA干扰领域中使用的定位引物和切割酶，其中定位引物是与靶基因目标片段中检测位点的双链分别互补的两条寡核苷酸，优选地，其本身全部或部分互补，并且其中a)的试剂与b)的试剂各自独立存在。本发明的定位引物的设计中，应把目标靶点设计在定位引物的中部偏向5’端的数个碱基(根据实际需要，本实施例中是3个)中，配对的特异性碱基数量一般在2～12个，具体的特异性碱基数量需要根据目标靶点设计和筛选，使其在存在错配时无法协助切割酶进行切割即可。切割酶是Argonaute酶，其来自于原核生物，优选地，来源于嗜热古细菌。根据不同的靶基因目标片段设计定位引物，并将定位引物与切割酶预先混合，形成复合物。该复合物与靶基因的目标片段进行反应，经过切割作用使目标片段分为更小的若干片段，例如两个片段。在一些实施方案中，将定位引物、切割酶和靶基因的目标片段同时混合也可达到同样目的。
电泳过程是指本领域常规的琼脂糖凝胶电泳过程或聚丙烯酰氨凝胶电泳过程，或毛细管电泳，为本领域技术人员所熟知，是常用的分辨基因片段的手段，其浓度及操作可由本领域技术人员根据所需分离的核酸片段的大小容易地调整。
本发明将上述三个过程组合在一起，解决了为解决同样问题时使用多重PCR技术所遇到的多重引物设计难题。与之相比，本发明无需进行多重引物设计，仅需设计复制和富集过程引物和定位引物。
其中，本发明的PCR过程和定位切割过程在一些实施方案中是可以互换的。既可以先进行PCR过程以复制和富集靶基因特定片段后再利用切割酶复合物切割目标产物，也可以先进行定位切割过程，对目标靶点进行切割，使目标基因断裂；然后进行PCR过程，此时PCR引物可以设计在靶基因的目标片段中的目标靶点位置中或分别在该位置前后。由于断裂的基因无法完成PCR过程，因而无法获得预期产物。此时可通过电泳中有无相应的产物来分析、判断是否有目标靶点的存在。
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
实施例
实施例1 PCR过程
选择HCV 1a基因型的5’UTR作为靶标，其序列如下：
GCCAGCCCCCTGATGGGGGCGACACTCCACCATGAATCACTCCCCTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAGAAAGCGTCTAGCCATGGCGTTAGTATGAGTGTCGTGCAGCCTCCAGGACCCCCCCTCCCGGGAGAGCCATAGTGGTCTGCGGAACCGGTGAGTACACCGGAATTGCCAGGACGACCGGGTCCTTTCTTGGATAAACCCGCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTACTGCCTGATAGGGTGCTTGCGAGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGACCGTGCACC(SEQ ID NO：1)。
根据本领域的常规要求设计目标富集引物如下(下划线)：
F：GGAGAGCCATAGTGGTCTG(SEQ ID NO：2)，
R：CTACGAGACCTCCCGG(SEQ ID NO：3)。
两条引物扩增的目标序列大小为200bp。
配制PCR反应液：20mM Tris/HCl,pH 8、250mM KCl、300μM Mg2+、250μM上下游引物、5U Taq酶，模板量10ng。PCR反应条件：95℃预变性3分钟，95℃30秒-60℃30秒-72℃30秒循环30次，最后72℃5分钟，获得PCR产物。结果表明PCR产物的大小为200bp，与预期的大小一致(数据未显示)。
实施例2定位切割过程和电泳过程
2.1定位引物的长度
在各种基因检测中，可以发生一个或多个基因变异，这些基因可能是人体自身基因也可能是病原体基因。针对不同的目标基因靶点需要设计不同碱基和不同长度的定位引物。本发明可以使用12bp以上的定位引物。在20mM Tris/HCl,pH 8、300μM Mg2+、75℃反应1小时的条件下，使下述长度5～80bp的定位引物(双链)分别与5μg切割酶(Argonaute酶，来源于嗜热菌Thermus thermophiles，参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/？term＝TTHB068)和500ng目标基因(实施例1中的PCR产物)共同反应，结果见图2。由图2可见，12、20、40、80bp的定位引物均可实现切割。高于80bp的更长的定位引物理论上不会影响实施效果，但是这样的引物合成成本过高，且不会取得与之相称的性能提升，因此在技术上没有必要。长度低于12bp的定位引物则无法实现切割。定位引物的特异性是检测效果的一个重要方面。本发明的定位引物的设计中，应把目标靶点设计在定位引物的中部偏向5’端的数个碱基(根据实际需要，本实施例中是3个)中，配对的特异性碱基数量一般在2～12个，具体的特异性碱基数量需要根据目标靶点设计和筛选，使其在存在错配时无法协助切割酶进行切割即可。
5bp:P-ACTGC(SEQ ID NO：4)，
