JP2023520203A - 核酸ライブラリを調製するための方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
複数の実施形態は、核酸ライブラリの調製に関する。いくつかの実施形態は、正規化された核酸ライブラリ、例えば、増幅された核酸の量が異なる量の入力核酸に対して実質的に同じであるライブラリの調製に関する。いくつかの実施形態は、ある特定のアダプターを用いたインデックス付き核酸ライブラリの調製に関する。核酸を修飾する方法であって、ポリメラーゼの存在下で前記核酸を増幅する又は伸長させることを含み、前記増幅及び/又は前記伸長が、無機ピロリン酸(PPi)を除去する、加ピロリン酸分解を阻害する、かつ/又はMg2+-PPi複合体の形成を阻害するのに好適な条件下で行われる、方法もまた提供される。
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、米国特許仮出願第63/001,684号(2020年3月30日出願)、表題「METHOD AND COMPOSITIONS FOR PREPARING NORMALIZED NUCLEIC ACID LIBRARIES」(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に対する優先権を主張する。
本出願は、米国特許仮出願第63/001,684号(2020年3月30日出願)、表題「METHOD AND COMPOSITIONS FOR PREPARING NORMALIZED NUCLEIC ACID LIBRARIES」(参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)に対する優先権を主張する。
(配列表の参照)
本出願は、電子フォーマットでのシーケンス表と共に出願されている。配列表は、ILLINC450WOSEQLISTと題されたファイル(2021年3月22日作成、およそ2Kbのサイズ)として提供される。シーケンス表の電子フォーマット中の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子フォーマットでのシーケンス表と共に出願されている。配列表は、ILLINC450WOSEQLISTと題されたファイル(2021年3月22日作成、およそ2Kbのサイズ)として提供される。シーケンス表の電子フォーマット中の情報は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
(発明の分野)
複数の実施形態は、核酸ライブラリの調製に関する。いくつかの実施形態は、正規化された核酸ライブラリ、例えば、増幅された核酸の量が異なる量の入力核酸に対して実質的に同じであるライブラリの調製に関する。いくつかの実施形態は、ある特定のアダプターを用いたインデックス付き核酸ライブラリの調製に関する。
複数の実施形態は、核酸ライブラリの調製に関する。いくつかの実施形態は、正規化された核酸ライブラリ、例えば、増幅された核酸の量が異なる量の入力核酸に対して実質的に同じであるライブラリの調製に関する。いくつかの実施形態は、ある特定のアダプターを用いたインデックス付き核酸ライブラリの調製に関する。
一般的な慣行として、下流分析用の核酸ライブラリを調製するために使用される生体サンプルは、各サンプルのカスタマイズされた手順に関係なく、標準化されたアッセイプロトコルに従って均一に処理される。多くの近代的な核酸分析技術の性能が入力核酸の核酸濃度に依存するため、重要な品質管理(quality control、QC)測定値は核酸ライブラリの核酸濃度である。かかる下流分析が、典型的には、高価な試薬を使用し、実施に多大なコスト高を招くため、核酸濃度要件及び/又は他のQC測定値を満たしていないサンプルは、サンプル調製が所望の用途に本質的に適していないと仮定して単に廃棄される。
例えば、ハイスループット配列決定としても知られている次世代配列決定(next-generation sequencing、NGS)用途では、多くの場合、実質的に均一なDNAモル濃度を有する核酸ライブラリを調製することが望ましいが、ロジスティック的に困難である。この問題は、多くの場合、複数の不均一な生体サンプルから構築された核酸ライブラリの調製時に、特に、望ましい供給源の生体サンプルが不均衡に不十分である場合に生じる。加えて、この問題は、標的核酸分子が、同じ生体サンプルに由来するなお他の核酸と比較して、比較的珍しい及び/又は不安定な核酸種である場合に生じる。ゲノムの異なる領域の表現が比較的同等であるため、ゲノムなどの供給源から核酸ライブラリを作製することは困難である。
いくつかの実施形態は、標的核酸を含む核酸ライブラリを正規化する方法であって、(a)正規化量の捕捉プローブが結合した基質を得ることであって、捕捉プローブが第1の増幅部位を含む、得ることと、(b)複数の標的核酸を捕捉プローブにハイブリダイズさせることと、(c)捕捉プローブを伸長させて、伸長されたプローブを得ることであって、伸長されたプローブが第2の増幅部位を含む、得ることと、(d)伸長プライマーを第2の増幅部位にハイブリダイズさせることによって伸長されたプローブを増幅することであって、伸長プライマーの量が捕捉プローブの正規化量以上であり、増幅が、実質的に全ての捕捉プローブが伸長されるように行われ、それにより、正規化量の増幅された標的核酸が得られる、増幅することと、を含み、第1の増幅部位と伸長プライマーが互いにハイブリダイズすることができないか、又は互いに本質的にハイブリダイズすることができない、方法を含む。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位と伸長プライマーは、互いに非相補的である。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位及び伸長プライマーは、互いに非相補的なヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、伸長プライマーとのハイブリダイゼーションを阻害する修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位及び伸長プライマーは各々、同じタイプのヌクレオチドを欠いている。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、互いに相補的なタイプのヌクレオチドを欠いており、伸長プライマーは各々、第1の増幅部位と本質的に同じタイプのヌクレオチドからなる。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、及びチミン(T)から選択される少なくとも1つのタイプのヌクレオチドを欠いている。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とチミン(T)又はグアニン(G)とシトシン(C)から選択されるヌクレオチドの組み合わせを欠いている。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とグアニン(G)、アデニン(A)とシトシン(C)、シトシン(C)とチミン(T)、又はグアニン(G)とチミン(T)から選択されるヌクレオチドの組み合わせからなる。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とグアニン(G)のヌクレオチドの組み合わせからなる。
いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、溶液中に存在する。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、第1のインデックス又は第1の配列決定プライマー部位を含む。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、第1の遺伝子座特異的プライマーを含む。
いくつかの実施形態では、複数の標的核酸は、第1の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズする。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブの伸長は、第1の遺伝子座特異的プライマーを第2の遺伝子座特異的プライマーにライゲーションすることを含む。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブの伸長は、(i)第2の遺伝子座特異的プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせることと、(ii)第1の遺伝子座特異的プライマーを第2の遺伝子座特異的プライマーにライゲーションすることとを含む。
いくつかの実施形態では、第2の遺伝子座特異的プライマーは、第2の増幅部位を含む。
いくつかの実施形態では、第2の遺伝子座特異的プライマーは、第2のインデックス又は第2の配列決定プライマー部位を含む。
いくつかの実施形態は、(iii)伸長オリゴヌクレオチドを第2の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズさせることと、(iv)第2の遺伝子座特異的プライマーを、ポリメラーゼ伸長によって伸長オリゴヌクレオチドに相補的な配列で伸長させることとも含む。
いくつかの実施形態では、伸長オリゴヌクレオチドは、第2の増幅部位に相補的な部位、第2のインデックスに相補的な部位、又は第2の配列決定プライマー部位に相補的な部位を含む。
いくつかの実施形態では、標的核酸は、第2の増幅部位に相補的な部位を含み、伸長は、標的核酸に相補的な配列での第1の遺伝子座特異的プライマーのポリメラーゼ伸長を含む。
いくつかの実施形態は、標的核酸の末端にアダプターを付加することによって標的核酸を調製することも含み、アダプターは、第2の増幅部位に相補的な部位を含む。
いくつかの実施形態では、アダプターの付加は、タグメンテーション反応を含む。
いくつかの実施形態では、基質は、複数のビーズを含む。
いくつかの実施形態では、基質は、フローセルを含む。
いくつかの実施形態では、増幅は、捕捉プローブの正規化量が増幅産物の量を制限するような条件下で行われる。
いくつかの実施形態は、増幅された標的核酸を配列決定することも含む。
いくつかの実施形態は、核酸ライブラリを調製する方法であって、(a)複数の捕捉プローブが結合した基質を得ることであって、捕捉プローブが第1の増幅部位及び第1の遺伝子座特異的プライマーを含む、得ることと、(b)複数の標的核酸を第1の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズさせることと、(c)第2の遺伝子座特異的プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせることと、(d)第2の遺伝子座特異的プライマーを伸長オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることであって、伸長オリゴヌクレオチドが第2の増幅サイトに相補的な部位を含む、ハイブリダイズさせることと、(e)(i)第1の遺伝子座特異的プライマーを第2の遺伝子座特異的プライマーにライゲーションすること、及び(ii)ライゲーションされた第2の遺伝子座特異的プライマーを、ポリメラーゼ伸長によって伸長オリゴヌクレオチドに相補的な配列で伸長させることによって、ハイブリダイズされた第2の遺伝子座特異的プライマーを伸長させて、複数の伸長されたプローブを得ることと、を含む、方法を含む。
いくつかの実施形態では、(i)は、第1の遺伝子座特異的プライマーを伸長させることと、第1の遺伝子座特異的プライマーを第2の遺伝子座特異的プライマーにライゲーションすることとを含む。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、第1のインデックス又は第1の配列決定プライマー部位を含む。
いくつかの実施形態では、伸長オリゴヌクレオチドは、第2のインデックスに相補的な部位又は第2の配列決定プライマー部位に相補的な部位を含む。
いくつかの実施形態では、基質は、複数のビーズを含む。
いくつかの実施形態では、基質は、フローセルを含む。
いくつかの実施形態は、正規化量の増幅された標的核酸を得ることであって、伸長プライマーを第2の増幅部位にハイブリダイズさせることによって伸長されたプローブを増幅することを含む、得ることも含み、基質は、正規化量の捕捉プローブを含み、伸長プライマーの量は、捕捉プローブの正規化量以上である。
いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、溶液中に存在する。
いくつかの実施形態では、増幅は、捕捉プローブの正規化量が増幅産物の量を制限するような条件下で行われる。
いくつかの実施形態は、増幅された標的核酸を配列決定することも含む。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位又は第2の増幅部位は、P5配列、P5配列の相補体、P7配列、又はP7配列の相補体を含む。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位と伸長プライマーは、互いにハイブリダイズすることができないか、又は互いに本質的にハイブリダイズすることができない。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位と伸長プライマーは、互いに非相補的である。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位及び伸長プライマーは、互いに非相補的なヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、伸長プライマーとのハイブリダイゼーションを阻害する修飾ヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位及び伸長プライマーは各々、同じタイプのヌクレオチドを欠いている。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、及びチミン(T)から選択される少なくとも1つのタイプのヌクレオチドを欠いている。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とチミン(T)又はグアニン(G)とシトシン(C)から選択されるヌクレオチドの組み合わせを欠いている。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とグアニン(G)、アデニン(A)とシトシン(C)、シトシン(C)とチミン(T)、又はグアニン(G)とチミン(T)から選択されるヌクレオチドの組み合わせからなる。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とグアニン(G)のヌクレオチドの組み合わせからなる。
いくつかの実施形態は、(a)複数の捕捉プローブ及び複数の伸長プライマーが結合した基質を得ることであって、捕捉プローブが第1の増幅部位及び第1の遺伝子座特異的プライマーを含み、伸長プライマーが第2の増幅部位にハイブリダイズすることができ、捕捉プローブ又は伸長プライマーの量が正規化量である、得ることと、(b)複数の標的核酸を第1の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズさせることと、(c)捕捉プローブを伸長させて、伸長されたプローブを得ることであって、伸長されたプローブが第2の増幅部位を含む、得ることと、(e)伸長されたプローブを伸長プライマーにハイブリダイズさせることによって伸長されたプローブを増幅して、正規化量の増幅された標的核酸を得ることと、を含む、方法を含む。
いくつかの実施形態では、正規化量は、増幅された標的核酸の量を制限する。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、第1のインデックス又は第1の配列決定プライマー部位を含む。
いくつかの実施形態では、伸長オリゴヌクレオチドは、第2のインデックスに相補的な部位又は第2の配列決定プライマー部位に相補的な部位を含む。
いくつかの実施形態では、増幅は、捕捉プローブ又は伸長プライマーの正規化量が増幅産物の量を制限するような条件下で行われる。
いくつかの実施形態では、基質は、複数のビーズを含む。
いくつかの実施形態では、基質は、フローセルを含む。
いくつかの実施形態では、増幅は、ブリッジ増幅を含む。
いくつかの実施形態は、増幅された標的核酸を配列決定することも含む。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブの伸長は、第1の遺伝子座特異的プライマーを第2の遺伝子座特異的プライマーにライゲーションすることを含む。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブの伸長は、(i)第2の遺伝子座特異的プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせることと、(ii)第1の遺伝子座特異的プライマーを第2の遺伝子座特異的プライマーにライゲーションすることとを含む。
いくつかの実施形態では、第2の遺伝子座特異的プライマーは、第2の増幅部位を含む。
いくつかの実施形態では、第2の遺伝子座特異的プライマーは、第2のインデックス又は第2の配列決定プライマー部位を含む。
いくつかの実施形態は、(iii)伸長オリゴヌクレオチドを第2の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズさせることと、(iv)第2の遺伝子座特異的プライマーを、ポリメラーゼ伸長によって伸長オリゴヌクレオチドに相補的な配列で伸長させることとも含む。
いくつかの実施形態では、伸長オリゴヌクレオチドは、第2の増幅部位に相補的な部位、第2のインデックスに相補的な部位、又は第2の配列決定プライマー部位に相補的な部位を含む。
いくつかの実施形態では、標的核酸は、第2の増幅部位に相補的な部位を含み、伸長は、標的核酸に相補的な配列での第1の遺伝子座特異的プライマーのポリメラーゼ伸長を含む。
いくつかの実施形態は、標的核酸の末端にアダプターを付加することによって標的核酸を調製することも含み、アダプターは、第2の増幅部位に相補的な部位を含む。
いくつかの実施形態では、アダプターの付加は、タグメンテーション反応を含む。
いくつかの実施形態は、標的核酸中のバリアントの存在又は不在を決定することも含む。
いくつかの実施形態は、インデックス付き核酸ライブラリを調製する方法であって、(a)Yアダプターを複数の標的核酸に付加することであって、Yアダプターが標的核酸の各々の第1の末端及び第2の末端に付加され、Yアダプターが各々、第1のプライマー結合部位及びモザイク要素を含む第1の鎖と、第2のプライマー結合部位及びモザイク要素の相補体を含む第2の鎖とを含む、付加することと、(b)第1の伸長オリゴヌクレオチドを第2のプライマー結合部位にハイブリダイズさせることであって、第1の伸長オリゴヌクレオチドが第1のインデックス及び第3のプライマー結合部位を含む、ハイブリダイズさせることと、(c)第2のプライマー結合部位を含む第2の鎖を伸長させ、それにより、第1のインデックスを標的核酸に付加することと、を含む、方法を含む。
いくつかの実施形態では、Yアダプターの第1の鎖の5’末端は、ヌクレアーゼ分解に耐性を示す。
いくつかの実施形態では、Yアダプターの第1の鎖の5’末端は、2つの連続するヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む。
いくつかの実施形態では、Yアダプターの第2の鎖の5’末端はリン酸化されている。
いくつかの実施形態では、(a)は、複数の標的核酸を複数のトランスポソームと接触させることを含み、トランスポソームは各々、Yアダプター及びトランスポザーゼを含む。
いくつかの実施形態では、トランスポソームは、ダイマーを含む。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Tn5トランスポザーゼを含む。
いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、基質に結合している。
いくつかの実施形態では、基質は、複数のビーズを含む。
いくつかの実施形態では、ビーズは磁性である。
いくつかの実施形態では、第1の伸長オリゴヌクレオチドの3’末端はブロックされている。
いくつかの実施形態では、第1の伸長オリゴヌクレオチドの5’末端はリン酸化されている。
いくつかの実施形態では、第1の伸長オリゴヌクレオチドは、ビーズに結合されている。
いくつかの実施形態は、(c)の前に第1の伸長オリゴヌクレオチドをビーズから切断することも含む。
いくつかの実施形態では、(c)は、ポリメラーゼ伸長を含む。
いくつかの実施形態では、(c)は、リガーゼでの伸長を含む。
いくつかの実施形態では、リガーゼでの伸長は、ライゲーションオリゴヌクレオチドを、第2のプライマー結合部位にハイブリダイズされた第1の伸長オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることと、ライゲーションオリゴヌクレオチドを、第2のプライマー結合部位を含む第2の鎖にライゲーションすることとを含む。
いくつかの実施形態では、ライゲーションオリゴヌクレオチドは、追加のインデックスを含む。
いくつかの実施形態では、ライゲーションオリゴヌクレオチドは、追加のプライマー結合部位を含む。
いくつかの実施形態は、工程(c)の後に第1の伸長オリゴヌクレオチドを除去することも含む。
いくつかの実施形態では、除去は、エキソヌクレアーゼ処理を含む。
いくつかの実施形態では、第1の伸長オリゴヌクレオチドは、ウラシルヌクレオチドを含み、除去は、ウラシル特異的切除試薬(uracil-specific excision reagent、USER)酵素による第1の伸長オリゴヌクレオチドの分解を含む。
いくつかの実施形態は、第1のインデックスを含む標的核酸を増幅することも含む。
