JP6484636B2 - 固相担体におけるアンプリコン調製および配列決定 - Google Patents

Description

本開示は概して、核酸増幅および配列決定のための方法および組成物に関し、具体的には、標的ポリヌクレオチドの固相担体への捕捉および配列決定に関する。

ポリヌクレオチドにコードされた情報（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）は、医学および生命科学にとって最も重要であるため、ポリヌクレオチドを迅速かつ安価に配列決定する必要性が存在する。現在のところ、商用の配列決定技法はサンプルとライブラリの調製を必要とし、これは双方とも手がかかる。さらに読み出しは、多くのアプリケーションにおいて所望より遅い。そのため処理量は限定され、コストは比較的高い。

したがって、標的ポリヌクレオチドを調整し配列を決定する、より迅速で効率的な方法の必要性が存在する。本開示はこの必要性を満たし、関連する利点も同様に提示する。

本開示は、アンプリコンの調製方法を提供する。該方法は、（ａ）複数の標的ポリヌクレオチドを含む核酸サンプルを、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で少なくとも１つのプライマーに接触させるステップであって、前記少なくとも１つのプライマーはアダプターを含む、ステップと；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により前記複数の標的ポリヌクレオチドを増幅し、複数のアンプリコンを生成するステップと；（ｃ）固相担体に固定化した複数の標的特異的捕捉プライマーを、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で前記複数のアンプリコンと直接的に接触させて、第１の複数の固定化アンプリコンを生成するステップであって、前記固相担体はさらに、複数のユニバーサル捕捉プライマーを含む、ステップと；（ｄ）前記複数の標的特異的捕捉プライマーを伸長して、前記標的ポリヌクレオチドに対し相補的な複数の固定化伸長生成物を生成するステップと；（ｅ）前記複数の固定化伸長生成物に対して前記複数のユニバーサル捕捉プライマーをアニールするステップと；（ｆ）ＰＣＲにより前記複数の固定化伸長生成物を増幅し、第２の複数の固定化アンプリコンを生成するステップであって、前記固定化アンプリコンの集団は８５％以上の均一性を備える、ステップを含む。該方法は、１０ｎｇ以下の入力核酸と共に使用することが可能であり、さらに、第２の複数の固定化アンプリコンの配列を決定するステップを含むことが可能である。該方法はまた、がん関連遺伝子など、疾患または疾病に関連した遺伝子の存在を判断するのに用いることが可能である。セルフリーＤＮＡも本開示の方法で用いることが可能である。

本開示はさらに、核酸配列変異体の検出感度を高める方法を提供する。該方法は、（ａ）複数の標的ポリヌクレオチドを含む核酸サンプルを、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で遺伝子特異的フォワードプライマーおよび遺伝子特異的リバースプライマーと接触させるステップであって、前記遺伝子特異的フォワードプライマーの各種は、固有の配列インデックスとアダプターを含む、ステップと；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、前記複数の標的ポリヌクレオチドを増幅して、複数のアンプリコンを生成するステップと、（ｃ）固相担体に固定化した複数の標的特異的捕捉プライマーを、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で前記複数のアンプリコンと直接的に接触させて、第１の複数の固定化アンプリコンを生成するステップであって、前記固相担体はさらに、複数のユニバーサル捕捉プライマーを含む、ステップと；（ｄ）前記複数の標的特異的捕捉プライマーを伸長して、前記標的ポリヌクレオチドに対し相補的な複数の固定化伸長生成物を生成するステップと；（ｅ）前記複数の固定化伸長生成物に対し、前記複数のユニバーサル捕捉プライマーをアニールするステップと；（ｆ）ＰＣＲにより、前記複数の固定化伸長生成物を増幅して第２の複数の固定化アンプリコンを生成するステップであって、前記第２の複数の固定化アンプリコンは、８５％以上の均一性を備える、ステップと；（ｇ）前記第２の複数の固定化アンプリコンの配列を決定するステップと；（ｈ）標的ポリヌクレオチド種に関し、変異体位置にある３つ以上のヌクレオチド配列を比較することにより、１つまたは２つ以上の標的ポリヌクレオチドに関するランダムな配列エラーを解消するステップであって、前記標的ポリヌクレオチド種を固有の配列インデックスにより特定し、それにより前記１つまたは２つ以上の標的ポリヌクレオチドにおける真のヌクレオチド配列変異体を求める、ステップを含む。該方法は、変異体ヌクレオチド位置について０．３％以下のミスマッチ率を検出することが可能である。

固相担体上のアンプリコンの調製および配列決定における、例示的なステップを示す図である。 ゲノムＤＮＡのマルチプレックス１００サイクル配列決定ランに関し、２つの異なる核酸入力量についての配列決定均一性および配列決定深度の比較を示す図である。 ホルマリン固定パラフィン包埋組織から得たＤＮＡのマルチプレックス５０サイクル配列決定ランに関し、４つの異なる核酸入力量についての配列決定均一性および配列決定深度の比較を示す図である。 マルチプレックス配列決定ランにおいて、１ｍＬの血漿から単離した１０ｎｇのセルフリーＤＮＡについての配列決定均一性および配列決定深度の比較を示す図である。 ランダムなヌクレオチド配列決定エラーから真のヌクレオチド変異体を区別するための、固有の分子バーコードまたはヌクレオチドインデックスの使用を例示する図である。 固有分子バーコード修正を使用したヌクレオチドミスマッチ率（右）と、固有分子バーコード修正を使用しないヌクレオチドミスマッチ率（左）の比較を示す図である。 インデックスを、標的特異的増幅プライマーを介して標的ポリヌクレオチドに組み込む１つのステップであって、該インデックスはシーケンシンプライマーの結合部位の下流にある、ステップを示す図である。 インデックスを、配列決定プライマーを介して標的ポリヌクレオチドに組み込む２つのステップであって、該インデックスは配列決定プライマーの結合部位の上流にある、ステップを示す図である。

本開示は、標的ポリヌクレオチドを迅速で効率的に調製および配列決定する方法を対象にする。該方法は、標的ポリヌクレオチドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、固相担体への直接固定化、クローン増幅、および配列決定を含む。それらは、統合工程において個別または共に利用することでき、サンプル〜結果（sample-to-answer）が迅速なアンプリコン配列決定を可能にする。統合方法は、アンプリコンライブラリ調整が不必要であり、それによってライゲーションに関連する非効率性が解消されることから、特に有用である。配列決定用統合方法が持つ、他の特に有用な特質には、例えばアンプリコン精製とＰＣＲ後の追加の濃縮ステップの必要性が解消されることが含まれ、アンプリコンを固定化する迅速なハイブリダイゼーションステップを可能にし、非常に少量の入力核酸とともに利用しながら高品質の配列決定結果を達成することが可能である。

特異的な一実施形態において、本開示の方法は標的ポリヌクレオチドの集団のマルチプレックスＰＣＲを利用し、ここで１つのプライマーは、固相担体に固定化したオリゴヌクレオチドに対し、相補的なアダプターを含む。標的ポリヌクレオチドの増幅集団は、最初に精製ステップにかけずに固相担体に固定化する。固定化は、固相担体に予め播種した標的特異的捕捉オリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによる。標的ポリヌクレオチドの増幅集団のアダプター末端を固定化相補的オリゴヌクレオチドにアニールし、該相補的オリゴヌクレオチドを伸長反応においてプライマーとして用いて二本鎖の標的ポリヌクレオチドの集団を生成する。クローン増幅に続き、標的ポリヌクレオチドコロニーを３５以上のサイクルからなるマルチプレックス配列決定にかける。

本明細書で用いる場合、「複数」という用語は、２つ以上の異なるポリヌクレオチドまたは他の参照分子の集団を指す。したがって特に明記しない限り、「複数」という用語は集団と同義的に用いる。複数には、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００以上の異なる要素の集団が含まれる。複数にはまた、２００、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００、５００００、１×１０⁵、２×１０⁵、３×１０⁵、４×１０⁵、５×１０⁵、６×１０⁵、７×１０⁵、８×１０⁵、９×１０⁵、１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、または、１×１０^７以上の異なる要素が含まれ得る。複数には、上記の例示的な集団数の間にある整数が全て含まれる。

本明細書で用いる場合、「標的ポリヌクレオチド」という用語は、分析または処置の対象であるポリヌクレオチドを意味することを目的とする。分析または処置には、ポリヌクレオチドをコピー、増幅、配列決定、および／または、核酸照合のための他の工程にかけるステップが含まれる。標的ポリヌクレオチドは、分析すべき標的配列とは別のヌクレオチド配列を含み得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、プライマー結合部位として機能するアダプターなど、分析すべき標的ポリヌクレオチド配列の側面に位置する１つまたは２つ以上のアダプターを含み得る。捕捉オリゴヌクレオチドまたは捕捉プライマーに対しハイブリダイズした標的ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドを含み得、これは標的ポリヌクレオチドの全てが伸長に非常に適しているとは限らないやり方で、捕捉オリゴヌクレオチドの5'末端または3'末端を超えて伸長する。以下でさらに詳細に述べるように、特定の実施形態において複数の標的ポリヌクレオチドは異種を含み、これは、その標的ポリヌクレオチド配列は異なるものの、２つ以上の異種に共通のアダプターを有する。特定の標的ポリヌクレオチド配列に隣接することが可能な２つのアダプターは、同一の配列を有するか、または、該２つのアダプターは異なる配列を有することが可能である。したがって、複数の異なる標的ポリヌクレオチドは、標的ポリヌクレオチド配列の各末端に、同じアダプター配列か、または、２つの異なるアダプター配列を有することが可能である。したがって、複数の標的ポリヌクレオチドの種は既知の配列領域を含むことが可能であり、これは、例えば、配列決定により評価される未知の配列領域に隣接する。標的ポリヌクレオチドが一方の末端にのみアダプターを有する場合、該アダプターは標的ポリヌクレオチドの3'末端または5'末端の何れかに位置させることが可能である。標的ポリヌクレオチドはアダプター無しに用いることが可能で、この場合、プライマー結合配列は、標的ポリヌクレオチドで見つけられた配列から直接的に生成することが可能である。

本明細書で用いる場合、複数の捕捉プライマーを接触させることに関連して用いる際の「直接的」という用語は、参照工程後の重大な介在精製ステップなしに、接触物質を複数の捕捉プライマーに適用することを意味することを目的とする。重大な介在精製ステップは、細胞成分の複雑さを低減することを目的とした工程を含み、例えば、増幅反応後にプライマー、酵素、および、未増幅または不適切に増幅された鋳型の存在を減少させるステップを含む。重大な介在精製ステップは、バッファの修正、サンプル核酸の沈殿、および他の副次的な核酸操作工程を含むことは目的にしない。

本明細書で用いる場合、「捕捉プライマー」という用語は、ヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを意味することを目的とし、これは、例えば、増幅もしくは配列決定反応のプライマーアニーリングステップで遭遇する条件下で分析する、または、核酸照合にかける、一本鎖ポリヌクレオチド配列に対し、特異的にアニールすることが可能である。該して、「核酸」、「ポリヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書で互換的に用いる。異なる用語は、具体的に別の指示がない限り、サイズ、配列、または他の特性の特段の違いを表すことを目的としない。記載の明確性のため、特定の方法またはいくつかの核酸種を含む組成物を記載する際、核酸のある種を別のものから区別するために該用語を用いることが可能である。

本明細書で用いる場合、捕捉プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドに関連して用いる際の「標的特異的」という用語は、標的ポリヌクレオチド配列に対し特異的なヌクレオチド配列、つまり、標的ポリヌクレオチドの識別領域に対し選択的にアニールすることが可能なヌクレオチド配列を含む、捕捉プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを意味することを目的とする。標的特異的捕捉プライマーは、単一種のオリゴヌクレオチドを有するか、または、異なる配列を有する２つ以上の種を含むことが可能である。したがって、標的特異的捕捉プライマーは、３，４、５、６、７、８、９、または１０以上の異なる配列など、２つ以上の配列とすることができる。標的特異的捕捉オリゴヌクレオチドは、標的特異的捕捉プライマー配列と、ユニバーサル捕捉プライマー配列を含むことが可能である。配列決定プライマー配列などの他の配列は、標的特異的捕捉プライマーに含むことが可能である。

比較すると、捕捉プライマーまたは他のオリゴヌクレオチド配列に関連して用いる「ユニバーサル」という用語は、複数の捕捉プライマーのうち共通のヌクレオチド配列を有する捕捉プライマーまたは他のオリゴヌクレオチドを意味することを目的とする。共通の配列は、例えば、同一のアダプター配列に対し相補的な配列とすることが可能である。ユニバーサル捕捉プライマーは、異種を必ずしも区別せず、複数の異なるポリヌクレオチドを照合するのに適用可能であるのに対し、標的特異的捕捉プライマーは、異種の区別に適用可能である。

本明細書で用いる場合、ヌクレオチド配列に関連して用いる際の「インデックス」という用語は、サンプル内に含まれるポリヌクレオチド内の他のインデックスおよび他のヌクレオチド配列から区別可能な、固有ヌクレオチド配列を意味することを目的とする。ヌクレオチドインデックスは、ランダムまたは特異的にデザインされた、ヌクレオチド配列とすることができる。インデックスは、分析または照合する集団および／または複数のポリヌクレオチドの、複数のインデックス内固有ヌクレオチド配列であるのに十分な長さである限り、所望の配列長さとすることが可能である。本開示のヌクレオチドインデックスは、例えば、標的ポリヌクレオチドに付着させて特定の種をタグ付けまたはマーク付けし、集団内でタグ付けした種の全要素を識別するのに有用である。したがって、インデックスはバーコードとして有用であり、ここで同一分子種の異なる要素は、同一のインデックスを含むことが可能であり、異なるポリヌクレオチド集団内にある異種は、異なるインデックスを有することが可能である。

本明細書で用いる場合、核酸に関連して用いる際の「固定化した」という用語は、共有結合または非共有結合を介して、固相担体に直接的または非直接的に付着させることを意味することを目的とする。本開示のある実施形態において、共有結合付着を用いることができるが、概して必要なのは、核酸が、例えば核酸増幅および／または配列決定を必要とするアプリケーションにおいて、担体を使用することを目的とする条件下で静止するか、または、担体に付着することだけである。典型的に、捕捉プライマーまたは増幅プライマーとして使用するオリゴヌクレオチドを固定化し、その結果、3'末端が酵素伸長に適用可能になり、配列の少なくとも一部を相補的な配列に対しハイブリダイズすることができる。固定化は、表面に付着させたオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションによって生じさせることが可能であり、この場合、固定化したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、3'−5'方向とすることが可能である。あるいは、固定化は、上で述べた共有結合付着といった塩基対ハイブリダイゼーション以外の手段により生じさせることが可能である。

