JP2003505036A

JP2003505036A - 核酸決定のための多重鎖置換

Info

Publication number: JP2003505036A
Application number: JP2001511216A
Authority: JP
Inventors: シャラトシング，; アニタイナンダー，; エドウィンエフ．ウルマン，; リチンカオ，; デイビッドアルバグリ，
Original assignee: アクララバイオサイエンシーズ，インコーポレイテッド
Priority date: 1999-07-16
Filing date: 2000-06-30
Publication date: 2003-02-12
Also published as: WO2001006008A2; CA2379749A1; EP1200624A2; WO2001006008A3

Abstract

(57)【要約】多量の事象の多重決定が、異なるオリゴヌクレオチドの組合わせを使用して、正確かつ単純な様式で達成され、このオリゴヌクレオチドは、捕捉および支持体からの放出、ならびにオリゴヌクレオチドの群の連続した放出のための鎖置換オリゴヌクレオチドの両方に役立つ。また含まれるのは、オリゴヌクレオチド試薬の一部が識別子であり得るので、特定の特徴を同定するために役立つ。この方法は、捕捉／放出配列に連結されたか、または捕捉／放出配列として役立つ鎖伸長の開始のためのプライマーを使用して例示され、ここで伸長されたプライマーは識別子を有する。プライマーの伸長後、伸長されたプライマーは捕捉され、そして独立して放出され、そして放出された伸長されたプライマーがアッセイされる。本方法は、核酸配列決定、１ヌクレオチド多型決定、核酸フラグメントの同定などについての適用を見出す。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（序論）（背景）種の核酸配列の知識は、多くの種々の目的のためにますます必要である。最も
簡単なゲノムにおいてさえ、多くの塩基によって目的の、異なる種に対してゲノ
ムの配列決定をすることは圧倒する仕事となる。特定の種についてのコンセンサ
ス配列における目的だけでなく、単一の種の個体間の違いを決定する目的もある
。核酸を配列決定することに対する多くの意欲があり、これらの配列決定は、新
規の配列決定、または比較的、確証的または法医学的な適用などのための再配列
決定を含む。核酸配列が決定され得る割合を改善させるために、分析にはキャピ
ラリー電気泳動を用いる自動化機械が発明されている。それは、主にポリメラー
ゼ連鎖反応の使用に基づきゲノムＤＮＡフラグメントを増幅し、プライマー伸長
および終結決定が続く。プライマー伸長に単一のプライマーを使用することはゆ
っくりであり、かつスループットおよび試薬使用の点で非効率的である。好まし
くは、複数の異なるプライマー（例えば、ＤＮＡの長い鎖またはＤＮＡの異なる
鎖に沿って広がった多重プライマー）を所望する。この結果、同時に数キロベー
スを配列決定し得る。配列を決定し得るためには、各領域からの広範囲のフラグ
メントを分離する方法なしではこの型の多重化は問題である。

【０００２】配列決定に加えて、多重化する手法が大きな利点となる多くの型の遺伝的分析
方法がある。例えば、異なる形質を特徴づけるか、または同定するために、単一
ヌクレオチド多型性(「ＳＮＰ」）の群を用いる可能性は主要な目的の領域とな
る。この目的の領域は、現在ＳＮＰを登録する段階にある。一度十分な数のＳＮ
Ｐが統計的に十分な集団について同定されると、ＳＮＰのプロフィールを形質に
関連づける主要な努力が始まる。各例において、例えば、単一塩基プライマー伸
長または連結反応によって、多くのヌクレオチド決定が行われ、個別に行われる
場合、非常に非効率かつ高価である。試薬の同じプールの中で多くの反応が同時
に起こるため、多重化はスループットおよびコストのより高い効率をもたらす。
しかし、多重化を使用する試みは、多くの関連したＤＮＡ、ＲＮＡまたはヌクレ
オチド分子、固有に起こる誤差およびそれらの増幅の可能性、ならびに実質的に
純粋な分画を得るための配列分離の障害によって混同される。また、可能な範囲
で試薬の回収および再利用を行うのが望ましい。

