KR102445790B1 - mRNA를 증폭하는 방법 및 전장 mRNA 라이브러리를 제조하는 방법 - Google Patents

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Abstract

샘플에 함유된 적어도 하나의 RNA를 증폭시키는 본 발명의 방법은, 제1 프라이머를 사용하여 적어도 하나의 RNA를 역전사하는 단계, 주형-비의존적 폴리머라제의 작용에 의해, 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제1 파트너에 의해 3'-위치에서 변형되어 있는 디데옥시 뉴클레오티드를 첨가하여, 단일 3'-아지드- 또는 3'-알킨-변형된 디데옥시 뉴클레오티드를 수득된 cDNA의 3'-말단에 부착시키는 단계, 폴리뉴클레오티드 서열 및 이의 5'-말단에 이러한 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제2 파트너를 포함하는 어댑터 분자를 첨가하는 단계, 및 트리아졸 결합의 형성하에 어댑터를 3'-변형된 cDNA에 결찰시키는 단계, 어댑터 분자의 적어도 일부에 상보적이고 이의 3'-말단에 cDNA의 3'-말단에서 디데옥시 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 제2 프라이머를 첨가하여 트리아졸 결합에 중첩하는 제2 프라이머의 혼성화 및 결합을 수행하는 단계, 제3 프라이머를 첨가하는 단계 및 전장 cDNA를 증폭하는 단계를 포함한다. 이 방법의 변형도 또한 개시되어 있다. 특히 전장 RNA 라이브러리를 제조하고 샘플에 함유된 복수의 RNA를 서열분석하기 위한 이러한 방법의 용도, 뿐만아니라 이러한 방법을 수행하기 위한 시약 키트가 또한 개시되고 본 발명에 포함된다.

Description

mRNA를 증폭하는 방법 및 전장 mRNA 라이브러리를 제조하는 방법
본 발명은 적어도 하나의 RNA, 특히 샘플에 함유된 적어도 하나의 mRNA를 증폭하는 방법, 복수의 RNA 분자를 함유하는 샘플로부터 전장 RNA 라이브러리를 제조하기 위한 이러한 방법의 용도, 특정 세포의 전체 RNA 또는 유기체의 전체 엑솜을 서열분석하는 방법 및 유전자 진단을 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법 중 적어도 하나를 수행하기 위한 시약을 함유하는 키트에 관한 것이다.
최근 몇 년 동안의 모든 기술 진보에도 불구하고, RNA 서열분석, 특히 전장 mRNA 서열분석 또는 전사체 또는 엑솜 서열분석은 거대한 과제로 남아 있다. 엑솜은, 엑손에 함유된 유기체 게놈의 모든 부분을 포함하며, 유전 정보의 전사 및 RNA 스플라이싱에 의한 인트론의 제거 후에, 그러한 유기체의 최종 단백질로 번역되는 mRNA를 생성한다. 반면에, 전사체는 하나의 세포 또는 특정 세포 모집단의 모든 RNA, 특히 모든 상응하는 mRNA를 포함한다.
전체 엑솜 서열분석은 일반 질환과 희귀 질환을 이해하는 데 크게 기여할 수 있다. 특정 단백질의 기능에 영향을 미치거나 심지어 기능을 제거하는 돌연변이는 멘델 질환의 주요 원인으로 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[참조: Choi et al. (Proc Natl Acad Sci USA, 106(45), p. 19096-19101(2009)) 및 Bamshad et al. (Nat Rev. Genet., 12, 745-755 (2011))]은, 멘델 및 비-멘델 질환에서 역할을 하는 유전적 변이를 결정하기 위한 전체 엑솜 포획 및 대규모 병렬 DNA 서열분석에 대해 보고했다.
특히 암세포의 전사체는 발암을 더 잘 이해하는 데 특히 중요하다. 그러나, 줄기 세포와 같은 다른 세포 유형에서 분자 메커니즘 및 세포 경로 분석은 다양한 상이한 적용 및 용도에 대한 바이오마커 발견과 마찬가지로 연구의 영구적 초점이다.
인간 및 동물 엑솜 및 전사체는 특히 질환의 치료 또는 예방을 발전시키는 데 관심이 있는 반면, 식물 세포의 경우, 식물 유전학에 대한 보다 양호한 이해, 예를 들어, 표적 돌연변이 및 유전 공학에 의한 농작물의 개량을 위해 추가적인 관심이 있다.
유전 물질의 신속한 분석을 위해서는 사용하기 쉽고 효율적이며 신뢰할 수 있는 도구가 필요하다. 주요 문제는 환자 혈액 또는 기타 공급원과 같은 작은 유기체학적 샘플로부터 관심 DNA 또는 RNA를 직접 검출해야 한다는 것이다. 이들은 유전 물질의 다양한 구성요소를 극소량으로만 제공한다. 필요한 감도에 도달하기 위해서는 일반적으로 분석 전에 샘플 중의 핵산 양을 증가시키는 증폭 단계가 필요하다. 또는, DNA/RNA 분석물에서 직접 수득된 미세한 검출 신호가 증폭되는 검출 방법이 적용된다.
핵산 증폭 방법에는 PCR 증폭 및 기타 핵산 증폭 프로토콜이 포함된다. PCR 증폭은 유기체학적 물질에서 수득된 상이한 DNA 가닥 풀 내에서 관심 DNA 서열만이 증폭된다는 주요 이점이 있다. 이것은 복잡한 유기체학적 샘플에서 단일 유전자의 신뢰할 수 있는 분석을 위한 기초이다. 지난 몇 년 동안, 초점은 차세대 서열분석(NGS) 기술과 RNA 서열분석으로 옮겨졌다. RNA를 직접 서열분석하는 강력한 방법이 없기 때문에, 모든 라이브러리 제조 방법은 mRNA를 DNA로 역전사하는 것으로 개시한다. 이어서, 생성된 단일 가닥 cDNA는 일반적으로 소위 "이중 가닥 합성" 동안 이중 가닥 DNA(dsDNA)로 전환되어, 올리고뉴클레오티드를 서열분석 기계와 호환되도록 한다. 또한, 서열분석 절차에는 어댑터 서열이 필요하다. 이러한 어댑터는 태그 부착(트랜스포사제 매개 DNA 단편화 및 프라이머 첨가)에 의해 또는 효소 결찰을 통해서만 dsDNA에 효율적으로 도입될 수 있다. 이러한 단일 가닥 RNA에서 이중 가닥 DNA로의 변환 과정은 현재 RNA 라이브러리 제조 방법이 복잡한 이유이다.
최근, WO 2019/063803은 리가제가 dsDNA에 대해 나타낸 것과 유사한 효율로 단일 가닥 DNA를 화학적으로 결찰할 수 있는 화학적 결찰 방법을 개시했다. 이 방법은 2001/2002년에 샤플레스 및 멜달(Sharpless and Meldal) 그룹에 의해 독립적으로 정의된 클릭 화학 개념을 사용한다[참조: Sharpless, KB et al., Angew. Chem. 2002, 114, 2708, Angew. Chem. Int. Ed. 2002, 41, 2596; Meldal, M. et al., J. Org. Chem. 2002, 67, 3057]. 1,3-양극성 후이스겐 부가 환화(Huisgen cycloaddition)[참조: R. Huisgen, 1,3,-Diploar Cycloaddition Chemistry (Ed.: A Padwa), Wiley, New York, 1984]의 변이인, 1,2,3-트리아졸을 수득하기 위한 아지드와 알킨의 구리-촉매된 반응이 클릭 반응을 수행하기 위해 가장 널리 사용되는 방법이 되었다. 온화한 조건과 고효율의 결과로서, 이 반응은 다양한 목적을 위한 DNA 표지와 같은 유기체학 및 재료 과학에서 무수히 많은 응용 분야를 발견했다[참조: Gramlich, PMA et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 8350].
이 화학적 결찰 원리에 의해, 다양한 그룹에서 효소 결찰 없이 라이브러리 제조 방법을 개발하게 되었다[참조: Routh, A. et al., J. Mol. Biol. 427, 2610-2616(2015), US 2018/0127816 A1(Illumina, Inc.), Miura, F. et al., Nucleic Acids Research, Vol. 46, No. 16, e95(2018)]. 프로토콜 단계 수를 감소시키는 이점에도 불구하고, 예를 들어, 제2 가닥 합성의 필요성을 제거하거나, 인공 재조합 및 프라이머 이량체 형성을 억제함으로써 종래 프로토콜에 비해 감도가 약간 저하되는 것으로 나타났다. 게다가, 역전사 동안 인공 뉴클레오티드를 도입할 필요가 있고, 수득된 백본 모방물이 표준 라이브러리 제조 방법에서 사용되는 모든 폴리머라제에 의해 수용되지 않기 때문에, 새로운 프로토콜의 광범위한 상업적 적용이 누락되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 mRNA의 증폭 및 특히 샘플에 함유된 복수의 mRNA, 예를 들어, 개체의 특정 세포 유형의 전체 엑솜 제제 또는 총 mRNA의 전장 라이브러리의 제조를 위한 개선된 개념을 제공하는 것이었다. 다른 RNA, 특히 바이러스 RNA의 서열분석 또는 증폭을 촉진하는 것은 본 발명자들이 수행한 연구의 또 다른 측면이었다. 또한, 단일 가닥 DNA의 결합을 위한 화학적 결찰 방법의 효율성을 이용하면서도, 라이브러리 워크플로우에서 표준 효소와 호환되는 방법을 제공하는 것이 목적이었다.
발명의 요약
본 발명은, 특히 특정 세포의 전체 mRNA 또는 유기체의 전체 엑솜에 대한 전장 mRNA 라이브러리의 제조를 위해 RNA, 바람직하게는 mRNA를 증폭 및/또는 서열분석하기 위한 개선된 방법을 제공함으로써 상기 언급된 문제를 해결한다.