いくつかの実施形態では、増幅は、増幅プライマーを第1のプライマー結合部位及び第3のプライマー結合部位にハイブリダイズさせることを含む。
いくつかの実施形態では、増幅は、PCRを含む。
いくつかの実施形態では、増幅は、ブリッジ増幅を含む。
いくつかの実施形態は、第2のインデックスを、第1のインデックスを含む標的核酸に付加することも含む。
いくつかの実施形態では、第2のインデックスの付加は、第2の伸長オリゴヌクレオチドを、第1のインデックスを含む標的核酸の第3のプライマー結合部位にハイブリダイズさせることであって、第2の伸長オリゴヌクレオチドが第2のインデックスを含む、ハイブリダイズさせることと、第3のプライマー結合部位を含む第2の鎖を伸長させ、それにより、第2のインデックスを、第1のインデックスを含む標的核酸に付加することとを含む。
いくつかの実施形態では、第2の伸長オリゴヌクレオチドの3’末端はブロックされている。
いくつかの実施形態では、第2の伸長オリゴヌクレオチドの5’末端はリン酸化されている。
いくつかの実施形態では、第3のプライマー結合部位を含む第2の鎖の伸長は、ポリメラーゼ伸長を含む。
いくつかの実施形態では、第3のプライマー結合部位を含む第2の鎖の伸長は、リガーゼでの伸長を含む。
いくつかの実施形態は、第3のプライマー結合部位を伸長させた後に第2の伸長オリゴヌクレオチドを除去することも含む。
いくつかの実施形態は、第3のインデックスを、第2のインデックスを含む標的核酸に付加することも含む。
いくつかの実施形態は、追加のインデックスを、第3のインデックスを含む標的核酸に付加することも含む。
いくつかの実施形態では、標的核酸は、ゲノムDNAを含む。
いくつかの実施形態は、複数の標的核酸をコンビナトリアルインデックス付けする方法であって、(a)一次インデックス付き核酸のプールを得ることであって、標的核酸を第1のインデックスで伸長させることによって第1のインデックスを標的核酸の複数の亜集団に付加することであって、異なる第1のインデックスが亜集団の各々に付加される、付加することと、異なる第1のインデックスを含む亜集団を組み合わせて、一次インデックス付き核酸のプールを得ることであって、第1のインデックスが前述の方法のうちのいずれか1つの方法に従って標的核酸の亜集団に付加される、得ることと、を含む、得ることと、(b)プールを一次インデックス付き核酸の複数の亜集団に分けることと、(c)二次インデックス付き核酸のプールを得ることであって、一次インデックス付き核酸を第2のインデックスで伸長させることによって第2のインデックスを一次インデックス付き核酸の複数の亜集団に付加することであって、異なる第2のインデックスが亜集団の各々に付加される、付加することと、異なる第2のインデックスを含む亜集団を組み合わせて、二次インデックス付き核酸のプールを得ることと、を含む、方法を含む。
いくつかの実施形態は、(b)及び(c)を繰り返すことと、追加のインデックスをインデックス付き亜集団に付加することとも含む。
いくつかの実施形態では、第1のインデックスの標的核酸の亜集団への付加は、ウェル、チャネル、又は液滴から選択される区画内で行われる。
いくつかの実施形態は、核酸を修飾する方法であって、ポリメラーゼの存在下で核酸を増幅する又は伸長させることを含む、方法を含む。
前述の方法のうちのいずれか1つのいくつかの実施形態は、増幅及び/又は伸長が、無機ピロリン酸(inorganic pyrophosphate、PPi)を除去する、加ピロリン酸分解を阻害する、かつ/又はMg2+-PPi複合体の形成を阻害するのに好適な条件下で行われる方法を含む。いくつかの実施形態では、PPiは、可溶性である。いくつかの実施形態では、増幅及び/又は伸長は、無機ピロホスファターゼの存在下で行われる。
いくつかの実施形態では、無機ピロホスファターゼの存在下で増幅及び/又は伸長の産物収量を達成する速度は、無機ピロホスファターゼの不在下で増幅及び/又は伸長の産物収量を達成する速度と比較して増加する。いくつかの実施形態では、増幅及び/又は伸長の産物収量を達成する速度は、少なくとも2倍増加する。
いくつかの実施形態では、増幅及び/又は伸長は、等温条件下で行われる。
いくつかの実施形態では、増幅及び/又は伸長は、PCR、ブリッジ増幅、全ゲノム増幅、ループ媒介等温増幅(loop-mediated isothermal amplification、LAMP)、単一細胞から得られた核酸からの増幅、合成による配列決定(sequencing by synthesis、SBS)反応、及び除外増幅(exclusion amplification、ExAMP)から選択される反応を行うことを含む。いくつかの実施形態では、増幅及び/又は伸長は、単一細胞から得られた核酸からの増幅を行うことを含む。いくつかの実施形態では、増幅及び/又は伸長は、合成による配列決定(SBS)反応を行うことを含む。いくつかの実施形態では、増幅及び/又は伸長は、ブリッジ増幅を行うことを含む。いくつかの実施形態では、配列決定反応は、増幅及び/又は伸長を含む。
複数の実施形態は、核酸ライブラリの調製に関する。いくつかの実施形態は、正規化された核酸ライブラリ、例えば、(増幅された)核酸の量が実質的に同じであるライブラリの調製に関する。いくつかの実施形態は、ある特定のアダプターを用いたインデックス付き核酸ライブラリの調製に関する。
いくつかの実施形態は、実質的に同様の量の標的核酸を有する正規化核酸ライブラリの調製に関する。いくつかのかかる実施形態では、実質的に同様の量の増幅された核酸を有する正規化された核酸ライブラリを調製した。いくつかの実施形態では、入力核酸は、ビーズに結合した捕捉プローブにハイブリダイズされ、捕捉プローブは、互いに相補的なタイプのヌクレオチドを欠く第1の増幅部位を含む。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、単一のタイプのヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とチミン(T)又はグアニン(G)とシトシン(C)から選択されるヌクレオチドの組み合わせを欠いている。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とグアニン(G)、アデニン(A)とシトシン(C)、シトシン(C)とチミン(T)、又はグアニン(G)とチミン(T)から選択されるヌクレオチドの組み合わせからなる。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とグアニン(G)のヌクレオチドの組み合わせからなる。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、1つのタイプのヌクレオチドからなり得る。
捕捉プローブは、ハイブリダイズされた入力核酸に相補的な配列で伸長され得る。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、重合によって伸長される。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、ハイブリダイズされた入力核酸に相補的なオリゴヌクレオチドと捕捉プローブとのライゲーションによって伸長される。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、重合及びライゲーションによって伸長される。伸長された捕捉プローブは、第2の増幅部位及び/又はサンプルインデックスを含み得る。
伸長された捕捉プローブは、溶液中の伸長プライマーを第2の増幅部位にハイブリダイズさせることによってビーズ上で増幅され得る。いくつかの実施形態では、伸長プライマーの量は、捕捉プローブの正規化量以上である。いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、第1の増幅部位と同じタイプのヌクレオチドから本質的になる。いくつかのかかる実施形態では、伸長プライマー及び捕捉プローブは、相補的なヌクレオチドを含まず、プライマーダイマーの形成などの伸長プライマーと捕捉プローブとの間の相互作用が減少する。ハイブリダイズされた伸長プライマーを伸長させることができ、産物をビーズ上の伸長されていない捕捉プローブにハイブリダイズさせることができる。伸長された捕捉プローブが増幅され、これにより、実質的に全ての捕捉プローブが伸長され、それにより、正規化量の増幅された標的核酸が得られるようになる。
いくつかの実施形態は、標的核酸を伸長させることによってアダプターが付加される核酸ライブラリの調製に関する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、第1の遺伝子座特異的プライマーを含む捕捉プローブにハイブリダイズされる。捕捉プローブは、ハイブリダイズされた標的核酸を第2の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズさせることによって伸長され得る。いくつかの実施形態では、第1の遺伝子座特異的プライマーと第2の遺伝子座特異的プライマーがライゲーションされ、それにより、捕捉プローブを伸長させることができる。いくつかの実施形態では、伸長プライマーを第2の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズさせ、かつ伸長プライマーに相補的な配列で第2の遺伝子座特異的プライマーを伸長させることによって、第2の遺伝子座特異的プライマーを伸長させることができる。いくつかの実施形態では、サンプルインデックスは、伸長工程により導入される。
ある特定の定義
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」とは、相補的な塩基鎖対合を介して結合する核酸分子の能力を指すことができる。かかるハイブリダイゼーションは、核酸分子が適切な条件下及び/又は状況下で接触したときに生じ得る。本明細書で使用される場合、2つの核酸分子は、それらの2つの分子が逆平行二本鎖核酸構造を形成することができる場合、互いに特異的にハイブリダイズすることができるといわれる。核酸分子は、それらが完全な相補性を呈する場合、別の核酸分子の「相補体」であるといわれる。本明細書で使用される場合、核酸分子は、それらの分子のうちの1つの全てのヌクレオチドが他方の塩基対合パートナーヌクレオチドに相補的である場合、「完全な相補性」を呈するといわれる。2つの分子は、それらが少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールされた状態を保つことを可能にするのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができる場合、「最小限に相補的」であるといわれる。いくつかの事例では、それらの分子は、それらが従来の「高ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールされた状態を保つことを可能にするのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができる場合、「相補的」であるといわれる。例えば、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、他の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子は、他の核酸分子の「ハイブリダイズ可能な同族体」であるといわれる。従来のストリンジェンシー条件は、Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Handbook,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、及びHaymes et al.In:Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,IRL Press,Washington,D.C.(1985)に記載されており、それらは各々、本明細書で論じられる本開示のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、完全な相補性からの逸脱は、かかる逸脱が二本鎖構造を形成するそれらの分子の能力を完全に妨げない限り、いくつかの実施形態では許容される。したがって、いくつかの実施形態で本開示の核酸分子又はその断片がプライマー又はプローブとしての機能を果たすために、核酸分子は、用いられる特定の溶媒及び塩濃度下で安定した二本鎖構造を形成することができるように配列が十分に相補的であれば十分である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸は、それらの標的に完全に相補的である。
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」とは、相補的な塩基鎖対合を介して結合する核酸分子の能力を指すことができる。かかるハイブリダイゼーションは、核酸分子が適切な条件下及び/又は状況下で接触したときに生じ得る。本明細書で使用される場合、2つの核酸分子は、それらの2つの分子が逆平行二本鎖核酸構造を形成することができる場合、互いに特異的にハイブリダイズすることができるといわれる。核酸分子は、それらが完全な相補性を呈する場合、別の核酸分子の「相補体」であるといわれる。本明細書で使用される場合、核酸分子は、それらの分子のうちの1つの全てのヌクレオチドが他方の塩基対合パートナーヌクレオチドに相補的である場合、「完全な相補性」を呈するといわれる。2つの分子は、それらが少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールされた状態を保つことを可能にするのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができる場合、「最小限に相補的」であるといわれる。いくつかの事例では、それらの分子は、それらが従来の「高ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールされた状態を保つことを可能にするのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができる場合、「相補的」であるといわれる。例えば、少なくとも低ストリンジェンシー条件下で、他の核酸分子にハイブリダイズする核酸分子は、他の核酸分子の「ハイブリダイズ可能な同族体」であるといわれる。従来のストリンジェンシー条件は、Sambrook et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Handbook,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)、及びHaymes et al.In:Nucleic Acid Hybridization,A Practical Approach,IRL Press,Washington,D.C.(1985)に記載されており、それらは各々、本明細書で論じられる本開示のために参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。したがって、完全な相補性からの逸脱は、かかる逸脱が二本鎖構造を形成するそれらの分子の能力を完全に妨げない限り、いくつかの実施形態では許容される。したがって、いくつかの実施形態で本開示の核酸分子又はその断片がプライマー又はプローブとしての機能を果たすために、核酸分子は、用いられる特定の溶媒及び塩濃度下で安定した二本鎖構造を形成することができるように配列が十分に相補的であれば十分である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される核酸は、それらの標的に完全に相補的である。
本明細書で使用される場合、「核酸分子」及び「ポリヌクレオチド」は、本明細書で互換的に使用され、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA、及び核酸類似体を含むDNA又はRNA分子を含む核酸分子などのRNA分子及びDNA分子の両方を指す。核酸分子は、任意の三次元構造を有することができる。核酸分子は、二本鎖又は一本鎖(例えば、センス鎖又はアンチセンス鎖)であり得る。核酸分子の非限定的な例には、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(messenger RNA、mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、siRNA、マイクロRNA、tracrRNA、crRNA、ガイドRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、核酸プローブ、及び核酸プライマーが挙げられる。核酸分子は、非従来型ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される「ポリヌクレオチド配列」及び「核酸配列」という用語は、本明細書で互換的に使用され、ポリヌクレオチド分子の配列を指す。米国特許法施行規則第1.822条に記載のヌクレオチド塩基の命名法が本明細書で使用される。
本明細書で使用される場合、「核酸サンプル」という用語は、核酸分子の収集物を指す。いくつかの実施形態では、核酸サンプルは、単一の生物学的源、例えば、1つの個体又は1つの組織サンプル由来のものであり、他の実施形態では、核酸サンプルは、例えば、2つ以上の生物、個体、又は組織由来の核酸を含むプールされたサンプルである。
本明細書で使用される場合、「核酸サンプル」は、本明細書で使用される、当該技術分野で既知の任意の方法によって調製された核酸ライブラリを含む「核酸ライブラリ」を包含する。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリの提供は、例えば、宿主のベクターへのライゲーション及び形質転換などによって、1つ以上の核酸サンプルをベクターベースの収集物に組み込むプロセスを含む、ライブラリを調製するのに必要な工程を含む。いくつかの実施形態では、核酸ライブラリの提供は、アダプターへのライゲーションなどによって、核酸サンプルをベクターベースではない収集物に組み込むプロセスを含む。いくつかの実施形態では、アダプターは、PCRプライマーにアニールしてPCRによる増幅を促進することができるか、又は、例えば、配列決定テールアダプターなどのユニバーサルプライマー領域であり得る。いくつかの実施形態では、アダプターは、ユニバーサル配列決定アダプターであり得る。
本明細書で使用される場合、「実質的に」は、本明細書に照らして読まれるその通常の意味を有し、例えば、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%を意味することができる。
増幅産物の正規化
いくつかの実施形態は、正規化量の増幅産物を有する核酸ライブラリの調製に関する。例えば、異なる標的核酸から得られたある特定の増幅産物の量は、増幅産物間で実質的に同じであり得る。いくつかの実施形態では、正規化された核酸ライブラリの核酸量は、約30%、20%、10%、5%、3%、2%、又は1%未満異なる。いくつかの実施形態では、正規化された核酸ライブラリの核酸量は、約2倍、3倍、4倍、又は5倍未満異なる。いくつかの実施形態では、プールされた核酸ライブラリは、結果として得られたプールされた核酸ライブラリ中の構成核酸の量が入力核酸の量に関係なく実質的に同様である量で生成される。いくつかの実施形態では、プールされた核酸ライブラリ中の構成核酸の量は、約30%、20%、10%、5%、3%、2%、又は1%未満異なる。いくつかの実施形態では、プールされた核酸ライブラリ中の構成核酸の量は、約2倍、3倍、4倍、又は5倍未満異なる。
いくつかの実施形態は、正規化量の増幅産物を有する核酸ライブラリの調製に関する。例えば、異なる標的核酸から得られたある特定の増幅産物の量は、増幅産物間で実質的に同じであり得る。いくつかの実施形態では、正規化された核酸ライブラリの核酸量は、約30%、20%、10%、5%、3%、2%、又は1%未満異なる。いくつかの実施形態では、正規化された核酸ライブラリの核酸量は、約2倍、3倍、4倍、又は5倍未満異なる。いくつかの実施形態では、プールされた核酸ライブラリは、結果として得られたプールされた核酸ライブラリ中の構成核酸の量が入力核酸の量に関係なく実質的に同様である量で生成される。いくつかの実施形態では、プールされた核酸ライブラリ中の構成核酸の量は、約30%、20%、10%、5%、3%、2%、又は1%未満異なる。いくつかの実施形態では、プールされた核酸ライブラリ中の構成核酸の量は、約2倍、3倍、4倍、又は5倍未満異なる。
正規化された核酸ライブラリを調製するいくつかの実施形態は、増幅プライマーが限られた量で提供され、かつ他の増幅試薬が非限定的な量で提供される増幅条件を提供することを含み得る。いくつかのかかる実施形態では、増幅産物の量は、限定された増幅プライマーの量に従って制限される。いくつかのかかる実施形態では、2つ以上の増幅反応が行われ得、各増幅反応により他の増幅反応(複数可)と実質的に同じ量の増幅産物がもたらされ得る。
いくつかの実施形態では、複数の捕捉プローブ及び複数の伸長プライマーが結合した基質が提供され得る。いくつかの実施形態では、基質は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、基質は、平面基質である。いくつかの実施形態では、平面基質は、ウェルなどの分離した部位を含む。いくつかの実施形態では、基質は、複数のビーズを含み得る。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、第1の増幅部位を含み得る。増幅部位は、増幅プライマーに対する結合部位を含み得る。いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、第2の増幅部位にハイブリダイズすることができる部位を含み得る。いくつかの実施形態では、第1及び第2の増幅プライマーからの標的核酸の増幅により正規化量の増幅産物がもたらされるように、捕捉プローブ又は伸長プライマーが正規化量で提供され得る。例えば、増幅産物の量が捕捉プローブの量によって制限されるように、捕捉プローブの量が伸長プライマーの量以下で提供され得るか、又は増幅産物の量が伸長プライマーの量によって制限されるように、伸長プライマーの量が捕捉プローブの量以下で提供され得る。
