CN105917006B - 固体支持物上的扩增子制备和测序 - Google Patents

固体支持物上的扩增子制备和测序 Download PDF

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Abstract

本公开内容涉及分子生物学领域，并且更加具体地涉及用于在固体表面上捕获、扩增和测序靶多核苷酸的方法。

Description

固体支持物上的扩增子制备和测序
背景
本公开内容一般地涉及用于核酸扩增和测序的方法和组合物，并且更加具体地涉及在固体支持物上捕获和测序靶多核苷酸。
由于多核苷酸(例如，DNA或者RNA)中编码的信息对于医学和生命科学具有至高无上的重要性，对快速且廉价地测序多核苷酸存在需求。目前，商业测序技术需要样品和文库制备，此二者均是费力的。此外，读出(readout)慢于许多应用所需。因此，通量有限并且成本相对高。
因此，对用于制备靶多核苷酸并对其测序的更加快速且有效的方法存在需求。本公开内容满足该需求并且还提供了相关的优势。
实施方案的概述
本公开内容提供了一种用于扩增子制备的方法。所述方法包括：(a)使包含多个靶多核苷酸的核酸样品与至少一种引物在足以用于杂交的条件下接触，所述至少一种引物含有衔接子；(b)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述多个靶多核苷酸以产生多个扩增子；(c)使固定在固体支持物上的多个靶特异性捕获引物与所述多个扩增子在足以用于杂交的条件下直接接触以产生第一多个固定的扩增子，所述固体支持物还包含多个通用捕获引物；(d)延伸所述多个靶特异性捕获引物以产生与所述靶多核苷酸互补的多个固定的延伸产物；(e)使所述多个通用捕获引物退火至所述多个固定的延伸产物，以及(f)通过PCR扩增所述多个固定的延伸产物以产生第二多个固定的扩增子，其中所述固定的扩增子的群体包含85％或更高的均一性。所述方法可以以10ng或更少的输入核酸使用，并且可以进一步包括对所述第二多个固定的扩增子测序。所述方法还可以用于确定与紊乱或疾病相关的基因的存在，所述基因包括癌症相关基因。无细胞DNA也可以在本公开内容的方法中被采用。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸可包含10ng或更少的输入核酸。在一些实施方案中，所述足以用于杂交的条件可包括孵育10分钟或更少。在一些实施方案中，所述直接接触步骤(c)可包括基本上未纯化的第一多个扩增子。在一些实施方案中，所述第一多个扩增子可包含高比例的细胞组分。在一些实施方案中，所述衔接子可与所述多个通用捕获引物互补。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸的所述扩增可包括不对称PCR。在一些实施方案中，所述至少一种引物可包括两种引物，并且所述两种引物的至少一种可含有所述衔接子。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸的所述扩增可包括多重扩增。在一些实施方案中，所述多重扩增可包括180重或更多重的多重性。在一些实施方案中，所述固体支持物还可包含第二多个通用捕获引物。在一些实施方案中，所述多个靶特异性捕获引物还可包含通用捕获引物区域。在一些实施方案中，所述通用捕获引物区域可具有对应于所述第二多个通用捕获引物的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多个靶特异性捕获引物可包含200种或更多种不同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸可包含200种或更多种不同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸可包含多个基因组核酸。在一些实施方案中，所述固定的延伸产物的所述扩增可包括桥式扩增。在一些实施方案中，所述固体支持物可包含流动池。在一些实施方案中，所述方法还可包括对所述第二多个固定的扩增子测序。在一些实施方案中，所述测序可包括50个循环。在一些实施方案中，从开始到结束的时间可包括3小时或更少。
本公开内容还提供了一种用于确定癌症相关基因的存在的方法，所述方法包括：(a)使包含多个靶多核苷酸的核酸样品与至少一种引物在足以用于杂交的条件下接触，所述至少一种引物含有衔接子；(b)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述多个靶多核苷酸以产生多个扩增子；(c)使固定在固体支持物上的对一种或更多种不同的癌症特异性的多个靶特异性捕获引物与所述多个扩增子在足以用于杂交的条件下直接接触以产生第一多个固定的扩增子，所述固体支持物还包含多个通用捕获引物；(d)延伸所述多个靶特异性捕获引物以产生与所述靶多核苷酸互补的多个固定的延伸产物；(e)使所述多个通用捕获引物退火至所述多个所述固定的延伸产物；(f)通过PCR扩增所述多个固定的延伸产物以产生第二多个固定的扩增子，其中所述固定的扩增子的群体包含85％或更高的均一性；以及(g)对所述第二多个固定的延伸产物测序以确定癌症相关基因的存在或不存在。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸可包含10ng或更少的输入核酸。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸可包括无细胞DNA(cfDNA)。在一些实施方案中，所述足以用于杂交的条件可包括孵育10分钟或更少。在一些实施方案中，所述直接接触步骤(c)可包括基本上未纯化的第一多个扩增子。在一些实施方案中，所述衔接子可与所述多个通用捕获引物互补。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸的所述扩增可包括不对称PCR。在一些实施方案中，所述至少一种引物可包含两种引物，并且所述两种引物的至少一种可含有所述衔接子。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸的所述扩增可包括多重扩增。在一些实施方案中，所述多重扩增可包括180重或更多重的多重性。在一些实施方案中，所述固体支持物还可包含第二多个通用捕获引物。在一些实施方案中，所述多个靶特异性捕获引物还包含通用捕获引物区域。在一些实施方案中，所述通用捕获引物区域可具有对应于所述第二多个通用捕获引物的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多个靶特异性捕获引物可包含200种或更多种不同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多个靶特异性捕获引物可包含选自由以下组成的基因的组的两个或更多个不同的核苷酸序列：AKT1、CTNNB1、FLT3、KRAS、PTPN11、SRC、ALK、EGFR、GNAS、MLH1、RB1、STK11、ATM、ERBB2、HNF1A、MPL、RAD50、TP53、BRAF、ERBB4、IDH1、NRAS、RET、VHL、BRCA1、FBXW7、JAK3、PIK3CA、SMAD4、CDH1、FGFR2、KIT、PTEN、SMARCB1、ABL1、CSF1R、GNA11、JAK2、NOTCH1、SMO、APC、FGFR1、GNAQ、KDR、NPM1、CDKN2、FGFR3、HRAS、MET和PDGFRA。在一些实施方案中，所述多个靶特异性捕获引物可包含用于以下基因中的每个的核苷酸序列：AKT1、CTNNB1、FLT3、KRAS、PTPN11、SRC、ALK、EGFR、GNAS、MLH1、RB1、STK11、ATM、ERBB2、HNF1A、MPL、RAD50、TP53、BRAF、ERBB4、IDH1、NRAS、RET、VHL、BRCA1、FBXW7、JAK3、PIK3CA、SMAD4、CDH1、FGFR2、KIT、PTEN、SMARCB1、ABL1、CSF1R、GNA11、JAK2、NOTCH1、SMO、APC、FGFR1、GNAQ、KDR、NPM1、CDKN2、FGFR3、HRAS、MET和PDGFRA。在一些实施方案中，所述固定的延伸产物的所述扩增可包括桥式扩增。在一些实施方案中，所述固体支持物可包括流动池。在一些实施方案中，所述测序可包括50个循环。在一些实施方案中，从开始到结束的时间可包括3小时或更少。
本公开内容还提供了一种用于增加核酸序列变异的检测灵敏度的方法。所述方法包括：(a)使包含多个靶多核苷酸的核酸样品与基因特异性正向引物和反向引物在足以用于杂交的条件下接触，所述基因特异性正向引物中的每种包含独特的序列标志(index)和衔接子；(b)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述多个靶多核苷酸以产生多个扩增子；(c)使固定在固体支持物上的多个靶特异性捕获引物与所述多个扩增子在足以用于杂交的条件下直接接触以产生第一多个固定的扩增子，所述固体支持物还包含多个通用捕获引物；(d)延伸所述多个靶特异性捕获引物以产生与所述靶多核苷酸互补的多个固定的延伸产物；(e)使所述多个通用捕获引物退火至所述多个固定的延伸产物；(f)通过PCR扩增所述多个固定的延伸产物以产生第二多个固定的扩增子，其中所述第二多个固定的扩增子包含85％或更高的均一性；(g)对所述第二多个固定的扩增子测序，以及(h)通过在一个靶多核苷酸种类的一个变异位置处比较三个或更多个核苷酸序列消除一个或更多个靶多核苷酸的随机序列错误，其中所述靶多核苷酸种类通过所述独特的序列标志鉴定，从而确定所述一个或更多个靶多核苷酸中真正的核苷酸序列变异。所述方法可以检测到变异核苷酸位置的0.3％或更低的错配率。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸可包含10ng或更少的输入核酸。在一些实施方案中，所述足以用于杂交的条件可包括孵育10分钟或更少。在一些实施方案中，可检测到变异核苷酸位置的0.3％或更小的错配率。在一些实施方案中，接触步骤(a)可包括使用第一基因特异性正向引物和反向引物的第一轮PCR扩增和使用与所述第一基因特异性正向引物的部分互补的第二正向引物的第二轮PCR扩增，第二正向引物可包含所述独特的序列标志和所述衔接子。在一些实施方案中，所述衔接子可与所述多个通用捕获引物互补。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸的所述扩增可包括不对称PCR。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸的所述扩增可包括多重扩增。在一些实施方案中，所述多重扩增可包括180重或更多重的多重性。在一些实施方案中，所述固体支持物还可包含第二多个通用捕获引物。在一些实施方案中，所述多个靶特异性捕获引物还可包含通用捕获引物区域。在一些实施方案中，所述通用捕获引物区域可具有对应于所述第二多个通用捕获引物的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多个靶特异性捕获引物可包含200种或更多种不同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸可包含200种或更多种不同的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多个靶多核苷酸可包括多个基因组核酸。在一些实施方案中，所述固定的延伸产物的所述扩增可包括桥式扩增。在一些实施方案中，所述固体支持物可包括流动池。在一些实施方案中，所述测序可包括50个循环。在一些实施方案中，从开始到结束的时间可包括3小时或更少。
附图简述
图1是示出了固体支持物上的扩增子的制备和测序的示例性步骤的示意图。
图2示出了基因组DNA的多重100个循环测序运行的两种不同输入量的核酸的测序均一性与测序深度的比较。
图3示出了从福尔马林固定、石蜡包埋的组织获得的DNA的多重50个循环测序运行的四种不同输入量的核酸的测序均一性与测序深度的比较。
图4示出了多重测序运行的从1ml血浆中分离的10ng无细胞DNA的测序均一性和测序深度的比较。
图5是示例使用独特的分子条码或核苷酸标志区分真正的核苷酸变异与随机核苷酸测序错误的示意图。
图6示出了使用(右)或不使用(左)独特的分子条码校正的核苷酸错配率的比较。
图7是示出了通过靶特异性扩增引物将标志一步并入靶多核苷酸中的示意图，其中所述标志在测序引物结合位点的下游。
图8是示出了通过测序引物将标志两步并入靶多核苷酸中的示意图，其中所述标志在测序引物结合位点的上游。
实施方案的详述