제1 측면에서, 본 발명은 샘플에 함유된 적어도 하나의 RNA, 바람직하게는 mRNA를 증폭 및/또는 서열분석하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 적어도 하나의 제1 프라이머를 제공하는 단계로서 이 제1 프라이머가 증폭될 적어도 하나의 RNA의 3'-말단에 또는 그 근처에 위치하는 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 단계, 및 적어도 하나의 RNA에 대한 적어도 하나의 제1 프라이머의 혼성화를 가능하게 하는 조건하에서 상기 적어도 하나의 제1 프라이머를 샘플에 첨가하는 단계,
b) 역전사효소 및 뉴클레오티드를 샘플에 첨가하여 적어도 하나의 RNA의 전장 cDNA(들)을 첨가함을 포함하는 조건하에서 상기 적어도 하나의 RNA를 역전사하는 단계,
c) 적어도 과량의 뉴클레오티드로부터 상기 샘플을 정제하는 단계,
d) 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제1 파트너를 포함하도록 3'-위치에서 변형되어 있는 디데옥시 뉴클레오티드, 및 단계 b)에서 수득된 cDNA(들)의 3'-말단에서 단일 3'-아지드- 또는 3'-알킨 변형된 디데옥시 뉴클레오티드를 부착하기 위한 주형-비의존적 폴리머라제를 첨가하는 단계,
e) 적어도 단계 d)에서 첨가된 과량의 변형된 디데옥시 뉴클레오티드로부터 상기 샘플을 정제하는 단계,
f) 클릭 반응을 수행하고 어댑터 분자를 트리아졸 결합의 형성하에 단계 d)에서 수득된 3'-변형된 cDNA(들)에 결찰시키기 위한 조건하에서, 폴리뉴클레오티드 서열, 이의 5' 말단에 부착된 상기 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제2 파트너가 부착된 포함하는 어댑터 분자를 첨가하는 단계,
g) 어댑터 분자의 5'-말단에서 적어도 6개의 뉴클레오티드에 상보적이고 이의 3'-말단에 cDNA(들)의 3'-말단에서 디데옥시 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머를 첨가하여, 트리아졸 결합과 중첩하는 위치에서 단계 e)에서 수득된 결찰된 어댑터/cDNA 분자에 대한 제2 프라이머의 혼성화 및 결합을 수행하는 단계,
및 대안적으로
h) DNA 폴리머라제를 첨가하여, 제2 프라이머의 쇄 연장을 달성하고, 단계 b)에서 수득된 전체 cDNA(들)에 상보적인 서열을 포함하는 제2 가닥 DNA(들)를 생성하는 단계, 및
i) 단계 h)의 제2 가닥 DNA(들)를 서열분석하는 단계, 또는
j) 제1 프라이머의 적어도 일부와 동일한 제3 프라이머를 첨가하고, 전장 cDNA(들)을 증폭하여 전장 RNA 라이브러리를 수득하는 단계,
또는
h') DNA 폴리머라제를 첨가하여, 제2 프라이머의 쇄 연장을 달성하고, 동시에 제2 가닥 DNA(들) 및 전체 cDNA(들)의 서열을 결정하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
제2 측면에서, 본 발명은 샘플에 함유된 적어도 하나의 RNA, 바람직하게는 mRNA를 증폭 및/또는 서열분석하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 적어도 하나의 제1 프라이머를 제공하는 단계로서, 이 제1 프라이머가 증폭될 적어도 하나의 mRNA의 3'-말단에 또는 그 근처에 위치하는 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 이 프라이머가 이의 5' 말단에서 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제1 파트너에 의한 변형을 함유하는, 단계, 및 적어도 하나의 mRNA에 대한 적어도 하나의 제1 프라이머의 혼성화를 가능하게 하는 조건하에서 상기 적어도 하나의 제1 프라이머를 샘플에 첨가하는 단계,
b) 역전사효소 및 뉴클레오티드를 샘플에 첨가하여 적어도 하나의 mRNA의 전장 cDNA(들)을 첨가함을 포함하는 조건하에서 상기 적어도 하나의 mRNA를 역전사하는 단계,
c) 적어도 과량의 뉴클레오티드로부터 상기 샘플을 정제하는 단계,
d) 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제1 파트너를 포함하도록 3'-위치에서 변형되어 있는 디데옥시 뉴클레오티드, 및 단계 b)에서 수득된 cDNA(들)의 3'-말단에서 단일 3'-아지드- 또는 3'-알킨 변형된 디데옥시 뉴클레오티드를 부착하기 위한 주형-비의존적 폴리머라제를 첨가하는 단계,
e) 적어도 단계 d)에서 첨가된 과량의 변형된 디데옥시 뉴클레오티드로부터 샘플을 정제하는 단계,
f) 클릭 결찰 반응을 수행하여 트리아졸 결합의 형성하에 원형 단일 가닥 cDNA(들)을 생성하는 단계,
g) 제1 프라이머의 5'-말단에서 적어도 6개의 뉴클레오티드에 상보적이고 이의 3'-말단에 cDNA(들)의 3'-말단에서 디데옥시 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머를 첨가하여 트리아졸 결합과 중첩하는 위치에서 단계 f)에서 수득된 결찰된 원형 제1 프라이머/cDNA 분자(들)에 대한 제2 프라이머의 혼성화 및 결합을 수행하는 단계, 및
h) DNA 폴리머라제를 첨가하여 제2 프라이머의 쇄 연장을 달성하고 후속적으로 전장 cDNA(들)을 증폭하는 단계 또는
h') DNA 폴리머라제를 첨가하여 제2 프라이머의 쇄 연장을 달성하고, 동시에 전체 cDNA(들)을 포함하는 원형 단일 가닥 DNA(들)의 서열을 결정하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
제3 측면에서, 본 발명은 복수의 mRNA 분자를 함유하는 샘플로부터 전장 mRNA 라이브러리를 제조하기 위한 이러한 본 발명의 방법의 용도에 관한 것이다.
제4 측면에서, 본 발명은 유기체의 하나 이상의 유형의 세포 또는 유기체의 전체 엑솜의 전체 mRNA를 서열분석하는 방법으로서, 상기 방법이 이러한 엑솜 또는 전체 세포 mRNA를 함유하는 샘플을 제공하는 단계, 본원에 기재된 바와 같은 본 발명에 따른 방법을 수행함으로써 전장 mRNA의 라이브러리를 제조하는 단계, 및 수득된 총 세포 mRNA 또는 엑솜의 서열을 결정하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
제5 측면에서, 본 발명은 샘플에 함유된 적어도 하나의 RNA, 바람직하게는 mRNA를 증폭 및/또는 서열분석하기 위한 키트로서, 상기 키트가
a) 프라이머가 증폭될 적어도 하나의 mRNA의 3'-말단에 또는 그 근처에 위치한 서열에 상보적인 서열을 포함하는 제1 프라이머,
b) 역전사효소,
c) 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제1 파트너를 포함하도록 3' 위치에서 변형되어 있는 디데옥시 뉴클레오티드,
d) 주형-비의존적 폴리머라제,
e) 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고 이의 5'-말단에서 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제2 파트너가 부착된 어댑터 분자,
f) 어댑터 분자의 5'-부분에서 적어도 6개의 뉴클레오티드에 상보적이고 이의 3'-말단에 c)의 디데옥시 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머,
g) 제1 프라이머의 적어도 일부와 동일한 제3 프라이머를 포함하는, 키트에 관한 것이다.
본 발명의 제6 측면은, 샘플에 함유된 적어도 하나의 RNA, 바람직하게는 mRNA를 증폭 및/또는 서열분석하기 위한 키트로서, 상기 키트가
a) 프라이머가 증폭될 적어도 하나의 mRNA의 3'-말단에 또는 그 근처에 위치한 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 이 프라이머가 이의 5' 말단에 아지드 및 알킬 분자 쌍의 제1 파트너에 의한 변형을 함유하는 제1 프라이머,
b) 역전사효소,
c) 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제2 파트너를 포함하도록 3' 위치에서 변형되어 있는 디데옥시 뉴클레오티드,
d) 주형-비의존적 폴리머라제,
e) 제1 프라이머의 5'-부분에서 적어도 6개의 뉴클레오티드에 상보적이고 이의 3'-말단에 c)의 디데옥시 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는, 키트이다.
본 발명 및 바람직한 구현예에 대한 상세한 설명
통상 사용되는 방법을 통한, 천연 공급원으로부터의 전장 RNA, 특히 전장 mRNA, 특정 세포 또는 세포 유형의 총 mRNA, 또는 심지어 유기체의 전체 엑솜, 즉 유전자를 인코딩하는 단백질의 완전한 코딩 영역의 증폭은 여전히 복잡하고 시간 소비적 절차이다. 본 발명은,소위 "클릭 화학"을 사용하여 전장 RNA의 증폭을 용이하게 하고, 심지어 샘플에 함유된 몇몇 또는 다수의 RNA의 증폭도 단일 절차로 수행될 수 있다. RNA의 서열 결정은 증폭 후 또는 RNA(들)의 역전사에 의해 수득된 cDNA(들)의 제2 가닥 합성 동안 수행될 수 있다.
원칙적으로, 본 발명의 방법은 이러한 RNA, 특히 임의 종류의 RNA를 함유하는 혼합물의 증폭 및/또는 서열분석이 요구되는 경우, 모든 종류의 RNA에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법을 mRNA에 적용하는 것이 바람직하고, 이러한 방법에 포함되는 또 다른 바람직한 RNA는 임의 형태의 바이러스 RNA, 즉 숙주의 게놈에 통합되는 바이러스 RNA이다. 본 발명의 방법에 대한 하기의 상세한 예시적 설명은 종종 주로 mRNA를 지칭하지만, 바이러스 RNA 또는 다른 RNA를 동일한 방법으로 증폭 또는 서열분석하기 위해 동일한 측정 및 단계가 또한 수행될 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명의 전반적인 맥락에서, mRNA는 메신저 RNA, 즉 세포 또는 유기체에 함유된 DNA에 의해 인코딩되고 세포 메카니즘에 의해 단백질로 번역될 수 있는 리보핵산을 지칭한다. 추가로, 여기에 정의된 바와 같이, 용어 RNA 및 mRNA는 또한 합성 리보핵산, 또는 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 mRNA를 포함할 수 있다. RNA 또는 mRNA는 추가로 당 모이어티의 유사체를 함유하는 핵산을 포함하는 것을 의미한다. 천연 RNA 및 mRNA는 아데닌, 우라실, 시토신 또는 구아닌으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 염기를 함유하지만, 비-천연 염기도 포함될 수 있다.
본 발명의 방법은 한 종류의 RNA 또는 mRNA만을 함유하는 샘플에 적용될 수 있다. 그것은 샘플이 동일한 뉴클레오티드 서열과 동일한 수의 뉴클레오티드를 갖는 핵산만을 함유함을 의미한다. 본 발명의 다른 구현예에서, 샘플은 2개 이상의 상이한 RNA 및/또는 mRNA, 바람직하게는 2개 이상의 상이한 mRNA를 함유할 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "상이한 RNA 및/또는 mRNA"는 상이한 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산뿐만아니라, 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖지만, 어떠한 이유로든, 상이한 수의 뉴클레오티드를 함유하는 RNA 및/또는 mRNA도 포함하는 것을 의도한다.