本明細書で用いる場合、「固相担体」という用語は、例えば、ラテックスビーズ、デキストランビーズ、ポリスチレン表面、ポリプロピレン表面、ポリアクリルアミドゲル、金表面、ガラス表面、およびシリコンウエハなど、核酸を付着させることが可能な任意の不溶性基板またはマトリックスを意味することを目的とする。表面は、平面、球状、または多孔質など、特定のアプリケーションに適切な任意の所望の形状とすることが可能である。例えば、固相担体は平坦なガラス表面とすることが可能である。固相担体はまた、フローセルの内側に取り付けて、種々の反応物の溶液との相互作用を可能にすることもできる。

ある実施形態において、固相担体は不活性な基板またはマトリックスを含むことが可能であり、これは例えば、ポリヌクレオチドに対する共有結合付着を可能にする反応基を有する中間物質の層またはコーティングを適用することにより、化学的に官能基化されている。中間物質を、共有結合または非共有結合により固相担体に直接的または非直接的に付着させることが可能である。固相担体に対する非共有結合付着の非限定的例として、このような担体は、ガラスなどの不活性基板上にポリアクリルアミドヒドロゲル層を備えることが可能である。このような実施形態において、ポリヌクレオチドは中間層（例えば、ヒドロゲル）に対し直接的に、共有結合的に付着させることが可能であるが、中間層自体は、他の基板またはマトリックス（例えば、ガラス基板）の層に非共有結合的に付着させることが可能である。

本開示は、アンプリコンの調製方法を提供する。該方法は、（ａ）複数の標的ポリヌクレオチドを有する核酸サンプルを、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で少なくとも１つのプライマーと接触させるステップであって、前記少なくとも１つのプライマーはアダプターを含む、ステップと；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により前記複数の標的ポリヌクレオチドを増幅し、複数のアンプリコンを生成するステップと；（ｃ）固相担体に固定化した複数の標的特異的捕捉プライマーを、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で前記複数のアンプリコンと直接的に接触させて、第１の複数の固定化アンプリコンを生成するステップであって、前記固相担体はさらに、複数のユニバーサル捕捉プライマーを有する、ステップと；（ｄ）前記複数の標的特異的捕捉プライマーを伸長して、前記標的ポリヌクレオチドに対し相補的な、複数の固定化伸長生成物を生成するステップと；（ｅ）前記複数の固定化伸長生成物に対して前記複数のユニバーサル捕捉プライマーをアニールするステップと；（ｆ）ＰＣＲにより前記複数の固定化伸長生成物を増幅して、第２の複数の固定化アンプリコンを生成するステップであって、前記第２の複数の固定化アンプリコンは８５％以上の均一性を備える、ステップを含む。

本開示のアンプリコンの調製方法は、標的ポリヌクレオチドまたはその照合生成物のサンプルの質を高める１つまたは２つ以上の特徴を統合し、固定化標的ポリヌクレオチドのクローン集団の調製に関し、迅速で効率的なマルチステッププロセスを可能にする。各調製工程は使用準備が整った複数の標的ポリヌクレオチドを生成し、これは本明細書で記載するいずれの工程でも利用可能である。

アンプリコン調製に関する本開示の方法は、複数の標的ポリヌクレオチドを有する核酸サンプルを、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で少なくとも１つのプライマーと接触させるステップを含む。該少なくとも１つのプライマーは、アダプターを含むことが可能である。

核酸サンプルは、真核生物ソースまたは原核生物ソース、および合成ソースを含む任意の所望のソースから生じさせることが可能である。ある実施形態では、核酸サンプルソースを対象の生物から生じさせ、これはゲノムデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含むだろう。例えば、サンプルはヒトソースから生じさせることができ、ここでゲノム情報は、診断または治療の目的に望ましい。同様に、サンプルは、飼育動物ソースまたは家畜ソースから生じさせることが可能であり、ここでゲノム情報はまた、診断または治療の目的に望ましい。他の核酸サンプルソースには、例えば、細菌、酵母、真菌、およびげっ歯類等が含まれる。本明細書で提供する教示および指導を考慮すると、当業者は、任意の核酸ソースを本開示の方法で使用可能であることを理解しよう。

標的ポリヌクレオチドには、照合する任意の所望の核酸が含まれる。これに関し、標的ポリヌクレオチドには、例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）、ＥＳＴ、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、および合成ＤＮＡまたはＲＮＡが含まれる。特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチドはゲノムＤＮＡであり、照合は診断情報または治療介入に適用可能である。

したがって、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を意味する。該用語は、同義語としてヌクレオチド類似物から作成されるＤＮＡまたはＲＮＡいずれかの類似物を含み、（センスまたはアンチセンスなどの）一本鎖および二本鎖のポリヌクレオチドに適用可能であることを理解すべきである。

標的ポリヌクレオチド分子は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）形状（例えば、ゲノムＤＮＡ断片、ＰＣＲ、および増幅生成物等）で生じさせるか、または、ＤＮＡまたはＲＮＡとして一本鎖形状で生じさせ、ｄｓＤＮＡ形状に変換することが可能である。例として、ｍＲＮＡ分子を、当技術分野で周知の標準的な技法を用いて、本開示の方法で使用するのに適した二本鎖ｃＤＮＡにコピーすることが可能である。標的ポリヌクレオチド分子の正確な配列は、既知の場合も未知の場合もあり得る。

核酸サンプルは、未濃縮ゲノムＤＮＡの初期サンプルとすることが可能である。核酸サンプルとして有用なゲノムＤＮＡの例として、ヒトゲノムは約３１億の配列塩基からなる。本開示の方法で使用可能な他のゲノムについての例示的なサイズ推定値は、約２．７Ｇｂｐ（マウス）、２．８Ｇｂｐ（ラット）１．７Ｇｂｐ（ゼブラフィッシュ）、１６５Ｍｂｐ（ミバエ）、１３．５Ｍｂｐ（出芽酵母）、３９０Ｍｂｐ（フグ）２７８Ｍｂｐ（蚊）または１０３Ｍｂｐ（シー・エレガンス）である。当業者は、例えば、より小さいまたはより大きいゲノムなど、上記の例示的なもの以外のサイズを有するゲノムを本開示の方法で使用可能であることを理解しよう。

特定の実施形態において、標的ポリヌクレオチド分子はＤＮＡ分子である。特に、標的ポリヌクレオチド分子は生物の全ゲノム相補物を表し、プロモータ配列およびエンハンサー配列などのノンコーディング調節配列と同様にイントロン配列およびエクソン配列の両方（コーディング配列）を含む、ゲノムＤＮＡ分子である。特定の染色体など、ポリヌクレオチド配列またはゲノムＤＮＡの特定のサブセットも使用することが可能である。特に、標的ポリヌクレオチド分子の配列またはその一部を、標的配列とすることが可能である。さらに、標的ポリヌクレオチド分子は、例えば、上記で例示したように、ヒト、哺乳動物、細菌、真菌または植物のゲノムＤＮＡ分子に由来する。したがって、本開示は、複数のポリヌクレオチドを用いる方法を提供し、ここで該複数の標的ポリヌクレオチドには、複数のゲノム核酸が含まれる。

ある実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、疾患または疾病がある、または、あると疑われる対象から得たゲノムＤＮＡに対応する。他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、疾患または疾病があると疑われる対象から得たゲノムＤＮＡに対応する。さらに他の実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、疾患または疾病の兆候がない対象から得たゲノムＤＮＡに対応する。最初の実施形態では、本開示の方法は、例えば、疾患または疾病か否かを確かめるために用いることが可能である。後の２つの実施形態では、本開示の方法は、例えば、疾患または疾病の可能性または流行を判断するために用いることが可能である。

テストする疾患または疾病は、流行または可能性について遺伝子的に判断または評価することが可能な疾患または疾病とすることができる。このような疾患または疾病には、遺伝的に受け継がれる全ての疾患または疾病、および、遺伝子変化もしくは特異的な対立遺伝子により引き起こされる、または、相関関係にある全ての疾患または疾病が含まれる。遺伝子変化には、例えば、１つまたは２つ以上の核酸変異が含まれる。このような疾病または疾患は、当業者に周知である。例えば、遺伝子疾患または遺伝病に関連する既知の遺伝子は１９０００超ある（例えば、GENECARDS、Weizmann Institute of Science、アクセス日２０１４年１月６日、URL: genecards.org/cgi-bin/listdiseasecards.pl?type=fullを参照）。対象における、これらの遺伝子または遺伝子変異のいずれかまたは全ての存在を、例えば、対象由来のゲノムＤＮＡを本開示の方法で用いて評価することが可能である。

例示的な遺伝性の疾患または疾病には、がん、嚢胞性線維症、ダウン症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、血友病、神経線維腫症、テイ・サックス病、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、軟骨無形成症、α-1アンチトリプシン欠損症、抗リン脂質症候群、自閉症、常染色体優性多発性嚢胞腎疾患、シャルコー・マリー・トゥース病、猫鳴き症候群、クローン病、ダーカム病、デュアン症候群、第Ｖ因子ライデン栓友病、家族性高コレステロール血症、家族性地中海熱、脆弱Ｘ症候群、ゴーシェ病、ヘモクロマトーシス、遺伝性球状赤血球、全前脳症、クラインフェルター症候群、マルファン症候群、筋緊張性ジストロフィー、ヌーナン症候群、不完全な骨形成、フェニルケトン、ポーランド異常、ポルフィリン症、多発性嚢胞腎疾患、原発性線毛ジスキネジア、早老症、網膜色素変性症、レット症候群、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、鎌状赤血球症、脊髄性筋萎縮症、サラセミア、トリメチルアミン、ターナー症候群、多彩ポルフィリン症、口蓋心臓顔面症候群、ＷＡＧＲ症候群、および、ウィルソン病が含まれる。

例示的ながんには、乳がん、膀胱がん、結腸がん、大腸がん、胃がん、消化管間質腫瘍、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、腎臓がん、白血病、リンパ腫、肺がん、網膜芽細胞腫、メラノームなどの皮膚がん、前立腺がん、神経線維腫症、卵巣がん、横紋筋肉腫および甲状腺がんが含まれる。

遺伝子疾患または遺伝病の有無または傾向を判断するための、対象由来の有用なゲノムＤＮＡソースには、ｃｆＤＮＡが含まれる。セルフリーＤＮＡは当技術分野では周知である。例えば、母体循環系にある周知の胎児核酸の存在に加え、他の核酸を血清から単離し増幅可能であることもまた、周知である。この点に関し、Mulcahyら、LANCET 348: 628 (1996), Cancer and Mutant DNA in Blood Plasmaは特に、がん患者の血漿（Chenら）および血清（Narwozら）中の循環ＤＮＡの存在を示すいくつかのレポートを再検討し、自由に循環する遺伝物質の量の増大が、自己免疫疾患患者と同様にがん患者でも記載されていることを指摘した。さらに、セルフリー循環ＤＮＡの発見はまた、疾病状態に特有のものではない。EmanuelおよびPestka、GATA 10(6):144-146 (1993), Amplification of Specific Gene Products from Serumは、健康な人の血清中にある、ＰＣＲによる遺伝子分析を実行するのに十分な量のフリーＤＮＡの存在について記載している。加えて、Shapiro、Determination of Circulating DNA Levels in Patients with Benign or Malignant Gastrointestinal Disease, Cancer 51(11):2116-20 (1983)は、血清ＤＮＡ濃度が悪性腫瘍では著しく上昇し、良性の胃腸疾患では中程度に上昇することを報告している。

したがって、本開示は、がん関連遺伝子の存在を判断する方法を提供する。該方法は、（ａ）複数の標的ポリヌクレオチドを含む核酸サンプルを、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で少なくとも１つのプライマーに接触させるステップであって、前記少なくとも１つのプライマーはアダプターを含む、ステップと；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により前記複数の標的ポリヌクレオチドを増幅し、複数のアンプリコンを生成するステップと；（ｃ）固相担体に固定化した、１つまたは２つ以上の異なるがんに特異的な複数の標的特異的捕捉プライマーを、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で前記複数のアンプリコンに直接的に接触させて第１の複数の固定化アンプリコンを生成するステップであって、前記固相担体は複数のユニバーサル捕捉プライマーをさらに含む、ステップと；（ｄ）前記複数の標的特異的捕捉プライマーを伸長して、前記標的ポリヌクレオチドに対し相補的な、複数の固定化伸長生成物を生成するステップと；（ｅ）前記複数の固定化伸長生成物に対し、前記複数のユニバーサル捕捉プライマーをアニールするステップと；（ｆ）ＰＣＲにより、前記複数の固定化伸長生成物を増幅して、第２の複数の固定化アンプリコンを生成するステップであって、前記固定化アンプリコンの集団は８５％以上の均一性を備える、ステップと；（ｇ）前記第２の複数の固定化伸長生成物を配列決定し、がん関連遺伝子の有無を判断するステップを含む。複数の標的ポリヌクレオチドは１０ｎｇ以下の入力核酸とすることが可能であり、入力核酸はｃｆＤＮＡとすることが可能である。

標的ポリヌクレオチド分子は、本明細書に記載のいずれかの方法の前または後で化学的または酵素的に処置することが可能である。本明細書に記載の方法において、核酸サンプルは断片化するか、または、断片化せずに用いることが可能である。サンプルは、例えば、ランダムプライマー伸長といった全サンプル増幅技法を用いる前に増幅することが可能である。

複数の標的ポリヌクレオチドを、少なくとも１つのプライマーに接触させることが可能である。図１パネル１は例示的な構成を図示し、ここで複数の標的ポリヌクレオチドの各要素を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅のために、一対のプライマーに接触させ、ハイブリダイズする。以下でさらに記載するように、非対称ＰＣＲを要求される場合、標的ポリヌクレオチドを単一プライマーにハイブリダイズすることが可能である。図１パネル１に示すように、少なくとも１つのプライマーはまた、例えば、下流工程で用いることが可能なアダプターを含む。したがって、本開示は、２つのプライマーを用いて増幅し、指数関数的な増幅をもたらす方法を提供する。片方または両方のプライマーは、アダプターを含むことが可能である。複数の標的ポリヌクレオチドを１つのプライマーを用いて増幅し、非対称増幅をもたらす増幅方法も提供する。該１つのプライマーはアダプターを含み得る。