本公开内容涉及用于靶多核苷酸的快速且有效的制备和测序的方法。所述方法包括靶多核苷酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增、直接固定到固体支持物、克隆扩增和测序。它们可以被单独使用或者在允许快速的样品至答案(sample-to-answer)的扩增子测序的整合的程序中被一起利用。整合的方法特别有用，因为扩增子文库制备是不必需的，从而消除了与连接相关的无效性。用于测序的整合的方法的其他特别有用的特性包括，例如，消除对于PCR之后的扩增子纯化和额外富集步骤的需求，允许用于扩增子固定的快速杂交步骤，并且可以以非常小量的输入核酸利用，同时获得高质量的测序结果。
在一个具体的实施方案中，本公开内容的方法采用靶多核苷酸群体的多重PCR，其中一种引物含有与固定在固定支持物上的寡核苷酸互补的衔接子。扩增的靶多核苷酸群体被固定在固体支持物上而不需要首先经历纯化步骤。固定是通过与已经被预先接种到固体支持物上的靶特异性捕获寡核苷酸杂交进行的。使扩增的靶多核苷酸群体的衔接子末端退火至固定的互补寡核苷酸，并且所述互补寡核苷酸被用作延伸反应中的引物以产生双链靶多核苷酸群体。克隆扩增之后，靶多核苷酸集落(colony)经历由35个循环或更多组成的多重测序。
如本文所使用的，术语“多个”是指两个或更多个不同多核苷酸或其他所提及的分子的群体。因此，除非另有明确说明，术语“多个”与群体同义使用。多个包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个或者更多个不同的群体成员。多个还可以包括200、300、400、500、1000、5000、10000、50000、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106或1x107个或更多个不同的成员。多个包括以上示例性群体数目之间的所有整数。
如本文所使用的，术语“靶多核苷酸”意指为分析或作用的目标的多核苷酸。分析或作用包括使多核苷酸经历拷贝、扩增、测序和/或用于核酸询问的其他程序。靶多核苷酸可以包括除了待分析的靶序列之外的核苷酸序列。例如，靶多核苷酸可以包括侧接待分析的靶多核苷酸序列的一个或更多个衔接子，包括起引物结合位点作用的衔接子。杂交至捕获寡核苷酸或者捕获引物的靶多核苷酸可以含有延伸超过捕获寡核苷酸的5'或3'末端的核苷酸，以这样的方式使得并非全部靶多核苷酸都能够进行延伸。
在特定的实施方案中，如下文进一步详细描述的，多个靶多核苷酸包括不同种类，所述不同种类在它们的靶多核苷酸序列上有差异但是具有对于所述不同种类的两个或更多个相同的衔接子。可以侧接特定的靶多核苷酸序列的两个衔接子可以具有相同的序列，或者所述两个衔接子可以具有不同的序列。因此，多个不同的靶多核苷酸可以在靶多核苷酸序列的每个末端具有相同的衔接子序列或者两个不同的衔接子序列。因此，多个靶多核苷酸中的种类可以包括已知序列区域，所述已知序列区域侧接待通过例如测序评价的未知序列区域。在其中靶多核苷酸在单个末端携带衔接子的情况下，衔接子可以位于靶多核苷酸的3'末端或5'末端。靶多核苷酸可以在没有任何衔接子的情况下使用，在这种情况下引物结合序列可以直接来自靶多核苷酸中发现的序列。
如本文所使用的，术语“直接”当在提及接触多个捕获引物使用时，意指接触材料被应用到该多个捕获引物，而无需在所提及的程序之后的明显介入的纯化步骤。明显介入的纯化步骤包括预期降低细胞组分的复杂性的那些程序，包括例如在扩增反应后减少引物、酶和未扩增的或错误扩增的模板的存在。明显介入的纯化步骤不预期包括缓冲液的改变、样品核酸的沉淀和其他小的核酸操作程序。
如本文所使用的，术语“捕获引物”意指具有核苷酸序列的寡核苷酸，所述核苷酸序列能够在例如扩增或测序反应的引物退火步骤中遇到的条件下特异性退火至待分析的或待经历核酸询问的单链多核苷酸序列。通常，术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中可以互换使用。除非另有明确说明，这些不同术语不预期指示在尺寸、序列或其他性质方面的任何特定区别。为了描述清楚，当描述包括若干核酸种类的特定的方法或组合物时，这些术语可以用于区分核酸的一个种类与另一个种类。
如本文所使用的，术语“靶特异性”当提及捕获引物或其他寡核苷酸使用时，意指包含对靶多核苷酸序列特异性的核苷酸序列，即，能够选择性退火至靶多核苷酸的识别区域的核苷酸序列的捕获引物或其他寡核苷酸。靶特异性捕获引物可以具有单一种类的寡核苷酸，或者其可以包括具有不同序列的两个或更多个种类。因此，靶特异性捕获引物可以为两个或更多个序列，包括3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个不同序列。靶特异性捕获寡核苷酸可以包含靶特异性捕获引物序列和通用捕获引物序列。其他序列例如测序引物序列等还可以被包含在靶特异性捕获引物中。
相比之下，术语“通用”当提及捕获引物或其他寡核苷酸序列使用时，意指具有在多个捕获引物之间的共同核苷酸序列的捕获引物或其他寡核苷酸。共同序列可以是，例如，与相同衔接子序列互补的序列。通用捕获引物适合用于询问多个不同多核苷酸而不必需区分不同种类，而靶特异性捕获引物适合用于区分不同种类。
如本文所使用的，术语“标志”当提及核苷酸序列使用时，意指与其他标志以及与样品中含有的多核苷酸中的其他核苷酸序列可区别的独特的核苷酸序列。核苷酸标志可以是随机的或者特别设计的核苷酸序列。标志可以具有任何需要的序列长度，只要其具有足够长度以在群体中的多个标志中和/或在被分析或者询问的多个多核苷酸中成为独特的核苷酸序列即可。本公开内容的核苷酸标志对于例如附接到靶多核苷酸以对特定种类加标签或标记特定种类用于鉴定群体中加标签的种类的所有成员是有用的。因此，标志作为条码是有用的，其中相同分子种类的不同成员可以含有相同的标志并且其中不同多核苷酸的群体中的不同种类可以具有不同标志。
如本文所使用的，术语“固定的”当提及核酸使用时，意指经由共价键或非共价键直接或间接附接至固体支持物。在本公开内容的某些实施方案中，可以使用共价附接，但是通常地所需要的全部为，在其中意图使用支持物的条件下例如在需要核酸扩增和/或测序的应用中核酸保持固定或附接至支持物。通常，待作为捕获引物或扩增引物使用的寡核苷酸被固定，使得3'末端对于酶促延伸是可利用的并且该序列的至少一部分能够杂交至互补序列。固定可以经由杂交至表面附接的寡核苷酸发生，在这种情况下固定的寡核苷酸或多核苷酸可以为3'-5'方向。可选地，固定可以通过除碱基配对杂交之外的其他方式发生，例如上文描述的共价附接。
如本文所使用的，术语“固体支持物”意指核酸可以与其附接的任何不可溶的基底(substrate)或基质(matrix)，诸如例如，乳胶珠、葡聚糖珠、聚苯乙烯表面、聚丙烯表面、聚丙烯酰胺凝胶、金表面、玻璃表面和硅晶片。表面可以是任何所需形状，所述形状包括，例如，适合用于特定应用的平面的、球形的或多孔的。例如，固体支持物可以是平面的玻璃表面。固体支持物还可以被安装在流动池的内部，以允许与多个试剂的溶液相互作用。
在某些实施方案中，固体支持物可以包括惰性基底或基质，该惰性基底或基质已经例如通过应用中间材料的层或涂层被化学官能化，所述中间材料具有允许共价附接至多核苷酸的反应性基团。中间材料可以经由共价键或非共价键直接或间接附接至固体支持物。作为用于非共价附接至固体支持物的非限制性实例，这类支持物可以包括在惰性基底例如玻璃上的聚丙烯酰胺水凝胶层。在这类实施方案中，多核苷酸可以直接共价附接至中间层(例如，水凝胶)，但是中间层本身可以非共价附接至其他基底或基质(例如玻璃基底)层。
本公开内容提供了一种用于扩增子制备的方法。所述方法包括：(a)使具有多个靶多核苷酸的核酸样品与至少一种引物在足以用于杂交的条件下接触，所述至少一种引物含有衔接子；(b)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述多个靶多核苷酸以产生多个扩增子；(c)使固定在固体支持物上的多个靶特异性捕获引物与所述多个扩增子在足以用于杂交的条件下直接接触以产生第一多个固定的扩增子，所述固体支持物还具有多个通用捕获引物；(d)延伸所述多个靶特异性捕获引物以产生与所述靶多核苷酸互补的多个固定的延伸产物；(e)使所述多个通用捕获引物退火至所述多个固定的延伸产物，以及(f)通过PCR扩增所述多个固定的延伸产物以产生第二多个固定的扩增子，其中所述第二多个固定的扩增子包含85％或更高的均一性。
本公开内容的扩增子制备方法整合了提高靶多核苷酸或者其询问产物的样品质量的一个或更多个特征以能够得到用于制备固定的靶多核苷酸的克隆群体的快速且有效的多步骤程序。每个制备程序得到可以在本文描述的任何程序中使用的即用型(ready-to-use)多个靶多核苷酸。
本公开内容的用于扩增子制备的方法包括使具有多个靶多核苷酸的核酸样品与至少一种引物在足以用于杂交的条件下接触。所述至少一种引物可以含有衔接子。
核酸样品可以来源于任何所需来源，包括真核或原核来源以及合成来源。在某些实施方案中，核酸样品来源将来源于感兴趣的生物体并且包括基因组脱氧核糖核酸(DNA)。例如，样品可以来源于人类来源，其中遗传信息是合乎诊断或治疗目的需要的。类似地，样品可以来源于家畜或者农场动物来源，其中遗传信息也是合乎诊断或治疗目的需要的。核酸样品的其他来源包括，例如，细菌、酵母、真菌、啮齿动物等。考虑到本文提供的教导和指导，本领域技术人员将理解，任何核酸来源可以用于本公开内容的方法中。
靶多核苷酸包括待询问的任何所需的核酸。在这方面，靶多核苷酸包括，例如，基因组DNA、cDNA、无细胞DNA(cfDNA)、EST、mRNA、hnRNA、rRNA、tRNA、snRNA、线粒体DNA和合成的DNA或RNA。在特定实施方案中，靶多核苷酸是基因组DNA，并且询问适合用于诊断信息或治疗性干预。
因此，术语“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。该术语应该被理解为包括作为等同物的由核苷酸类似物制成的DNA或者RNA的类似物，并且适用于单链(例如正义或反义)和双链多核苷酸。
靶多核苷酸分子可以起源于双链DNA(dsDNA)形式(例如，基因组DNA片段、PCR和扩增产物等)，或者可以起源于单链形式，如DNA或RNA，并且已被转化为dsDNA形式。例如，mRNA分子可以使用本领域公知的标准技术被拷贝到适合用于在本公开内容的方法中使用的双链cDNA中。靶多核苷酸分子的精确序列可以是已知的或者未知的。
核酸样品可以是未富集的基因组DNA的初始样品。作为可用作核酸样品的基因组DNA的实例，人类基因组由大约31亿个碱基的序列组成。对可在本公开内容的方法中使用的其他基因组的示例性尺寸评估是约2.7Gbp(小鼠)、2.8Gbp(大鼠)、1.7Gbp(斑马鱼)、165Mbp(果蝇)、13.5Mbp(酿酒酵母(S.cerevisiae))、390Mbp(河豚)、278Mbp(蚊子)或者103Mbp(秀丽隐杆线虫(C.elegans))。本领域技术人员将认识到可在本公开内容的方法中使用具有除了以上示例的那些以外的尺寸的基因组，包括，例如，更小或更大的基因组。
在特定实施方案中，靶多核苷酸分子是DNA分子。更具体地，靶多核苷酸分子代表生物体的全部遗传互补物(genetic complement)，并且是包括内含子和外显子序列(编码序列)以及非编码调控序列诸如启动子和增强子序列的基因组DNA分子。也可以使用多核苷酸序列或基因组DNA的特定亚组，诸如特定的染色体。又更加具体地，靶多核苷酸分子或其一部分的序列可以是靶序列。仍然又更加具体地，靶多核苷酸分子是基因组DNA分子，所述基因组DNA分子例如，如之前所示例的来自人类、哺乳动物、细菌、真菌或植物基因组DNA。因此，本公开内容提供了一种使用多个多核苷酸的方法，其中多个靶多核苷酸包括多个基因组核酸。
在某些实施方案中，靶多核苷酸对应于从患有或怀疑患有紊乱或疾病的受试者获得的基因组DNA。在其他实施方案中，靶多核苷酸对应于从怀疑患有紊乱或疾病的受试者获得的基因组DNA。又在其他实施方案中，靶多核苷酸对应于从其中没有患有紊乱或疾病迹象的受试者获得的基因组DNA。在前者的实施方案中，本公开内容的方法可以用于例如确认紊乱或疾病的存在。在后两个实施方案中，本公开内容的方法可以用于例如确定紊乱或疾病的可能性或患病率。
被测试的紊乱或疾病可以是可以从遗传学上确定或评价患病率或可能性的任何紊乱或疾病。这类紊乱或疾病包括所有遗传学上遗传紊乱或疾病以及可以由遗传改变或特定基因的等位基因引起的或者与遗传改变或特定基因的等位基因相关的所有紊乱或疾病。遗传改变包括，例如，一个或更多个核酸突变。这类疾病或紊乱是本领域技术人员熟知的。例如，存在多于19,000个已知的与遗传紊乱或疾病相关的基因(参见，例如，GENECARDS,Weizmann Institute of Science,date of access January 6,2014.URL:genecards.org/cgi-bin/listdiseasecards.pl？type＝full)。受试者中这些基因或遗传突变中的任一个或全部的存在或不存在可以使用例如来自该受试者的基因组DNA在本公开内容的方法中评价。