【０００３】配列特異的ＤＮＡ精製方法またはプライマー特異的ＤＮＡ精製方法に関する多
くの方法が記述された。これには、３重親和性捕捉や、ペプチド核酸媒介性捕捉
、配列親和性、またはビオチン捕捉に基づいた方法が含まれるが、これらは多重
成分の独立放出で多重化したサンプルを精製する手法を述べていない。

【０００４】よって、多重化したプロトコルを用いる遺伝的分析を行うための改良されたプ
ロセスを開発する重要な目的が存在する。それによって、正確さや、時間、装置
および試薬の使用における効率性、および再現性が得られる。

【０００５】（先行技術の簡単な記述）米国特許第５，６４８，２１３号は鎖置換の利用を公開する。米国特許第５，
５１４，５４３号および同第５，５８０，７３２号は一度のアッセイにおける複
数のプローブを用いるＤＮＡ配列検出を記述する。ＷＯ９８／Ｕ０００２０７は
、可逆的な連結で支持体に付着された生体高分子を記載する。ＷＯ９８／ＵＳ１
４６１０は多重ポリヌクレオチド捕捉方法および組成物を記述する。ＥＰ０４１
６８１７はポリヌクレオチドテールを含むプライマーを記述する。

【０００６】（発明の要旨）複数の標的部分の少なくとも１つの特徴の多重化した決定のための方法と組成
物を提供する。単一工程において、複数の部分をプロセスし、標的部分の目的の
特徴を提供するために規定されるべきアッセイ要素の集合を提供する。この方法
を、配列決定および遺伝子型分類などのための標的部分として核酸と共に例示す
る。複数の異なるプライマーを使用し、プライマーを改変し、（改変された）プ
ライマーを分離し、選択鎖置換を使用して（改変された）プライマーを独立に放
出し、そして放出された（改変された）プライマーをアッセイすることによって
、多重化した決定を、標的部分の少なくとも１つの特徴を同定するために行う。
利用された組成物は分離する支持体を構成する。それは、鎖置換プローブと組み
合わされてプライマープローブを捕捉し、次に選択的に放出するための複数の捕
捉プローブを有する。また、標識あるいは識別子が存在し得、これらによって、
異なるプライマーの分化がさらに起こる。

【０００７】（特定の実施形態の説明）標的部分の多重化した決定についての方法と組成物を開示する。この方法およ
び組成物では、プライマーとして、相補的な核酸配列（例えば、プライマー）を
捕捉するための捕捉プローブとして、ならびに捕捉プローブからプライマーを選
択的に放出するための鎖置換物として、核酸配列を利用する。その方法を実行す
る際は、ハイブリダイゲーション条件下において、標的核酸配列に特有のプライ
マー混合物を一本鎖の標的部分に組み合わせる。そこでは、プライマー／標的の
二本鎖が形成される。それから、核酸標的部分の目的の特徴に依存して、プライ
マーを種々の方法で改変する。改変されたプライマーを標的部分から放出し、改
変されたプライマーを分離するために相同な核酸配列（捕捉プローブ）によって
捕捉する。改変されたプライマーを必要に応じて洗浄し、非結合の成分を除去し
、それから連続的に鎖置換プローブを加えることによって、支持体から独立に放
出する。各々は捕捉プローブの１つに特異的で、捕捉プローブに対してプライマ
ーが持つより強い結合親和性を有する。鎖置換プローブがそれらの共通の結合領
域からプライマーを置換するので、プライマーを捕捉プローブから放出する。そ
れから、放出され伸長したプライマーの各群を目的についてアッセイし得る。

【０００８】本方法は、複合混合物における標的種の同定を包含する。そこでは、多くの異
なる標的種が目的である。本方法によって、核酸配列決定、単一ヌクレオチド多
型性（「ＳＮＰ」）決定、フラグメント同定、細胞株、表現型などに関する遺伝
子型分類、および対立形質プロフィールのために特定の応用を見い出す。通常、
これらの決定は、細胞ゲノム、細胞からのｃＤＮＡ転写、ＤＮＡおよびＲＮＡの
複合混合物などのような大量の核酸存在下で行われる。一般的に、ＤＮＡまたは
ＲＮＡの量は少なくとも約２ｋｂであり、より一般的には、少なくとも約５ｋｂ
で、全長ゲノム補体であり得る。この量のＤＮＡまたはＲＮＡでは、分画のみが
目的で、ヒトゲノムのＳＮＰ分類の場合における１０億塩基当たり約１００個か
ら、プラスミド挿入物を配列決定する場合における約５０％までの範囲である。