概して増幅反応は、しばしばフォワードプライマーおよびリバースプライマーと呼ばれる２つのプライマーを用いる。増幅プライマーは、典型的には一本鎖ポリヌクレオチド構造である。これはまた、少なくとも一部の実施形態において任意の非天然修飾がプライマーとしての機能を永続的または不可逆的に含まないという条件で、天然または非天然の塩基の混合物を含み、天然および非天然の骨格リンケージもまた含む。増幅プライマーは、伸長または増幅反応時に鋳型ポリヌクレオチド鎖にアニールし、アニールした鋳型鎖に対し相補的な新しいポリヌクレオチド鎖の酵素的合成の開始点として作用する能力を有する。

プライマーは、追加的に非ヌクレオチド化学修飾を含み、例えば、必要な場合、プライマーの固相担体への共有結合を促進する。ある化学修飾はそれ自体がプライマーとしての分子の機能を向上するか、または、プライマー（またはそれに由来する伸長ポリヌクレオチド鎖）を固相担体から切断することを可能にする切断部位を提供するなど、他の有用な機能を提供することが可能である。有用な化学修飾は可逆修正も提供し、これは、修飾を除去または逆転させるまで、プライマーのハイブリダイゼーションまたは伸長を防ぐ。

5'末端および3'末端が既知の配列領域を保持するように、プライマーをデザインすることが可能である。既知の配列は、本明細書でいうユニバーサル配列とすることができ、そのため、複数のオリゴヌクレオチドに共通の配列を有することが可能である。あるいは、例えば、既知だが複数のオリゴヌクレオチドに固有の配列とすることが可能である。ユニバーサル配列は、プライマーのハイブリダイゼーションに便利な部位として機能し、ユニバーサル配列に対し相補的な単一プライマー対を用いて多数の異なる配列の増幅を可能にすることができる。さらに、ユニバーサル配列はまた、例えば捕捉プライマーに対し相補的なアダプターとして機能することが可能であり、捕捉プライマーを固相担体に付着させた実施形態において、ポリヌクレオチドを含むアダプターを捕捉プライマーに固定化することを可能にする。図１パネル１は、下部プライマーの厚肉部として、アダプターとしてのユニバーサル配列を示す。上部プライマーはまた、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズしない配列を含んでいるように示されている。この領域は、ユニバーサル配列または他の配列とすることが可能であり、ユニバーサル配列以外の配列である場合、既知または未知の配列を有することが可能である。

一実施形態において、少なくとも１つのプライマーのハイブリダイゼーション後、複数の標的ポリヌクレオチドを、例えばＰＣＲにより増幅することが可能である。ＰＣＲ増幅は、図１パネル１に示すように、フォワードプライマーおよびリバースプライマーとともに実行し、標的ポリヌクレオチドの指数関数的増幅をもたらすことが可能である。ＰＣＲ増幅はまた、１つのプライマーとともに実行し、標的ポリヌクレオチドの非対称増幅または線形増幅をもたらすことが可能である。非対称増幅は、複数の標的ポリヌクレオチドの一本鎖アンプリコンを生成するのに有用である。本明細書に記載の増幅反応の生成物をアンプリコンと呼ぶ。したがって、複数の標的ポリヌクレオチドの増幅は、鋳型として同一のヌクレオチド配列を有する複数のアンプリコンを生成するだろう。

ＰＣＲ増幅反応に一般的に関連して本明細書で例示するが、本明細書で提供する教示および指導を考慮すると、当業者は、種々の異なる種類のＰＣＲ法といった核酸を増幅する他の方法が、本明細書で開示する増幅ステップで用いるために修正可能であることを知っているだろう。例えば、オリゴヌクレオチドの標的ポリヌクレオチドへのハイブリダイゼーションを用いる増幅反応は、本明細書に開示する増幅ステップにおいて有用である。これは、それが、例えば捕捉プライマーへのハイブリダイゼーションを可能にするアダプターを含むためである。このような、異なるタイプのＰＣＲ法といった他の増幅反応には、例えば、米国特許第８００３３５４号明細書に記載されるように、マルチプレックスＰＣＲ、デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、ダイヤルアウト（dial-out）ＰＣＲ、アレル特異的（allele-specific）ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、ヘリカーゼ依存（helicase-dependent）増幅、ホットスタート（hot start）ＰＣＲ、ライゲーション媒介（ligation-mediated）ＰＣＲ、ミニプライマーＰＣＲ、マルチプレックスライゲーション依存プローブ増幅（multiplex ligation-dependent probe amplification、ＭＬＰＡ）、ネステッド（nested）ＰＣＲ、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（RT-PCR）、固相ＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅（strand displacement amplification、ＳＤＡ）、転写媒介増幅（transcription mediated amplification、ＴＭＡ）、および、核酸配列ベース増幅（nucleic acid sequence based amplification、NASBA）が含まれる。

ポリヌクレオチド照合用マルチプレクス法は、複数の標的ポリヌクレオチドを操作および分析するのに特に有用な方法である。これは、それが、一回の反応で多くの異種標的ポリヌクレオチドの照合を可能にするためである。マルチプレックス法には、例えば、マルチプレックス増幅およびマルチプレックス配列決定が含まれる。他のマルチプレックス核酸照合法が当技術分野では周知である。

マルチプレックスＰＣＲに典型的に関連し、マルチプレックス増幅は単一標的ポリヌクレオチド混合物内にある多数のプライマーセットから成り、異なる標的ポリヌクレオチド配列に特異的な、様々なサイズのアンプリコンを生成する。多数の、異なる標的ポリヌクレオチドを同時に標的にすることにより、一回の増幅反応で複数の標的ポリヌクレオチドの配列情報を得ることが可能であり、これは別の方法では、数倍の反応物とより多くの実行時間を必要とするだろう。各標的特異的プライマーセットのアニーリング温度は、一回の反応で正しく機能するように最適化することが可能であり、アンプリコンサイズ（つまり、塩基対長さ）は同じ、または、異なる長さとすることが可能である。ＰＣＲ用マルチプレキシングキットが商業的に利用可能であり、当技術分野で周知である。異なる標的ポリヌクレオチド種の数は、所望のアプリケーション次第で変動し得る。例えば、マルチプレックス増幅は、２５、５０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００以上の異種標的ポリヌクレオチドについて実行することが可能である。マルチプレックス増幅はまた、上記範囲の任意の整数に対応する複数の標的ポリヌクレオチドについて実行することができる。したがって、本開示はまた、２００以上の異なるヌクレオチド配列を有する複数の標的ポリヌクレオチドなど、上記の数または多数の異なる標的ポリヌクレオチド要素を有する複数の標的ポリヌクレオチドを提供する。

したがって、本開示は、複数の標的ポリヌクレオチドの増幅方法を提供し、ここで該方法はマルチプレックス増幅を含む。マルチプレックス増幅は、マルチプレックスＰＣＲとすることが可能である。本開示はまた、１８０以上の異なる標的ポリヌクレオチド種というマルチプレックス性を有するマルチプレックス増幅方法を提供する。

他の適切な核酸増幅方法には、オリゴヌクレオチド伸長法、ライゲーションローリングサークル型増幅（ligation, rolling circle amplification、ＲＣＡ）法（Lizardiら、Nat. Genet. 19:225-232 (1998)）、およびオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ（oligonucleotide ligation assay、ＯＬＡ）（概して、米国特許第７５８２４２０号明細書；同第５１８５２４３号明細書；同第５６７９５２４号明細書；同第５５７３９０７号明細書；欧州特許第０３２０３０８号明細書；同第０３３６７３１号明細書；同第０４３９１８２号明細書；国際公開第９０／０１０６９号；同第８９／１２６９６号；および、同第８９／０９８３５号を参照）が含まれる。対象の核酸を増幅するように特異的にデザインすることが可能な、プライマー伸長およびライゲーションのプライマーの非限定的例として、増幅は、米国特許第７５８２４２０号明細書および同第７６１１８６９号明細書に例示されているGoldenGate assay（カリフォルニア州サンディエゴ、Illumina（登録商標）社）に用いるプライマーを含み得る。

本開示の方法で用いることが可能な例示的な等温増幅法には、例えばDeanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002)で例示される多置換増幅（Multiple Displacement Amplification、ＭＤＡ）、または、例えば米国特許第６２１４５８７号明細書で例示される等温鎖置換核酸増幅（isothermal strand displacement nucleic acid amplification）が含まれ、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれるが、これらに限定されるわけではない。本開示で用いることが可能な別の非ＰＣＲベース法には、例えば、Walkerら、Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995；米国特許第５４５５１６６号明細書；同第５１３０２３８号明細書；およびWalkerら、Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992)に記載されている鎖置換増幅（strand displacement amplification、ＳＤＡ）、または、例えば、Lageら、Genome Research 13:294-307 (2003)に記載されている超分岐鎖置換増幅（hyperbranched strand displacement amplification）が含まれる。等温増幅法は、鎖置換Phi29ポリメラーゼ、または、Bst DNAポリメラーゼラージフラグメントつまりゲノムＤＮＡのランダムプライマー増幅用5'->3' exo^-とともに用いることが可能である。これらのポリメラーゼの使用は、その高い処理能力および鎖置換作用を利用する。高い処理能力は、ポリメラーゼが長さ１０〜２０ｋｂの断片を生成することを可能にする。上記したように、より小さい断片は、クレノウポリメラーゼといった処理能力および鎖置換作用が低いポリメラーゼを用いて、等温条件下で生成することが可能である。増幅反応、条件およびコンポーネントについての追加の記載は、米国特許第７６７０８１０号明細書の開示に詳細に述べられており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。

本開示で有用な別の核酸増幅法はTagged PCRであり、これは、例えば、Grothuesら、Nucleic Acids Res. 21(5):1321-2 (1993)に記載されるように、定常5'領域の後にランダム3'領域が続く２−ドメインプライマーの集団を用いる。増幅の第１ラウンドを実行し、個別ハイブリダイゼーションに基づく熱変性ＤＮＡにおいてランダムに合成した3'領域から多数の開始を可能にする。3'領域の性質により、開始部位はゲノム全体を通してランダムであるようにする。そのため、非結合プライマーを除去し、さらに、定常5'領域に対し相補的なプライマーを用いて複製を起こすことが可能である。

上記の例示的な増幅方法を用いて、複数の標的ポリヌクレオチドなど、１つまたは２つ以上の標的ポリヌクレオチドを増幅することが可能である。標的ポリヌクレオチドを溶液中で増幅するか、または、固相担体に固定化し、溶液中で遊離した複数のアンプリコンまたは固相担体に固定化した複数のアンプリコンを生成することが可能である。

増幅反応における複数の標的ポリヌクレオチドの入力量は、マイクログラム（μｇ）〜ナノグラム（ｎｇ）以下に及び得る。一部の実施形態において、複数の標的ポリヌクレオチドの開始量は、例えば、１００μｇ以上の入力核酸とすることが可能である。開始量はまた、例えば、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０または９０μｇの入力核酸とすることが可能である。他の実施形態では、入力核酸の開始量は、低ナノグラム範囲を含むナノグラム範囲とすることが可能である。このような実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドの開始量は、例えば、１００ｎｇ以下の入力核酸とすることが可能である。開始量はまた、例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０または１０ｎｇ未満の入力核酸とすることが可能である。他の実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドの開始量は、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２または０．５ｎｇ未満の入力核酸とすることが可能である。開始量はまた、上記の例示量の間の任意の量とすることが可能である。したがって、本開示は、複数の標的ポリヌクレオチドが増幅反応用に１０ｎｇ未満の入力核酸を含む方法を提供する。さらに、複数の標的ポリヌクレオチドは、増幅反応用の１ｎｇの入力核酸または１ｎｇ未満の入力核酸とすることが可能である。

一部の実施形態において、複数の固定化標的特異的捕捉プライマーを、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で複数のアンプリコンと接触させる。標的特異的捕捉プライマーの標的特異的領域は、１つまたは２つ以上の標的ポリヌクレオチドにアニールするようにデザインすることが可能である。ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド捕捉プライマーは、標的特異的捕捉プライマーを介して固定化されるだろう。

図１パネル２は、固相担体に固定化された複数の標的特異的捕捉プライマーを例示する。この図において、標的特異的捕捉プライマーは固相担体に固定化された他の捕捉プライマーより長い。当業者は、標的特異的捕捉プライマーが他の捕捉プライマーより長いか、短いか、または同じ長さであるか否かは重要ではないことを理解しよう。むしろ、任意の捕捉プライマーは、その機能を果たすのに必要な配列を有するだろう。標的特異的捕捉プライマーはその標的ポリヌクレオチドに、選択的または特異的にアニールするように機能する。あるユニバーサル捕捉プライマーのような他の捕捉プライマーは、アダプター、プライマー結合部位、または他の既知の配列といった既知の配列にアニールするように機能する。

複数の標的特異的捕捉プライマー内の各要素は、同一の標的特異的配列か、または異なる標的特異的配列を有することが可能である。前者の実施形態では、複数の標的特異的捕捉プライマーは、複数の同一種の標的ポリヌクレオチドにアニールし、該複数の同一種の標的ポリヌクレオチドを捕捉するだろう。後者の実施形態では、複数の標的特異的捕捉プライマーは、複数の異種標的ポリヌクレオチドにアニールし、該複数の異種標的ポリヌクレオチドを捕捉するだろう。該して、捕捉プライマーの標的特異的領域は、複数の標的ポリヌクレオチドの特定の要素に関し、同一領域に対して相補的であるようにデザインする。しかしながら、標的特異的領域はまた、特定の標的ポリヌクレオチド内で異なるヌクレオチド配列に対し相補的であるようにデザインすることが可能である。したがって、本明細書で提供する教示および指導を考慮すると、当業者は、どのような要素組成物を複数の標的特異的捕捉プライマーに含むことが特定のアプリケーションに必要であるかを理解しよう。

