JP2003501071A - 複数の核酸の固相増幅法 - Google Patents

複数の核酸の固相増幅法

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JP2003501071A JP2001501652A JP2001501652A JP2003501071A JP 2003501071 A JP2003501071 A JP 2003501071A JP 2001501652 A JP2001501652 A JP 2001501652A JP 2001501652 A JP2001501652 A JP 2001501652A JP 2003501071 A JP2003501071 A JP 2003501071A
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ボールズ，ティー．，クリスチャン
エイブラムス，エズラ，エス．
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Abstract

(57)【要約】 回収された一本鎖増幅一本鎖核酸分子を、第二および後続の段階のブリッジ増幅を開始するために使用する多段階ブリッジ増幅法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 マイクロアレイ技術における最近の発展は、１つの核酸試料中の何十万もの個
々の遺伝要素を同時に分析することを可能にしている。数十万のオリゴヌクレオ
チドを含有するプローブアレイが１つのガラスチップ（１ｃｍ2 ）上に存在する
技術が既に存在する（Wang, D.G.ら、Science,280:1077-1082(1998) ）。しかし
、この合成能力の増大は、ハイブリッド形成標的を得るためのポリメラーゼ連鎖
反応（ＰＣＲ）増幅技術の能力を越えている。例えば、１０4 個のランダムに分
布したヒト単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）用のプローブを含有するマイクロア
レイを使用して、１つのハイブリッド形成実験において１つの個体の詳細なゲノ
ムマップを得ることができる。現在、単一のＰＣＲ反応において１００個を越え
る独立した遺伝子座を増幅することは極めて困難である（Wang, D.G.ら、Scienc
e,280:1077-1082(1998) ）。従って、現在のＰＣＲ技術を使用する場合、１０4 遺伝子座ＳＮＰタイピングチップ（typing chip ）を完全に利用するためには、
各反応が１００個の異なる遺伝子座を増幅する少なくとも１００の別個のＰＣＲ
反応を実施し、プールしなければならない。
【０００２】 質量分析法のような他の多重遺伝子タイピング（multiplex genotyping）技術
にも同様の困難が予想される（Hallら、Nature biotechnology, 16:1352-1365(1
998)、およびFuら、Nature Biotechnology, 16:381(1998)）。このような理由か
ら、大量の多重（multiplex ）核酸増幅を可能にする新規方法が必要とされてい
る。そのような方法は、１つの反応において、１０3 〜１０4 個の異なる産物を
生じうるのが理想的であろう。マイクロアレイまたは多重質量分析タイピング法
と組み合わせたそのような多重増幅法は、多数の個体の高密度全ゲノムＳＮＰマ
ップを迅速に作成することを可能にするであろう。これは、直ちに、複合体質（
complex traits）（例えば、喘息、高血圧および種々の形態の心臓疾患）、ヒト
遺伝疾患研究、薬理遺伝学および癌生物学を包含する多くの分野における遺伝子
研究を促進するであろう。改良された多重増幅法はまた、遺伝子発現の分析を非
常に容易にするであろう。
【０００３】 発明の概要 本発明は、固相増幅法を使用して、標的核酸分子を増幅する方法を開示する。
そのような方法の１つは、米国特許第５，６４１，６５８号に開示されており、
それに開示の内容は全て本発明の開示の一部を構成するものとする。一段階の固
相増幅法が、本明細書おいて「ブリッジ増幅」と称される。
【０００４】 本発明は、回収された一本鎖増幅核酸分子を使用して、ブリッジ増幅の第二の
段階を開始する多段階ブリッジ増幅法を包含する。次の段階のブリッジ増幅が後
に続き、後続の各段階のブリッジ増幅は、その前の段階のブリッジ増幅において
生成された一本鎖増幅核酸分子により開始される。この多段階法は循環的であり
、従って、１つの標的分子を、十万倍以上に増幅させることができる反復プロセ
スを提供する。この反復プロセスは、ブリッジ増幅の増幅力を有意に増加させる
。
【０００５】 より詳しくは、２つまたはそれ以上のブリッジ増幅の段階を含む、１つまたは
それ以上の標的核酸分子の固相多段階増幅法を本明細書において開示する。本発
明の方法において、１つまたはそれ以上の一本鎖核酸分子を第一の段階のブリッ
ジ増幅において生成し、該分子を使用して第二段階のブリッジ増幅を開始し、第
二段階のブリッジ増幅において生成された一本鎖核酸分子を使用して第三段階の
ブリッジ増幅を開始し、第四段階も同様に行い、多段階のブリッジ増幅を経て、
増幅された標的分子を生成する。
【０００６】 第一段階のブリッジ増幅は、ハイブリッド形成条件下に、標的分子に特異的な
固定化オリゴヌクレオチドプライマーを含有する固体支持体と混合された１つま
たはそれ以上の標的核酸分子を含む。例えば、試料（即ち、被検試料）は１つの
タイプの標的分子を含有することができ、固体支持体はそのタイプの標的分子に
特異的な１組の固定化プライマーを含有することができる。または、試料は複数
の標的分子を含有することができ、固体支持体は複数の組の固定化プライマーを
含有し、プライマーの各組は標的分子の１つに特異的である。標的分子は、それ
らの特異的固定化プライマーとハイブリッド形成する。次に、形成したハイブリ
ッド形成複合体を熱サイクル反応によって増幅し、それによって二本鎖増幅核酸
分子を形成する。増幅は、約５〜約５０の熱サイクルからほぼ成り、各熱サイク
ルは、各反応に適した条件下に行われる、変性、プライマーアニーリング、およ
び重合反応（プライマー伸長）から成る。一般に、増幅は約３５の熱サイクルか
ら成る。
【０００７】 二本鎖増幅核酸分子を切断し（cleave）、変性し、それによって一本鎖増幅核
酸分子を解離する（releasing）。次に、これらの新しく解離された一本鎖増幅
核酸分子を、特異的固定化プライマーを含有する新しい固体支持体に接触させ、
第二段階のブリッジ増幅を開始する。ブリッジ増幅の段階は、標的分子の所望の
増幅を達成するまで繰り返されうる。次に、増幅された標的核酸分子を、固体支
持体上で分析するか、または溶液相（solution phase）法または固相法による分
析のために支持体から切断することができる。
【０００８】 本発明のオリゴヌクレオチドプライマーは、固体支持体に固定化される。これ
らのプライマーは、所定の標的核酸分子に特異的である。好ましくは、プライマ
ーは一本鎖ＤＮＡ分子である。本発明の１つの実施態様において、標的分子の増
幅に特異的な１組のプライマー（例えば、第一および第二プライマーから成る１
組のプライマー）を固体支持体に固定化する。第一プライマーは、標的分子に含
有されるヌクレオチド配列領域、例えば３’末端に相補的である。第二プライマ
ーは、標的分子の相補的核酸鎖の３’末端に相補的である。同じ固体支持体に結
合された種々の標的分子に特異的な、多くの組のプライマーが存在する。好まし