본 발명의 맥락 내에서 사용되는 용어 "클릭 화학" 또는 "클릭-반응" 등은 당해 기술 분야에 기재된 모든 상응하는 방법 및 상기 "발명의 배경" 부분에서 언급된 예시적 간행물을 지칭하는 것으로 의도한다. 이는, 특히, 클릭 반응을 수행하기 위한 조건, 시약 및 방법에 관한 한, 본 발명의 목적을 위해 구체적으로 그 개시내용이 포함되는 WO 2019/063803 A1을 참조한다. 바람직하게는, 단계 f)의 맥락에서, 구리 촉매된 아지드-알킨 부가 환화 반응(CuAAC)이 수행되고, 가장 바람직하게는 WO 2019/063803 A1에 기재된 조건하에 수행된다. 그러나, 본 발명의 맥락 내에서, 알킨 및 아지드 변형 핵산을 결찰하기 위한 추가로 익히 공지된 방법인, 스트레인-촉진된 구리-비함유 클릭 결찰(SPAAC)을 수행하는 것이 또한 가능하고 바람직하다[참조: 예를 들어, I.S. Marks et al., Bioconjug Chem. 2011 22(7):1259-1264, M. Shelbourne et al., Chem. Commun. 2012, 48, 11184-11186, M. Shelbourne et al., Chem. Commun. 2011, 47, 6257-6259]. 클릭 반응에 사용하기 위한 뉴클레오티드 및 핵산의 변형에 적합한 알킨 및 아지드 잔기는 선행 기술에 기재되어 있고 당업자에게 익히 공지되어 있다. 클릭-가능한 5'-알킨- 또는 아지드 변형된 올리고뉴클레오티드의 예도 도 7에 개요되어 있다. 알킨 삼중 결합 또는 아지드 모티프와 이렇게 변형된 뉴클레오티드 사이의 스페이서의 길이는 다양할 수 있으며, 알킨 및 아지드 분자 쌍의 클릭 반응으로부터 발생하는 트리아졸 결합을 포함하는 각각의 주형을 통해 판독하는 DNA 폴리머라제 또는 역전사효소의 능력에 의해서만 제한된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 스페이서는 적어도 하나의 원자 및 최대 30개 원자, 보다 바람직하게는 최대 20개 원자, 가장 바람직하게는 최대 10개 원자를 포함한다. 스페이서는 C 원자를 포함하지만, 헤테로원자 N 및/또는 O도 포함할 수 있다.
간단히 요약하면, 본 발명의 제1 측면은 역전사를 통해 하나 이상의 (m)RNA 주형으로부터 cDNA 제조를 포함하고, 그 동안 또는 그 후에, 수득된 하나 이상의 cDNA가 이들의 3'-말단에서 변형되어 알킨- 또는 아지드 변형을 포함한다. 보다 구체적으로, 클릭 반응에 관여하는 분자 쌍의 한 파트너가 cDNA(들)에 부착된다. 그 후, 폴리- 또는 올리고뉴클레오티드 서열과 이의 3'-말단에 분자 쌍의 제2 파트너를 포함하는 어댑터가 클릭 반응을 통해 cDNA(들)에 결찰된다. 이 어댑터와 특정 제2 프라이머를 사용하면, cDNA(들)을 매우 효과적으로 증폭시키거나 cDNA(들)을 직접 서열분석할 수 있다.
본 발명의 제1 방법은 초기 단계 a)를 포함하고, 여기서 적어도 하나의 (m)RNA의 3'-말단에 또는 그 근처에 위치하는 서열에 상보적인 제1 프라이머가 (m)RNA(들)을 함유하는 샘플에 첨가된다. 이 제1 프라이머를 샘플에 첨가하는 것은 상보적인 (m)RNA 서열에 대한 제1 프라이머의 혼성화를 가능하게 하는 조건하에서 발생한다.
적어도 하나의 제1 프라이머는, (m)RNA에 대한 프라이머의 효과적 혼성화를 가능하게 하기 위해 각각의 표적 (m)RNA에 상보적인 충분한 수의 핵산을 포함한다. 제1 프라이머는 DNA/RNA 증폭 절차에서 유용한 것으로 간주되는 임의 수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 제1 프라이머는 적어도 5개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 10개 또는 적어도 15개의 뉴클레오티드로 구성된다. 이러한 바람직한 구현예에서, 제1 프라이머는 추가로 최대 60개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 최대 50개의 뉴클레오티드, 가장 바람직하게는 최대 45개의 뉴클레오티드로 구성된다. 적어도 하나의 mRNA에 대한 적어도 하나의 제1 프라이머의 혼성화를 수행 또는 촉진하기 위한 조건은 당업자에게 익히 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[참조: J. Zhang et al., Biochem. J., 1999, 337, 231-241]에 기재된 것들을 포함한다. 특히 바람직한 조건은 또한 당업자가 예비 시험에 의해 용이하게 결정할 수 있다.
이 제1 본 발명의 방법의 제2 단계 b)에서, 적어도 하나의 (m)RNA에 혼성화된 프라이머의 3'-말단에서 개시하여, (m)RNA는 샘플에 역전사효소 및 뉴클레오티드의 첨가를 포함하는 조건하에 역전사되어 적어도 하나의 mRNA의 전장 cDNA(들)을 제공한다. 천연의 4개 유형의 뉴클레오티드 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP가 일반적으로 본 발명의 맥락에서 사용되지만, 인공 뉴클레오티드도, 그들이 본 발명의 방법의 임의의 추가 단계의 cDNA 형성을 손상시키지 않는 한, 포함될 수 있다. 단계 a)와 관련하여, 역전사를 위한 조건도 당업자에게 익히 공지되어 있다.
중간 단계 c)에서, 단계 b)에서 사용된 적어도 과량의 뉴클레오티드가 제거된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 또한 잔류하는 (m)RNA(들), 과량의 역전사효소 및 과량의 제1 프라이머(들)가 이 단계 동안 제거될 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, cDNA 정제는 당업계에 공지된 방법에 따라 수행되고, 정제된 cDNA는 방법의 추가 단계에 포함된다.
후속 단계 d)에서, 3'-위치에서 변형되어 아지드/알킨 클릭-반응 쌍의 제1 파트너를 포함하는 디데옥시 뉴클레오티드(ddNTP)와 주형 독립적 폴리머라제가 샘플에 첨가된다. 용어 "디데옥시 뉴클레오티드" 또는 ddNTP는 2'- 또는 3'-하이드록실 그룹이 없는 뉴클레오티드를 나타낸다. 본 발명의 맥락 내에서, ddNTP는 염기 아데닌, 티민, 시토신 또는 구아닌 중 하나를 포함한다. 변형된 디데옥시 뉴클레오티드는 폴리머라제에 의해 이의 3' 말단에서 cDNA 서열에 첨가되며, 디데옥시 뉴클레오티드는 필요한 3'-하이드록실 그룹을 함유하지 않기 때문에, 더 이상의 쇄 연장은 발생할 수 없고, 부착된 아지드 또는 알킨 그룹은 cDNA의 3' 말단과 제2 클릭 반응 파트너의 반응에 이용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 알킨 또는 아지드 그룹은 ddNTP의 데옥시리보스 모이어티의 3'-위치에 부착되고, 또한 바람직하게는 ddNTP는 분자에 부착된 아지드 그룹을 함유한다.
추가의 중간 단계 e)에서, 단계 d)에서 사용된 적어도 과량의 변형된 디데옥시 뉴클레오티드가 제거된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 또한 이 단계 동안, 궁극적으로 잔류하는 (m)RNA(들), 과량의 역전사효소 및 과량의 제1 프라이머(들)가 제거될 수 있고/있거나, 단계 d)에서 사용되는 주형-비의존적 폴리머라제가 제거될 수 있다.
f) 단계에서, 어댑터 분자는 제2 클릭 반응 파트너로서 샘플에 첨가된다. 어댑터 분자는 올리고 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이의 5'-말단에 부착된 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제2 파트너를 함유한다. 알킨 그룹과 아지드 그룹 사이에서 발생하는 클릭 반응은 트리아졸 결합의 형성하에 어댑터 분자를 cDNA의 3'-말단에 결찰시킨다. 어댑터 분자는 혼성화 및 후속 증폭을 통해 본 발명의 방법의 다음 단계에서 제2 프라이머의 결합을 돕는다. 따라서, 어댑터 분자는 이러한 제2 프라이머의 결합을 가능하게 하기에 충분한 수의 뉴클레오티드, 일반적으로 적어도 6개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 적어도 10개, 더욱 바람직하게는 적어도 15개의 뉴클레오티드를 함유한다. 바람직한 구현예에서, 어댑터 분자는 최대 100개의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 최대 80 또는 60개의 뉴클레오티드를 함유한다. 또한, 본 발명의 바람직한 구현예는 단계 e)에서, 이의 5'-말단에 부착된 알킨을 함유하는 어댑터 분자를 사용하는 것도 고려된다.
다음 단계 g)에서, 어댑터 분자의 전체 또는 일부에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 상기 언급한 제2 프라이머가 첨가된다. 제2 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 어댑터 분자의 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에서 적어도 6개의 뉴클레오티드에 상보적이며, cDNA(들)의 3'-말단에서 디데옥시 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 이의 3'-말단에 함유한다. 따라서, 제2 프라이머는 혼성화하고, 클릭 반응을 통해 형성된 트리아졸 결합과 중첩되는 위치에서 결찰된 어댑터/cDNA 분자에 결합한다.
추가 단계에서, 제2 프라이머는 DNA 폴리머라제의 첨가로 연장된다. 하나 이상의 RNA의 증폭이 목적시되는 한, 제1 프라이머(들)의 적어도 일부와 동일한 하나 이상의 제3 프라이머가 첨가될 수 있고, 이어서 수득된 cDNA를 공지된 방법에 따라 증폭시킬 수 있다. 이 옵션은 단계 h) 및 j)에 의해 정의된다. 제3 프라이머는, 예를 들어, 제1 프라이머보다 적은 뉴클레오티드를 포함하지만, 여전히 혼성화를 보장할 수 있다. 제3 프라이머는 또한, 혼성화를 보장하는 특정 서열, 및 적어도 하나의 mRNA 상의 제1 프라이머의 표적 서열에 상보적이지 않은 추가 서열을 포함할 수 있다.
하나 이상의 RNA의 서열분석이 목적시되는 한, 본 발명의 맥락 내에 상이한 옵션이 존재한다. 먼저, 단계 g) 후에, DNA 폴리머라제를 첨가하여 제2 프라이머의 쇄 연장을 달성하고, 단계 b)에서 생성된 전체 cDNA(들)에 상보적인 서열을 포함하는 "전장" 제2 가닥 DNA(들)를 생성할 수 있다. 이러한 제2 가닥 DNA(들)는 단일 분자 서열분석을 위한 공지된 방법(예: Pacific Biosciences, https://www.pacb.com/에서 이용가능한 시스템 및 키트)에 따라 증폭되지 않고 서열분석될 수 있다. 이 옵션은 단계 h) 및 i)에서 정의된다.
