KR20160107200A - 고형 지지체 상에서의 앰플리콘 제조 방법 및 시퀀싱 - Google Patents

고형 지지체 상에서의 앰플리콘 제조 방법 및 시퀀싱 Download PDF

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Abstract

본 기재내용은 분자 생물학 분야 및 더욱 특히, 고형 표면 상에 표적 폴리뉴클레오타이드를 포획하고, 증폭하고 시퀀싱하는 방법에 관한 것이다.

Description

고형 지지체 상에서의 앰플리콘 제조 방법 및 시퀀싱 {AMPLICON PREPARATION AND SEQUENCING ON SOLID SUPPORTS}
본 기재내용은 일반적으로 핵산 증폭 및 시퀀싱을 위한 방법 및 조성물, 및 더욱 구체적으로, 고형 지지체 상의 표적 폴리뉴클레오타이드의 포획 및 시퀀싱에 관한 것이다.
폴리뉴클레오타이드 (예를 들어, DNA 또는 RNA)에서 엔코딩된 정보는 의약 및 생명 과학에 매우 중요한 것이기 때문에, 폴리뉴클레오타이드를 신속하고 저렴하게 시퀀싱할 필요가 존재한다. 현재에서, 통상의 시퀀싱 기법은 샘플 및 라이브러리 제조를 필요로 하는데, 이 둘 모두는 고된 작업이다. 게다가, 판독은 많은 적용에 있어서 요망되는 것보다 더 느리다. 따라서, 처리량은 제한되며 비용은 비교적 높다.
따라서, 표적 폴리뉴클레오타이드의 제조 및 시퀀싱을 위한 더욱 신속하고 효율적인 방법에 대한 요구가 존재한다. 본 기재내용은 이러한 요구를 충족시키며 마찬가지로 관련된 이점을 제공한다.
구체예의 요약
본 기재내용은 엠플리콘을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 본 방법은 (a) 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 샘플을 적어도 하나의 프라이머와 하이브리드화시키기에 충분한 조건하에 접촉시키는 단계로서, 적어도 하나의 프라이머가 어댑터를 함유하는 단계; (b) 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시켜 복수의 엠플리콘을 생성시키는 단계; (c) 고형 지지체 상에 고정화된 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 복수의 엠플리콘과 하이브리드화시키기에 충분한 조건하에 직접적으로 접촉시켜 제 1의 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성시키는 단계로서, 고형 지지체가 복수의 보편적 포획 프라이머를 추가로 포함하는 단계; (d) 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 연장시켜 표적 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 복수의 고정화된 연장 생성물을 생성시키는 단계; (e) 복수의 보편적 포획 프라이머를 복수의 고정화된 연장 생성물에 어닐링시키는 단계, 및 (f) 복수의 고정화된 연장 생성물을 PCR에 의해 증폭시켜 제 2의 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성시키는 단계로서, 고정화된 엠플리콘의 군집은 85% 또는 그 초과의 균일성을 포함하는 단계를 포함한다. 본 방법은 10 ng 또는 그 미만의 투입 핵산과 사용될 수 있으며 제 2의 복수의 고정화된 엠플리콘을 시퀀싱하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 본 방법은 또한, 암 관련 유전자를 포함하는 장애 또는 질병과 관련된 유전자의 존재를 결정하는데 사용될 수 있다. 무세포 DNA는 또한, 본 기재내용의 방법에 사용될 수 있다.
본 기재내용은 핵산 서열 변이의 검출 민감도를 증가시키는 방법을 추가로 제공한다. 본 방법은 (a) 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 샘플을 유전자 특이적 전방향 및 후방향 프라이머와 하이브리드화시키기에 충분한 조건하에 접촉시키는 단계로서, 각 종의 유전자 특이적 전방향 프라이머는 고유의 서열 지표 및 어댑터를 포함하는 단계; (b) 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시켜 복수의 엠플리콘을 생성시키는 단계; (c) 고형 지지체 상에 고정화된 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 복수의 엠플리콘과 하이브리드화시키기에 충분한 조건하에 직접 접촉시켜 제 1의 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성시키는 단계로서, 고형 지지체가 복수의 보편적 포획 프라이머를 추가로 포함하는 단계; (d) 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 연장시켜 표적 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 복수의 고정화된 연장 생성물을 생성시키는 단계; (e) 복수의 보편적 포획 프라이머를 복수의 고정화된 연장 생성물에 어닐링시키는 단계; (f) 복수의 고정화된 연장 생성물을 PCR에 의해 증폭시켜 제 2의 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성시키는 단계로서, 제 2의 복수의 고정화된 엠플리콘이 85% 또는 그 초과의 균일성을 포함하는 단계; (g) 제 2의 복수의 고정화된 엠플리콘을 시퀀싱하는 단계, 및 (h) 표적 폴리뉴클레오타이드 종에 대한 변이 위치에서 3개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드 서열을 비교함으로써 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드에 대한 무작위 서열 에러를 제거하는 단계로서, 표적 폴리뉴클레오타이드 종이 고유의 서열 지표에 의해 식별되어 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드에서 진정한 뉴클레오타이드 서열 변이를 결정하는 단계를 포함한다. 본 방법은 변이 뉴클레오타이드 위치에 있어서 0.3% 또는 그 미만의 불일치 비율을 검출할 수 있다.
도 1은 고형 지지체 상의 엠플리콘의 제조 및 시퀀싱에서 예시적 단계를 보여주는 도식이다.
도 2는 유전체 DNA의 다중 (multiplex) 100 주기 시퀀싱 진행을 위한 2개의 상이한 투입량의 핵산에 있어서 시퀀싱 균일성 및 시퀀싱 깊이의 비교를 보여준다.
도 3은 포르말린-고정된 파라핀 매립된 조직으로부터 수득된 DNA의 다중 50 주기 시퀀싱 진행을 위한 4개의 상이한 투입량의 핵산에 대한 시퀀싱 균일성 및 시퀀싱 깊이의 비교를 보여준다.
도 4는 다중 시퀀싱 진행을 위한 1 ml의 혈장으로부터 분리된 10 ng의 무세포 DNA에 있어서 시퀀싱 균일성 및 시퀀싱 깊이의 비교를 보여준다.
도 5는 고유의 분자 바코드 또는 뉴클레오타이드 지표를 사용하여, 무작위 뉴클레오타이드 시퀀싱 에러와 비교하여 진정한 뉴클레오타이드 변이를 구별하는 것을묘사하는 개략도이다.
도 6은 고유의 분자 바코드 보정의 사용 (오른쪽) 및 비사용 (왼쪽)하에 뉴클레오타이드 불일치 비율의 비교를 보여준다.
도 7은 표적 특이적 증폭 프라이머를 통한 표적 뉴클레오타이드로의 지표의 1 단계 혼입을 보여주는 개략도이며, 여기에서 지표는 시퀀싱 프라이머 결합 자리의 다운스트림이다.
도 8은 시퀀싱 프라이머를 통한 표적 폴리뉴클레오타이드로의 지표의 2 단계 혼입을 보여주는 개략도이며, 여기에서 지표는 시퀀싱 프라이머 결합 자리의 업스트림이다.
본 기재내용은 표적 폴리뉴클레오타이드의 신속하고 효율적인 제조 및 시퀀싱을 위한 방법에 관한 것이다. 본 방법은 표적 폴리뉴클레오타이드의 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 고형 지지체로의 직접 고정화, 클론 증폭 및 시퀀싱을 포함한다. 이들은 신속한 샘플-대-대응 엠플리콘 시퀀싱을 허용하는 통합된 절차에서 개별적으로 사용되거나 함께 이용될 수 있다. 통합된 방법은 엠플리콘 라이브러리 제조가 불필요하기 때문에 특히 유용한데, 이에 의해 결찰과 관련된 비효율성이 제거된다. 시퀀싱을 위한 통합된 방법의 기타 특히 유용한 속성은 예를 들어, PCR 후의 엠플리콘 정제 및 추가적인 풍부화 단계의 필요성 제거를 포함하며, 이는 엠플리콘 고정화를 위한 신속한 하이브리드화 단계를 허용하고, 매우 소량의 투입 핵산으로 활용될 수 있으면서 높은 품질의 시퀀싱 결과를 달성할 수 있다.
한 특정 구체예에서, 본 기재내용의 방법은 표적 폴리뉴클레오타이드의 군집의 다중 PCR을 사용하며, 여기에서 하나의 프라이머는 고형 지지체 상에 고정화된 올리고뉴클레오타이드에 상보적인 어댑터를 함유한다. 표적 폴리뉴클레오타이드의 증폭된 군집은 먼저 정제 단계로 처리되지 않고 고형 지지체 상에 고정화된다. 고정화는 고형 지지체 상에 사전-씨딩되었던 표적 특이적 포획 올리고뉴클레오타이드로의 하이브리드화에 의해 이루어진다. 표적 폴리뉴클레오타이드의 증폭된 군집의 어댑터 말단은 고정화된 상보적인 올리고뉴클레오타이드로 어닐링되며, 상보적인 올리고뉴클레오타이드는 이중 가닥 표적 폴리뉴클레오타이드의 군집을 생성하기 위한 연장 반응에서 프라이머로서 사용된다. 클론 증폭 후, 표적 폴리뉴클레오타이드 콜로니는 35 주기 또는 그 초과로 이루어진 다중 시퀀싱으로 처리된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "복수의"는 2개 이상의 상이한 폴리뉴클레오타이드 또는 기타 기준 분자의 군집을 지칭한다. 따라서, 명백하게 달리 언급되지 않는 한, 용어 "복수"는 군집과 유사하게 사용된다. 복수는 군집의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 또는 그 초과의 상이한 구성원을 포함한다. 복수는 또한, 200, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000, 50000, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8 x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106 또는 1x107, 또는 그 초과의 상이한 구성원을 포함할 수 있다. 복수는 상기 예시적인 군집 수들 사이의 모든 정수를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적 폴리뉴클레오타이드"는 분석 또는 작용의 대상인 폴리뉴클레오타이드를 의미하고자 한다. 분석 또는 작용은 폴리뉴클레오타이드의 복사, 증폭, 시퀀싱 및/또는 핵산 조회(interrogation)를 위한 기타 절차로의 처리를 포함한다. 표적 폴리뉴클레오타이드는 분석될 표적 서열에 추가적인 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드는 분석하고자 하는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 측면에 인접한 프라이머 결합 자리로서 작용하는 어댑터를 포함하는 하나 이상의 어댑터를 포함할 수 있다. 포획 올리고뉴클레오타이드 또는 포획 프라이머로 하이브리드화된 표적 폴리뉴클레오타이드는 표적 폴리뉴클레오타이드 전부가 연장되도록 보정되는 것은 아닌 방식으로 포획 올리고뉴클레오타이드의 5' 또는 3' 말단을 넘어서 연장하는 뉴클레오타이드를 함유할 수 있다. 특정 구체예에서, 하기 추가로 상세히 제시된 바와 같이, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 이들의 표적 폴리뉴클레오타이드 서열이 상이한 상이한 종을 포함하나, 2개 이상의 상이한 종에 있어서 동일한 어댑터를 갖는다. 특정 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 측면에 인접할 수 있는 2개의 어댑터는 동일한 서열을 가질 수 있거나 2개의 어댑터는 상이한 서열을 가질 수 있다. 따라서, 복수의 상이한 표적 폴리뉴클레오타이드는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 각 말단에서 동일한 어댑터 서열 또는 2개의 상이한 어댑터 서열을 가질 수 있다. 따라서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드에서의 종은 예를 들어, 시퀀싱에 의해 평가하고자 하는 비공지의 서열 부위의 측면에 인접한 공지된 서열 부위를 포함할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오타이드가 단일 말단에서 어댑터를 수반하는 경우, 어댑터는 표적 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단 또는 5' 말단에 위치할 수 있다. 표적 폴리뉴클레오타이드는 임의의 어댑터 없이 사용될 수 있으며, 이 경우 프라이머 결합 서열은 표적 폴리뉴클레오타이드에서 발견된 서열로부터 직접적으로 비롯될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 복수의 포획 프라이머를 접촉시키는 것과 관련하여 사용되는 경우 용어 "직접적으로"는, 접촉 물질이 언급된 절차 후에 현저한 간섭의 정제 단계 없이 복수의 포획 프라이머에 가해짐을 의미하고자 한다. 현저한 간섭의 정제 단계는 예를 들어, 프라이머, 효소, 및 증폭 반응 후 증폭되지 않거나 잘못 증폭된 주형의 존재의 감소를 포함하는, 세포 구성요소의 복잡성을 감소시키고자 하는 그러한 절차를 포함한다. 현저한 간섭의 정제 단계는 완충제의 변형, 샘플 핵산의 침전 및 기타 소 핵산 조작 절차를 포함하는 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "포획 프라이머"는 예를 들어, 증폭 또는 시퀀싱 반응의 프라이머 어닐링 단계에서 직면한 조건하에 분석되거나 핵산 조회 처리될 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 어닐링될 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 의미하고자 한다. 일반적으로, 용어 "핵산," "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이러한 다양한 용어는 달리 구체적으로 명시하지 않는 한 크기, 서열 또는 기타 특성에서의 임의의 특정한 차이를 나타내고자 하는 것은 아니다. 설명의 명확성을 위해, 용어는 수개의 핵산 종을 포함하는 특정 방법 또는 조성물을 기술하는 경우 다른 것으로부터 한 종의 핵산을 구별하는데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 포획 프라이머 또는 기타 올리고뉴클레오타이드와 관련하여 사용되는 경우 용어 "표적 특이적"은 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적인 뉴클레오타이드 서열 즉, 표적 폴리뉴클레오타이드의 식별 부위에 선택적으로 어닐링될 수 있는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 포획 프라이머 또는 기타 올리고뉴클레오타이드를 의미하고자 한다. 표적 특이적 포획 프라이머는 단일 종의 올리고뉴클레오타이드를 가질 수 있거나, 이는 상이한 서열을 갖는 2개 이상의 종을 포함할 수 있다. 따라서, 표적 특이적 포획 프라이머는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 초과의 상이한 서열을 포함하는 2개 또는 그 초과의 서열일 수 있다. 표적 특이적 포획 올리고뉴클레오타이드는 표적 특이적 포획 프라이머 서열 및 보편적 포획 프라이머 서열을 포함할 수 있다. 기타 서열 예컨대, 시퀀싱 프라이머 서열 및 기타 등등은 또한, 표적 특이적 포획 프라이머에 포함될 수 있다.
비교시, 포획 프라이머 또는 기타 올리고뉴클레오타이드 서열과 관련하여 사용되는 경우 용어 "보편적"은 복수의 포획 프라이머 중에서 공통의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 포획 프라이머 또는 기타 올리고뉴클레오타이드를 의미하고자 한다. 공통의 서열은 예를 들어, 동일한 어댑터 서열에 상보적인 서열일 수 있다. 보편적 포획 프라이머는 상이한 종을 반드시 구별할 필요 없이 복수의 상이한 폴리뉴클레오타이드의 조회에 적용될 수 있는 반면, 표적 특이적 포획 프라이머는 상이한 종을 구별하기 위해 적용가능하다.
본원에 사용된 바와 같이, 뉴클레오타이드 서열과 관련하여 사용되는 경우 용어 "지표"는 샘플 내에 함유된 폴리뉴클레오타이드 내의 다른 뉴클레오타이드는 물론 다른 지표로부터 구별 가능한 고유의 뉴클레오타이드 서열을 의미하고자 한다. 뉴클레오타이드 지표는 무작위의 또는 특이적으로 설계된 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 지표는, 분석되거나 조회되는 복수의 폴리뉴클레오타이드 내에서 및/또는 군집의 복수의 지표 내에서 독특한 뉴클레오타이드 서열이 되게 하기에 충분한 길이를 지니는 한, 임의의 요망되는 서열 길이일 수 있다. 본 기재내용의 뉴클레오타이드 지표는 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드에 부착되어 군집 내의 태깅된 종의 모든 구성원을 식별하기 위한 특정 종을 태깅 또는 마킹하는데 유용하다. 따라서, 지표는 동일한 분자 종의 상이한 구성원이 동일한 지표를 함유할 수 있는 경우 및 상이한 폴리뉴클레오타이드의 군집 내의 상이한 종이 상이한 지표를 함유할 수 있는 경우 바코드로서 유용하다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산과 관련하여 사용되는 경우 용어 "고정화된"은 공유 또는 비-공유 결합(들)을 통한 고형 지지체로의 직접 또는 간접 부착을 의미하고자 한다. 본 기재내용의 특정 구체예에서, 공유 부착이 사용될 수 있으나, 일반적으로 요구되는 모든 것은 핵산이 예를 들어, 핵산 증폭 및/또는 시퀀싱이 필요한 적용에서 지지체를 사용하고자 하는 조건하에 지지체에 부착된 채 유지되거나 정지된 채 유지되는 것이다. 전형적으로 포획 프라이머 또는 증폭 프라이머로서 사용될 올리고뉴클레오타이드는 3' 말단이 효소 연장에 이용가능하고 서열의 적어도 일부가 상보적 서열에 하이브리드화될 수 있도록 고정화된다. 하이브리드화를 통해 표면 부착된 올리고뉴클레오타이드로의 고정화가 발생할 수 있으며, 이 경우 고정화된 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 3'-5' 배향일 수 있다. 대안적으로, 고정화는 염기-쌍 하이브리드화 예컨대, 상기 제시된 공유 부착 이외의 수단에 의해 발생할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "고형 지지체"는 핵산이 부착될 수 있는 임의의 불용성 기판 또는 매트릭스 예컨대, 예를 들어, 라텍스 비드, 덱스트란 비드, 폴리스티렌 표면, 폴리프로필렌 표면, 폴리아크릴아미드 겔, 골드 표면, 유리 표면 및 실리콘 웨이퍼를 의미하고자 한다. 표면은 예를 들어, 특정 적용에 적합한 판형, 구형 또는 다공형을 포함한 임의의 바람직한 형상일 수 있다. 예를 들어, 고형 지지체는 판형 유리 표면일 수 있다. 고형 지지체는 또한, 플로우 셀의 내부 상에 탑재되어 다양한 시약의 용액과의 상호작용을 허용할 수 있다.