くは、プライマーの組の少なくとも一方が、切断性（cleavable）部分を有する
。より好ましくは、各プライマーの組の２つのプライマーが、異なる切断性部分
を有する。例えば、プライマーの組の一方が、そのヌクレオチド配列中に制限部
位を有することができる。
【０００９】 好ましくは、標的分子はＤＮＡ分子である。他の核酸分子、例えばＲＮＡも本
発明に含まれる。標的核酸分子（または単に標的または標的分子）は、植物また
は動物組織に由来しうる。好ましくは、標的分子は、第一固定化プライマーにハ
イブリッド形成することができる１つのヌクレオチド配列領域を有する。標的分
子は、二本鎖または一本鎖形態であることができる。存在する標的分子が二本鎖
形態の場合、それを処理して一本鎖形態にする。
【００１０】 固体支持体は、ビーズ、粒子、シート、ディップスティック、ロッド、膜、フ
ィルター、繊維（例えば、光学繊維およびガラス繊維）等でありうる。好ましく
は、固体支持体はビーズである。固体支持体の材料組成は、プラスチック、ナイ
ロン、ガラス、シリカ、金属、合金、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、
架橋デキストランおよびそれらの組み合わせを包含するが、それらに限定されな
い。固体支持体は、オリゴヌクレオチドプライマーの結合によって改変しうるの
が好ましい。
【００１１】 ブリッジ増幅は、標的分子と第一オリゴヌクレオチドプライマーとの間で形成
されるハイブリッド形成複合体で開始される（図１Ａ参照）。好ましくは、標的
分子は、ハイブリッド形成に好適な条件下に、固体支持体に固定化された第一プ
ライマーにハイブリッド形成し、それによってハイブリッド形成複合体を形成す
る（図１Ａ（ａおよびｂ）参照）。第一プライマーは、重合に好適な条件下にデ
オキシヌクレオチドを添加することによって伸長される（図１Ａ（ｃ）参照）。
相補鎖にハイブリッド形成した標的分子を有する新しく形成された二本鎖（dupl
ex）分子を変性に付し、それによって、その二本鎖から標的分子を解離させる。
相補鎖は、第一プライマーを介して固体支持体に結合したままにされる（図１Ａ
（ｄ）参照）。
【００１２】 一本鎖相補的核酸分子は、固体支持体に固定化されている第二プライマーに接
触させることによって、ブリッジハイブリッド形成複合体を形成する（図１Ａ（
ｅ）参照）。好ましくは、第二プライマーは第一プライマーが結合されているの
と同じ固体支持体に固定化される。第二プライマーは、重合に好適な条件下にデ
オキシヌクレオチドを添加することによって伸長される（図１Ａ（ｆ）参照）。
この新しく形成された二本鎖分子を変性に付して、それぞれのオリゴヌクレオチ
ドプライマーを介して固体支持体に結合している２つの一本鎖核酸分子を得る（
図１Ａ（ｇ）参照）。各一本鎖核酸分子は、ブリッジハイブリッド形成複合体を
形成することができる（図１Ａ（ｈ）参照）。一旦、ブリッジハイブリッド形成
複合体が形成されると、重合に好適な条件下に、新生相補鎖が合成される（図１
Ａ（ｉ）参照）。このプロセス（即ち、図１Ａに示す段階「ｇ」〜「ｉ」の熱サ
イクル工程）を約５〜約５０回繰り返す。一般に、増幅は、約３５の熱サイクル
から成る。このプロセスの次に、二本鎖核酸分子を切断する（図１Ｂ（ｊ）参照
）。１つの実施態様において、第一プライマーを、例えば制限エンドヌクレアー
ゼを使用して切断する。この切断は、二本鎖核酸分子の結合を、第一プライマー
を介する固体支持体へのそれらの結合から分離するであろう。別の実施態様にお
いて、第二プライマーが切断され、それによって、二本鎖核酸分子の結合を、第
二プライマーを介する固体支持体へのそれらの結合から分離する。切断後に、二
本鎖核酸分子を変性に付し、それによって、一本鎖核酸分子を解離し（図１Ｂ（
ｋ）参照）、それを回収し、使用して、第二ラウンドのブリッジ増幅を開始する
ことができる（図２参照）。
【００１３】 本発明の１つの実施態様において、多段階ブリッジ増幅法を使用する、試料中
の１つまたはそれ以上の標的分子の存在または非存在の検出を開示する。この実
施態様において、増幅分子は、生物試料、例えば微生物ＤＮＡにおける、核酸標
的の存在または非存在を検出する信号としての役割を果たすことができる。増幅
工程の間に、新生増幅一本鎖核酸分子が、デオキシヌクレオチドの組み込みによ
って形成される。１つまたはそれ以上のこれらのデオキシヌクレオチドは、新生
増幅一本鎖核酸分子への組み込み前に標識することができる。標識された新生増
幅一本鎖核酸分子の検出は、被検試料中の少なくとも１個の標的分子の存在を示
すものである。放射能以外の標識、例えば、化学発光、発光および蛍光を使用す
ることができる。
【００１４】 本発明の他の実施例において、２つまたはそれ以上の段階のブリッジ増幅を含
む、１つまたはそれ以上の標的核酸分子の固相多段階増幅法に使用される試薬を
供給するキットを開示する。このキットにおいて、第一段階のブリッジ増幅にお
いて生成された一本鎖増幅分子が、第二段階のブリッジ増幅を開始させ、後続の
各段階のブリッジ増幅が、その前の段階のブリッジ増幅において生成された一本
鎖増幅分子で開始され、該キットにおいて、１つの試薬が、１つまたはそれ以上
の標的核酸分子に特異的な１組のプライマーを少なくとも二段階のブリッジ増幅
に充分な量で含有する固相支持体を含んで成る。
【００１５】 従って、本発明は、標的核酸分子の、改良された固相増幅法を提供する。特に
、本発明は、核酸分析のための、改良された多重増幅法を提供する。
【００１６】 発明の詳細な説明 本発明は、固体支持体を使用して多段階増幅を行う、標的核酸分子の増幅法を
開示する。固体支持体を使用するそのような１つの方法は、Adams およびKronの
米国特許第５，６４１，６５８号に開示されているようなブリッジ増幅であり、
それに開示の内容は全て本発明の開示の一部を構成するものとする。この方法は
、本質的に、標的分子に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーが結合されてい
る固体支持体に、標的分子を接触させることから成る。ハイブリッド形成は、標
的分子と固定化オリゴヌクレオチドプライマーの間で生じる。適切な増幅試薬の
存在下に、標的分子を標的分子がハイブリッド形成する固定化プライマーのポリ
メラーゼ伸長のための鋳型鎖として使用して相補的一本鎖核酸分子を合成し、二
本鎖増幅産物を得る。この二本鎖を変性して、標的分子が二本鎖から解離される
ようにする。相補鎖は、固定化オリゴヌクレオチドプライマーを介して固体支持
体に結合したままである。この相補鎖は、その３’末端に相補的なもう１つのプ
ライマーに接触させることによって、ブリッジ様構造を形成する。適切な試薬の
存在下に、相補鎖を、第一相補鎖に同調させて、二本鎖核酸分子を形成する。こ
の二本鎖を変性して、これらの相補鎖が接触し、新しいプライマーにハイブリッ
ド形成しうるようにし、それによって新しいラウンドの増幅を促進する。
【００１７】 ブリッジ増幅は、ＰＣＲのような他の増幅法と比較して、標的容量が顕著に増
加される。本発明を使用した場合、多段階ブリッジ増幅法を使用した増幅力は、
溶液相ＰＣＲの増幅力にほぼ等しい。
【００１８】 現在、１つの試料中の多くの異なる標的核酸分子を、ブリッジ増幅を使用して
増幅することができる（米国特許第５，６４１，６５８号参照）。他の多重法（
multiplex methods ）は、溶液相ＰＣＲに基づくものであり、１つの反応におい