複数の標的特異的捕捉プライマーは大きく、または、小さくすることが可能である。当業者は、複数の標的特異的捕捉プライマーは、捕捉することを望む各標的ポリヌクレオチドに対し、少なくとも１つの標的特異的捕捉プライマーを含むことを理解しよう。複数はまた、複数の標的ポリヌクレオチド内の一部またはすべての標的ポリヌクレオチド種について、多数の標的特異的捕捉プライマーなど、同一の標的ポリヌクレオチド種に対する多数の標的特異的捕捉プライマーを含み得る。したがって、本開示は、複数の標的特異的捕捉プライマーを提供し、これは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または２００以上の異なる要素の集団を含む。複数の標的特異的捕捉プライマーはまた、例えば、３００、４００、５００、１０００、５０００、１００００、５００００、１×１０^５、２×１０^５、３×１０^５、４×１０^５、５×１０^５、６×１０^５、７×１０^５、８×１０^５、９×１０^５、１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、５×１０^６、６×１０^６、７×１０^６、８×１０^６、９×１０^６、１×１０^７以上の異なる要素を含み得る。複数の標的特異的捕捉プライマーはまた、上記の例示的集団数の間の全ての整数を含み得る。したがって、本開示は、２００以上の異なるヌクレオチド配列を有する複数の標的特異的捕捉プライマーを提供する。

複数の標的特異的捕捉プライマーは、図１パネル２に示すように固相担体に固定化することが可能である。複数の標的特異的捕捉プライマーはまた、溶液中に遊離させて用い、その後、例えば、標的特異的捕捉プライマーの第２領域に対し相補的なユニバーサル配列を有する捕捉プライマーへのハイブリダイゼーションにより、固相担体に固定化することが可能である。

図１パネル２に例示するように、複数の標的特異的捕捉プライマーをまず固相担体に固定化する特異的な実施形態では、標的特異的捕捉プライマーを、図示するように固相担体に直接的に付着させることが可能である。あるいは、標的特異的捕捉プライマーをユニバーサル捕捉プライマーから固相担体に生成することができる。この点に関し、捕捉プライマーのより厚い部分は、固相担体に予め播種したユニバーサル配列を表す。ユニバーサルプライマーに対し相補的な領域を有する標的特異的捕捉プライマーまたは複数の標的特異的捕捉プライマーは、例えば、図１パネル２に示すように、ユニバーサル捕捉プライマーにアニールし、その後伸長させて、標準の長さの標的特異的捕捉プライマーまたは複数の標的特異的捕捉プライマーを生成することが可能である。

固定化標的特異的捕捉プライマーを用いる実施形態は、複数のアンプリコンの正規化を可能にすることから有用である。例えば、固相担体を、標準コピー数の各種標的特異的捕捉プライマーを含むように生成し、標準コピー数の標的ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンの捕捉を可能にすることができる。標的特異的捕捉プライマーの標準コピー数は変更可能であり、標準コピー数の、豊富または稀有な標的ポリヌクレオチド種の両方を等しい頻度で捕捉するようにデザインすることが可能である。他の実施形態では、異種標的特異的捕捉プライマーを標準化せず、ランダムを含む任意の所望比率で固定化することが可能である。本明細書で提供する教示および指導を考慮すると、当業者は、等量のコピー数などの標準化コピー数または他の比率の、どちらの異種標的特異的捕捉プライマーが特定の使用に望ましいか、分かるだろう。

複数の標的特異的捕捉プライマーを有することに加え、固相担体はまた、図１パネル２に示すように、複数の他タイプの捕捉プライマーを含むことが可能である。複数の捕捉プライマーは、同じまたは異なる配列を有することが可能である。図１パネル２は、２つの複数のユニバーサル捕捉プライマーを示す（垂直オリゴヌクレオチドの塗りつぶした厚肉部および点描した厚肉部）。この例示的な実施形態において、一方の複数のユニバーサル捕捉プライマーは、複数の標的ポリヌクレオチドに加えたアダプターに対し相補的である。ユニバーサル捕捉プライマーは、例えば、アダプターを含む複数の標的ポリヌクレオチドまたはそのアンプリコンを捕捉するのに有用である。ユニバーサル捕捉プライマーはまた、例えば、図１パネル３および下記でさらに示すブリッジ増幅を行うのに有用である。固相担体は、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上の異なる複数のユニバーサル捕捉プライマーを含むことが可能である。

したがって、本開示は、複数のユニバーサル捕捉プライマーに対し相補的なアダプターを有する、複数の標的ポリヌクレオチドおよび／またはそのアンプリコンを提供する。固相担体は、第１、第２またはより大きい数の、異なる複数のユニバーサル捕捉プライマーを含むことが可能である。ユニバーサル捕捉プライマー領域をさらに有する複数の特異的捕捉プライマーも提供する。ユニバーサル捕捉プライマー領域は、第１または第２の複数のユニバーサル捕捉プライマーに対応するヌクレオチド配列を有することが可能である。

したがって、一部の実施形態において、本開示の方法は、複数の固定化標的特異的捕捉プライマーを有する固相担体を提供するステップを含む。一部の実施形態において、固相担体を提供するステップは、標的特異的捕捉プライマーを固相担体に固定化するステップを含む。一部の実施形態において、複数の標的特異的捕捉プライマーは固相担体に直接的に固定化する。

一部の実施形態では、標的特異的捕捉プライマーを１つまたは２つ以上のステップで固相担体に集める。一部の実施形態では、標的特異的捕捉プライマーの固定化は、ユニバーサル捕捉プライマーを固相担体に固定化するステップを含む。ある実施形態では、標的特異的捕捉プライマーの固定化はさらに、固定化ユニバーサル捕捉プライマーを標的特異的捕捉プライマーに変換するステップを含む。ある実施形態では、標的特異的捕捉プライマーの固定化はさらに、スプリントオリゴヌクレオチドをユニバーサル捕捉プライマーとアニールするステップを含み、ここで該スプリントオリゴヌクレオチドは、標的特異的捕捉プライマーのユニバーサル領域に対し相補的なユニバーサル領域と、標的ヌクレオチドの標的特異的領域に対し相補的な標的特異的領域を含む。ある実施形態では、標的特異的捕捉プライマーの固定化はさらに、ユニバーサル捕捉プライマーを伸長し、標的特異的捕捉プライマーを生成するステップを含む。

一部の実施形態では、標的特異的捕捉プライマーを、他の標的特異的捕捉プライマーと組み合わせて固定化する。一部の実施形態では、標的特異的捕捉プライマーは複数の標的特異的捕捉プライマーを含む。一部の実施形態では、複数の標的特異的捕捉プライマーは２タイプの標的特異的捕捉プライマーのみを含む。例えば、標的特異的捕捉プライマーは、Ｐ５またはＰ７などの２つのユニバーサル捕捉領域のうち何れか１つと、１つの標的特異的領域を含む。Ｐ５領域は、ヌクレオチド配列5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3'を含む。Ｐ７領域は、ヌクレオチド配列5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’を含む。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは、Ｐ５領域配列の逆相補体（「反Ｐ５」：5'-TCGGTGGTCGCCGTATCATT-3'）またはＰ７領域配列の逆相補体（「反Ｐ７」：5'-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’）の捕捉プライマーである。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドはIllumina（登録商標）捕捉プライマーのＰ５（対の末端）（5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC-3'）またはＰ７（対の末端）（5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA(8-oxo-G)AT-3'）とハイブリダイズすることが可能である。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは、Illumina（登録商標）捕捉プライマーのＰ５（対の末端）の逆相補体（「反Ｐ５（対の末端）」：5'-GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3'）またはＰ７（対の末端）の逆相補体（「反Ｐ７（対の末端）」：5'-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'）とハイブリダイズすることが可能である。

他の実施形態において、複数の標的特異的捕捉プライマーは、異なる要素の集団を含む。ある実施形態において、標的特異的捕捉プライマーの集団は、１０、１００、１０００、１００００、１０００００、１００００００、１０００００００超の異なる要素を含み得る。ある実施形態において、標的特異的捕捉プライマーは、標的特異的捕捉領域に含まれる配列が異なる。ある実施形態において、標的特異的捕捉プライマーは、異なる標的ポリヌクレオチドを標的にする。

本開示の一部の実施形態において、固定化標的特異的捕捉プライマーには複数の固定化標的特異的捕捉プライマーが含まれ、標的ポリヌクレオチドには複数の標的ポリヌクレオチドを含まれる。

一部の実施形態では、基本的に、全ての固定化捕捉プライマーが標的特異的捕捉プライマーである。他の実施形態では、標的特異的捕捉プライマーをユニバーサル捕捉プライマーと組み合わせて固定化する。ある実施形態では、超過標的特異的捕捉プライマーを固定化する。ある実施形態では、ユニバーサル捕捉プライマーに対する標的特異的捕捉プライマーの超過は、２：１、３：１、５：１、１０：１、５０：１、１００：１、５００：１、１０００：１、１００００：１、５０：０００：１または１０００００：１より大きい。ある実施形態では、超過ユニバーサル捕捉プライマーを固定化する。ある実施形態では、標的特異的捕捉プライマーに対するユニバーサル捕捉プライマーの超過は、２：１、３：１、５：１、１０：１、５０：１、１００：１、５００：１、１０００：１、１００００：１、５０：０００：１または１０００００：１より大きい。

遺伝子疾患または遺伝病の有無またはかかりやすさを判断するためのある実施形態では、複数の標的特異的捕捉プライマーを、そのような遺伝子疾患または遺伝病と関連する１つまたは２つ以上の遺伝子に向けることが可能である。このような遺伝子疾患または遺伝病には、以前例示したものまたは当技術分野で周知のもののいずれかを含む。例えば、複数の標的特異的捕捉プライマーを２つ以上の疾患に向け、多数の異なる疾患または疾病の有無またはかかりやすさを検出することが可能である。したがって、標的特異的捕捉プライマーのパネルを利用して、多数の異なる疾病を検出することが可能である。パネルは、異なるまたは同じ遺伝子疾患または遺伝子病に関連する、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または２００以上の遺伝子に対し特異的な、複数の標的特異的捕捉プライマー内の要素が含み得る。

がんに関連した遺伝子パネルに関する例として、複数の標的特異的捕捉プライマーは、以下のがん関連遺伝子の全ての組み合わせおよび／または順列など、任意の組み合わせを含み得る：AKT1、CTNNB1、FLT3、KRAS、PTPN11、SRC、ALK、EGFR、GNAS、MLH1、RB1、STK11、ATM、ERBB2、HNF1A、MPL、RAD50、TP53、BRAF、ERBB4、IDH1、NRAS、RET、VHL、BRCA1、FBXW7、JAK3、PIK3CA、SMAD4、CDH1、FGFR2、KIT、PTEN、SMARCB1、ABL1、CSF1R、GNA11、JAK2、NOTCH1、SMO、APC、FGFR1、GNAQ、KDR、NPM1、CDKN2、FGFR3、HRAS、MET、および／またはPDGFRA。

したがって、本開示は、がん関連遺伝子の存在を判断する方法を提供し、ここで複数の標的特異的捕捉プライマーは、以下の遺伝子から選択した２つ以上の異なるヌクレオチド配列を含む：AKT1、CTNNB1、FLT3、KRAS、PTPN11、SRC、ALK、EGFR、GNAS、MLH1、RB1、STK11、ATM、ERBB2、HNF1A、MPL、RAD50、TP53、BRAF、ERBB4、IDH1、NRAS、RET、VHL、BRCA1、FBXW7、JAK3、PIK3CA、SMAD4、CDH1、FGFR2、KIT、PTEN、SMARCB1、ABL1、CSF1R、GNA11、JAK2、NOTCH1、SMO、APC、FGFR1、GNAQ、KDR、NPM1、CDKN2、FGFR3、HRAS、MET、およびPDGFRA。複数の標的特異的捕捉プライマーは以下の各遺伝子のヌクレオチド配列とすることが可能である：AKT1、CTNNB1、FLT3、KRAS、PTPN11、SRC、ALK、EGFR、GNAS、MLH1、RB1、STK11、ATM、ERBB2、HNF1A、MPL、RAD50、TP53、BRAF、ERBB4、IDH1、NRAS、RET、VHL、BRCA1、FBXW7、JAK3、PIK3CA、SMAD4、CDH1、FGFR2、KIT、PTEN、SMARCB1、ABL1、CSF1R、GNA11、JAK2、NOTCH1、SMO、APC、FGFR1、GNAQ、KDR、NPM1、CDKN2、FGFR3、HRAS、MET、およびPDGFRA。

一部の実施形態では、複数のアンプリコンを、例えば、固相担体に固定化した複数の標的特異的捕捉プライマーを直接的に接触させるなどの増幅工程後に、複数の標的特異的捕捉プライマーに直接的に適用または接触させる。したがって、複数のアンプリコンを、著しい精製ステップを挟まず複数の捕捉プライマーに適用することが可能であり、部分的または実質的に未精製の複数のアンプリコンとすることが可能である。そのためこの実施形態では、複数のアンプリコンは、高比率の細胞成分、プライマー、増幅酵素、および未増幅または誤って増幅されたポリヌクレオチドといった混合細胞成分を含む。

他の実施形態では、複数の標的捕捉プライマーを接触させる前に、複数のアンプリコンを部分的または完全に精製することが可能である。このような核酸精製工程は当業者にとって周知であり、例えば、高分子および塩などの細胞成分を除去する沈殿、ろ過、およびクロマトグラフィーを含む。

例えば、固相担体に固定化した複数の標的特異的捕捉プライマーを含む複数の標的特異的捕捉プライマーをハイブリダイズするのに十分な条件には、数分から１時間以上にわたる培養またはアニーリングが含まれ得る。より短いハイブリダイゼーション時間は、任意の後続のステップまたは統合工程でのステップに効率的に移るのに有用である。一部の実施形態において、ハイブリダイゼーションは、例えば６０分以下とすることが可能である。ハイブリダイゼーション時間はまた、例えば、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０分以下とすることが可能である。ハイブリダイゼーションはまた、例えば、９、８、７、６、５分など１０分より短くすることが可能である。ハイブリダイゼーション時間は、さらに、上記の例示時間の間で任意の時間とすることが可能である。したがって、本開示は、ハイブリダイゼーションに十分な条件に、標的特異的捕捉プライマーを培養する、または、アンプリコンもしくは他のポリヌクレオチドへアニールする時間が１０分以下であることを含む、方法を提供する。

一部の実施形態において、複数のアンプリコンは、複数の標的特異的捕捉プライマーに接触させる前は二本鎖とすることが可能である。標的特異的捕捉プライマーによりアニールし捕捉することを可能にするため、複数のアンプリコンを、例えば、高温、または、二本鎖ポリヌクレオチドの２つの鎖を分離するＴｍを降下させる化学反応物により、変性することが可能である。部分的な鎖分離を含む鎖分離は、例えば、複数の標的特異的捕捉プライマーを接触させる前または同時に、行うことが可能である。他の実施形態では、複数のアンプリコンは一本鎖とすることが可能である。このような一本鎖の実施形態では、鎖分離のステップは必要ではないが、該ステップは一本鎖内の第２構造を除去するために有益に用いることが可能である。