대안적 구현예에서, 서열분석은 DNA 폴리머라제를 첨가한 후 제2 프라이머의 쇄 연장과 동시에 수행될 수 있다. 이 대체 옵션은 단계 h')에 의해 정의된다. 서열분석은, 예를 들어, 공지된 생거(Sanger) 서열분석 방법 또는 이 원리를 기반으로 개발된 방법 또는 합성에 의한 서열분석 방법(예: Illumina, https://illumina.com/에서 이용가능한 시스템 및 키트)에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 방법은, 처음으로, 일반적으로 사용되는 공정에서 요구되는 RNA의 단편화 및 무작위 프라이밍을 필요로 하지 않고서 특정 RNA 샘플에 대한 증폭된 cDNA를 생성할 수 있게 하고, 그 중 하나는 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 이러한 선행 기술의 증폭 공정과 비교하여, 본 발명의 방법은, 예를 들어, 중첩하는 단편에 대한 서열 데이터를 정렬할 필요 없이 완전한 mRNA 또는 관심 mRNA에 대한 완전하게 대표적 cDNA 라이브러리에 도달하는 데 저 적은 공정 단계를 필요로 한다. 또한, 본 발명의 방법은 무작위 프라이밍 또는 특정 프라이밍으로부터 전장 라이브러리를 생성한다. 또한, 본 발명의 방법은 라이브러리 제조 워크플로우를 위한 표준 폴리머라제로 수행될 수 있다. 폴리(dT) 프라이밍을 사용하는 본 발명의 방법의 개략도는 도 2에 도시되어 있다.
제1 프라이머로서, 본 발명의 맥락 내에서 다양한 상이한 대안 및 각각의 폴리뉴클레오티드가 고려될 수 있다. 첫째, 선행 기술 방법으로부터 공지된 바와 같이, 무작위 프라이머가 사용될 수 있다. 이 제1 대안의 경우, RNA 또는 RNA들, 바람직하게는 mRNA 또는 mRNA들 내의 무작위 부분에 혼성화하는 무작위 서열을 갖는 다소 짧은 뉴클레오티드 서열이 사용될 수 있다. 이러한 무작위 제1 프라이머를 사용하는 공정의 생성물은 상이한 길이를 갖는다.
본 발명의 제2 대안 및 바람직한 구현예에서, 무작위 프라이머 대신에 특정 프라이머가 사용된다. 이 대안은 샘플에 함유된 적어도 하나의 RNA의 서열 또는 동일성이 공지된 경우에 특히 적용 가능하다. 샘플에 존재할 수 있는 하나 이상의 공지된 (m)RNA의 존재에 대해 샘플이 분석되는 경우, 상응하는 특정 프라이머를 사용하여, 이러한 공지된 (m)RNA의 검출을 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예이기도 한 추가 대안에서, 폴리(dT) 프라이머는 mRNA 증폭을 위한 적어도 하나의 제1 프라이머로서 사용된다. 폴리(dT) 프라이머는 일반적으로 6 내지 30개의 dT 뉴클레오티드를 포함한다. 프라이머는 샘플에서 적어도 하나의 mRNA의 폴리(A) 테일(들)에 혼성화를 가능하게 하는 조건하에서 샘플에 첨가된다. 모든 mRNA 분자는 3'-말단에 다중 아데노신 모노포스페이트로 이루어진 폴리(A) 테일을 포함한다. 폴리(A) 테일은 유전자의 전사가 완료된 후에 발생하는 폴리아데닐화를 통해 진핵생물 RNA에 첨가된다. 그러나, 폴리(A) 테일은 번역 동안 코딩 기능이 없다. 따라서, 폴리(A) 테일은 프라이머 혼성화를 위한 이상적인 표적이며, 상응하는 폴리(dT) 프라이머를 제공하는 것에는 표적 mRNA의 서열에 대한 임의의 지식이 필요하지 않다. 또한, 폴리(dT) 프라이머의 사용은 샘플에 함유된 mRNA(들)의 완전한 코딩 서열의 역전사 및 증폭을 가능하게 한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 또한 상이한 종류의 프라이머, 즉 무작위 및 특정 프라이머 또는 무작위 및 폴리(dT) 프라이머 또는 특정 및 폴리(dT) 프라이머의 사용을 포함한다. 이는 프라이머가 또한 특정 앵커 또는 포획 서열을 포함하는 경우에 특히 유용하다. 예를 들어, 샘플에서 공지된 mRNA의 존재를 검출하기 위해 특정 프라이머가 포함될 수 있다. 예를 들어, 그러한 특정 프라이머의 5'-말단에 부착된 포획 서열의 존재는 증폭 후 후속 단계에서 이 공지된 mRNA에 대해 수득된 증폭된 cDNA를 고체 지지체에 부착하여, 다른 증폭 생성물로부터 고체 지지체에 부착된 cDNA를 분리하고, 이러한 cDNA의 존재를 검출하는 옵션을 제공한다. 제1 프라이머(들)에 부착된 포획 또는 앵커 서열의 포함에 의해 제공되는 다른 유용한 옵션은 당업자에 의해 용이하게 인식될 수 있고 또한 본 발명의 맥락 내에 포함된다.
mRNA 증폭을 위한 본 발명의 특히 바람직한 구현예에서, 폴리(dT) 프라이머는 앵커 서열을 포함하는 적어도 하나의 제1 프라이머로서 사용된다. 이 앵커 서열은 일반적으로 2 내지 50개 뉴클레오티드의 추가 5'-말단-연장을 제공한다. 바람직하게는, 앵커 서열은 적어도 5개, 더욱 바람직하게는 적어도 8개의 뉴클레오티드를 함유한다. 추가의 바람직한 구현예에서, 앵커 서열은 최대 40개, 보다 바람직하게는 최대 30개의 뉴클레오티드를 함유한다. 이러한 앵커 서열의 존재는, 예를 들어, 본 발명의 방법에 사용되는 폴리(dT) 프라이머(들)의 균일한 배치를 보장할 가능성을 제공한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 3'-알킨- 또는 3'-아지드-변형된 ddGTP 또는 3'-알킨- 또는 3'-아지드-변형된 ddCTP가 본 발명의 방법의 단계 d)에서 첨가된다. cDNA의 3'-말단에 염기 G 또는 C 중 하나가 존재하면, 다음 단계 g)에서 제2 프라이머의 특히 효율적인 혼성화 및 부착을 초래하는 것으로 관찰되었다. 단계 d)에서 cDNA에 3'-알킨- 또는 3'-아지드 변형된 ddGTP를 첨가하여 cDNA의 3'-말단이 G를 포함하도록 변형된 경우에 최상의 결합 결과가 수득되었고, 가장 바람직한 변형된 디데옥시 뉴클레오티드는 3'-아지도-2',3'-디데옥시 GTP(AzddGTP)이다.
단계 d)에 대해 상기 언급한 바람직한 구현예에 상응하여, 단계 g)의 제2 프라이머는 이의 3'-말단에 dG 또는 dC, 가장 바람직하게는 dC를 함유하는 것이 더욱 바람직한다. 본 발명의 방법은 제2 프라이머가 이의 3'-말단에 cDNA(들)의 3'-말단에서 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 것을 필요로 한다. 따라서, 단계 d)에서 알킨 또는 아지드 변형된 ddGTP가 사용되는 바람직한 구현예에서, 제2 프라이머는 이의 3'-말단에 dC를 함유한다. 알킨 또는 아지드 변형된 ddCTP가 단계 d)에 포함되는 다른 바람직한 구현예에서, 제2 프라이머는 상응하게 3'-말단에 dG를 함유한다. 변형된 ddGTP를 사용하는 상기 개시된 가장 바람직한 구현예와 일치하여, 이러한 가장 바람직한 구현예에서 이의 3'-말단에 dC를 함유하는 제2 프라이머가 사용된다. 본 발명의 추가의 바람직한 구현예에서, 제2 프라이머는 이의 3'-말단의 제2 위치에 dC를 포함한다. 제2 프라이머가 클릭 반응에 의해 형성된 트리아졸 결합과 중첩되는 이 위치에서 dC의 존재는 프라이머 결합 및 후속 프라이머 연장을이 상당히 향상시킨다는 것이 본 발명자들에 의해 인식되었다.
단계 d)에서 주형 독립적 폴리머라제로서, 바람직하게는 효소 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT)가 사용된다. 효소는 DNA 폴리머라제의 X 계열의 구성원이고, DNA 분자의 3'-말단에 뉴클레오티드의 첨가를 촉매한다. 대부분의 다른 DNA 폴리머라제와 달리, TdT는 주형을 필요로 하지 않는다. 이는 바람직한 기질로서 3'-오버행에 뉴클레오티드를 첨가할 수 있지만, 무딘 또는 오목한 3'-말단에 뉴클레오티드를 첨가하는 경우에도 양호하게 작동한다. 따라서, 분자 유기체학, 즉 cDNA 말단의 신속한 증폭(RACE), PCR 및 보다 최근의 효소적 드 노보(de novo) 유전자 합성에서 중요하고 광범위한 응용으로 밝혀졌다.
본 발명의 맥락에서, 검출 가능한 표지 또는 태그를 포함하는 모이어티를 포함하거나, 고체 지지체 상에 고정화를 가능하게 하는 프라이머 및 어댑터 분자 중 적어도 하나를 포함하는 것은 옵션이고, 또한 바람직한 구현예이다. 이러한 옵션 중 하나는 제1 프라이머(들)에 대해 이미 상기 기재되었다. 이러한 모이어티는, 예를 들어, 추가 분자를 통해 직접적으로 또는 간접적으로 고체 지지체에 대한 공유 결합을 형성할 수 있다. 예를 들어, 추가 검출 또는 서열분석을 위해 증폭된 핵산을 포획하는 것이 의도되는 경우, 고체 지지체에 대한 고정화가 매우 유리할 수 있으며, 자동화된 서열분석 방법에서 일반적으로 사용된다. 이러한 구현예에 따라, 본 발명에서 사용되는 프라이머 또는 어댑터 중 하나는 고체 지지체에 이미 부착되어 존재할 수도 있고, 상기 방법은 이러한 고체 지지체의 존재하에 수행될 수 있다. 고체 지지체로서, 임의의 물질이 직접 또는 반응 혼합물로부터 부착된 분자의 포획 및 분리를 가능하게 할 수 있는 후기 단계에서 포함되거나 첨가될 수 있다. 고체 지지체로서, 본 발명의 맥락 내에서 다양한 물질 및 분자가 포함되고 사용될 수 있다. 예를 들어, 평평한 또는 3차원 표면이 고체 지지체로서 제공될 수 있으며, 예를 들어, 프라이머 또는 어댑터가 부착되거나, 후속 결합 반응을 통해 부착될 수 있는 비드가 이러한 맥락에서 유리하게 사용될 수 있다. 또한, 표지된 형태로, 즉 증폭 생성물의 검출을 가능하게 하는 검출 가능한 표지 또는 태그를 포함하는 프라이머 또는 어댑터 중 하나를 사용하는 것도 가능한다. 특히, 특정 프라이머가 사용되는 경우, 증폭된 cDNA의 존재에 대한 상응하는 검출은 당업자에게 공지된 방법에 의해 용이하게 수행될 수 있다.