6bp:P-ACTGCT(SEQ ID NO：5)，
7bp:P-GACTGCT(SEQ ID NO：6)，
8bp:P-GACTGCTA(SEQ ID NO：7)，
9bp:P-AGACTGCTA(SEQ ID NO：8)，
10bp:P-AGACTGCTAG(SEQ ID NO：9)，
11bp:P-AAGACTGCTAG(SEQ ID NO：10)，
12bp:P-AAGACTGCTAGC(SEQ ID NO：11)，
20bp:P-CCGCAAGACTGCTAGCCGAG(SEQ ID NO：12)，
40bp:P-GGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGT(SEQ ID NO：13)，
80bp:P-GCTCAATGCCTGGAGATTTGGGCGTGCCCCCGCAAGACTGCTAGCCGAGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGGCCTTGTGGTAC(SEQ ID NO：14)。
当引物中的目标靶点CTG出现任意1或2个错配碱基时，比如变为CTA、或TTA等，切割则无法完成，因此可以推断1或2个错配碱基可以导致切割失败，那么如果存在3个碱基及以上错配时，切割必然无法完成。在本实施例中，定位引物是依据HCV 1a基因型设计的。当切割样本是HCV 3a基因型时，由于其目标靶点CTG位置对应的是TCA，结果表明其无法被上述的定位引物和切割酶实施切割并形成相应大小的片段。
2.2定位引物的浓度
定位引物应与切割酶按一定比例形成复合物。20mM Tris/HCl,pH 8、300μM Mg2+、75℃反应1小时的条件下，切割酶Argonaute与上述12bp定位引物按照1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10的摩尔比(具体用量见图3)混合形成复合物时，均能达到同样的切割效果。尽管切割酶与定位引物是形成复合物后与目标基因进行反应，三者在反应过程是1:1:1的分子比例，但是由于在较高温度下，切割酶与定位引物形成的复合物是一种动态平衡的复合状态，更高的定位引物用量有利于切割酶形成复合物的效率，从而提高切割效率。而定位引物的浓度在20mM Tris/HCl,pH 8、250mM KCl、300μM Mg2+的反应条件下，应不低于100nM，结果见图3。
2.3切割酶的反应温度
来自于嗜热古细菌的Argonaute酶，一般具有较高的耐热性。参考同样来自嗜热古细菌的DNA聚合酶及其缓冲液体系，在20mM Tris/HCl,pH 8、250mM KCl、300μM Mg2+的反应条件下，使用实施例1的靶基因、富集引物、PCR反应条件，上述的12bp定位引物、切割酶和反应体系，在多个温度下进行反应1小时，结果见图4，由结果可见，65℃-98℃是适合于切割的反应温度。
2.4Mg2+、Mn2+和Co2+的浓度对定位切割反应的影响
来自于嗜热古细菌的Argonaute酶，一般要求二价阳离子作为催化剂。参考同样来自嗜热古细菌的DNA聚合酶及其缓冲液体系，在20mM Tris/HCl,pH 8、250mM KCl的反应条件下，使用实施例1的靶基因、引物、PCR反应体系和反应条件和上述的定位引物及定位酶分别测试Mg2+、Mn2+、Co2+的系列浓度，于75℃进行反应1小时，结果见图5、图6、图7。由结果可见，Mg2+浓度为50μM以上，例如200μM、300μM、400μM、500μM，Mn2+浓度为10μM以上，例如50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM，Co2+浓度为200μM以上，例如300μM、500μM、800μM、1000μM，作为催化剂是本发明切割酶反应体系的缓冲液必需的。
2.5定位切割反应过程的反应时间
定位切割过程的反应时间与切割酶在反应温度下的活性高度相关。对于来自于嗜热古细菌的Argonaute酶，最适反应温度在前面所述的65℃以上。在20mM Tris/HCl,pH 8、250mM KCl、300μM Mg2+的反应条件下，使用实施例1的靶基因、引物、PCR反应体系和条件和上述的定位引物及定位酶分别在65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、92℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃进行反应5分钟，结果见图8。可见，可以使用的温度范围为65-98℃，效果较好的温度范围为80-98℃，优选的温度范围为90-98℃，反应时间为5分钟以上皆可获得较好的切割效果。
2.6电泳过程
上述实施例中，在进行定位切割反应后，反应产物均利用聚丙烯酰氨凝胶电泳进行分离和确认。由于产物片段大小仅为约100bp，因此，使用的聚丙烯酰氨凝胶电泳浓度为15％，电泳条件为电压60V，电泳2小时左右。根据指示剂迁移位置来判定是否终止电泳。