固相担体に固定化した標的特異的捕捉プライマーにアニールし固定化した複数のアンプリコンを生成することによるアンプリコン捕捉に続き、例えば、固定化した複数のアンプリコンを部分的に二本鎖に、部分的に一本鎖にすることが可能である。図１パネル３に示すように、最も左の固定化アンプリコンを標的特異的捕捉プローブにハイブリダイズし、非相補的領域は一本鎖のままとする。複数の固定化アンプリコンを含む固定化アンプリコンは、標的特異的捕捉プライマーから酵素伸長することにより二本鎖とすることが可能である。このような二本鎖の伸長生成物を、図３パネル３の中間の固定化アンプリコンで示す。伸長反応は当技術分野で周知であり、下記および実施例においてさらに例示する。

本開示の特定の実施形態に従う次のステップで、固定化した複数のアンプリコンをさらなる工程に進めることが可能である。このようなさらなる工程には、例えば、増幅または配列決定が含まれる。ある実施形態において、第１の複数の固定化アンプリコンを、前述の方法または当技術分野で周知の他の方法のいずれかを用いて増幅し、第２の複数の固定化アンプリコンを生成する。固相担体に固定化する場合、１つの特に有用な増幅工程には、ブリッジ増幅が含まれる。図１パネル３に示すように、例えば、伸長反応から生成した二本鎖または部分的に二本鎖のアンプリコンを変性し、固定化鎖を、例示のようにアダプターへのハイブリダイゼーションを介してユニバーサル捕捉プライマーにアニールする。結果として生じる構造を両末端に固定化してブリッジを作成し、そして、ユニバーサル捕捉プライマーを伸長し、その後例えば標的特異的捕捉プライマーに含まれるユニバーサルプライマー領域を用いて増幅することが可能である。この第２のユニバーサル捕捉プライマーは、アダプター配列に対し相補的な第１のユニバーサルプライマーと異なってよい。固定化していない鎖は、例えば、洗い流される場合がある。したがって、本開示の方法は、ブリッジ増幅を含む増幅方法を提供する。

本明細書に記載のブリッジ増幅方法は、複数内のアンプリコンに対し均一なクラスタまたはコロニー数をもたらす。クラスタの均一性は図２および３に示し、下記の実施例でさらに記載する。したがって、本開示は固定化ポリヌクレオチドの増幅方法を提供し、ここで均一性には０．１平均で８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、または９５以上が含まれる。

ブリッジ増幅において、例えば、適切な条件を、固定化した複数の一本鎖伸長生成物などの固定化一本鎖伸長生成物に適用し、その結果、一本鎖伸長生成物を固定化ユニバーサル捕捉プライマーにアニールしてブリッジ構造の形をした複合体を形成する。バッファを無効化および／またはハイブリダイズするといった適切な条件は当技術分野では周知である（SambrookおよびRussell、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)；Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1998)を参照）。無効化および／またはハイブリダイズしたバッファはその後除去することが可能である。

次に、伸長に対し適切な条件を適用することにより伸長反応を行う。複合体の増幅オリゴヌクレオチドをヌクレオチドの配列追加により伸長し、一本鎖ポリヌクレオチド分子に対し相補的な伸長生成物を生成する。結果として生じる二本鎖を両末端で固定化し、その結果、各鎖を固定する。

ポリメラーゼ活性を有する酵素を含む伸長バッファ／溶液などの適切な条件が当技術分野では周知である（Sambrookら、上記参考文献；Ausubelら、上記参考文献を参照）。このブリッジ増幅技法は、例えば、米国特許第７１１５４００号明細書および米国特許出願公開第２００５／０１００９００号明細書に記載されているように実行することが可能であり、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる。

本開示で用いることが可能なポリメラーゼ活性を有する酵素の例には、ＤＮＡポリメラーゼ（クレノウ断片、T4ＤＮＡポリメラーゼ）、種々の熱安定性バクテリアに由来する耐熱ＤＮＡポリメラーゼ（Taqポリメラーゼ、VENTポリメラーゼ、Pfuポリメラーゼ、またはTfIＤＮＡポリメラーゼなど）、およびその遺伝子改変誘導体（TaqGold、VENTexo、またはPfuexo）がある。ＲＮＡポリメラーゼおよび逆転写酵素の組み合わせも、伸長生成物を生成するのに用いることが可能である。特に酵素は、これらおよび関連する実施形態において鎖置換能を有することが可能であり、特に酵素は約７〜約９のｐＨ、特に７．９〜８．８のｐＨで活性し、特に、ある例示的な実施形態では酵素はＢｓｔまたはクレノウである。

使用するヌクレオシドトリホスフェート分子は、典型的に、例えばｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰといったデオキシリボヌクレオチドトリホスフェートであるか、または、例えばＡＴＰ、ＵＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰといったリボヌクレオシドトリホスフェートである。ヌクレオシドトリホスフェート分子は、天然または非天然に発生することが可能である。

ハイブリダイゼーションおよび伸長のステップ後、担体および付着核酸を変性条件に従わせることが可能である。伸長バッファを変性バッファの流入により概ね除去するように、フローセルを用いることが可能である。適切な変性バッファが当技術分野で周知である（Sambrookら、上記参考文献；Ausubelら、上記参考文献を参照）。例として、ｐＨ変化およびイオン強度の低い溶液により、実質的に等しい温度で核酸を変性することが可能である。ホルムアミドおよび尿素は核酸の塩基とともに新しい水素結合を形成し、ワトソン・クリック型塩基対につながる水素結合を阻害する。特定の実施形態において、ホルムアミド濃度は５０％以上である。これらは一本鎖核酸分子をもたらす。必要であれば、鎖は、非常に低塩（例えば０．０１Ｍカチオン状態）かつ高ｐＨ（＞１２）の溶液で処置するか、カオトロピック塩（例えば塩化グアニジニウム）を用いることにより分離することが可能である。特定の実施形態では強塩基を用いる。強塩基は、酸塩基反応において非常に弱い酸を脱プロトン化することができる塩基性化合物である。塩基の強度はそのｐＫｂ値により示され、ｐＫｂ値が約１未満の化合物は強塩基と呼ばれ、当業者に周知である。特定の実施形態において、強塩基は０．０５Ｍ〜０．２５Ｍ、特に０．１Ｍの濃度で用いる水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）である。

上で例示したハイブリダイゼーション、伸長、および変性のステップ後、（初めに固定化した）第１の鋳型一本鎖ポリヌクレオチド分子と同じ配列を含む第１核酸と、それに対し相補的であり、固定化捕捉オリゴヌクレオチドの一つから伸長する第２核酸の、２つの固定化核酸が存在するだろう。両方の固定化鎖をその後、担体をさらにハイブリダイゼーション、伸長、および変性のサイクルにかけることにより、増幅ラウンドを始めることができる。したがって増幅は、アニーリング、伸長、および変性のサイクルを通して、一本鎖から二本鎖へ、１つの二本鎖から２つの二本鎖へ、２つの二本鎖から４つの二本鎖へなどと進む。

増幅方法の各ステップの間で、任意の洗浄ステップを実行することが有益であり得る。例えば、ｄＮＴＰの有無を問わないポリメラーゼ酵素なしの伸長バッファを、固相担体を除去して全伸長バッファと交換する前に該固相担体に適用することが可能である。

このようなさらなる増幅ラウンドを用いて、一本鎖ポリヌクレオチド配列およびその相補的配列の多数の固定化コピーを有する核酸コロニーまたはクラスタを生成することが可能である。

アンプリコンの最初の固定化は、伸長生成物を、鋳型ポリヌクレオチド分子の全長のある距離に位置するユニバーサル捕捉プライマーと、ハイブリダイズすることが可能であることを意味する。固定化伸長生成物およびその相補物のより多くのコピーを、さらなる増幅ラウンドを実行することにより、つまり、ハイブリダイゼーション、伸長、および変性のさらなるラウンドを実行することにより合成したら、生成された核酸コロニーまたはクラスタの境界をさらに伸長させることができるだろう。

したがって、本開示の方法は、第１の複数の多重固定化一本鎖アンプリコンから第２の複数の固定化アンプリコンまたはポリヌクレオチドのコロニーを生成することを可能にし、そして、これらのコロニーの密度を、固相担体に固定化したユニバーサル捕捉プライマーの比率を変えることにより制御することを可能にする。

特定の一態様では、本開示の方法を用いて、固相増幅により、米国特許第７１１５４００号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１００９００号明細書、国際公開第００／１８９５７号、および同９８／４４１５１号に記載されているものと類似した核酸コロニーのクラスタ化アレイが調製される。

本開示の方法により形成したクラスタ化アレイは、マイクロアレイなど規則正しいアレイで通常実行されるアプリケーションでの使用に適している。非限定的例として、このようなアプリケーションには、ハイブリダイゼーション分析、遺伝子発現分析、タンパク質結合分析、配列決定、遺伝子型決定、および核酸メチル化分析等が含まれる。クラスタ化アレイは、例えば、蛍光ＲＮＡとのハイブリダイゼーションまたは蛍光標識タンパク質を用いた結合研究など下流アプリケーションに用いる前に、配列決定することが可能である。

図１パネル４に示すように、本開示はまた、固相増幅により生成した増幅核酸の配列を決定する方法を含む。したがって、本開示は、上記のように固相増幅を用いた複数の固定化伸長生成物を増幅するステップと、核酸配列決定反応を実行して、固相増幅反応で生成された少なくとも１つの増幅核酸鎖の全てまたは一部の配列を決定するステップを含む、核酸配列決定方法を提供する。

ある実施形態において、本明細書に記載の、複数の異なる標的ポリヌクレオチドの配列を獲得する方法は、連続的または統合したやり方で行うことが可能であり、これは開始〜終了時間を短くする。例えば、本明細書に記載の方法を使うと、複数の標的ポリヌクレオチドの配列は３時間以下５０回の配列決定サイクルで決定することが可能である。開始〜終了時間はまた、例えば、５０回の配列決定サイクルで２．９、２．８、２．７、２．６または２．５時間以下とすることが可能である。統合方法は、例えば、１０ｎｇ以下の入力核酸で開始するステップと；複数の標的ポリヌクレオチドを増幅して複数のアンプリコンを生成するステップと；前記複数のアンプリコンを捕捉して第１の複数の固定化アンプリコンを生成するステップと；前記第１の複数の固定化アンプリコンを増幅して第２の複数の固定化アンプリコンを生成し、少なくとも５０回の配列決定サイクルで前記アンプリコンの配列を決定するステップを含む。当業者は、複数の標的ポリヌクレオチドについて配列の獲得にかかる開始〜終了時間は同じように効率的であるものの、より多くの配列決定サイクルを行う場合はより長くなるだろうということを理解しよう。例えば、５０回の配列決定サイクルは約２時間かかり、開始〜終了までの全時間は約２時間５０分になり得る一方、１５０回の配列決定サイクルは４．５時間かかり、開始〜終了の全時間は約５〜６時間の間になり得る。

配列決定は、任意の適切な配列決定技法を用いて行うことが可能である。特に有用な方法は、ヌクレオチドを連続的に遊離3'ヒドロキシル基に付加し、5'から3'の方向でポリヌクレオチド鎖を合成するものである。付加するヌクレオチドの性質は、各ヌクレオチド付加後または配列決定プロセス終了時に判断することが可能である。ライゲーションによる配列決定を用い、隣接塩基の全てを配列決定するわけではない配列決定技法、および、塩基を表面の鎖に付加するのではなく除去する、超並列的遺伝子ビーズクローン解析法（massively parallel signature sequencing；ＭＰＳＳ）などの技法もまた、本開示の範囲内である。

例えば、１つの有用な配列決定方法は、合成時解読（sequencing-by-synthesis；ＳＢＳ）法である。ＳＢＳでは、核酸鋳型（例えば、標的核酸またはそのアンプリコン）に沿った核酸プライマーの伸長をモニタリングして、鋳型のヌクレオチド配列を決定する。基礎となる化学プロセスは、（例えば、ポリメラーゼ酵素により触媒される）重合とすることが可能である。特定のポリメラーゼに基づいたＳＢＳの実施形態では、蛍光標識ヌクレオチドを鋳型依存方法でプライマーに付加し（それによりプライマーを伸長し）、その結果、プライマーに付加したヌクレオチドの順番と型の検出を用いて鋳型の配列を決定することが可能である。

以下でさらに記載するように、フローセルは、本開示の方法により生成した増幅ＤＮＡ断片を収容するのに便利な固相担体を提供する。このようなフォーマットにおける１つまたは２つ以上のアンプリコンは、ＳＢＳまたは他の、サイクルにおいて反応物の送達を繰り返す検出技法にかけることが可能である。例えば、第１のＳＢＳサイクルを開始するため、１つまたは２つ以上のヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどを、１つまたは２つ以上の増幅核酸分子を収容するフローセルに／フローセルを介して流すことが可能である。プライマー伸長が標識ヌクレオチドの取り込みを引き起こす部位を検出することが可能である。任意で、ヌクレオチドは可逆性終結特性をさらに含むことができ、これはヌクレオチドをプライマーに付加したら、さらなるプライマー伸長を終結する。例えば、可逆性ターミネーター部を有するヌクレオチド類似物をプライマーに付加し、その結果、脱ブロック剤を送達して該部を取り除くまで、後続の伸長を生じ得なくすることが可能である。したがって、可逆性終結法を用いる実施形態では、脱ブロック化試薬を（検出が起きる前後で）フローセルに送達することが可能である。洗浄は、種々の送達ステップの間で行うことが可能である。その後、サイクルをｎ回繰り返し、ｎヌクレオチド分、プライマーを伸長し、それにより長さｎの配列を検出することが可能である。本開示の方法により生成されるアンプリコンと共に使用する上で容易に適合させることが可能な例示的な工程、流体システム、および検出プラットフォームは、例えば、Bentleyら、Nature 456:53-59 (2008)；国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７０５７０２６号明細書、国際公開第９１／０６６７８号、同第０７／１２３７４４号、米国特許第７３２９４９２号明細書、同第７２１１４１４号明細書、同第７３１５０１９号明細書、同第７４０５２８１号明細書、および、米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載されており、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。