【０００９】必要な試薬はプライマーオリゴヌクレオチド、支持体に結合するあるいは結合
し得る捕捉プローブオリゴヌクレオチド、および鎖置換オリゴヌクレオチドであ
る。通常、これらのヌクレオチドの各々は組成および機能が異なる。

【００１０】オリゴヌクレオチドに関して、天然に存在するヌクレオチドのみでなく、本発
明の目的と機能的に同等なヌクレオチドも含むことが意図される。ヌクレオチド
はバックボーン、同等の部分（例えば、、ホスホラミダイド、アミノ酸、ホスホ
トリエステル、メチルホスホネート、チオホスホネート、チオホスホラミド、ア
ラビノシドなど）で置換されているリン酸および糖、によって変化し得る。所望
の相補的配列に結合親和性を与える塩基と糖は、天然のものおよび天然にないも
のの両方ともが利用されてもよい。

【００１１】例えば、５−（１−プロピニル）ウラシルおよび５（−1−プロピニル）シト
シンのように、多くの天然にない塩基が、置換した天然の塩基より高い結合親和
性を有することがわかる。これは、米国特許第５，８３０，６５３号で記述され
る。また、いくつかの天然にないヌクレオチド構造は、天然の核酸配列、特に、
リン酸エステルバックボーンがポリアミドバックボーンで置換されるペプチド核
酸（ＰＮＡ）に対して、天然のヌクレオチド構造より高い結合親和性を有するこ
とが示されている（Ｎｅｉｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．，Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．，Ｂｅｒｇ
，Ｒ．Ｈ．およびＢｕｃｈａｒｄｔ，Ｏ．「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｅｌｅｃｔｉ
ｖｅｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｏｆＤＮＡｂｙｓｔｒａｎｄｄｉｓｐ
ｌａｃｅｍｅｎｔｗｉｔｈａｔｈｙｍｉｎｅ−ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ
ｐｏｌｙａｍｉｄｅ」Ｓｃｉｅｎｃｅ２５４（１９９１）１４９７−１５００
；ＮｅｉｌｓｅｎＰ．Ｅ．ら，米国特許５，５３９，０８２号；Ｂｕｃｈａｒ
ｄｔ，Ｏ．，Ｅｇｈｏｌｍ，Ｍ．，Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．およびＢｅｒｇ，
Ｒ．Ｈ．「ＰｅｐｔｉｄｅＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ」ＰＣＴＷＯ９２／
２０７０２（１９９２）；Ｔｈｏｍｓｏｎ，Ｓ．，Ｎｏｂｌｅ，Ｓ．およびＲｉ
ｃｃａ，Ｄ．「Ｐｅｐｔｉｄｅｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓａｎｄｔｈｅ
ｅｆｆｅｃｔｏｎｇｅｎｅｔｉｃｍａｔｅｒｉａｌ」ＰＣＴ出願ＷＯ９
３／１２１２９（１９９３））。特に、それは鎖置換プローブの活性を向上させ
るのに有利であり得る。そこでは、プローブはプローブの結合親和性を増強する
天然にない成分を含む。また、そのことは、任意のプローブの対において、任意
の天然の塩基によりも互いに優先的に結合する部分で互いに結合する対をなす置
換代替塩基とって有利であり得る。例えば、ｉｓｏ−ｄＣｔｐｏｓｐ−ｄＧは互
いに結合するが、アデノシン、チミジン、シチジン、グアノシン、またはウリジ
ンと効果的に塩基対を形成しない。このことは、米国特許第５，６８１，７０２
号に記載される。