て約１００個またはそれ以下の標的核酸分子に制限されている。この制限は、お
そらく、ＰＣＲプライマーの組が高濃度で存在し、実際の増幅標的より効率的に
増幅される非生産的な「プライマー−ダイマー」産物を形成する故に存在すると
推測される（Chouら、Nucleic Acid Res., 20:1717-1723(1996) 、およびLandeg
ren, Current Opinion in Biotech., 7:95-97(1996) ）。ブリッジ増幅法は、特
定の標的のための両方のプライマーが共通の固体支持体に固定化されているプラ
イマーの組を使用することによって、この制限を除去する。非生産的なプライマ
ー−プライマー相互作用は、プライマー固定によって除去される。さらに、異な
る各標的核酸分子の増幅が、空間的に線引きされた（delineated）仕方で、独立
して起こる。空間的線引き（spatial delineation ）は、プライマーが任意のタ
イプの固体支持体に固定される結果として起こる。固定の第一の機能は、プライ
マー間の非生産的相互作用を除去することである。事実上どのような種類の表面
（ビーズでもよい）への固定でも、プライマーの拡散係数を顕著に減少させる故
に、ブリッジ増幅の利益を得るために、定序（ordered）アレイを必ずしも使用
する必要がない。
【００１９】 ブリッジ増幅の成功にもかかわらず、その方法は、増幅技術を必要とする全て
の用途に適しているわけではない。ＰＣＲの成功は、標的核酸分子の百万倍の増
幅が容易に得られることによるものである。この程度の増幅は、コストが低く安
全な蛍光技術を使用する容易な検出のために、充分な産物を生じる。しかし、Ad
ams およびKron（米国特許第５，６４１，６５８号）によって開示されるような
一段階ブリッジ増幅は、現在、およそ数千倍の標的増幅を行っている。従って、
シングルコピー(single-copy) ヒト遺伝子は、放射能を検出可能標識として使用
した場合、ブリッジ増幅実験で検出されうるのみである。
【００２０】 本発明に特に含まれるのは、固体支持体を使用する多段階増幅法によって、１
つまたはそれ以上の標的核酸分子を増幅する方法である。固体支持体は、固定化
されたオリゴヌクレオチドプライマーを含有する。ブリッジ増幅の各段階におい
て、二本鎖増幅核酸分子（本明細書において「二本鎖増幅分子」とも称される）
を生成し、変性した後、元のプライマーの直ぐ近くにあってポリメラーゼによっ
て伸長される新しい固定化プライマー（即ち、未使用の非反応性プライマー）と
ハイブリッド形成して、新しい増幅産物を得ることによって、１つの標的分子が
数千倍に増幅される。１つまたはそれ以上の標的核酸分子を、固体支持体に固定
化されているプライマーおよび増幅試薬（例えば、デオキシヌクレオチドおよび
ＤＮＡポリメラーゼ）と接触させる（即ち、混合する）ことによって、１つまた
はそれ以上の二本鎖増幅分子が好適な条件下に形成され、そのような増幅試薬は
当業者によく知られている（Ausubel,F.M., ら（編）、Current Protocols in M
olecular Biology, John Wiley & Sons(出版) 、vol.2, ch.15.4（1991）、それ
に記載に内容は全て本発明の開示の一部を構成するものとする）（図３参照）。
【００２１】 １組のオリゴヌクレオチドプライマー（第一および第二プライマーから成る）
が、固体支持体に結合される。種々の標的核酸分子のためにデザインされた１組
を越えるプライマーを固体支持体に結合させることもでき、簡潔にするために、
１つの標的分子だけに特異的な１つの組のプライマーのみをここに開示する。好
ましくは、固体支持体へのプライマーの結合は、共有結合である。オリゴヌクレ
オチドプライマーは好ましくは一本鎖ＤＮＡ分子である。好ましくは、第一プラ
イマーは、第一の二本鎖増幅核酸分子を生成する増幅反応のための鋳型として使
用される標的分子の一本鎖に相補的であり、第二プライマーは、標的分子の相補
鎖に相補的である。両方のプライマーは、固体支持体に結合された５’末端を有
し、従って、３’末端は遊離しており、適切な核酸分子とのハイブリッド形成お
よびプライマー伸長反応に使用することができる（米国出願第０８／８１２，１
０５号、およびRehmanら、Nucleic Acid Res., 27:649-655(1999) 、これらの両
方に記載の内容は全て本発明の開示の一部を構成するものとする）。プライマー
の表面密度は、反応の二本鎖増幅分子が、結合している第一プライマーと第二プ
ライマーとの間に一本鎖または二本鎖核酸ブリッジの形で架橋する（span) こと
を可能にするのに充分に高い。
【００２２】 オリゴヌクレオチドプライマーは、共有電子対相互作用によって、固体支持体
に結合される。オリゴヌクレオチドプライマーは、約５〜約数百個のヌクレオチ
ド（例えば、約５００個のヌクレオチド）の長さを有しうる。好ましくは、プラ
イマーは、約５〜約５０個のヌクレオチドの長さを有しうる。最も好ましくは、
プライマーは、約１５〜約３０個のヌクレオチドの長さを有しうる。プライマー
は、増幅することを所望する標的核酸分子に基づいてデザインされる。プライマ
ーの組は、ビーズ支持体のような固体支持体上で、直交（orthogonal）保護基、
例えばジメチルトリチル基またはレブリネート（Hornら、Nucleic Acid Res.,25
:4835-4841(1997)；およびHornら、Nucleic Acid Res.,25:4842-4848(1997)、こ
れらに記載の内容は全て本発明の開示の一部を構成するものとする）、および５
’−３’合成（Glen Research catalog,1998, Gren Research, Sterling, VA ；
およびCoassin ら、国際特許出願第ＷＯ９４／２４３１２号、これらに記載の内
容は全て本発明の開示の一部を構成するものとする）を行うためのホスホラミダ
イト試薬および支持体を使用して、直接的に合成することができる。または、プ
ライマーは、一般法によって合成して、合成後に支持体に結合させることができ
る。オリゴヌクレオチドプライマーの合成後の結合の方法は、当業者によく知ら
れている（Rehmanら、Nucleic Acid Res.,27:649-655(1999 ）、それに記載の内
容は全て本発明の開示の一部を構成するものとする）。
【００２３】 好ましくは、オリゴヌクレオチドプライマーは、改変５’−アクリルアミド部
分（AcryditeTM ホスホラミダイト、Mosaic echnologies, Boston, MA）が組み
込まれるように合成され、それによって、固体支持体、例えばアクリルアミドを
含有する支持体に、プライマーを固定化することができる。切断を受ける化学ま
たは光化学基を、支持体上のリンカー部分の構造に組み込むか、または固定化前
に１つのまたは両方のプライマーに組み込む。さらに、切断性の基を、改変ホス
ホラミダイトの形態でオリゴヌクレオチド合成の間に導入することもできる（Ol
ejnik ら、Nucleic Acid Res.,26:3572-3576(1998)、それに記載の内容は全て本
発明の開示の一部を構成するものとする）。プライマーは好ましくは、共有電子
対（covalent）相互作用によって固体支持体に結合される（Rehmanら、Nucleic
Acid Res.,27:649-655(1999)参照）。しかし、非共有電子対結合法も、本発明に
使用することができ、当業者によく知られている（Cass T.,およびLigler, F.S.