또한, 상기 개요된 옵션을 조합하여 증폭된 cDNA의 포획 및 검출을 제공할 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 추가 구현예에서, 본 발명의 방법에 사용되는 프라이머 또는 어댑터 중 적어도 하나는 고체 지지체에 부착되거나, 고체 지지체에 대한 결합을 촉진하는 분자에 연결되거나 결합되고, 적어도 프라이머 및 어댑터 분자 중 다른 하나는 검출 가능한 표지 또는 검출 가능한 표지가 부착될 수 있는 분자를 함유한다. 본 발명의 이러한 구현예는 증폭 생성물의 간단하고 바람직하게는 또한 자동화된 검출을 가능하게 하고, 따라서 분석될 샘플에서 특정 mRNA의 존재를 가능하게 한다.
상기한 바람직한 예는 본 발명의 방법의 가능한 모든 변형 및 이점을 완전히 열거할 수는 없지만, 당업자는 연구 또는 진단의 특정 목적에 가장 적합하도록 방법을 용이하게 적응시킬 수 있다. 따라서, 특히, 본 발명의 방법과 추가로 공지된 절차의 조합은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 방법 및 본 발명의 제2 측면의 변형이 도 9에 도시되어 있다. 이러한 대안적 방법에서, 제1 프라이머로서, 본 발명의 맥락 내에서 다양한 상이한 대체물 및 각각의 폴리뉴클레오티드가 고려될 수 있다. 첫째, 5'-말단에서 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제1 파트너로 변형된 프라이머는 공지된 고체-상 방법에 의해 제조될 수 있고, 상기 단계 a) 및 b)에서 상기 기재된 바와 같이 역전사에 사용될 수 있다. 단계 c)에서 정제 및 단계 d)에서 주형 독립적 폴리머라제를 통해 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제2 파트너를 운반하도록 변형된 ddNTP의 첨가 후, 아지드 및 알킨 잔기를 이의 말단에 함유하는 cDNA(들)가 생성된다. 과량의 뉴클레오티드를 제거한 후, 클릭 결찰을 수행하여 클릭 조건하에서 원형 단일 가닥 cDNA를 생성할 수 있다(예: V. Cassinelli, et al. Angew. Chem. Int. Ed., 2015, 54, 7795-7798). 연결을 방지하기 위해, 이중 변형된 cDNA는 이전에 기재된 바와 같이 클릭 결찰 전에 희석된다[참조: R. Kumar et al., J. Am. Chem. Soc., 2007, 129(21), 6859-6864]. 이어서, 롤링 원 증폭(BGI genomics NGS 방법)에서 주형을 증폭하거나 서열분석하기 위해, 단계 g)의 제2 프라이머 대신에, 제1 프라이머의 적어도 일부에 상보적인 대안적 제2 프라이머가 사용될 수 있다. 따라서, 이 대안적 방법에서, 본 발명의 제1 방법에 대해 기재된 대부분의 측면이 여전히 적용되지만, 본 발명의 제1 측면의 단계 f)에 기재된 어댑터 분자의 첨가는 더 이상 적용가능하지 않거나, 요구되지 않는다. 그러나, 대안적 제2 프라이머는 또한, 이의 3'-말단에, cDNA의 3' 말단에서 디데옥시 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 포함한다(클릭 반응을 통한 순환 전).
본 발명의 방법 및 본 발명의 전술한 제2 측면의 맥락에서, 단계 h)를 통해 증폭을 수행하는 대신에, 단계 h')에서 공지된 방법에 따라 서열분석을 직접 수행하는 것도 가능하다. 예를 들어, 생거 서열분석은 본 발명의 방법의 단계 g)에서 수득된 생성물 또는 대안적 방법에 대해 도 9의 하단에 도시된 바와 같은 원형 DNA/프라이머 작제물을 사용하여 직접 수행될 수 있다. 또한, 단일 뉴클레오티드 서열분석 방법은 본 발명의 방법의 단계 g)의 생성물 또는 대안적 방법의 원형 DNA/프라이머 작제물의 쇄 연장에 의해 수득된 생성물을 사용하여 적용될 수 있다.
본 발명의 추가 주제 및 제3 측면은 전장 mRNA 라이브러리를 제조하기 위한 샘플에 함유된 하나 이상의 mRNA를 증폭하기 위한 상기 기재된 본 발명의 방법의 용도이다. 특히, 폴리(dT) 프라이머가 적어도 하나의 제1 프라이머로서 사용되는 본 발명의 바람직한 구현예의 맥락에서, 상기 방법은 샘플에 함유된 완전한 mRNA 서열의 증폭을 가능하게 한다. 이것은 샘플이 유기체의 하나 이상 유형의 세포의 총 mRNA 또는 심지어 유기체의 전체 엑솜, 즉 특정 세포 또는 유기체에서 단백질로 번역될 총 mRNA를 함유하는 경우에 특히 유용하다.
본 발명의 추가의 제4 주제는 상기 기재된 바와 같고, 증폭된 mRNA 또는 수득된 mRNA 라이브러리의 서열의 결정을 추가로 포함하는 본 발명의 방법 및 용도에 관한 것이다. 이러한 방법은 유기체의 세포의 총 mRNA 및 심지어 유기체의 전체 엑솜의 신뢰할 수 있는 서열분석을 가능하게 하고, mRNA 풀 내의 희귀 전사체의 검출도 보장한다. 이러한 방법을 제공하는 것은 의학 연구 및 임상 진단에서, 예를 들어, 복잡한 장애에서의 변이체 맵핑, 유전적 이상의 조사, 질환의 유전적 기초의 결정 또는 멘델 장애 진단 및 기타 용도에 특히 유용하다.
본 발명의 추가의 제5 및 제6 주제는 본 발명의 상기 언급된 방법 및 용도 중 적어도 하나를 수행하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 제1 측면에 따라 샘플에 함유된 적어도 하나의 (m)RNA를 증폭 및/또는 서열분석할 수 있도록 하는 키트는
a) 프라이머가 증폭될 적어도 하나의 (m)RNA의 3'-말단에 또는 그 근처에 위치한 서열에 상보적인 서열을 포함하는 제1 프라이머,
b) 역전사효소,
c) 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제1 파트너를 포함하도록 3' 위치에서 변형되어 있는 디데옥시 뉴클레오티드,
d) 주형-비의존적 폴리머라제,
e) 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고 이의 5'-말단에 상기 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제2 파트너가 부착된 어댑터 분자,
f) 어댑터 분자의 5'-부분에서 적어도 6개의 뉴클레오티드에 상보적이고 이의 3'-말단에 c)의 디데옥시 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머,
g) 임의로 제1 프라이머의 적어도 일부와 동일한 제3 프라이머를 포함한다.
본 발명의 제2 측면에 따라 샘플에 함유된 적어도 하나의 RNA, 바람직하게는 mRNA의 증폭 및/또는 서열분석을 수행하는 데 유용한 키트는
a) 프라이머가 증폭될 적어도 하나의 mRNA의 3'-말단에 또는 그 근처에 위치한 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 이 프라이머가 이의 5' 말단에 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제1 파트너에 의한 변형을 함유하는 제1 프라이머,
b) 역전사효소,
c) 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제2 파트너를 포함하도록 3' 위치에서 변형되어 있는 디데옥시 뉴클레오티드,
d) 주형-비의존적 폴리머라제,
e) 제1 프라이머의 5'-부분에서 적어도 6개의 뉴클레오티드에 상보적이고 이의 3'-말단에 c)의 디데옥시 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함한다.
또한, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 추가의 유용한 시약, 특히 다음 중 적어도 하나를 함유할 수 있다:
h) RNase,
i) 네 종류의 모든 자연 발생적인 뉴클레오티드,
j) 클릭 반응을 수행하기 위한 시약,
k) 완충제 및 용매,
l) cDNA 증폭을 수행하기 위한 시약,
m) 정제용 시약.
이러한 방법을 수행하기 위한 키트에 함유된 시약은 추가 시약을 포함하거나 특정 방법에 필요하지 않은 시약을 별도로 설정하도록 당업자에 의해 용이하게 조정될 수 있다.
본 발명의 하나의 주제와 관련하여 상기 개시된 모든 정보는 이 정보가 명시적으로 반복되지 않더라도 본 발명의 맥락 내에서 인식가능한 관련성을 갖는 다른 주제의 맥락에서 동등하게 적용되는 것으로 간주된다.
도 1은 라이브러리 제조를 위한 RNA의 일반적인 선행 기술 PCR 증폭의 개략도를 도시한다.
RNA 샘플은 초음파 장치를 사용하여 단편화되고, 단편은 (무작위로) 프라이밍되고, 역전사효소를 사용하여 제1 가닥 합성(cDNA 합성)이 수행된다. dTTP 대신에 우라실을 도입하는 제2 가닥이 생성되고, 이중 가닥 DNA 단편이 정제되어 무디게 된다. dA 테일링은 후속적 효소 어댑터 결찰 단계의 효율성을 높이기 위해 수행된다. 크기 선택을 수반하는 또 다른 클린-업 단계가 수행되고, PCR 농축 전에 U 함유 가닥이 제거된다.
도 2는 mRNA를 증폭하고 전장 mRNA 라이브러리를 제공하기 위해 폴리(dT) 프라이밍을 포함하는 본 발명의 방법의 개략도를 도시한다.
도 3a는 본 발명의 방법에 의해 생성된 클릭 결찰된 cDNA 풀로부터 생성된 전장 PCR 단편을 도시한다. 하나의 프라이머는 클릭 결찰된 어댑터(어댑터 프라이머1)에 결합하고, 제2 프라이머는 역전사 프라이밍에 사용되는 폴리(dT)(폴리(dT) 프라이머 역방향)의 일부이다. 연장 시간(1 내지 10분)에 따라, PCR 단편의 분포는 보다 긴 증폭으로 이동한다.
도 3b, c는 생물분석기 장치(Agilent)를 사용하는 전장 PCR 단편의 분석을 나타낸다. PCR 동안 3분 연장 시간(C)을 갖는 샘플의 dsDNA 크기 분포는 1분 연장 시간(B)에 비해 보다 큰 크기로 명확하게 이동한다.
도 4는 본 발명의 방법에 의해 생성된 클릭 결찰된 cDNA 풀로부터 생성된 PCR 단편을 도시한다. 프라이머는 전사체의 바로 5' 말단을 커버한다. GAPDH 및 β-Gal과 같은 하우스 키핑 유전자에 인접하여, eGFP, Cas9 및 Fluc에 대한 mRNA를 내부 제어를 위해 Jurkat 세포 전체 mRNA 풀에 스파이킹했다.