【００１２】プライマーオリゴヌクレオチドは、好ましくは２つの核酸配列部分を有し、そ
して２つの核酸配列部分の間に複製不可能な部分、または２つの核酸配列部分に
わたりポリメラーゼ活性を妨げる接合部を必要に応じて持つ。この一般型のプラ
イマーはＥＰ４１６８１７およびＷＯ９４／２１８２０に早くから記載されてい
て、本明細書中ではそれを参考として援用する。第一配列部分は少なくとも約８
つのヌクレオチド、より一般的には少なくとも約１２ヌクレオチドから成る標的
結合配列であり、３０以上のヌクレオチドを有し得る。相補的ヌクレオチドの数
が多いほど、標的に対する特異性はより強くなる。標的組成物の複雑性が高いほ
ど、より長いヌクレオチドを有するのにより望ましい。プライマーヌクレオチド
は、捕捉ヌクレオチドにハイブリダイズするために設計された第２配列部分を必
要に応じて有し、それは少なくとも５ヌクレオチド、普通は少なくとも６ヌクレ
オチドを有し、そして３０ヌクレオチド以上まで有し得、より一般的には約２０
ヌクレオチドより多く有しない。考慮すべきことは、望ましい特異性レベル、オ
リゴヌクレオチドを調製する費用およびサンプル組成の複雑性レベルなどである
。一般的には、オリゴヌクレオチド部分は、一緒に少なくとも１３ヌクレオチド
、より一般的には少なくとも１８ヌクレオチドであり、そして約５０ヌクレオチ
ド以上ではない。

【００１３】プライマーオリゴヌクレオチドの２つの配列部分に連結する選択的な複製不可
能な部分は鎖において少なくとも２つの原子から成り立ち、鎖において約１２０
原子以上から成らない。好ましくは鎖で約６０原子以上から成らず、より好まし
くは鎖で約３０原子以から成らない。プロピル、ドデシル、オクタデシルなどの
ようなメチレン鎖を使用し得る。溶解性を考慮すべき場合は、鎖には１つ以上の
ヘテロ原子も含まれ得、一般的には、窒素、酸素、硫黄およびリンから選択され
る。しかし、他の原子も存在し得る。好都合なことに、結合基はアミノ酸または
ポリペプチド、ポリオキシエチレンのようなポリエーテル、複製不可能なヌクレ
オチド、ポリエステルなどであり得る。ジエチレングリコール、トリエチレング
リコール、テトラエチレングリコール、ペンタエチレングリコール、ヘキサエチ
レングリコールなどのようなポリオキシエチレンは、そのコンホメーションの可
撓性と親水性に特に有利である。一般的に、自動化合成機と共用できる標準的な
カップリング化学を用いて、連結基をホスホジエステル群などを通してオリゴヌ
クレオチド配列にカップリングする。

【００１４】プライマーオリゴヌクレオチドをポリメラーゼ連鎖反応に用いる場合、ポリメ
ラーゼがオリゴヌクレオチドの捕捉配列部分に伸長し、その部分を２本鎖にする
のを避ける方法が望まれる。２つの配列部分間に組み入れられた非ヌクレオチド
連結基は、その能力のためＰＣＲを停止する際に作用するのに望ましい。ポリメ
ラーゼ酵素は、非ヌクレオチドなので、連結を超えて伸長しない。あるいは、連
結基を組み入れずにＰＣＲを停止させる手法は、２つの連続した配列に２つの配
列の逆５’−３’配向を調製することである。他の適用例では、連結基は異なる
ハイブリダイズ成分に立体的放出を提供するのに望ましくあり得る。

【００１５】第一配列部分は実質的に相同であり、通常、標的配列に完全に相補的である。
通常、２０％未満の相同差があり、より一般的には、オリゴヌクレオチド配列と
標的配列との間には約１５％未満の相同差がある。このことは、Ｓｈｐａｅｒら
，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１９９６，３８：１７９−９１；ＳｔａｔｅｓおよびＡｇ
ａｒｗａｌ，Ｉｓｍｂ１９９６；４：２１１−７；Ｍｏｔｔら，Ｃｏｍｐｕｔ
ＡｐｐｌＢｉｏｓｃｉ１９８９，５：１２３−３１；ならびにＰｅａｒｓ
ｏｎおよびＬｉｐｍａｎ，ＰＮＡＳＵＳＡ１９８８，８５：２４４４−８に
記述されているような方法（特にＬＦＡＳＴＡ方法）によって決定される。ほと
んどの部分に対して、プライマーオリゴヌクレオチドの第一配列部分と標的配列
との間に、５より少ない、より一般的には３より少ない、好ましくは約１より多
くないヌクレオチド置換、挿入または欠失、あるいはそれらの組合せが存在する
。