（編）、「Immobilized Biomolecules in Analysis:A Practical Approach 」、
1998, Oxford University Press, Oxford, UK 、これらに記載の内容は全て本発
明の開示の一部を構成するものとする）。
【００２４】 固体支持体は、ビーズ、粒子、シート、ディップスティック、膜、フィルター
、繊維（例えば、ガラス繊維および光学繊維）等であることができる。好ましく
は、固体支持体はビーズである。固体支持体の好適な材料組成は、プラスチック
、ナイロン、ガラス、シリカ、金属、合金、ポリアクリルアミド、ポリアクリレ
ート、架橋デキストランおよびそれらの組み合わせを包含するが、それらに限定
されない。固体支持体は、オリゴヌクレオチドプライマーの結合によって改変さ
れうるのが好ましい。固体支持体は、どのような幾何学形態でも有することがで
きる。例えば、固体支持体は、ほぼ球形（例えばビーズ）であることができる。
または、固体支持体は、シートまたは膜のような平面状であることもできる。固
体支持体は、磁性を有することもできる。好ましくは、固体支持体は、熱的に安
定であり（例えば、１００℃までの温度に耐えうる）、ＰＣＲに一般に使用され
る熱サイクル条件に耐えることができる。
【００２５】 一般に、標的分子はＤＮＡ分子である。標的分子は、約３０〜約５０，０００
個のヌクレオチドの長さを有することができる。標的核酸は、一本鎖または二本
鎖である。標的分子が二本鎖の場合、それを変性に付して、２つの一本鎖核酸を
得る。これらの一本鎖核酸の両方ともを、それぞれ標的分子と呼ぶことができる
。簡潔にするために、一本鎖だけを、第一プライマーにハイブリッド形成し、そ
れによって増幅反応を開始させる鋳型鎖として説明する。しかし、固体支持体に
固定化された適切な組のプライマー（即ち、同じプライマーであるが、異なる順
序の相互作用）を使用した場合に、もう一方の標的一本鎖についても、この工程
が反映されることを理解すべきである。他の核酸分子、例えばＲＮＡも本発明に
含まれる。標的核酸分子（または、単に標的または標的分子）は、植物または動
物組織、細胞、組織または臓器培養系に由来することができる。好ましくは、標
的分子は、増幅に付す前に精製される。核酸を精製する方法は、当業者によく知
られている（Ausubel, F.M.,ら（編）、Current Protocols in Molecular Biolo
gy, John Wiley & Sons （出版）、vol.1, ch.2-4(1991) 、それに記載の内容は
全て本発明の開示の一部を構成するものとする）。好ましくは、標的分子、特に
鋳型鎖は、第一固定化プライマーにハイブリッド形成することができる１つのヌ
クレオチド配列領域を有する。
【００２６】 ハイブリッド形成複合体は、ハイブリッド形成に好適な条件下に、標的分子を
第一オリゴヌクレオチドプライマーに接触させる（例えば、混合する）ことによ
って形成される（米国特許第５，６４１，６５８号および米国特許出願第０８／
８００，８４０号、それらに開示の内容は全て本発明の開示の一部を構成するも
のとする）。一本鎖標的分子（即ち、鋳型鎖）は、第一の結合オリゴヌクレオチ
ドプライマーに対してハイブリッド形成する（図３ａ参照）。第一オリゴヌクレ
オチドプライマーは、標的分子の鋳型鎖に含有されるヌクレオチド配列領域に相
補的なヌクレオチド配列領域を有するプライマーである。相補的領域は、約５〜
約５０個のヌクレオチドの長さである。
【００２７】 第一の二本鎖増幅核酸分子（本明細書において「第一の二本鎖増幅分子」とも
称される）は、増幅に好適な条件下に、ハイブリッド形成複合体を増幅試薬に接
触させる（例えば、混合する）ことによって形成される（図３ｂ参照）。好適な
増幅条件下に、一本鎖標的分子を鋳型鎖として使用して、新生相補鎖が合成され
る。この増幅反応後に、二本鎖増幅分子が生成され、固体支持体に結合されたま
まにされる。増幅に好適な条件は、熱的に安定なＤＮＡポリメラーゼ、デオキシ
ヌクレオチド、適切なイオン強度およびｐＨ、ならびに当業者によく知られてい
る核酸増幅反応を促進する他の必要な試薬（Ausubel, F.M.,ら（編）、Current
Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons(出版) 、vol.2, ch.15.4
（1991）、それに記載の内容は全て本発明の開示の一部を構成するものとする）
を含む。第一プライマーは、デオキシヌクレオチドによって伸長され、第一の一
本鎖増幅核酸分子（本明細書において「第一の一本鎖増幅分子」とも称する）を
形成する。この第一の一本鎖増幅分子は、標的鋳型に相補的であり、それらは一
緒になって第一の二本鎖増幅分子を形成する。
【００２８】 第一の二本鎖増幅分子は、相補鎖（即ち、第一の一本鎖増幅分子）にハイブリ
ッド形成した標的分子を有して成る二本鎖核酸である。変性条件下に、結合標的
核酸分子を、それの結合相補鎖（即ち、第一の一本鎖増幅分子）から分離する（
図３ｃ参照）。第一の一本鎖増幅分子を、固体支持体の表面に接触させ、第一の
一本鎖増幅分子に相補的なヌクレオチド配列領域を有し、固体支持体に結合され
ている相補的な第二オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリッド形成し、第一
ブリッジハイブリッド形成複合体を形成する（図３ｄ参照）。相補的領域は、約
５〜約５０個のヌクレオチドの長さである。好ましくは、固体支持体は、第一プ
ライマーが結合されているのと同じ支持体である。
【００２９】 第一の一本鎖増幅分子を鋳型鎖として使用して新生相補鎖が合成される好適な
増幅条件下に、第二の二本鎖増幅核酸分子（本明細書において、「第二の二本鎖
増幅分子」とも称される）が形成される（図３ｅ参照）。第二プライマーがデオ
キシヌクレオチドの添加によって伸長されて、それによって、第一の一本鎖増幅
分子に相補的な鎖が形成される。この相補鎖は、第二の一本鎖増幅核酸分子と称
される（本明細書において、「第二の一本鎖増幅分子」とも称される）。この第
二の一本鎖増幅分子を有するヌクレオチド配列は、元の標的分子のヌクレオチド
配列と同じ配列である。第一および第二の一本鎖増幅分子は共にハイブリッド形
成して、第二の二本鎖増幅分子を形成する。
【００３０】 第二の二本鎖増幅分子を変性に付す。変性は、例えば、第二の二本鎖増幅分子
をアルカリ雰囲気（例えば、１５ｍＭ ＮａＯＨ）中に置くことによって行われ
る。または、二本鎖増幅分子を、ヌクレオチド塩基成分のような多くの因子に依
存する融解温度に暴露する。好適な変性条件は、当業者によく知られている。変
性した後、第一の一本鎖増幅分子と第二の一本鎖増幅分子との間の水素結合を破
壊して、第一および第二の一本鎖増幅分子を得る。これらの一本鎖分子は、オリ
ゴヌクレオチドプライマーを介して、固体支持体に結合したままである。第一の
一本鎖増幅分子は、固定化第一プライマーを介して結合されたままであり、第二
の一本鎖増幅分子は、固定化第二プライマーを介して結合されたままである（図
３ｆ参照）。
【００３１】 好適な変性／アニール条件下に、複数の第二ブリッジハイブリッド形成複合体
が形成される（図３ｇ参照。簡潔にするために、２個だけのブリッジハイブリッ
ド形成複合体を示す）。例えば、結合した第一の一本鎖増幅分子を、第一の一本
鎖増幅分子の３’末端領域に相補的なヌクレオチド配列領域を有する新しい第二
オリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、そうすることによって、第二ブリッ
ジハイブリッド形成複合体を形成する。同様に、第二の一本鎖増幅分子を、第二
の一本鎖増幅分子の３’末端領域に相補的なヌクレオチド配列領域を有する新し
い第一オリゴヌクレオチドプライマーと接触させ、そうすることによって、もう
１つの第二ブリッジハイブリッド形成複合体を形成する。好ましくは、第一およ
び第二の一本鎖増幅分子を接触させるオリゴヌクレオチドプライマーは、一本鎖
増幅分子が結合されるのと同じ固体支持体に固定化される。
【００３２】 第三および第四の二本鎖増幅核酸分子（本明細書において、「第三および第四
の二本鎖増幅分子」とも称される）は、第二ブリッジハイブリッド形成複合体を
、適切な増幅試薬に接触させることによって形成される（図３ｈ参照）。第一お
よび第二の固定化プライマーを、デオキシヌクレオチドの添加によって伸長させ
る。第二プライマーの伸長は、第一の一本鎖増幅分子を鋳型として使用して、第
三の一本鎖核酸増幅分子（本明細書において、「第三の一本鎖増幅分子」とも称
される）を形成する。ハイブリッド形成された第一および第三の一本鎖増幅分子