특정 구체예에서, 고형 지지체는 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드로의 공유 부착을 허용하는 반응성 기를 갖는 중간 물질의 층 또는 코팅의 적용에 의해 화학적으로 작용기화된 불활성 기판 또는 매트릭스를 포함할 수 있다. 중간 물질은 공유 또는 비-공유 결합을 통해 고형 지지체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 고형 지지체로의 비-공유 부착에 대한 비제한적 예로서, 이러한 지지체는 유리와 같은 불활성 기판 상의 폴리아크릴아미드 하이드로겔 층을 포함할 수 있다. 이러한 구체예에서, 폴리뉴클레오타이드는 중간 층 (예를 들어, 하이드로겔)에 직접적으로 공유 부착될 수 있으나, 중간 층 자체는 다른 층의 기판 또는 매트릭스 (예를 들어, 유리 기판)에 비-공유적으로 부착될 수 있다.
본 기재내용은 엠플리콘 제조 방법을 제공한다. 본 방법은 (a) 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 갖는 핵산 샘플을 적어도 하나의 프라이머와 하이브리드화시키기에 충분한 조건하에 접촉시키는 단계로서, 적어도 하나의 프라이머가 어댑터를 함유하는 단계; (b) 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시켜 복수의 엠플리콘을 생성시키는 단계; (c) 고형 지지체 상에 고정화된 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 복수의 엠플리콘과 하이브리드화시키기에 충분한 조건하에 직접적으로 접촉시켜 제 1의 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성시키는 단계로서, 고형 지지체가 복수의 보편적 포획 프라이머를 추가로 갖는 단계; (d) 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 연장시켜 표적 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 복수의 고정화된 연장 생성물을 생성시키는 단계; (e) 복수의 보편적 포획 프라이머를 복수의 고정화된 연장 생성물로 어닐링시키는 단계, 및 (f) 복수의 고정화된 연장 생성물을 PCR에 의해 증폭시켜 제 2의 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성시키는 단계로서, 상기 제 2의 복수의 고정화된 엠플리콘이 85% 또는 그 초과의 균일성을 포함하는 단계를 포함한다.
본 기재내용의 엠플리콘 제조 방법은 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 이들의 조회 생성물의 샘플 질을 증가시키는 하나 이상의 특징들을 통합시켜 고정화된 표적 폴리뉴클레오타이드의 클로날 군집의 제조를 위한 신속하고 효율적인 다단계 공정을 가능하게 한다. 각 제조 절차는 본원에 기술된 임의의 절차에서 사용될 수 있는 사용 준비된 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 발생시킨다.
엠플리콘 제조를 위한 본 기재내용의 방법은 적어도 하나의 프라이머를 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 갖는 핵산 샘플과 하이브리드화시키기에 충분한 조건하에 접촉시키는 것을 포함한다. 적어도 하나의 프라이머는 어댑터를 함유할 수 있다.
핵산 샘플은 진핵생물 또는 원핵생물 공급원은 물론 합성 공급원을 포함하는 임의의 요망되는 공급원으로부터 기원할 수 있다. 특정 구체예에서, 핵산 샘플 공급원은 관심 유기체로부터 기원할 것이며, 유전체 데옥시리보핵산 (DNA)을 포함한다. 예를 들어, 샘플은 유전자 정보가 진단 또는 치료 목적에 바람직한 인간 공급원으로부터 기원할 수 있다. 유사하게는, 샘플은 유전자 정보가 또한, 진단 또는 치료 목적에 바람직한 가축 또는 농장 동물로부터 기원할 수 있다. 핵산 샘플에 대한 기타 공급원은 예를 들어, 박테리아, 효모, 진균류, 설치류 및 기타 등등을 포함한다. 본원에 제공된 교시 및 안내를 고려할 경우, 당업자는 핵산의 어떠한 공급원도 본 기재내용의 방법에 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
표적 폴리뉴클레오타이드는 조회될 임의의 요망되는 핵산을 포함한다. 이와 관련하여, 표적 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 유전체 DNA, cDNA, 무세포 DNA (cfDNA), EST, mRNA, hnRNA, rRNA, tRNA, snRNA, 미토콘트리아 DNA 및 합성 DNA 또는 RNA를 포함한다. 특정 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 유전체 DNA이며, 조회는 진단 정보 또는 치료학적 조정에 적용가능하다.
따라서, 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 데옥시리보핵산 (DNA) 및 리보핵산 (RNA)을 지칭한다. 상기 용어는 등가물로서 뉴클레오타이드 유사체로부터의 제조된 DNA 또는 RNA의 유사체를 포함하며, 단일 가닥 (예컨대, 센스 또는 안티센스) 및 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드에 적용가능한 것으로 이해되어야 한다.
표적 폴리뉴클레오타이드 분자는 이중-가닥 DNA (dsDNA) 형태 (예를 들어, 유전체 DNA 단편, PCR 및 증폭 생성물 및 기타 등등)로 비롯될 수 있거나 DNA 또는 RNA로서 단일 가닥 형태로 비롯되어 dsDNA 형태로 전환될 수 있다. 예로서, mRNA 분자는 당해 기술에 널리 공지된 표준 기법을 이용하여 본 기재내용의 방법에 사용하기에 적합한 이중-가닥 cDNA로 복사될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오타이드 분자의 정확한 서열은 공지되거나 비공지될 수 있다.
핵산 샘플은 비풍부화된 유전체 DNA의 초기 샘플일 수 있다. 핵산 샘플로서 유용한 유전체 DNA의 예로서, 인간 유전체는 대략 31억 염기 서열로 구성된다. 본 기재내용의 방법에 사용될 수 있는 기타 유전체에 대한 예시적인 크기 추정치는 약 2.7 Gbp (마우스), 2.8 Gbp (래트), 1.7 Gbp (지브라피쉬), 165 Mbp (초파리), 13.5 Mbp (S. 세레비시애 (S. cerevisiae)), 390 Mbp (복어), 278 Mbp (모기) 또는 103 Mbp (C. 엘레간스 (C. elegans))이다. 당업자는 예를 들어, 더 작거나 더 큰 유전체를 포함하는, 상기 예시된 것들 이외의 크기를 갖는 유전체가 본 기재내용의 방법에 사용될 수 있음이 인지될 것이다.
특정 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드 분자는 DNA 분자이다. 더욱 특히, 표적 폴리뉴클레오타이드 분자는 유기체의 전체 유전자 상보체를 나타내며, 인트론 및 엑손 서열 (코딩 서열) 둘 모두는 물론 비-코딩 조절 서열 예컨대, 프로모터 및 인핸서 서열을 포함하는 유전체 DNA 분자이다. 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 유전체 DNA의 특정 아군 예컨대, 특정 크로모좀이 또한 사용될 수 있다. 더욱 더 특히, 표적 폴리뉴클레오타이드 분자 또는 이의 일부의 서열이 표적 서열일 수 있다. 여전히 더욱 더 특히, 표적 폴리뉴클레오타이드 분자는 예를 들어, 이전에 예시된 바와 같이 인간, 포유동물, 박테리아, 진균류 또는 식물 유전체 DNA로부터의 유전체 DNA 분자이다. 따라서, 본 기재내용은 복수의 폴리뉴클레오타이드를 사용하는 방법으로서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드가 복수의 유전체 핵산을 포함하는 방법을 제공한다.
특정 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 장애 또는 질병을 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터 수득된 유전체 DNA에 상응한다. 기타 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 장애 또는 질병을 갖는 것으로 의심된 환자로부터 수득된 유전체 DNA에 상응한다. 여전히 기타 구체예에서, 표적 폴리뉴클레오타이드는 장애 또는 질병의 징조가 없는 대상체로부터 수득된 유전체 DNA에 상응한다. 이전 구체예에서, 본 기재내용의 방법은 예를 들어, 장애 또는 질병의 존재를 확인하는데 이용될 수 있다. 후자의 두 구체예에서, 본 기재내용의 방법은 예를 들어, 장애 또는 질병의 가능성 또는 유병률을 측정하는데 이용될 수 있다.
평가될 장애 또는 질병은 유병률 또는 가능성에 대해 유전적으로 결정되거나 평가될 수 있는 임의의 장애 또는 질병일 수 있다. 이러한 장애 또는 질병은 모든 유전적으로 유전된 장애 또는 질병은 물론 유전자 변경 또는 특이적 유전자 대립인자에 의해 초래되거나 이와 상호관련될 수 있는 모든 장애 또는 질병을 포함한다. 유전자 변경은 예를 들어, 하나 이상의 핵산 돌연변이를 포함한다. 이러한 질병 또는 장애는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 유전자 장애 또는 질병과 연관된 19,000개 초과의 공지된 유전자가 존재한다 (예를 들어, 문헌 [GENECARDS, Weizmann Institute of Science, date of access January 6, 2014. URL: genecards.org/cgi-bin/listdiseasecards.pl?type=full] 참조). 대상체에서 이들 유전자 또는 유전자 돌연변이 중 일부 또는 전부의 존재 또는 부재가 예를 들어, 본 기재내용의 방법에서 그러한 대상체로부터의 유전체 DNA를 사용하여 평가될 수 있다.
예시적인 유전적으로 유전 가능한 장애 또는 질병은 암, 낭포성 섬유증, 다운 증후군, 뒤 시엔 느 근위축증, 혈우병, 신경 섬유 종증, 테이-삭스 병, 알츠하이머 병, 파킨슨 병, 헌팅톤 병, 연골 무형성증, 알파-1 항트립신 결핍증, 항인지질 증후군, 자폐증, 상염색체 우성 다낭성 신종, 샤르코-마리에-치아, 크리 두 채트 (Cri du chat), 크론병, 더컴병, 듀안 증후군, 인자 V 라이덴 혈전성향증, 가족성 고 콜레스테롤 혈증, 가족성 지중해 발열, 여린 X 증후군, 고셔병, 혈색소증, 유전 구형적혈구증, 완전전뇌증, 클라인펠터 증후군, 마르팡 증후군, 근긴장성 이영양증, 누난 증후군, 불완전 골생성증, 페닐케톤뇨증, 폴란드 이상 (Poland Anomaly), 포르피린증, 다낭성 신장 질환, 원발 섬모 운동 이상증, 조로증, 색소성 망막염, 레트 증후군, 중증 복합 면역결핍 (SCID), 낫 적혈구병, 척추 근육 위축증, 지중해 빈혈, 트리메틸아미누리아 (Trimethylaminuria), 터너 증후군, 혼합 포르피린증, 구개심장안면 증후군, WAGR 증후군 및 윌슨 병을 포함한다.
예시적인 암은 유방암, 방광암, 결장 암, 결장직장 암, 위암, 위장관 기질 종양, 염증성 근육섬유모세포 종양, 신장암, 백혈병, 림프종, 폐암, 망막모세포종, 흑색종을 포함하는 피부암, 전립선암, 신경섬유종증, 난소암, 횡문근육종 및 갑상샘암을 포함한다.
유전자 장애 또는 질병의 존재, 부재 또는 소인을 측정하기 위한 대상체로부터의 유전체 DNA의 한 유용한 공급원은 cfDNA를 포함한다. 무세포 DNA는 당해 기술에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 모계 순환에서 태아 핵산의 널리 공지된 존재 이외에, 기타 핵산이 혈청으로부터 분리되고 증폭될 수 있음이 당해 기술에 또한 널리 공지되어 있다. 이와 관련하여, 문헌 [Mulcahy et al, LANCET 348: 628 (1996), Cancer and Mutant DNA in Blood Plasma]은, 암 환자의 혈장 (Chen et al.) 및 혈청 (Narwoz et al.)에서 순환 DNA의 존재를 보여주며, 또한 암은 물론 자가면역 질환을 갖는 대상체에서 기술되었던 증가된 양의 자유롭게 순환하는 유전자 물질의 발생을 강조하는 특히 수개의 문헌들을 고찰하였다. 게다가, 무세포 순환 DNA의 발견은 또한 질병 상태에 대해 고유한 것이 아니다. 문헌 [Emanuel and Pestka, GATA 10(6): 144-146 (1993), Amplification of Specific Gene Products from Serum]은 건강한 개체의 혈청에서 PCR에 의한 유전자 분석을 수행하기에 충분한 양의 자유 DNA의 존재를 기술한다. 또한, 문헌 [Shapiro, Determination of Circulating DNA Levels in Patients with Benign or Malignant Gastrointestinal Disease, Cancer 51(11):2116-20 (1983)]은 혈청 DNA 농도가 악성종양에서 현격하게 증가되며 양성 위장관 질병에서 완만하게 증가됨을 보고한다.
따라서, 본 기재내용은 암 관련 유전자의 존재를 결정하는 방법을 제공한다. 본 방법은 (a) 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 샘플을 적어도 하나의 프라이머와 하이브리드화시키기에 충분한 조건하에 접촉시키는 단계로서, 적어도 하나의 프라이머가 어댑터를 함유하는 단계; (b) 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시켜 복수의 엠플리콘을 생성시키는 단계; (c) 고형 지지체 상에 고정화된 하나 이상의 상이한 암에 특이적인 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 복수의 엠플리콘과 하이브리드화시키기에 충분한 조건하에 직접적으로 접촉시켜 제 1의 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성시키는 단계로서, 고형 지지체가 복수의 보편적 포획 프라이머를 추가로 포함하는 단계; (d) 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 연장시켜 표적 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 복수의 고정화된 연장 생성물을 생성시키는 단계; (e) 복수의 보편적 포획 프라이머를 복수의 고정화된 연장 생성물에 어닐링시키는 단계; (f) 복수의 고정화된 연장 생성물을 PCR에 의해 증폭시켜 제 2의 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성시키는 단계로서, 고정화된 엠플리콘의 군집이 85% 또는 그 초과의 균일성을 포함하는 단계, 및 (g) 제 2의 복수의 고정화된 연장 생성물을 시퀀싱하여 암 관련 유전자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함한다. 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 10 ng 또는 그 미만의 투입 핵산일 수 있으며 투입 핵산은 cfDNA일 수 있다.
표적 폴리뉴클레오타이드 분자는 본원에 기술된 임의의 방법 전에 또는 후에 화학적으로 또는 효소적으로 처리될 수 있다. 본원에 기술된 방법에서, 핵산 샘플은 절편화될 수 있거나 절편화 없이 사용될 수 있다. 샘플은 사용 전에 증폭 예를 들어, 전체 샘플 증폭 기법 예컨대, 무작위 프라이머 연장 처리될 수 있다.
복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 적어도 하나의 프라이머와 접촉될 수 있다. 도 1, 패널 1은 예시적인 구성을 묘사하며, 여기에서 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 각 구성원은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의한 증폭을 위해 한 쌍의 프라이머와 접촉하여 이에 하이브리드화된다. 추가로 하기 기술된 바와 같이, 비대칭 PCR이 요망되는 경우 표적 폴리뉴클레오타이드는 단일 프라이머로 하이브리드화될 수 있다. 도 1, 패널 1에 묘사된 바와 같이, 적어도 하나의 프라이머는 또한, 예를 들어, 다운스트림 절차에 사용될 수 있는 어댑터를 함유한다. 따라서, 본 기재내용은 2개의 프라이머를 사용하여 기하급수적인 증폭을 발생시키는 증폭 방법을 제공한다. 하나 또는 둘 모두의 프라이머는 어댑터를 함유할 수 있다. 또한, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드가 하나의 프라이머를 사용하여 증폭되어, 비대칭적 증폭을 발생시키는 증폭 방법이 제공된다. 하나의 프라이머는 어댑터를 함유할 수 있다.
일반적으로, 증폭 반응은 종종 전방향 및 역방향 프라이머로 표시된 2개의 프라이머를 사용한다. 증폭 프라이머는 전형적으로 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 구조물이다. 이들은 또한, 천연 또는 비-천연 염기 및 또한, 천연 및 비-천연 백본 연결의 혼합물을 포함하며, 단 적어도 일부 구체예에서, 어떠한 비-천연 변형도 프라이머로서의 기능을 영구적으로 또는 비가역적으로 배제시키지 않는다. 증폭 프라이머는 연장 또는 증폭 반응의 조건 동안 주형 폴리뉴클레오타이드 가닥으로 어닐링하고 어닐링된 주형 가닥에 상보적인 새로운 폴리뉴클레오타이드 가닥의 효소 합성을 위한 개시점으로서 작용하는 능력을 갖는다.