【００１６】いくつかの配列決定適用で起こり得るように、第一配列部分が複数のプライマ
ーオリゴヌクレオチド内で特有な場合、第２配列部分は、望ましいが、必須では
ない。よって、特有のプライマー位置を使用して配列する場合、プライマーオリ
ゴヌクレオチドは標的配列に相同な配列を含むことのみが必要で、ここでは同じ
配列が捕捉オリゴヌクレオチドにハイブリダイズするのを助ける。

【００１７】直前に記載したように、プライマーオリゴヌクレオチドの第一配列部分、ある
いは第２部分は、捕捉オリゴヌクレオチドに、一般的に相補的である。通常は、
捕捉工程で高い親和性および特異性を持つことが望ましい。一般的には、お互い
に結合するプライマーオリゴヌクレオチドと捕捉オリゴヌクレオチドの一部は相
補的であり、そして配列を選択し、捕捉工程で存在し得る他の配列に関連して特
有の結合を提供する。

【００１８】しかし、一般的には約５ｋｂを超えず、通常は約２ｋｂを超えない単一捕捉核
酸を所望するにもかかわらず、依然として差次的な放出が得られ得る状況があり
得る。このような状況では、単一捕捉核酸といくつかのプライマーオリゴヌクレ
オチドを合成し得、その各々は捕捉核酸の異なる領域に結合するための第２の部
分を有する。捕捉核酸に各プライマーオリゴヌクレオチドの第２の部分に相補的
な捕捉配列を適切に配置することによって、プライマーオリゴヌクレオチドのセ
ットを利用し得る。このセットは、同じ捕捉核酸であるが、異なる領域に結合し
得、その結果、独立した放出の所望のレベルが鎖置換によって可能となる。経済
性、特殊性、サンプルの大きさ、および複雑性のような種々の考慮に依存して、
１０より多いプライマーオリゴヌクレオチドについて単一捕捉核酸を所望するが
、一般的には、単一の捕捉核酸によって捕捉された約１０未満の異なるプライマ
ーを、しばしば、５未満のプライマーを所望する。

【００１９】捕捉オリゴヌクレオチドは捕捉配列から構成され、プライマーオリゴヌクレオ
チドの第２の部分に結合し、そして置換開始配列を有し得る。一般的には、捕捉
オリゴヌクレオチドは、少なくとも約８のヌクレオチドであり、そして約６０を
超えないヌクレオチドであり、通常は、約３６を超えないヌクレオチドである。
捕捉ヌクレオチドの捕捉配列はプライマーヌクレオチドの第２の部分と同じ長さ
であり得るが、いくつかの場合は異なり得、通常は約５を超えない塩基が異なり
得る。

【００２０】捕捉ヌクレオチドは、通常は置換開始配列を含み、この配列はプライマーオリ
ゴヌクレオチドとも標的配列ともハイブリダイズしない。置換開始配列は、鎖置
換オリゴヌクレオチドが結合し、そして捕捉プローブ／プライマー二重鎖への置
換オリゴヌクレオチドの侵入を容易にする領域を提供し、究極的には溶液へのプ
ライマーオリゴの置換を誘導する。

【００２１】置換開始配列が捕捉配列に接し得るか、または、約１−５ヌクレオチド、通常
は１−３ヌクレオチド、捕捉配列から分離され得るか、あるいは非ヌクレオチド
結合部分がこの２つの配列を分離し得る。この連結基は、上述される、プライマ
ーオリゴヌクレオチドに必要に応じて含まれるリンカーと類似した組成を持つ。