上述电泳过程可以是普通琼脂糖电泳、聚丙烯酰氨凝胶电泳，也可以是毛细管电泳，不同的电泳具有不同的片段分辨率，需要与上述的PCR引物和定位引物所扩增的产物片段大小进行匹配。如切割后的产物核酸片段大小差异在20bp或以上，可以选择任一种电泳方法，如果产物核酸片段的大小差异在20bp或以下，则应选择聚丙烯酰氨凝胶电泳和更大分辨率的毛细管电泳，通过酶切核酸片段产物的电泳图谱特点，检测目标基因或对基因进行分型。
实施例3定位切割反应过程的实例
上述实施例中使用的目标基因是HCV 1a基因型的5’UTR，对于一个HCV 3a基因型5’UTR，其目标靶点CTG位置对应的是TCA。因此，使用上述实施例的定位引物时，无法实施切割来形成相应大小的片段。本实施例针对HCV 3a基因型的5'UTR再次验证了本发明系统的功效。具体而言，本实施例的目标富集引物及其实施同实施例1，同时设计定位双链引物为：P-AAGATCACTAGC(SEQ ID NO：15)，该定位引物为HCV 3a基因型特异性的。其它反应条件同实施例2。结果表明，使用该定位引物和Agonaute酶时，可以特异性地切割扩增的HCV 3a基因型5’UTR的片段，而不能切割扩增的HCV 1a基因型的5’UTR。
Claims (10)
1.一种基因检测和/或基因分型的组合物，包含下述组分：
a)任选地，针对待测靶基因的一个或多个目标片段的引物、PCR反应体系；
b)针对该靶基因的所述目标片段的定位引物和Argonaute酶及其反应体系；
其中定位引物是与靶基因目标片段中检测位点的双链分别互补的两条寡核苷酸，优选地，其本身全部或部分互补，并且其中a)的试剂与b)的试剂各自独立存在。
2.根据权利要求1所述的基因检测和/或基因分型的组合物，其中定位引物是5'端磷酸化修饰的DNA或RNA，其长度为12bp～100bp，优选地，定位引物为DNA，优选地，长度为20bp～50bp；和/或其中Argonaute酶来自于原核生物，优选地，来源于嗜热古细菌，优选地，来自嗜热菌(Thermus thermophiles)、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)或超好热始原菌(Thermococcus kodakaraensis)。
3.根据权利要求1或2所述的基因检测和/或基因分型的组合物，其还包括用于电泳以分离、鉴定定位切割产物的试剂，所述电泳包括琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰氨凝胶电泳或毛细管电泳。
4.根据权利要求1至3任一项所述的基因检测和/或基因分型的组合物，其中a)的反应体系缓冲液可以与b)的反应体系缓冲液相同或不同；和/或其中定位引物的浓度为100nM～1mM，优选浓度为500nM～500μM，切割酶与定位引物的摩尔浓度比为1:1～10；和/或其中b)的反应体系为：10mM～50mM Tris/HCl,pH 7～9，优选地20mM Tris/HCl,pH 8，25mM Tris/HCl,pH 8.2，15mM Tris/HCl,pH 8.2，以及选自Mg2+、Mn2+或Co2+的阳离子，优选地，Mg2+浓度为50μM以上，例如200μM、300μM、400μM、500μM，和/或Mn2+浓度为10μM以上，例如50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM，和/或Co2+浓度为200μM以上，例如300μM、500μM、800μM、1000μM。
5.根据权利要求1至4任一项所述的基因检测和/或基因分型的组合物，其中目标片段的长度为50-5000bp，优选地，100-1000bp，和/或引物是一组或多组，和/或DNA聚合酶选自Taq酶、Pfu Taq酶和KOD Taq酶。
6.根据权利要求1至5任一项所述的基因检测和/或基因分型的组合物，其被配置为试剂盒。
7.一种基因检测和/或基因分型的方法，其利用权利要求1-6任一项所述的基因检测和/或基因分型的组合物进行。
8.根据权利要求7所述的基因检测和/或基因分型的方法，其中利用a)进行PCR反应以复制和富集靶基因的一个或多个目标片段，所得产物与b)的试剂进行反应，优选地，产物与b)的试剂反应的时间为30秒-1小时，优选地，产物与b)的试剂反应的温度为20～99.9℃，例如65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、98℃；和/或其中利用a)进行PCR反应的循环次数为5-50。
9.根据权利要求7-8所述的基因检测和/或基因分型的方法，其还包括最后的电泳过程，优选地，电泳是琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳，优选地，电泳的分辨率是一个碱基、不超过50个碱基的多个碱基。
10.根据权利要求7-9所述的基因检测和/或基因分型的方法，其用于病原体基因分型、基因多态性检测。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108796036A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-11-13 | 上海交通大学 | 基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用 |