いくつかの実施形態では、核酸サンプルが捕捉プローブにハイブリダイズされ得、捕捉プローブが伸長されて、伸長されたプローブが生成され得る。いくつかの実施形態では、伸長されたプローブは、伸長プライマーにハイブリダイズすることができる第2の増幅部位を含み得る。いくつかの実施形態では、伸長されたプローブは、伸長されたプローブを伸長プローブにハイブリダイズさせることによって増幅され得、伸長プローブが伸長され得、その後の産物が捕捉プローブ及び伸長プライマーにハイブリダイズされ得る。いくつかの実施形態では、増幅は、ブリッジ増幅を含み得る。
標的核酸を含む核酸ライブラリを正規化するいくつかの実施形態は、正規化量の捕捉プローブ及び複数の伸長プライマーが結合した基質を得ることを含み得る。いくつかの実施形態では、基質は、複数のビーズを含む。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、第1の増幅部位を含み、伸長プライマーに本質的にハイブリダイズすることができないか、又は本質的にハイブリダイズすることができない。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位と伸長プライマーは、互いに非相補的である。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位及び伸長プライマーは、互いに非相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、伸長プライマーとのハイブリダイゼーションを阻害する修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位及び伸長プライマーは各々、同じタイプのヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、互いに相補的なタイプのヌクレオチドを欠く第1の増幅部位を含む。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とチミン(T)又はグアニン(G)とシトシン(C)から選択されるヌクレオチドの組み合わせを欠いている。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とグアニン(G)、アデニン(A)とシトシン(C)、シトシン(C)とチミン(T)、又はグアニン(G)とチミン(T)から選択されるヌクレオチドの組み合わせからなる。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とグアニン(G)のヌクレオチドの組み合わせからなる。いくつかの実施形態では、プライマーは、ダイマー形成を防止する擬似相補的塩基又は塩基及び修飾を含み得る。
いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、第2の増幅部位にハイブリダイズすることができる部位を含む。いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、第1の増幅部位と同じタイプのヌクレオチドから本質的になる。いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、第1の増幅部位と同じタイプのヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、溶液中に存在する。
いくつかの実施形態は、複数の標的核酸を捕捉プローブにハイブリダイズさせることと、捕捉プローブを伸長させて、伸長されたプローブを得ることとを含む。いくつかの実施形態では、伸長されたプローブは、伸長されたプローブを伸長プローブにハイブリダイズさせることによって増幅され得、伸長されたプローブが伸長され得、その後の産物が捕捉プローブ及び伸長プライマーにハイブリダイズされ得る。いくつかの実施形態では、増幅は、ブリッジ増幅を含み得る。いくつかの実施形態では、伸長プライマーの量は、捕捉プローブの正規化量以上であり、増幅は、実質的に全ての捕捉プローブが伸長されて、正規化量の増幅された標的核酸が得られるように行われる。
いくつかの実施形態では、DNAが全ゲノム増幅を使用して増幅され、捕捉プローブにハイブリダイズされ、増幅可能な標的ライブラリの形成、正規化により限定された増幅、及び正規化された標的配列決定ライブラリの配列決定がもたらされる。
いくつかの実施形態では、標的配列ライブラリの分析のための工程が含まれる。例えば、配列決定は、一塩基多型及びバリアントの分析のために捕捉プローブ及びゲノムDNAを含み得る。捕捉プローブの配列決定により、標的領域、バリアント、及びサンプルインデックス又はバーコードが特定され得る。いくつかの実施形態では、分析は、参照ゲノムとの配列決定リードの整列を含まない。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、第1のインデックスを含み得、かつ/又は伸長プライマーは、第2のインデックスに相補的な配列を含み得る。インデックスは、核酸の供給源を特定することができる配列を含み得る。例えば、インデックスは、標的核酸の供給源をある特定のサンプルに特定することができる。いくつかの実施形態では、インデックスは、標的核酸の増幅産物の供給源を核酸のある特定のサンプルに特定することができる。いくつかの実施形態では、インデックスは、50、40、30、20、10、又は5個未満の連続するヌクレオチド、又は前述の数のうちのいずれか2つの間の数のヌクレオチドを含み得る。
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、第1の配列決定プライマー部位を含み得、かつ/又は伸長プライマーは、第2の配列決定プライマー部位に相補的な配列を含み得る。配列決定プライマー部位は、配列決定プライマーに対する結合部位を含み得る。配列決定プライマー部位の例には、配列P5、P7、又はそれらの相補体を有する核酸が挙げられる。
プライマーP5 AAT GAT ACG GCG ACC ACC GA(配列番号1)
プライマーP7 CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT(配列番号2)
いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、第1の遺伝子座特異的プライマーを含み得る。第1の遺伝子座特異的プライマーは、標的核酸中の第1の遺伝子座結合部位に結合することができる核酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、標的核酸を捕捉プローブの第1の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズさせ、かつ第2の遺伝子座特異的プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせることによって伸長され得る。いくつかの実施形態では、第1の遺伝子座特異的プライマーと第2の遺伝子座特異的プライマーは、互いに隣接する標的核酸上の位置で結合する。いくつかの実施形態では、第1の遺伝子座特異的プライマーと第2の遺伝子座特異的プライマーが結合する標的核酸上の位置は、標的核酸上で、200、100、50、40、30、20、105、1個未満の連続するヌクレオチド分だけ離れた位置、又は標的核酸上で前述の数のうちのいずれか2つの間の任意の数のヌクレオチド分だけ離れた位置である。いくつかの実施形態では、捕捉プローブの伸長は、第1の遺伝子座特異的プライマーを第2の遺伝子座特異的プライマーにライゲーションすることを含み得る。いくつかの実施形態では、捕捉プローブの伸長は、第1の遺伝子座特異的プライマーをポリメラーゼで伸長させることと、第1の遺伝子座特異的プライマーを第2の遺伝子座特異的プライマーにライゲーションすることとを含み得る。いくつかの実施形態では、捕捉プローブの伸長は、第1の遺伝子座特異的プライマーをポリメラーゼで伸長させることを含み得る。
いくつかの実施形態では、第2の遺伝子座特異的プライマーは、第2の増幅部位を含み得る。いくつかの実施形態では、第2の遺伝子座特異的プライマーは、第2のインデックスを含み得る。いくつかの実施形態では、第2の遺伝子座特異的プライマーは、第2の配列決定プライマー部位を含み得る。
いくつかの実施形態では、アダプターが第2の遺伝子座特異的プライマーに付加され得る。アダプターは、第2の増幅部位、第2のインデックス、及び/又は第2の配列決定プライマー部位を含み得る。いくつかの実施形態では、アダプターは、第2の遺伝子座特異的プライマーへのライゲーション又は伸長及びライゲーションによって付加され得る。いくつかの実施形態では、伸長オリゴヌクレオチドは、第2の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズされ得る。伸長オリゴヌクレオチドは、第2の増幅部位、第2のインデックス、及び/又は第2の配列決定プライマー部位に相補的な配列を含み得る。第2の遺伝子座特異的プライマーは、伸長オリゴヌクレオチドに相補的な配列で伸長され得、それにより、第2の増幅部位、第2のインデックス、及び/又は第2の配列決定プライマー部位を含むことができる。いくつかの実施形態では、標的核酸が第1の遺伝子座特異的プライマー及び第2の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズされ、伸長オリゴヌクレオチドが第2の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズされる。いくつかの実施形態では、伸長オリゴヌクレオチドが第2の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズされるのと同時に、標的核酸が第1の遺伝子座特異的プライマー及び第2の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズされる。いくつかの実施形態では、伸長オリゴヌクレオチドが第2の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズされる前に、標的核酸が第1の遺伝子座特異的プライマー及び第2の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズされる。いくつかの実施形態では、伸長オリゴヌクレオチドが第2の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズされた後に、標的核酸が第1の遺伝子座特異的プライマー及び第2の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズされる。いくつかの実施形態では、第1の遺伝子座特異的プライマーはポリメラーゼ及び/又はリガーゼを使用して伸長され、第2の遺伝子座特異的プライマーに結合され、第2の遺伝子座特異的プライマーはポリメラーゼで伸長される。
一実施形態例が図1(パネルA)に示されており、ここで、捕捉プローブがビーズに結合しており、捕捉プローブは、増幅部位(P5)、第1の配列決定プライマー部位(first sequencing primer site、CS1)、インデックス、及び目的とする一塩基多型(single nucleotide polymorphism、SNP)又は挿入/欠失の1塩基上流に設計された第1の遺伝子座特異的プローブ(first locus specific probe、LSP1)を含む。ビーズは、P5又はP7などの配列決定アダプターを含む高濃度の伸長プライマーでグラフトされてもいる。言うまでもなく、他の配列決定アダプターが企図されることを理解されたい。捕捉プローブは、標的核酸へのハイブリダイゼーション、並びに第2の遺伝子座特異的プローブ(second locus specific probe、LSP2)及びP7配列に相補的な配列(P7’)を含むオリゴヌクレオチドとのライゲーションによって伸長される。伸長された捕捉プローブは、ビーズ上で増幅される。図1(パネルB)は、ブリッジ増幅、等温リコンビナーゼ支援増幅、又は任意の他の種類のクローン増幅を含む代替の増幅工程を要約する。各ビーズ表面上の配列決定アダプターの密度が、クラスター化反応の完了後の最終ライブラリの濃度を決定する。クラスター化時間は、初期標的捕捉伸長効率に関係なく、ビーズ表面上のP5/P7プライマーの完全利用に達するように最適化されている。その後、増幅されたライブラリがビーズから除去され、差次的インデックス付きサンプルがプールされ、クラスター化され、アッセイの複雑さに応じて適切なプラットフォーム上で配列決定される。図1(パネルB)は、ビーズ上の捕捉プローブにハイブリダイズされた異なる量の標的核酸を有する3つのビーズを示し、ビーズ上の増幅により正規化量の増幅産物がもたらされる。ビーズ表面上の配列決定アダプターの所定の量又は密度を選択することにより、そのビーズ上で増幅されたときに特定のアンプリコンの最終濃度を変化させることができる。
一実施形態例が図2に示されており、ここで、ゲノムDNA(genomic DNA、gDNA)がトランスポソームでタグメント化されている。タグメンテーション反応によりgDNAが断片化され、DNA断片にアダプターが付加される。アダプターは、P7配列、第1のインデックス、及び共通プライマー部位(CS2)を含む。断片の末端がギャップ埋めされ、断片はPCRによって増幅される。増幅された断片は、ビーズに結合した捕捉プローブとハイブリダイズする。捕捉プローブは、P5配列、共通プライマー部位(CS1)、第2のインデックス、及び第1の遺伝子座特異的プライマー(LSP1)を含む。LSP1は、目的とする一塩基多型(星型)のすぐ上流に結合するように設計されている。P7配列及び/又はP5配列を含む伸長プライマーは、ビーズに結合している。非結合ライブラリがストリンジェントな洗浄により洗浄され、遺伝子座特異的プローブが高忠実度DNAポリメラーゼにより伸長されて、SNP、下流領域、及び第2の配列決定アダプターをインデックスでコピーする(CS2’_インデックス’_P7’)。標的DNA鎖を除去した後、図1に示されるように、伸長された鎖が同じビーズ上でのクラスター化によって正規化される。
別の実施形態例が図3に示されており、ここで、gDNAが最小限のアダプター配列を含むTDE1トランスポソームでタグメント化されている。タグメンテーション反応によりgDNAが断片化され、最小限のアダプターが断片の末端に付加され、アダプターがモザイク要素(mosaic element、ME)及び共通配列(common sequence、CS)並びにそれらの相補体を含むようになる。タグメンテーション及びギャップ埋めを行った後、初期ライブラリがCS部位を介してPCRによって予備増幅される。変性したライブラリがビーズに結合した捕捉プローブにハイブリダイズされ、捕捉プローブが、P5配列、第1の共通配列(first common sequence、CS1)、インデックス、及び第1の遺伝子座特異的プローブ(LSP1)を含むようになる。LSP1は、目的とするSNP(星形)のすぐ上流の標的核酸に結合するように設計されている。5’リン酸化末端、第2の遺伝子座特異的プライマー(LSP2)、第2の共通配列の相補体(CS2’)、及びP7配列の相補体(P7’)を含む伸長プライマーが、SNPの1塩基又は2~3塩基下流にハイブリダイズされる。非結合ライブラリ及び過剰な伸長プライマーがストリンジェントな洗浄により洗浄され、捕捉プローブのLSP1がSNP上で伸長され、伸長プライマーの下流LSP2にライゲーションされる。配列決定アダプターを含むようになった結果として得られたライブラリ鎖が洗浄され、同じビーズ上でクラスター化される。あるいは、入力DNAがT7又はSP6プロモーター配列を含むTSMでタグメント化され、インビトロ転写(in vitro transcription、IVT)によって増幅され得る。
更に別の実施形態例が図4Aに示されており、ここで、gDNAがT7配列を含むトランスポソームでタグメント化されている。タグメンテーション反応によりgDNAが断片化され、断片の末端にアダプターが付加される。アダプターは、T7配列及びME配列、並びにそれらの相補体を含む。断片がインビトロ転写によって増幅されて、複数のRNAが得られる。RNAがビーズに結合した捕捉プローブにハイブリダイズされ、捕捉プローブが、P5配列、第1の共通配列(CS1)、インデックス、及び第1の遺伝子座特異的プローブ(LSP1)を含むようになる。LSP1は、目的とするSNP(星形)のすぐ上流の標的核酸に結合するように設計されている。5’リン酸化末端、第2の遺伝子座特異的プライマー(LSP2)、第2の共通配列の相補体(CS2’)、及びP7配列の相補体(P7’)を含む伸長プライマーが、SNPの1塩基又は2~3塩基下流にハイブリダイズされる。捕捉プローブが逆転写酵素で伸長され、伸長された捕捉プローブが伸長プライマーにライゲーションされる。配列決定アダプターを含むようになった結果として得られたライブラリ鎖が洗浄され、同じビーズ上でクラスター化される。
別の実施形態例が図4Bに示されており、ここで、gDNAがT7配列を含むトランスポソームでタグメント化されている。タグメンテーション反応によりgDNAが断片化され、断片の末端にアダプターが付加される。アダプターは、T7配列及びME配列、ならびにそれらの相補体を含む。断片がインビトロ転写によって増幅されて、複数のRNAが得られる。RNAが、P5配列、第1の共通配列(CS1)、インデックス、及び第1の遺伝子座特異的プローブ(LSP1)を含むオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされる。LSP1は、目的とするSNP(星形)のすぐ上流の標的核酸に結合するように設計されている。ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドは、逆転写(RT)によって伸長される。伸長産物は、第2の遺伝子座特異的プライマー(LSP2)に結合する伸長産物中の領域を介してフローセルに結合した捕捉プローブにハイブリダイズされる。捕捉プローブは、P7配列及び第2のLSP2を含む。捕捉プローブが伸長され、伸長された捕捉プローブは、クラスター増幅、例えば、ブリッジ増幅などの固相増幅によって増幅される。
もう1つの実施形態例が図5に示されており、ここで、目的とするSNP(星形)を含む増幅された標的核酸がビーズに結合した捕捉プローブにハイブリダイズされている。増幅には、線形増幅又は指数関数的増幅が含まれ得る。増幅の例には、全ゲノム増幅及び標的増幅が挙げられる。捕捉プローブは、P5配列及び第1の遺伝子座特異的プローブ(LSP1)を含む。伸長プライマーがハイブリダイズされた標的核酸にハイブリダイズされ、伸長オリゴヌクレオチドが伸長プライマーにハイブリダイズされる。伸長プライマーは、第2の遺伝子座特異的プライマー(LSP2)及び第2の共通配列(CS2)を含む。伸長オリゴヌクレオチドは、伸長プライマーのCS2領域にハイブリダイズし、インデックス及びP7配列を含む。捕捉プローブのLSP1が伸長プライマーのLSP2にライゲーションされ、伸長プライマーが伸長されて、伸長オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むようになる。ハイブリダイズされた標的核酸が除去される。伸長された捕捉プローブがビーズに結合したP5プライマー及び溶液中のP7プライマーを介して増幅される。増幅により正規化量の増幅産物がもたらされ、これは、増幅がビーズに結合したP5プライマーの量によって制限されるためである。
一実施形態例が図6にも示されており、ここで、目的とするSNP(星形)を含む増幅された標的核酸がビーズに結合した捕捉プローブにハイブリダイズされている。捕捉プローブは、GGA配列及び第1の遺伝子座特異的プローブ(LSP1)を含む。伸長プライマーがハイブリダイズされた標的核酸にハイブリダイズされ、伸長オリゴヌクレオチドが伸長プライマーにハイブリダイズされる。伸長プライマーは、第2の遺伝子座特異的プライマー(LSP2)及び第2の共通配列(CS2)を含む。伸長オリゴヌクレオチドは、伸長プライマーのCS2領域にハイブリダイズし、インデックス及びAAG配列を含む。捕捉プローブのLSP1が伸長プライマーのLSP2にライゲーションされ、伸長プライマーが伸長されて、伸長オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むようになる。ハイブリダイズされた標的核酸が除去される。伸長された捕捉プローブがビーズに結合したGGAプライマー及び溶液中のAAGプライマーを介して増幅される。増幅により正規化量の増幅産物がもたらされ、これは、増幅がビーズに結合したGGAプライマーの量によって制限されるためである。
異なる量の入力核酸により、実質的に同様の量の増幅産物がもたらされ得る。図7に示されるように、異なる量の標的核酸がビーズに結合した捕捉プローブにハイブリダイズされ、捕捉プローブが伸長されて、異なる量の伸長された捕捉プローブが生成される(図7の左側)。伸長された捕捉プローブがビーズに結合した第1のプライマー及び溶液中の第2のプライマーを介して増幅される。増幅産物の量は、ビーズに結合した第1のプライマーの量によって制限される。したがって、初期入力核酸の量が異なった場合でも、増幅により実質的に同様の量の増幅産物がもたらされる。