示例性的遗传学上可遗传的紊乱或疾病包括癌症、囊性纤维化、唐氏综合征、杜氏肌营养不良、血友病、神经纤维瘤、泰-萨克斯病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、软骨发育不全、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、抗磷脂综合征、孤独症、常染色体显性多囊肾病、夏科-马里-图斯病(Charcot-Marie-Tooth)、猫叫综合征(Cri du chat)、克罗恩氏病、德卡姆病、杜安氏综合征、因子V莱顿血栓形成倾向(Factor V Leiden Thrombophilia)、家族性高胆固醇血症、家族性地中海热、脆性X综合征、戈谢病、血色病、遗传性球形红细胞增多症、前脑无裂畸形、克兰费尔特综合征、马凡综合征、强直性肌营养不良、努南综合征、成骨不全症、苯丙酮尿、波兰异常(Poland Anomaly)、卟啉症、多囊性肾病、原发性纤毛运动障碍、早衰、色素性视网膜炎、Rett综合征、重症联合免疫缺陷(SCID)、镰状细胞病、脊髓性肌萎缩、地中海贫血(Thalassemia)、三甲基胺尿症、特纳综合征、多样性卟啉病、腭心面综合征(Velocardiofacial Syndrome)、WAGR综合征和威尔逊氏病。
示例性癌症包括乳腺癌、膀胱癌、结肠癌、结直肠癌、胃癌、胃肠间质瘤、炎性肌纤维母细胞瘤、肾癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、视网膜母细胞瘤、皮肤癌(包括黑素瘤)、前列腺癌、神经纤维瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤和甲状腺癌。
确定遗传紊乱或疾病的存在、不存在或倾向的来自受试者的一种有用的基因组DNA的来源包括cfDNA。无细胞DNA是本领域熟知的。例如，除了公知的母体循环中胎儿核酸的存在之外，本领域还公知可以从血清中分离和扩增其他核酸。在此方面，尤其是，Mulcahy等,LANCET 348:628(1996),Cancer and Mutant DNA in Blood Plasma，综述了表明癌症患者的血浆中(Chen等)和血清(Narwoz等)中存在循环DNA的若干报道，并且还指出已经描述了在患有癌症以及自身免疫性疾病的受试者中存在增加量的游离的循环遗传物质。此外，无细胞循环DNA的发现对于疾病状态不是独特的。Emanuel和Pestka,GATA 10(6):144-146(1993),Amplification of Specific Gene Products from Serum描述了在健康个体的血清中存在游离DNA并且所述游离DNA呈足以进行通过PCR的遗传分析的量。此外，Shapiro,Determination of Circulating DNA Levels in Patients with Benign orMalignant Gastrointestinal Disease,Cancer 51(11):2116-20(1983)报道了血清DNA浓度在恶性胃肠疾病中显著升高，并且在良性胃肠疾病中适度升高。
因此，本公开内容提供了一种用于确定癌症相关基因的存在的方法。所述方法包括：(a)使包含多个靶多核苷酸的核酸样品与至少一种引物在足以用于杂交的条件下接触，所述至少一种引物含有衔接子；(b)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述多个靶多核苷酸以产生多个扩增子；(c)使固定在固体支持物上的对一种或更多种不同的癌症特异性的多个靶特异性捕获引物与所述多个扩增子在足以用于杂交的条件下直接接触以产生第一多个固定的扩增子，所述固体支持物还包含多个通用捕获引物；(d)延伸所述多个靶特异性捕获引物以产生与所述靶多核苷酸互补的多个固定的延伸产物；(e)使所述多个通用捕获引物退火至所述多个固定的延伸产物；(f)通过PCR扩增所述多个固定的延伸产物以产生第二多个固定的扩增子，其中所述固定的扩增子的群体包含85％或更高的均一性，以及(g)对第二多个固定的延伸产物测序以确定癌症相关基因的存在或不存在。所述多个靶多核苷酸可以为10ng或更少的输入核酸，并且输入核酸可以是cfDNA。
靶多核苷酸分子可以在本文描述的任一方法之前或之后被化学处理或酶促处理。在本文描述的方法中，核酸样品可以被片段化或者可以被使用而不进行片段化。样品可以在使用之前经历扩增，例如，全样品扩增技术诸如随机引物延伸。
多个靶多核苷酸可以与至少一种引物接触。图1的图框1图解了一个示例性配置，其中多个靶多核苷酸中的每个成员与一对引物接触并与其杂交，用于通过聚合酶链式反应(PCR)扩增。如下文进一步描述的，当需要不对称PCR时，靶多核苷酸可以杂交至单一引物。如图1的图框1中所示的，至少一种引物还含有可在例如下游程序中使用的衔接子。因此，本公开内容提供了一种使用两种引物并且产生指数扩增的扩增方法。一种或两种引物可以含有衔接子。还提供了一种扩增方法，其中多个靶多核苷酸使用一种引物被扩增，导致不对称扩增。所述一种引物可以含有衔接子。
通常扩增反应使用通常被称为正向引物和反向引物的两种引物。扩增引物通常是单链多核苷酸结构。它们还可以含有天然或非天然碱基并且还有天然和非天然骨架连接的混合物，条件是，至少在一些实施方案中，任何非天然修饰不会永久地或者不可逆地阻止作为引物的功能。扩增引物具有在延伸或扩增反应的条件下退火至模板多核苷酸链的能力，以及充当用于与退火的模板链互补的新多核苷酸链的酶促合成的起始点的能力。
如果需要的话，引物另外可以包括非核苷酸化学修饰，例如，以促进引物与固体支持物的共价附接。某些化学修饰自身可以改进分子作为引物的功能，或者可以提供一些其他有用的功能，诸如提供使引物(或者从其衍生的延伸的多核苷酸链)从固体支持物切割的切割位点。有用的化学修饰还可以提供可逆的修饰，所述可逆的修饰阻止引物的杂交或延伸直至修饰被去除或者逆转。
引物可以被设计以使得5'末端和3'末端携带已知序列区域。已知序列在该术语在本文中使用时可以是通用序列，并且因此具有在多个寡核苷酸之间的共同序列。可选地，例如，其可以是已知的，但是在多个寡核苷酸之间独特的序列。通用序列可以充当引物杂交的便利位点以使得能够使用与该通用序列互补的单一引物对扩增多个不同序列。此外，在捕获引物附接至固体支持物的实施方案中，通用引物还可以充当与例如捕获引物互补的衔接子，并且允许将含有衔接子的多核苷酸固定至捕获引物。图1的图框1将作为衔接子的通用引物作为下部引物上的粗的(thick)部分示出。还示出了上部引物为含有不与靶多核苷酸杂交的序列。此区域可以是通用序列或者其他序列，并且如果其是除了通用引物之外的序列，其可以具有已知的或未知的序列。
在一个实施方案中，至少一种引物杂交之后，多个靶多核苷酸可以经历通过例如PCR的扩增。PCR扩增可以使用如图1的图框1中所示的正向和反向引物进行，以产生靶多核苷酸的指数扩增。PCR扩增还可以使用一种引物进行，以产生靶多核苷酸的不对称或线性扩增。不对称扩增对于产生多个靶多核苷酸的单链扩增子是有用的。本文描述的扩增反应的产物被称为扩增子。因此，多个靶多核苷酸的扩增会产生具有与其模板相同的核苷酸序列的多个扩增子。
虽然本文一般性参考PCR扩增反应进行示例，考虑到本文提供的教导和指导，本领域技术人员将知晓，用于扩增核酸的其他方法，包括多种不同类型的PCR方法，可以被修改以用于本文公开的扩增步骤中。例如，采用寡核苷酸与靶多核苷酸杂交的扩增反应在本文公开的扩增步骤中是有用的，因为它们可以包含衔接子以例如允许杂交至捕获引物。包括不同类型的PCR方法的这类其他扩增反应包括，例如，如美国专利号8,003,354中所描述的多重PCR、数字PCR(dPCR)、dial-out PCR、等位基因特异性PCR、不对称PCR、解旋酶依赖性扩增、热启动PCR、连接介导的PCR、迷你引物PCR、多重连接依赖性探针扩增(MLPA)、巢式PCR、定量PCR(qPCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、固相PCR、连接酶链式反应、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。
用于多核苷酸询问的多重方法是用于操作和分析多个靶多核苷酸的特别有用的方法，因为它们允许在单个反应中询问许多不同种类的靶多核苷酸。多重方法包括，例如，多重扩增和多重测序。其他多重核酸询问方法是本领域熟知的。
示例性参考多重PCR，多重扩增由在单一靶多核苷酸混合物中的多个引物组组成，以产生对不同靶多核苷酸序列特异性的不同尺寸的扩增子。通过同时靶向多个不同的靶多核苷酸，可以从单个扩增反应获得关于多个靶多核苷酸的序列信息，该序列信息以其他方式将需要若干倍该试剂以及更多的时间以进行。用于每个靶特异性引物组的退火温度可以被优化以在单个反应中正确工作，并且扩增子尺寸(即，碱基对长度)可以是相同或不同的长度。用于PCR的多重化试剂盒是商购可得的，并且是本领域熟知的。不同靶多核苷酸种类的数目可以取决于所需应用而变化。例如，多重扩增可以对25、50、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、320、340、360、380、400、450、500、600、700、800、900、1000或更多种不同种类的靶多核苷酸进行。多重扩增还可以对对应于以上范围内的任意整数的多个靶多核苷酸进行。因此，本公开内容还提供了具有以上数目或更大数目的不同靶多核苷酸成员的多个靶多核苷酸，包括具有200种或更多种不同核苷酸序列的多个靶多核苷酸。
因此，本公开内容提供了一种扩增多个靶多核苷酸的方法，其中所述方法包括多重扩增。多重扩增可以为多重PCR。本公开内容还提供了一种具有180重或更多重的多重性的不同靶多核苷酸种类的多重扩增的方法。
用于核酸扩增的其他合适方法可包括寡核苷酸延伸和连接技术、滚环扩增(RCA)技术(Lizardi等,Nat.Genet.19:225-232(1998))和寡核苷酸连接测定(OLA)技术(通常参见美国专利号7,582,420、5,185,243、5,679,524和5,573,907；EP 0 320 308 Bl；EP 0 336731 Bl；EP 0 439 182 B1；WO 90/01069；WO 89/12696；和WO 89/09835)。作为可被特异地设计以扩增感兴趣的核酸的引物延伸和连接引物的非限制性实例，扩增可包括用于GoldenGate测定(
Figure GDA0001186981210000161
Inc.,San Diego,CA)的引物，如由美国专利号7,582,420和7,611,869所示例的。
可以用于本公开内容的方法中的示例性等温扩增方法包括，但不限于如由例如Dean等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:5261-66(2002)所示例的多重置换扩增(MDA)，或者由例如美国专利号6,214,587所示例的等温链置换核酸扩增，它们的每个通过引用以其全文并入本文。可用于本公开内容的另外的非基于PCR的方法包括例如链置换扩增(SDA)，其在例如Walker等,Molecular Methods for Virus Detection,Academic Press,Inc.,1995；美国专利号5,455,166和5,130,238，以及Walker等,Nucl.Acids Res.20:1691-96(1992)中描述；或者超支化链置换扩增，其在例如Lage等,Genome Research 13:294-307(2003)中描述。等温扩增方法可与用于基因组DNA的随机引物扩增的链置换Phi 29聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段5'->3'exo-一起使用。这些聚合酶的使用利用了其高的持续合成能力和链置换活性。高的持续合成能力允许聚合酶产生长10-20kb的片段。如以上描述的，可在等温条件下使用具有低的持续合成能力和链置换活性的聚合酶诸如Klenow聚合酶产生较小的片段。扩增反应、条件和组分的另外的描述详细描述于美国专利号7,670,810的公开内容中，其通过引用以其全文并入本文。