프라이머는 예를 들어, 비-뉴클레오타이드 화학적 변형을 추가적으로 포함하여 바람직한 경우, 고형 지지체로의 프라이머의 공유 부착을 촉진한다. 특정한 화학적 변형 자체는 프라이머로서의 분자의 기능을 개선시킬 수 있거나, 고형 지지체로부터 프라이머 (또는 이들로부터 유래된 연장된 폴리뉴클레오타이드 가닥)를 절단되게 하는 절단 자리를 제공하는 것과 같은 일부 기타 유용한 기능을 제공할 수 있다. 유용한 화학적 변형은 또한, 변형이 제거되거나 역전될 때까지 프라이머의 하이브리드화 또는 연장을 방지하는 가역적 변형을 제공할 수 있다.
프라이머는 5' 말단 및 3' 말단이 공지된 서열 부위를 수반하도록 설계될 수 있다. 공지된 서열은 용어가 본원에 사용되는 바와 같은 보편적 서열일 수 있으며 따라서, 복수의 올리고뉴클레오타이드 중의 공통의 서열을 가질 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 이는 복수의 올리고뉴클레오타이드 중 공지되나 고유의 서열일 수 있다. 보편적 서열은 보편적 서열에 상보적인 단일 프라이머 쌍을 사용하여 다중의 상이한 서열의 증폭을 가능하게 하는 프라이머의 하이브리드화를 위한 편리한 자리로서 제공될 수 있다. 추가로, 보편적 서열은 또한, 예를 들어, 포획 프라이머에 상보적인 어댑터로서 제공될 수 있으며, 고형 지지체에 포획 프라이머가 부착되는 구체예에서 포획 프라이머로의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 어댑터의 고정화를 허용할 수 있다. 도 1, 패널 1은 바닥 프라이머 상의 두꺼운 부분으로서 어댑터로서의 보편적 서열을 묘사한다. 상단 프라이머는 또한, 표적 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화되지 않는 서열을 함유하는 것으로 묘사된다. 이러한 부위는 보편적 또는 기타 서열일 수 있으며 보편적 서열 이외의 서열인 경우 공지된 또는 비공지된 서열을 가질 수 있다.
일 구체예에서, 적어도 하나의 프라이머의 하이브리드화 후, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, PCR에 의해 증폭 처리될 수 있다. PCR 증폭은 도 1, 패널 1에 묘사된 바와 같이 전방향 및 역방향 프라이머로 수행되어 표적 폴리뉴클레오타이드의 기하급수적 증폭을 발생시킬 수 있다. 또한, PCR 증폭은 하나의 프라이머로 수행되어 표적 폴리뉴클레오타이드의 비대칭 또는 선형 증폭을 발생시킬 수 있다. 비대칭 증폭은 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 엠플리콘을 생성하는데 유용하다. 본원에 기술된 증폭 반응의 생성물은 엠플리콘으로서 언급된다. 따라서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 증폭은 이들의 주형과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 복수의 엠플리콘을 생성할 것이다.
PCR 증폭 반응과 일반적으로 관련하여 본원에 예시된 바와 같이, 본원에 제공된 교시 및 안내를 고려할 경우, 당업자는 다양하게 상이한 유형의 PCR 방법을 포함하는, 핵산을 증폭시키기 위한 기타 방법이 본원에 기재된 증폭 단계에 사용되도록 보정가능함을 인지하고 있을 것이다. 예를 들어, 표적 폴리뉴클레오타이드로의 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화를 이용한 증폭 반응은 본원에 기재된 증폭 단계에 유용한데, 왜냐하면 이들은 예를 들어, 포획 프라이머로의 하이브리드화를 허용하는 어댑터를 포함할 수 있기 때문이다. 상이한 유형의 PCR 방법을 포함하는 이러한 기타 증폭 반응은 예를 들어, 미국 특허 번호 8,003,354에 기술된 바와 같은 다중 PCR, 디지털 PCR (dPCR), 다이알-아웃 PCR, 대립유전자-특이적 PCR, 비대칭 PCR, 헬리카제-의존적 증폭, 핫 스타트 PCR, 결찰-매개된 PCR, 미니프라이머 PCR, 다중 결찰-의존적 프로브 증폭 (MLPA), 내포된 PCR, 정량적 PCR (qPCR), 역전사 PCR (RT-PCR), 고체상 PCR, 리가제 사슬 반응, 가닥 치환 증폭 (SDA), 전사 매개된 증폭 (TMA) 및 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA)을 포함한다.
폴리뉴클레오타이드 조회를 위한 다중 방법은 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 조작하고 분석하는데 특히 유용한 방법인데, 왜냐하면 이들은 단일 반응에서 많은 다양한 종의 표적 폴리뉴클레오타이드의 조회를 허용하기 때문이다. 다중 방법은 예를 들어, 다중 증폭 및 다중 시퀀싱을 포함한다. 기타 다중 핵산 조회 방법은 본 기술에 널리 공지되어 있다.
예시적인 다중-PCR과 관련하여, 다중 증폭은 다양한 표적 폴리뉴클레오타이드 서열에 특이적인 다양한 크기의 엠플리콘을 생성하기 위한 단일 표적 폴리뉴클레오타이드 혼합물 내의 다중 프라이머 세트로 구성된다. 다중의 상이한 표적 폴리뉴클레오타이드를 동시에 표적화함으로써, 서열 정보는 단일 증폭 반응으로부터 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드에 대해 수득될 수 있으며, 그렇지 않으면 수행하는데 수배의 시약 및 더 많은 시간이 요구될 것이다. 표적 특이적 프라이머 세트 각각에 대한 어닐링 온도는 단일 반응 내에서 올바르게 작업하도록 최적화될 수 있으며, 엠플리콘 크기 (즉, 염기쌍 길이)는 동일하거나 상이한 길이일 수 있다. PCR을 위한 다중 키트(multiplexing kit)는 시중에서 입수 가능하며, 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다. 상이한 표적 폴리뉴클레오타이드 종의 수는 요망되는 적용에 따라 다양할 수 있다. 예를 들어, 다중 증폭은 25, 50, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 초과의 상이한 종의 표적 폴리뉴클레오타이드에 대해 수행될 수 있다. 다중 증폭은 또한, 상기 범위 내의 임의의 정수에 상응하는 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드에 대해 수행될 수 있다. 따라서, 본 기재내용은 또한, 표적 폴리뉴클레오타이드의 상기 수 또는 더 큰 수의 상이한 구성원을 갖는 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 제공하며, 이는 200개 또는 그 초과의 상이한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
따라서, 본 기재내용은 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 증폭 방법을 제공하며, 상기 방법은 다중 증폭을 포함한다. 다중 증폭은 다중 PCR일 수 있다. 본 기재내용은 또한 180개 또는 그 초과의 상이한 표적 폴리뉴클레오타이드 종의 다중성 (multiplexicity)을 갖는 다중 증폭 방법을 제공한다.
핵산 증폭을 위한 기타 적합한 방법은 올리고뉴클레오타이드 연장 및 결찰, 회전환 증폭 (RCA) (Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)) 및 올리고뉴클레오타이드 결찰 검정 (OLA) (일반적으로, 미국 특허 번호 7,582,420, 5,185,243, 5,679,524 및 5,573,907; EP 0 320 308 B1; EP 0 336 731 B1; EP 0 439 182 B1; WO 90/01069; WO 89/12696; 및 WO 89/09835 참조) 기법을 포함할 수 있다. 관심 핵산을 증폭하기 위해 특정하게 설계될 수 있는 프라이머 연장 및 결찰 프라이머의 비제한적 예로서, 증폭은 미국 특허 번호 7,582,420 및 7,611,869에 예시된 바와 같은 GoldenGate 검정 (Illumina®, Inc., San Diego, CA)을 위해 사용된 프라이머를 포함할 수 있다.
본 기재내용의 방법에 이용될 수 있는 예시적인 등온 증폭 방법은 비제한적으로, 예를 들어, 문헌 [Dean et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002)]에 의해 예시된 바와 같은 다중 치환 증폭법 (MDA) 또는 예를 들어, 미국 특허 번호 6,214,587에 의해 예시된 등온 가닥 치환 핵산 증폭법을 포함하며, 상기 문헌 각각은 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다. 본 기재내용에 이용될 수 있는 또 다른 비-PCR-기반 방법은 예를 들어, 문헌 [Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995]; 미국 특허 번호 5,455,166, 및 5,130,238, 및 문헌 [Walker et al, Nucl. Acids Res. 20: 1691-96 (1992)]에 기술된 예를 들어, 가닥 치환 증폭법 (SDA) 또는 예를 들어, 문헌 [Lage et al., Genome Research 13:294-307 (2003)]에 기술된 초분지된 가닥 치환 증폭법을 포함한다. 등온 증폭 방법은 유전체 DNA의 무작위 프라이머 증폭을 위한 가닥-대체 Phi 29 중합효소 또는 Bst DNA 중합효소 큰 절편인 5'->3' 엑소-와 사용될 수 있다. 이들 중합효소의 사용은 이들의 높은 진행성 및 가닥 치환 활성의 이점을 갖는다. 높은 진행성은 중합효소가 10-20 kb 길이인 절편을 생성하게 한다. 상기 제시된 바와 같이, 더 작은 절편이 낮은 진행성 및 가닥-치환 활성을 갖는 중합효소 예컨대, 클레노브 중합효소를 사용하여 등온 조건하에서 생성될 수 있다. 증폭 반응, 조건 및 구성요소의 추가적인 설명은 그 전체가 본원에 참조로 통합된 미국 특허 번호 7,670,810의 기재내용에 상세히 제시되어 있다.
본 기재내용에 유용한 또 다른 핵산 증폭 방법은 예를 들어, 문헌 [Grothues et al. Nucleic Acids Res. 21(5): 1321-2 (1993)]에 기술된 바와 같이 불변 5' 부위 이어서 무작위 3' 부위를 갖는 2-도메인 프라이머의 군집을 이용하는 Tagged PCR이다. 제 1회의 증폭은 무작위로-합성된 3' 부위로부터의 개별적인 하이브리드화를 기반으로 하는 열 변성 DNA에서의 다수의 개시를 허용하도록 수행된다. 3' 부위의 특성으로 인해, 개시 자리는 유전체에 걸쳐 무작위인 것으로 고려된다. 그 후, 비결합된 프라이머는 제거될 수 있으며 추가의 복제가 불변 5' 부위에 상보적인 프라이머를 사용하여 발생할 수 있다.
상기 예시적 증폭 방법은 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드를 증폭하는데 이용될 수 있다. 표적 폴리뉴클레오타이드는 용액 중에서 또는 고형 지지체 상에 고정화된 채 증폭되어 용액 중에 자유로운 복수의 엠플리콘 또는 고형 지지체 상에 고정화된 복수의 엠플리콘을 생성할 수 있다.
증폭 반응에서 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드에 대한 투입량은 마이크로그램 (㎍) 내지 나노그램 (ng) 또는 그 미만의 범위일 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드에 대한 출발량은 예를 들어, 100 μg 또는 그 초과의 투입 핵산일 수 있다. 또한, 출발량은 예를 들어, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90 μg의 투입 핵산일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 출발량의 투입 핵산은 낮은 나노그램 범위를 포함하는 나노그램 범위일 수 있다. 이러한 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드에 대한 출발량은 예를 들어, 100 ng 또는 그 미만의 투입 핵산일 수 있다. 또한, 출발량은 예를 들어, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 ng 또는 그 미만의 투입 핵산일 수 있다. 기타 구체예에서, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드에 대한 출발량은 예를 들어, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 0.5 ng 또는 그 미만의 투입 핵산일 수 있다. 출발량은 또한, 상기 예시적인 양들 사이의 임의의 양일 수 있다. 따라서, 본 기재내용은 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드가 증폭 반응을 위한 10 ng 또는 그 미만의 투입 핵산을 포함하는 방법을 제공한다. 추가로, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 증폭 반응을 위한 1 ng 투입 핵산 또는 1 ng 또는 그 미만의 투입 핵산일 수 있다.
일부 구체예에서, 복수의 고정화된 표적 특이적 포획 프라이머는 복수의 엠플리콘과 하이브리드화시키기에 충분한 조건하에 접촉된다. 표적 특이적 포획 프라이머의 표적 특이적 부위는 표적 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 부위에 어닐링되도록 설계될 수 있다. 하이브리드화된 표적 폴리뉴클레오타이드 포획 프라이머는 표적 특이적 포획 프라이머를 통해 고정화될 것이다.
도 1, 패널 2는 고형 지지체에 고정화된 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 예시한다. 이러한 예시에서, 표적 특이적 포획 프라이머는 고형 지지체 상에 고정화된 기타 포획 프라이머보다 길다. 당업자는 표적 특이적 포획 프라이머가 고형 지지체에 고정화되는 기타 포획 프라이머보다 길거나, 짧거나 이와 동일한 길이인지의 여부는 중요하지 않음을 이해할 것이다. 그 보다는, 임의의 포획 프라이머는 이의 기능을 수행하는데 필요한 서열을 지닐 것이다. 표적 특이적 포획 프라이머는 이의 표적 폴리뉴클레오타이드에 선택적으로 또는 특이적으로 어닐링되도록 작용한다. 기타 포획 프라이머 예컨대, 특정한 보편적 포획 프라이머는 공지된 서열 예컨대, 어댑터, 프라이머 결합 자리 또는 기타 공지의 서열에 어닐링되도록 작용한다.
복수의 표적 특이적 포획 프라이머 내의 각 구성원은 동일한 표적 특이적 서열 또는 상이한 표적 특이적 서열을 가질 수 있다. 전자의 구체예에서, 복수의 표적 특이적 포획 프라이머는 복수의 동일한 종의 표적 폴리뉴클레오타이드에 어닐링되어 이를 포획할 것이다. 후자의 구체예에서, 복수의 표적 특이적 포획 프라이머는 복수의 상이한 종의 표적 폴리뉴클레오타이드에 어닐링되어 이를 포획할 것이다. 일반적으로, 포획 프라이머의 표적 특이적 부위는 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 특정 구성원에 대한 동일한 부위에 상보적이 되도록 설계된다. 그러나, 표적 특이적 부위는 또한, 특정 표적 폴리뉴클레오타이드 내의 상이한 뉴클레오타이드 서열에 상보적이도록 설계될 수 있다. 따라서, 본원에 제공된 교시 및 안내를 고려할 경우, 당업자는 복수의 표적 특이적 포획 프라이머에 포함될 구성원의 어떠한 조성이 특정 적용에 필요한지를 이해할 것이다.
복수의 표적 특이적 포획 프라이머는 크거나 작을 수 있다. 당업자는 복수의 표적 특이적 포획 프라이머가 포획되어야 하는 각 표적 폴리뉴클레오타이드에 대한 적어도 하나의 표적 특이적 포획 프라이머를 함유할 것임을 이해할 것이다. 복수는 또한, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드 내의 일부 또는 모든 표적 폴리뉴클레오타이드 종에 대한 다중의 표적 포획 프라이머를 포함하는, 동일한 표적 폴리뉴클레오타이드 종에 대한 다중의 표적 특이적 포획 프라이머를 포함할 수 있다. 따라서, 본 기재내용은 군집의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 200개 또는 그 초과의 상이한 구성원을 포함하는 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 제공한다. 복수의 표적 특이적 포획 프라이머는 또한, 예를 들어, 300, 400, 500, 1000, 5000, 10000, 50000, 1x105, 2x105, 3x105, 4x105, 5x105, 6x105, 7x105, 8x105, 9x105, 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106 또는 1x107개 또는 그 초과의 상이한 구성원을 포함할 수 있다. 복수의 표적 특이적 포획 프라이머는 또한, 상기 예시적 군집 수 사이의 모든 정수를 포함할 수 있다. 따라서, 본 기재내용은 200개 또는 그 초과의 상이한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 제공한다.
복수의 표적 특이적 포획 프라이머는 도 1, 패널 2에 묘사된 바와 같이 고형 지지체 상에 고정화될 수 있다. 복수의 표적 특이적 포획 프라이머는 또한, 용액 중에 자유롭게 사용될 수 있으며 후속하여 예를 들어, 표적 특이적 포획 프라이머 상의 제 2 부위에 상보적인 보편적 서열을 갖는 포획 프라이머로의 하이브리드화에 의해 고형 지지체상에 고정화될 수 있다.