いくつかの実施形態では、標的核酸は、第2の増幅部位に相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、第2のインデックス及び/又は第2の配列決定プライマーに相補的な配列を含む。いくつかのかかる実施形態では、第1の遺伝子座特異的プライマーを含む捕捉プローブは、標的核酸を第1の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズさせ、かつ第1の遺伝子座特異的プライマーをポリメラーゼで伸長させて、第2の増幅部位、第2のインデックス、及び/又は第2の配列決定プライマーなどの標的核酸に相補的な配列を組み込むことによって伸長され得る。いくつかの実施形態では、標的核酸は、第2の増幅部位、第2のインデックス、及び/又は第2の配列決定プライマーに相補的な配列を含む付加されたアダプターによって調製され得る。いくつかの実施形態では、標的核酸は、タグメンテーション反応によって調製され得る。例えば、標的核酸を含む投入核酸は、複数のトランスポソームと接触させることができる。トランスポソームは、入力核酸を断片化し、アダプターを核酸断片の末端に結合させることができる。タグ付け反応の例は、その全体が参照により組み込まれる米国特許第9,040,256号に開示されている。
いくつかの実施形態では、調製された核酸ライブラリ又はプールされたライブラリは、次世代配列決定(NGS)などの技術及び配列決定による遺伝子型決定(genotyping-by-sequencing、GBS)などの関連方法を利用する配列決定用途を含む、下流分析用途に好適であり得る。例えば、第1の遺伝子座特異的プライマー及び第2の遺伝子座特異的プライマーは、それらの2つの結合部位間に一塩基多型SNP、挿入、欠失、又は複製を有する位置で標的核酸に結合することができる。増幅された標的核酸を配列決定することができ、SNP、挿入、欠失、又は重複を特定することができる。
いくつかの実施形態では、増幅産物は、ビーズなどの固体支持体から分離され得る。一般に、酵素の使用並びに/又は温度及び/若しくはpHの変化などの固体支持体から核酸を除去するための任意の好適な方法を使用することができる。いくつかの実施形態では、増幅産物は、溶出によって固体支持体から分離される。いくつかの実施形態では、増幅産物は、加熱された緩衝液中に溶出される。ストレプトアビジンが固相支持体に含まれ、かつ核酸がビオチン化されて核酸の固体支持体への結合を促進するいくつかの実施形態では、核酸増幅産物は、加熱されたアビジン-ビオチン切断によって固体支持体から分離され得る。
いくつかの実施形態では、核酸増幅は、実質的に等温の条件下で行われる。増幅に最適な温度は異なり、例えば、配列長、融解温度、及びポリメラーゼの選択などのプライマー特性に依存し得る。いくつかの実施形態では、増幅温度は、摂氏60度未満、例えば、摂氏50度未満、摂氏45度未満、例えば、摂氏42度、38度、35度、30度、25度、又は20度である。いくつかの好ましい実施形態では、増幅温度は、摂氏約38度である。いくつかの実施形態では、等温増幅は、除外増幅(exclusion amplification、Ex-Amp)とも呼ばれる結合平衡除外増幅(kinetic exclusion amplification、KEA)を使用して行われ得る。
いくつかの実施形態では、増幅された/正規化された核酸ライブラリは、増幅試薬を反応させて複数の増幅部位を生成することによって構築され得、これらの複数の増幅部位は各々、それらの部位を播種した個々の標的核酸から実質的にクローン性のアンプリコン集団を含む。いくつかの実施形態では、増幅反応は、それぞれの増幅部位の容量を満たすのに十分な数のアンプリコンが産生されるまで進行する。このように、既に播種された部位を容量まで満たすと、ターゲット核酸がその部位に着地して増幅するのを阻害し、それによってその部位でアンプリコンのクローン集団を産生する。いくつかの実施形態では、第2のターゲット核酸がその部位に到達する前に増幅部位が容量まで満たされていなくても、見かけのクローン性を達成することができる。いくつかの条件下では、第1のターゲット核酸の増幅は、その部位に輸送される第2のターゲット核酸からのコピーの産生を有効に上回るか又は圧倒するのに十分な数のコピーが作製される点まで進行し得る。例えば、直径500nm未満の円形特徴部(例えば、ビーズ)上でブリッジ増幅プロセスを使用する実施形態では、第1の標的核酸の指数関数的増幅を14サイクル行った後に、同じ部位での第2の標的核酸からの汚染がIllumina配列決定プラットフォーム上での合成による配列決定分析に悪影響を及ぼすのに不十分な数の汚染アンプリコンしか生成しないことが決定された。
いくつかの実施形態では、結合平衡除外は、別のイベント又はプロセスが発生することを効果的に排除するために、十分に速い速度でプロセスが生じるときに生じ得る。例えば、ユニバーサルプライマーを有するビーズの溶液であって、溶液中でビーズに標的核酸がランダムに播種され、標的核酸のコピーが増幅プロセスで生成されて、各々のビーズが満たされる。結合平衡除外によれば、播種プロセスと増幅プロセスは、増幅速度が播種速度を超える条件下で同時に進行することができる。したがって、第1の標的核酸が播種された特定のビーズ上にコピーが作製される速度が比較的速いため、増幅のために第2の核酸がその特定のビーズを播種することを効果的に除外する。結合平衡除外法は、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2013/0338042号の開示に詳述されているように行うことができる。
いくつかの実施形態では、結合平衡除外は、増幅を開始する比較的遅い速度、例えば、標的核酸の後続のコピー又は標的核酸の第1のコピーを作製する比較的速い速度比較して遅い標的核酸の第1のコピーを作製する速度を利用することができる。いくつかの実施形態では、結合平衡除外は、固体基質上のビーズ又は他の部位などの部位が核酸シードのコピーで満たされるように、増幅が生じる比較的速い速度と比較して比較的遅い拡散又は輸送などの比較的遅い速度の標的核酸播種により生じる。別の実施形態では、結合平衡除外は、部位が満たされるように、後続のコピーが作製される比較的速い速度と比較して遅延活性化又は緩徐活性化などの部位を播種した標的核酸の第1のコピーの形成の遅れにより生じ得る。いくつかの実施形態では、個々の部位にいくつかの異なる標的核酸が播種されている場合があり、例えば、増幅前にいくつかの標的核酸が各部位に存在し得る。しかしながら、任意の所与の標的核酸の第1のコピー形成がランダムに活性化され得、これにより、後続のコピーが生成される速度と比較して第1のコピー形成の平均速度が比較的遅くなる。この場合、個々の部位にいくつかの異なる標的核酸が播種されている場合があるが、結合平衡除外により、それらの標的核酸のうちの1つのみの増幅が可能になる。より具体的には、第1の標的核酸が増幅のために活性化されると、その部位はそのコピーで急速に満たされ、それにより、第2の標的核酸のコピーがその部位で作製されるのが防止される。
増幅試薬は、アンプリコン形成を促進する更なる成分を含むことができ、場合によってはアンプリコン形成の速度を増加させる。一実施例は、リコンビナーゼである。リコンビナーゼは、反復的な浸潤/伸長を可能にすることによって、アンプリコン形成を促進することができる。より具体的には、リコンビナーゼは、標的核酸をアンプリコン形成の鋳型として使用するポリメラーゼによる標的核酸の浸潤及びポリメラーゼによるプライマーの伸長を促進することができる。このプロセスは、浸潤/伸長の各ラウンドから産生されたアンプリコンが後続のラウンドで鋳型として機能する鎖反応として繰り返すことができる。加熱又は化学変性などによる変性サイクルが必要とされないため、このプロセスは、標準PCRよりも迅速に起こり得る。したがって、リコンビナーゼ促進増幅は、等温的に行うことができる。増幅を促進するために、リコンビナーゼ促進増幅試薬中に、ATP、又は他のヌクレオチド、又はいくつかの事例ではその非加水分解性類似体を含めることが望ましい。リコンビナーゼと一本鎖結合(SSB)タンパク質の混合物は、SSBが増幅を更に促進できるため、特に有用である。リコンビナーゼ促進増幅用の代表的な製剤には、TwistDx(Cambridge,UK)からTwistAmpキットとして市販されているものが挙げられる。リコンビナーゼ促進増幅試薬の有用な成分及び反応条件は、各々参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第5,223,414号及び米国特許第7,399,590号に記載されている。
アンプリコン形成を促進し、場合によってはアンプリコン形成の速度を増加させるために増幅試薬に含めることができる成分の別の例は、ヘリカーゼである。ヘリカーゼは、アンプリコン形成の連鎖反応を可能にすることによって、アンプリコン形成を促進することができる。加熱又は化学変性などによる変性サイクルが必要とされないため、このプロセスは、標準PCRよりも迅速に起こり得る。したがって、ヘリカーゼ促進増幅は、等温的に行うことができる。ヘリカーゼと一本鎖結合(SSB)タンパク質の混合物は、SSBが増幅を更に促進できるため、特に有用である。ヘリカーゼ促進増幅のための代表的な製剤としては、Biohelix社(ビバリー、マサチューセッツ州)からIsoAmpキットとして市販されているものが挙げられる。更に、ヘリカーゼタンパク質を含む有用な製剤の例は、各々参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第7,399,590号及び米国特許第7,829,284号に記載されている。
いくつかの実施形態では、増幅試薬は、1つ以上の起点結合タンパク質を含み得る。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、増幅反応に起点結合タンパク質を含めることにより、アンプリコン形成が促進され、いくつかの事例では、アンプリコン形成の速度が高くなる。
いくつかの実施形態では、増幅試薬は、ポリメラーゼを更に含み得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、Bstポリメラーゼ、poIDポリメラーゼ、9°Nポリメラーゼ、又はphi29ポリメラーゼなどの鎖置換ポリメラーゼであり得る。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、熱安定性ポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、鋳型はRNAであり、ポリメラーゼは逆転写酵素を含み得る。
サンプル表現又は特異性の維持は、次世代配列決定(NGS)及び標的配列決定などのいくつかの下流分析用途のための多くのライブラリ調製方法に有用である。例えば、差次的に発現される遺伝子の探索などの多くのcDNAライブラリ用途の場合、初期mRNA集団に対するライブラリにおけるcDNA表現の歪みを最小限に抑えることが有用である。言い換えれば、いくつかの下流用途では、ライブラリ中の個々のcDNAの含有量は、初期RNAのコピー数に比例し得る。対照的に、いくつかの他の用途では、ライブラリ中の異なる個々のcDNAの濃度が均等化され得る。本明細書に記載の実施形態は、DNA種間比及び可能性のあるマイナー対立遺伝子頻度コールを含む入力DNAライブラリの複雑さを維持することができ、増幅されて正規化されたライブラリの量以外の差はほとんど又は全く観察されない。
配列決定による遺伝子型決定
いくつかの実施形態は、標的核酸を配列決定して、標的核酸におけるSNP、挿入、欠失、又は複製を特定することによって遺伝子型決定するための方法及びシステムを含む。いくつかのかかる実施形態では、標的核酸を含む核酸ライブラリは、複数の捕捉プローブが結合した基質を得ることによって調製することができる。いくつかの実施形態では、基質は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、基質は、平面基質である。いくつかの実施形態では、平面基質は、ウェルなどの分離した部位を含む。いくつかの実施形態では、基質は、複数のビーズを含み得る。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、第1の増幅部位及び第1の遺伝子座特異的プライマーを含む。いくつかの実施形態は、複数の標的核酸を第1の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズさせることを含む。いくつかの実施形態では、第1の遺伝子座特異的プライマーが伸長されて、第2の増幅部位を含む伸長されたプローブを得ることができる。いくつかの実施形態では、伸長されたプローブが増幅及び配列決定され、それにより、標的核酸におけるSNP、挿入、欠失、又は重複が特定され得る。
いくつかの実施形態は、標的核酸を配列決定して、標的核酸におけるSNP、挿入、欠失、又は複製を特定することによって遺伝子型決定するための方法及びシステムを含む。いくつかのかかる実施形態では、標的核酸を含む核酸ライブラリは、複数の捕捉プローブが結合した基質を得ることによって調製することができる。いくつかの実施形態では、基質は、固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、基質は、平面基質である。いくつかの実施形態では、平面基質は、ウェルなどの分離した部位を含む。いくつかの実施形態では、基質は、複数のビーズを含み得る。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、第1の増幅部位及び第1の遺伝子座特異的プライマーを含む。いくつかの実施形態は、複数の標的核酸を第1の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズさせることを含む。いくつかの実施形態では、第1の遺伝子座特異的プライマーが伸長されて、第2の増幅部位を含む伸長されたプローブを得ることができる。いくつかの実施形態では、伸長されたプローブが増幅及び配列決定され、それにより、標的核酸におけるSNP、挿入、欠失、又は重複が特定され得る。
いくつかの実施形態では、第1の遺伝子座特異的プライマーの伸長は、第2の遺伝子座特異的プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせることと、第1の遺伝子座特異的プライマーを第2の遺伝子座特異的プライマーにライゲーションすることとを含み得る。いくつかの実施形態では、伸長オリゴヌクレオチドが第2の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズされ得、第2の遺伝子座特異的プライマーがポリメラーゼで伸長されて、伸長オリゴヌクレオチドに相補的な配列を含むようになり得る。いくつかの実施形態では、伸長オリゴヌクレオチドに相補的な配列は、第2の増幅部位、第2の配列決定プライマー、及び/又は第2のインデックスを含み得る。
いくつかの実施形態では、伸長されたプローブが増幅されて、正規化量の増幅産物の正規化量を得ることができる。いくつかの実施形態では、増幅は、捕捉プローブの量又は伸長プライマーの量のいずれかによって制限される。いくつかの実施形態では、基質は、正規化量の捕捉プローブを含み、伸長プライマーの量は、捕捉プローブの正規化量以上である。いくつかの実施形態では、基質は、正規化量の伸長プライマーを含み、捕捉プローブの量は、捕捉プローブの正規化量以上である。いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、基質に結合している。いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、溶液中に存在する。
いくつかの実施形態では、第1の増幅部位と伸長プライマーは、互いにハイブリダイズすることができないか、又は互いに本質的にハイブリダイズすることができない。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位と伸長プライマーは、互いに非相補的である。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位及び伸長プライマーは、互いに非相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、伸長プライマーとのハイブリダイゼーションを阻害する修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位及び伸長プライマーは各々、同じタイプのヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、互いに相補的なタイプのヌクレオチドを欠いており、伸長プライマーは、第1の増幅部位と同じタイプのヌクレオチドから本質的になる。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とチミン(T)又はグアニン(G)とシトシン(C)から選択されるヌクレオチドの組み合わせを欠いている。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とグアニン(G)、アデニン(A)とシトシン(C)、シトシン(C)とチミン(T)、又はグアニン(G)とチミン(T)から選択されるヌクレオチドの組み合わせからなる。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とグアニン(G)のヌクレオチドの組み合わせからなる。
固体支持体
いくつかの実施形態は、固体支持体などの1つ以上の基質を含む。本明細書に開示される方法に好適な固体支持体は、一般に、任意の便利なサイズのものであり得、任意の数の既知の材料から製造され得る。好ましくは、本明細書に開示される実施形態で使用される固体支持体は、既知の結合能力を提供し、結果として固体支持体の固定量当たり実質的に変動しない量の結合核酸をもたらす任意の好適なタイプのものであり得る。かかる材料の例には、無機物、天然ポリマー、及び合成ポリマーが挙げられる。これらの材料の具体例には、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ゼラチン、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、ビニルとアクリルアミドとのコポリマー、ジビニルベンゼンなどで架橋されたポリスチレン、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、天然スポンジ、シリカゲル、制御細孔ガラス、金属、架橋デキストラン(例えば、Sephadex(商標))アガロースゲル(Sepharose(商標))、及び当業者に既知の他の固体支持体が挙げられる。
いくつかの実施形態は、固体支持体などの1つ以上の基質を含む。本明細書に開示される方法に好適な固体支持体は、一般に、任意の便利なサイズのものであり得、任意の数の既知の材料から製造され得る。好ましくは、本明細書に開示される実施形態で使用される固体支持体は、既知の結合能力を提供し、結果として固体支持体の固定量当たり実質的に変動しない量の結合核酸をもたらす任意の好適なタイプのものであり得る。かかる材料の例には、無機物、天然ポリマー、及び合成ポリマーが挙げられる。これらの材料の具体例には、セルロース、セルロース誘導体、アクリル樹脂、ガラス、シリカゲル、ゼラチン、ポリスチレン、ポリビニルピロリドン、ビニルとアクリルアミドとのコポリマー、ジビニルベンゼンなどで架橋されたポリスチレン、ポリアクリルアミド、ラテックスゲル、シリコン、プラスチック、ニトロセルロース、ポリスチレン、デキストラン、ゴム、天然スポンジ、シリカゲル、制御細孔ガラス、金属、架橋デキストラン(例えば、Sephadex(商標))アガロースゲル(Sepharose(商標))、及び当業者に既知の他の固体支持体が挙げられる。
いくつかの実施形態では、固相支持体は、合成ポリマー支持体、例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、置換ポリスチレン(例えば、カルボキシル化又はアミノ化ポリスチレン)、ポリアミド、ポリアクリルアミド、ポリ塩化ビニルなど、又は核酸親和性クロマトグラフィーに有用な任意の材料を含み得る。いくつかの実施形態では、固相は、平面、曲面、ウェル、又はマイクロ流体デバイスの一部であり得る。
本明細書に開示されるいくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズを含み得る。ビーズは、球形、略球形、卵形、円盤形、立方体、不定形、及び他の三次元形状などの多種多様な形状のうちのいずれかであり得る。ビーズは、例えば、樹脂及びポリマーを含む多種多様な材料を使用して製造され得る。ビーズは、例えば、マイクロビーズ、マイクロ粒子、ナノビーズ、及びナノ粒子を含む任意の好適なサイズであり得る。いくつかの事例では、ビーズは、磁気応答性であり、他の事例では、ビーズは、有意に磁気応答性ではない。磁気応答性ビーズの場合、磁気応答性材料は、ビーズの実質的に全て、ビーズの一部、又はビーズの1つの成分のみを構成し得る。ビーズの残りは、とりわけ、アッセイ試薬の結合を許可するポリマー材料、コーティング、及び部分を含み得る。好適なビーズの例には、フローサイトメトリーマイクロビーズ、ポリスチレンマイクロ粒子及びナノ粒子、官能化ポリスチレンマイクロ粒子及びナノ粒子、被覆ポリスチレンマイクロ粒子及びナノ粒子、シリカマイクロビーズ、蛍光マイクロスフェア及びナノスフェア、官能化蛍光マイクロスフェア及びナノスフェア、被覆蛍光マイクロスフェア及びナノスフェア、染色マイクロ粒子及びナノ粒子、磁性マイクロ粒子及びナノ粒子、超常磁性マイクロ粒子及びナノ粒子、(例えば、Invitrogen Group(Carlsbad,Ca)から入手可能なDYNABEADS(登録商標)粒子)、蛍光マイクロ粒子及びナノ粒子、被覆磁性マイクロ粒子及びナノ粒子、強磁性マイクロ粒子及びナノ粒子、被覆強磁性マイクロ粒子及びナノ粒子、並びに米国特許出願公開第2005/0260686号、米国特許出願公開第2003/0132538号、米国特許出願公開第2005/0118574号、米国特許出願公開第2005/0277197号、米国特許出願公開第2006/0159962号(これらの全開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる)に開示されるものが挙げられる。ビーズは、生体分子又は生体分子に結合してそれと複合体を形成することができる他の物質と予め結合していてもよい。ビーズは、抗体、タンパク質、若しくは抗原、DNA/RNAプローブ、又は所望の標的に対して親和性を有する任意の他の分子と予め結合していてもよい。ビーズ特性は、多重化態様の実施形態で用いられ得る。多重化に好適な特性を有するビーズ、並びにかかるビーズから放出されたシグナルを検出及び分析する方法の例は、米国特許出願公開第2008/0305481号、米国特許出願公開第2008/0151240号、米国特許出願公開第2007/0207513号、米国特許出願公開第2007/0064990号、米国特許出願公開第2006/0159962号、米国特許出願公開第2005/0277197号、米国特許出願公開第2005/0118574号(これらの開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる)で見つけられ得る。