は、第三の二本鎖増幅分子を形成する。同様の方法によって、第一プライマーの
伸長は、第二の一本鎖増幅核酸分子を鋳型として使用して、第四の一本鎖増幅核
酸分子（本明細書において、「第四の一本鎖増幅分子」とも称される）を形成す
る。ハイブリッド形成された第二および第四の一本鎖増幅分子は、第四の二本鎖
増幅分子を形成する。この増幅熱サイクルは一般に約５〜約５０サイクル繰り返
されて、複数の第三および第四の二本鎖増幅分子を形成する。さらに一般的には
、増幅は、約３５の熱サイクルによって行われる。各サイクルは、各温度におい
て約１分間の持続時間の９５℃、６０℃および７２℃から成ることができる。そ
のような熱サイクル条件は、当業者によく知られている。熱サイクルの追加ラウ
ンドは、複数の追加増幅二本鎖分子を形成する。
【００３３】 第一段階のブリッジ増幅からの増幅産物は、一本鎖形態で解離され、次の段階
のブリッジ増幅を開始させるために使用される（図３ｉとｊ参照）。第三および
第四の二本鎖増幅分子は、固体支持体への結合から切断される（図３ｉ参照）。
好ましくは、各二本鎖増幅分子の１つのプライマーだけを完全に切断して、「部
分的に解離した」二本鎖増幅分子を得る。本明細書で定義される「部分的に解離
した」とは、切断後の二本鎖増幅分子が、未切断プライマーを介して固体支持体
に結合したままであることを意味する。切断は、酵素的または化学的手段によっ
て行うことができる。酵素的切断は、特定の制限エンドヌクレアーゼ部位を、固
体支持体に結合しているプライマーに組み込むことによって行われる。最も好ま
しくは、第一プライマーに含有される制限部位は、第二プライマーに含有される
制限部位と異なる（例えば、第一プライマーはＥｃｏＲＩ部位を含有し、第二プ
ライマーはＨｉｎｄＩＩＩ部位を含有する）。本発明の１つの実施態様において
は、第一プライマーを切断する。または、第二プライマーを切断する。
【００３４】 制限以外の、二本鎖増幅分子を固体支持体から切断する方法も当業者によく知
られている。例えば、２つのプライマーの１つまたは両方が化学的に不安定な基
を有する化学リンカーによって固体支持体に結合している場合に、化学的切断が
使用される。ジチオール結合は、熱安定性であるが化学薬剤、例えば、ジチオト
レイトール（ＤＴＴ）、β−メルカプトエタノール、トリス（２−カルボキシエ
チル）ホスフィンＨＣｌ（ＴＣＥＰ）および他のジスルフィド還元剤によって容
易に切断される結合化学の１つの例である（Day ら、Biochem.J.,278:735-740(1
991)；Singh ら、Methods in Enzymology, 251:167-173(1995)、これらに記載の
内容は全て本発明の開示の一部を構成するものとする）。または、２つのプライ
マーの１つまたは両方が、光化学的に不安定な結合部分によって固体支持体に結
合している場合、光化学的切断を使用することができる。ＤＮＡオリゴヌクレオ
チドに関する光化学的切断性結合化学は、以前に報告されている（Olejnik ら、
Nucleic Acid Res.,26:3572-3576(1998)および米国特許第５，６７９，７７３号
、これらに記載の内容は全て本発明の開示の一部を構成するものとする）。例え
ば、光化学的に切断性のリンカーは、置換ニトロフェノール基を有して成ること
ができる。
【００３５】 次に、切断した二本鎖増幅分子を変性に付し、それによって、一本鎖核酸分子
を、それらの二本鎖増幅親分子（即ち、第一の一本鎖増幅分子と第三の一本鎖増
幅分子との間で形成されるハイブリッド形成複合体、および第二の一本鎖増幅分
子と第四の一本鎖増幅分子との間で形成されるハイブリッド形成複合体）から解
離する。解離された一本鎖核酸分子を回収し、新しい増幅支持体に適用して、第
二段階のブリッジ増幅を開始させる（図３ｊ参照）。後続の段階のブリッジ増幅
を、その前の段階のブリッジ増幅において生成された一本鎖増幅分子を使用して
開始する。
【００３６】 ブリッジ増幅段階は、所望のレベルの標的分子増幅が達成されるまで繰り返す
ことができる。例えば、２つ段階のブリッジ増幅は、１０6 倍程度の増幅を生じ
ることができ（２つの段階の合計は１０００×１０００であり、各段階は約１０
００倍の増幅を生じる）。高レベルの増幅が所望とされる場合、より多くの段階
のブリッジ増幅を行うことができる。
【００３７】 一旦、所望のレベルの増幅が達成されると、固体支持体上に形成された産物を
、固体支持体に結合したままで分析することができる。例えば、固体支持体がビ
ーズである場合、ビーズを濃縮して、シグナル発光（例えば蛍光）を分析するこ
とができる。または、産物を支持体から切断し、たとえば、ゲル電気泳動のよう
な溶液相法によって分析することができる（実施例参照）。
【００３８】 切断された二本鎖増幅分子の変性は、固体支持体装置（即ち、結合産物を有す
る増幅固体支持体）を、約９０℃〜約１００℃の高温、約１２の高いｐＨのよう
な変性条件に暴露するか、または有機溶媒またはカオトロピック剤を使用する変
性化学処理に付すことによって行われる。または、鎖分離は、酵素的鎖分離法、
例えば、ＡＴＰの存在下にＤＮＡヘリカーゼを使用する固体支持体装置の処理に
よって行われる（Lohman T.M.,およびBjornson,K.P., Annu. Rev. Biochem, 65:
169-214(1996) 、これらに記載の内容は全て本発明の開示の一部を構成するもの
とする）。
【００３９】 二本鎖増幅分子は、例えば、増幅工程の間に組み込まれる標識デオキシヌクレ
オチドを使用して、重合反応の間に検出可能に標識することができる。標識には
、放射能、化学発光、発光および蛍光剤を使用することができる。好ましくは、
標識は蛍光剤である。改変ヌクレオチドを使用する、目的とする核酸分子の直接
的標識化は、当業者によく知られている多くの酵素法によって行うことができる
（Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual 、2 nd ed., Cold Spr
ing Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY(1989)、それに記載されている内容
は全て本発明の開示の一部を構成するものとする）。二本鎖増幅分子を検出する
ために、臭化エチジウムのような挿入性色素を使用することができる。二本鎖増
幅分子の検出は、その分子、例えば、第三および/ または第四の一本鎖増幅分子
に対してハイブリッド形成する二本鎖増幅分子のヌクレオチド配列領域に相補的
なヌクレオチド配列領域を有する標識核酸を使用して行うこともできる。
【００４０】 本発明の１つの実施態様において、多段階ブリッジ増幅法を使用して、被検試
料における標的分子の存在または非存在を検出する方法を本明細書に開示する。
増幅産物は、多段階ブリッジ増幅法の増幅段階の際に形成される。産物は、前段
落に記載のように標識し検出することができる（前記および実施例参照）。増幅
力が顕著に増加する場合、放射能以外の標識を使用することができる。この検出
法に使用しうる他の標識は、化学発光、発光および蛍光を包含する。好ましくは
、標識は蛍光剤である。
【００４１】 本発明の他の実施態様において、２つまたはそれ以上の段階のブリッジ増幅を
含む、１つまたはそれ以上の標的核酸分子の固相多段階増幅法に使用されるキッ
トを開示する。第一段階のブリッジ増幅において生成された一本鎖増幅分子は、
第二段階のブリッジ増幅を開始させ、後続の各段階のブリッジ増幅は、その前の
段階のブリッジ増幅において生成された一本鎖増幅分子を使用して開始される。
１つのキット試薬は、少なくとも二段階のブリッジ増幅を行うための固体支持体
を含んで成る。固体支持体は、１つまたはそれ以上の標的分子を増幅させるため
の少なくとも１組のプライマーを有して成る。例えば、１つの実施態様において
、キットの固体支持体試薬はビーズを含んで成り、各ビーズは１つまたはそれ以
上の標的分子に特異的な１組のプライマーを含んで成る。
【００４２】 本明細書に開示する改良された多段階ブリッジ増幅法を使用する固相の増幅力
は、一段階ブリッジ増幅と比較して顕著に増加される。約３０〜約４０の増幅サ
イクルから成る増幅の各段階は、数千倍の標的増幅を生じることができる。全て
の段階の合計増幅度は、各段階からのそれぞれの増幅因子（factor）の産物と同
じ高さである。例えば、３５の熱サイクルを必要とする一段階のブリッジ増幅に
ついて１０００倍の増幅であると仮定すれば、３連続の段階のブリッジ増幅は、
１０9 の合計増幅を生じることができる（各段階の際に、ブリッジ増幅二本鎖分
子を完全に回収し、使用すると仮定する）。従って、この新規方法は、一本鎖増