在本公开内容中有用的另一个核酸扩增方法是加标签的PCR，其使用具有恒定的5'区域接着是随机的3'区域的双域(two-domain)引物的群体，如在例如Grothues等，Nucleic Acids Res.21(5):1321-2(1993)中描述的。进行第一轮扩增以允许在热变性的DNA上基于单独杂交的从随机合成的3'区域的大量起始。由于3'区域的性质，起始位点被构思为遍及基因组随机的。其后，未结合的引物可被移除并且另外的复制可使用与恒定的5’区域互补的引物进行。
以上示例性扩增方法可以被用于扩增一个或更多个靶多核苷酸，包括多个靶多核苷酸。靶多核苷酸可以在溶液中或固定在固体支持物上被扩增，以产生在溶液中游离的多个扩增子或者固定至固体支持物的多个扩增子。
扩增反应中多个靶多核苷酸的输入量可以在从微克(μg)至纳克(ng)或更低的范围。在一些实施方案中，多个靶多核苷酸的起始量可以是例如100μg或更多的输入核酸。起始量还可以是例如10、20、30、40、50、60、70、80或90μg的输入核酸。在其他实施方案中，输入核酸的起始量可以在纳克范围内，包括低纳克范围。在这类实施方案中，多个靶多核苷酸的起始量可以是例如100ng或更少的输入核酸。起始量还可以是例如90、80、70、60、50、40、30、20或10ng或更少的输入核酸。在其他实施方案中，多个靶多核苷酸的起始量可以是例如9、8、7、6、5、4、3、2或0.5ng或更少的输入核酸。起始量还可以是以上示例的量之间的任意量。因此，本公开内容提供了一种方法，其中多个靶多核苷酸包括用于扩增反应的10ng或更少的输入核酸。此外，多个靶多核苷酸可以是用于扩增反应的1ng输入核酸或1ng或更少的输入核酸。
在一些实施方案中，多个固定的靶特异性捕获引物在足以用于杂交的条件下与多个扩增子接触。靶特异性捕获引物的靶特异性区域可以被设计为退火至靶多核苷酸的一个或更多个区域。杂交的靶多核苷酸捕获引物将通过靶特异性捕获引物成为被固定的。
图1的图框2示例了被固定至固体支持物的多个靶特异性捕获引物。在该图示中，靶特异性捕获引物比被固定至固体支持物的其他捕获引物更长。本领域技术人员将理解，靶特异性捕获引物比被固定至固体支持物的其他捕获引物更长、更短或与其具有相同长度是不重要的。当然，任何捕获引物将具有执行其功能所必需的序列。靶特异性捕获引物的功能是选择性地或特异性地退火至其靶多核苷酸。其他捕获引物诸如某些通用捕获引物的功能是退火至已知序列诸如衔接子、引物结合位点或其他已知序列。
多个靶特异性捕获引物中的每个成员可以具有相同的靶特异性序列或者不同的靶特异性序列。在前者的实施方案中，多个靶特异性捕获引物将退火至多个相同种类的靶多核苷酸并将其捕获。在后者的实施方案中，多个靶特异性捕获引物将退火至多个不同种类的靶多核苷酸并将其捕获。通常，捕获引物的靶特异性区域被设计为与多个靶多核苷酸的特定成员的同一区域互补。但是，靶特异性区域还可以被设计为与特定靶多核苷酸内的不同核苷酸序列互补。因此，考虑到本文提供的教导和指导，本领域技术人员将理解，特定的应用需要在多个靶特异性捕获引物中包含什么样的成员组成。
多个靶特异性捕获引物可以是大的或小的。本领域技术人员将理解，多个靶特异性捕获引物将含有用于需要被捕获的每个靶多核苷酸的至少一种靶特异性捕获引物。多个还可以包括针对相同靶多核苷酸种类的多个靶特异性捕获引物，包括用于多个靶多核苷酸中的一些或全部靶多核苷酸种类的多个靶特异性捕获引物。因此，本公开内容提供了多个靶特异性捕获引物，所述多个靶特异性捕获引物包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或200种或者更多种不同的群体成员。多个靶特异性捕获引物还可以包括例如300、400、500、1000、5000、10000、50000、1x105、2x105、3x105、4x105、5x105、6x105、7x105、8x105、9x105、1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106或1x107种或更多种不同的成员。多个靶特异性捕获引物还可以包括以上示例的群体数目之间的所有整数。因此，本公开内容提供了具有200种或更多种不同核苷酸序列的多个靶特异性捕获引物。
如图1的图框2中所示例的，多个靶特异性捕获引物可以被固定至固体支持物。多个靶特异性捕获引物还可以在溶液中游离使用，并且随后通过例如杂交至具有通用序列的捕获引物而被固定至固体支持物，所述通用序列与靶特异性捕获引物上的第二区域互补。
在其中多个靶特异性捕获引物如图1的图框2中所示例的被首先固定至固体支持物的具体实施方案中，靶特异性捕获引物被直接附接至固体支持物，如所示例的。可选地，靶特异性捕获引物可以在固体支持物上从通用捕获引物产生。在这方面，捕获引物的较粗部分代表被预先接种到固体支持物的通用序列。具有与通用引物互补的区域的一个靶特异性捕获引物或多个靶特异性捕获引物可以例如退火至通用捕获引物，并且随后被延伸以产生如图1的图框2所示的全长靶特异性捕获引物或者多个靶特异性捕获引物。
采用固定的靶特异性捕获引物的实施方案是有用的，因为其允许多个扩增子的标准化。例如，可以产生固体支持物使得其含有标准拷贝数的每个种类的靶特异性捕获引物，因此，允许捕获标准拷贝数的靶多核苷酸或其扩增子。靶特异性捕获引物的标准拷贝数可以变化，并且可以被设计使得标准拷贝数的丰富的和稀有的靶多核苷酸种类二者以相等的频率被捕获。在其他实施方案中，不同种类的靶特异性捕获引物未被标准化，并且可以以任何需要的比例包括随机比例被固定。考虑到本文提供的教导和指导，本领域技术人员将知晓，无论是标准化的拷贝数(包括等量拷贝数)还是其他比例的不同种类的靶特异性捕获引物是特定用途所需要的。
如图1的图框2所示，除了具有多个靶特异性捕获引物，固体支持物还可以包括多个其他类型的捕获引物。多个捕获引物可以具有相同或不同的序列。图1的图框2示出了两种多个通用捕获引物(垂直寡核苷酸的填充部分和点描的粗的部分)。在该示例性实施方案中，一种多个通用捕获引物与添加至多个靶多核苷酸的衔接子互补。该通用捕获引物对于捕获例如包含该衔接子的多个靶多核苷酸或其扩增子是有用的。如图1的图框3所示的以及下文进一步描述的，通用捕获引物还例如对于进行桥式扩增是有用的。固体支持物可以含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10种或更多种不同的多个通用捕获引物。
因此，本公开内容提供了具有与多个通用捕获引物互补的衔接子的多个靶多核苷酸和/或其扩增子。固体支持物可以包含第一、第二或更大数目的不同的多个通用捕获引物。还提供了还具有通用捕获引物区域的多个靶特异性捕获引物。通用捕获引物区域可以具有对应于第一或第二多个通用捕获引物的核苷酸序列。
因此，在一些实施方案中，本公开内容的方法包括提供固体支持物，所述固体支持物具有多个固定的靶特异性捕获引物。在一些实施方案中，提供固体支持物包括将靶特异性捕获引物固定到固体支持物上。在一些实施方案中，多个靶特异性捕获引物被直接固定到固体支持物上。
在一些实施方案中，靶特异性捕获引物在一个或更多个步骤中被装配在固体支持物上。在一些实施方案中，靶特异性捕获引物的固定包括将通用捕获引物固定到固体支持物上。在某些实施方案中，靶特异性捕获引物的固定还包括将固定的通用捕获引物转化为靶特异性捕获引物。在某些实施方案中，靶特异性捕获引物的固定还包括使夹板(splint)寡核苷酸与通用捕获引物一起退火，其中夹板寡核苷酸包含与靶特异性捕获引物的通用区域互补的通用区域以及与靶核苷酸中的靶特异性区域互补的靶特异性区域。在某些实施方案中，靶特异性捕获引物的固定还包括延伸通用捕获引物以产生靶特异性捕获引物。
在一些实施方案中，将靶特异性捕获引物与其他靶特异性捕获引物组合固定。在一些实施方案中，靶特异性捕获引物包括多个靶特异性捕获引物。在一些实施方案中，多个靶特异性捕获引物包括仅两种类型的靶特异性捕获引物。例如，靶特异性捕获引物包括两个通用捕获区域中的一个诸如P5或P7区域以及一个靶特异性区域。P5区域包括核苷酸序列5'-AATGATACGGCGACCACCGA-3'。P7区域包括核苷酸序列5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3'。在某些实施方案中，寡核苷酸是P5区域序列的反向互补序列("anti-P5"：5'-TCGGTGGTCGCCGTATCATT-3')或者P7区域序列的反向互补序列("anti-P7"：5'-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3')捕获引物。在某些实施方案中，寡核苷酸可以与
Figure GDA0001186981210000211
捕获引物P5(配对末端)(5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC-3')或P7(配对末端)(5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA(8-oxo-G)AT-3')杂交。在某些实施方案中，寡核苷酸可以与
Figure GDA0001186981210000212
捕获引物P5(配对末端)的反向互补序列("anti-P5(配对末端)"：5'-GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3')或P7(配对末端)的反向互补序列("anti-P7(配对末端)"：5'-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3')杂交。
在其他实施方案中，多个靶特异性捕获引物包含不同成员的群体。在某些实施方案中，靶特异性捕获引物的群体可以包含多于10、100、1,000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000个不同成员。在某些实施方案中，靶特异性捕获引物在靶特异性捕获区域中包含的序列方面不同。在某些实施方案中，靶特异性捕获引物靶向不同的靶多核苷酸。
在本公开内容的一些实施方案中，固定的靶特异性捕获引物包括多个固定的靶特异性捕获引物，并且靶多核苷酸包括多个靶多核苷酸。
在一些实施方案中，基本上所有固定的捕获引物是靶特异性捕获引物。在其他实施方案中，将靶特异性捕获引物与通用捕获引物组合固定。在某些实施方案中，过量的靶特异性捕获引物被固定。在某些实施方案中，相对于通用捕获引物过量的靶特异性捕获引物为大于2:1、3:1、5:1、10:1、50:1、100:1、500:1、1,000:1、10,000:1、50,000:1、或100,000:1。在某些实施方案中，过量的通用捕获引物被固定。在某些实施方案中，相对于靶特异性捕获引物过量的通用捕获引物为大于2:1、3:1、5:1、10:1、50:1、100:1、500:1、1,000:1、10,000:1、50,000:1、或100,000:1。
在涉及确定遗传紊乱或疾病的存在、不存在或易感性的某些实施方案中，多个靶特异性捕获引物可以涉及与这类遗传紊乱或疾病相关的一个或更多个基因。这类遗传紊乱或疾病包括之前示例的或本领域熟知的那些中的任一种。例如，多个靶特异性捕获引物可以涉及两种或更多种紊乱以检测多种不同紊乱或疾病的存在、不存在或易感性。因此，一组靶特异性捕获引物可以被用于检测多种不同疾病。该组可以包括多个靶特异性捕获引物中的成员，所述成员是对与不同或相同遗传紊乱或疾病相关的2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或200个或者更多个基因特异性的。
作为提及一组与癌症相关基因的实例，多个靶特异性捕获引物可以包括以下癌症相关基因的任意组合，包括所有组合和/或排列：AKT1、CTNNB1、FLT3、KRAS、PTPN11、SRC、ALK、EGFR、GNAS、MLH1、RB1、STK11、ATM、ERBB2、HNF1A、MPL、RAD50、TP53、BRAF、ERBB4、IDH1、NRAS、RET、VHL、BRCA1、FBXW7、JAK3、PIK3CA、SMAD4、CDH1、FGFR2、KIT、PTEN、SMARCB1、ABL1、CSF1R、GNA11、JAK2、NOTCH1、SMO、APC、FGFR1、GNAQ、KDR、NPM1、CDKN2、FGFR3、HRAS、MET和/或PDGFRA。