パイロシーケンシングなど、サイクル反応を用いる他の配列決定工程を用いることが可能である。パイロシーケンシングは、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖に取り込まれると、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の放出を検出する（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる、Ronaghiら、Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996)；Ronaghi、Genome Res. 11(1), 3-11 (2001)；Ronaghiら、Science 281(5375), 363 (1998)；米国特許第６２１０８９１号明細書；同第６２５８５６８号明細書；および同第６２７４３２０号明細書を参照）。パイロシーケンシングにおいて、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによりアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に即座に変換することにより検出することが可能であり、発生したＡＴＰ量はルシフェラーゼ発光光子を介して検出することが可能である。したがって、配列決定反応は、発光検出系によりモニタリングすることが可能である。蛍光ベース検出系で用いる励起放射線源は、パイロシーケンシング工程に必要ではない。本開示に従って生成したアンプリコンへのパイロシーケンス法の適用に適合させることができる、本開示に従って生成したアンプリコンに対するパイロシーケンシングの適用において、適合させることが可能な有用な流体形、検出器および工程は、例えば、ＷＩＰＯ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／５７１１１、米国特許出願公開第２００５／０１９１６９８号明細書、米国特許第７５９５８８３号、および同第７２４４５５９号明細書明細書に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを要する方法を利用することが可能である。例えば、ヌクレオチドの取り込みは、フルオロフォア担持ポリメラーゼとγ-ホスフェート標識ヌクレオチドの間の蛍光共鳴エネルギー移動（fluorescence resonance energy transfer；ＦＲＥＴ）相互作用により、または、zeromode waveguides（ＺＭＷ）法により検出することが可能である。ＦＲＥＴをベースとする配列決定用の技法および試薬は、例えば、Leveneら、Science 299, 682-686 (2003)；Lundquistら、Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008）；Korlachら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。

一部のＳＢＳ実施形態は、ヌクレオチドが伸長生成物に取り込まれた際に放出される光子の検出を含む。例えば、放出光子の検出に基づいた配列決定は、Ion Torrent（コネチカット州ギルフォード、Life Technologies子会社）から市販されている電気的検出器および関連技法、または、それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号明細書；同第２００９／０１２７５８９号明細書；同第２０１０／０１３７１４３号明細書；または同第２０１０／０２８２６１７号明細書に記載されている配列決定方法および系を用いることが可能である。本明細書で述べる、結合平衡除外法（kinetic exclusion）を用いた標的核酸を増幅する方法は、プロトンを検出するのに用いる基板に容易に適用することが可能である。具体的には、本明細書で述べる方法を用いて、プロトンの検出に使用するアンプリコンのクローン集団を生成することが可能である。

別の有用な配列決定技法は、ナノポアシーケンシングである（例えば、Deamerら、Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000)；Deamerら、Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002)；Liら、Nat. Mater. 2:611-615 (2003)を参照。これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）。一部のナノポア実施形態では、標的核酸または標的核酸から除去した別ヌクレオチドをナノポアに通す。核酸またはヌクレオチドをナノポアに通すと、ポアの電気伝導度の変動を測定することにより、それぞれのヌクレオチド型を特定することが可能である（米国特許第７００１７９２号明細書；Soniら、Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007)；Healy、Nanomed. 2, 459-481 (2007)；Cockroftら、J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008)。これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）。

本開示に従った検出に適用可能な、アレイをベースとする発現および遺伝子型決定の例示的方法は、米国特許第７５８２４２０号明細書；同第６８９０７４１号明細書；同第６９１３８８４号明細書もしくは同第６３５５４３１号明細書、または、米国特許出願公開第２００５／００５３９８０号明細書；同第２００９／０１８６３４９号明細書もしくは同第２００５／０１８１４４０号明細書に記載されており、これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。

フォワード増幅オリゴヌクレオチドおよびリバース増幅オリゴヌクレオチドの両方が固相表面に共有結合的に固定化される固相増幅反応の生成物は、上記のようないわゆるブリッジ構造である。例えば配列決定といった核酸照合工程に、より適した鋳型を生成するため、少なくとも部分的に一本鎖である鋳型を生成することを目的に、ブリッジ構造の固定化鎖のうち１つの全てまたは少なくとも一部を、実質的に除去または置換することが有用であり得る。したがって、一本鎖の鋳型の一部は、配列決定プライマーにハイブリダイズするために利用可能である。ブリッジ２本鎖核酸構造において、１本の固定化鎖の全てまたは一部を除去するプロセスは、本明細書で線形化ということが可能であり、そして、国際公開第０７０１０２５１号および米国特許出願公開第２００９／１１８１２８号明細書にさらに詳細に記載され、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

ブリッジ鋳型構造は、限定エンドヌクレアーゼで一方または両方の鎖を切断することにより、または、ニッキングヌクレアーゼで一方の鎖を切断することにより、線形化することが可能である。他の切断方法を限定酵素またはニッキング酵素の代替案として用いることが可能であり、該切断方法には、とりわけ、化学切断（例えば、過ヨウ素酸塩を用いたジオールリンケージの切断）、エンドヌクレアーゼ（例えば、アメリカ合衆国マサチューセッツ州イプスウィッチ、ＮＥＢ社により提供される、製品番号Ｍ５５０５ＳのＵＳＥＲ）を用いるか、熱もしくはアルカリにさらすことによる非塩基部位の切断、増幅生成物に取り込まれるか、さもなければデオキシリボヌクレオチドから成るリボヌクレオチドの切断、光化学切断、または、ペプチドリンカーの切断が含まれる。

切断ステップ後、切断に用いた方法を問わず、固相担体に付着していない切断鎖の一部を除去するため切断反応の生成物を変性条件に従わせることが可能である。例えば、水酸化ナトリウム溶液、ホルムアミド溶液、または熱といった適切な変性条件が、標準分子生物学プロトコル（Sambrookら、上記参考文献；Ausubelら、上記参考文献）に関して熟練の読者には明らかであろう。変性は、部分的または実質的に一本鎖の配列決定鋳型の生成をもたらす。その後、配列決定プライマーを鋳型の一本鎖部にハイブリダイズすることにより、配列決定反応を開始することが可能である。

種々の固相担体を本開示の方法で使用可能である。例えば、一部の実施形態において固相担体は、捕捉プライマーを規則正しいパターンで固定化するのに適したパターン付き表面を含む。「パターン付き表面」は、固相担体の露出層における異なる領域の配置を意味する。例えば、１つまたは２つ以上の領域は、１つまたは２つ以上の捕捉プライマーが存在するフィーチャとすることが可能である。フィーチャは、捕捉プライマーが存在しない格子間領域により分離することが可能である。一部の実施形態において、パターンは、行と列の形をしたx−yフォーマットのフィーチャとすることが可能である。一部の実施形態においてパターンは、フィーチャおよび／または格子間領域の繰り返し配置とすることが可能である。一部の実施形態において、パターンは、フィーチャおよび／または格子間領域のランダム配置とすることが可能である。一部の実施形態において、捕捉プライマーは固相担体にランダムに分布させる。一部の実施形態において、捕捉プライマーはパターン付き表面に分布させる。本明細書に述べる方法および組成物で用いることが可能な例示的パターン付き表面は、米国特許出願番号第１３／６６１５２４号明細書または米国特許出願公開第２０１２／０３１６０８６号明細書に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態において、固相担体は表面にウェルまたはくぼみのアレイを含む。これは、種々の技法を用いて当技術分野で一般的に知られているように製造することができ、該技法にはフォトリソグラフィ、スタンピング技法、成形技法、およびマイクロエッチング技法が含まれるが、これらに限定されるわけではない。当業者には理解されるだろうが、用いる技法は組成物およびアレイ基板の形に左右されるだろう。

固相担体の組成物および形状寸法は、その用途によって変化する。一部の実施形態において、固相担体は、スライド、チップ、マイクロチップ、および／またはアレイなどの平面構造である。したがって、基板の表面は平面層形状とすることが可能である。一部の実施形態において、固相担体は１つまたは２つ以上のフローセル表面を含む。本明細書で用いる場合の「フローセル」という用語は、１つまたは２つ以上の流体試薬を流すことができる固相表面を含んだチャンバを意味する。本明細書で容易に使用可能なフローセル、関連する流体系、および検出プラットフォームの例は、例えば、Bentleyら、Nature 456:53-59 (2008)；国際公開第WO０４／０１８４９７号；米国特許第７０５７０２６号明細書；国際公開第ＷＯ９１／０６６７８号；同第ＷＯ０７／１２３７４４号；米国特許第７３２９４９２号明細書；米国特許第７２１１４１４号明細書；米国特許第７３１５０１９号明細書；米国特許第７４０５２８１号明細書、および米国特許出願公開２００８／０１０８０８２号明細書に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。

一部の実施形態において、固相担体またはその表面は、チューブまたは容器の内部表面または外部表面のような非平面状である。一部の実施形態において、固相担体は微小球またはビーズを含む。本明細書の「微小球」、「ビーズ」、「微粒子」、もしくは「粒子」、または文法上の同義語は、離散小粒子を意味する。適切なビーズ組成物には、プラスチック、セラミック、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性体、トリアゾル、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックス、または、セファロースなどの架橋デキストラン、セルロース、ナイロン、架橋ミセルおよびテフロン（登録商標）が含まれるが、これらに限定されるわけではなく、同様に、固相担体として本明細書で略述した任意の他の物質を全て用いることができる。インディアナ州フィッシャーズBangs Laboratories社の「微小球検出ガイド」は有用なガイドである。ある実施形態では、微小球は磁気微小球または磁気ビーズである。

ビーズは球体である必要がなく、不規則な粒子を用いることができる。あるいは、または、加えて、ビーズは多孔質とすることができる。ビーズのサイズは、ナノメートルつまり１００ｎｍからミリメートルつまり１ｍｍに及び、約０．２ミクロン〜約２００ミクロンのビーズが好適であり、約０．５〜約５ミクロンのビーズが特に好適であるが、一部の実施形態ではより小さいまたはより大きいビーズを用いることができる。

本開示はまた、ある実施形態において、１つまたは２つ以上の捕捉プライマーを固定化するフローセルを提供する。ある複数の捕捉プライマーは標的捕捉プライマーとすることが可能である。標的特異的捕捉プライマーは、ユニバーサルプライマー領域を含むことが可能である。別の複数の捕捉プライマーは、ユニバーサル捕捉プライマーとすることが可能である。上記の例示的な複数の捕捉プライマーの片方または両方を、フローセルに固定化することが可能である。

従って、本開示はまた、複数のアンプリコンクラスタを調整するためのフローセルにも関連し、ここでフローセルは、１つまたは２つ以上の複数の固定化捕捉プライマーのコーティングを含む。したがって、本明細書に記載の固相担体は、フローセル内またはフローセルの一部として生じさせることが可能であり、本明細書で述べる方法は、フローセル内で実行することが可能である。１つまたは２つ以上の複数の捕捉プライマーは、狭小な各位置にある異なる配列を含んだ離散位置ではなく、フローセルの表面全体にコーティングすることが可能である。フローセルは１ｃｍ^２以上の大きさとすることができ、それにより、１ｃｍ^２以上の全体は、１つまたは２つ以上の複数の捕捉プライマーそれぞれにつき、捕捉プライマーの多数のコピーのコーティングを含む。オリゴヌクレオチドをアレイの単一平面ではなく、フローセルチャンバそれぞれの表面；上部、下部、壁、および端に付着させることから、フローセルは、例えば、まだらのアレイまたはフォトリソグラフィ−で合成したアレイと区別することが可能である。しかしながら、必要であれば、本明細書で述べる方法で用いるフローセルは、オリゴヌクレオチドに対し異なる反応度の表面を有することが可能であり、この結果、オリゴヌクレオチドは、１つもしくはサブセットの前記表面か、または、これらの表面内サブセット領域にのみ付着する。

フローセルは、ある実施形態において、異なる配列組成物、つまり、図１パネル３に示すように２つの捕捉プライマー種と標的特異的捕捉プライマーという３つの複数の捕捉プライマー種でコーティングすることが可能である。さらに、標的特異的捕捉プライマーは、図１パネル３で示すように、２つの複数の捕捉プライマーの一方として、同一の配列を有するユニバーサルプライマー領域を含むことが可能である。フローセルはある実施形態において、わずか３つの複数の捕捉プライマー種でコーティングすることが可能である。しかしながら、他の特定の実施形態では、フローセルはさらに、ユニバーサル捕捉プライマー、標的特異的捕捉プライマー、または他の捕捉プライマー種という、１つまたは２つ以上の他の複数の捕捉プライマー種を含むことが可能である。標的特異的捕捉プライマーは、ユニバーサル捕捉プライマーより低い濃度、例えば、少なくとも、１００、１０００、１０００００倍低い相対濃度で存在し得る。２つの複数のユニバーサル捕捉プライマーは、例えば、２倍未満で変化させながら、互いに同程度の比率で存在させることが可能である。本明細書で提供する教示および指導を考慮すると、当業者は、所望の結果を得るためにどのような構成のユニバーサル捕捉プライマーと標的特異的捕捉プライマーをフローセルに固定化すべきか、理解するだろう。

本開示はまた、核酸配列変異体の検出感度を高める方法を提供する。該方法は、（ａ）複数の標的ポリヌクレオチドを含む核酸サンプルを、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で、遺伝子特異的フォワードプライマーおよび遺伝子特異的リバースプライマーに接触させるステップであって、前記遺伝子特異的フォワードプライマーの各種は固有の配列インデックスおよびアダプターを含む、ステップと；（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、前記複数の標的ポリヌクレオチドを増幅し、複数のアンプリコンを生成するステップと；（ｃ）固相担体に固定化した複数の標的特異的捕捉プライマーを、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で前記複数のアンプリコンと直接的に接触させて、第１の複数の固定化アンプリコンを生成するステップであって、前記固相担体は複数のユニバーサル捕捉プライマーをさらに含む、ステップと；（ｄ）前記複数の標的特異的捕捉プライマーを伸長して、前記標的ポリヌクレオチドに対し相補的な、複数の固定化伸長生成物を生成するステップと；（ｅ）前記複数のユニバーサル捕捉プライマーを前記複数の固定化伸長生成物にアニールするステップと；（ｆ）ＰＣＲにより前記複数の固定化伸長生成物を増幅して、第２の複数の固定化アンプリコンを生成するステップであって、前記第２の複数の固定化アンプリコンは８５％以上の均一性を備える、ステップと；（ｇ）前記第２の複数の固定化アンプリコンの配列を決定するステップと；（ｈ）標的ポリヌクレオチド種に関し、変異体位置にある３つ以上のヌクレオチド配列を比較することにより、１つまたは２つ以上の標的ポリヌクレオチドに関するランダムな配列エラーを解消するステップであって、前記標的ポリヌクレオチド種を前記固有の配列インデックスにより特定し、それにより、前記１つまたは２つ以上の標的ポリヌクレオチドにおける真のヌクレオチド配列変異体を求める、ステップを含む、方法を提供する。