복수의 표적 특이적 포획 프라이머가 도 1, 패널 2에 예시된 바와 같이 먼저 고형 지지체 상에 고정화되는 특정 구체예에서, 표적 특이적 포획 프라이머는 예시된 바와 같이 고형 지지체에 직접 부착될 수 있다. 대안적으로, 표적 특이적 포획 프라이머는 보편적 포획 프라이머로부터 고형 지지체 상에 생성될 수 있다. 이와 관련하여, 포획 프라이머의 더 두꺼운 부분은 고형 지지체에 사전 씨딩된 보편적 서열을 나타낸다. 도 1, 패널 2에서 설명된 바와 같이, 보편적 프라이머에 대해 상보적인 부위를 갖는 표적 특이적 포획 프라이머 또는 복수의 표적 특이적 포획 프라이머는 예를 들어, 보편적 포획 프라이머에 어닐링되고 이어서 연장되어 전장의 표적 특이적 포획 프라이머 또는 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 생성할 수 있다.
고정화된 표적 특이적 포획 프라이머를 사용하는 구체예가 유용한데 왜냐하면 이들은 복수의 엠플리콘의 표준화를 허용하기 때문이다. 예를 들어, 고형 지지체는 표준의 복사 개수의 각 종의 표적 특이적 포획 프라이머를 함유하도록 생성될 수 있어, 표준의 복사 개수의 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 엠플리콘의 포획을 허용한다. 표적 특이적 포획 프라이머의 표준의 복사 개수는 변화될 수 있으며 표준 복사 개수의 풍부한 및 희귀한 둘 모두의 표적 폴리뉴클레오타이드 종이 동일한 빈도로 포획되도록 설계될 수 있다. 기타 구체예에서, 상이한 종의 표적 특이적 포획 프라이머는 표준화되지 않으며, 무작위를 포함하는 임의의 요망되는 비율로 고정화될 수 있다. 본원에 제공된 교시 및 안내를 고려할 때, 당업자는 동일한 수의 복사 개수를 포함하는 표준화된 복사 개수 또는 기타 비율의 상이한 종의 표적 특이적 포획 프라이머가 특정 용도에 바람직한 지의 여부를 알 수 있을 것이다.
복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 갖는 것 이외에, 고형 지지체는 또한 도 1, 패널 2에 묘사된 바와 같이 복수의 다른 유형의 포획 프라이머를 포함할 수 있다. 이러한 복수의 포획 프라이머는 동일하거나 상이한 서열을 가질 수 있다. 도 1, 패널 2는 2개의 복수의 보편적 포획 프라이머 (수직 올리고뉴클레오타이드의 흑색 및 점묘법으로 나타낸 두꺼운 섹션)를 설명한다. 이러한 예시적 구체예에서, 한 복수의 보편적 포획 프라이머는 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드에 첨가된 어댑터에 상보적이다. 보편적 포획 프라이머는 예를 들어, 어댑터를 함유하는 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 엠플리콘을 포획하는데 유용하다. 보편적 포획 프라이머는 또한, 도 1, 패널 3에 설명되고 하기 추가로 기술된 바와 같이, 예를 들어, 브릿지 증폭을 수행하는데 유용하다. 고형 지지체는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 또는 그 초과의 상이한 복수의 보편적 포획 프라이머를 포함할 수 있다.
따라서, 본 기재내용은 복수의 보편적 포획 프라이머에 상보적인 어댑터를 갖는 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이의 엠플리콘을 제공한다. 고형 지지체는 제 1, 제 2 또는 더 큰 수의 상이한 복수의 보편적 포획 프라이머를 포함할 수 있다. 또한, 보편적 포획 프라이머 부위를 추가로 갖는 복수의 표적 특이적 포획 프라이머가 제공된다. 보편적 포획 프라이머 부위는 제 1 또는 제 2의 복수의 보편적 포획 프라이머에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 가질 수 있다.
따라서, 일부 구체예에서, 본 기재내용의 방법은 복수의 고정화된 표적 특이적 포획 프라이머를 갖는 고형 지지체를 제공하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 고형 지지체를 제공하는 것은 고형 지지체 상으로의 표적 특이적 포획 프라이머를 고정화시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 특이적 포획 프라이머는 고형 지지체 상에 직접적으로 고정화된다.
일부 구체예에서, 표적 특이적 포획 프라이머는 하나 이상의 단계로 고형 지지체 상에 어셈블링된다. 일부 구체예에서, 표적 특이적 포획 프라이머의 고정화는 고형 지지체 상으로 보편적 포획 프라이머를 고정화시키는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 표적 특이적 포획 프라이머의 고정화는 고정화된 보편적 포획 프라이머를 표적 특이적 포획 프라이머로 전환시키는 것을 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 표적 특이적 포획 프라이머의 고정화는 보편적 포획 프라이머를 지닌 스필린트(splint) 올리고뉴클레오타이드를 어닐링시키는 것을 추가로 포함하며, 여기에서 스플린트 올리고뉴클레오타이드는 표적 뉴클레오타이드에서 표적 특이적 부위에 상보적인 표적 특이적 부위 및 표적 특이적 포획 프라이머의 보편적 부위에 상보적인 보편적 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 표적 특이적 포획 프라이머의 고정화는 보편적 포획 프라이머를 연장시켜 표적 특이적 포획 프라이머를 생성하는 것을 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 표적 특이적 포획 프라이머는 기타 표적 특이적 포획 프라이머와 조합되어 고정화된다. 일부 구체예에서, 표적 특이적 포획 프라이머는 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 포함한다. 일부 구체예에서, 복수의 표적 특이적 포획 프라이머는 단지 2개 유형의 표적 특이적 포획 프라이머를 포함한다. 예를 들어, 표적 특이적 포획 프라이머는 2개의 보편적 포획 부위, 예컨대, P5 또는 P7 부위 중 하나 및 하나의 표적 특이적 부위를 포함한다. P5 부위는 뉴클레오타이드 서열 5'- AATGATACGGCGACCACCGA-3'를 포함한다. P7 부위는 뉴클레오타이드 서열 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'를 포함한다. 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 P5 부위 서열 ("항-P5": 5'-TCGGTGGTCGCCGTATCATT-3') 또는 P7 부위 서열 ("항-P7": 5'-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3') 포획 프라이머의 역 상보체이다. 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 Illumina® 포획 프라이머 P5 (말단 쌍) (5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC-3') 또는 P7 (말단 쌍) (5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA(8-옥소-G)AT-3')과 하이브리다이징될 수 있다. 특정 구체예에서, 올리고뉴클레오타이드는 Illumina® 포획 프라이머 P5(말단 쌍) ("항-P5 (말단 쌍)": 5'-GTGT AGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3') 또는 P7(말단 쌍) ("항-P7(말단 쌍)": 5'-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3')의 역 상보체와 하이브리다이징될 수 있다.
기타 구체예에서, 복수의 표적 특이적 포획 프라이머는 상이한 구성원의 군집을 포함한다. 특정 구체예에서, 표적 특이적 포획 프라이머의 군집은 10, 100, 1,000, 10,000, 100,000, 1,000,000, 10,000,000개 초과의 상이한 구성원을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 표적 특이적 포획 프라이머는 표적 특이적 포획 부위에 포함된 서열이 상이하다. 특정 구체예에서, 표적 특이적 포획 프라이머는 다양한 표적 폴리뉴클레오타이드를 표적으로 한다.
본 기재내용의 일부 구체예에서, 고정화된 표적 특이적 포획 프라이머는 복수의 고정화된 표적 특이적 포획 프라이머를 포함하며 표적 폴리뉴클레오타이드는 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구체예에서, 본질적으로 모든 고정화된 포획 프라이머는 표적 특이적 포획 프라이머이다. 기타 구체예에서, 표적 특이적 포획 프라이머는 보편적 포획 프라이머와 조합되어 고정화된다. 특정 구체예에서, 과량의 표적 특이적 포획 프라이머가 고정화된다. 특정 구체예에서, 보편적 포획 프라이머에 비해 과량의 표적 특이적 포획 프라이머는 2:1, 3:1, 5:1, 10:1, 50:1, 100:1, 500:1, 1,000:1, 10,000:1, 50:000:1 또는 100,000:1 초과이다. 특정 구체예에서, 과량의 보편적 포획 프라이머가 고정화된다. 특정 구체예에서, 표적 특이적 포획 프라이머에 비해 과량의 보편적 포획 프라이머는 2:1, 3:1, 5:1, 10:1, 50:1, 100:1, 500:1, 1,000:1, 10,000:1, 50:000:1 또는 100,000:1 초과이다.
유전자 장애 또는 질환의 존재, 부재 또는 감수성 측정에 대한 특정 구체예에서, 복수의 표적 특이적 포획 프라이머는 이러한 유전자 장애 또는 질병과 연관된 하나 이상의 유전자에 관한 것일 수 있다. 이러한 유전자 장애 또는 질환은 이전에 예시되거나 당해 기술에 널리 공지된 임의의 것을 포함한다. 예를 들어, 복수의 표적 특이적 포획 프라이머는 2개 또는 그 초과의 질병과 관련되어 다중의 상이한 질병 또는 질환의 존재, 부재 또는 감수성을 검출할 수 있다. 따라서, 표적 특이적 포획 프라이머의 패널은 다중의 상이한 질병을 검출하는데 사용될 수 있다. 패널은 상이하거나 동일한 유전자 장애 또는 질환과 연관된 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 200개 또는 그 초과의 유전자에 특이적인 복수의 표적 특이적 포획 프라이머 내의 구성원을 포함할 수 있다.
암 관련 유전자의 패널에 관한 예로서, 복수의 표적 특이적 포획 프라이머는 하기 암 관련 유전자의 임의의 조합 (모든 조합 및/또는 순열 포함)을 포함할 수 있다: AKT1, CTNNB1, FLT3, KRAS, PTPN11, SRC, ALK, EGFR, GNAS, MLH1, RB1, STK11, ATM, ERBB2, HNF1A, MPL, RAD50, TP53, BRAF, ERBB4, IDH1, NRAS, RET, VHL, BRCA1, FBXW7, JAK3, PIK3CA, SMAD4, CDH1, FGFR2, KIT, PTEN, SMARCB1, ABL1, CSF1R, GNA11, JAK2, NOTCH1, SMO, APC, FGFR1, GNAQ, KDR, NPM1, CDKN2, FGFR3, HRAS, MET 및/또는 PDGFRA.
따라서, 본 기재내용은 암 관련 유전자의 존재를 결정하는 방법으로서, 복수의 표적 특이적 포획 프라이머가 하기 유전자로부터 선택된 2개 또는 그 초과의 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법을 제공한다: AKT1, CTNNB1, FLT3, KRAS, PTPN11, SRC, ALK, EGFR, GNAS, MLH1, RB1, STK11, ATM, ERBB2, HNF1A, MPL, RAD50, TP53, BRAF, ERBB4, IDH1, NRAS, RET, VHL, BRCA1, FBXW7, JAK3, PIK3CA, SMAD4, CDH1, FGFR2, KIT, PTEN, SMARCB1, ABL1, CSF1R, GNA11, JAK2, NOTCH1, SMO, APC, FGFR1, GNAQ, KDR, NPM1, CDKN2, FGFR3, HRAS, MET 및 PDGFRA. 복수의 표적 특이적 포획 프라이머는 하기 유전자 각각에 대한 뉴클레오타이드 서열일 수 있다: AKT1, CTNNB1, FLT3, KRAS, PTPN11, SRC, ALK, EGFR, GNAS, MLH1, RB1, STK11, ATM, ERBB2, HNF1A, MPL, RAD50, TP53, BRAF, ERBB4, IDH1, NRAS, RET, VHL, BRCA1, FBXW7, JAK3, PIK3CA, SMAD4, CDH1, FGFR2, KIT, PTEN, SMARCB1, ABL1, CSF1R, GNA11, JAK2, NOTCH1, SMO, APC, FGFR1, GNAQ, KDR, NPM1, CDKN2, FGFR3, HRAS, MET 및 PDGFRA.
일부 구체예에서, 복수의 엠플리콘은 예를 들어, 고형 지지체에 고정화된 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 직접 접촉시키는 것을 포함하는 증폭 절차 후 복수의 표적 특이적 포획 프라이머에 직접적으로 가해지거나 접촉된다. 따라서, 복수의 엠플리콘은 현저하게 간섭되는 정제 단계 없이 복수의 포획 프라이머에 가해질 수 있으며 부분적으로 또는 실질적으로 정제되지 않은 복수의 엠플리콘일 수 있다. 따라서, 이러한 구체예에서, 복수의 엠플리콘은 고효율의 세포 구성요소, 프라이머, 증폭 효소 및 증폭되지 않은 또는 잘못 증폭된 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 혼합 세포 구성요소를 포함할 수 있다.
기타 구체예에서, 복수의 엠플리콘은 복수의 표적 특이적 포획 프라이머와의 접촉 전에 부분적으로 또는 완전하게 정제될 수 있다. 이러한 핵산 정제 절차는 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 세포 구성요소 예컨대, 거대분자, 염 및 기타 등등을 제거하기 위한 예를 들어, 침전, 여과 및 크로마토그래피를 포함한다.
예를 들어, 고형 지지체 상에 고정화된 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 포함하는 복수의 표적 특이적 포획 프라이머의 하이브리드화에 적합한 조건은 수분 내지 시간 또는 그 초과의 범위의 인큐베이션 또는 어닐링 기간을 가질 수 있다. 더 짧은 하이브리드화 시간은 통합된 절차에서 임의의 후속 단계 또는 단계들로 효율적으로 진행되기에 유용하다. 일부 구체예에서, 하이브리드화 시간은 예를 들어, 60분 또는 그 미만일 수 있다. 하이브리드화 시간은 또한, 예를 들어, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10분 또는 그 미만일 수 있다. 하이브리드화는 또한, 예를 들어, 9, 8, 7, 6 또는 5분을 포함하여, 10분보다 짧을 수 있다. 하이브리드화 시간은 추가적으로 상기 예시적 기간 사이의 임의의 기간일 수 있다. 따라서, 본 기재내용은, 하이브리드화에 충분한 조건이 10분 또는 그 미만 동안의 표적 특이적 포획 프라이머의 인큐베이션 시간 또는 앰플리콘 또는 기타 폴리뉴클레오타이드로의 어닐링 시간을 포함하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 복수의 엠플리콘은 복수의 표적 특이적 포획 프라이머와 접촉되기 전에 이중 가닥일 수 있다. 표적 특이적 포획 프라이머에 의한 어닐링 및 포획을 허용하기 위해, 복수의 엠플리콘은 예를 들어, Tm을 감소시키는 화학적 시약 또는 고온에 의해 변성되어 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드의 2개 가닥을 분리할 수 있다. 부분적 가닥 분리를 포함하는 가닥 분리는 예를 들어, 복수의 표적 특이적 포획 프라이머와의 접촉 전에 또는 접촉과 동시에 수행될 수 있다. 기타 구체예에서, 복수의 엠플리콘은 단일 가닥일 수 있다. 이러한 단일 가닥 구체예에서, 가닥 분리 단계는 불필요하나, 단일 가닥 내의 2차 구조를 제거하기 위해 유용하게 이용될 수 있다.
고형 지지체 상에 고정화된 표적 특이적 포획 프라이머로의 어닐링에 의해 엠플리콘을 포획하여 고정화된 복수의 엠플리콘을 생성시킨 후, 예를 들어, 고정화된 복수의 엠플리콘은 부분적으로 이중 가닥일 수 있으며 부분적으로 단일 가닥일 수 있다. 도 1, 패널 3에 묘사된 바와 같이, 가장 왼쪽의 고정화된 엠플리콘이 표적 특이적 포획 프로브에 하이브리다이징되고 비-상보적 부위는 단일 가닥으로 남아 있다. 고정화된 복수의 엠플리콘을 포함하는 고정화된 엠플리콘은 표적 특이적 포획 프라이머로부터의 효소 연장에 의해 이중 가닥으로 만들어질 수 있다. 이러한 이중 가닥 연장 생성물은 도 3, 패널 3의 중간의 고정화된 엠플리콘으로 묘사된다. 연장 반응은 당해 기술에 널리 공지되어 있으며 하기 및 실시예에서 추가로 예시된다.
본 기재내용의 특정 구체예에 따른 다음 단계에서, 고정화된 복수의 엠플리콘은 추가의 절차로 처리될 수 있다. 이러한 추가의 절차는 예를 들어, 증폭 또는 시퀀싱을 포함한다. 특정 구체예에서, 제 1의 복수의 고정화된 엠플리콘은 상기 기술된 임의의 방법 또는 당해기술에서 널리 공지된 기타 방법을 이용하여 증폭되어 제 2의 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성시킨다. 고형 지지체 상에 고정화되는 경우, 특히 유용한 한 증폭 절차는 브릿지 증폭을 포함한다. 도 1, 패널 3에 묘사된 바와 같이, 예를 들어, 연장 반응으로부터 생성된 이중 가닥 또는 부분적인 이중 가닥 엠플리콘은 변성되고, 고정화된 가닥은 예시된 바와 같이 어댑터로의 하이브리드화를 통해 보편적 포획 프라이머에 어닐링된다. 생성된 구조물은 양 말단에서 고정화되어 브릿지를 생성시키고, 보편적 포획 프라이머는 예를 들어, 표적 특이적 포획 프라이머에 함유된 보편적 프라이머 부위를 사용하여 연장되고 이어서 증폭될 수 있다. 이러한 제 2의 보편적 포획 프라이머는 어댑터 서열에 상보적인 제 1의 보편적 프라이머와 상이할 수 있다. 고정화되지 않은 가닥은 예를 들어, 세척 제거될 수 있다. 따라서, 본 기재내용의 방법은 브릿지 증폭을 포함하는 증폭 방법을 제공한다.