因此，本公开内容提供了一种用于确定癌症相关基因的存在的方法，其中多个靶特异性捕获引物包括选自以下基因的两个或更多个不同核苷酸序列：AKT1、CTNNB1、FLT3、KRAS、PTPN11、SRC、ALK、EGFR、GNAS、MLH1、RB1、STK11、ATM、ERBB2、HNF1A、MPL、RAD50、TP53、BRAF、ERBB4、IDH1、NRAS、RET、VHL、BRCA1、FBXW7、JAK3、PIK3CA、SMAD4、CDH1、FGFR2、KIT、PTEN、SMARCB1、ABL1、CSF1R、GNA11、JAK2、NOTCH1、SMO、APC、FGFR1、GNAQ、KDR、NPM1、CDKN2、FGFR3、HRAS、MET和PDGFRA。多个靶特异性捕获引物可以是用于以下基因中的每个的核苷酸序列：AKT1、CTNNB1、FLT3、KRAS、PTPN11、SRC、ALK、EGFR、GNAS、MLH1、RB1、STK11、ATM、ERBB2、HNF1A、MPL、RAD50、TP53、BRAF、ERBB4、IDH1、NRAS、RET、VHL、BRCA1、FBXW7、JAK3、PIK3CA、SMAD4、CDH1、FGFR2、KIT、PTEN、SMARCB1、ABL1、CSF1R、GNA11、JAK2、NOTCH1、SMO、APC、FGFR1、GNAQ、KDR、NPM1、CDKN2、FGFR3、HRAS、MET和PDGFRA。
在一些实施方案中，多个扩增子在扩增程序之后被直接应用于多个靶特异性捕获引物或者与多个靶特异性捕获引物接触，包括，例如，直接接触被固定在固体支持物的多个靶特异性捕获引物。因此，多个扩增子可以被应用至多个捕获引物而不需要明显介入的纯化步骤，并且可以为部分未纯化的或者基本上未纯化的多个扩增子。在该实施方案中，多个扩增子因此可以在混合物中包含细胞组分(包括高定量的细胞组分)、引物、扩增酶和未扩增的或错误扩增的多核苷酸。
在其他实施方案中，多个扩增子可以在接触多个靶特异性捕获引物之前被部分或完全纯化。这类核酸纯化程序对于本领域技术人员是熟知的，并且包括，例如，沉淀、过滤和色谱分析以去除细胞组分诸如大分子、盐等。
足以用于多个靶特异性捕获引物的杂交的条件可以具有从数分钟至一小时或更长的范围内的孵育时间或退火时间，所述多个靶特异性捕获引物包括例如被固定在固体支持物上的多个靶特异性捕获引物。较短的杂交时间对于有效进行整合程序中的任何后续的一个或多个步骤是有用的。在一些实施方案中，杂交时间可以是例如60分钟或者更少。杂交时间还可以是例如50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10分钟或者更少。杂交还可以是例如短于10分钟，包括例如9、8、7、6或5分钟。另外，杂交时间可以为以上示例的时间段之间的任意时间段。因此，本公开内容提供了一种方法，其中足以用于杂交的条件包括靶特异性捕获引物与扩增子或其他多核苷酸的持续10分钟或更少的孵育或退火时间。
在一些实施方案中，多个扩增子在接触多个靶特异性捕获引物之前可以为双链。为了允许被靶特异性捕获引物退火和捕获，多个扩增子可以通过例如高温或降低Tm以分离双链多核苷酸的两条链的化学试剂被变性。链分离，包括部分链分离，可以在例如接触多个靶特异性捕获引物之前或同时进行。在其他实施方案中，多个扩增子可以为单链。在这类单链实施方案中，链分离步骤是非必需的，但是可以被有用地采用以去除单链中的二级结构。
通过退火至固定在固体支持物上的靶特异性捕获引物以产生固定的多个扩增子的扩增子捕获之后，例如，固定的多个扩增子可以为部分双链以及部分单链。如图1的图框3中所示，最左侧固定的扩增子杂交至靶特异性捕获探针并且非互补区域仍为单链。包括固定的多个扩增子的固定的扩增子可以通过从靶特异性捕获引物的酶促延伸被制成双链。这样的双链延伸产物在图1的图框3的中间的固定的扩增子中示出。延伸反应是本领域熟知的，并且在下文和实施例中被进一步示例。
在根据本公开内容的特定实施方案的下一步中，固定的多个扩增子可以经历另外的程序。例如，这类另外的程序包括扩增或测序。在某些实施方案中，第一多个固定的扩增子使用先前描述的方法或本领域熟知的其他方法中的任一个被扩增以产生第二多个固定的扩增子。当固定在固体支持物上时，一个特别有用的扩增程序包括桥式扩增。如图1的图框3中所示，从延伸反应产生的双链扩增子或部分双链扩增子例如被变性，并且，固定的链通过与如所示例的衔接子的杂交而被退火至通用捕获引物。得到的结构在两个末端处被固定以产生桥，并且通用捕获引物可以被延伸并且随后使用例如包含在靶特异性捕获引物中的通用引物区域被扩增。该第二通用捕获引物可以不同于与衔接子序列互补的第一通用引物。未固定的链可以例如被洗掉。因此，本公开内容的方法提供了一种包括桥式扩增的扩增方法。
本文描述的桥式扩增方法产生在多个中均一的扩增子簇或集落数。簇均一性在图2和图3中示出，并且在以下实施例中进一步描述。因此，本公开内容提供了一种扩增固定的多核苷酸的方法，其中均一性在0.1平均值处包括80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％或95％或更高。
在桥式扩增中，例如，合适的条件被应用到包括固定的多个单链延伸产物的固定的单链延伸产物，使得单链延伸产物退火至固定的通用捕获引物以形成桥式结构形式的复合体。合适的条件诸如中和和/或杂交缓冲液是本领域熟知的(参见Sambrook和Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第三版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress(2001)；Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley andSons,Baltimore,Md.(1998))。中和和/或杂交缓冲液可以随后被去除。
应用用于延伸的合适的条件之后，进行延伸反应。通过核苷酸的顺序添加而延伸复合体的扩增寡核苷酸，以产生与单链多核苷酸分子互补的延伸产物。得到的双链体在两个末端被固定使得每条链都被固定。
合适的条件诸如包含具有聚合酶活性的酶的延伸缓冲液/溶液是本领域熟知的(参见Sambrook等,同上；Ausubel等，同上)。该桥式扩增技术可以如在例如US 7,115,400和US 2005/0100900 Al中所描述的被执行，所述专利的内容通过引用并入本文。
可以在本公开内容中使用的具有聚合酶活性的酶的实例是DNA聚合酶(Klenow片段、T4 DNA聚合酶)、来自多种耐热性细菌的热稳定DNA聚合酶(诸如Taq、VENT、Pfu或TfIDNA聚合酶)以及其遗传修饰的衍生物(TaqGold、VENTexo或Pfu exo)。RNA聚合酶和逆转录酶的组合也可以被用于产生延伸产物。特别地，酶可以在这些和相关的实施方案中具有链置换活性；更加特别地，酶可以在约7至约9的pH，特别是pH 7.9至pH 8.8是有活性的；而更加特别地，在某些示例性实施方案中酶是Bst或Klenow。
使用的核苷三磷酸分子通常是脱氧核糖核苷三磷酸，例如dATP、dTTP、dCTP、dGTP，或者是核糖核苷三磷酸例如ATP、UTP、CTP、GTP。核苷三磷酸分子可以是天然存在的或非天然存在的。
杂交和延伸步骤之后，支持物和附接的核酸可以经历变性条件。可以使用流动池，使得延伸缓冲液通常通过变性缓冲液的流入而被去除。合适的变性缓冲液是本领域熟知的(参见Sambrook等,同上；Ausubel等，同上)。例如，已知的是改变pH和低离子强度溶液可以在基本上等温温度下使核酸变性。甲酰胺和尿素与核酸的碱基形成新的氢键，破坏导致沃森-克里克碱基配对的氢键。在特定实施方案中，甲酰胺的浓度为50％或更多。这些导致单链核酸分子。如果需要的话，链可以通过用具有非常低的盐(例如小于0.01M阳离子条件)和高pH(>12)的溶液处理或者通过使用离液序列高的盐(例如盐酸胍)被分离。在特定实施方案中，使用强碱。强碱是能够在酸碱反应中将非常弱的酸去质子化的碱性化学化合物。碱的强度通过其pKb值指示，具有小于约1的pKb值的化合物被称为强碱并且是本领域技术人员熟知的。在特定实施方案中，强碱是以从0.05M至0.25M，特别是0.1M的浓度使用的氢氧化钠(NaOH)溶液。
上文示例的杂交、延伸和变性步骤之后，将存在两种固定的核酸，第一种含有与(最初被固定的)第一模板单链多核苷酸分子相同的序列，并且第二种为与其互补的从固定的捕获寡核苷酸中的一个延伸的核酸。然后固定的两种链能够通过使支持物经历另外的杂交、延伸和变性的循环而起始另外的轮次的扩增。因此，扩增贯穿退火、延伸和变性的循环从单链进行至双链体，一个双连体至两个双链体，两个双链体至四个双链体等。
在扩增方法的每个步骤之间进行任选的洗涤步骤可以是有用的。例如，不含有聚合酶、含有或不含有dNTP的延伸缓冲液可以应用至固体支持物，随后被去除并替换为全延伸缓冲液。
这类另外的轮次的扩增可以被用于产生具有多个拷贝的固定的单链多核苷酸序列和其互补序列的核酸集落或簇。
扩增子的初始固定意指延伸产物可以与通用捕获引物杂交，所述通用捕获引物位于模板多核苷酸分子全长内的一定距离处。更多拷贝的固定的延伸产物和其互补序列通过进行另外的轮次的扩增即另外的轮次的杂交、延伸和变性而被合成之后，随后正在产生的核酸集落或簇的边界将能够进一步延伸。
因此，本公开内容的方法允许从第一多个的多个固定的单链扩增子产生第二多个固定的扩增子或多核苷酸集落，并且可以通过改变固定在固体支持物上的通用捕获引物的比例控制这些集落的密度。
在一个特定的方面，本公开内容的方法被用于通过固相扩增制备与US 7,115,400、US 2005/0100900 Al、WO 00/18957和WO 98/44151中描述的那些类似的核酸集落的成簇阵列(clustered array)。
通过本公开内容的方法形成的成簇阵列适合用于在通常在有序阵列诸如微阵列上进行的应用中使用。这类应用的非限制性实例包括杂交分析、基因表达分析、蛋白质结合分析、测序、基因分型、核酸甲基化分析等。成簇阵列可以在被用于下游应用之前被测序，所述下游应用诸如，例如与荧光RNA杂交或使用荧光标记的蛋白质的结合研究。
如图1的图框4中所示，本公开内容还包括对通过固相扩增产生的扩增的核酸测序的方法。因此，本公开内容提供了一种核酸测序的方法，所述方法包括使用如上文所描述的固相扩增来扩增多个固定的延伸产物，以及进行核酸测序反应以确定在固相扩增反应中产生的至少一条扩增的核酸链的全部或一部分的序列。
在某些实施方案中，本文公开的用于获得多个不同靶多核苷酸的序列的方法可以以顺序或整合的方式进行，所述顺序或整合的方式导致短的从开始到结束的时间。例如，使用本文所描述的方法，多个靶多核苷酸的序列可以在3小时或更少时间内持续50个测序循环被确定。从开始到结束的时间还可以是，例如2.9、2.8、2.7、2.6或2.5小时或更少时间持续50个测序循环。整合的方法包括，例如，以10ng或更少的输入核酸开始；扩增多个靶多核苷酸以产生多个扩增子；捕获多个扩增子以产生第一多个固定的扩增子；扩增第一多个固定的扩增子以产生第二多个固定的扩增子，以及持续至少50个测序循环对扩增子测序。本领域技术人员将理解，用于获得多个靶多核苷酸的序列的从开始到结束的时间将类似地有效，但是当进行更多测序循环时从开始到结束的时间更长。例如，50个测序循环需要约2小时，并且可以导致约2小时50分钟的总的从开始到结束的时间，而150个测序循环需要约4.5小时，并且可以导致在约5至6小时之间的总的从开始到结束的时间。
测序可以使用任何合适的测序技术进行。特别有用的方法是其中核苷酸被相继添加至游离的3'羟基，导致以5'至3'方向合成多核苷酸链的方法。添加的核苷酸的性质可以在每次核苷酸添加之后或者测序过程结束时被确定。使用通过连接测序的测序技术，其中并非每个连续碱基都被测序，以及诸如其中碱基被从表面的链移除而非添加到表面的链的大规模平行标记测序(MPSS)的技术也在本公开内容的范围内。
例如，一种有用的测序方法是合成测序法(SBS)。在SBS中，监测核酸引物沿着核酸模板(例如，靶核酸或其扩增子)的延伸以确定模板中核苷酸的序列。潜在的化学过程可以是聚合作用(例如，如被聚合酶催化)。在特定的基于聚合酶的SBS实施方案中，荧光标记的核苷酸以模板依赖性方式被添加至引物(从而延伸引物)，以使得检测添加至引物的核苷酸的顺序和类型可被用来确定模板的序列。
如下文进一步描述的，流动池提供了用于容纳由本公开内容的方法产生的扩增的DNA片段的方便的固体支持物。以此形式的一个或更多个扩增子可经历SBS或涉及循环重复递送试剂的其他检测技术。例如，为了起始第一SBS循环，一个或更多个标记的核苷酸、DNA聚合酶等可流入/流经容纳一个或更多个扩增的核酸分子的流动池。其中引物延伸导致标记的核苷酸被并入的那些位点可被检测。任选地，核苷酸还可包括可逆终止特性，该特性在核苷酸已被添加至引物后终止进一步的引物延伸。例如，具有可逆终止子部分的核苷酸类似物可被添加至引物，以使得随后的延伸不能发生，直到递送解阻断剂以移除该部分。因此，对于使用可逆终止的实施方案，可将解阻断剂递送至流动池(在检测发生之前或之后)。在多个递送步骤之间可进行洗涤。然后可重复循环n次，以将引物延伸n个核苷酸，从而检测长度n的序列。可容易地适于与由本公开内容的方法产生的扩增子一起使用的示例性SBS过程、流体系统和检测平台被描述于例如Bentley等人,Nature 456:53-59(2008)；WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281和US 2008/0108082中，其每个通过引用并入本文。