いくつかの実施形態では、ビーズは、任意の便利なサイズのものであり得、任意の数の既知の材料から製造され得る。いくつかの実施形態では、ビーズは、例えば、磁性ビーズ、常磁性ビーズ、プラスチックビーズ、ポリスチレンビーズ、ガラスビーズ、アガロースビーズ、及びそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、ビーズは、直径およそ2~100μm、又は直径10~80μm、最も好ましくは直径20~40μmのビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズは、溶液中に提供され得る。又は、いくつかの実施形態では、ビーズは、固体支持体上に固定化され得る。
いくつかの実施形態では、固体支持体は、ストレプトアビジンを含み得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ストレプトアビジン被覆ビーズであるか、又はそれを含み得る。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ストレプトアビジン被覆磁性ビーズであるか、又はそれを含み得る。固相支持体がストレプトアビジンを含むいくつかの実施形態では、核酸分子がビオチン化されて、核酸の固体支持体への結合が促進され得る。
入力核酸
いくつかの実施形態では、入力核酸サンプルは、一本鎖核酸を含む。いくつかの実施形態では、入力核酸サンプル中の少なくとも1つの標的核酸は、二本鎖であり得るか、又は適切な手順を使用して少なくとも部分的に二本鎖にされ得る。いくつかの実施形態では、入力核酸サンプルは、一本鎖核酸分子と二本鎖核酸分子との混合物を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、線状であり得る。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、環状であり得るか、又は線状領域と環状領域との組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態では、入力核酸サンプルは、一本鎖核酸を含む。いくつかの実施形態では、入力核酸サンプル中の少なくとも1つの標的核酸は、二本鎖であり得るか、又は適切な手順を使用して少なくとも部分的に二本鎖にされ得る。いくつかの実施形態では、入力核酸サンプルは、一本鎖核酸分子と二本鎖核酸分子との混合物を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、線状であり得る。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、環状であり得るか、又は線状領域と環状領域との組み合わせを含み得る。
いくつかの実施形態では、入力核酸の量は、約0.01ng~100ngであり得る。いくつかの実施形態では、入力核酸の量は、約0.1ng、0.2ng、0.3ng、0.4ng、0.5ng、0.6ng、0.7ng、0.8ng、0.9ng、1ng、1.1ng、1.2ng、1.3ng、1.5ng、2.0ng、2.5ng、3.0ng、3.5ng、4.0ng、4.5ng、5.0ng、又は前述の値のうちのいずれか2つによって定義される範囲内である。いくつかの実施形態では、入力核酸の量は、約5.5ng、6.0ng、6.5ng、7.0ng、7.5ng、8.0ng、8.5ng、9.0ng、9.5ng、10.0ng、11.0ng、11.5ng、12.0ng、12.5ng、13.0ng、13.5ng、14.0ng、15.0ng、15.5ng、16.0ng、16.5ng、17.0ng、18.0ng、18.5ng、19.0ng、19.5ng、20.0ng、又は前述の値のうちのいずれか2つによって定義される範囲内である。いくつかの実施形態では、入力核酸の量は、約21.0ng、22.0ng、22.5ng、23.0ng、23.5ng、24.0ng、24.5ng、25.0ng、26.0ng、27.0ng、28.0ng、29.0ng、30.0ng、32.5ng、35.0ng、37.5ng、40.0ng、42.5ng、45.0ng、47.5ng、50.0ng、52.5ng、55.0ng、60.0ng、65.0ng、70.0ng、75.0ng、80.0ng、85.0ng、90.0ng、又は前述の値のうちのいずれか2つによって定義される範囲内である。いくつかの実施形態では、入力核酸の量は、約0.08、0.4、2.0、10.0、又は50.0ngである。
いくつかの実施形態では、増幅工程は、単一の核酸ライブラリに対して行われる。いくつかの実施形態では、増幅工程は、複数の核酸ライブラリに対して行われる。いくつかの実施形態では、複数の核酸ライブラリ由来の増幅産物が組み合わせられて、組み合わせられたプールされた核酸ライブラリを形成する。いくつかの実施形態では、複数の核酸ライブラリ由来の増幅産物は、固相支持体から除去された後に組み合わせられる。いくつかの実施形態では、複数の核酸ライブラリ由来の増幅産物は、固相支持体から除去される前に組み合わせられる。いくつかの実施形態では、複数の入力核酸サンプルは、増幅工程前に組み合わせられる。いくつかの実施形態では、入力核酸サンプルの各々の量は、複数の核酸サンプルにわたって正規化されていない。
いくつかの実施形態では、ライブラリは、DNAから生成される。いくつかの実施形態では、ライブラリは、RNAから生成される。いくつかの実施形態では、ライブラリは、タンパク質から生成される。いくつかの実施形態では、ライブラリは、DNA、RNA、及びタンパク質の組み合わせから生成される。例えば、抗体-オリゴコンジュゲートを使用して、固体支持体上にライブラリを生成し、その後、固体支持体上での制限された増幅によって正規化することができる。
いくつかの実施形態では、複数の入力核酸サンプルは、少なくとも2、4、8、12、24、48、96、200、384、400、500、100、1500、又は前述の数のうちのいずれか2つによって定義される範囲内の数の入力核酸サンプルを含む。
いくつかの実施形態では、構成増幅産物の各集団の相対的表現は、プールされた核酸ライブラリ内で有利に調整され得る。本明細書で使用される「有利に調整される」とは、プールされた核酸ライブラリ中の各構成増幅産物の量が制御又は既定され得ることを意味する。いくつかの実施形態では、構成増幅産物の各々量は、プールされた核酸ライブラリ内で実質的に均一に表現される。あるいは、複数の構成増幅産物は、プールされた核酸ライブラリ中に異なる所定の濃度で存在し得る。これは、異なる量の固相支持体をその上に固定されたままの増幅産物で構築することによって、又は固相支持体から回収された後に異なる量の複数の構成増幅産物をプールすることによって達成され得る。言い換えれば、有利な調整は、プールされた核酸ライブラリ内の比例表現及び構成増幅産物の集団数の両方を選択的に調整することを含み得る。いくつかの実施形態では、有利な調整は、増幅産物を固相支持体から回収することに加えて、構成増幅産物のサンプルを少なくとも1つの処理工程に供することを含み得る。
伸長によるインデックス付け
本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、核酸分子上の共通配列にハイブリダイズされたインデックス付けオリゴヌクレオチドの伸長による核酸ライブラリのインデックス付けを含む。DNAライブラリインデックス付けのためのいくつかのプロトコルは、複数の酵素工程及び精製工程を含み得るか、又は最終PCR増幅工程で行われ得る。かかるインデックス付けプロトコルは、単一ラウンドのインデックス付けにも依存し得、それ故に、コンビナトリアルインデックス付けをサポートせず、これは、単一のサンプル中の多数の分子をインデックスの個別の組み合わせで個別にタグ付けすることを含み得る。有利には、本明細書に提供される実施形態は、単一インデックス付け及び複数段階のインデックス付けなどのコンビナトリアルインデックス付けの両方を含み得る。いくつかの実施形態は、溶液中での核酸のインデックス付け、又はビーズなどの基質に結合した核酸のインデックス付けを含む。いくつかの実施形態は、ビーズに結合した粗クロマチンなどのDNAなどの核酸のインデックス付けを含む。いくつかの実施形態は、細胞/核の内部に存在するDNAなどの核酸のインサイツインデックス付けを含む。
本明細書に提供されるいくつかの実施形態は、核酸分子上の共通配列にハイブリダイズされたインデックス付けオリゴヌクレオチドの伸長による核酸ライブラリのインデックス付けを含む。DNAライブラリインデックス付けのためのいくつかのプロトコルは、複数の酵素工程及び精製工程を含み得るか、又は最終PCR増幅工程で行われ得る。かかるインデックス付けプロトコルは、単一ラウンドのインデックス付けにも依存し得、それ故に、コンビナトリアルインデックス付けをサポートせず、これは、単一のサンプル中の多数の分子をインデックスの個別の組み合わせで個別にタグ付けすることを含み得る。有利には、本明細書に提供される実施形態は、単一インデックス付け及び複数段階のインデックス付けなどのコンビナトリアルインデックス付けの両方を含み得る。いくつかの実施形態は、溶液中での核酸のインデックス付け、又はビーズなどの基質に結合した核酸のインデックス付けを含む。いくつかの実施形態は、ビーズに結合した粗クロマチンなどのDNAなどの核酸のインデックス付けを含む。いくつかの実施形態は、細胞/核の内部に存在するDNAなどの核酸のインサイツインデックス付けを含む。
インデックス付き核酸ライブラリを調製するためのいくつかの実施形態は、Yアダプターを複数の標的核酸に付加することを含む。いくつかの実施形態では、Yアダプターは、両鎖が互いにハイブリダイズされる一部又は末端、及び鎖が互いにハイブリダイズされない一部又は末端を含む二本鎖核酸を含む。いくつかの実施形態では、Yアダプターは、標的核酸の各々の第1の末端及び第2の末端に付加され、Yアダプターは各々、第1のプライマー結合部位及びモザイク要素を含む第1の鎖と、第2のプライマー結合部位及びモザイク要素の相補体を含む第2の鎖とを含む。いくつかの実施形態は、第1の伸長オリゴヌクレオチドを第2のプライマー結合部位にハイブリダイズさせることも含み、ここで、第1の伸長オリゴヌクレオチドが第1のインデックス及び第3のプライマー結合部位を含む。いくつかの実施形態は、第2のプライマー結合部位を含む第2の鎖を伸長させ、それにより、第1のインデックスを標的核酸に付加することも含む。
いくつかの実施形態では、Yアダプターの第1の鎖の5’末端は、ヌクレアーゼ分解に耐性を示す。例えば、Yアダプターの第1の鎖の5’末端は、少なくとも2つの連続するヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含み得る。いくつかの実施形態では、Yアダプターの第2の鎖の5’末端はリン酸化されている。
いくつかの実施形態では、Yアダプターの複数の標的核酸への付加は、複数の標的核酸を複数のトランスポソームと接触させることを含み、ここで、トランスポソームが各々、Yアダプター及びトランスポザーゼを含む。いくつかの実施形態では、トランスポソームは、ダイマーを含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、Tn5トランスポザーゼを含む。いくつかの実施形態では、トランスポザーゼは、基質に結合している。いくつかの実施形態では、基質は、複数のビーズを含む。いくつかの実施形態では、ビーズは磁性である。
いくつかの実施形態では、第1の伸長オリゴヌクレオチドの3’末端はブロックされている。いくつかの実施形態では、第1の伸長オリゴヌクレオチドの5’末端はリン酸化されている。いくつかの実施形態では、第1の伸長オリゴヌクレオチドは、ビーズに結合されている。いくつかの実施形態は、第2のプライマー結合部位を含む第2の鎖を伸長させる前に第1の伸長オリゴヌクレオチドをビーズから切断することも含む。
いくつかの実施形態では、第2のプライマー結合部位を含む第2の鎖の伸長は、ポリメラーゼ伸長及び/又はリガーゼでの伸長を含む。いくつかの実施形態では、リガーゼでの伸長は、ライゲーションオリゴヌクレオチドを、第2のプライマー結合部位にハイブリダイズされた第1の伸長オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることと、ライゲーションオリゴヌクレオチドを、第2のプライマー結合部位を含む第2の鎖にライゲーションすることとを含む。いくつかの実施形態では、ライゲーションオリゴヌクレオチドは、追加のインデックスを含む。いくつかの実施形態では、ライゲーションオリゴヌクレオチドは、追加のプライマー結合部位を含む。
いくつかの実施形態は、第2のプライマー結合部位を含む第2の鎖を伸長させた後に第1の伸長オリゴヌクレオチドを除去することを含む。いくつかの実施形態では、除去は、エキソヌクレアーゼ処理を含む。いくつかの実施形態では、第1の伸長オリゴヌクレオチドは、ウラシルヌクレオチドを含み、除去は、ウラシル特異的切除試薬(USER)酵素による第1の伸長オリゴヌクレオチドの分解を含む。
いくつかの実施形態は、第2のインデックスを、第1のインデックスを含む標的核酸に付加することも含む。いくつかの実施形態では、第2のインデックスの付加は、第2の伸長オリゴヌクレオチドを、第1のインデックスを含む標的核酸の第3のプライマー結合部位にハイブリダイズさせることであって、第2の伸長オリゴヌクレオチドが第2のインデックスを含む、ハイブリダイズさせることと、第3のプライマー結合部位を含む第2の鎖を伸長させ、それにより、第2のインデックスを、第1のインデックスを含む標的核酸に付加することとを含む。いくつかの実施形態では、第2の伸長オリゴヌクレオチドの3’末端はブロックされている。いくつかの実施形態では、第2の伸長オリゴヌクレオチドの5’末端はリン酸化されている。
いくつかの実施形態では、第3のプライマー結合部位を含む第2の鎖の伸長は、ポリメラーゼ伸長を含む。いくつかの実施形態では、第3のプライマー結合部位を含む第2の鎖の伸長は、リガーゼでの伸長を含む。いくつかの実施形態は、第3のプライマー結合部位を伸長させた後に第2の伸長オリゴヌクレオチドを除去することも含む。
いくつかの実施形態は、第3のインデックスを、第2のインデックスを含む標的核酸に付加することも含む。いくつかの実施形態は、追加のインデックスを、第3のインデックスを含む標的核酸に付加することも含む。
いくつかの実施形態は、第1のインデックス、第2のインデックス、第3のインデックス、又はそれ以上などの1つ以上のインデックスを含む標的核酸を増幅することも含む。いくつかの実施形態では、増幅は、増幅プライマーを第1のプライマー結合部位に、かつ第3、第4、又は第5のプライマー結合部位にハイブリダイズさせることを含む。いくつかの実施形態では、プライマー結合部位は、P5配列又はP7配列又はそれらの相補体などの一般的配列を含み得る。いくつかの実施形態では、増幅は、PCRを含む。いくつかの実施形態では、増幅は、ブリッジ増幅を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ゲノムDNAを含む。
いくつかの実施形態は、複数の標的核酸をコンビナトリアルインデックス付けする方法を含む。いくつかの実施形態は、(a)一次インデックス付き核酸のプールを得ることであって、第1のインデックスを標的核酸の複数の亜集団に付加することであって、異なる第1のインデックスが亜集団の各々に付加される、付加することと、異なる第1のインデックスを含む亜集団を組み合わせて、一次インデックス付き核酸のプールを得ることであって、第1のインデックスが前述の実施形態のうちのいずれかに従って標的核酸の亜集団に付加される、得ることと、を含む、得ることと、(b)プールを一次インデックス付き核酸の複数の亜集団に分けることと、(c)二次インデックス付き核酸のプールを得ることであって、第2のインデックスを一次インデックス付き核酸の複数の亜集団に付加することであって、異なる第2のインデックスが亜集団の各々に付加される、付加することと、異なる第2のインデックスを含む亜集団を組み合わせて、二次インデックス付き核酸のプールを得ることと、を含む、得ることとを含む。いくつかの実施形態は、(b)及び(c)を繰り返すことと、追加のインデックスをインデックス付き亜集団に付加することとも含む。いくつかの実施形態では、第1のインデックスの標的核酸の亜集団への付加は、ウェル、チャネル、又は液滴から選択される区画内で行われる。
溶液中でのタグメント化DNAの伸長による単一段階インデックス付けの例が図14に提示される。簡潔には、図14は、溶液中でのハイブリダイゼーション-伸長による単一段階インデックス付けを示す。DNAは、Y-TSMによって溶液中でタグメント化され、その後、TSM不活性化、インデックス付けオリゴアニーリング、及び伸長が続く。必要に応じて、エキソヌクレアーゼ処理及び最終PCR増幅が行われる。したがって、第1の工程では、ゲノムDNAがトランスポソーム(transposome、TSM)でタグメント化され、これにより、トランスポソームがDNAに挿入され、DNAが断片化されるようになる。トランスポソームは、モザイク末端(mosaic end、ME)配列並びに共通配列CS1及びCS2’を含む核酸を含む。DNAへのトランスポソーム配列の挿入により、DNAがYアダプターを有する末端を有するようになる。DNA断片は各々、いずれかの末端で異なる共通配列に隣接し得る。いくつかの実施形態では、トランスファー鎖などのトランスポソーム核酸の5’末端におけるいくつかのヌクレオシドは、ヌクレアーゼ分解に耐性を示すホスホロチオエート結合を含み得る。図14に示されるように、タグメンテーションを停止することができ、SDSでの処理などによってトランスポソームを除去することができる。CS3_i1_CS2インデックス付けオリゴなどのインデックス付けオリゴをYアダプターにハイブリダイズさせることができる。DNAポリメラーゼとリガーゼとの混合物を使用して、非トランスファー鎖上でのタグメンテーション中に生成された9塩基ギャップを充填し、ライゲーションし、ハイブリダイズされたインデックス付けオリゴにわたって伸長させることができる。カクテル又は単一5’エキソヌクレアーゼを付加して、過剰なインデックス付けオリゴヌクレオチドを除去することができる。PCRは、CS1配列及びCS3配列を含む配列決定アダプタープライマーを用いて行うことができる。しかしながら、比較的低濃度のインデックス付けオリゴを使用した場合、エキソヌクレアーゼ処理をスキップすることができるか、又はインデックス付けオリゴヌクレオチドを依然としてTn5に結合しているタグメント化DNAに最初にハイブリダイズさせた。伸長反応前にカラムを使用してDNAを精製することができる。いくつかの実施形態では、インデックス付けプライマーは、チミンの代わりにウラシル塩基を用いて合成され、その後、ウラシル特異的切除試薬(USER)酵素などの酵素による分解によって除去され得る。PCRフリーワークフローを含むいくつかの実施形態では、CS1及びCS3は、フローセル上でのクラスター化に利用され得るP5配列及びP7配列を含むことができる。
ビーズ上でタグメント化されたDNAに適用されるインデックス付けワークフローのいくつかの実施形態が図15に示される。簡潔には、図15は、ビーズ上でのハイブリダイゼーション-伸長による単一段階インデックス付けの一実施形態を示し、ここで、DNAが、磁性ビーズに予め結合しているYアダプターでトランスポソームによってタグメント化され、TSM不活性化、インデックス付けオリゴアニーリング、及びギャップ充填/ライゲーション/伸長を含む全ての結果として起こる工程は、再懸濁及び異なる緩衝液中でのビーズのペレット化によって行われる。伸長によってインデックス付けを行う利点、例えば、一連の分割及びプール反応における段階的な複数のインデックスの付加は、コンビナトリアルインデックス付けワークフローで観察することができる。インデックス付けの段階数に応じて、コンビナトリアルインデックス付けは、比較的小さいプール、例えば、何百個かの初期インデックスを用いた、例えば、単一細胞由来の、何百万個もの分子の個別のインデックス付けを含み得る。
複数のインデックスのDNA分子への付加を含むいくつかの実施形態が図16及び図17に示される。図16は、ビーズ上でタグメント化されたDNAへの伸長によるインデックスの付加の一実施形態例を示す。いくつかの実施形態では、Tn5がタグメンテーション停止工程中に除去され、非トランスファー鎖が第一段階インデックス付けと同時にギャップ充填ライゲーションされる。インデックス付けオリゴヌクレオチドの除去は、NaOHでのビーズ洗浄、その後、中和及び次の段階のインデックス付けプライマーハイブリダイゼーションによって達成される。図17は、溶液中でのタグメンテーションを含む一実施形態を示す。いくつかの実施形態では、DNA連続性を維持するために、Tn5がDNAフィラメントに結合した状態でインデックス付け伸長工程が行われる。Tn5除去及び非トランスファー鎖ギャップ充填ライゲーションは、PCR直前にワークフローの最後の工程で行われる。インデックス付けプライマーが5’特異的エキソヌクレアーゼ処理によって放出されるか、又はインデックス付けプライマーがチミンの代わりにウラシルを用いて合成されるかのいずれかが起こり、伸長後の複合体がUSER酵素で処理される。コンビナトリアルインデックス付けワークフローの実施形態に含まれる分割-プールサイクルは図16及び図17には示されていない。図16及び図17に示される実施形態では、第1のインデックスの付加後、インデックス付けオリゴヌクレオチドは、図16のビーズベースのワークフローなどにおいて洗浄されるか、又は図17の溶液ワークフローなどにおいて分解され得る。第二段階のオリゴヌクレオチドがハイブリダイズされ、その後、その伸長及び除去が続き得る第二段階インデックス付けが続き得る。いくつかの実施形態では、インデックス付けプライマーハイブリダイゼーション/伸長/除去のサイクルは、アッセイの必要な複雑さに応じて複数回繰り返され得る。