도 5는 본 발명의 방법에 의해 생성된 클릭 결찰된 cDNA 풀로부터 생성된 PCR 단편을 도시한다. 하나의 프라이머는 클릭 결찰된 어댑터에 결합하고, 제2 프라이머는 유전자 특이적 역상보체에 결합한다(도 4의 Int rev와 같이). 인공적으로 생성된 β-Gal 유전자 단편을 제외하고는, 모든 PCR 생성물은 도 4에 비해 예상된 바와 같이 보다 크다.
도 6은 본 발명의 방법에 대한 단일 가닥 cDNA의 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 매개 3'-말단 표지를 위한 예시적 클릭-준비 뉴클레오티드를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 방법을 위한 어댑터 올리고뉴클레오티드의 예시적 클릭-준비 5'-말단을 나타낸다.
도 8은 천연 포스포디에스테르(좌측)와 비교한 본 발명의 방법에 대한 예시적 트리아졸 백본 버전을 나타낸다.
도 9는 전장 mRNA 서열분석을 위한 대체 워크플로우의 개략도를 나타낸다. 5'-알킨/아지드 변형된 프라이머가 역전사에 사용되고, 생성되는 cDNA가 정제된다. 아지드/알킨 뉴클레오티드는 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT)에 의해 3'-말단에 도입되고, 과량의 뉴클레오티드의 제거 후, 클릭 결찰이 수행되어 원형 ssDNA를 생성한다. 적어도 부분적으로 상보적 프라이머를 초기 프라이머에 적용함으로써, 원형 ssDNA의 증폭 또는 심지어 서열분석이 가능할 것이다.
도 10은 프라이밍된 모델 RNA(A)에서 수행된 트리아졸 판독의 PCR 생성물(B)을 나타낸다. 모델 RNA는 3'-아지도 ddATP를 함유하는 뉴클레오티드 혼합물로 역전사시키고, 뉴클레오티드를 제거하고, cDNA를 5'-알킨 어댑터(알킨-올리고1)에 클릭 결찰시켰다. 조 클릭 반응 혼합물은 상이한 주형 양, 폴리머라제 및 사이클링 조건을 포함하는 PCR의 주형으로서 사용되었다.
도 11은 비변형된 올리고뉴클레오티드(올리고2)에 대한 TdT 매개 AzddNTP 도입 및 2개의 합성 제조된 올리고뉴클레오티드(3'-N3-참조, 알킨 올리고3 및 아지도-올리고2) 사이의 클릭과 비교하여 짧은 모델 알킨 올리고뉴클레오티드(알킨-올리고3)에 의한 후속 클릭의 결과를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 방법에 따라 처리된 PCR 단편(도 5, 레인 4)으로부터 생성된 생거 서열분석의 모세관 전기영동 자취를 나타낸다. 서열분석은 프로토콜 후에 mRNA의 5'-말단이 손상되지 않은 상태로 잔류함을 입증한다. 여기에서는 역전사 전에 RNA 풀에 스파이킹된 Fluc mRNA(반딧불이 루시퍼라제)에 대해 수행되었다. 평균 품질 값 스코어(QV)는 54.34, 즉 특정 서열에 대한 > 99.999% 확실성이다.
하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명한다:
실시예
실시예 1(도 3과 관련)
내부 제어를 위해, GAPDH와 같은 하우스키핑 유전자에 인접하여, eGFP(Baseclick), CleanCap®Cas9(Trilink), CleanCap®ß-Gal(Trilink) 및 CleanCap®Fluc(Trilink)의 mRNA(0.1μg)를 Jurkat 세포 총 RNA 풀의 2μg으로 스파이킹했다. 이 RNA 풀에, 1μL dNTP 혼합물(10mM)과 2μL의 폴리(dT) 프라이머(100μM)를 조합하여 RNase 비함유 H2O와 함께 총 용적 13μL로 되게 했다. 혼합물을 5분 동안 65℃에서 배양하고, 3분 동안 0℃로 냉각하여 혼성화를 가능하게 했다. cDNA 합성을 위해, 4μL 5×SuperScriptIV 완충제, 1μL 디티오트레이톨(100mM), 200단위 Superscript IV 역전사효소를 첨가하고, RNase 비함유 물로 총 용적 20μL까지 충전시켰다. 혼합물을 50℃에서 20분 동안, 80℃에서 10분 동안 배양하고, 3분 동안 4℃로 냉각시켰다. cDNA 합성 후, 3μL 10×RNase H 완충제, 1μL RNase A(10mg/mL), 1.4μL RNase H(5U/μL) 및 4μL 새우 알칼리성 포스파타제(1U/μL) 및 0.6μL dH2O를 첨가하여 RNA와 과량의 뉴클레오티드를 제거했다. 혼합물을 37℃에서 25분, 65℃에서 15분 동안 배양하고, 0℃로 3분 동안 냉각한 다음, PCR 생성물에 대한 제조업체의 지시에 따라 스핀 컬럼 방법(BaseClean Kit)으로 세정하고, 17μL dH2O로 용출시켰다.
정제된 혼합물은 3'-N3-ddGTP에 의한 아지드 신장에 직접 사용되었다. 17μL 정제된 cDNA 혼합물에 5μL 5× TdT 완충제, 1μL 3'-N3-ddGTP(10mM) 및 2μL 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(20U/μL)를 첨가했다. 용액을 37℃에서 1시간 동안 배양하고, 3분 동안 0℃로 냉각시켰다. 변형된 cDNA를 PCR 생성물에 대한 제조업체의 지시에 따라 스핀 컬럼 방법(BaseClean Kit)으로 정제하고, 9μL로 용출시켰다.
클릭 결찰은 9μL의 정제된 및 아지드 변형된 cDNA, 0.5μL의 알킨 어댑터(100μM), 2.5μL 활성제2 40(baseclick GmbH), 0.5μL dH2O 및 2개의 반응기 펠릿을 사용하여 수행되었다. 반응 혼합물을 45℃, 600rpm에서 40분 동안 배양했다. 반응 후, 상청액을 새로운 바이알로 옮겼다. 펠렛을 12.5μL 물로 세척하고, 상청액을 이전 상청액으로 옮겼다. 클릭 결찰된 cDNA는 PCR 생성물에 대한 제조업체의 지시에 따라 스핀 컬럼 방법(BaseClean Kit)을 사용하여 세정하고, 10μL로 용출시켰다.
클릭 결찰 후, 표적화되지 않은 프라이머(어댑터 프라이머1 및 폴리(dT) 프라이머 역방향)를 사용하여 cDNA 풀을 증폭하여 전장 mRNA 라이브러리를 수득했다. 200μL 반응 바이알에서, 11.5μL dH2O, 4μL 5× OneTaq 완충제, 1μL 어댑터 프라이머1(10μM), 1μL 폴리(dT) 프라이머 역방향(10μM), 0.4μL dNTP 혼합물(10mM), 2μL 정제된 클릭 결찰 혼합물 및 0.13μL OneTaq DNA 폴리머라제(5000U/μL)(New England Biolabs)를 조합했다. 샘플은 열순환기(BioRad)에서 열 순환 프로그램에 적용했다.
표준 사이클링으로서, 하기 조건이 상이한 연장 시간(단계 4)으로 사용되었다:
Figure 112021131978400-pct00001
PCR 혼합물은 PCR 생성물에 대한 제조업체의 지시에 따라 스핀 컬럼 방법(BaseClean Kit)을 사용하여 세정하고, 10μL dH2O로 용출시켰다. 도 3a에서, 각 PCR 반응의 3μL 분취량을, TAE 완충제(20mM TRIS, 10mM 아세트산, 0.5mM EDTA)에서 제조된 1.5% 아가로스 겔(10×15cm)에서 분석했다.
도 3b 및 c에 도시된 바와 같은 바이오분석기 측정의 경우, mRNA 풀(도 3a 레인 1 연장 시간 1분 및 레인 2 연장 시간 3분)에서 생성된 전장 PCR 단편의 1μL 정제된 분취량을 DNA 1000 키트(Agilent) 및 유기체분석기 장치(Agilent 2100)를 사용하여 측정했다.
올리고뉴클레오티드:
Figure 112021131978400-pct00002
변형:
Figure 112021131978400-pct00003
실시예 2(도 4와 관련)
클릭 결찰(실시예 3에 기재된 절차) 후, 표적 프라이머(다양한 인턴 프라이머 역방향 및 정방향, 하기 표 참조)를 사용하여 cDNA 풀에서 특정 유전자를 증폭하여 특정 PCR 단편을 생성했다. 200μL 반응 바이알에서, 11.5μL dH2O, 4μL 5× OneTaq 표준 반응 완충제, 1μL 인턴 역방향 프라이머(10μM), 1μL 인턴 정방향 프라이머(10μM), 0.4μL dNTP 혼합물(10mM), 2μL 정제된 및 클릭 결찰된 cDNA 혼합물 및 0.13μL OneTaq DNA 폴리머라제(5000U/μL)(New England Biolabs)를 조합했다. 샘플은 열순환기(BioRad)에서 열 순환 프로그램에 적용했다.
Figure 112021131978400-pct00004
각 PCR 증폭의 정제되지 않은 분취량 5μL를, TAE 완충제(10mM TRIS, 10mM 아세트산, 0.5mM EDTA)에서 제조된 1.5% 아가로즈 겔(10×15cm)에서 분석했다.
올리고뉴클레오티드:
Figure 112021131978400-pct00005
Figure 112021131978400-pct00006
실시예 3(도 5 및 도 12와 관련)
클릭 결찰(도 3의 예에 기재된 절차) 후, 유전자 특이적 프라이머와 일반적 어댑터 프라이머 표적화 프라이머(다양한 인턴 프라이머 역방향 및 어댑터 프라이머 1, 하기 표 참조)를 사용하여 cDNA 풀에서 특정 유전자를 증폭시켰고, 이는 특정 PCR 단편을 초래한다. 200μL 반응 바이알에서, 11.5μL dH2O, 4μL 5× OneTaq 표준 반응 완충제, 1μL 인턴 역방향 프라이머(10μM), 1μL 어댑터 프라이머1(10μM), 0.4μL dNTP 혼합물(10mM), 2μL 정제된 및 클릭 결찰된 cDNA 혼합물 및 0.13μL OneTaq DNA 폴리머라제(5000U/μL)(New England Biolabs)를 조합했다. 샘플은 열순환기(BioRad)에서 열 순환 프로그램에 적용했다.
Figure 112021131978400-pct00007
각 PCR 증폭의 5μL 미정제 분취량을 TAE 완충제(20mM TRIS, 10mM 아세트산, 0.5mM EDTA)에서 제조된 1.5% 아가로스 겔(10×15cm)에서 분석했다.
도 12에 제시된 생거 서열분석을 위해, Fluc(반딧불이 루시퍼라제)의 생성된 PCR 단편을 PCR 생성물에 대한 제조업체의 지시에 따라 스핀 컬럼 방법(BaseClean Kit)을 사용하여 세정하고, 20μL dH2O로 용출시켰다. 이 주형과 특정 프라이머(FLUC 인턴 역방향 프라이머)는 생거 서열분석을 위해 유로핀스 게노믹스(Eurofins Genomics)(Ebersberg, Germany)에 따라 제조되고, 보내졌다.