| CN110283941A (zh) * | 2019-06-28 | 2019-09-27 | 湖北大学 | 一种用于hpv分型检测的试剂盒与方法 |
| WO2020215652A1 (zh) * | 2019-04-22 | 2020-10-29 | 上海交通大学 | 基于核酸酶偶联pcr原理富集低丰度dna突变的检测技术体系及应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105483118A (zh) * | 2015-12-21 | 2016-04-13 | 浙江大学 | 以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术 |
| US20160289734A1 (en) * | 2015-04-03 | 2016-10-06 | University Of Massachusetts | Methods of using oligonucleotide-guided argonaute proteins |
-
2016
- 2016-07-18 CN CN201610566368.3A patent/CN106555011B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160289734A1 (en) * | 2015-04-03 | 2016-10-06 | University Of Massachusetts | Methods of using oligonucleotide-guided argonaute proteins |
| CN105483118A (zh) * | 2015-12-21 | 2016-04-13 | 浙江大学 | 以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GANG SHENG等: "Structure-based cleavage mechanism of Thermus thermophilus Argonaute DNA guide strand-mediated DNA target cleavage", 《PNAS》 * |
| KIM J M等: "Genotyping with CRISPR-Cas-derived RNA-guided endonucleases", 《NATURE COMMUNICATIONS》 * |
| YANLI WANG等: "Nucleation, propagation and cleavage of target RNAs inargonaute silencing complexes", 《NATURE.》 * |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108796036A (zh) * | 2018-04-03 | 2018-11-13 | 上海交通大学 | 基于原核Argonaute蛋白的核酸检测方法及其应用 |
| JP2021517469A (ja) * | 2018-04-03 | 2021-07-26 | 上海交通大学Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｊｉａｏ Ｔｏｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ | 原核アルゴノートタンパク質に基づいた核酸検出方法およびその使用 |
| EP3792364A4 (en) * | 2018-04-03 | 2021-08-18 | Shanghai Jiaotong University | NUCLEIC ACID DETECTION PROCESS BASED ON A PROCARYOTE ARGONAUTE PROTEIN AND ITS APPLICATION |
| JP7224676B2 (ja) | 2018-04-03 | 2023-02-20 | ジャオホン バイオテクノロジー （シャンハイ） カンパニー リミテッド | 原核アルゴノートタンパク質に基づいた核酸検出方法およびその使用 |
| WO2020215652A1 (zh) * | 2019-04-22 | 2020-10-29 | 上海交通大学 | 基于核酸酶偶联pcr原理富集低丰度dna突变的检测技术体系及应用 |
| CN110283941A (zh) * | 2019-06-28 | 2019-09-27 | 湖北大学 | 一种用于hpv分型检测的试剂盒与方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106555011B (zh) | 2023-12-19 |
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