幅産物を使用して第二段階のブリッジ増幅を開始させる多段階ブリッジ増幅法を
実施することによって、元のブリッジ増幅法の低い増幅力の問題を克服する。
【００４３】 本発明の特徴および他の詳細について、実施例においてより詳しく記載し、説
明する。本発明の特定の実施態様は、例として示されるものであり、本発明を制
限するものではないと理解すべきである。本発明の本質的特徴は、本発明の範囲
を逸脱せずに種々の実施態様において使用される。
【００４４】 実施例 多段階ブリッジ増幅：二本鎖増幅核酸分子の使用と一本鎖増幅核酸分子の使用と
の比較 この実施例は、酵母遺伝子フラグメント（ＬＥＵ２）を使用する２段階ブリッ
ジ増幅法を例示する。酵母ＬＥＵ２遺伝子のヌクレオチド配列、塩基７６８５〜
７９４３（Genbank Accession No. AFO49063）を表４に示す。固体支持体にプラ
イマーを固定させる５’−アクリルアミド修飾（AcryditeTM phosphoramidite
、Mosaic Technologies, Boston, MA ）を使用して、オリゴヌクレオチドプライ
マーを合成した。この場合、固体支持体はポリアクリルアミドビーズである。ビ
ーズ製造の間の改変プライマーとアクリルアミドゲルミックスとの共重合によっ
て、固定化プライマーを有する固体支持体を得た。熱サイクルの間、プライマー
は５’−アクリルアミド基を介して結合されたままにされた（Rehmanら、Nuclei
c Acid Res.,27:649-655(1999)）。
【００４５】 １０％のポリアクリルアミド（アクリルアミド／ｂｉｓ、２９：１）、１０ｍ
Ｍの硼酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８. ０）、１００μＭの各５’−アクリルアミ
ドプライマー（ （配列番号：１）、および （配列番号：２）、制限部位はイタリック体で示され、「Ｑ」は５’−アクリル
アミド基を表す）、および０. ２％の過硫酸アンモニウム（重量／容量）を含有
する溶液１μＬを、０. ４％のＮ，Ｎ，Ｎ’, Ｎ’−テトラメチルエチレンジア
ミン（ＴＥＭＥＤ）を含有する脱気した鉱油にピペットで添加することによって
、固定化プライマーを有するアクリルアミドビーズを製造した。増幅は、室温で
３５分間にわたって行った。過剰の鉱油をデカンテーションし、３０ｍＬのＴＥ
緩衝液（１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）および１ｍＭ ＥＤＴＡ）を
含有する５０ｍＬの使い捨て管にビーズを入れた。残留鉱油を、クロロホルム（
１回の抽出につき１５ｍＬ）を使用して２〜３回抽出した。次に、ビーズをＴＥ
緩衝液（１回につき１５ｍＬ）で数回洗浄した。非固定化プライマーをビーズか
ら除去するために、その調製物を０. ５ｘＴＢＥ（８９ｍＭトリス−ボレート（
ｐＨ８．３）および２ｍＭ ＥＤＴＡ）で平衡化させ、垂直ポリアクリルアミド
ゲルの穴に入れ、次に、その調製物を２０Ｖ／ｃｍで６０分間電気泳動に付した
。
【００４６】 ハイブリッド形成の前に、ビーズを、ＤＮＡポリメラーゼの非存在下に１５の
熱サイクルにかけて、熱的に安定でないプライマーを除去した。次に、１ｘサー
モポル（thermopol ）緩衝液（１０ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（
ｐＨ８．８）、１０ｍＭ （ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、２ｍＭ ＭｇＳＯ4 、０. １％
Triton Ｘ−１００、New England Biolabs, Beverly, MA）、および５０μｇ
／ｍＬのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および１２０ｎｇ／ｍＬの変性大腸菌（
E.coli）ゲノムＤＮＡを使用して、１〜２時間にわたってビーズを平衡化させた
。熱サイクルは、各３０秒間の９４℃、６０℃および７２℃のプロフィールを使
用して行った。
【００４７】 ハイブリッド形成および増幅を、別段階で行った。各増幅反応は、１つの１μ
Ｌビーズ支持体を使用した。酵母（Saccharomyces cerevisiae）標的ＤＮＡを、
所望の増幅標的核酸配列内で切断しない２つの制限エンドヌクレアーゼ（Ｓａｕ
９６およびＨｉｎｃＩＩ、New England Biolabs, Beverly, MA）を使用して制限
した。ハイブリッド形成反応は、１００μＬの合計反応容量中に、１プライマー
改変ビーズ、１ｘサーモポル緩衝液、５０μｇ／ｍＬ ＢＳＡおよび５０μｇ／
ｍＬ 制限酵母ＤＮＡを含有した。反応は、９４℃で２分間の変性によって開始
し、ハイブリッド形成は、振とうマイクロプレートインキュベーター（Taitec M
icroincubator M-36, Taitec Instruments, San Jose, CA）において６０℃で３
０分間にわたって行った。ハイブリッド形成後、ビーズを、１００μＬの１ｘサ
ーモポル緩衝液および５０μｇ／ｍＬ ＢＳＡを使用して６０℃で１０分間振と
うしながら１回洗浄した。
【００４８】 ハイブリッド形成後、１ｘサーモポル緩衝液、５０μｇ／ｍＬ ＢＳＡ、各２
００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、および０．０１Ｕ／
μＬ Ｖｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）を
含有する３０μＬの増幅反応混合物にビーズを入れた。反応物を７２℃で５分間
インキュベートして、ハイブリッド形成した標的分子を伸長させた。初期伸長後
、ビーズに結合した標的分子を、各３０秒間の９４℃、６０℃および７２℃から
成る３５の熱サイクルによって増幅させた。
【００４９】 増幅後、ビーズを、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡを含有する１ｘＮＥＢ緩衝液３
（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（２５℃においてｐＨ７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣ
ｌ2 、１ｍＭ ＤＴＴ）を使用して１回洗浄した。次に、ＸｈｏＩおよびＰｓｔ
Ｉを組み合わせるかまたはＰｓｔＩだけを使用して、産物をビーズから制限した
（restricted）。制限反応は、１ｘＮＥＢ緩衝液３、０．１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ
、および３０Ｕの各制限エンドヌクレアーゼ（New England Biolabs, Beverly,
MA）を含有する３０μＬ容量中で行った。制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩおよ
びＰｓｔＩは、オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチド配列内で
切断した。制限は、３７℃で３時間にわたって行った。
【００５０】 第一段階の制限消化（restriction digestion）後に、１０μＬの二重制限産
物を、次の段階のブリッジ増幅のためのインプット標的核酸分子として使用した
。９４℃で２分間加熱することによって、一重制限産物をＰｓｔＩ処理ビーズか
ら溶出した。１０μの溶出産物を、第二段階のブリッジ増幅のためのインプット
標的核酸分子として使用した。次の段階（この場合は第二段階）のハイブリッド
形成および増幅を、第一段階について記載したように行った。第一段階の増幅二
本鎖核酸分子の切断について記載したのと同じ緩衝液および方法を使用して、産
物を、ＲｓａＩおよびＥｃｏＲＩを用いて第二段階固体支持体から制限した。Ｒ
ｓａＩおよびＥｃｏＲＩは、二本鎖増幅産物内で切断した。各反応の１０μＬの
アリコートを非変性１ｘＴＢＥ、１０％ポリアクリルアミドゲル（Novex, San D
iego, CA）中で電気泳動に付した。ゲルを、ＳＹＢＲグリーンＩ（Molecular Pr
obes, Eugene, OR）で染色し、Molecular Dynamics Fluorimager 595（Molecula
r Dynamics, Sunnyvale,CA）を使用して造影した（図５参照）。
【００５１】 図５は、実験の実施から得たゲルを示す。レーン３〜６のそれぞれに、一段階
のブリッジ増幅反応から得た二本鎖増幅産物を負荷した。各場合に、１０μＬ、
または３３％の合計３０μＬの制限反応を負荷した。レーン３および４に示され