いくつかの実施形態では、核酸は、サイクル数が増加するにつれて分解し得る。オリゴヌクレオチドなどの核酸の分解を減少させるために、いくつかの実施形態は、図18に示される1つ以上の方法工程を含むことができる。いくつかの実施形態では、溶液中での複数のハイブリダイゼーション-単一伸長/ライゲーション工程を使用して三段階インデックス付けが行われ得る。例えば、いくつかの実施形態では、Tn5が結合したタグメント化細胞がマイクロタイタープレートのウェル中に分布している。各ウェルの内容物を個々の第一段階5’リン酸化インデックス付けオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることができる。過剰なハイブリダイズされていないインデックス付けオリゴヌクレオチドを除去することができる。細胞をプールし、一連の第2の5’リン酸化インデックス付けオリゴヌクレオチドを有するマイクロタイタープレートのウェルに分割することができる。第二インデックス付けオリゴヌクレオチドを第1のインデックス付けオリゴヌクレオチドの粘着性5’末端にアニールし、その後、非トランスファー鎖上でのTn5除去及び両ギャップのギャップ充填ライゲーションを行うことができる。ライブラリ要素をプールし、PCRフリー二段階インデックス付けワークフローで使用するか、又はインデックス付けプライマーを用いたPCR増幅のために分割するかのいずれかを行って、第三段階のインデックス付けを追加することができる。各々のインデックス付け工程で5’リン酸化インデックス付けオリゴヌクレオチドを使用することにより、このプロトコルは、三段階から複数段階のインデックス付けに拡大することができる。過剰のインデックス付けオリゴヌクレオチドが細胞をプールする工程で洗い流され得るため、このワークフローを単一細胞ATAC-seqで使用することができる。いくつかの実施形態は、長い連結リード用途のためにDNAがビーズ上でタグメント化された同様のプロトコルの使用を含む。
いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーション-伸長によるインデックス付けは、固有の切断可能なインデックス付けオリゴヌクレオチドで覆われたビーズの大きなプール由来の単一のインデックス付けビーズを含む個々の区画で行われ得る。区画の例には、マイクロウェルプレート中のウェル、Fluidigm様チャネル、又は液滴が含まれる。段階情報又は単一細胞分解を提供するために、インデックス付け用のタグメント化DNAは、ビーズに予め結合されるか、又は核エンベロープの内部に含まれるかのいずれかが行われ得る。液滴中でのハイブリダイゼーション-伸長によるビーズ結合タグメント化DNAの単一段階インデックス付けの一実施形態例が図19に示される。液滴中でのハイブリダイゼーション-伸長による単一段階インデックス付けは、切断可能なインデックス付けオリゴヌクレオチド並びにオリゴヌクレオチド切断及び伸長に必要な他の成分で個別に覆われたビーズ/ヒドロゲル粒子のプールで乳化されたビーズに予め結合したYアダプタートランスポソームでのDNAのタグメント化を含み得る。液滴は、1容器当たり1つのタグメンテーション及び1つのインデックス付けビーズを封入することを目標とする液滴発生器又はエマルジョン試薬のいずれかによって発生させることができる。封入時に、インデックス付けオリゴヌクレオチドが放出され、タグメント化DNAにハイブリダイズされ、伸長される。インデックス付きDNAは、エマルジョンが破壊された後にPCR増幅される。
いくつかの実施形態では、液滴は、ハイブリダイゼーション工程で使用され得る。いくつかの実施形態では、後続の伸長工程は、液滴の内容物が放出された後にバルクで行われ得る。図20は、液滴中でのハイブリダイゼーション-バルク伸長による単一段階インデックス付けを含む一実施形態を示す。いくつかの実施形態では、タグメント化DNAは、切断可能なインデックス付けオリゴヌクレオチドで個別に覆われたビーズ/ヒドロゲル粒子のプールで乳化され、オリゴ切断のための成分のみが含まれる。封入時に、インデックス付けオリゴヌクレオチドが放出され、タグメント化DNAにハイブリダイズされる。インデックス付けオリゴヌクレオチドの伸長を含む後続の工程は、エマルジョンが破壊された後に行われ得る。
いくつかの実施形態は、遺伝子座特異的配列を含むオリゴヌクレオチドによってグラフトされたビーズ上でのDNA分子の濃縮も含む。簡潔には、サンプルインデックス付けオリゴヌクレオチドが濃縮/ハイブリダイゼーション混合物に付加され、濃縮後工程で遺伝子座特異的濃縮オリゴヌクレオチド間のギャップが埋められるのと同時に伸長される。図21に示されるように、増幅されたゲノムDNAが変性され、目的とするSNPのすぐ上流に設計された捕捉ビーズ上の遺伝子座特異的プローブ(LSP1)にハイブリダイズされる。同時に、CS2’配列を含む5’リン酸化LSP2オリゴヌクレオチドは、同じSNPから1塩基又は塩基数個分下流でハイブリダイズされる。ハイブリダイゼーション混合物には、CS2及びP7共通配列に隣接するインデックス配列を含むインデックス付けオリゴヌクレオチドも補充されている。非結合ライブラリ、過剰なLSP2、及びインデックス付けオリゴヌクレオチドが、ストリンジェントな洗浄によって洗浄され、その後、それぞれ、SNP及びインデックス付けオリゴヌクレオチドにわたってLSP1及びLSP2伸長が続く。伸長及びライゲーションされた構築物が変性条件下で洗浄されて、正規化/増幅反応前にハイブリダイズされたゲノムDNA及びインデックス付けオリゴが除去される。
重合反応の効率の増加
核酸増幅反応は、Mg2+などの触媒金属の存在下でプライマーの3’末端にデオキシヌクレオシド三リン酸(deoxynucleoside triphosphate、dNTP)を組み込むことによってプライマーを伸長させるポリメラーゼの使用を含む。順重合反応には、伸長されたプライマー及び無機ピロリン酸(PPi)を生成するためのプライマーへのヌクレオチドの付加が含まれるが、逆反応も可能であり、増加量のPPiが重合を阻害することができる。
核酸増幅反応は、Mg2+などの触媒金属の存在下でプライマーの3’末端にデオキシヌクレオシド三リン酸(deoxynucleoside triphosphate、dNTP)を組み込むことによってプライマーを伸長させるポリメラーゼの使用を含む。順重合反応には、伸長されたプライマー及び無機ピロリン酸(PPi)を生成するためのプライマーへのヌクレオチドの付加が含まれるが、逆反応も可能であり、増加量のPPiが重合を阻害することができる。
PPi蓄積は、反応条件が等温全ゲノム増幅反応中に0.4ug/uL超などの大量のDNAをもたらす場合に悪化する。マグネシウムPPi複合体の蓄積は、白色の目に見える沈殿物として視覚化され得る。観察された沈殿物の程度は、時間依存的であり、全ゲノム増幅反応において時間の増加とともに増加する。しかしながら、増幅反応における沈殿は、単一細胞ゲノム用途などの高DNA収量が所望される用途を妨害し得る。SBS化学事象中に利用されるナノウェル中のDNAクラスターなどの限局された体積に起因して局所濃度が上昇し得るため、ナノウェルにおけるDNA伸長に影響が及ぼされ得る。
本明細書に提供される方法及び組成物のいくつかの実施形態は、核酸を修飾することであって、ポリメラーゼの存在下で核酸を増幅する又は伸長させることを含む、修飾することを含む。いくつかの実施形態では、増幅及び/又は伸長は、PPiを除去する、加ピロリン酸分解を阻害する、かつ/又はMg2+-PPi複合体の形成を阻害するのに好適な条件下で行われる。いくつかの実施形態では、PPiは、可溶性である。いくつかの実施形態では、増幅及び/又は伸長は、無機ピロホスファターゼの存在下で行われる。いくつかの実施形態では、無機ピロホスファターゼの存在下で増幅及び/又は伸長の産物収量を達成する速度は、無機ピロホスファターゼの不在下で増幅及び/又は伸長の産物収量を達成する速度と比較して増加する。いくつかの実施形態では、増幅及び/又は伸長の産物収量を達成する速度は、少なくとも2倍、少なくとも3倍、又は少なくとも5倍増加する。いくつかの実施形態では、増幅及び/又は伸長は、等温条件下で行われる。いくつかの実施形態では、増幅及び/又は伸長は、PCR、ブリッジ増幅、全ゲノム増幅、ループ媒介等温増幅(LAMP)、単一細胞から得られた核酸からの増幅、合成による配列決定(SBS)反応、及び除外増幅(ExAMP)から選択される反応を行うことを含む。
いくつかの実施形態では、増幅及び/又は伸長は、単一細胞から得られる核酸からの増幅、又は無細胞核酸からの増幅を行うことを含む。いくつかの実施形態では、増幅及び/又は伸長は、合成による配列決定(SBS)反応を行うことを含む。いくつかの実施形態では、増幅及び/又は伸長は、ブリッジ増幅を行うことを含む。
SBSでは、核酸鋳型(例えば標的核酸又はそのアンプリコン)に沿った核酸プライマーの伸長を監視して、鋳型中のヌクレオチドの配列を決定する。基礎となる化学プロセスは、重合(例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒される)であり得る。特定のポリマーベースのSBSの実施態様では、プライマーに付加されるヌクレオチドの順序及び種類の検出を使用して鋳型の配列を決定することができるように、蛍光標識ヌクレオチドを鋳型依存的にプライマーに付加する(それによってプライマーを伸長させる)。いくつかの実施形態では、SBSは、パロシーケンシングを含む。パイロシークエンシングは、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖に取り込まれたときにPPiの放出を検出する(各々参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ronaghi,et al.,Analytical Biochemistry 242(1),84-9(1996)、Ronaghi,Genome Res.11(1),3-11(2001)、Ronaghi et al.Science 281(5375),363(1998)、米国特許第6,210,891号、同第6,258,568号、及び同第6,274,320号)。パイロシーケンシングでは、放出されたPPiは、ATPスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸(adenosine triphosphate、ATP)に変換されることによって検出することができ、生成されたATPのレベルは、ルシフェラーゼ生成光子により検出することができる。したがって、配列決定反応は、発光検出システムを介して監視することができる。フローセルは、本明細書に提供されるいくつかの方法及び組成物によって生成される増幅された核酸分子を収容するのに便利な形式を提供する。かかる形式での1つ以上の増幅された核酸分子は、サイクル中に試薬を繰り返し送達することを含むSBS又は他の検出技法に供され得る。例えば、第1のSBSサイクルを開始するために、1つ以上の標識されたヌクレオチド、DNAポリメラーゼなどを、1つ以上の増幅された核酸分子を収容するフローセルに流入/通過させることができる。プライマー伸長によって標識ヌクレオチドを組み込む部位は、検出することができる。任意選択的に、ヌクレオチドは、ヌクレオチドがプライマーに付加されると、更なるプライマー伸長を終結する可逆的終結特性を更に含むことができる。例えば、可逆的ターミネーター部分を有するヌクレオチド類似体をプライマーに付加して、デブロッキング作用因子が送達されてその部分を除去するまで、その後の伸長が起こらないようにすることができる。したがって、可逆的終端を使用する実施形態では、デブロッキング試薬をフローセルに送達することができる(検出発生の前又は後)。洗浄は、様々な送達工程の間に実施することができる。その後、サイクルをn回繰り返してプライマーをn個のヌクレオチドで伸長させ、それにより、長さnの配列を検出することができる。本明細書に提供される方法及び組成物とともに使用するために容易に適合させることができるSBS手順、流体系、及び検出プラットフォームの例は、例えば、各々参照により本明細書に組み込まれる、Bentley et al.,Nature 456:53-59(2008)、国際公開第04/018497号、米国特許第7,057,026号、米国特許第7,329,492号、米国特許第7,211,414号、米国特許第7,315,019号、米国特許第7,405,281号に記載されている。
いくつかの実施形態は、オリゴヌクレオチド伸長及びライゲーションを含む核酸の増幅及び/又は伸長、ローリングサークル増幅(rolling circle amplification、RCA)(参照により全体が本明細書に組み込まれる、Lizardi et al.,Nat.Genet.19:225-232(1998))、並びにオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(oligonucleotide ligation assay、OLA)を含む。例えば、各々参照により全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第7,582,420号、同第5,185,243号、同第5,679,524号、及び同第5,573,907号、欧州特許第0320308号、欧州特許第0336731号、欧州特許第0439182号、国際公開第90101069号、国際公開第89/12696号、及び国際公開第89109835号を参照されたい。これらの増幅方法は、核酸を増幅するように設計され得ることが理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、増幅方法は、関心対象の核酸に特異的に向けられるプライマーを含むライゲーションプローブ増幅又はオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ(OLA)反応を含み得る。いくつかの実施形態では、増幅法は、関心対象の核酸に特異的に指向されるプライマーを含有するプライマー伸長ライゲーション反応を含んでもよい。関心対象の核酸を増幅するように特別に設計することができるプライマー伸長及びライゲーションプライマーの非限定的な例として、増幅は、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第7,582,420号及び同第7,611,869号に例示されるようなGoldenGateアッセイ(Illumina,Inc.,San Diego,Calif.)に使用されるプライマーを含み得る。
等温増幅法の例には、例えば、Dean et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:5261-66(2002)によって例示されている多置換増幅(Multiple Displacement Amplification、MDA)、又は例えば米国特許第6,214,587号によって例示されている等温鎖置換核酸増幅が挙げられるが、これらに限定されず、これらは各々、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示で使用され得る他の非PCR系方法としては、例えば、Walker et al.,Molecular Methods for Virus Detection,Academic Press,Inc.,1995、米国特許第5,455,166号、及び同第5,130,238号、並びにWalkerら、Nucl.Acids Res.20:1691-96(1992)に記載されている鎖置換増幅(SDA)又は例えば、Lage et al.,Genome Research 13:294-307(2003)に記載されている超分枝鎖置換増幅が挙げられ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態は、ブリッジ増幅などの増幅を含む。ブリッジ増幅の例は、各々参照により全体が組み込まれる、米国特許出願公開第2020/0181686号、米国特許出願公開第2019/0374923号、米国特許出願公開第2018/0291444号、及び米国特許出願公開第2017/0342406号に開示されている。いくつかの実施形態では、ブリッジ増幅は、固体支持体上に固定化され、かつ伸長反応から生成された二本鎖又は部分的に二本鎖のアンプリコンを含み得、これらは変性され、固定化された鎖は、アダプターへのハイブリダイゼーションによりユニバーサル捕捉プライマーにアニールされる。結果として得られた構造が両方の末端に固定化されてブリッジが作成され、ユニバーサル捕捉プライマーが伸長され、その後、例えば、標的特異的捕捉プライマーに含まれるユニバーサルプライマー領域を使用して増幅され得る。この第2のユニバーサル捕捉プライマーは、アダプター配列に相補的な第1のユニバーサルプライマーとは異なり得る。固定化されていない鎖は、例えば、洗い流され得る。ブリッジ増幅により、複数のアンプリコンに対して均一のクラスター又はコロニー数がもたらされ得る。いくつかの実施形態では、増幅は、除外増幅を含み得る。例えば、米国特許出願公開第2020/0181686号及び米国特許出願公開第2019/0374923号を参照されたい。
システム及びキット
いくつかの実施形態は、捕捉プローブが結合した基質を含むシステム及びキットに関する。いくつかの実施形態では、基質は、複数のビーズを含む。いくつかの実施形態は、伸長プライマーも含む。いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、第1の増幅部位を含む。いくつかのかかる実施形態では、第1の増幅部位と伸長プライマーは、互いにハイブリダイズすることができないか、又は互いに本質的にハイブリダイズすることができない。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位と伸長プライマーは、互いに非相補的である。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位及び伸長プライマーは、互いに非相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、伸長プライマーとのハイブリダイゼーションを阻害する修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位及び伸長プライマーは各々、同じタイプのヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、互いに相補的なタイプのヌクレオチドを欠いており、伸長プライマーは各々、第1の増幅部位と本質的に同じタイプのヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位及び伸長プライマーは、互いに相補的なタイプのヌクレオチド、及び各伸長プライマーを欠いている。例えば、第1の増幅部位は、アデニン(A)とチミン(T)又はグアニン(G)とシトシン(C)から選択されるヌクレオチドの組み合わせを欠いている。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とグアニン(G)、アデニン(A)とシトシン(C)、シトシン(C)とチミン(T)、又はグアニン(G)とチミン(T)から選択されるヌクレオチドの組み合わせからなる。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とグアニン(G)のヌクレオチドの組み合わせからなる。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、1つのタイプのヌクレオチドからなり得る。いくつかの実施形態では、システム又はキットは、伸長プライマーを含む。いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、捕捉プローブと同じタイプのヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、捕捉プローブの量以下の量で提供される。いくつかの実施形態では、システム又はキットは、トランスポソーム、リガーゼ、ポリメラーゼ、及び/又は無機ピロホスファターゼを含むこともできる。