上記の方法はまた、核酸配列変異体の検出感度を高めるために用いることが可能である。核酸増幅および配列決定において、これらの工程におけるポリメラーゼの非忠実性から生じる配列決定エラーを、例えば、真の配列と区別することが重要である。この区別は、サンプルにおいて自然に生じる変異体配列を特定するために特に重要である。真の配列変異体をランダムなヌクレオチド配列エラーと区別することは、固有の配列バーコードまたは配列インデックスを複数の標的ポリヌクレオチド内の各ポリヌクレオチド種と関連付けることにより達成可能である。

図５は、固有インデックスの各標的ポリヌクレオチド種への付着を示す。図５は（該図で「鋳型」と特定されている）複数の標的ポリヌクレオチドを示す。説明のため、複数体は３つの要素からなり、ここで要素の１つは真のヌクレオチド変異体（白星）である。固有バーコードを各要素に加え、前記複数体を増幅して、固有にバーコードを付けた最初の要素にそれぞれ由来する３つの複数のアンプリコンを生成する。３つの複数体の起源は、バーコードの配列決定および特定により、特定することが可能である。各複数体の要素の比較により、それぞれまたはほとんどの要素で変異体が生じているのが分かる。対照的に、ある複数のアンプリコンは、アンプリコン複数体の残りの要素と比較して配列の違う要素（黒星）を含む。この複数体の要素の大多数はそのヌクレオチド変化を含まないため、その混入はランダムエラーにより起きたものである。

上記の設計はまた、複数の異なる標的ポリヌクレオチド内の真の変異体を特定するのに適用可能である。本明細書に記載するように、標的ポリヌクレオチド種は、同一の配列を有する複数の標的ポリヌクレオチドの要素を意味する。この実施形態では、各標的ポリヌクレオチド種を、該標的ポリヌクレオチド種を他の標的ポリヌクレオチド種と区別する同一の固有インデックスで特定する（逆の場合も同じ）。したがって、同一の配列を有する標的ポリヌクレオチド（つまり、種の要素）は同一のインデックスを有する。増幅に続くことと種の要素の配列を決定することは、同一のインデックスを有することにより特定することが可能であり、ランダムエラーと比較される真の変異体の発生は、複数の種の要素内の他の要素との配列比較に基づいて判断することが可能である。

したがって、上述の方法はさらに、標的ポリヌクレオチドを増幅するのに用いる遺伝子特異的プライマー内にインデックス配列を含むことが可能である。そのため、各遺伝子特異的プライマーは、それが対応する標的ポリヌクレオチドを特定する固有のインデックスを含むことになる。したがって、複数の異なる標的ポリヌクレオチドに対応する複数の遺伝子特異的プライマーを用いて複数の異なる標的ポリヌクレオチドを増幅し、そして、固有に特定するインデックスを、このように生成される、結果として生じる複数のアンプリコン内の各アンプリコン種に組み込む。

インデックスは、他のインデックスと区別可能な固有ヌクレオチド配列とすることが可能である。それはまた、標的ポリヌクレオチド内の配列または位置の何れかによって、複数のポリヌクレオチド内にある他のヌクレオチド配列と区別することが可能である。ヌクレオチドインデックスは、ランダムな、または、特異的にデザインした、ヌクレオチド配列とすることが可能である。インデックスは、分析または照合する集団の複数のインデックスおよび／または複数のポリヌクレオチド内の、固有ヌクレオチド配列であるのに十分な長さである限り、任意の所望の配列長とすることが可能である。一部の実施形態において、インデックスは、ポリヌクレオチド、または、約８〜３０個のヌクレオチドにわたるポリヌクレオチド内領域である。インデックスは、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個以上の長さのヌクレオチドとすることが可能である。例えば、インデックスは、３５、４０、４５、５０個以上の長さのヌクレオチドとすることが可能である。

図７は、インデックスを標的ポリヌクレオチドに取り込むための、１つの例示的な遺伝子特異的プライマーデザインを示す。この実施形態において、インデックスは、遺伝子特異的フォワードプライマー（ＧＳＦ）におけるグレー一色の領域に対応する。図７に示すように、インデックスを含む遺伝子特異的フォワードプライマーと遺伝子特異的リバースプライマーに対応するプライマー対での増幅により、インデックスをアンプリコンに取り込む。図７はさらに、非対称増幅および後続のブリッジ増幅による継続増幅フォローインデックスの取り込みと、ＧＳＦによりまた導入されたプライマー結合部位に対し特異的な配列決定プライマーを用いる配列決定を示す。

図８はインデックスを標的ポリヌクレオチドに取り込むための、別の例示的な遺伝子特異的プライマーを示す。この実施形態では、インデックスを第２の増幅ステップで取り込む。例えば最初の増幅は、遺伝子特異的フォワード（ＧＳＦ）プライマーおよび遺伝子特異的リバース（ＧＳＲ）プライマーの対で実行する。プライマーの一方または両方は、増幅の後続ラウンド用のプライマー結合部位など、ユニバーサル配列領域を含むことが可能である。この実施形態において、インデックスはグレー一色の領域にも対応し、それは後続ラウンドのプライマーの何れかに含めることが可能であるが、ＧＳＦにより取り込まれるプライマー結合部位に結合するプライマー（ＳＢＳ３配列決定プライマー）にあるように図示されている。図８に示すように、インデックスを含むプライマーとリバースプライマーに対応するプライマー対での増幅は、インデックスをアンプリコンに取り込む。図８はさらに、非対称増幅および後続のブリッジ増幅による継続増幅フォローインデックスの取り込みと、後続の増幅ラウンドで用いるプライマーによりまた導入されたプライマー結合部位に対し特異的な、配列決定プライマーを用いた配列決定とを示す。このプライマーはまた第２のプライマー結合部位を含み、この結果、それは、標的ポリヌクレオチドと並行して配列決定するためのインデックスの上流にある。

本明細書で提供する教示および指導を考慮すると、当業者は、本明細書で開示する全ての方法はまた、標的特異的捕捉プライマーに取り込んだ固有インデックスで実行し、核酸配列変異体の検出感度を高めることが可能であることを理解するだろう。

したがって、本開示の方法は、核酸配列変異体の検出感度を高める方法を提供し、ここで複数の標的ポリヌクレオチドは１０ｎｇ以下の入力核酸を含む。該方法は、ハイブリダイゼーションに十分な条件を有し、１０分以下の培養を含むことが可能である。該方法はさらに、変異体ヌクレオチド位置について０．３％以下のミスマッチ率を検出するステップを含む。

核酸配列変異体の検出感度を高める方法であって、複数の標的ポリヌクレオチドを有する核酸を接触させるステップは、第１の遺伝子特異的フォワードプライマーとリバースプライマーを用いるＰＣＲ増幅の第１ラウンドと、第１の遺伝子特異的フォワードプライマーの一部に対し相補的な第２のフォワードプライマーを用いたＰＣＲ増幅の第２ラウンドを含み、前記第２のフォワードプライマーは固有配列インデックスおよびアダプターを含む、方法も提供する。アダプターは、複数のユニバーサル捕捉プライマーに対し相補的とすることが可能である。ユニバーサル捕捉プライマーは、固相担体に固定化することが可能である。

核酸配列変異体の検出感度を高める方法であって、前記複数の標的ポリヌクレオチドの増幅には非対称ＰＣＲを含む方法を、さらに提供する。前記複数の標的ポリヌクレオチドの増幅はまた、マルチプレックス増幅を含み得る。マルチプレックス増幅は１８０以上のマルチプレックス性を含む。

核酸配列変異体の検出感度を高める方法であって、前記固相担体はさらに、第２の複数のユニバーサル捕捉プライマーを含む方法を、さらに提供する。さらに、複数の標的特異的捕捉プライマーはさらにユニバーサル捕捉プライマー領域を含むことが可能である。前記ユニバーサル捕捉プライマー領域は、前記第２の複数のユニバーサル捕捉プライマーに対応する、または、相補的である、ヌクレオチド配列を有することが可能である。

核酸配列変異体の検出感度を高める方法であって、前記複数の標的特異的捕捉プライマーは２００以上の異なるヌクレオチド配列を含む方法も提供する。該方法は、２００個以上の異なるヌクレオチド配列を含む複数の標的ポリヌクレオチド内での、配列変異体検出を含む。前記複数の標的ポリヌクレオチドは、複数のゲノム核酸とすることが可能である。

核酸配列変異体の検出感度を高める方法であって、固定化伸長生成物の増幅はブリッジ増幅を含む方法を、追加的に提供する。該方法は固相担体を含み、ここで該固相担体はフローセルとすることが可能である。

核酸配列変異体の検出感度を高める方法であって、増幅した複数の標的ポリヌクレオチドから生成した複数のアンプリコンの配列決定は５０回の配列決定サイクルを含む方法を、さらに提供する。該方法は開始〜終了時間が３時間以下である。

本開示の種々の実施形態の作業に実質的に影響を与えない修飾も、本明細書で提供する開示の定義内に含まれると理解される。したがって、以下の実施例は本開示を説明することを意図するが、本開示を限定するわけではない。

（実施例１）
アンプリコンの調製および配列決定の工程
この実施例では、アンプリコンの調製および標的ポリヌクレオチド配列決定のための統合工程を記載する。

簡潔に言うと、サンプルのゲノムＤＮＡを、５０μＬのKAPA 2X 2GマルチプレックスＰＣＲバッファ（マサチューセッツ州ウィルミントン、Kapa Biosystems社）、０．５μＭのフォワードプライマーミックス（Ｆ）、０．０２μＭのリバースプライマーミックス（Ｒ）、２０単位のKAPA 2G Hot Start Enzyme（バッファ（マサチューセッツ州ウィルミントン、Kapa Biosystems社）、および水を含む、総容量１００μＬのＰＣＲ反応混合物に加えた。以下のＰＣＲプログラムを用いて増幅を行った：９５℃１分間の培養後、以下の培養を３０サイクル行った：（１）９７℃５秒；（２）５８℃４５秒；（３）７２℃１分；および、（４）４℃で保持。ＰＣＲ生成物を下記のようにフローセルに固定化しクラスタ化した後、続いて配列を決定した。

捕捉プローブ伸長、上記ＰＣＲ生成物の標的クラスタ化、および配列決定を、MiSeq（登録商標）ベンチトップ型シーケンサー（カリフォルニア州サンディエゴ、Illumina社）を用いて行った。

この工程では、MiSeqキットカートリッジ（カリフォルニア州サンディエゴ、Illumina社）を、自動MiSeqランの前に約３０分、水中で解凍し、ヒートブロックを９５℃にした。加えて、ＨＦＥチューブ（６００μＬ（カリフォルニア州サンディエゴ、Illumina社））を冷蔵庫で解凍し、０．１Ｎ ＮａＯＨの溶液１ｍＬを調製した。ＰＣＲ生成物（１００μＬ）を、エッペンチューブ内で４００μＬのＨＴ１バッファ（カリフォルニア州サンディエゴ、Illumina社）で希釈した。同様に、捕捉プローブ鋳型を、別のチューブ内で、６００μＬのＨＴ１バッファにおいて調製した。脱イオン水をヒートブロックウェルに加え、上記２つのチューブを５分間ゆっくりと振りながら（約１００ｒｐｍ）ウェルに差し込んだ。５分間のヒートブロック培養後、チューブを少なくとも２分間冷蔵庫に置いた。解凍したMiSeqカートリッジを数回逆にして試薬を分散させ、再度底に沈降させた。試薬を以下のようにMiSeqカートリッジに投入した：ＰＣＲ生成物をカートリッジ内の＃１７チューブに移し；捕捉プローブを＃１８チューブに移し、ＨＦＥを＃１９チューブに投入し、０．１Ｎ ＮａＯＨを＃２０チューブに加えた。MiSeqカートリッジ、MiSeq FC（カリフォルニア州サンディエゴ、Illumina社）、およびMiSeqに対するPR2（カリフォルニア州サンディエゴ、Illumina社）ボトルをMiSeqシーケンサーにセットアップし、配列決定ランプロセスを製造業者の助言に従って開始した。調製したサンプルシートを投入し（Javelin v.51 chemistry）、製造業者の助言に従いフローチェックステップを経た後、伸長、標的クラスタ化、および配列決定のランを開始した。

捕捉プローブ伸長、上記ＰＣＲ生成物の標的クラスタ化、および配列決定も、Genome Analyzer（カリフォルニア州サンディエゴ、Illumina社）を用いて行った。

この工程に関し、クラスタ化および配列決定の鋳型を、８−チューブストリップ内でＨＴ１バッファをＰＣＲ生成物を混合することにより調製した（それぞれ、１〜１０μＬのＰＣＲ生成物と１９〜１０μＬのＨＴ１バッファ）。捕捉プローブ（３〜５００ｐＭ）を別の８−チューブストリップで調製した。解凍したcBOT Paired End Cluster Plate v3（カリフォルニア州サンディエゴ、Illumina社）をｃＢＯＴ自動クラスタ化システムに置き、捕捉プローブ伸長と増幅の工程を、ランコマンドを用いて開始した。（Run <Capture_Probe_Extension_Amp_LBH_v#> recipe）。一連の標準Genome Analyzer（ＧＡ）配列決定試薬（カリフォルニア州サンディエゴ、Illumina社）を解凍し（IMX、LFN、CLM、SMX）、ＬＦＮのチューブの全内容物をＩＭＸチューブに加え、続いてHDP36を同じIMXチューブに加えた。内容物をよく混ぜた。PR1、PR2、PR3（カリフォルニア州サンディエゴ、Illumina社）を含む全ての試薬とバッファを指定された位置でGAに置き、続いてGAコマンド<Prime_v#> recipeを用いて全ラインと試薬をプライミングした。フローセルとプリズムをそれぞれエタノールワイプとレンズペーパーできれいにし、プリズムを機械に再度挿入した。ビームダンプを下げた。フローセルをプリズムの頂部に適切に位置させ、マニホールドをゆっくりと下げた。フローセルへの試薬の適切な流れを、１００μLの溶液５（PR2）を６０μＬ／分の吸引速度および２０００μＬ／分の分注速度で手動で注入することにより確かめた。イマージョンオイル（１３５μＬ）をプリズムとフローセルの間に適用した。計測器の扉を閉め、配列決定ランをＧＡコマンドラン<GA2_40cyle_10rows_SR_v8.3> recipeで開始した。