使用循环反应的其他测序过程可被利用，诸如焦磷酸测序。焦磷酸测序在特定的核苷酸被并入新生核酸链时，检测无机焦磷酸(PPi)的释放(Ronaghi等,AnalyticalBiochemistry 242(1),84-9(1996)；Ronaghi,Genome Res.11(1),3-11(2001)；Ronaghi等Science 281(5375),363(1998)；US 6,210,891；US 6,258,568和US.6,274,320，其每个通过引用并入本文)。在焦磷酸测序中，释放的PPi可通过由ATP硫酸化酶即时转化成腺苷三磷酸(ATP)来检测，并且产生的ATP的水平可经由荧光素酶产生的质子来检测。因此，测序反应可经由发光检测系统来监测。用于基于荧光的检测系统的激发放射源对于焦磷酸测序程序不是必需的。可以适用于将焦磷酸测序应用至根据本公开内容产生的扩增子的有用的流体系统、检测器和程序描述于例如WIPO专利申请系列号PCT/US11/57111、US 2005/0191698Al、US 7,595,883和US 7,244,559中，其每个通过引用并入本文。
一些实施方案可利用涉及DNA聚合酶活性的实时监测的方法。例如，核苷酸并入可通过携带荧光团的聚合酶和γ-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用来检测，或用零模波导(zeromode waveguide，ZMW)来检测。用于基于FRET的测序的技术和试剂描述于例如Levene等Science 299,682-686(2003)；Lundquist等Opt.Lett.33,1026-1028(2008)；Korlach等Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176–1181(2008)中，其公开内容通过引用并入本文。
一些SBS实施方案包括检测将核苷酸并入延伸产物后释放的质子。例如，基于检测释放的质子的测序可使用电子检测器和从Ion Torrent(Guilford,CT,a LifeTechnologies subsidiary)市售可得的相关技术，或描述于US 2009/0026082 A1；US2009/0127589 A1；US 2010/0137143 A1；或US 2010/0282617 A1中的测序方法和系统，其每个通过引用并入本文。本文描述的用于使用动力学排除扩增靶核酸的方法可容易地应用于被用来检测质子的基底。更具体地，本文描述的方法可被用来产生用于检测质子的扩增子的克隆群体。
另一个有用的测序技术是纳米孔测序(参见，例如，Deamer等TrendsBiotechnol.18,147-151(2000)；Deamer等Acc.Chem.Res.35:817-825(2002)；Li等Nat.Mater.2:611-615(2003)，其公开内容通过引用并入本文)。在一些纳米孔实施方案中，靶核酸或从靶核酸移除的单个核苷酸通过纳米孔。随着核酸或核苷酸通过纳米孔，每个核苷酸类型可通过测量孔的电导波动来鉴定。(美国专利号7,001,792；Soni等Clin.Chem.53,1996-2001(2007)；Healy,Nanomed.2,459-481(2007)；Cockroft等J.Am.Chem.Soc.130,818-820(2008)，其公开内容通过引用并入本文)。
可以被应用于根据本公开内容的检测的用于基于阵列的表达和基因分型分析的示例性方法描述于美国专利号7,582,420；6,890,741；6,913,884或6,355,431或美国专利公开号2005/0053980 A1；2009/0186349 A1或US 2005/0181440 A1，其每个通过引用并入本文。
其中正向和反向扩增寡核苷酸被共价固定到固体表面上的固相扩增反应的产物是如上文所描述的所谓的桥式结构。为了提供用于核酸询问程序诸如测序的更加合适的模板，例如，去除或者替代桥式结构中的固定的链中的一个的基本上全部或至少一部分以产生为至少部分单链的模板可以是有用的。为单链的模板的部分因此对于与测序引物的杂交将是可利用的。去除桥式双链核酸结构中的一个固定的链的全部或一部分的过程在本文中可以被称为线性化，并且进一步详细描述于WO07010251和US20090118128中，其内容通过引用全文并入本文。
桥式模板结构可以通过使用限制性核酸内切酶切割一条或两条链或者通过使用切刻核酸内切酶(nicking endonuclease)切割一条链而被线性化。其他切割方法可以被用作限制性酶或切刻酶的替代物，所述其他切割方法除其他之外包括化学切割(例如，用高碘酸盐切割二醇键)、通过使用核酸内切酶(例如由NEB,Ipswich,MA,USA提供的产品型号为M5505S的USER)切割或者通过暴露于热或碱的脱碱基位点的切割、并入原本包含脱氧核糖核苷酸的扩增产物的核糖核苷酸的切割、光化学切割或肽接头的切割。
切割步骤之后，不管用于切割的方法如何，切割反应的产物可以经历变性条件以去除未附接至固体支持物的被切割的链的部分。合适的变性条件，例如氢氧化钠溶液、甲酰胺溶液或热，将随着参考标准分子生物学方案对熟练读者是明显的(Sambrook等同上；Ausbel等同上)。变性导致产生为部分或基本上单链的测序模板。然后可以通过使测序引物杂交至模板的单链部分来起始测序反应。
多种固体支持物对于在本公开内容的方法中使用是可得的。例如，在一些实施方案中，固体支持物包括适于以有序的图案固定捕获引物的图案化的表面。“图案化的表面(patterned surface)”指在固体支持物的暴露层中或暴露层上不同区域的排列。例如，区域的一个或更多个可以是其中存在一个或更多个捕获引物的特征。特征可被其中不存在捕获引物的间隙区域分开。在一些实施方案中，图案可以是以行和列形式的x-y格式的特征。在一些实施方案中，图案可以是特征和/或间隙区域的重复排列。在一些实施方案中，图案可以是特征和/或间隙区域的随机排列。在一些实施方案中，捕获引物在固体支持物上随机地分布。在一些实施方案中，捕获引物在图案化的表面上分布。可以用于本文描述的方法和组合物中的示例性图案化的表面描述于美国系列号13/661,524或美国专利申请公开号2012/0316086 A1中，其每个通过引用并入本文。
在一些实施方案中，固体支持物包括表面中的孔或凹陷的阵列。如本领域普遍已知的，这可利用多种技术制造，所述技术包括但不限于光刻法、冲压技术、塑模技术和微蚀刻技术。如将被本领域人员所领会的，使用的技术将取决于阵列基底的组成和形状。
固体支持物的组成和几何结构可随其用途而不同。在一些实施方案中，固体支持物是平面结构，诸如载玻片、芯片、微芯片和/或阵列。如此，基底的表面可以是平面层的形式。在一些实施方案中，固体支持物包括流动池的一个或更多个表面。如本文使用的术语“流动池”指包含固体表面的室，一种或更多种流体试剂可流动穿过所述室。可在本公开内容的方法中容易地使用的流动池和相关流体系统和检测平台的实例被描述于例如Bentley等人,Nature 456:53-59(2008)；WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281和US 2008/0108082中，其每个通过引用并入本文。
在一些实施方案中，固体支持物或其表面是非平面的，诸如管或容器的内表面或外表面。在一些实施方案中，固体支持物包括微球或珠。本文中“微球”或“珠”或“颗粒”或语法上等同物是指小的离散颗粒。合适的珠成分包括但不限于塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁性材料、二氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、乳胶或交联的葡聚糖诸如Sepharose、纤维素、尼龙、交联的胶束和teflon，以及本文概述的用于固体支持物的任何其他材料可全部被使用。来自Bangs Laboratories,Fishers Ind.的“微球检测指南(Microsphere Detection Guide)”是有用的指南。在某些实施方案中，微球为磁性微球或珠。
珠不必是球形的；可使用不规则颗粒。可选地或另外地，珠可以是多孔的。珠尺寸范围从纳米即100nm至毫米即1mm，从约0.2微米至约200微米的珠是优选的，并且从约0.5至约5微米的珠是特别地优选的，尽管在一些实施方案中，可使用更小或更大的珠。
在某些实施方案中，本公开内容还提供了一种流动池，所述流动池具有固定至其的一种或更多种的多个捕获引物。一种多个捕获引物可以为靶特异性捕获引物。靶特异性捕获引物可以包括通用引物区域。另一种多个捕获引物可以为通用捕获引物。以上示例的多个捕获引物中的一种或两种可以被固定至流动池。
因此，本公开内容还涉及用于制备多个扩增子簇的流动池，其中所述流动池含有一种或更多种的多个固定的捕获引物的涂层。因此，如本文所描述的固体支持物可以出现在流动池的内部或者作为流动池的一部分，并且本文描述的方法可以在流动池中被执行。一种或更多种的多个捕获引物可以遍及整个流动池表面而不是在离散位置被涂覆，所述离散位置在每个小位置包含不同序列。流动池可以具有1cm2或更大的尺寸，其中整个1cm2或更大包括多个拷贝的捕获引物的涂层，该多个拷贝的捕获引物针对一种或更多种的多个捕获引物中的每一个。流动池由于以下事实可以与例如点制的阵列或光刻法合成的阵列区分开：寡核苷酸被附接至每一个表面：流动池室的顶部、底部、壁和端部，而非在单个平面表面上的阵列。但是，如果需要的话，在本文描述的方法中使用的流动池可以具有对寡核苷酸具有不同反应性的表面，使得寡核苷酸仅被附接至前面提及的表面中的一个或一个亚组，或甚至仅附接至这些表面中的一个亚组的区域。
在一些实施方案中，流动池可以用具有不同序列组成的三个多个捕获引物种类来涂覆，即如图1的图框3中所示的两种捕获引物种类和一种靶特异性捕获引物。此外，如图1的图框3中所示，靶特异性捕获引物可以包含通用引物区域，所述通用引物区域具有与所述两种多个捕获引物中的一种相同的序列。在某些实施方案中，流动池可以用不多于三种多个捕获引物种类来涂覆。但是，在其他特定实施方案中，流动池还可以包含一个或更多个其他多个捕获引物种类，无论是通用捕获引物、靶特异性捕获引物或其他种类的捕获引物。靶特异性捕获引物可以以比通用捕获引物更低的浓度存在，例如以至少100、1000或100,000倍更低的相对浓度存在。两种多个通用捕获引物可以以与彼此相似的比率存在，例如，差异小于两倍。考虑到本文提供的教导和指导，本领域技术人员将知晓什么配置的通用捕获引物和靶特异性捕获引物固定在流动池上以达到所需结果。
本公开内容还提供了一种用于增加核酸序列变异的检测灵敏度的方法。所述方法包括：(a)使包含多个靶多核苷酸的核酸样品与基因特异性正向引物和反向引物在足以用于杂交的条件下接触，所述基因特异性正向引物中的每种包含独特的序列标志和衔接子；(b)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述多个靶多核苷酸以产生多个扩增子；(c)使固定在固体支持物上的多个靶特异性捕获引物与所述多个扩增子在足以用于杂交的条件下直接接触以产生第一多个固定的扩增子，所述固体支持物还包含多个通用捕获引物；(d)延伸所述多个靶特异性捕获引物以产生与所述靶多核苷酸互补的多个固定的延伸产物；(e)使所述多个通用捕获引物退火至所述多个固定的延伸产物；(f)通过PCR扩增所述多个固定的延伸产物以产生第二多个固定的扩增子，其中所述第二多个固定的扩增子包含85％或更高的均一性；(g)对所述第二多个固定的扩增子测序，以及(h)通过在一个靶多核苷酸种类的一个变异位置处比较三个或更多个核苷酸序列消除一个或更多个靶多核苷酸的随机序列错误，其中所述靶多核苷酸种类通过所述独特的序列标志鉴定，从而确定所述一个或更多个靶多核苷酸中真正的核苷酸序列变异。
先前描述的方法也可以用于增加核酸序列变异的检测灵敏度。在核酸扩增和测序中，重要的是区分由这些程序中聚合酶失真导致的测序错误与例如真实序列。该区别对于鉴定天然存在于样品中的变异序列是特别重要的。区分真正的序列变异与随机核苷酸序列错误可以通过将独特的序列条码或标志与多个靶多核苷酸中的每个多核苷酸种类相关联来实现。
图5示出了用于每个靶多核苷酸种类的独特的标志的附接。图5示出了多个靶多核苷酸(在其中被标识为“模板”)。为了示例的目的，多个由三个成员组成，其中一个成员是真正的核苷酸变异(浅色星形)。独特的条码被添加到每个成员，并且多个被扩增以产生三种多个扩增子，所述三种多个扩增子的每种来源于独特地加条码的最初成员。所述三种多个的来源可以通过测序和鉴定条码来鉴定。每种多个中的成员的比较显示出发生在每个成员或大多数成员中的变异。相比之下，一种多个扩增子含有具有与多个扩增子的其余成员相比的序列差异的成员(深色星形)。由于该多个中的大多数成员不含有该核苷酸变化，该核苷酸变化的并入通过随机错误发生。