【００２２】置換開始配列は、異なる捕捉オリゴヌクレオチド間で共通であり得るか、また
は異なり得る。それは、ホモオリゴ（例えば、ｐｏｌｙ−ｄＴなど）、または様
々なヌクレオチドを有し得る。置換開始の目的のために、捕捉オリゴヌクレオチ
ドのこの部分の多様性は、捕捉配列の多様性より実質的に低くあり得ることを理
解すべきである。開始配列は２ヌクレオチドを同じくらい少なく、より通常には
少なくとも約３ヌクレオチドであり得、そして一般的には２０ヌクレオチドより
少なく、一般的には約１２ヌクレオチドを超えない。置換開始配列は捕捉配列の
５’または３’にあり得、そして固体支持体については捕捉配列の近位または遠
位であり得る。

【００２３】単一の捕捉核酸が所望する場合は、プライマーオリゴヌクレオチドを結合する
ための複数の捕捉配列置換が、置換開始配列と共に散在し得る。各捕捉配列を各
置換開始配列に提供することにより、独立かつ無作為に、各捕捉されたプライマ
ーオリゴヌクレオチドの放出を引き起こす能力を保持する。

【００２４】捕捉オリゴヌクレオチドはまた、イオン性の部分（単数または複数）を形成す
る。この部分を、修飾ヌクレオチドとして、あるいは、内部または末端の塩基か
、糖、もしくはリン酸基に結合体化した非ヌクレオシド成分として、組み込み得
る。特に、ポリ（アミノ酸）（例えば、ポリリジンなど）のようなポリカチオン
部分は有用である。ポリカチオン部分は、ジスルフィド結合形成またはスルフヒ
ドリル−マレイミドカップリング反応を介する適切な修飾によって、オリゴヌク
レオチドに都合良くカップリングされ得る。オリゴヌクレオチド結合体を調製す
る方法は周知である。あるいは、チミジンのアミノ保有誘導体のようなヌクレオ
シド誘導体は、標準的なオリゴヌクレオチド合成方法を用いて都合よく取り込ま
れ得る。イオン性の部分は、本発明を実行する際形成されたハイブリッドの周り
の局所的なイオン強度を増大させるように機能し得、二重鎖結合親和性および結
合した多重鎖のプライマーを選択的に放出する能力に不利な影響を与えずに種々
の緩衝液中で塩の濃度を減少させる。

【００２５】その捕捉オリゴヌクレオチドを支持体に直接的または間接的のいずれか、に結
合する。支持体は容器の壁、ディスク、多孔または固体のビーズ、糸、毛細管表
面、ポリマーならびに樹状の物質を含み得る。実際、実体に結合するものと結合
しないものを物理的に分離させ、そしてまた洗浄し、特異的に結合した混合物を
保持する一方、非特異的に結合した成分を除去することを可能にする任意の成分
を含み得る。都合の良いことに、支持体はビーズまたは容器か、ウェル、あるい
はチャネルの空間的に決められた領域であり得る。

【００２６】通常、連結基を捕捉オリゴヌクレオチドと支持体との間で利用する。これは一
般的には親水性の連結基であり、好都合には、鎖の中で少なくとも２つの原子か
らなり、鎖で約１２０を超えない原子から構成される。好ましくは鎖中で約６０
を超えない原子から構成され、より好ましくは鎖の中で約３０を越えない原子か
ら構成される。プロピル、ドデシル、オクタデシルなどのようなメチレン鎖が使
用され得る。溶解性が考慮される場合は、鎖は１つ以上のへテロ原子（一般的に
それを窒素、酸素、硫黄およびリンから選択するされるが、他の原子も存在し得
る）もまた含む。好都合なことに、連結基はアミノ酸またはポリペプチド、ポリ
オキシエチレンのようなポリエチレン、ポリグリコライドのようなエステルまた
はポリエステルなどであり得る。ジヘキサエチレングリコール、トリヘキサエチ
レングリコール、テトラヘキサエチレングリコール、ヘキサヘキサエチレングリ
コールなどのようなポリオキシエチレンは、これらの立体配置的可撓性や親和性
のために特に役に立つ。