올리고뉴클레오티드:
Figure 112021131978400-pct00008
실시예 4(도 10 관련)
트리아졸 판독의 실현가능성은 모델 RNA 서열의 역전사에 대해 예시되었다. RNA를 프라이머1에 혼성화한 후, 200μM dTTP, dGTP, dCTP 및 3'-아지도-ddATP의 존재하에 MuLV 역전사효소를 사용하여 역전사했다. 뉴클레오티드 및 효소는 제조업체의 지시에 따라 뉴클레오티드 제거 키트(Qiagen)를 사용하여 cDNA의 정제로 제거했다.
알킬 올리고1은 총 12.5μL 반응 혼합물 중의 단일 반응기 펠릿(600-800μm, 구리 원소 함유)을 포함하는 200μL 반응 바이알에서 정제된 cDNA에 클릭하고, 45℃에서 60분 동안 배양했다. 반응 혼합물은, 800μM THPTA, 20mM MgCl2, 5% DMSO, 7μM 알킨 올리고1 및 약 4μM 정제된 cDNA으로 구성되었다. 필요한 경우, dH2O를 사용하여 용적을 최종 12.5μL로 조정했다.
배양 후, 샘플을 단시간 스핀다운하고, 상청액을 새로운 바이알로 옮겨 반응을 중지시켰다. 조 클릭 반응물은 추가 정제 없이 PCR 증폭을 위해 1:1000, 1:5000 및 1:10000(최대 4nM, 0.8nM 및 0.4nM)으로 희석시켰다.
200μL 반응 바이알에서, 총 20μL의 용적으로 PCR 증폭액을 제조했다. 클릭 반응 희석액을 200μM dNTP, 10pmol의 프라이머2 및 프라이머3 및 1U 폴리머라제와 조합했다. 다양한 폴리머라제에 대해, 제조업체의 권장 사항에 따라, Pfu, 퓨전(Phusion), Q5, 원 Taq 및 드림 Taq 완충제를 사용했다. 샘플은 열순환기(BioRad)에서 열 순환 프로그램에 적용했다.
표준 사이클링 조건으로서, 하기 조건이 사용되었다:
Figure 112021131978400-pct00009
Pfu 폴리머라제의 경우, 상이한 주형 희석액과 대체 순환 조건이 연구되었다:
Figure 112021131978400-pct00010
배양 후, 샘플을 단시간 스핀다운하고, 분취량을 TAE 완충제(20mM TRIS, 10mM 아세트산, 0.5mM EDTA)에서 제조된 3% 아가로스 겔(10×15cm)에서 분석했다.
샘플은 20% 보라색 로딩 염료(NEB)로 제조했고, 이에 따라 저분자량 DNA 래더(25-766bp, NEB, N3233)를 그에 따라 제조했고; 일반적으로, 0.5μL 마커가 5μL 로딩 용적에 사용되었다. 겔은 일정한 전력(10W, 최대 500V, 최대 100mA)을 60분 동안 적용하는 TAE 완충제에서 실행되었다. 이어서, 겔을 새로 제조된 1:10000 브롬화에티듐 희석액에서 15분 동안 배양한 다음, dH2O에서 15분 동안 탈색했다. 시각화를 위해, Gel Doc EZ 이미저(Bio Rad)가 사용되었다.
올리고뉴클레오티드:
Figure 112021131978400-pct00011
역전사 후에 생성된 cDNA: (서열번호 20)
Figure 112021131978400-pct00012
생성된 클릭 생성물: (서열번호 21)
Figure 112021131978400-pct00013
AT = 백본 모방을 통해 결합된 A 및 T
생성된 PCR 생성물: (서열번호 22)
Figure 112021131978400-pct00014
변형:
Figure 112021131978400-pct00015
실시예 5(도 11과 관련)
25μL의 최종 용적에, 샘플은 1μM 올리고2(Oligo2), 1mM 3'-아지도-2',3'-디데옥시구아노신-5'-트리포스페이트 또는 3'-아지도-2',3'-디데옥시우리딘 및 TdT-효소(2U/μl)를, TdT 반응을 위한 1× 말단 뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 완충제(25mM 트리스-HCl(pH 7.2), 200mM 칼륨 카코딜레이트, 0.01%(v/v) 트리톤 X-100, 1mM CoCl2)에 함유했다. 반응물을 37℃에서 밤새(12 내지 15시간) 배양하고, 70℃로 10분 동안 가열하여 중지했다. QIAquick 뉴클레오티드 제거 키트를 사용하여 혼합물을 정제하고, 30μL 물에서 용출시켰다.
200μL 반응 바이알에서, 2개의 반응기 펠릿(600-800μm, 구리 원소 함유)을 12.5μL 반응 혼합물과 조합하고, 45℃에서 60분 동안 배양했다. 클릭 반응 혼합물은 800μM THPTA, 40mM MgCl2, H2O 중 5%(v/v) DMSO, 1μM의 알킨-올리고3 및 TdT 반응으로부터 약 0.3μM 정제된 아지드 올리고뉴클레오티드로 구성되었다. 참조로서, 800μM THPTA, 40mM MgCl2, H2O 중 5%(v/v) DMSO, 1μM의 알킨-올리고3 및 약 1μM의 아지드-올리고2로 구성된 반응 혼합물을 혼합했다.
배양 후, 샘플을 단시간 스핀다운하고, 상청액을 새로운 바이알로 옮겨 반응을 중지시켰다. 샘플은 20% 폴리아크릴아미드 겔에서 분석했다. 참조로서, 저분자량 DNA 래더(25-766bp, NEB, N3233)를 사용했다.
올리고뉴클레오티드의 변성 PAGE를 위해, 샘플을 우레아(50v/v)와 혼합하고, 20% 변성 폴리아크릴아미드 겔(7.5mL Rotiphorese® 서열분석 겔 농축액, 750μL Rotiphorese® 서열분석 완충제 농축액, 2.09mL 재증류수, 3mL의 6M 우레아 용액, 1.5mL 10× 트리스-보레이트-EDTA(TBE) 완충제(1M 트리스, 1M H3BO3, 25mM EDTA), 150μL 과황산암모늄(10%(w/v), 10μL 테트라메틸 에틸렌 디아민(W×D×H = 7.5×0.1×8.3cm)에 로딩했다. 겔 전기영동은 150V에서 2시간 동안 0.5×TBE 완충제에서 수행되었다. 겔은 브롬화에티듐 용액으로 염색하고, 물로 세척했다. 이어서, BioRad의 겔 Doc™ EZ 시스템을 사용하여 밴드를 시각화하고, 이미지 LabTM 소프트웨어를 사용하여 분석했다.
올리고뉴클레오티드:
Figure 112021131978400-pct00016
변형:
Figure 112021131978400-pct00017
SEQUENCE LISTING <110> baseclick GmbH <120> Method of amplifying mRNAs and for preparing full length mRNA libraries <130> IPA211675-DE <140> TBD <141> 2020-12-21 <150> EP19219326.6 <151> 2019-12-23 <150> EP20158810.0 <151> 2020-02-21 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 42 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Poly(dT) Primer <220> <221> misc_feature <222> (41)..(41) <223> v is a, c or g <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n is a, c, g, or t <400> 1 gtgactggag ttcagacgtg tttttttttt tttttttttt vn 42 <210> 2 <211> 59 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Alkyne Adapter <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1) <223> modified with 5'-Hexynyl linker <400> 2 tagatcggaa gagcgtcgtg tagggaaaga gtgtagatct cggtggtcgc cgtatcatt 59 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Adapter Primer1 <400> 3 cgacgctctt ccgatctac 19 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Poly(dT) Primer Reverse <400> 4 gtgactggag ttcagacgtg t 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> GAPDH Intern Reverse Primer <400> 5 ggagggatct cgctcctg 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> GAPDH Intern Forward Primer <400> 6 atggggaagg tgaaggtcgg 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> eGFP Intern Reverse Primer <400> 7 gccgtaggtc agggtggtc 19 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> eGFP Intern Forward Primer <400> 8 gcgaactagt aagcaaggag g 21 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Cas9 Intern Reverse Primer <400> 9 ccaccaggaa gctctcctcc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Cas9 Intern Forward Primer <400> 10 atggccccca agaagaagcg 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> ?Gal Intern Reverse Primer <400> 11 gcactccagc cagctctc 18 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> ?Gal Intern Forward Primer <400> 12 atgagcttca ccctgaccaa ca 22 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> FLUC Intern Reverse Primer <400> 13 gttgtagatg tcgttggcgg g 21 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> FLUC Intern Forward Primer <400> 14 atggaggacg ccaagaacat ca 22 <210> 15 <211> 58 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Alkyne Oligo1 <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1) <223> modified with 5'-alkyne dT <400> 15 aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatct 58 <210> 16 <211> 58 <212> RNA <213> artificial sequence <220> <223> Model RNA <400> 16 uucgacaaac gaaaacacaa acacaaacca aacagaaaac aguacaugua aucgacca 58 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Primer1 <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1) <223> modified with FAM <400> 17 tggtcgatta catgtac 17 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Primer2 <400> 18 tggtcgatta catgtactgt ttt 23 <210> 19 <211> 17 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Primer3 <400> 19 agatcggaag agcgtcg 17 <210> 20 <211> 57 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Resulting cDNA after reverse transcription <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1) <223> modified with FAM <220> <221> misc_binding <222> (57)..(57) <223> modified with N3 <400> 20 tggtcgatta catgtactgt tttctgtttg gtttgtgttt gtgttttcgt ttgtcga 57 <210> 21 <211> 116 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Resulting click product <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1) <223> modified with FAM <400> 21 tggtcgatta catgtactgt tttctgtttg gtttgtgttt gtgttttcgt ttgtcgataa 60 tgatacggcg accaccgaga tctacactct ttccctacac gacgctcttc cgatct 116 <210> 22 <211> 116 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Resulting PCR product <400> 22 tggtcgatta catgtactgt tttctgtttg gtttgtgttt gtgttttcgt ttgtcgataa 60 tgatacggcg accaccgaga tctacactct ttccctacac gacgctcttc cgatct 116 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Oligo2 <400> 23 ttggtatcgc tatcgctatg g 21 <210> 24 <211> 32 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Alkyne-Oligo3 <220> <221> misc_binding <222> (1)..(1) <223> modified with 5'-Hexynyl linker <400> 24 aaaaaaacca tgaacaaaat gtgactcata tc 32 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Azide-Oligo2 <220> <221> misc_binding <222> (21)..(21) <223> modified with 3'-Azide, 5-methylcytosine <400> 25 ttggtatcgc tatcgctatg g 21