以上设计还适用于鉴定多个不同靶多核苷酸中的真正变异。如本文所公开的，一个靶多核苷酸种类是指具有相同序列的多个靶多核苷酸的成员。在该实施方案中，每个靶多核苷酸种类使用相同的独特标志鉴定，所述相同的独特标志区分该靶多核苷酸种类与其他靶多核苷酸种类(并且反之亦然)。因此，具有相同序列的靶多核苷酸(即，种类成员)具有相同标志。扩增和测序之后，种类成员可以通过具有相同标志被鉴定，并且与随机错误相比真正变异的出现可以基于与多个种类成员中的其他成员的序列比较来确定。
因此，先前描述的方法可以在用于扩增靶多核苷酸的基因特异性引物中进一步包括标志序列。因此，每个基因特异性引物将含有鉴定其对应的靶多核苷酸的独特标志。因此，对应于多个不同的靶多核苷酸的多个基因特异性引物可以被用于扩增所述多个不同的靶多核苷酸，并且导致独特鉴定的标志并入因此产生的多个扩增子中的每个所得的扩增子种类。
标志可以为与其他标志可区分的独特的核苷酸序列。标志也可以通过序列或在靶多核苷酸中的位置与多个多核苷酸中的其他核苷酸序列可区分。核苷酸标志可以是随机的或者特别设计的核苷酸序列。标志可以具有任何需要的序列长度，只要其具有足够长度以在群体的多个标志中和/或在待被分析或者询问的多个多核苷酸中为独特的核苷酸序列即可。在一些实施方案中，标志是范围从约8-30个核苷酸的的多核苷酸或多核苷酸中的区域。标志可以是例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸或更长。例如，标志可以是35、40、45或50个核苷酸或更长。
图7示出了将标志并入靶多核苷酸的一个示例性基因特异性引物设计。在该实施方案中，标志对应于基因特异性正向引物(GSF)上的实心灰色区域。使用引物对扩增将标志并入扩增子，所述引物对对应于其中所示的含有标志的基因特异性正向引物和基因特异性反向引物。图7进一步示出了标志并入之后的通过不对称扩增和随后的桥式扩增的继续扩增以及测序，所述测序使用对也通过GSF引入的引物结合位点特异性的测序引物。
图8示出了将标志并入靶多核苷酸的另一个示例性基因特异性引物设计。在该实施方案中，标志在第二扩增步骤中被并入。例如，初始扩增使用一对基因特异性正向(GSF)引物和反向(GSR)引物进行。所述引物中的一个或两个可以含有通用序列区域，诸如用于后续轮次的扩增的引物结合位点。在该实施方案中，标志也对应于实心灰色区域，并且虽然标志可以被包含在随后轮次的引物中的任一个中，但是其被示例为在结合至通过GSF并入的引物结合位点的引物(SBS3测序引物)中。使用如其中所示的对应于含有标志的引物和反向引物的引物对的扩增将标志并入扩增子中。图8进一步示出了标志并入之后通过不对称扩增和随后的桥式扩增的继续扩增以及测序，所述测序使用对引物结合位点特异性的测序引物，所述引物结合位点也通过在随后轮次的扩增中使用的引物被引入。该引物还可以含有第二引物结合位点，使得其在标志的上游与靶多核苷酸串联用于测序。
考虑到本文提供的教导和指导，本领域技术人员将知晓，本文公开的所有方法还可以使用并入靶特异性捕获引物中的独特标志进行，以增加核酸序列变异的检测灵敏度。
因此，本公开内容的方法提供了一种用于增加核酸序列变异的检测灵敏度的方法，其中多个靶多核苷酸包含10ng或更少的输入核酸。所述方法可以使足以用于杂交的条件包括持续10分钟或更少的孵育。所述方法还包括检测到变异核苷酸位置的0.3％或更低的错配率。
还提供了一种用于增加核酸序列变异的检测灵敏度的方法，其中接触具有多个靶多核苷酸的核酸样品的步骤包括使用第一基因特异性正向引物和反向引物的第一轮的PCR扩增以及使用与第一基因特异性正向引物的部分互补的第二正向引物的第二轮的PCR扩增，所述第二正向引物包含独特的序列标志和衔接子。衔接子可以与多个通用捕获引物互补。通用捕获引物可以被固定至固体支持物。
还提供了一种用于增加核酸序列变异的检测灵敏度的方法，其中多个靶多核苷酸的扩增包括不对称PCR。多个靶多核苷酸的扩增还可以包括多重扩增。多重扩增包括180重或更多重的多重性。
又还提供了一种用于增加核酸序列变异的检测灵敏度的方法，其中固体支持物还包含第二多个通用捕获引物。进一步地，多个靶特异性捕获引物还可以包含通用捕获引物区域。通用捕获引物区域可以具有对应于第二多个通用捕获引物或者与第二多个通用捕获引物互补的核苷酸序列。
还提供了一种用于增加核酸序列变异的检测灵敏度的方法，其中多个靶特异性捕获引物包括200种或更多种不同的核苷酸序列。所述方法包括在包括200种或更多种不同的核苷酸序列的多个靶多核苷酸内的序列变异检测。多个靶多核苷酸可以是多个基因组核酸。
另外提供了一种用于增加核酸序列变异的检测灵敏度的方法，固定的延伸产物的扩增包括桥式扩增。所述方法包括固体支持物，其中所述固体支持物可以为流动池。
还提供了一种用于增加核酸序列变异的检测灵敏度的方法，其中从扩增的多个靶多核苷酸产生的多个扩增子的测序包括50个测序循环。所述方法包括3小时或更少的从开始到结束的时间。
应理解，基本上不影响本公开内容的多个实施方案的活性的修改也可以被包括在本文提供的公开内容的定义中。因此，以下实施例旨在说明但不限制本发明。
实施例I
扩增子制备和测序程序
该实施例描述了用于扩增子制备和靶多核苷酸测序的整合程序。
简言之，将样品基因组DNA添加到100μl总体积的PCR反应混合物中，该PCR反应混合物含有50μl的KAPA 2X 2G多重PCR缓冲液(Kapa Biosystems,Wilmington,MA)、0.5μΜ的正向引物混合物(F)、0.02μΜ的反向引物混合物(R)、20个单位的KAPA 2G热启动酶(缓冲液(Kapa Biosystems,Wilmington,MA)和水。使用以下PCR程序进行扩增：在95℃孵育1分钟(min)，随后为30个循环的以下孵育：(1)97℃持续5秒(sec)；(2)58℃持续45sec；(3)72℃持续1min，和(4)保持在4℃。随后在如以下所描述的固定至流动池并成簇后，对PCR产物测序。
使用MiSeq benchtop测序仪(Illumina,San Diego,CA)进行捕获探针延伸、以上PCR产物的靶向成簇和测序。
对于该程序，在自动MiSeq运行之前在水中解冻MiSeq试剂盒筒(cartridge)(Illumina,San Diego,CA)大约30min，并且打开加热模块至95℃。另外，在冰上解冻HFE管(600μl(Illumina,San Diego,CA))，并制备1ml的0.1N NaOH溶液。在eppendorf管中用400μl的HT1缓冲液(Illumina,San Diego,CA)稀释PCR产物(100μl)。类似地，在单独的管中在600μl的HT1缓冲液中制备捕获探针模板。将去离子水添加到加热模块孔中，并且将以上两个管插入到孔中，缓慢摇晃(大约100rpm)5min。5min加热模块孵育之后，将管放置在冰上至少2min。将解冻的MiSeq筒翻转若干次以分散试剂并将试剂向下重新沉淀到底部。如下将试剂装载到MiSeq筒中：将PCR产物转移到筒中的#17管中；将捕获探针转移到#18管中，将HFE装载到#19管中，并且将0.1N NaOH添加到#20管中。将MiSeq筒、MiSeq FC(Illumina,SanDiego,CA)和用于MiSeq的PR2(Illumina,San Diego,CA)瓶装配到MiSeq测序仪上，并且根据制造商的推荐启动测序运行程序。装载制备的样品板(Javelin v.51 chemistry)，并且根据制造商的推荐在流动检查步骤之后启动延伸、靶向成簇和测序运行。
还使用Genome Analyzer(Illumina,San Diego,CA)进行捕获探针延伸、以上PCR产物的靶向成簇和测序。
对于该程序，通过在8联排管中混合HT1缓冲液与PCR产物(1至10μl的PCR产物分别加19至10μl的HT1缓冲液)，制备成簇和测序模板。在另一个8联排管中制备捕获探针(3-500pM)。将解冻的cBOT成对末端簇板v3(Illumina,San Diego,CA)放置到cBOT自动成簇系统上，并且使用运行命令(Run<Capture_Probe_Extension_Amp_LBH_v#>recipe)启动捕获探针延伸和扩增的程序。解冻一组标准基因组分析仪(GA)测序试剂(Illumina,San Diego,CA)(IMX、LFN、CLM、SMX)，并且将LFN的整管内容物添加到IMX管中，随后将HDP36添加到同一IMX管中。充分混合内容物。将所有试剂和缓冲液，包括PR1、PR2、PR3(Illumina,San Diego,CA)，以其指定的位置放置到GA上，随后使用GA命令<Prime_v#>recipe用试剂填装所有线路。分别用乙醇擦拭和镜头纸清洁流动池和棱镜，并且将棱镜重新插入到机器中。降低束流捕集器。将流动池恰当地放置在棱镜的顶部，并缓慢降低多支管(manifold)。通过以60μl/min的吸入速率和2000μl/min的分配速率人工泵入100μl溶液5(PR2)，确认试剂恰当的流入流动池中。将浸没油(135μl)应用在棱镜和流动池之间。关闭仪器门，并且使用GA命令Run<GA2_40cyle_10rows_SR_v8.3>recipe启动测序运行。
实施例II
由整合的制备和测序程序产生的序列质量
该实施例描述了使用多种浓度和类型的输入核酸的序列均一性和测序深度的比较。
将实施例I中描述的程序用于从靶多核苷酸的群体制备扩增子，并且通过多重测序确定它们的序列。图2示出了使用1ng和10ng的输入基因组DNA的结果。
均一性基于来自MiSeqReporter的每个扩增子的簇计算。对具有多于0.1平均值、0.2平均值、0.3平均值、0.5平均值的簇的扩增子的数目进行计数。例如，在0.2平均值下，多于80％的扩增子具有多于0.2平均值的数目的簇。
对于测序深度，对具有多于10/100/250/500个簇的扩增子的数目进行计数。例如，多于80％的扩增子具有至少500x的覆盖率。均一性和覆盖率是人们用于测量测序质量的典型度量。图2中所示的结果表明，使用1ng和10ng的基因组DNA可以得到高测序质量。
图3中示出了使用四个不同量的从福尔马林固定的石蜡包埋的组织获得的DNA的结果。如图所示，四个不同浓度在从1ng至50ng的范围内。
图3中所示的均一性和测序深度的结果进一步表明，对于宽范围的从福尔马林固定的石蜡包埋的组织获得的DNA可以获得高测序质量。指示具有指定质量的簇的数目的簇PF(通过滤波器(Passing Filter))密度是非常好的。特异性是多少读出为准确的度量。在本研究中实现了多于90％的特异性。
使用从来自正常人以及来自癌症患者的血浆中提取的无细胞DNA(cfDNA)进行另外的研究，并且获得类似结果。图4示出了使用从1ml的血浆中分离的10ng的cfDNA的结果。
就图2和3来说，均一性类似地基于来自MiSeqReporter的每个扩增子的簇计算。对具有多于0.1平均值、0.2平均值、0.3平均值、0.5平均值的簇的扩增子的数目进行计数。在0.2平均值下，多于80％的扩增子具有多于0.2平均值的数目的簇。
类似地，对于测序深度，对具有多于10/100/250/500个簇的扩增子的数目进行计数。所有扩增子具有至少500x的覆盖率。另外，表格插图中所示的簇PF密度和其他参数也非常好。结果表明得到93％的特异性，意味着93％的簇比对到正确的靶。另外，这些结果表明，可以直接从分离自血浆的无细胞DNA获得高测序质量。
实施例III
由整合的制备和测序程序产生的检测灵敏度
该实施例示出了靶多核苷酸群体中单个突变的检测准确度。
遵循本文描述的方法使用从Horizon Diagnostics获得的1.65ng的DNA以201多重形式(201重)制备文库并测序。下表中列出的突变被鉴定出，具有列出的指定频率。该DNA已经被Horizon Diagnostics使用数字PCR验证为具有特定频率的突变。1.65ng是大约500个单倍体基因组拷贝。在1％的比率下，存在大约5个拷贝的突变体。因此，该方法足够灵敏以在不同序列的群体中检测到5个拷贝的突变体。
同时检测多个突变体*
Figure GDA0001186981210000391
*具有突变的参考基因组DNA从Horizon Diagnostics获得。
**来自两个独立实验的结果。
实施例IV
用于确定真正序列变异和错误的独特的分子标志
该实施例描述独特的核苷酸标志区分靶多核苷酸序列中测序错误与真正变异的用途。