본원에 기술된 브릿지 증폭 방법은 복수개 내에 엠플리콘에 대한 균일한 클러스터 또는 콜로니 수를 발생시킨다. 클러스터 균일성은 도 2 및 3에 설명되어 있으며, 하기 실시예에서 추가로 기술된다. 따라서, 본 기재내용은 고정화된 폴리뉴클레오타이드의 증폭 방법으로서, 균일성이 0.1 평균에서 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94 또는 95 또는 그 초과를 포함하는 방법을 제공한다.
예를 들어, 브릿지 증폭에서, 적합한 조건은, 단일 가닥 연장 생성물이 고정화된 보편적 포획 프라이머에 어닐링되어 브릿지 구조 형태의 복합물을 형성하도록 고정화된 복수의 단일 가닥 연장 생성물을 포함하는 고정화된 단일 가닥 연장 생성물에 가해진다. 적합한 조건 예컨대, 중화 및/또는 하이브리다이징 완충제는 당해 기술분야에 널리 공지되어 있다 (문헌 [Sambrook and Russell, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, third edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1998)] 참조). 이어서, 중화 및/또는 하이브리다이징 완충제가 제거될 수 있다.
이어서 연장에 적합한 조건을 이용하여 연장 반응을 수행한다. 복합체의 증폭 올리고뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드의 연속 첨가에 의해 연장되어 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 분자에 상보적인 연장 생성물을 생성한다. 생성된 듀플렉스는 각 가닥이 고정되도록 양 끝에서 고정된다.
중합효소 활성을 지닌 효소를 포함하는 연장 완충제/용액과 같은 적합한 조건은 당 분야에 잘 알려져 있다 (Sambrook et al, supra; Ausubel et al. supra 참조). 이러한 브릿지 증폭 기술은 내용이 본원에 참조로서 포함되는, 예를 들어, US 7,115,400 및 US 2005/0100900 Al에 기재된 대로 수행될 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 중합효소 활성을 지닌 효소의 예는 DNA 중합효소 (Klenow 단편, T4 DNA 중합효소), 다양한 열안정 박테리아로부터의 열-안정 DNA 중합효소 (예컨대, Taq, VENT, Pfu, 또는 Tfl DNA 중합효소) 뿐만 아니라 이들의 유전자 변형된 유도체 (TaqGold, VENTexo, 또는 Pfu exo)이다. RNA 중합효소 및 및 역전사효소의 조합물도 연장 생성물을 생성하는데 이용될 수 있다. 특히 효소는 이러한 및 관련 구체예에서 가닥 전위 활성을 지닐 수 있고, 보다 특히 효소는 약 7 내지 약 9의 pH, 특히 pH 7.9 내지 pH 8.8에서 활성일 수 있으며, 또한 보다 특히 효소는 특정 예시적 구체예에서 Bst 또는 Klenow이다.
이용되는 뉴클레오사이드 트리포스페이트 분자는 통상적으로 데옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트, 예를 들어 dATP, dTTP, dCTP, dGTP이거나, 리보뉴클레오사이드 트리포스페이트, 예를 들어 ATP, UTP, CTP, GTP이다. 뉴클레오사이드 트리포스페이트 분자는 자연 또는 비-자연적으로 발생할 수 있다.
하이브리드화 및 연장 단계 후에, 지지체 및 부착된 핵산은 변성 조건으로 처리될 수 있다. 플로우 셀은 연장 완충제가 일반적으로 변성 완충제의 유입에 의해 제거되도록 이용될 수 있다. 적합한 변성 완충제는 당 분야에 잘 알려져 있다 (Sambrook et al, supra; Ausubel et al. supra 참조). 예로서, pH 및 저 이온 강도 용액의 변경은 실질적으로 등온 온도에서 핵산을 변성시킬 수 있는 것이 공지되어 있다. 포름아미드 및 우레아는 Watson-Crick 염기 페어링을 발생시키는 수소 결합을 붕괴시켜 핵산의 염기와 새로운 수소 결합을 형성한다. 특정 구체예에서, 포름아미드의 농도는 50% 이상이다. 이는 단일 가닥 핵산 분자를 발생시킨다. 요망되는 경우, 가닥들은 매우 낮은 염 (예를 들어 0.01 M 미만의 양이온 조건) 및 높은 pH (>12)의 용액으로 처리하거나 카오트로픽 염 (예컨대, 구아니디늄 하이드로클로라이드)을 이용하여 분리될 수 있다. 특정 구체예에서, 강 염기가 이용된다. 강 염기는 산 염기 반응에서 매우 약산을 탈양자화시킬 수 있는 염기성 화학적 화합물이다. 염기의 강도는 이의 pKb 값으로 표시되고, pKb 값이 약 1 미만인 화합물을 강 염기라고 하며 이는 당분야 숙련자에게 잘 알려져 있다. 특정 구체예에서, 강 염기는 0.05 M 내지 0.25 M, 특히 0.1 M의 농도로 이용되는 소듐 하이드록사이드 (NaOH) 용액이다.
상기 예시된 하이브리드화, 연장 및 변성 단계 이후, 2개의 고정된 핵산이 존재할 것인데, 첫 번째는 제1 주형 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 분자 (초기에 고정됨)와 동일한 서열을 함유하고 두 번째는 이에 상보적인 핵산이며, 이들은 고정된 포획 올리고뉴클레오타이드 중 하나로부터 연장된다. 둘 모두의 고정화된 가닥은 그 후 지지체를 하이브리드화, 연장 및 변성의 추가 사이클로 처리함에 의해 추가 라운드의 증폭을 개시할 수 있다. 따라서, 증폭은 단일 가닥에서 듀플렉스, 한 듀플렉스에서 2개의 듀플렉스, 2개의 듀플렉스에서 4개의 듀플렉스 등으로 어닐링, 연장 및 변성의 사이클을 통해 진행된다.
증폭 방법의 각 단계 사이에 임의의 세척 단계를 수행하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, dNTP'가 있거나 없이 중합효소가 없는 연장 완충제를 고형 지지체에 적용시킨 후 제거하고 완전한 연장 완충제로 대신할 수 있다.
그러한 추가 라운드의 증폭을 이용하여 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드 서열 및 이의 상보적 서열의 다수의 고정화된 복사체를 갖는 핵산 콜로니 또는 클러스터를 생성할 수 있다.
엠플리콘의 초기 고정화는 연장 생성물이 주형 폴리뉴클레오타이드 분자의 총 길이 내 소정의 거리에 위치한 보편적 포획 프라이머와 하이브리드화될 수 있음을 의미한다. 추가 라운드의 증폭, 즉, 추가 라운드의 하이브리드화, 연장 및 변성을 수행함에 의해 고정화된 연장 생성물 및 이의 보체의 하나 초과의 복사체가 합성되었고, 그 후 생성되는 핵산 콜로니 또는 클러스터의 경계는 추가로 연장될 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명의 방법은 제1 복수의 다중 고정화된 단일 가닥 엠플리콘으로부터의 제2 복수의 고정화된 엠플리콘 또는 폴리뉴클레오타이드 콜로니의 생성을 허용하고 이러한 콜로니의 밀도는 고형 지지체 상에 고정화된 보편적 포획 프라이머의 비율을 변경시킴에 의해 조절될 수 있다.
한 특정 양태에서, 본 발명의 방법을 이용하여, 고형-상 증폭에 의해, US 7,115,400, US 2005/0100900 Al, WO 00/18957 및 WO 98/44151에 기재된 것과 유사한 핵산 콜로니의 클러스터링된 어레이를 제조한다.
본 발명의 방법에 의해 형성된 클러스터링된 어레이는 일반적으로 마이크로-어레이와 같은 정렬된 어레이(ordered array) 상에서 수행되는 적용에 사용하기 적합하다. 비제한적인 예로서 이러한 적용은 하이브리드화 분석, 유전자 발현 분석, 단백질 결합 분석, 시퀀싱, 유전형 분석, 핵산 메틸화 분석 등을 포함한다. 클러스터링된 어레이는, 예를 들어, 형광 RNA와 하이브리드화 또는 형광 표지된 단백질을 이용한 결합 연구와 같은 다운스트림 적용에 이용되기 전에 시퀀싱될 수 있다.
도 1, 패널 4에 예시된 대로, 본 발명은 또한 고형-상 증폭에 의해 생성된 증폭된 핵산의 시퀀싱 방법을 포함한다. 따라서, 본 발명은 상기 기재된 대로 고형-상 증폭을 이용하여 복수의 고정화된 연장 생성물을 증폭시키고 핵산 시퀀싱 반응을 수행하여 고형-상 증폭 반응에서 생성된 적어도 하나의 증폭된 핵산 가닥 전부 또는 일부의 서열을 결정하는 것을 포함하는 핵산 시퀀싱 방법을 제공한다.
특정 구체예에서, 복수의 상이한 표적 폴리뉴클레오타이드의 서열을 수득하기 위해 본원에 기재된 방법은 시작부터 종료까지의 짧은 시간을 초래하는 순차적 또는 통합된 방식으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법을 이용하여, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 서열은 50회 시퀀싱 주기 동안 3시간 또는 그 이내에 결정될 수 있다. 시작부터 종료까지의 시간은 또한 50회 시퀀싱 주기 동안 예를 들어, 2.9, 2.8, 2.7, 2.6 또는 2.5 시간 또는 그 이내일 수 있다. 통합된 방법은, 예를 들어, 10 ng 또는 그 미만의 투입 핵산으로 시작하여; 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 증폭시켜 복수의 엠플리콘을 생성하고; 복수의 엠플리콘을 포획하여 제1 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성하고; 제1 복수의 고정화된 엠플리콘을 증폭시켜 제2 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성하고, 적어도 50회 시퀀싱 주기 동안 엠플리콘을 시퀀싱하는 것을 포함한다. 당분야 숙련자는 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 서열을 수득하기 위한 시작부터 종료까지의 시간이 유사하게 효율적일 것이나, 더 많은 시퀀싱 주기가 수행되는 경우 더 길어짐을 이해할 것이다. 예를 들어, 50회 시퀀싱 주기는 약 2시간이 걸리고 약 2시간 50분의 전체 시작부터 종료까지의 시간을 발생시킬 수 있는 반면, 150회 시퀀싱 주기는 약 4.5시간이 걸리고 약 5-6시간의 전체 시작부터 종료까지의 시간을 발생시킬 수 있다.
시퀀싱은 임의의 적합한 시퀀싱 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 특히 유용한 방법은 뉴클레오타이드가 자유 3' 하이드록실기에 연속으로 첨가되어, 5'에서 3' 방향으로 폴리뉴클레오타이드 사슬의 합성을 발생시키는 것이다. 첨가되는 뉴클레오타이드의 특성은 각 뉴클레오타이드 첨가 후에 또는 시퀀싱 공정의 끝에 결정될 수 있다. 모든 연속적인 염기가 시퀀싱되는 것은 아닌, 라이게이션에 의한 시퀀싱을 이용하는 시퀀싱 기술, 및 염기가 표면 상의 가닥에 첨가된다기보다 가닥으로부터 제거되는 대량 병렬 시그니처 시퀀싱 (massively parallel signature sequencing) (MPSS)과 같은 기술이 또한 본 발명의 범위 내에 있다.
예를 들어, 한 유용한 시퀀싱 방법은 합성에 의한 시퀀싱 (SBS)이다. SBS에서, 핵산 주형 (예컨대, 표적 핵산 또는 이의 엠플리콘)에 따른 핵산 프라이머의 연장을 모니터하여 주형에서 뉴클레오타이드의 서열을 결정한다. 기초가 되는 화학 공정은 중합반응일 수 있다 (예컨대, 중합효소에 의해 촉매화됨). 특정 중합효소-기반 SBS 구체예에서, 형광 표지된 뉴클레오타이드를, 프라이머에 첨가되는 뉴클레오타이드의 순서 및 유형의 검출이 주형의 서열을 결정하는데 이용될 수 있게 하는 주형 의존적인 방식으로 프라이머에 첨가한다 (이에 의해 프라이머를 연장시킴).
하기에 추가로 설명된 대로, 플로우 셀은 본 발명의 방법에 의해 생성되는 증폭된 DNA 단편을 수용하기 편리한 고형 지지체를 제공한다. 이러한 포맷으로 하나 이상의 엠플리콘을 주기에 시약의 반복적인 전달을 수반하는 다른 검출 기술 또는 SBS로 처리할 수 있다. 예를 들어, 제1 SBS 주기를 개시하기 위해, 하나 이상의 표지된 뉴클레오타이드, DNA 중합효소 등을 하나 이상의 증폭된 핵산 분자를 포함한 플로우 셀로/을 통해 유동시킬 수 있다. 프라이머 연장이 표지된 뉴클레오타이드의 혼입을 초래하는 그러한 부위가 검출될 수 있다. 임의로, 뉴클레오타이드는 일단 뉴클레오타이드가 프라이머에 첨가된 다음 추가 프라이머 연장을 종료시키는 가역적인 종료 속성을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 가역적인 종료자 모이어티를 지니는 뉴클레오타이드 유사체가 프라이머에 첨가되어, 탈차단제가 전달되어 모이어티를 제거할 때까지 후속 연장이 발생할 수 없도록 할 수 있다. 따라서, 가역적인 종료를 이용하는 구체예의 경우, 탈차단제가 플로우 셀에 전달될 수 있다 (검출이 일어나기 전 또는 후). 세척은 다양한 전달 단계 사이에 수행될 수 있다. 그 후 주기가 n회 반복되어 n개 뉴클레오타이드만큼 프라이머를 연장시켜, 길이 n의 서열을 검출할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 생성되는 앰플리콘에 사용하기 위해 용이하게 채용될 수 있는 예시적인 SBS 절차, 유체 시스템 및 검출 플랫폼은, 예를 들어, 문헌[Bentley et al, Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; US 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; US 7,405,281, 및 US 2008/0108082]에 기재되어 있고, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
주기 반응을 이용하는 다른 시퀀싱 절차, 예컨대 파이로시퀀싱이 이용될 수 있다. 파이로시퀀싱은 특정 뉴클레오타이드가 신생 핵산 가닥에 혼입됨에 따라 무기 피로포스페이트(PPi)의 방출을 검출한다 (Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi et al. Science 281(5375), 363 (1998); US 6,210,891; US 6,258,568 및 US. 6,274,320, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함됨). 파이로시퀀싱에서, 방출된 PPi는 ATP 설푸릴라제에 의해 아데노신 트리포스페이트 (ATP)로 즉시 전환됨에 의해 검출될 수 있고, 생성된 ATP의 수준은 루시페라제-생성된 광자를 통해 검출될 수 있다. 따라서, 시퀀싱 반응은 발광 검출 시스템을 통해 모니터될 수 있다. 형광 기반 검출 시스템에 이용된 여기 방사선원은 파이로시퀀싱 절차에 필수적인 것은 아니다. 본 발명에 따라 생성된 엠플리콘에 파이로시퀀싱의 적용을 위해 채용될 수 있는 유용한 유체 시스템, 검출기 및 절차는, 예를 들어, WIPO 특허 출원 일련 번호 PCT/US11/57111, US 2005/0191698 A1, US 7,595,883, 및 US 7,244,559에 기재되어 있고, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구체예는 DNA 중합효소 활성의 실시간 모니터를 수반하는 방법을 활용할 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 혼입은 형광단-함유 중합효소 및 γ-포스페이트-표지된 뉴클레오타이드 간의 형광 공명 에너지 전이 (FRET) 상호작용을 통해, 또는 제로모드 웨이브가이드(zeromode waveguide)(ZMW)를 이용하여 검출될 수 있다. FRET-기반 시퀀싱을 위한 기술 및 시약은, 예를 들어, 문헌[Levene et al. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist et al. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach et al. Proc . Natl . Acad . Sci . USA 105, 1176-1181 (2008)]에 기재되어 있고, 이의 설명은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 SBS 구체예는 뉴클레오타이드의 연장 생성물로의 혼입시에 방출되는 양성자의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 양성자의 검출에 기반한 시퀀싱은 Ion Torrent로부터 시판되는 전기 검출기 및 관련 기술 (Guilford, CT, a Life Technologies subsidiary) 또는 US 2009/0026082 Al; US 2009/0127589 Al; US 2010/0137143 Al; 또는 US 2010/0282617 Al (이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다)에 기재된 시퀀싱 방법 및 시스템을 이용할 수 있다. 동역학적 배제를 이용하여 표적 핵산을 증폭시키기 위해 본원에 개시된 방법은 양성자를 검출하기 위해 이용된 기질에 용이하게 적용될 수 있다. 보다 특히, 본원에 개시된 방법은 양성자를 검출하기 위해 이용된 엠플리콘의 클로날 집단을 생성하기 위해 이용될 수 있다.