いくつかの実施形態は、捕捉プローブが結合した基質を含むシステム及びキットに関する。いくつかの実施形態では、基質は、複数のビーズを含む。いくつかの実施形態は、伸長プライマーも含む。いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、溶液中に存在する。いくつかの実施形態では、捕捉プローブは、第1の増幅部位を含む。いくつかのかかる実施形態では、第1の増幅部位と伸長プライマーは、互いにハイブリダイズすることができないか、又は互いに本質的にハイブリダイズすることができない。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位と伸長プライマーは、互いに非相補的である。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位及び伸長プライマーは、互いに非相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、伸長プライマーとのハイブリダイゼーションを阻害する修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位及び伸長プライマーは各々、同じタイプのヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、互いに相補的なタイプのヌクレオチドを欠いており、伸長プライマーは各々、第1の増幅部位と本質的に同じタイプのヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位及び伸長プライマーは、互いに相補的なタイプのヌクレオチド、及び各伸長プライマーを欠いている。例えば、第1の増幅部位は、アデニン(A)とチミン(T)又はグアニン(G)とシトシン(C)から選択されるヌクレオチドの組み合わせを欠いている。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とグアニン(G)、アデニン(A)とシトシン(C)、シトシン(C)とチミン(T)、又はグアニン(G)とチミン(T)から選択されるヌクレオチドの組み合わせからなる。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、アデニン(A)とグアニン(G)のヌクレオチドの組み合わせからなる。いくつかの実施形態では、第1の増幅部位は、1つのタイプのヌクレオチドからなり得る。いくつかの実施形態では、システム又はキットは、伸長プライマーを含む。いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、捕捉プローブと同じタイプのヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、伸長プライマーは、捕捉プローブの量以下の量で提供される。いくつかの実施形態では、システム又はキットは、トランスポソーム、リガーゼ、ポリメラーゼ、及び/又は無機ピロホスファターゼを含むこともできる。
実施例1-GGA/AAGプライマーを用いた配列決定による遺伝子型決定
「GGA/AAG」プライマー系を利用した方法を開発した。GGAプライマーは、配列番号3の配列(AAAAAGGAGGAGGAGGAGGAGGAAAA)を有し、AAGプライマーは、配列番号4の配列(AAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAA)を有した。この方法では、ビーズ上プライマー(捕捉プローブ)及び溶液中プライマー(伸長プライマー)はいずれも、T又はCヌクレオチドを含まず、Ex-ampで等温増幅を駆動するために使用した。プライマーは、それら自体と又は互いに相互作用することができず、結果として、ビーズの表面上にオリゴダイマーを形成しなかった。
「GGA/AAG」プライマー系を利用した方法を開発した。GGAプライマーは、配列番号3の配列(AAAAAGGAGGAGGAGGAGGAGGAAAA)を有し、AAGプライマーは、配列番号4の配列(AAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAA)を有した。この方法では、ビーズ上プライマー(捕捉プローブ)及び溶液中プライマー(伸長プライマー)はいずれも、T又はCヌクレオチドを含まず、Ex-ampで等温増幅を駆動するために使用した。プライマーは、それら自体と又は互いに相互作用することができず、結果として、ビーズの表面上にオリゴダイマーを形成しなかった。
P5/P7プライマー系とGGA/AAGプライマー系を比較するために、GGAプライマー又はP5プライマーのいずれかを表面上にグラフトすることによって2つのビーズタイプを生成した(図8)。P5/P7アダプターを有するPhiXライブラリをP5ビーズにハイブリダイズさせ、AAG/GGAアダプターを有するPhiXライブラリをGGAビーズにハイブリダイズさせた。異なる量のライブラリ並びに少量及び多量のライブラリをビーズにハイブリダイズさせた。ビーズを洗浄し、ExAMP試薬で再懸濁し、溶液中P7プライマー又は溶液中AAGプライマーのいずれかを補充した。等温増幅を、38℃で1時間回転するハイブリダイゼーションオーブン内で行った。増幅後、ビーズを洗浄し、対応するセットの共通プライマーを有するPCRで更に増幅し、PhiXゲノムの200bp領域を標的とし、増幅された材料をアガロースゲル上で分析した(図9及び図10)。前述のワークフローは、図5及び図6に示されるワークフローと実質的に同様であった。有意なプライマー二量体化生成物がP5/P7ライブラリで観察され、プライマー二量体化はGGA/AAGプライマー系で有意に減少した(図9)。増幅された材料のゲル分析は、AAG/GGAアダプターで生成されたライブラリで有意により等しい収量を示した(図10)。GGA/AAGプライマー系は、異なる量の入力DNAに対してよりP5/P7系よりも正規化された量の出力DNAをもたらした。
実施例2-ビーズ上でのGGA/AAG正規化の効率
実施例1と実質的に同様の研究では、P5/P7プライマー系又はGGA/AAGプライマー系のいずれかを使用して、様々な量の入力DNAに対する出力DNAの相対量を測定した。表1及び図11は、結果を要約する。表1は、GGA/AAGプライマー系を使用した出力DNAの相対量が、異なる量の入力DNAに対して実質的に同様であったことを示す。
実施例1と実質的に同様の研究では、P5/P7プライマー系又はGGA/AAGプライマー系のいずれかを使用して、様々な量の入力DNAに対する出力DNAの相対量を測定した。表1及び図11は、結果を要約する。表1は、GGA/AAGプライマー系を使用した出力DNAの相対量が、異なる量の入力DNAに対して実質的に同様であったことを示す。
ライブラリを、様々な量のライブラリ入力DNAについて、1時間又は一晩のいずれかにわたってビーズにハイブリダイズさせた。図12は、P5/P7系を使用した一晩のハイブリダイゼーションが有意な量の副産物をもたらしたことを示す。
実施例3-GGA/AAGプライマー系又はP5/P7プライマー系を用いた配列決定による遺伝子型決定
GGA/AAGプライマー系又はP5/P7プライマー系を、12プレックスビーズプールを用いた研究で比較した。簡潔には、4.8Mビーズ/条件(各ビーズタイプ800K)、各ビーズプールの複製物を使用した。ヒトgDNAを全ゲノム増幅し、約50μgの増幅DNAを24%ホルムアミド中でビーズ上の捕捉プローブと室温で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズされていないDNAをビーズから洗い流し、捕捉プローブを伸長させ、ハイブリダイズされたDNAを伸長された捕捉プローブから除去し、溶液中のP7プライマー又はAAGプライマーのいずれかを使用して捕捉プローブを増幅した。増幅産物を定量的PCR(quantitative PCR、qPCR)によって分析した。図13は、ビーズ上での増幅を有するqPCR産物及び有しないqPCR産物の例を示す。GGA/AAGプライマー系を使用して、より高い増幅収量が観察された。
GGA/AAGプライマー系又はP5/P7プライマー系を、12プレックスビーズプールを用いた研究で比較した。簡潔には、4.8Mビーズ/条件(各ビーズタイプ800K)、各ビーズプールの複製物を使用した。ヒトgDNAを全ゲノム増幅し、約50μgの増幅DNAを24%ホルムアミド中でビーズ上の捕捉プローブと室温で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイズされていないDNAをビーズから洗い流し、捕捉プローブを伸長させ、ハイブリダイズされたDNAを伸長された捕捉プローブから除去し、溶液中のP7プライマー又はAAGプライマーのいずれかを使用して捕捉プローブを増幅した。増幅産物を定量的PCR(quantitative PCR、qPCR)によって分析した。図13は、ビーズ上での増幅を有するqPCR産物及び有しないqPCR産物の例を示す。GGA/AAGプライマー系を使用して、より高い増幅収量が観察された。
実施例4-GGA/AAGプライマー系を用いた配列決定による遺伝子型決定
実施例3で使用したプロトコルと実質的に同様のプロトコルの例を提供する。プライマーの命名法は、図5及び図6と一致している。工程は、一晩のハイブリダイゼーション、ギャップ充填ライゲーション、exAMP正規化、一段階exAMP及び/又は二段階exAMP、並びに配列決定を含んだ。
実施例3で使用したプロトコルと実質的に同様のプロトコルの例を提供する。プライマーの命名法は、図5及び図6と一致している。工程は、一晩のハイブリダイゼーション、ギャップ充填ライゲーション、exAMP正規化、一段階exAMP及び/又は二段階exAMP、並びに配列決定を含んだ。
一晩のハイブリダイゼーション:(1)LSP2及びインデックスプライマーを10:9の比率(LSP2:インデックス比は5μM:4.5μMに相当する)で1倍アニーリング緩衝液(10mM Tris-HCl、pH7.5、100mM NaCl、0.1mM EDTA)中でアニールし、氷上に保持した。(2)特異的ゲノム遺伝子座に対する捕捉オリゴと個別に予め結合したビーズのパネルを混合することによってLSP1ビーズプールを調製し、ExAMP正規化用のプライマーとして後の工程で機能する「GGA-増幅」オリゴ(配列番号5)を調製した。(3)各サンプル管に所望の量のLSP1ビーズプール(例えば、1遺伝子座当たり500個のLSP1ビーズ)を添加し、各管内のビーズ総数を空のPMPビーズで500万個にした。空のPMPビーズを使用してビーズ損失を減少させた。(4)別個の管内で、5μlの事前に調製した全ゲノム増幅(whole genom amplified、WGA)DNA、17μlのIllumina RA1緩衝液を混合し、95℃で5分間熱変性させた。(5)WGA DNA変性中、ビーズを磁化し、上清を除去し、RA1緩衝液中の22μlの変性WGA DNAをビーズペレットに移し、再懸濁した。(6)2μlの5:4.5μMのLSP2:インデックス二本鎖を添加した。LSP2:インデックス二本鎖は、最終約に約400:360nMであった。(7)一定速度で回転させながら、又は頻繁に撹拌しながら、48℃で一晩のハイブリダイゼーションを行った。
ギャップ充填ライゲーション:(1)インキュベートした後、ビーズを磁化し、上清を廃棄した。(2)ビーズを42℃に予熱した100μlのRA1緩衝液中に再懸濁した。ビーズを42℃で5分間インキュベートした。(3)加熱洗浄工程をあと2回繰り返した。(4)100μlのGBS洗浄緩衝液(100mM Tris-HCl、pH7.5、100mM NaCl、0.1%Tween(登録商標)20)で1回洗浄した。(5)ビーズを磁化し、上清を除去し、20μlのIllumina ELM3混合物中に再懸濁した。ビーズを室温で30分間インキュベートした。(6)インキュベートした後、ビーズを磁化し、上清を廃棄した。(7)100μlのGBS洗浄緩衝液で2回洗浄した。(8)ビーズを磁化し、上清を廃棄し、ビーズを20μlの0.1N NaOH中に再懸濁した。ビーズを室温で5分間インキュベートした。(9)ビーズを磁化し、上清を除去し、100μlのGBS洗浄緩衝液で3回洗浄した。
ExAMP正規化:(1)ExAMP試薬を以下のように調製した(8つのサンプル):140μlのEPX1、20μlのEPX2、74μlのEPX3、200nMの最終溶液中「AAGGGGT」プライマー(配列番号6)を混合した。(2)ビーズを磁化し、上清を除去し、ビーズを5μlのRSB中に再懸濁し、ビーズに20μlのEPX/溶液中プライマー混合物を添加した。一段階又は二段階ExAMPプロトコルを続けた。
一段階ExAMP:(1)ビーズを38℃で15分間インキュベートした。15分後、350nMの最終「P5-GGA」(配列番号7)及び350nMの最終「AAGGGGT-P7」(配列番号8)アダプタープライマーを添加した。(2)ビーズを回転させながら38℃でさらに45分間インキュベートした。
二段階ExAMP:(1)ビーズを38℃で1時間インキュベートした。(2)インキュベートした後、新たなExAMPサンプルを以下のように調製した(8個のサンプル):140μlのEPX1、20μlのEPX2、74μlのEPX3、500nMの「P5-GGA」プライマー(配列番号7)、及び500nMの「AAGGGGT-P7」プライマー(配列番号8)を混合した。(3)ビーズを磁化し、上清を除去し、GBS洗浄緩衝液で1回洗浄した。(4)5μlのRSB及び20μlの新たなExAMP/プライマー混合物でビーズを再懸濁した。(5)ビーズを回転させながら38℃でさらに1時間インキュベートした。
配列決定:(1)インキュベートした後、サンプルをQubitで定量化した5μgのZymoカラムで洗浄し、配列決定のためにクラスター化した。(2)配列決定を以下のように単一リード及び単一インデックスランで行った:リード1:76bpの「P5-GGA」リード1プライマー(配列番号7)。インデックス1:8bpのCS’インデックス1プライマー(配列番号9)。表2は、ある特定のプライマーの配列を列記する。
実施例5-加速された効率的な核酸増幅
この実施例では、全ゲノム増幅反応を行い、PPi蓄積が反応速度に悪影響を及ぼし、重合を阻害したかを決定した。増幅中のDNA収量を、PicoGreen dsDNA定量キット(Molecular Probes)で測定した。DNA収量は37℃で3時間後に80μgに達し、最大24時間まで実質的に一定のままであった。dNTPの量を増加させても反応速度は増加しなかった。
この実施例では、全ゲノム増幅反応を行い、PPi蓄積が反応速度に悪影響を及ぼし、重合を阻害したかを決定した。増幅中のDNA収量を、PicoGreen dsDNA定量キット(Molecular Probes)で測定した。DNA収量は37℃で3時間後に80μgに達し、最大24時間まで実質的に一定のままであった。dNTPの量を増加させても反応速度は増加しなかった。
不溶性沈殿物がDNA増幅中に反応管内に蓄積した。この不溶性物質がPPi沈殿物であると仮定した。DNA増幅後に沈殿物を0.1~1単位の無機ピロホスファターゼ(inorganic pyrophosphatase、iPPase)(New England Biolabs、M0361L)で処理した。しかしながら、沈殿物を加水分解する試みは失敗した。iPPase活性は不溶性PPi基質によって抑制されたかもしれず、かつ/又はiPPaseは、複合体形成されていないPPi基質と比較して、ピロリン酸マグネシウム複合体との活性を欠いている可能性がある。マグネシウムPPi複合体の蓄積が、以下の2つの機構:(1)反応を加ピロリン酸分解方向に駆動するPPiイオン、及び(2)ピロリン酸マグネシウム種の形成によるMg2+イオン枯渇を介して、反応速度を抑制することができると仮定した。
PPiの生成を減少させ、加ピロリン酸分解及びマグネシウムPPi複合体の形成を最小限に抑えるために、PPiがリアルタイムで生成されているときにiPPaseがPPiを加水分解するように、iPPaseを等温全ゲノム増幅反応物に添加した。全ゲノム増幅反応物をiPPase(IPP)の存在下又は不在下のいずれかで200ngの入力DNAと0.5~3時間インキュベートした。図22は、IPPの存在下又は不在下で行われ、かつ0.5時間、1時間、2時間、及び3時間のインキュベーション時間でサンプリングされた増幅反応物の総DNA収量のグラフである。iPPaseを含まない反応の場合、DNA収量80μgが3時間後に観察され、時間によらず実質的に一定であった。iPPaseを含む反応の場合、DNA収量80μgが1時間後に達成され、時間によらず実質的に一定であった。これらの観察結果は、全ゲノム増幅中のPPi生成と一致しており、増加したレベルの加ピロリン酸分解及びマグネシウムPPi複合体形成を含む悪影響をもたらした。
増幅反応を100ngのDNAで繰り返した。DNAをInfinium EXワークフローで処理して、1サンプルウェル当たり60KのSNP含有量で機能的遺伝子型決定性能を測定した。染色後のスペクトル特有の色素に由来するXraw及びYraw色素強度を測定した(図23)。図23は、60KのInfinium EXビーズチップを用いてiPPase(IPP)の存在下又は不在下で行われ、かつ0.5時間、1時間、2時間、及び3時間のインキュベーション時間でサンプリングされた増幅反応物の蛍光強度のグラフを示す。図23に示されるように、iPPaseを含む製剤でのXraw及びYraw強度値は、より短い増幅時間(30分及び1時間)でより高く、2時間及び3時間で等しかった。iPPase(IPP)の存在下又は不在下で行われ、かつ0.5時間、1時間、2時間、及び3時間のインキュベーション時間でサンプリングされた増幅反応物のコール率を図24に示す。図24に示されるように、重要な遺伝子型測定基準であるコール率は、30分時点及び1時間時点で、DNA増幅でiPPaseを含む製剤でより高かった。コール率は、1時間時点で下限仕様限界(lower specification limit、LSL=0.995)を超えた一方で、iPPaseを含まない製剤は、最低2時間の増幅時間を必要とした。したがって、増幅反応におけるiPPaseの存在が反応効率を大幅に増加させた。
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、「包含する」、「含有する」又は「特徴とする」と同義であり、包括的又は非限定的であり、更なる列挙されていない要素又は方法工程を除外しない。
上記の説明は、本発明のいくつかの方法及び材料を開示するものである。本発明は、方法及び材料の修正、並びに製造方法及び設備の変更を受け入れる余地がある。そのような修正は、本開示又は本明細書に開示される本発明のその開示又は実施を考慮することで当業者に明らかになるであろう。したがって、本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態に限定されることを意図するものではなく、本発明の真の範囲及び趣旨に含まれる全ての修正及び代替を網羅することを意図する。
公開及び未公開の出願、特許、並びに文献の参照を含むがこれらに限定されない、本明細書で引用される全ての参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれ、本明細書の一部をなす。参照により組み込まれる刊行物及び特許又は特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する場合、本明細書は、そのような矛盾する資料に優先する及び/又はより上位にあることを意図する。
Claims (117)
- 標的核酸を含む核酸ライブラリを正規化する方法であって、
(a)正規化量の捕捉プローブが結合した基質を得ることであって、前記捕捉プローブが第1の増幅部位を含む、得ることと、
(b)複数の標的核酸を前記捕捉プローブにハイブリダイズさせることと、
(c)前記捕捉プローブを伸長させて、伸長されたプローブを得ることであって、前記伸長されたプローブが第2の増幅部位を含む、得ることと、
(d)伸長プライマーを前記第2の増幅部位にハイブリダイズさせることによって前記伸長されたプローブを増幅することであって、前記伸長プライマーの量が前記捕捉プローブの前記正規化量以上であり、前記増幅が、実質的に全ての前記捕捉プローブが伸長されるように行われ、それにより、正規化量の増幅された標的核酸が得られる、増幅することと、を含み、
前記第1の増幅部位と前記伸長プライマーが互いにハイブリダイズすることができないか、又は互いに本質的にハイブリダイズすることができない、方法。 - 前記第1の増幅部位と前記伸長プライマーが互いに非相補的である、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位及び前記伸長プライマーが互いに非相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位が、前記伸長プライマーとのハイブリダイゼーションを阻害する修飾ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位及び前記伸長プライマーが各々、同じタイプのヌクレオチドを欠いている、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位が、互いに相補的なタイプのヌクレオチドを欠いており、前記伸長プライマーが各々、前記第1の増幅部位と同じタイプのヌクレオチドから本質的になる、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位が、アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、及びチミン(T)から選択される少なくとも1つのタイプのヌクレオチドを欠いている、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位が、アデニン(A)とチミン(T)又はグアニン(G)とシトシン(C)から選択されるヌクレオチドの組み合わせを欠いている、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位が、アデニン(A)とグアニン(G)、アデニン(A)とシトシン(C)、シトシン(C)とチミン(T)、又はグアニン(G)とチミン(T)から選択されるヌクレオチドの組み合わせからなる、請求項7又は8に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位が、アデニン(A)とグアニン(G)のヌクレオチドの組み合わせからなる、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記伸長プライマーが溶液中に存在する、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉プローブが第1のインデックス又は第1の配列決定プライマー部位を含む、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉プローブが第1の遺伝子座特異的プライマーを含む、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
- 前記複数の標的核酸が前記第1の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズする、請求項13に記載の方法。
- 前記捕捉プローブの伸長が、前記第1の遺伝子座特異的プライマーを第2の遺伝子座特異的プライマーにライゲーションすることを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記捕捉プローブの伸長が、