【００２７】固体支持体にオリゴヌクレオチドを結合させるための化学は周知である。捕捉
オリゴヌクレオチドまたは連結基は、適切に官能化した支持体を反応するか、ま
たはそれに結合するのに適した化学反応体または結合対の１つのメンバーと共に
提供され得る。この方法は、当該分野で公知であり、そして、例えば、ビオチン
／ストレプトアビジン結合またはチオール／マレイミド付加体形成を含む。

【００２８】捕捉オリゴヌクレオチドは、代表的にはプライマーオレオヌクレオチドを含む
サンプル溶液に接する前に支持体に結合される。しかし、使用される結合化学の
型に依存して、捕捉オリゴヌクレオチドおよびプライマーオリゴヌクレオチドが
、ハイブリダイゼーション条件下で最初に結合して、二重鎖形成することが好都
合であり得る。これに続いて、二重鎖を支持体に接触させる。ここでは、上記の
ように適切に修飾された捕捉オリゴヌクレオチドは適切に官能化した支持体と反
応または結合する。薬剤を組み合わせる順は、従って、変化し得、その結果、捕
捉オリゴヌクレオチドを通してプライマーオリゴヌクレオチドを支持体に可逆的
に結合する構造を形成する。

【００２９】ビーズ支持体は、一般的には約１μ〜１ｍｍの範囲の、通常は少なくとも約１
０μ、より通常は約５０μ〜５００μの範囲の直径の、ラテックス、金属ゾル、
コロイド炭素およびポリアクリルアミドなどのような任意の好都合な組成物の支
持体であり得る。ビーズは、所望の分離様式に依存して、非磁性、反磁性または
超常磁性であり得る。広範な種々のビーズは異なる供給元から市販されている。
ビーズを捕捉オリゴヌクレオチドに連結するために官能基化し得るか、または連
結基を結合するために反応性官能基を有し得る。支持体がビーズ、糸、メンブラ
ンまたは溶解性ポリマーの場合、上述の支持体の操作を容易にするために、さら
に容器壁、より大きなビーズ、あるいは不溶性ポリマーのような固体表面に連結
させ得る。例えば、米国特許第５，９００，４８１号および本明細書でビーズの
記述またはビーズへのヌクレオチドの結合体化のために引用文献を参照のこと。

【００３０】支持体は、プラスチック、ガラス、シリカのような任意の好都合な組成物の支
持体であり得る表面であり得、その組成物は、次いで、ポリマー、バイオポリマ
ーまたは他の分子でコートされ得る。そのコーティングは、分析物の非特異的吸
着またはサンプル自体で引き起こされた汚染を減らすように機能する。コーティ
ングはまた捕捉オリゴヌクレオチドの支持体への固定化の際に、捕捉オリゴヌク
レオチドが反応し得る化学反応物または結合対の１つのメンバーを与えることに
よって、機能し得る。コーティングはまた多イオン性の混合物、特にポリリジン
またはアミノ化されたデキストランのようなポリカチオン、を含み得る。それら
はオリゴヌクレオチドの周りのイオンの強度を調整するために含まれ得る。支持
体はまたメンブラン（例えば、ニトロセルローズ）のような多孔性表面であり得
る。

【００３１】個々の支持体に結合したオリゴヌクレオチドの数は、通常は少なくとも約１０
、好ましくは少なくとも約５０であり、そして１０⁸以上であってもよく、アッ
セイ、許容された重複、標識の多様性、ならびに異なる標識を区別し得る感受性
のために必要とする異なるビーズまたはポリマー支持体の数に依存する。

【００３２】第３のオリゴヌクレオチドは鎖置換物オリゴヌクレオチドである。鎖置換物は
、プライマーオリゴヌクレオチドを溶液に置換するために、捕捉オリゴヌクレオ
チドに相同な配列を含み得る。鎖置換物は捕捉配列に相補的な配列の全体または
主要な部分を有し得、一般的には近接塩基として配列の少なくとも約７５％を有
す。上述したように、鎖置換物は天然のＤＮＡオリゴヌクレオチド組成物を有す
る必要はないが、修飾の性質に依存して、一部または全体が、他のバックボーン
（塩基あるいはイオン性部分、特により高い親和性のハイブリダイゼーションを
与えるもの）と置換され得る。最も好都合なのは、鎖置換物は捕捉オリゴヌクレ
オチドに相補的であるが、特に置換開始配列および捕捉配列が、連続しない場合
または他の特別な状況の場合は変化し得る。