る産物は、第一段階の増幅反応のＰｓｔＩ−ＸｈｏＩ二重消化からの産物である
。レーン５および６は、第二段階の反応からの産物であり、該反応において、一
本鎖第一段階増幅産物を第二段階のための標的核酸インプット分子として使用し
た。レーン７および８は、第二段階の増幅反応からの産物であり、該反応におい
て、二本鎖第一段階増幅産物を、第二段階のための標的核酸インプット分子とし
て使用した。レーン「ｍ」は、ＤＮＡサイズマーカーを含有する：０．０５μｇ
のｐＢＲ３２２のＭｓｐＩ消化物（New England Biolabs, Beverly, MA）。
【００５２】 レーン５〜８に示される産物の蛍光測定分析は、第一段階の増幅産物を一本鎖
形態で添加した場合に、第二段階のブリッジ増幅反応が、顕著に多い産物を生じ
たことを示す。レーン７および８に示される第二段階産物は、第一段階のブリッ
ジ増幅二本鎖核酸分子（レーン３および４）のレベルの１５倍の増加を示す。こ
れに対して、レーン５および６に示される増幅二本鎖核酸分子は、第一段階の産
物レベルの４５倍の増加を示す。従って、第二ブリッジ増幅段階における一本鎖
第一段階産物の使用は、この実験において約３倍で全体的増幅度を増加させる。
【００５３】 本発明を、好ましい実施態様を参照して詳しく示し説明したが、当業者は、添
付の特許請求の範囲に規定される本発明の意図および範囲を逸脱せずに、形態お
よび細部において種々の変更を加えうることを理解するであろう。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａおよび１Ｂは多段階ブリッジ増幅の略図である。
【図２】 図２は段階１のブリッジ増幅から段階２のブリッジ増幅への進行の略図である
。
【図３】 図３ａ〜３ｊは多段階ブリッジ増幅の細部略図である。
【図４】 図４は酵母ＬＥＵ２遺伝子標的のヌクレオチド配列を示す図であり、プライマ
ーの５’末端ヌクレオチド配列に導入された（engineered）ＰｓｔＩおよびＸｈ
ｏＩ制限部位は図示されていない。
【図５】 図５は２段階ブリッジ増幅反応の実施によって得たゲルの写真であって、ブリ
ッジ増幅のＤＮＡ鋳型として、一本鎖標的核酸を使用した場合と、二本鎖核酸分
子を使用した場合とを比較する写真である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ， ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ， ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ， ＺＷ (72)発明者 エイブラムス，エズラ，エス． アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02465 ニュートン，コルベール ロード ４ Ｆターム(参考） 4B024 AA20 CA01 CA09 HA12 4B063 QA01 QQ42 QQ52 QR32 QR55 QR62 QR84 QS25 QS34 QX01 【要約の続き】

Claims (38)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 第一段階のブリッジ増幅において生成された一本鎖増幅分子
    が第二段階のブリッジ増幅を開始し、かつ後続の各段階のブリッジ増幅がその前
    の段階のブリッジ増幅において生成された一本鎖増幅分子により開始される、２
    つまたはそれ以上の段階のブリッジ増幅を含む、１つまたはそれ以上の標的核酸
    分子の固相多段階増幅法。
  2. 【請求項２】 各段階のブリッジ増幅が、 （ａ）固体支持体上に固定化された１組のオリゴヌクレオチドプライマーに標的
    核酸分子をハイブリッド形成させる工程、ならびに （ｂ）熱サイクルを実施し、ブリッジ増幅二本鎖分子の形成によりオリゴヌクレ
    オチドプライマーにハイブリッド形成した標的核酸分子を増幅する工程、 を含む、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 熱サイクルを実施する工程（ｂ）が約５〜約５０の熱サイク
    ルを含む請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 （ｃ）ブリッジ増幅二本鎖分子を切断し、かつ変性して、一
    本鎖増幅分子を形成する工程； （ｄ）工程（ｃ）の一本鎖増幅分子を回収する工程、および （ｅ）一本鎖増幅分子を新しい固体支持体と接触させる工程、ならびに （ｆ）工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返して、標的核酸分子を増幅する工程、 をさらに含む請求項２記載の方法。
  5. 【請求項５】 （ａ）固体支持体上に固定化された１組のオリゴヌクレオチ
    ドプライマーに標的核酸分子をハイブリッド形成させる工程； （ｂ）熱サイクルを実施し、オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリッド形成
    した標的核酸分子を増幅して、二本鎖増幅分子を形成する工程； （ｃ）二本鎖増幅分子を切断し、かつ変性して、一本鎖増幅分子を形成する工程
    ； （ｄ）工程（ｃ）の一本鎖増幅分子を回収する工程、 （ｅ）一本鎖増幅分子を新しい固体支持体と接触させる工程、ならびに （ｆ）工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返して、標的核酸分子を増幅する工程、 を含む、少なくとも１つのプライマーが標的核酸分子に特異的にハイブリッド形
    成するものである、２つまたはそれ以上の固定化オリゴヌクレオチドプライマー
    を含む固体支持体を用いる、１つまたはそれ以上の標的核酸分子の増幅方法。
  6. 【請求項６】 熱サイクルを実施する工程（ｂ）が約５〜約５０の熱サイク
    ルを含む請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 各熱サイクルが９５℃、６０℃および７２℃での各々約５秒
    〜約１分を含む請求項６記載の方法。
  8. 【請求項８】 （ａ）ハイブリッド形成に適する条件下で標的核酸分子を固
    体支持体と接触させることにより、固体支持体に固定化された第一のオリゴヌク
    レオチドプライマーにハイブリッド形成した一本鎖標的核酸分子を含むハイブリ
    ッド形成複合体を形成する工程； （ｂ）プライマー媒介ポリメラーゼ伸長反応に適する条件下で工程（ａ）のハイ
    ブリッド形成複合体を増幅試薬と接触させることにより、標的核酸分子に対する
    相補鎖を形成するようにデオキシヌクレオチドにより第一のプライマーを伸長し
    て形成される第一の一本鎖増幅分子にハイブリッド形成した標的核酸分子を含む
    第一の二本鎖増幅分子を形成する工程； （ｃ）（ｂ）の第一の二本鎖増幅分子を変性し、それにより第一の二本鎖増幅分
    子から一本鎖標的分子を解離させる工程； （ｄ）ハイブリッド形成に適する条件下で、工程（ｂ）の第一の一本鎖増幅分子
    と固体支持体に固定化された第二のオリゴヌクレオチドプライマーとを含む第一
    のブリッジハイブリッド形成複合体を形成する工程； （ｅ）プライマー媒介増幅反応に適する条件下で工程（ｄ）のブリッジハイブリ
    ッド形成複合体を増幅試薬と接触させることにより、第二の二本鎖増幅分子を形
    成する工程、ここで、第二の一本鎖増幅分子は工程（ｄ）の第一の一本鎖増幅分
    子に相補的であり、かつ該分子と塩基対を形成するように形成される； （ｆ）（ｅ）の第二の二本鎖増幅分子を変性し、固体支持体に固定化した第一お
    よび第二の一本鎖増幅分子を生成させる工程； （ｇ）（ｉ）ハイブリッド形成に適する条件下の工程（ｆ）の第一の一本鎖増幅
    分子と固体支持体に固定化された第二のオリゴヌクレオチドプライマー、および
    （ｉｉ）ハイブリッド形成に適する条件下の工程（ｆ）の第二の一本鎖増幅分と
    固体支持体に固定化された第一のオリゴヌクレオチドプライマー、 を含む第二のブリッジハイブリッド形成複合体を形成する工程； （ｈ）プライマー媒介増幅反応に適する条件下で工程（ｇ）の第二のブリッジハ
    イブリッド形成複合体を増幅試薬と接触させることにより、 （ｉ）第一の一本鎖増幅分子に相補的であり、かつ該分子と塩基対を形成する、
    新生の第三の一本鎖増幅分子を含む第三の二本鎖増幅分子、および （ｉｉ）第二の一本鎖増幅分子に相補的であり、かつ該分子と塩基対を形成する