또 다른 유용한 시퀀싱 기술은 나노포어 시퀀싱이다 (예를 들어, Deamer et al. Trends Biotechnol. 18, 147-151 (2000); Deamer et al. Acc. Chem. Res. 35:817-825 (2002); Li et al. Nat. Mater. 2:611-615 (2003) 참조, 이의 설명은 본원에 참조로서 포함됨). 일부 나노포어 구체예에서, 표적 핵산 또는 표적 핵산으로부터 제거된 개별 뉴클레오타이드는 나노포어를 통과한다. 핵산 또는 뉴클레오타이드가 나노포어를 통과함에 따라, 포어의 전기 전도도에서의 변동을 측정함에 의해 각각의 뉴클레오타이드 유형이 식별될 수 있다 (U.S. Patent No. 7,001,792; Soni et al. Clin. Chem. 53, 1996-2001 (2007); Healy, Nanomed. 2, 459-481 (2007); Cockroft et al. J. Am. Chem. Soc. 130, 818-820 (2008), 이의 설명은 본원에 참조로서 포함됨).
본 발명에 따른 검출에 적용될 수 있는 어레이-기반 발현 및 유전형 분석의 예시적인 방법은 US 특허 번호 7,582,420; 6,890,741; 6,913,884 또는 6,355,431 또는 US 특허 공개 2005/0053980 Al; 2009/0186349 Al 또는 US 2005/0181440 Al에 기재되어 있고, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
전방향 및 후방향 증폭 올리고뉴클레오타이드 둘 모두가 고체 표면 상에 공유적으로 고정화된 고형-상 증폭 반응의 생성물은 소위 상기 기재된 브릿지 구조물이다. 시퀀싱과 같은 핵산 조회 절차에 더욱 적합한 주형을 제공하기 위해, 예를 들어, 브릿지 구조의 고정화된 가닥들 중 하나의 실질적으로 모두 또는 적어도 일부를 제거하거나 전위시켜 적어도 부분적으로 단일 가닥인 주형을 생성하는 것이 유용할 수 있다. 따라서 단일 가닥인 주형의 일부는 시퀀싱 프라이머에 대한 하이브리드화에 이용될 수 있을 것이다. 브릿지 이중 가닥 핵산 구조에서 고정화된 한 가닥의 모두 또는 일부를 제거하는 공정은 본원에서 선형화로서 언급될 수 있고, 내용이 전문으로서 본원에 참조로서 포함되는 WO07010251 및 US20090118128에 추가로 상세하게 기재되어 있다.
브릿지 주형 구조는 제한 엔도누클레아제에 의한 한 가닥 또는 양 가닥의 절단에 의해 또는 니킹(nicking) 엔도누클레아제에 의한 한 가닥의 절단에 의해 선형화될 수 있다. 특히 화학적 절단 (예를 들어, 퍼아이오데이트에 의한 디올 결합의 절단), 엔도누클레아제(예를 들어 NEB, Ipswich, MA, USA에 의해 공급되는 USER, 파트 넘버 M5505S)로의 절단 또는 열 또는 알칼리에 노출에 의한 어베이직(abasic) 부위의 절단, 다른 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함하는 증폭 생성물에 혼입된 리보뉴클레오타이드의 절단, 광화학적 절단 또는 펩티드 링커의 절단을 포함하는 다른 절단 방법이 제한 효소 또는 니킹 효소의 대안으로서 이용될 수 있다.
절단 단계 후에, 절단에 사용된 방법과 무관하게, 절단 반응의 생성물은 고형 지지체에 부착되지 않은 절단된 가닥(들)의 부분(들)을 제거하기 위해 변성 조건으로 처리될 수 있다. 적합한 변성 조건, 예를 들어 소듐 하이드록사이드 용액, 포름아미드 용액 또는 열은 표준 분자 생물학 프로토콜 (Sambrook et al., supra; Ausubel et al. supra)을 참조하여 숙련된 독자에게 자명할 것이다. 변성은 부분적으로 또는 실질적으로 단일 가닥인 시퀀싱 주형을 생성한다. 그 후 시퀀싱 반응은 주형의 단일 가닥 부분에 대한 시퀀싱 프라이머의 하이브리드화에 의해 개시될 수 있다.
다양한 고형 지지체가 본 발명의 방법에서의 사용을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 고형 지지체는 정렬된 패턴의 포획 프라이머의 고정화에 적합한 패턴화 표면을 포함한다. "패턴화 표면"은 고형 지지체의 노출된 층에서의 또는 노출된 층 상의 상이한 배열 부위를 언급한다. 예를 들어, 하나 이상의 부위는 하나 이상의 포획 프라이머가 존재하는 특징부일 수 있다. 특징부는 포획 프라이머가 존재하지 않는 중간 부위에 의해 분리될 수 있다. 일부 구체예에서, 패턴은 행과 열로 존재하는 x-y 포맷의 특징부일 수 있다. 일부 구체예에서, 패턴은 특징부 및/또는 중간 부위의 반복적인 배열일 수 있다. 일부 구체예에서, 패턴은 특징부 및/또는 중간 부위의 랜덤 배열일 수 있다. 일부 구체예에서, 포획 프라이머는 고형 지지체 상에 임의로 분포된다. 일부 구체예에서, 포획 프라이머는 패턴화 표면 상에 분포된다. 본원에 개시된 방법 및 조성물에 이용될 수 있는 예시적인 패턴화 표면은 US 일련 번호 13/661,524 또는 US 특허 출원 공개 공보 2012/0316086 Al에 기재되어 있고, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구체예에서, 고형 지지체는 표면에 웰 또는 함몰부의 어레이를 포함한다. 이는 비제한적으로 포토리소그래피(photolithography), 스탬핑 기술(stamping techniques), 몰딩 기술(molding techniques) 및 마이크로에칭 기술(microetching techniques)을 포함하는 다양한 기술을 이용하여 당 분야에 일반적으로 공지된 대로 제작될 수 있다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 이용된 기술은 어레이 기판의 조성 및 형태에 의존적일 것이다.
고형 지지체의 조성 및 기하학은 이의 용도에 따라 다양할 수 있다. 일부 구체예에서, 고형 지지체는 슬라이드, 칩, 마이크로칩 및/또는 어레이와 같은 평면 구조이다. 이와 같이, 기판의 표면은 평면 층의 형태일 수 있다. 일부 구체예에서, 고형 지지체는 플로우 셀의 하나 이상의 표면을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "플로우 셀"은 하나 이상의 유체 시약이 가로질러 흐를 수 있는 고형 표면을 포함하는 챔버를 의미한다. 본 발명의 방법에서 용이하게 이용될 수 있는 플로우 셀 및 관련 유체 시스템 및 검출 플랫폼의 예는, 예를 들어, 문헌[Bentley et al, Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; US 7,057,026; WO 91/06678; WO 07/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; US 7,405,281, 및 US 2008/0108082]에 기재되어 있고, 이들 각각은 본원에 참조로서 포함된다.
일부 구체예에서, 고형 지지체 또는 이의 표면은 튜브 또는 용기의 내면 또는 외면과 같이, 평면이 아니다. 일부 구체예에서, 고형 지지체는 미소구체 또는 비드를 포함한다. 본원에서 "미소구체" 또는 "비드" 또는 "입자" 또는 문법적 등가물은 작은 개별 입자를 의미한다. 적합한 비드 조성물은 플라스틱, 세라믹, 유리, 폴리스티렌, 메틸스티렌, 아크릴산 폴리머, 상자성 물질, 토리아 졸(thoria sol), 카본 그라파이트, 이산화티탄, 라텍스 또는 가교된 덱스트란, 예컨대 세파로스, 셀룰로스, 나일론, 가교된 마이셀 및 테플론, 뿐만 아니라 고형 지지체에 대해 본원에 개요된 임의의 다른 물질을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니며, 이들 모두가 이용될 수 있다. Bangs Laboratories, Fishers Ind.로부터의 "미소구체 검출 가이드"가 도움이 되는 가이드이다. 특정 구체예에서, 미소구체는 자기 미소구체 또는 비드이다.
비드가 구체일 필요는 없으며; 불규칙한 입자가 이용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 비드는 다공성일 수 있다. 비드 크기는 나노미터, 즉 100 nm 내지 밀리미터, 즉 1 mm의 범위이고, 약 0.2 마이크론 내지 약 200 마이크론의 비드가 바람직하고, 약 0.5 내지 약 5 마이크론의 비드가 특히 바람직하지만, 일부 구체예에서 더 작거나 더 큰 비드가 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 특정 구체예에서 플로우 셀에 고정화된 하나 이상의 복수의 포획 프라이머를 지닌 플로우 셀을 제공한다. 하나의 복수는 표적 특이적 포획 프라이머일 수 있다. 표적 특이적 포획 프라이머는 보편적 프라이머 부위를 포함할 수 있다. 또 다른 복수는 보편적 포획 프라이머일 수 있다. 상기 예시적 복수의 포획 프라이머 중 하나 또는 둘 모두는 플로우 셀에 고정화될 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 복수의 엠플리콘 클러스터의 제조를 위한 플로우 셀에 관한 것이고, 여기서 플로우 셀은 코팅된 하나 이상의 복수의 고정화된 포획 프라이머를 함유한다. 따라서, 본원에 기재된 고형 지지체는 플로우 셀 내에서 또는 플로우 셀의 일부로서 발생할 수 있고 본원에 개시된 방법은 플로우 셀에서 수행될 수 있다. 하나 이상의 복수의 포획 프라이머는 각각의 작은 위치에 상이한 서열을 포함하는 별개의 위치에서라기보다 플로우 셀 표면의 전체에 걸쳐 코팅될 수 있다. 플로우 셀은 1 cm2 또는 그 초과의 크기를 지닐 수 있으므로 하나 이상의 복수의 포획 프라이머 각각에 대해 총 1 cm2 또는 그 초과는 다중 복사체의 포획 프라이머의 코팅을 포함한다. 플로우 셀은 올리고뉴클레오타이드가 단일 평면 표면 상의 어레이라기보다, 각각의 모든 표면; 플로우 셀 챔버의 상부, 하부, 벽 및 단부에 부착된다는 사실로 인해, 예를 들어 스폿팅된 어레이 또는 포토리소그래피에 의해 합성된 어레이로부터 구별될 수 있다. 그러나, 요망되는 경우 본원에 개시된 방법에 이용된 플로우 셀은 올리고뉴클레오타이드가 상기 언급된 표면 중 하나 또는 서브세트에만 부착되거나 심지어 이러한 표면 내 서브세트 부위에만 부착되도록 올리고뉴클레오타이드에 대해 상이한 반응성을 지닌 표면을 가질 수 있다.
플로우 셀은 특정 구체예에서 상이한 서열 조성의 3개의 복수의 포획 프라이머 종으로 코팅될 수 있는데, 즉 2개의 포획 프라이머 종 및 표적 특이적 포획 프라이머가 도 1, 패널 3에 예시되어 있다. 추가로, 표적 특이적 포획 프라이머는 도 1, 패널 3에 예시된 2개의 복수의 포획 프라이머 중 하나와 동일한 서열을 갖는 보편적 프라이머 부위를 포함할 수 있다. 플로우 셀은 특정 구체예에서 3개 이하의 복수의 포획 프라이머 종으로 코팅될 수 있다. 그러나, 다른 특정 구체예에서, 플로우 셀은 보편적 포획 프라이머, 표적 특이적 포획 프라이머 또는 포획 프라이머의 다른 종이든 간에 하나 이상의 다른 복수의 포획 프라이머 종을 추가로 포함할 수 있다. 표적 특이적 포획 프라이머는 보편적 포획 프라이머보다 낮은 농도, 예를 들어 적어도 100, 1000 또는 100,000배 낮은 상대 농도로 존재할 수 있다. 2개의 복수의 보편적 포획 프라이머는, 예를 들어 2배 미만만큼 달라지는 서로 유사한 비율로 존재할 수 있다. 본원에서 제공된 교시 및 지침을 고려하여, 당분야 숙련자는 요망되는 결과를 달성하기 위해 플로우 셀 상에 고정되는 보편적 포획 프라이머 및 표적 특이적 포획 프라이머가 어떤 구성인 지를 알게 될 것이다.
본 발명은 또한 핵산 서열 변이체의 검출 민감도를 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 샘플을 유전자 특이적 전방향 및 후방향 프라이머와 하이브리드화시키기에 충분한 조건하에 접촉시키는 단계로서, 각 종의 유전자 특이적 전방향 프라이머가 고유의 서열 지표 및 어댑터를 포함하는, 단계; (b) 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 증폭시켜 복수의 엠플리콘을 생성하는 단계; (c) 고형 지지체 상에 고정화된 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 복수의 엠플리콘과 하이브리드화시키기에 충분한 조건하에 직접 접촉시켜 제 1의 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성하는 단계로서, 고형 지지체가 복수의 보편적 포획 프라이머를 추가로 포함하는, 단계; (d) 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 연장시켜 표적 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 복수의 고정화된 연장 생성물을 생성하는 단계; (e) 복수의 보편적 포획 프라이머를 복수의 고정화된 연장 생성물에 어닐링시키는 단계; (f) 복수의 고정화된 연장 생성물을 PCR에 의해 증폭시켜 제2 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성하는 단계로서, 제 2의 복수의 고정화된 엠플리콘이 85% 또는 그 초과의 균일성을 포함하는, 단계; (g) 제 2의 복수의 고정화된 엠플리콘을 시퀀싱하는 단계, 및 (h) 표적 폴리뉴클레오타이드 종에 대해 변이체 위치에서 3개 이상의 뉴클레오타이드 서열을 비교하여 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드에 대한 무작위적 서열 에러를 제거하는 단계로서, 여기서 표적 폴리뉴클레오타이드 종이 고유의 서열 지표에 의해 식별되어 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드에서 진정한 뉴클레오타이드 서열 변이를 결정하는 단계를 포함한다.
앞서 기재된 방법은 또한 핵산 서열 변이체의 검출 민감도를 증가시키기 위해 이용될 수 있다. 핵산 증폭 및 시퀀싱에서, 이러한 절차에서 중합효소 비신뢰도(infidelity)로부터 초래된 시퀀싱 에러를, 예를 들어 진짜 서열로부터 구별하는 것이 중요하다. 이러한 구별은 샘플에서 자연 발생하는 변이 서열을 식별하기 위해 특히 중요하다. 무작위적 뉴클레오타이드 서열 에러에 비해 진정한 서열 변이를 구별하는 것은 고유의 서열 바코드 또는 지표를 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드 내 각각의 폴리뉴클레오타이드 종과 관련시킴에 의해 확립될 수 있다.
도 5는 각각의 표적 폴리뉴클레오타이드 종에 대한 고유 지표의 부착을 예시한다. 도 5는 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드 (그 안에서 "주형"으로서 식별됨)를 도시한다. 예시의 목적으로, 복수는 3개의 구성원으로 구성되며 한 구성원은 진정한 뉴클레오타이드 변이체이다 (밝은 별). 고유 바코드가 각각의 구성원에 첨가되고, 복수는 증폭되어 각각이 고유하게 바코드화된 원래 구성원으로부터 유래되는 3개의 복수의 엠플리콘을 생성한다. 3개의 복수의 기원은 바코드를 시퀀싱하고 식별함에 의해 확인될 수 있다. 각각의 복수 내 구성원들의 비교는 각각 또는 대부분의 구성원에서 발생하는 변이체를 나타낸다. 대조적으로, 하나의 복수의 엠플리콘은 엠플리콘 복수의 나머지 구성원에 비해 서열 차이를 지닌 구성원을 함유한다 (진한색 별). 이러한 복수 내 대부분의 구성원이 그 뉴클레오타이드 변화를 함유하지 않으므로 이의 혼입은 랜덤 에러에 의해 발생하였다.
상기 설계는 또한 복수의 상이한 표적 폴리뉴클레오타이드 내에서 진정한 변이체를 식별하는데 이용될 수 있다. 본원에 기재된 대로, 표적 폴리뉴클레오타이드 종은 동일한 서열을 갖는 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 구성원을 의미한다. 이러한 구체예에서, 각각의 표적 폴리뉴클레오타이드 종은 그 표적 폴리뉴클레오타이드 종을 다른 표적 폴리뉴클레오타이드 종으로부터 구별하는 (및 반대의 경우도 마찬가지임) 동일한 고유 지표에 의해 식별된다. 따라서, 동일한 서열을 갖는 표적 폴리뉴클레오타이드 (즉, 종 구성원)는 동일한 지표를 갖는다. 증폭 및 시퀀싱 후에 종 구성원은 동일한 지표를 지님에 의해 식별될 수 있고 무작위적 어레에 비해 진정한 변이의 발생은 복수의 종 구성원 내 다른 구성원에 대한 서열 비교에 기반하여 결정될 수 있다.
따라서, 앞서 기재된 방법은 표적 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키기 위해 이용된 유전자 특이적 프라이머 내에 지표 서열을 추가로 포함할 수 있다. 따라서 각각의 유전자 특이적 프라이머는 이의 상응하는 표적 폴리뉴클레오타이드를 식별하는 고유의 지표를 함유할 것이다. 따라서, 복수의 상이한 표적 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 복수의 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 복수의 상이한 표적 폴리뉴클레오타이드를 증폭시키고 고유의 식별 지표를 각각의 생성된 엠플리콘 종에 그렇게 생성된 복수의 엠플리콘 내에 혼입시킬 수 있다.