独特的分子条码(UMB)或随机核苷酸的标志(10-15N)被插入到PCR正向引物中的测序引物区域与基因特异性序列区域之间。通过进行2-4个循环的使用具有插入的UMB的PCR引物的PCR，将UMB引入模板DNA中。2-4个循环后，使用核酸外切酶1处理和SPRI珠清理来去除残留的UMB引物。使用包含通用衔接子序列的引物进行另外的30-35个循环的PCR。通过比较具有相同UMB的读出的序列进行数据分析。通过多于70％的UMB的序列确定碱基响应。只有具有多于2个拷贝的UMB在数据分析中才被考虑。如下文所示，在数据分析中不考虑来自UMB的信息的情况下，由PCR引起的噪声和测序错误可以高达0.24％。如果在数据分析中考虑来自UMB的信息，则可以去除所有噪声。并且实际突变体的观察到的频率更加接近0.05％的预期频率。
使用UMB区分信号与噪声
Figure GDA0001186981210000401
通过在野生型(A)中掺入PIK3CA H1047R突变体(G)基因组DNA获得的模板DNA。预期0.05％变异～10个分子(G)频率。
在此方面，图6示出了使用(右)和不使用(左)独特的分子条码校正的核苷酸错配率的比较。简言之，示出了在数据分析中考虑和不考虑来自UMB的信息的预期突变位点周围的20个位置的错配率。如图6所示，不考虑UMB，结果包括显著的非特异性噪声。噪声可以高达0.15％。在数据分析中考虑来自UMB的信息之后，所有噪声被去除。
遍及本申请，多种公开物都已经在括号中被提及。这些出版物的公开内容以其整体在此通过引用并入本申请，以便更全面地描述本公开内容所属领域的状态，所述出版物包括任何GenBank和GI号的出版物。
虽然本公开内容已经参考公开的实施方案被描述，本领域技术人员将容易地理解，上文详细描述的具体实施例和研究只是举例说明本公开内容。应理解，可以进行多种改变而不会偏离本公开内容的精神。因此，本公开内容仅由以下权利要求书来限制。

Claims (43)

1.一种用于扩增子制备的方法，所述方法包括：
(a)使包含多个靶多核苷酸的核酸样品与至少一种引物在足以用于杂交的条件下接触，其中所述至少一种引物中的正向引物或反向引物含有衔接子；
(b)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述多个靶多核苷酸以产生多个扩增子；
(c)使固定在固体支持物上的多个靶特异性捕获引物与所述多个扩增子在足以用于杂交的条件下直接接触以产生第一多个固定的扩增子，所述固体支持物还包含多个通用捕获引物；
(d)延伸所述多个靶特异性捕获引物以产生与所述第一多个固定的扩增子互补的多个固定的延伸产物，其中所述固定的延伸产物包含与所述通用捕获引物互补的衔接子部分；
(e)使所述多个通用捕获引物退火至所述多个所述固定的延伸产物；以及
(f)通过PCR扩增所述多个固定的延伸产物以产生第二多个固定的扩增子，其中所述固定的扩增子的群体包含85％或更高的均一性。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸包含10ng或更少的输入核酸。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述足以用于杂交的条件包括孵育10分钟或更少。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述直接接触步骤(c)包括未纯化的所述多个扩增子。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸的所述扩增包括不对称PCR。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一种引物包括两种引物，并且所述两种引物的至少一种含有所述衔接子。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸的所述扩增包括多重扩增。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述多重扩增包括180重或更多重的多重性。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述固体支持物还包含第二多个通用捕获引物。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述多个靶特异性捕获引物还包含通用捕获引物区域，并且其中所述通用捕获引物区域具有对应于所述第二多个通用捕获引物的核苷酸序列。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述多个靶特异性捕获引物包含200种或更多种不同的核苷酸序列。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸包含200种或更多种不同的核苷酸序列。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸包含多个基因组核酸。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述固定的延伸产物的所述扩增包括桥式扩增。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述固体支持物包含流动池。
16.如权利要求1所述的方法，所述方法还包括对所述第二多个固定的扩增子测序。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述测序包括50个循环。
18.如权利要求17所述的方法，其中从开始到结束的时间包括3小时或更少。
19.对一种或更多种不同的癌症特异性的多个靶特异性捕获引物和多个通用捕获引物在制备用于执行确定癌症相关基因的存在的方法的试剂盒中的用途，其中，所述方法包括以下步骤：
(a)使包含多个靶多核苷酸的核酸样品与至少一种引物在足以用于杂交的条件下接触，其中所述至少一种引物中的正向引物或反向引物含有衔接子；
(b)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述多个靶多核苷酸以产生多个扩增子；
(c)使固定在固体支持物上的所述对一种或更多种不同的癌症特异性的多个靶特异性捕获引物与所述多个扩增子在足以用于杂交的条件下直接接触以产生第一多个固定的扩增子，所述固体支持物还包含所述多个通用捕获引物；
(d)延伸所述多个靶特异性捕获引物以产生与所述第一多个固定的扩增子互补的多个固定的延伸产物，其中所述固定的延伸产物包含与所述通用捕获引物互补的衔接子部分；
(e)使所述多个通用捕获引物退火至所述多个所述固定的延伸产物；
(f)通过PCR扩增所述多个固定的延伸产物以产生第二多个固定的扩增子，其中所述固定的扩增子的群体包含85％或更高的均一性；以及
(g)对所述第二多个固定的延伸产物测序以确定癌症相关基因的存在或不存在。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述至少一种引物包含两种引物，并且所述两种引物的至少一种含有所述衔接子。
21.如权利要求19所述的用途，其中所述固体支持物还包含第二多个通用捕获引物。
22.如权利要求21所述的用途，其中所述多个靶特异性捕获引物还包含通用捕获引物区域，并且其中所述通用捕获引物区域具有对应于所述第二多个通用捕获引物的核苷酸序列。
23.如权利要求19所述的用途，其中所述多个靶特异性捕获引物包含200种或更多种不同的核苷酸序列。
24.如权利要求19所述的用途，其中所述多个靶特异性捕获引物包含用于捕获选自由以下组成的组的两个或更多个基因的不同的核苷酸序列：AKT1、CTNNB1、FLT3、KRAS、PTPN11、SRC、ALK、EGFR、GNAS、MLH1、RB1、STK11、ATM、ERBB2、HNF1A、MPL、RAD50、TP53、BRAF、ERBB4、IDH1、NRAS、RET、VHL、BRCA1、FBXW7、JAK3、PIK3CA、SMAD4、CDH1、FGFR2、KIT、PTEN、SMARCB1、ABL1、CSF1R、GNA11、JAK2、NOTCH1、SMO、APC、FGFR1、GNAQ、KDR、NPM1、CDKN2、FGFR3、HRAS、MET和PDGFRA。
25.如权利要求19所述的用途，其中所述多个靶特异性捕获引物包含用于捕获以下基因中的每个的核苷酸序列：AKT1、CTNNB1、FLT3、KRAS、PTPN11、SRC、ALK、EGFR、GNAS、MLH1、RB1、STK11、ATM、ERBB2、HNF1A、MPL、RAD50、TP53、BRAF、ERBB4、IDH1、NRAS、RET、VHL、BRCA1、FBXW7、JAK3、PIK3CA、SMAD4、CDH1、FGFR2、KIT、PTEN、SMARCB1、ABL1、CSF1R、GNA11、JAK2、NOTCH1、SMO、APC、FGFR1、GNAQ、KDR、NPM1、CDKN2、FGFR3、HRAS、MET和PDGFRA。
26.如权利要求19所述的用途，其中所述固体支持物包括流动池。
27.一种用于确定真正的核酸序列变异的方法，所述方法包括：
(a)使包含多个靶多核苷酸的核酸样品与基因特异性正向引物和反向引物在足以用于杂交的条件下接触，所述基因特异性正向引物中的每种包含衔接子和独特的序列标志；
(b)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述多个靶多核苷酸以产生多个扩增子；
(c)使固定在固体支持物上的多个靶特异性捕获引物与所述多个扩增子在足以用于杂交的条件下直接接触以产生第一多个固定的扩增子，所述固体支持物还包含多个通用捕获引物；
(d)延伸所述多个靶特异性捕获引物以产生与所述第一多个固定的扩增子互补的多个固定的延伸产物，其中所述固定的延伸产物包含与所述通用捕获引物互补的衔接子部分；
(e)使所述多个通用捕获引物退火至所述多个所述固定的延伸产物；
(f)通过PCR扩增所述多个固定的延伸产物以产生第二多个固定的扩增子，其中所述第二多个固定的扩增子包含85％或更高的均一性；
(g)对所述第二多个固定的扩增子测序；以及
(h)通过在一个靶多核苷酸种类的一个变异位置处比较三个或更多个核苷酸序列消除一个或更多个靶多核苷酸的随机序列错误，其中所述靶多核苷酸种类通过所述独特的序列标志鉴定，从而确定所述一个或更多个靶多核苷酸中真正的核苷酸序列变异。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸包含10ng或更少的输入核酸。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述足以用于杂交的条件包括孵育10分钟或更少。
30.如权利要求27所述的方法，其中检测到变异核苷酸位置的0.3％或更小的错配率。
31.如权利要求27所述的方法，其中接触步骤(a)包括使用第一基因特异性正向引物和反向引物的第一轮PCR扩增和使用与所述第一基因特异性正向引物的部分互补的第二正向引物的第二轮PCR扩增，第二正向引物包含所述独特的序列标志和所述衔接子。
32.如权利要求27所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸的所述扩增包括不对称PCR。
33.如权利要求27所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸的所述扩增包括多重扩增。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述多重扩增包括180重或更多重的多重性。
35.如权利要求27所述的方法，其中所述固体支持物还包含第二多个通用捕获引物。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述多个靶特异性捕获引物还包含通用捕获引物区域，并且其中所述通用捕获引物区域具有对应于所述第二多个通用捕获引物的核苷酸序列。
37.如权利要求27所述的方法，其中所述多个靶特异性捕获引物包含200种或更多种不同的核苷酸序列。
38.如权利要求27所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸包含200种或更多种不同的核苷酸序列。
39.如权利要求27所述的方法，其中所述多个靶多核苷酸包括多个基因组核酸。
40.如权利要求27所述的方法，其中所述固定的延伸产物的所述扩增包括桥式扩增。
41.如权利要求27所述的方法，其中所述固体支持物包括流动池。
42.如权利要求27所述的方法，其中所述测序包括50个循环。
43.如权利要求42所述的方法，其中从开始到结束的时间包括3小时或更少。
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