    、新生の第四の一本鎖増幅分子を含む第四の二本鎖増幅分子、 を形成する工程； （ｉ）１つまたはそれ以上の第一のオリゴヌクレオチドプライマーを切断し、そ
    れにより、固体支持体への少なくとも１つの結合から第三および第四の二本鎖増
    幅分子を切断する工程、あるいは他方、１つまたはそれ以上の第二のオリゴヌク
    レオチドプライマーを切断し、それにより、固体支持体への少なくとも１つの結
    合から第三および第四の二本鎖増幅分子を切断する工程； （ｊ）（ｈ）の切断された増幅二本鎖分子を変性し、それにより、固体支持体か
    ら増幅一本鎖分子を解離させる工程； （ｋ）工程（ｊ）由来の解離された一本鎖分子を、未使用の固定化されたオリゴ
    ヌクレオチドプライマーを含む新しい固体支持体に適用する工程、ならびに （ｌ）工程（ａ）〜（ｋ）を１回またはそれ以上繰り返し、それにより、標的核
    酸分子を増幅する工程、
    を含む、少なくとも１つが標的核酸分子に特異的にハイブリッド形成するもので
    ある、２つまたはそれ以上の固定化オリゴヌクレオチドプライマーを含む固体支
    持体を用いる、１つまたはそれ以上の標的核酸分子の増幅方法。
  9. 【請求項９】 工程（ｆ）、（ｇ）および（ｈ）を約５〜約５０回繰り返す
    請求項８記載の方法。
  10. 【請求項１０】 オリゴヌクレオチドプライマーが１つまたはそれ以上の電
    子対共有相互作用を通して固体支持体に固定化されている請求項８記載の方法。
  11. 【請求項１１】 オリゴヌクレオチドプライマーが固体支持体上に重合性表
    面層との共重合を介して固定化されている請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 工程（ｉ）において、オリゴヌクレオチドプライマーが化
    学的手段を用いて切断される請求項８記載の方法。
  13. 【請求項１３】 化学的手段がジスルフィド結合を還元する試薬から選択さ
    れる請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 還元試薬がＤＴＴ、β−メルカプトエタノールおよびＴＣ
    ＥＰからなる群より選択される請求項１３記載の方法。
  15. 【請求項１５】 工程（ｉ）において、オリゴヌクレオチドプライマーが光
    化学的手段を用いて切断される請求項８記載の方法。
  16. 【請求項１６】 オリゴヌクレオチドプライマーがニトロフェノール部分を
    含む請求項１５記載の方法。
  17. 【請求項１７】 工程（ｉ）において、オリゴヌクレオチドプライマーが酵
    素的手段を用いて切断される請求項８記載の方法。
  18. 【請求項１８】 酵素的手段が１つまたはそれ以上の制限エンドヌクレアー
    ゼを用いて成される請求項１７記載の方法。
  19. 【請求項１９】 二本鎖増幅分子を変性するために使用される変性剤が、少
    なくとも１つの以下の、高温、高ｐＨ、有機溶媒、カオトロピック剤およびそれ
    らの組み合わせからなる群より選択される変性剤を用いて変性される請求項８記
    載の方法。
  20. 【請求項２０】 固体支持体の材料組成がプラスチック、ガラス、シリカ、
    ナイロン、金属、合金、ポリアクリルアミド、ポリアクリレート、架橋デキスト
    ランおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される請求項８記載の方法。
  21. 【請求項２１】 固体支持体がビーズである請求項８記載の方法。
  22. 【請求項２２】 ビーズが、１つより多い標的核酸分子に対する、１つまた
    はそれ以上のオリゴヌクレオチドプライマーの組を含む、請求項２１記載の方法
    。
  23. 【請求項２３】 オリゴヌクレオチドプライマーが約５〜約５００のヌクレ
    オチド長である請求項８記載の方法。
  24. 【請求項２４】 １つまたはそれ以上の増幅産物が標識される請求項８記載
    の方法。
  25. 【請求項２５】 標識が放射能、化学発光、発光および蛍光からなる群より
    選択される請求項２４記載の方法。
  26. 【請求項２６】 第一段階のブリッジ増幅において生成された一本鎖増幅分
    子が第二段階のブリッジ増幅を開始し、かつ後続の各段階のブリッジ増幅がそれ
    より前の段階のブリッジ増幅において生成された一本鎖増幅分子により開始され
    る、２つまたはそれ以上の段階のブリッジ増幅を含む、１つまたはそれ以上の標
    的核酸分子の存在または非存在の検出を行う固相多段階法。
  27. 【請求項２７】 １つまたはそれ以上の一本鎖増幅分子が標識される請求項
    ２６記載の方法。
  28. 【請求項２８】 標識が放射能、化学発光、発光および蛍光からなる群より
    選択される請求項２７記載の方法。
  29. 【請求項２９】 各段階のブリッジ増幅が、 （ａ）固体支持体上に固定化された１組のオリゴヌクレオチドプライマーに標的
    核酸分子をハイブリッド形成する工程、ならびに （ｂ）熱サイクルを実施し、ブリッジ増幅二本鎖分子の形成によりオリゴヌクレ
    オチドプライマーにハイブリッド形成した標的核酸分子を増幅する工程、 を含む、請求項２６記載の方法。
  30. 【請求項３０】 熱サイクルを実施する工程（ｂ）が約５〜約５０の熱サイ
    クルを含む請求項２９記載の方法。
  31. 【請求項３１】 （ｃ）ブリッジ増幅二本鎖分子を切断し、かつ変性して、
    一本鎖増幅分子を形成する工程； （ｄ）工程（ｃ）の一本鎖増幅分子を回収する工程、および （ｅ）一本鎖増幅分子を新しい固体支持体と接触させる工程； （ｆ）工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返して、標的核酸分子を増幅する工程、ならび
    に （ｇ）標的分子の存在を検出する工程、ここで、一本鎖増幅分子または二本鎖増
    幅分子の検出が被検試料中の標的分子を示す、 をさらに含む請求項２６記載の方法。
  32. 【請求項３２】 （ａ）固体支持体上に固定化された１組のオリゴヌクレオ
    チドプライマーに標的核酸分子をハイブリッド形成させる工程； （ｂ）熱サイクルを実施し、オリゴヌクレオチドプライマーにハイブリッド形成
    した標的核酸分子を増幅して二本鎖増幅分子を形成するする工程； （ｃ）二本鎖増幅分子を切断し、かつ変性して、一本鎖増幅分子を形成する工程
    ； （ｄ）工程（ｃ）の一本鎖増幅分子を回収する工程、 （ｅ）一本鎖増幅分子を新しい固体支持体と接触させる工程、ならびに （ｆ）工程（ａ）〜（ｅ）を繰り返して、標的核酸分子を増幅する工程、ならび
    に （ｇ）標的分子の存在を検出する工程、ここで、一本鎖増幅分子または二本鎖増
    幅分子の検出が被検試料中の標的分子を示す、 を含む、少なくとも１つのプライマーが標的核酸分子に特異的にハイブリッド形
    成するものである、２つまたはそれ以上の固定化オリゴヌクレオチドプライマー
    を含む固体支持体を用いる、１つまたはそれ以上の標的核酸分子の存在または非
    存在の検出方法。
  33. 【請求項３３】 熱サイクルを実施する工程（ｂ）が約５〜約５０の熱サイ
    クルを含む請求項３２記載の方法。
  34. 【請求項３４】 各熱サイクルが９５℃、６０℃および７２℃での各々約１
    分を含む請求項３３記載の方法。
  35. 【請求項３５】 １つまたはそれ以上の一本鎖増幅分子が標識される請求項
    ３２記載の方法。
  36. 【請求項３６】 標識が放射能、化学発光、発光および蛍光からなる群より
    選択される請求項３５記載の方法。
  37. 【請求項３７】 第一段階のブリッジ増幅において生成された一本鎖増幅分
    子が第二段階のブリッジ増幅を開始し、かつ後続の各段階のブリッジ増幅がその
    前の段階のブリッジ増幅において生成された一本鎖増幅分子により開始され、１
    つの試薬が少なくとも１つの標的核酸分子を増幅するための少なくとも１組のプ
    ライマーを含む固相支持体を含んでなり、前記支持体が少なくとも二段階のブリ
    ッジ増幅に対して充分な量で提供される、２つまたはそれ以上の段階のブリッジ
    増幅を含む、１つまたはそれ以上の標的核酸分子の固相多段階増幅法に使用する
    ためのキット。
  38. 【請求項３８】 固体支持体試薬がビーズを含んでなり、各ビーズが１つま
    たはそれ以上の標的分子に特異的な１組のプライマーを含んでなるものである請
    求項３７記載のキット。
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