（実施例２）
統合調製から生じる配列の質および配列決定工程
この実施例では、種々の濃度およびタイプの入力核酸を用いた、配列の均一性および配列決定の深度の比較を記載する。

実施例１で記載した工程を用いて標的ポリヌクレオチドの集団からアンプリコンを調製し、マルチプレックス配列決定によりその配列を決定した。１ｎｇおよび１０ｎｇの入力ゲノムＤＮＡを用いた結果を図２に示す。

MiSeqReporterからの各アンプリコンクラスタを基に均一性を計算した。０．１平均、０．２平均、０．３平均、０．５平均超のクラスタを有するアンプリコンの数を数えた。例えば、０．２平均では、８０％超のアンプリコンが０．２超の平均クラスタ数を有した。

配列決定深度に関し、１０／１００／２５０／５００超のクラスタを有するアンプリコンの数を数えた。例えば、８０％超のアンプリコンが少なくとも５００xを対象範囲とした。均一性および対象範囲は、人々が配列決定の質を測るのに使う典型的な尺度である。図２に示す結果は、良質な配列決定が１ｎｇと１０ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて達成可能であることを示した。

ホルマリン固定パラフィン包埋組織から得た４つの異なる量のＤＮＡを用いた結果を図３に示す。４つの異なる濃度は、図に示すように１ｎｇ〜５０ｎｇに分布した。

図３に示す均一性と配列決定深度の結果はさらに、良質の配列決定がホルマリン固定パラフィン包埋組織から得られる広範囲のＤＮＡについて達成可能であることを示した。クラスタＰＦ（Passing Filter）濃度は特定の質を有するクラスタ数を示すが、該クラスタＰＦは非常に良好だった。特異性は、いくつのリードが正確であるかについての計測である。９０％超の特異性がこの研究で達成された。

追加の研究を、正常な人およびがん患者の血漿から抽出したセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）を用いて実行し、同様の結果を得た。１ｍＬの血漿から単離した１０ｎｇのｃｆＤＮＡを用いた結果を図４に示す。

図２および３のように、MiSeqReporterからの各アンプリコンのクラスタに基づいて均一性を計算した。０．１平均、０．２平均、０．３平均、０．５平均超のクラスタを有するアンプリコンの数を数えた。８０％超のアンプリコンが、０．２超の平均クラスタ数を有した。

同様に、配列決定深度に関し、１０／１００／２５０／５００超のクラスタを有するアンプリコン数を数えた。全てのアンプリコンは少なくとも５００xを対象範囲とした。加えて、クラスタＰＦ濃度および挿入した表に示す他のパラメータも非常に良好だった。９３％の特異性を示す結果が得られ、これは、９３％のクラスタが正しい標的に対して整列することを意味する。これらの結果は、良質な配列決定は、結晶から単離したセルフリーＤＮＡより直接獲得可能であることを追加的に示す。

（実施例３）
統合調製および配列決定工程から生じる検出感度
この実施例は、標的ポリヌクレオチドの集団内の単一変異の検出精度を示す。

本明細書に記載の方法に従い、２０１マルチプレックスフォーマット（201 plex）において、Horizon Diagnostics社より得た１．６５ｎｇのＤＮＡを用いてライブラリを調製し、配列決定した。以下の表に列記した変異を、列記の表示頻度で特定した。このＤＮＡは、デジタルＰＣＲを用いて、Horizon Diagnostics社により、ある変異頻度を有することを確かめられている。１．６５ｎｇは約５００個の半数体ゲノムコピーである。１％の比率で、約５コピーの突然変異体が存在する。そのためこの方法は、種々の配列の集団で５コピーの突然変異体を検出するのに十分高感度である。

（実施例４）
エラーから真の配列変異体を求める固有分子インデックス
この実施例は、標的ポリヌクレオチド配列での真の変異体による配列決定エラーを区別する、固有ヌクレオチドインデックスの使用について記載する。

固有分子バーコード（Unique Molecular Barcode、ＵＭＢ）またはランダムヌクレオチドのインデックス（１０−１５Ｎ）を、配列決定プライマー領域とＰＣＲフォワードプライマーの遺伝子特異的配列領域の間に挿入した。ＵＭＢを、ＵＭＢを挿入しながらＰＣＲプライマーで２〜４サイクルのＰＣＲを実行することにより鋳型ＤＮＡに導入した。２〜４サイクル後、残りのＵＭＢプライマーをエクソヌクレアーゼ１処置とＳＰＲＩビーズ除去を用いて取り除いた。ユニバーサルアダプターシーケンスからなるプライマーを用いて、追加で３０〜３５サイクルのＰＣＲを実行した。リードの配列を同一のＵＭＢと比較することにより、データ分析を実行した。７０％超のＵＭＢ配列によりベースコールを決定する。２超のコピーを有するＵＭＢのみをデータ分析で考慮した。下記に示すように、データ分析でＵＭＢからの情報を考慮しないと、ＰＣＲおよび配列決定エラーにより起きるノイズは０．２４％にまでなり得る。ＵＭＢからの情報をデータ分析で考慮すると、ノイズを全て除去することが可能である。そして、実際の突然変異体の観測頻度は、０．０５％という予測頻度にずっと近づく。

この点に関し、図６は、ヌクレオチドミスマッチ率と、固有分子バーコード修正あり（右）および固有分子バーコード修正なし（左）との比較を示す。簡潔に言うと、予測変異部位周りにある２０個の位置でのミスマッチ率を、データ分析におけるＵＭＢからの情報を考慮して、および、該情報を考慮しないで、示した。図６に示すように、ＵＭＢがなければ、結果は重大な非特異的ノイズを含んだ。ノイズは０．１５％にまでなり得る。データ分析におけるＵＭＢからの情報を考慮した後、ノイズは全て除去された。

この出願を通し、種々の刊行物を括弧内で言及した。任意のGenBankおよびGI number刊行物を含むこれらの刊行物全体の開示は、この結果、本開示が関連する技術の水準をより完全に記載するために参照によって本出願に組み込まれる。

本開示は、開示する実施形態に関連して記載したが、当業者は、上記で詳述した特異的な実施例および研究は本開示の単なる例示にすぎないことを容易に理解しよう。本開示の趣旨を離れることなく種々の修正が可能であることを理解すべきである。加えて、本開示は以下の請求の範囲によってのみ限定されるものである。

Claims (16)

1. （ａ）複数の標的ポリヌクレオチドを含む核酸サンプルを、ハイブリダイゼーションに
   十分な条件下で少なくとも１つのプライマーに接触させるステップであって、前記少なく
   とも１つのプライマーはアダプターを含む、ステップと；
   （ｂ）マルチプレックス非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により前記複数の標的
   ポリヌクレオチドを増幅し、複数の一本鎖アンプリコンを生成するステップと；
   （ｃ）固相担体に固定化した複数の標的特異的捕捉プライマーを、ハイブリダイゼーシ
   ョンに十分な条件下で前記複数の一本鎖アンプリコンと直接的に接触させて、第１の複数
   の固定化アンプリコンを生成するステップであって、前記固相担体はさらに、複数のユニ
   バーサル捕捉プライマーを含み、前記直接的に接触させるステップは、実質的に未精製で
   ある複数の一本鎖アンプリコンを含む、ステップと；
   （ｄ）前記複数の標的特異的捕捉プライマーを伸長して、前記第１の複数の固定化アン
   プリコンに対し相補的な、複数の固定化伸長生成物を生成し、前記固定化伸長生成物は、
   前記複数のユニバーサル捕捉プライマーに対し相補的であるアダプター部分を含むステッ
   プと；
   （ｅ）前記複数の固定化伸長生成物に対して複数のユニバーサル捕捉プライマーをアニ
   ールするステップと；
   （ｆ）ＰＣＲにより前記複数の固定化伸長生成物を増幅して、第２の複数の固定化アン
   プリコンを生成するステップであって、前記固定化アンプリコンの集団は８５％以上の均
   一性を備えるステップと、を含む、アンプリコン調製方法。
2. 前記複数の標的ポリヌクレオチドは１０ｎｇ以下の入力核酸を含む、請求項１に記載の
   方法。
3. 前記ハイブリダイゼーションに十分な条件には１０分以下の培養を含む、請求項１に記
   載の方法。
4. 前記直接的に接触させるステップ（ｃ）は、実質的に未精製である第１の複数のアンプ
   リコンを含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記少なくとも１つのプライマーは２つのプライマーを含み、前記２つのプライマーの
   うち少なくとも一方は前記アダプターを含む、請求項１に記載の方法。
6. 前記マルチプレックス増幅は１８０以上のマルチプレックス性を含む、請求項５に記載
   の方法。
7. 前記固相担体はさらに、第２の複数のユニバーサル捕捉プライマーを含む、請求項１に
   記載の方法。
8. 前記複数の標的特異的捕捉プライマーはさらに、ユニバーサル捕捉プライマー領域を含
   む、請求項７に記載の方法。
9. 前記ユニバーサル捕捉プライマー領域は、前記第２の複数のユニバーサル捕捉プライマ
   ーに対応するヌクレオチド配列を有する、請求項８に記載の方法。
10. 前記複数の標的特異的捕捉プライマーは、２００以上の異なるヌクレオチド配列を含む
    、請求項１に記載の方法。
11. 前記複数の標的ポリヌクレオチドは、２００以上の異なるヌクレオチド配列を含む、請
    求項１に記載の方法。
12. 前記複数の標的ポリヌクレオチドは複数のゲノム核酸を含む、請求項１に記載の方法。
13. 前記固定化伸長生成物の増幅はブリッジ増幅を含む、請求項１に記載の方法。
14. 前記固相担体はフローセルを含む、請求項１に記載の方法。
15. （ａ）複数の標的ポリヌクレオチドを含む核酸サンプルを、ハイブリダイゼーションに
    十分な条件下で少なくとも１つのプライマーに接触させるステップであって、前記少なく
    とも１つのプライマーはアダプターを含む、ステップと；
    （ｂ）マルチプレックス非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により前記複数の標的
    ポリヌクレオチドを増幅し、複数の一本鎖アンプリコンを生成するステップと；
    （ｃ）固相担体に固定化した、１つまたは２つ以上の異なるがんに特異的な複数の標的
    特異的捕捉プライマーを、ハイブリダイゼーションに十分な条件下で前記複数の一本鎖ア
    ンプリコンに直接的に接触させて第１の複数の固定化アンプリコンを生成するステップで
    あって、前記固相担体は複数のユニバーサル捕捉プライマーをさらに含み、前記直接的に
    接触させるステップは、実質的に未精製である複数の一本鎖アンプリコンを含む、ステッ
    プと；
    （ｄ）前記複数の標的特異的捕捉プライマーを伸長して、前記第１の複数の固定化アン
    プリコンに対し相補的な、複数の固定化伸長生成物を生成し、前記固定化伸長生成物は、
    前記複数のユニバーサル捕捉プライマーに対し相補的であるアダプター部分を含むステッ
    プと；
    （ｅ）前記複数の固定化伸長生成物に対し、複数のユニバーサル捕捉プライマーをアニ
    ールするステップと；
    （ｆ）ＰＣＲにより、前記複数の固定化伸長生成物を増幅して、第２の複数の固定化ア
    ンプリコンを生成するステップであって、前記固定化アンプリコンの集団は、８５％以上
    の均一性を備える、ステップと；
    （ｇ）前記第２の複数の固定化伸長生成物の配列を決定し、がん関連遺伝子の有無を判
    断するステップと、を含む、がん関連遺伝子の存在を判断する方法。
16. （ａ）複数の標的ポリヌクレオチドを含む核酸サンプルを、ハイブリダイゼーションに
    十分な条件下で、遺伝子特異的フォワードプライマーおよび遺伝子特異的リバースプライ
    マーに接触させるステップであって、前記遺伝子特異的フォワードプライマーの各種は固
    有の配列インデックスおよびアダプターを含む、ステップと；
    （ｂ）マルチプレックス非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により、前記複数の標
    的ポリヌクレオチドを増幅し、複数の一本鎖アンプリコンを生成するステップと；
    （ｃ）固相担体に固定化した複数の標的特異的捕捉プライマーを、ハイブリダイゼーシ
    ョンに十分な条件下で前記複数の一本鎖アンプリコンと直接的に接触させて、第１の複数
    の固定化アンプリコンを生成するステップであって、前記固相担体は複数のユニバーサル
    捕捉プライマーをさらに含み、前記直接的に接触させるステップは、実質的に未精製であ
    る複数の一本鎖アンプリコンを含む、ステップと；
    （ｄ）前記複数の標的特異的捕捉プライマーを伸長して、前記第１の複数の固定化アン
    プリコンに対し相補的な、複数の固定化伸長生成物を生成し、前記固定化伸長生成物は、
    前記複数のユニバーサル捕捉プライマーに対し相補的であるアダプター部分を含むステッ
    プと；
    （ｅ）前記複数のユニバーサル捕捉プライマーを前記複数の固定化伸長生成物にアニー
    ルするステップと；
    （ｆ）ＰＣＲにより前記複数の固定化伸長生成物を増幅して、第２の複数の固定化アン
    プリコンを生成するステップであって、前記第２の複数の固定化アンプリコンは８５％以
    上の均一性を備える、ステップと；
    （ｇ）前記第２の複数の固定化アンプリコンの配列を決定するステップと；
    （ｈ）標的ポリヌクレオチド種に関し、変異体位置にある３つ以上のヌクレオチド配列
    を比較することにより、１つまたは２つ以上の標的ポリヌクレオチドに関するランダムな
    配列エラーを解消するステップであって、前記標的ポリヌクレオチド種を前記固有の配列
    インデックスにより特定し、それにより、前記１つまたは２つ以上の標的ポリヌクレオチ
    ドにおける真のヌクレオチド配列変異体を求める、ステップと、を含む、核酸配列変異体
    を検出する方法。