지표는 다른 지표로부터 구별될 수 있는 독특한 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 이것은 또한 표적 폴리뉴클레오타이드 내의 서열 또는 위치에 의해 복수의 폴리뉴클레오타이드 내에서 다른 뉴클레오타이드 서열로부터 구별될 수 있다. 뉴클레오타이드 지표는 랜덤 또는 특수하게 설계된 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 지표는, 이것이 분석되거나 조회되는 복수의 폴리뉴클레오타이드 내에서 및/또는 군집의 복수의 지표 내에서 독특한 뉴클레오타이드 서열이 되기에 충분한 길이를 지니는 한, 임의의 요망되는 서열 길이를 지닐 수 있다. 일부 구체예에서, 지표는 약 8-30개 범위의 뉴클레오타이드인 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 내의 부위이다. 지표는, 예를 들어, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30개 또는 그보다 긴 뉴클레오타이드일 수 있다. 예를 들어, 지표는 35, 40, 45 또는 50개 또는 그보다 긴 뉴클레오타이드일 수 있다.
도 7은 지표를 표적 폴리뉴클레오타이드에 혼입시키기 위한 한 예시적인 유전자 특이적 프라이머 설계를 예시한다. 이러한 구체예에서, 지표는 유전자 특이적 전방향 프라이머 (GSF) 상의 솔리드 그레이 부위에 상응한다. 지표를 함유하는, 유전자 특이적 전방향, 및 그 안에 예시된 유전자 특이적 후방향 프라이머에 상응하는 프라이머 쌍에 의한 증폭은 지표를 엠플리콘에 혼입시킨다. 도 7은 비대칭 증폭 및 후속하는 브릿지 증폭 및 GSF에 의해 역시 도입된 프라이머 결합 부위에 특이적인 시퀀싱 프라이머를 이용한 시퀀싱에 의한 계속되는 증폭 후 지표 혼입을 추가로 예시한다.
도 8은 지표를 표적 폴리뉴클레오타이드에 혼입시키기 위한 또 다른 예시적인 유전자 특이적 프라이머 설계를 예시한다. 이러한 구체예에서, 지표는 두 번째 증폭 단계에서 혼입된다. 예를 들어, 초기 증폭은 유전자 특이적 전방향 (GSF) 및 후방향 (GSR) 프라이머의 쌍에 의해 수행된다. 프라이머 중 하나 또는 둘 모두는 후속 라운드의 증폭을 위한 프라이머 결합 부위와 같은 보편적 서열 부위를 함유할 수 있다. 이러한 구체예에서, 지표는 또한 솔리드 그레이 부위에 상응하며, 비록 이것이 후속 라운드 프라이머 중 어느 쪽에도 포함될 수 있으나, GSF에 의해 혼입된 프라이머 결합 부위에 결합하는 프라이머 (SBS3 시퀀싱 프라이머)에 있는 것으로 예시된다. 지표를 함유하는 프라이머 및 그 안에 예시된 후방향 프라이머에 상응하는 프라이머 쌍에 의한 증폭은 지표를 엠플리콘에 혼입시킨다. 도 8은 비대칭 증폭 및 후속하는 브릿지 증폭 및 후속 라운드의 증폭에 시용된 프라이머에 의해 또한 도입된 프라이머 결합 부위에 특이적인 시퀀싱 프라이머를 이용한 시퀀싱에 의한 계속되는 증폭 후 지표 혼입을 추가로 예시한다. 이러한 프라이머는 또한 제2 프라이머 결합 부위를 함유할 수 있어서 이것은 표적 폴리뉴클레오타이드와 나란히 시퀀싱되기 위한 지표의 업스트림이 된다.
본원에서 제공된 교시 및 지침을 고려하여, 당분야 숙련자는 본원에 기재된 모든 방법이 또한 핵산 서열 변이체의 검출 민감도를 증가시키기 위해 표적 특이적 포획 프라이머에 혼입된 고유 지표에 의해 수행될 수 있음을 알 것이다.
따라서, 본 발명의 방법은 핵산 서열 변이의 검출 민감도를 증가시키기 위한 방법을 제공하고, 여기서 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 10 ng 또는 그 미만의 투입 핵산을 포함한다. 상기 방법은 하이브리드화에 충분한 조건을 지닐 수 있어서 10분 또는 그 미만의 인큐베이션을 포함한다. 상기 방법은 변이체 뉴클레오타이드 위치에 대해 0.3% 또는 그 미만의 불일치를 검출하는 것을 추가로 포함한다.
핵산 서열 변이체의 검출 민감도를 증가시키기 위한 방법이 또한 제공되며, 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 지니는 핵산 샘플의 접촉 단계는 제 1 유전자 특이적 전방향 및 후방향 프라이머에 의한 제 1회의 PCR 증폭 및 제 1 유전자 특이적 전방향 프라이머의 일부에 상보적인 제 2 전방향 프라이머에 의한 제 2회의 PCR 증폭을 포함하고, 제 2 전방향 프라이머는 고유의 서열 지표 및 어댑터를 포함한다. 어댑터는 복수의 보편적 포획 프라이머에 상보적일 수 있다. 보편적 포획 프라이머는 고형 지지체에 고정화될 수 있다.
복수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 증폭이 비대칭적 PCR을 포함하는, 핵산 서열 변이의 검출 민감도를 증가시키기 위한 방법이 추가로 제공된다. 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 증폭은 또한 다중 증폭을 포함할 수 있다. 다중 증폭은 180 또는 그 초과의 다중성을 포함한다.
고형 지지체가 제2 복수의 보편적 포획 프라이머를 추가로 포함하는, 핵산 서열 변이체의 검출 민감도를 증가시키기 위한 방법이 또한 추가로 제공된다. 추가로, 복수의 표적 특이적 포획 프라이머는 보편적 포획 프라이머 부위를 추가로 포함할 수 있다. 보편적 포획 프라이머 부위는 제 2의 복수의 보편적 포획 프라이머에 상응하거나 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 지닐 수 있다.
복수의 표적 특이적 포획 프라이머가 200개 또는 그 초과의 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산 서열 변이체의 검출 민감도를 증가시키기 위한 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 200개 또는 그 초과의 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드 내의 서열 변이체 검출을 포함한다. 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드는 복수의 유전체 핵산일 수 있다.
고정화된 연장 생성물의 증폭이 브릿지 증폭을 포함하는, 핵산 서열 변이체의 검출 민감도를 증가시키기 위한 방법이 추가로 제공된다. 상기 방법은 고형 지지체가 플로우 셀일 수 있는 고형 지지체를 포함한다.
증폭된 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드로부터 생성된 복수의 엠플리콘의 시퀀싱이 50회 시퀀싱 주기를 포함하는, 핵산 서열 변이체의 검출 민감도를 증가시키기 위한 방법이 추가로 제공된다. 상기 방법은 3시간 또는 그 미만의 시작부터 종료까지의 시간을 포함한다.
본 발명의 다양한 구체예의 활성에 실질적인 영향을 미치지 않는 변형이 또한 본원에서 제공된 정의 내에 포함됨이 이해되어야 한다. 따라서, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며 제한하려는 것이 아니다.
실시예 I
엠플리콘 제조 및 시퀀싱 절차
본 실시예는 엠플리콘 제조 및 표적 폴리뉴클레오타이드 시퀀싱에 대한 통합된 절차를 기재한다.
간단히 말해, 샘플 유전체 DNA를 50 ㎕의 KAPA 2X 2G 다중 PCR 완충제 (Kapa Biosystems, Wilmington, MA), 0.5 μΜ의 전방향 프라이머 믹스 (F), 0.02 μΜ의 후방향 프라이머 믹스 (R), 20 유닛의 KAPA 2G 고온 개시 효소 (완충제(Kapa Biosystems, Wilmington, MA) 및 물을 함유하는 100 ㎕의 총 부피의 PCR 반응 혼합물에 첨가시켰다. 다음 PCR 프로그램을 이용하여 증폭을 수행하였다: 95℃에서 1분 (min) 동안 인큐베이션 이후 30회 주기의 다음 인큐베이션: (1) 97℃에서 5초 (sec); (2) 58℃에서 45초; (3) 72℃에서 1분, 및 (4) 4℃에서 유지. 하기 기재된 대로 플로우 셀로 고정화 및 클러스터링 후에 PCR 생성물을 후속하여 시퀀싱하였다.
포획 프로브 연장, 상기 PCR 생성물의 표적화된 클러스터링 및 시퀀싱을 MiSeq benchtop 시퀀서 (Illumina, San Diego, CA)를 이용하여 수행하였다.
이러한 절차를 위해, MiSeq 키트 카트리지 (Illumina, San Diego, CA)를 물에서 약 30분 동안 해동시킨 후 자동화 MiSeq 진행 및 열 블록을 95℃로 켰다. 추가로, HFE 튜브 (600 ㎕ (Illumina, San Diego, CA))를 얼음 위에서 해동시키고 0.1N NaOH 용액 1 ml를 제조하였다. PCR 생성물 (100 ㎕)을 에펜도르프 튜브에서 400 ㎕의 HT1 완충제 (Illumina, San Diego, CA)로 희석시켰다. 유사하게, 포획 프로브 주형을 별도의 튜브에서 600 ㎕의 HT1 완충제에서 제조하였다. 탈이온수를 열 블록 웰에 첨가하고, 상기 2개의 튜브를 느리게 진탕시키며 (약 100 rpm) 5분 동안 웰에 삽입하였다. 5분의 열 블록 인큐베이션 후 튜브를 적어도 2분 동안 얼음 위에 두었다. 해동된 MiSeq 카트리지를 여러 번 뒤집어 시약을 분산시키고 바닥에 재침전시켰다. 시약을 다음과 같이 MiSeq 카트리지에 로딩시켰다: PCR 생성물을 카트리지의 #17 튜브로 옮겼다; 포획 프로브를 #18 튜브로 옮기고, HFE를 #19 튜브에 로딩시키고 0.1N NaOH를 #20 튜브에 첨가하였다. MiSeq 카트리지, MiSeq FC (Illumina, San Diego, CA) 및 MiSeq에 대한 PR2 (Illumina, San Diego, CA) 보틀을 MiSeq 시퀀서 상에 설정하고 시퀀싱 진행 공정을 제조업체의 권장 사항에 따라 시작하였다. 제조된 샘플시트를 로딩시키고 (Javelin v.51 chemistry), 제조업체의 권장 사항에 따라 유동 검사 단계 후 연장, 표적화된 클러스터링 및 시퀀싱 진행을 개시하였다.
포획 프로브 연장, 상기 PCR 생성물의 표적화된 클러스터링 및 시퀀싱을 또한 유전체 분석기 (Illumina, San Diego, CA)를 이용하여 수행하였다.
이러한 절차를 위해, HT1 완충제를 8-튜브 스트립에서 PCR 생성물과 혼합시킴에 의해 클러스터링 및 시퀀싱 주형을 제조하였다 (각각 19 내지 10 ㎕의 HT1 완충제와 1 내지 10 ㎕의 PCR 생성물). 포획 프로브 (3-500 pM)를 또 다른 8-튜브 스트립에서 제조하였다. 해동된 cBOT 페어드 엔드 클러스터 플레이트 v3 (Illumina, San Diego, CA)를 cBOT 자동화 클러스터링 시스템 위에 놓고 진행 커맨드 (진행 <포획_프로브_연장_Amp_LBH_v#> 레시피)를 이용하여 포획 프로브 연장 및 증폭의 절차를 개시하였다. 표준 유전체 분석기 (GA) 시퀀싱 시약의 세트 (Illumina, San Diego, CA)를 해동시키고 (IMX, LFN, CLM, SMX) LFN의 전체 튜브 내용물을 IMX 튜브에 첨가시킨 후, HDP36을 동일한 IMX 튜브에 첨가시켰다. 내용물을 잘 혼합시켰다. PR1, PR2, PR3 (Illumina, San Diego, CA)을 포함하는 모든 시약 및 완충제를 이들의 지정된 위치에서 GA 상에 두고, 이어서 모든 라인을 GA 커맨드 <Prime_v#> 레시피를 이용하여 시약으로 프라이밍시켰다. 플로우 셀 및 프리즘을 각각 에탄올 와이프 및 렌즈 페이퍼로 세정하고, 프리즘을 기계에 재삽입시켰다. 빔 덤프(beam dump)를 낮추었다. 플로우 셀을 프리즘의 상부에 적절히 정위시키고 매니폴드를 서서히 낮추었다. 100 ㎕의 용액 5 (PR2)를 60 ㎕/분의 흡인 속도 및 2000 ㎕/분의 분배 속도로 수동으로 펌핑시킴에 의해 플로우 셀로의 시약의 적당한 흐름이 확인되었다. 이멀젼 오일 (135 ㎕)을 프리즘과 플로우 셀 사이에 적용시켰다. 기계 도어를 닫고, GA 커맨드 진행 <GA2_40cyle_10rows_SR_v8.3> 레시피로 시퀀싱 진행을 시작하였다.
실시예 II
통합된 제조 및 시퀀싱 절차에서 비롯된 서열 품질
본 실시예는 다양한 농도 및 유형의 투입 핵산을 이용한 서열 균일성 및 시퀀싱 깊이의 비교를 기재한다.
표적 폴리뉴클레오타이드의 집단으로부터 엠플리콘을 제조하고 멀티플렉스 시퀀싱에 의해 이들의 서열을 결정하기 위해 실시예 1에 기재된 절차를 이용하였다. 1 ng 및 10 ng의 투입 유전체 DNA를 이용한 결과가 도 2에 도시된다.
MiSeqReporter로부터의 각각의 엠플리콘의 클러스터에 기반하여 균일성을 계산하였다. 평균 0.1, 평균 0.2, 평균 0.3, 평균 0.5 초과의 클러스터를 지닌 엠플리콘의 수를 계수하였다. 예를 들어, 평균 0.2에서, 80%를 초과하는 엠플리콘이 평균 0.2 초과의 클러스터의 수를 지녔다.
시퀀싱 깊이의 경우, 10/100/250/500 초과의 클러스터를 지니는 엠플리콘의 수를 계수하였다. 예를 들어, 80%를 초과하는 엠플리콘이 적어도 500x의 적용범위를 지녔다. 균일성 및 적용범위는 시퀀싱 품질을 측정하기 위해 사람들이 사용하는 전형적인 메트릭스이다. 도 2에 도시된 결과는 1 ng 내지 lOng의 유전체 DNA를 이용하여 높은 시퀀싱 품질이 달성될 수 있음을 입증하였다.
포르말린-고정된 파라핀 임베딩된 조직에서 수득된 4개의 상이한 양의 DNA를 이용한 결과가 도 3에 도시된다. 4개의 상이한 농도는 도면에 도시된 대로 1 ng 내지 50 ng의 범위였다.
도 3에 도시된 균일성 및 시퀀싱 깊이 결과는 포르말린-고정된 파라핀 임베딩된 조직에서 수득된 광범한 범위의 DNA에 대해 높은 시퀀싱 품질이 달성될 수 있음을 추가로 입증하였다. 명시된 품질을 갖는 클러스터의 수를 나타내는 클러스터 PF (통과 필터) 밀도는 매우 우수하였다. 특이성은 얼마나 많은 판독이 정확한 지의 척도이다. 본 연구에서 90% 초과의 특이성이 달성되었다.
정상인 뿐만 아니라 암 환자의 혈장에서 추출된 무세포 DNA (cfDNA)를 이용하여 추가 연구를 수행하였고 유사한 결과가 수득되었다. 1 ml의 혈장에서 분리된 10 ng의 cfDNA를 이용한 결과가 도 4에 도시된다.
도 2 및 3과 마찬가지로, MiSeqReporter로부터의 각각의 엠플리콘의 클러스터에 기반하여 유사하게 균일성을 계산하였다. 평균 0.1, 평균 0.2, 평균 0.3, 평균 0.5 초과의 클러스터를 지닌 엠플리콘의 수를 계수하였다. 평균 0.2에서, 80%를 초과하는 엠플리콘이 평균 0.2 초과의 클러스터의 수를 지녔다.
유사하게, 시퀀싱 깊이의 경우, 10/100/250/500 초과의 클러스터를 지니는 엠플리콘의 수를 계수하였다. 모든 엠플리콘이 적어도 500x의 적용범위를 지녔다. 추가로, 클러스터 PF 밀도 및 표 삽입에 도시된 다른 파라미터도 매우 우수하였다. 상기 결과는 93%의 특이성이 달성되었음을 나타내는데, 이는 클러스터의 93%가 올바른 표적에 정렬됨을 의미한다. 이러한 결과는 높은 시퀀싱 품질이 혈장에서 분리된 세포 비함유 DNA로부터 직접 수득될 수 있음을 입증한다.
실시예 III
통합된 제조 및 시퀀싱 절차에서 비롯된 검출 민감도
본 실시예는 표적 폴리뉴클레오타이드의 집단 내에서 단일 돌연변이의 검출 정확성을 나타낸다.