(i)第2の遺伝子座特異的プライマーを前記標的核酸にハイブリダイズさせることと、(ii)前記第1の遺伝子座特異的プライマーを前記第2の遺伝子座特異的プライマーにライゲーションすることと、を含む、請求項15に記載の方法。 - 前記第2の遺伝子座特異的プライマーが前記第2の増幅部位を含む、請求項16に記載の方法。
- 前記第2の遺伝子座特異的プライマーが第2のインデックス又は第2の配列決定プライマー部位を含む、請求項16又は17に記載の方法。
- (iii)伸長オリゴヌクレオチドを前記第2の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズさせることと、
(iv)前記第2の遺伝子座特異的プライマーを、ポリメラーゼ伸長によって前記伸長オリゴヌクレオチドに相補的な配列で伸長させることと、を更に含む、請求項16に記載の方法。 - 前記伸長オリゴヌクレオチドが、前記第2の増幅部位に相補的な部位、第2のインデックスに相補的な部位、又は第2の配列決定プライマー部位に相補的な部位を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記標的核酸が前記第2の増幅部位に相補的な部位を含み、前記伸長が、前記標的核酸に相補的な配列での前記第1の遺伝子座特異的プライマーのポリメラーゼ伸長を含む、請求項16~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記標的核酸の末端にアダプターを付加することによって前記標的核酸を調製することを更に含み、前記アダプターが前記第2の増幅部位に相補的な部位を含む、請求項21に記載の方法。
- アダプターの付加がタグメンテーション反応を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記基質が複数のビーズを含む、請求項1~23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記基質がフローセルを含む、請求項1~24のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅が、前記捕捉プローブの前記正規化量が増幅産物の量を制限するような条件下で行われる、請求項1~25のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅された標的核酸を配列決定することを更に含む、請求項1~26のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸ライブラリを調製する方法であって、
(a)複数の捕捉プローブが結合した基質を得ることであって、前記捕捉プローブが第1の増幅部位及び第1の遺伝子座特異的プライマーを含む、得ることと、
(b)複数の標的核酸を前記第1の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズさせることと、
(c)第2の遺伝子座特異的プライマーを前記標的核酸にハイブリダイズさせることと、
(d)前記第2の遺伝子座特異的プライマーを伸長オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることであって、前記伸長オリゴヌクレオチドが第2の増幅部位に相補的な部位を含む、ハイブリダイズさせることと、
(e)
(i)前記第1の遺伝子座特異的プライマーを前記第2の遺伝子座特異的プライマーにライゲーションすること、及び
(ii)前記ライゲーションされた第2の遺伝子座特異的プライマーを、ポリメラーゼ伸長によって伸長オリゴヌクレオチドに相補的な配列で伸長させること
によって、前記ハイブリダイズされた第2の遺伝子座特異的プライマーを伸長させて、複数の伸長されたプローブを得ることと、を含む、方法。 - (i)が、前記第1の遺伝子座特異的プライマーを伸長させることと、前記第1の遺伝子座特異的プライマーを前記第2の遺伝子座特異的プライマーにライゲーションすることと、を含む、請求項28に記載の方法。
- 前記捕捉プローブが第1のインデックス又は第1の配列決定プライマー部位を含む、請求項28又は29に記載の方法。
- 前記伸長オリゴヌクレオチドが、第2のインデックスに相補的な部位又は第2の配列決定プライマー部位に相補的な部位を含む、請求項28~30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記基質が複数のビーズを含む、請求項28~31のいずれか一項に記載の方法。
- 前記基質がフローセルを含む、請求項28~32のいずれか一項に記載の方法。
- 正規化量の増幅された標的核酸を得ることであって、
伸長プライマーを前記第2の増幅部位にハイブリダイズさせることによって前記伸長されたプローブを増幅することを含む、得ることを更に含み、前記基質が正規化量の前記捕捉プローブを含み、前記伸長プライマーの量が前記捕捉プローブの前記正規化量以上である、請求項28~33のいずれか一項に記載の方法。 - 前記伸長プライマーが溶液中に存在する、請求項34に記載の方法。
- 前記増幅が、前記捕捉プローブの前記正規化量が増幅産物の量を制限するような条件下で行われる、請求項34又は35に記載の方法。
- 前記増幅された標的核酸を配列決定することを更に含む、請求項34~36のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位又は前記第2の増幅部位が、P5配列、P5配列の相補体、P7配列、又はP7配列の相補体を含む、請求項28~37のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位と前記伸長プライマーが互いにハイブリダイズすることができないか、又は互いに本質的にハイブリダイズすることができない、請求項28~38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位と前記伸長プライマーが互いに非相補的である、請求項39に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位及び前記伸長プライマーが互いに非相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項39に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位が、前記伸長プライマーとのハイブリダイゼーションを阻害する修飾ヌクレオチドを含む、請求項39に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位及び前記伸長プライマーが各々、同じタイプのヌクレオチドを欠いている、請求項39に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位が、アデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、及びチミン(T)から選択される少なくとも1つのタイプのヌクレオチドを欠いている、請求項39に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位が、アデニン(A)とチミン(T)又はグアニン(G)とシトシン(C)から選択されるヌクレオチドの組み合わせを欠いている、請求項39に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位が、アデニン(A)とグアニン(G)、アデニン(A)とシトシン(C)、シトシン(C)とチミン(T)、又はグアニン(G)とチミン(T)から選択されるヌクレオチドの組み合わせからなる、請求項44又は45に記載の方法。
- 前記第1の増幅部位が、アデニン(A)とグアニン(G)のヌクレオチドの組み合わせからなる、請求項44~46のいずれか一項に記載の方法。
- 正規化された核酸ライブラリを調製する方法であって、
(a)複数の捕捉プローブ及び複数の伸長プライマーが結合した基質を得ることであって、前記捕捉プローブが第1の増幅部位及び第1の遺伝子座特異的プライマーを含み、前記伸長プライマーが第2の増幅部位にハイブリダイズすることができ、前記捕捉プローブ又は前記伸長プライマーの量が正規化量である、得ることと、
(b)複数の標的核酸を前記第1の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズさせることと、
(c)捕捉プローブを伸長させて、伸長されたプローブを得ることであって、伸長されたプローブが第2の増幅部位を含む、得ることと、
(e)伸長されたプローブを伸長プライマーにハイブリダイズさせることによって伸長されたプローブを増幅して、正規化量の増幅された標的核酸を得ることと、を含む、方法。 - 前記正規化量が前記増幅された標的核酸の量を制限する、請求項48に記載の方法。
- 前記捕捉プローブが第1のインデックス又は第1の配列決定プライマー部位を含む、請求項48又は49に記載の方法。
- 前記伸長オリゴヌクレオチドが、第2のインデックスに相補的な部位又は第2の配列決定プライマー部位に相補的な部位を含む、請求項48~50のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅が、前記捕捉プローブ又は前記伸長プライマーの前記正規化量が増幅産物の量を制限するような条件下で行われる、請求項48~51のいずれか一項に記載の方法。
- 前記基質が複数のビーズを含む、請求項48~52のいずれか一項に記載の方法。
- 前記基質がフローセルを含む、請求項48~53のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅がブリッジ増幅を含む、請求項48~54のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅された標的核酸を配列決定することを更に含む、請求項48~55のいずれか一項に記載の方法。
- 前記捕捉プローブの伸長が、前記第1の遺伝子座特異的プライマーを第2の遺伝子座特異的プライマーにライゲーションすることを含む、請求項48に記載の方法。
- 前記捕捉プローブの伸長が、
(i)第2の遺伝子座特異的プライマーを前記標的核酸にハイブリダイズさせることと、
(ii)前記第1の遺伝子座特異的プライマーを前記第2の遺伝子座特異的プライマーにライゲーションすることと、を含む、請求項48に記載の方法。 - 前記第2の遺伝子座特異的プライマーが前記第2の増幅部位を含む、請求項58に記載の方法。
- 前記第2の遺伝子座特異的プライマーが第2のインデックス又は第2の配列決定プライマー部位を含む、請求項58又は59に記載の方法。
- (iii)伸長オリゴヌクレオチドを前記第2の遺伝子座特異的プライマーにハイブリダイズさせることと、
(iv)前記第2の遺伝子座特異的プライマーを、ポリメラーゼ伸長によって前記伸長オリゴヌクレオチドに相補的な配列で伸長させることと、を更に含む、請求項48に記載の方法。 - 前記伸長オリゴヌクレオチドが、前記第2の増幅部位に相補的な部位、第2のインデックスに相補的な部位、又は第2の配列決定プライマー部位に相補的な部位を含む、請求項61に記載の方法。
- 前記標的核酸が前記第2の増幅部位に相補的な部位を含み、前記伸長が、前記標的核酸に相補的な配列での前記第1の遺伝子座特異的プライマーのポリメラーゼ伸長を含む、請求項61又は62に記載の方法。
- 前記標的核酸の末端にアダプターを付加することによって前記標的核酸を調製することを更に含み、前記アダプターが前記第2の増幅部位に相補的な部位を含む、請求項63に記載の方法。
- アダプターの付加がタグメンテーション反応を含む、請求項64に記載の方法。
- 前記標的核酸中のバリアントの存在又は不在を決定することを更に含む、請求項48~65のいずれか一項に記載の方法。
- インデックス付き核酸ライブラリを調製する方法であって、
(a)Yアダプターを複数の標的核酸に付加することであって、前記Yアダプターが前記標的核酸の各々の第1の末端及び第2の末端に付加され、前記Yアダプターが各々、第1のプライマー結合部位及びモザイク要素を含む第1の鎖と、第2のプライマー結合部位及び前記モザイク要素の相補体を含む第2の鎖とを含む、付加することと、
(b)第1の伸長オリゴヌクレオチドを前記第2のプライマー結合部位にハイブリダイズさせることであって、前記第1の伸長オリゴヌクレオチドが第1のインデックス及び第3のプライマー結合部位を含む、ハイブリダイズさせることと、
(c)前記第2のプライマー結合部位を含む前記第2の鎖を伸長させ、それにより、前記第1のインデックスを前記標的核酸に付加することと、を含む、方法。 - 前記Yアダプターの前記第1の鎖の5’末端がヌクレアーゼ分解に耐性を示す、請求項67に記載の方法。
- 前記Yアダプターの前記第1の鎖の5’末端が2つの連続するヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を含む、請求項67又は68に記載の方法。
- 前記Yアダプターの前記第2の鎖の5’末端がリン酸化されている、請求項67~69のいずれか一項に記載の方法。
- (a)が、前記複数の標的核酸を複数のトランスポソームと接触させることを含み、前記トランスポソームが各々、Yアダプター及びトランスポザーゼを含む、請求項67~70のいずれか一項に記載の方法。
- 前記トランスポソームがダイマーを含む、請求項71に記載の方法。
- 前記トランスポザーゼがTn5トランスポザーゼを含む、請求項71又は72に記載の方法。
- 前記トランスポソームが基質に結合している、請求項71~73に記載の方法。
- 前記基質が複数のビーズを含む、請求項74に記載の方法。
- 前記ビーズが磁性である、請求項75に記載の方法。
- 前記第1の伸長オリゴヌクレオチドの3’末端がブロックされている、請求項67~76のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の伸長オリゴヌクレオチドの5’末端がリン酸化されている、請求項67~77のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第1の伸長オリゴヌクレオチドがビーズに結合している、請求項67~78のいずれか一項に記載の方法。
- (c)の前に前記第1の伸長オリゴヌクレオチドを前記ビーズから切断することを更に含む、請求項79に記載の方法。
- (c)がポリメラーゼ伸長を含む、請求項67~80のいずれか一項に記載の方法。
- (c)がリガーゼでの伸長を含む、請求項67~80のいずれか一項に記載の方法。
- リガーゼでの伸長が、
ライゲーションオリゴヌクレオチドを、前記第2のプライマー結合部位にハイブリダイズされた前記第1の伸長オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることと、
前記ライゲーションオリゴヌクレオチドを、前記第2のプライマー結合部位を含む前記第2の鎖にライゲーションすることと、を含む、請求項82に記載の方法。 - 前記ライゲーションオリゴヌクレオチドが追加のインデックスを含む、請求項83に記載の方法。
- 前記ライゲーションオリゴヌクレオチドが追加のプライマー結合部位を含む、請求項83に記載の方法。
- 工程(c)の後に前記第1の伸長オリゴヌクレオチドを除去することを更に含む、請求項67~85のいずれか一項に記載の方法。
- 前記除去がエキソヌクレアーゼ処理を含む、請求項86に記載の方法。
- 前記第1の伸長オリゴヌクレオチドがウラシルヌクレオチドを含み、前記除去が、ウラシル特異的切除試薬(USER)酵素による前記第1の伸長オリゴヌクレオチドの分解を含む、請求項87に記載の方法。
- 前記第1のインデックスを含む前記標的核酸を増幅することを更に含む、請求項67~88のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅が、増幅プライマーを前記第1のプライマー結合部位及び前記第3のプライマー結合部位にハイブリダイズさせることを含む、請求項89に記載の方法。
- 前記増幅がPCRを含む、請求項89又は90に記載の方法。
- 前記増幅がブリッジ増幅を含む、請求項89又は90に記載の方法。
- 第2のインデックスを、前記第1のインデックスを含む前記標的核酸に付加することを更に含む、請求項67~92のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2のインデックスの付加が、
第2の伸長オリゴヌクレオチドを、前記第1のインデックスを含む前記標的核酸の前記第3のプライマー結合部位にハイブリダイズさせることであって、前記第2の伸長オリゴヌクレオチドが前記第2のインデックスを含む、ハイブリダイズさせることと、
前記第3のプライマー結合部位を含む前記第2の鎖を伸長させ、それにより、前記第2のインデックスを、前記第1のインデックスを含む前記標的核酸に付加することと、を含む、請求項93に記載の方法。 - 前記第2の伸長オリゴヌクレオチドの3’末端がブロックされている、請求項94に記載の方法。
- 前記第2の伸長オリゴヌクレオチドの5’末端がリン酸化されている、請求項94又は95に記載の方法。
- 前記第3のプライマー結合部位を含む前記第2の鎖の伸長がポリメラーゼ伸長を含む、請求項94~96のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第3のプライマー結合部位を含む前記第2の鎖の伸長がリガーゼでの伸長を含む、請求項94~96のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第3のプライマー結合部位を伸長させた後に前記第2の伸長オリゴヌクレオチドを除去することを更に含む、請求項94~98のいずれか一項に記載の方法。
- 第3のインデックスを、前記第2のインデックスを含む前記標的核酸に付加することを更に含む、請求項94~99のいずれか一項に記載の方法。
- 追加のインデックスを、前記第3のインデックスを含む前記標的核酸に付加することを更に含む、請求項100に記載の方法。
- 前記標的核酸がゲノムDNAを含む、請求項67~101のいずれか一項に記載の方法。
- 複数の標的核酸をコンビナトリアルインデックス付けする方法であって、
(a)一次インデックス付き核酸のプールを得ることであって、
標的核酸を第1のインデックスで伸長させることによって前記第1のインデックスを前記標的核酸の複数の亜集団に付加することであって、異なる第1のインデックスが前記亜集団の各々に付加される、付加することと、
前記異なる第1のインデックスを含む前記亜集団を組み合わせて、前記一次インデックス付き核酸のプールを得ることと、を含む、得ることと、
(b)前記プールを一次インデックス付き核酸の複数の亜集団に分けることと、
(c)二次インデックス付き核酸のプールを得ることであって、
前記一次インデックス付き核酸を第2のインデックスで伸長させることによって前記第2のインデックスを前記一次インデックス付き核酸の複数の亜集団に付加することであって、異なる第2のインデックスが前記亜集団の各々に付加される、付加することと、
前記異なる第2のインデックスを含む前記亜集団を組み合わせて、前記二次インデックス付き核酸のプールを得ることと、を含む、得ることと、を含む、方法。 - (b)及び(c)を繰り返すことと、追加のインデックスをインデックス付き亜集団に付加することと、を更に含む、請求項103に記載の方法。
- 第1のインデックスの前記標的核酸の亜集団への付加が、ウェル、チャネル、又は液滴から選択される区画内で行われる、請求項103又は104に記載の方法。
- 前記増幅及び/又は前記伸長が、無機ピロリン酸(PPi)を除去する、加ピロリン酸分解を阻害する、かつ/又はMg2+-PPi複合体の形成を阻害するのに好適な条件下で行われる、請求項1~106のいずれか一項に記載の方法。
- 核酸を修飾する方法であって、
ポリメラーゼの存在下で前記核酸を増幅する又は伸長させることを含み、前記増幅及び/又は前記伸長が、無機ピロリン酸(PPi)を除去する、加ピロリン酸分解を阻害する、かつ/又はMg2+-PPi複合体の形成を阻害するのに好適な条件下で行われる、方法。 - 前記PPiが可溶性である、請求項106又は107に記載の方法。
- 前記増幅及び/又は前記伸長が無機ピロホスファターゼの存在下で行われる、請求項1~108のいずれか一項に記載の方法。
- 無機ピロホスファターゼの存在下で前記増幅及び/又は前記伸長の産物収量を達成する速度が、無機ピロホスファターゼの不在下で前記増幅及び/又は前記伸長の産物収量を達成する速度と比較して増加する、請求項109に記載の方法。
- 前記増幅及び/又は前記伸長の産物収量を達成する前記速度が少なくとも2倍増加する、請求項110に記載の方法。
- 前記増幅及び/又は前記伸長が等温条件下で行われる、請求項1~111のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅及び/又は前記伸長が、PCR、ブリッジ増幅、全ゲノム増幅、ループ媒介等温増幅(LAMP)、単一細胞から得られた核酸からの増幅、合成による配列決定(SBS)反応、及び除外増幅(ExAMp)から選択される反応を行うことを含む、請求項1~112のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅及び/又は前記伸長が、単一細胞から得られた核酸からの増幅を行うことを含む、請求項1~113のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅及び/又は前記伸長が、合成による配列決定(SBS)反応を行うことを含む、請求項1~113のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増幅及び/又は前記伸長が、ブリッジ増幅を行うことを含む、請求項1~113のいずれか一項に記載の方法。
- 配列決定反応が前記増幅及び/又は前記伸長を含む、請求項1~113のいずれか一項に記載の方法。
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