Claims (17)

  1. 샘플에 함유된 적어도 하나의 RNA, 또는 mRNA를 증폭 및/또는 서열분석하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 적어도 하나의 제1 프라이머를 제공하는 단계로서, 제1 프라이머는 증폭될 적어도 하나의 RNA의 3'-말단에 또는 그 근처에 위치하는 서열에 상보적인 서열을 포함하는 단계, 및 적어도 하나의 RNA에 대한 적어도 하나의 제1 프라이머의 혼성화를 가능하게 하는 조건 하에서 상기 적어도 하나의 제1 프라이머를 샘플에 첨가하는 단계,
    b) 역전사효소 및 뉴클레오티드를 샘플에 첨가하여 적어도 하나의 RNA의 전장 cDNA(들)를 제공함을 포함하는 조건 하에서 적어도 하나의 RNA를 역전사하는 단계,
    c) 적어도 과량의 뉴클레오티드로부터 샘플을 정제하는 단계,
    d) 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제1 파트너를 포함하도록 3'-위치에서 변형되어 있는 디데옥시 뉴클레오티드, 및 단계 b)에서 수득된 cDNA(들)의 3'-말단에서 단일 3'-아지드- 또는 3'-알킨 변형된 디데옥시 뉴클레오티드를 부착하기 위한 주형-비의존적 폴리머라제를 첨가하는 단계,
    e) 적어도 단계 d)에서 첨가된 과량의 변형된 디데옥시 뉴클레오티드로부터 샘플을 정제하는 단계,
    f) 클릭 반응(click reaction)을 수행하여 어댑터 분자를 트리아졸 결합의 형성하에 단계 d)에서 수득된 3'-변형된 cDNA(들)에 결찰시키기(ligate) 위한 조건 하에서, 폴리뉴클레오티드 서열, 및 그의 5' 말단에 부착된 상기 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제2 파트너를 포함하는 어댑터 분자를 첨가하는 단계,
    g) 어댑터 분자의 5'-말단에서 적어도 6개의 뉴클레오티드에 상보적이고 cDNA(들)의 3'-말단에서 디데옥시 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 그의 3'-말단에 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머를 첨가하여, 트리아졸 결합과 중첩하는 위치에서 단계 f)에서 수득된 결찰된 어댑터-cDNA 분자에 대한 제2 프라이머의 혼성화 및 결합을 수행하는 단계,
    및 대안적으로
    h) DNA 폴리머라제를 첨가하여 제2 프라이머의 쇄 연장을 달성하고, 단계 b)에서 수득된 전체 cDNA(들)에 상보적인 서열을 포함하는 제2 가닥 DNA(들)를 생성하는 단계, 및
    i) 단계 h)의 제2 가닥 DNA(들)를 서열분석하는 단계, 또는
    j) 제1 프라이머의 적어도 일부와 동일한 제3 프라이머를 첨가하고, 전장 cDNA(들)을 증폭하여 전장 RNA 라이브러리를 수득하는 단계,
    또는
    h') DNA 폴리머라제를 첨가하여 제2 프라이머의 쇄 연장을 달성하고, 제2 가닥 DNA(들) 및 전체 cDNA(들)의 서열을 동시에 결정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 샘플에 함유된 적어도 하나의 RNA, 또는 mRNA를 증폭 및/또는 서열분석하는 방법으로서, 상기 방법은
    a) 적어도 하나의 제1 프라이머를 제공하는 단계로서, 제1 프라이머는 증폭될 적어도 하나의 mRNA의 3'-말단에 또는 그 근처에 위치하는 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 이 프라이머는 이의 5' 말단에서 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제1 파트너에 의한 변형을 함유하는 단계, 및 적어도 하나의 mRNA에 대한 적어도 하나의 제1 프라이머의 혼성화를 가능하게 하는 조건 하에서 상기 적어도 하나의 제1 프라이머를 샘플에 첨가하는 단계,
    b) 역전사효소 및 뉴클레오티드를 샘플에 첨가하여 적어도 하나의 mRNA의 전장 cDNA(들)를 제공함을 포함하는 조건 하에서 상기 적어도 하나의 mRNA를 역전사하는 단계,
    c) 적어도 과량의 뉴클레오티드로부터 샘플을 정제하는 단계,
    d) 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제2 파트너를 포함하도록 3'-위치에서 변형되어 있는 디데옥시 뉴클레오티드, 및 단계 b)에서 수득된 cDNA(들)의 3'-말단에서 단일 3'-아지드- 또는 3'-알킨 변형된 디데옥시 뉴클레오티드를 부착하기 위한 주형-비의존적 폴리머라제를 첨가하는 단계,
    e) 적어도 단계 d)에서 첨가된 과량의 변형된 디데옥시 뉴클레오티드로부터 샘플을 정제하는 단계,
    f) 클릭 결찰(click ligation) 반응을 수행하여 트리아졸 결합의 형성하에 원형 단일 가닥 cDNA(들)를 생성하는 단계,
    g) 제1 프라이머의 5'-말단에서 적어도 6개의 뉴클레오티드에 상보적이고 cDNA(들)의 3'-말단에서 디데옥시 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 이의 3'-말단에 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머를 첨가하여 트리아졸 결합과 중첩하는 위치에서 단계 f)에서 수득된 결찰된 원형 제1 프라이머-cDNA 분자(들)에 대한 제2 프라이머의 혼성화 및 결합을 수행하는 단계, 및
    h) DNA 폴리머라제를 첨가하여 제2 프라이머의 쇄 연장을 달성하고 후속적으로 전장 cDNA(들)를 증폭하는 단계, 또는
    h') DNA 폴리머라제를 첨가하여 제2 프라이머의 쇄 연장을 달성하고 동시에 전체 cDNA(들)을 포함하는 원형 단일 가닥 DNA(들)의 서열을 결정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 a)에서 적어도 하나의 제1 프라이머로서, 앵커 서열로서 2 내지 50개 뉴클레오티드의 5'-연장을 포함하는 폴리(dT) 프라이머가 제공되고, 샘플에 존재하는 적어도 하나의 mRNA의 폴리(A) 테일(들)에 대한 혼성화를 가능하게 하는 조건 하에서 샘플에 첨가되는 방법.
  4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 단계 d)에서 3'-알킨- 또는 3'-아지드-변형된 ddGTP 또는 3'-알킨- 또는 3'-아지드-변형된 ddCTP, 또는 3'-아지드-변형된 ddGTP, 또는 3'-아지도-2',3'-디데옥시 GTP(AzddGTP)가 디데옥시 뉴클레오티드로서 사용되는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 g)에서 3'-말단에 dC 또는 dG, 또는 dC를 함유하는 제2 프라이머가 첨가되는 방법.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 g)에서 뉴클레오티드 서열의 3'-말단의 제2 위치에 dC 또는 dG, 또는 dC를 함유하는 제2 프라이머가 첨가되는 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 d)에서 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TdT)는 주형-비의존적 폴리머라제로서 사용되는 방법.
  8. 제1항 또는 제3항에 있어서, 단계 f)에서 알킨은 어댑터 분자의 5'-말단에 부착되는 방법.
  9. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 f)에서 클릭 반응은 구리 촉매된 아지드-알킨 부가 환화(copper catalyzed azide-alkyne cycloaddition, CuAAC) 또는 스트레인-촉진된 구리-비함유 클릭 결찰(strain-promoted copper-free click ligation, SPAAC)을 포함하는 방법.
  10. 복수의 mRNA 분자를 함유하는 샘플로부터 전장 mRNA 라이브러리를 제조하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법의 사용 방법.
  11. 제10항에 있어서, 복수의 mRNA 분자를 함유하는 샘플은 하나 이상의 유형의 세포의 전체 mRNA 또는 유기체의 전체 엑솜을 포함하는 사용 방법.
  12. 샘플에 함유된 복수의 mRNA, 하나 이상의 유형의 세포의 총 mRNA 또는 개체의 전체 엑솜을 서열분석하는 방법으로서, 상기 방법은
    이러한 복수의 mRNA, 이러한 총 세포 mRNA 또는 개체의 엑솜을 함유하는 샘플을 제공하는 단계, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하여 전장 mRNA의 라이브러리를 제조하는 단계, 및 증폭된 mRNA 또는 수득된 mRNA 라이브러리의 서열을 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 롱-리드(long-read) 서열분석 기술이 적용되는 방법.
  14. 제12항에 있어서, 복잡한 장애에서의 변이체 맵핑(mapping), 유전적 이상(genetic aberrations)의 조사를 위한 방법.
  15. 샘플에 함유된 적어도 하나의 RNA, 또는 mRNA를 증폭하기 위한 키트로서, 상기 키트는
    a) 증폭될 적어도 하나의 mRNA의 3'-말단에 또는 그 근처에 위치한 서열에 상보적인 서열을 포함하는 제1 프라이머,
    b) 역전사효소,
    c) 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제1 파트너를 포함하도록 3' 위치에서 변형되어 있는 디데옥시 뉴클레오티드,
    d) 주형-비의존적 폴리머라제,
    e) 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제2 파트너가 그의 5'-말단에 부착된 어댑터 분자,
    f) 어댑터 분자의 5'-부분에서 적어도 6개의 뉴클레오티드에 상보적이고 c)의 디데옥시 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 그의 3'-말단에 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머, 및
    g) 제1 프라이머의 적어도 일부와 동일한 제3 프라이머
    를 포함하는 키트.
  16. 샘플에 함유된 적어도 하나의 RNA, 또는 mRNA를 증폭 및/또는 서열분석하기 위한 키트로서, 상기 키트는
    a) 증폭될 적어도 하나의 mRNA의 3'-말단에 또는 그 근처에 위치한 서열에 상보적인 서열을 포함하고 그의 5' 말단에 아지드 및 알킬 분자 쌍의 제1 파트너에 의한 변형을 함유하는 제1 프라이머,
    b) 역전사효소,
    c) 아지드 및 알킨 분자 쌍의 제2 파트너를 포함하도록 3' 위치에서 변형되어 있는 디데옥시 뉴클레오티드,
    d) 주형-비의존적 폴리머라제, 및
    e) 제1 프라이머의 5'-부분에서 적어도 6개의 뉴클레오티드에 상보적이고 c)의 디데옥시 뉴클레오티드에 상보적인 뉴클레오티드를 그의 3'-말단에 함유하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머
    를 포함하는 키트,
  17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 다음 중 적어도 하나를 추가로 포함하는 키트:
    h) RNase,
    i) 네 종류의 모든 자연 발생적인 뉴클레오티드,
    j) 클릭 반응을 수행하기 위한 시약,
    k) 완충제 및 용매,
    l) cDNA 증폭을 수행하기 위한 시약,
    m) 정제용 시약.
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Routh Andrew 등, Journal of Molecular Biology, Academic Press, 427(16), 페이지 2610-2616, 2015.

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