Horizon Diagnostics로부터 수득된 201 멀티플렉스 포맷 (201 plex)의 1.65ng의 DNA를 이용하여 본원에 기재된 방법에 따라서 라이브러리를 제조하고 시퀀싱하였다. 하기 표에 열거된 돌연변이를 목록에 표시된 빈도로 확인하였다. 이러한 DNA는 디지털 PCR를 이용하여 Horizon Diagnostics에 의해 특정 돌연변이 빈도를 갖는 것이 입증되었다. 1.65ng는 약 500개 홑배수 유전체 복사체이다. 1% 비율에서, 돌연변이체의 약 5개 복사체가 존재한다. 따라서, 본 방법은 다양한 서열의 집단에서 복사체의 5개 돌연변이체를 검출하기에 충분히 민감하다.
여러 돌연변이체의 동시 검출*
Figure pct00001
*돌연변이를 지닌 참조 유전체 DNA는 Horizon Diagnostics로부터 수득된다.
**두 독립적인 실험으로부터의 결과.
실시예 IV
에러로부터 진정한 서열 변이체를 결정하기 위한 고유 분자 지표
본 실시예는 표적 폴리뉴클레오타이드 서열의 진짜 변이체에서 시퀀싱 에러를 구별하기 위한 고유 뉴클레오타이드 지표의 이용을 기재한다.
고유 분자 바코드 (UMB) 또는 무작위적 뉴클레오타이드 (10-15N)의 지표를 PCR 전방향 프라이머에서 시퀀싱 프라이머 부위와 유전자 특이적 서열 부위 사이에 삽입시켰다. UMB가 삽입된 PCR 프라이머에 의해 2-4회 주기의 PCR을 수행함에 의해 UMB를 주형 DNA에 도입시켰다. 2-4회 주기 후에, 엑소누클레아제 1 처리 및 SPRI 비드 클린 업을 이용하여 남아 있는 UMB 프라이머를 제거하였다. 추가 30-35회 주기의 PCR을 보편적 어댑터 서열로 구성된 프라이머를 이용하여 수행하였다. 동일한 UMB를 지닌 판독 서열의 비교에 의해 데이터 분석을 수행하였다. 70% 초과의 UMB의 서열에 의해 베이스 콜(base call)을 결정하였다. 2개 초과의 복사체를 지닌 UMB만이 데이터 분석에 고려되었다. 하기 제시된 대로, 데이터 분석에서 UMB로부터의 정보를 고려하지 않고, PCR에 의해 제기된 노이즈 및 시퀀싱 에러는 0.24%만큼 높을 수 있다. UMB로부터의 정보가 데이터 분석에서 고려되면, 모든 노이즈는 제거될 수 있다. 그리고 관찰된 실제 돌연변이체의 빈도는 0.05%의 예상 빈도에 훨씬 더 가깝다.
노이즈로부터 신호를 구별하기 위한 UMB 이용
Figure pct00002
*야생형 (A)에서 PIK3CA H1045KR 돌연변이체 (G) 유전체 DNA로 스파이킹함에 의해 수득된 주형 DNA. 0.05% 변이체 ~10 분자 (G) 빈도가 예상되었다.
이와 관련하여, 도 6은 고유 분자 바코드 보정을 사용하고 (우측) 사용하지 않은 (좌측) 뉴클레오타이드 미스매치율의 비교를 도시한다. 간단히 말해, 데이터 분석에서 UMB로부터의 정보를 고려하고 고려하지 않은, 예상된 돌연변이 부위 주변의 20개 위치에 대한 미스매치율이 도시된다. 도 6에 도시된 대로, UMB가 없는 경우 결과는 현저한 비특이적 노이즈를 포함하였다. 노이즈는 0.15%만큼 높을 수 있다. 데이터 분석에서 UMB로부터의 정보를 고려한 후, 모든 노이즈가 제거되었다.
본 출원을 통틀어 다양한 간행물이 괄호 안에 언급되었다. 임의의 GenBank 및 GI 넘버 간행물을 포함하는 이러한 간행물의 설명 전문은 본 발명이 속하는 기술의 상태를 보다 충분히 설명하기 위해 본 출원에 참조로서 포함된다.
비록 본 발명이 기재된 구체예를 참조로 하여 기술되었으나, 당분야 숙련자는 상기 상술된 특수한 실시예 및 연구가 단지 본 발명의 예시임을 용이하게 이해할 것이다. 다양한 변형이 본 발명의 사상을 벗어나지 않으며 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 본 발명은 하기 청구범위에 의해서만 제한된다.

Claims (60)

  1. 엠플리콘 제조 방법으로서,
    (a) 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 샘플을 적어도 하나의 프라이머와 하이브리드화시키기에 충분한 조건하에 접촉시키는 단계로서, 상기 적어도 하나의 프라이머가 어댑터를 함유하는 단계;
    (b) 상기 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시켜 복수의 엠플리콘을 생성시키는 단계;
    (c) 고형 지지체 상에 고정화된 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 상기 복수의 엠플리콘과 하이브리드화시키기에 충분한 조건하에 직접 접촉시켜 제 1의 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성시키는 단계로서, 상기 고형 지지체가 복수의 보편적 포획 프라이머를 추가로 포함하는 단계;
    (d) 상기 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 연장시켜 상기 표적 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 복수의 고정화된 연장 생성물을 생성시키는 단계;
    (e) 상기 복수의 보편적 포획 프라이머를 상기 복수의 상기 고정화된 연장 생성물에 어닐링시키는 단계, 및
    (f) PCR에 의해 상기 복수의 고정화된 연장 생성물을 증폭시켜 제 2의 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성시키는 단계로서, 고정화된 앰플리콘의 상기 군집이 85% 또는 그 초과의 균일성을 포함하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드가 10 ng 또는 그 미만의 투입 핵산을 포함하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 하이브리드화시키기에 충분한 상기 조건이 10분 또는 그 미만 동안의 인큐베이션을 포함하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 직접적인 접촉 단계 (c)가 실질적으로 정제되지 않은 제 1의 복수의 엠플리콘을 포함하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 제 1의 복수의 엠플리콘이 높은 비율의 세포 구성요소를 포함하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 어댑터가 상기 복수의 보편적 포획 프라이머에 상보적인 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 상기 증폭이 비대칭 PCR을 포함하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 적어도 하나의 프라이머가 2개의 프라이머를 포함하며, 상기 2개의 프라이머 중 적어도 하나가 상기 어댑터를 함유하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 상기 증폭이 다중(multiplex) 증폭을 포함하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 다중 증폭이 180 또는 그 초과의 다중성(multiplexicity)을 포함하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 고형 지지체가 제 2의 복수의 보편적 포획 프라이머를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 복수의 표적 특이적 포획 프라이머가 보편적 포획 프라이머 부위를 추가로 포함하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 보편적 포획 프라이머 부위가 상기 제 2의 복수의 보편적 포획 프라이머에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 복수의 표적 특이적 포획 프라이머가 200개 또는 그 초과의 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드가 200개 또는 그 초과의 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드가 복수의 유전체 핵산을 포함하는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 상기 고정화된 연장 생성물의 상기 증폭이 브릿지 증폭을 포함하는 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 상기 고형 지지체가 플로우 셀을 포함하는 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 상기 제 2의 복수의 고정화된 엠플리콘을 시퀀싱하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 시퀀싱이 50 주기를 포함하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 시작부터 종료까지의 시간(a start-to-finish time)이 3 시간 또는 그 미만을 포함하는 방법.
  22. 암 관련 유전자의 존재를 결정하는 방법으로서,
    (a) 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 샘플을 적어도 하나의 프라이머와 하이브리드화시키기에 충분한 조건하에서 접촉시키는 단계로서, 상기 적어도 하나의 프라이머가 어댑터를 함유하는 단계;
    (b) 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 상기 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 증폭시켜 복수의 엠플리콘을 생성시키는 단계;
    (c) 고형 지지체 상에 고정화된 하나 이상의 상이한 암에 특이적인 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 상기 복수의 엠플리콘과 하이브리드화시키에 충분한 조건하에 직접 접촉시켜 제 1의 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성시키는 단계로서, 상기 고형 지지체가 복수의 보편적 포획 프라이머를 추가로 포함하는 단계;
    (d) 상기 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 연장시켜 상기 표적 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 복수의 고정화된 연장 생성물을 생성시키는 단계;
    (e) 상기 복수의 보편적 포획 프라이머를 상기 복수의 상기 고정화된 연장 생성물에 어닐링시키는 단계;
    (f) PCR에 의해 상기 복수의 고정화된 연장 생성물을 증폭시켜 제 2의 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성시키는 단계로서, 고정화된 엠플리콘의 상기 군집이 85% 또는 그 초과의 균일성을 포함하는 단계, 및
    (g) 상기 제 2의 복수의 고정화된 연장 생성물을 시퀀싱하여 암 관련 유전자의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드가 10 ng 또는 그 미만의 투입 핵산을 포함하는 방법.
  24. 제 22항에 있어서, 상기 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드가 무세포 DNA (cfDNA)를 포함하는 방법.
  25. 제 22항에 있어서, 하이브리드화시키기에 충분한 상기 조건이 10 분 또는 그 미만 동안의 인큐베이션을 포함하는 방법.
  26. 제 22항에 있어서, 상기 직접 접촉시키는 단계 (c)가 실질적으로 정제되지 않은 제 1의 복수의 엠플리콘을 포함하는 방법.
  27. 제 22항에 있어서, 상기 어댑터가 상기 복수의 보편적 포획 프라이머에 상보적인 방법.
  28. 제 22항에 있어서, 상기 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 상기 증폭이 비대칭 PCR을 포함하는 방법.
  29. 제 22항에 있어서, 상기 적어도 하나의 프라이머가 2개의 프라이머를 포함하며 상기 2개의 프라이머 중 적어도 하나가 상기 어댑터를 함유하는 방법.
  30. 제 29항에 있어서, 상기 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 상기 증폭이 다중 증폭을 포함하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 상기 다중 증폭이 180 또는 그 초과의 다중성을 포함하는 방법.
  32. 제 22항에 있어서, 상기 고형 지지체가 제 2의 복수의 보편적 포획 프라이머를 추가로 포함하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 복수의 표적 특이적 포획 프라이머가 보편적 포획 프라이머 부위를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 상기 보편적 포획 프라이머 부위가 상기 제 2의 복수의 보편적 포획 프라이머에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 방법.
  35. 제 22항에 있어서, 상기 복수의 표적 특이적 포획 프라이머가 200개 또는 그 초과의 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
  36. 제 22항에 있어서, 상기 복수의 표적 특이적 포획 프라이머가 AKT1, CTNNB1, FLT3, KRAS, PTPN11, SRC, ALK, EGFR, GNAS, MLH1, RB1, STK11, ATM, ERBB2, HNF1A, MPL, RAD50, TP53, BRAF, ERBB4, IDH1, NRAS, RET, VHL, BRCA1, FBXW7, JAK3, PIK3CA, SMAD4, CDH1, FGFR2, KIT, PTEN, SMARCB1, ABL1, CSF1R, GNA11, JAK2, NOTCH1, SMO, APC, FGFR1, GNAQ, KDR, NPM1, CDKN2, FGFR3, HRAS, MET 및 PDGFRA로 구성된 유전자의 군으로부터 선택된 2개 또는 그 초과의 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
  37. 제 22항에 있어서, 상기 복수의 표적 특이적 포획 프라이머가 유전자 AKT1, CTNNB1, FLT3, KRAS, PTPN11, SRC, ALK, EGFR, GNAS, MLH1, RB1, STK11, ATM, ERBB2, HNF1A, MPL, RAD50, TP53, BRAF, ERBB4, IDH1, NRAS, RET, VHL, BRCA1, FBXW7, JAK3, PIK3CA, SMAD4, CDH1, FGFR2, KIT, PTEN, SMARCB1, ABL1, CSF1R, GNA11, JAK2, NOTCH1, SMO, APC, FGFR1, GNAQ, KDR, NPM1, CDKN2, FGFR3, HRAS, MET 및 PDGFRA 각각에 대한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
  38. 제 22항에 있어서, 상기 고정화된 연장 생성물의 상기 증폭이 브릿지 증폭을 포함하는 방법.
  39. 제 22항에 있어서, 상기 고형 지지체가 플로우 셀을 포함하는 방법.
  40. 제 22항에 있어서, 상기 시퀀싱이 50 주기를 포함하는 방법.
  41. 제 22항에 있어서, 시작부터 종료까지의 시간이 3 시간 또는 그 미만을 포함하는 방법.
  42. 핵산 서열 변이의 검출 민감도를 증가시키는 방법으로서,
    (a) 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 핵산 샘플을 유전자 특이적 전방향 및 역방향 프라이머와 하이브리드화시키기에 충분한 조건하에서 접촉시키는 단계로서, 각 종의 상기 유전자 특이적 전방향 프라이머는 고유의 서열 지표 및 어댑터를 포함하는 단계;
    (b) 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 상기 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드를 증폭시켜 복수의 엠플리콘을 생성시키는 단계;
    (c) 고형 지지체 상에 고정화된 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 상기 복수의 엠플리콘과 하이브리드화시키기에 충분한 조건하에서 직접 접촉시켜 제 1의 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성시키는 단계로서, 상기 고형 지지체가 복수의 보편적 포획 프라이머를 추가로 포함하는 단계;
    (d) 상기 복수의 표적 특이적 포획 프라이머를 연장시켜 상기 표적 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 복수의 고정화된 연장 생성물을 생성시키는 단계;
    (e) 상기 복수의 보편적 포획 프라이머를 상기 복수의 상기 고정화된 연장 생성물에 어닐링시키는 단계;
    (f) PCR에 의해 상기 복수의 고정화된 연장 생성물을 증폭시켜 제 2의 복수의 고정화된 엠플리콘을 생성시키는 단계로서, 상기 제 2의 복수의 고정화된 엠플리콘이 85% 또는 그 초과의 균일성을 포함하는 단계;
    (g) 상기 제 2의 복수의 고정화된 엠플리콘을 시퀀싱하는 단계, 및
    (h) 3개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드 서열을 표적 폴리뉴클레오타이드 종에 대한 변이 위치에서 비교함으로써 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드에 대한 무작위적 서열 에러를 제거하는 단계로서, 상기 표적 폴리뉴클레오타이드 종이 상기 고유의 서열 지표에 의해 확인되어, 상기 하나 이상의 표적 폴리뉴클레오타이드에서 진정한 뉴클레오타이드 서열 변이를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  43. 제 42항에 있어서, 상기 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드가 10 ng 또는 그 미만의 투입 핵산을 포함하는 방법.
  44. 제 42항에 있어서, 하이브리드화시키기에 충분한 상기 조건이 10 분 또는 그 미만 동안의 인큐베이션을 포함하는 방법.
  45. 제 42항에 있어서, 변이 뉴클레오타이드 위치에 대한 0.3% 또는 그 미만의 불일치 비율이 검출되는 방법.
  46. 제 42항에 있어서, 접촉 단계 (a)가 제 1의 유전자 특이적 전방향 및 역방향 프라이머와의 제 1회의 PCR 증폭 및 상기 제 1 유전자 특이적 전방향 프라이머의 일부에 상보적인 제 2의 전방향 프라이머와의 제 2회의 PCR 증폭을 포함하며, 제 2의 전방향 프라이머는 상기 고유의 서열 지표 및 상기 어댑터를 포함하는 방법.
  47. 제 42항에 있어서, 상기 어댑터가 상기 복수의 보편적 포획 프라이머에 상보적인 방법.
  48. 제 42항에 있어서, 상기 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 상기 증폭이 비대칭 PCR을 포함하는 방법.
  49. 제 42항에 있어서, 상기 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드의 상기 증폭이 다중 증폭을 포함하는 방법.
  50. 제 49항에 있어서, 상기 다중 증폭이 180 또는 그 초과의 다중성을 포함하는 방법.
  51. 제 42항에 있어서, 상기 고형 지지체가 제 2의 복수의 보편적 포획 프라이머를 추가로 포함하는 방법.
  52. 제 51항에 있어서, 상기 복수의 표적 특이적 포획 프라이머가 보편적 포획 프라이머 부위를 추가로 포함하는 방법.
  53. 제 52항에 있어서, 상기 보편적 포획 프라이머 부위가 상기 제 2의 복수의 보편적 포획 프라이머에 상응하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 방법.
  54. 제 42항에 있어서, 상기 복수의 표적 특이적 포획 프라이머가 200개 또는 그 초과의 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
  55. 제 42항에 있어서, 상기 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드가 200개 또는 그 초과의 상이한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
  56. 제 42항에 있어서, 상기 복수의 표적 폴리뉴클레오타이드가 복수의 유전체 핵산을 포함하는 방법.
  57. 제 42항에 있어서, 상기 고정화된 연장 생성물의 상기 증폭이 브릿지 증폭을 포함하는 방법.
  58. 제 42항에 있어서, 상기 고형 지지체가 플로우 셀을 포함하는 방법.
  59. 제 42항에 있어서, 상기 시퀀싱이 50 주기를 포함하는 방법.
  60. 제 59항에 있어서, 시작부터 종료까지의 시간이 3시간 또는 그 미만을 포함하는 방법.
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