【００３３】一般的には、相補的な場合は、鎖置換オリゴヌクレオチドの長さは捕捉オリゴ
ヌクレオチドの長さと等しい。しかし、その長さは、結合親和性がプライマーヌ
クレオチドの結合親和性よりも強い限りは、捕捉ヌクレオチドの長さより短くな
り得る。捕捉オリゴヌクレオチドが置換開始配列を含む場合は、鎖置換オリゴヌ
クレオチドの部分はその配列にハイブリダイズする。このバイブリダイゼーショ
ンの目的は鎖置換プロセスを進展させることで、Ｔ_mよって測定される結合親和
性は、少なくとも操作温度と同じであるべきであり、好ましくはアッセイの操作
温度より５〜１５℃高く、そして操作温度より高い２５℃以上であり得る。Ｔ_m
は、当該分野で周知なように、塩濃度および有機共溶媒のような溶液の組成物に
よって影響を受けるということを覚えておくべきである。

【００３４】さらに、付加領域にプライマーオリゴヌクレオチドを含む得る。その領域は、
識別子といわれ、その識別子はプライマー改変プロセスの間存在し、改変プライ
マーの部分を残す。キャラクタリゼーションの性質によって、識別子は特定のヌ
クレオチドの存在、組成、またはプライマーの同一性を同定するために役立ち得
、または標的核酸についての目的の他の情報を提供し得る。例えば、配列決定お
よびＳＮＰ決定において、特別に終端ヌクレオチドを標識させることなく、伸長
したプライマーの末端で特定ヌクレオチドを同定することを目的とし得る。より
詳細には、例えば、米国特許第４，６５６，１２７号と同第５，８８８，８１９
号で記載されるような方法を使用して単一塩基性プライマー伸長によって、ＳＮ
Ｐ決定を行う（すなわち、個々の位置の遺伝子型決定を行う）場合、識別子は、
オリゴヌクレオチドの捕捉配列またはプライマー配列に不可欠でない可変長のヌ
クレオチドであり得る。各々の異なるプライマーは、異なる識別子に結合する。
多重化の能力をさらに増大させるために、類似のシリーズの可変長の識別子が異
なる捕捉配列に結合し得る。

【００３５】プライマーを配列決定するのを避けるために、または異なるプライマーの移動
性における変化が標的配列の数の区別について十分な離散の機会を提供しない場
合に、識別子はプライマー配列に検出可能な標識を与え得る。

【００３６】識別子標識は多くの形体をとり得る。改変プライマーの検出方法によって、識
別標識があってもよいし、１つも標識がなくてもよい。異なる移動性によって検
出され得る改変プライマーを有することによる分離方法（例えば、クロマトグラ
フィーまたは電位泳動）を用いて、その移動性によって改変プライマーのみを検
出し得る。この型の識別子は移動性タグといわれ得る。そのような改変プライマ
ーはまた、例えば質量分析により、荷電率に対する差次的な質量に基づいて分離
され得る。同じ技術および他の技術について標識が必要であり得、この標識は電
磁的な手法（例えば、蛍光や電子イオン化）によって検出される。例えば、識別
子は標識されたヌクレオチドを含み得、そのヌクレオチドは成長する核酸の鎖に
結合または含有され得、そして標識を有する。その標識は、異なる蛍光材、移動
性の決定を可能にする電気泳動的タグ、電気化学的タグ、化学発光性タグ、およ
びガスクロマトグラフィータグなどのような区別、またはリガンド−レセプター
結合のような物理的分離が可能である。

【００３７】類似の標識をプライマーに結合し得るが、通常は、蛍光材は限られた種類の蛍
光剤である。プライマーが移動性によって変化する場合は、その多様性は、検出
され正確に区別され得る異なる蛍光剤の数によって広がる。通常、約２を超える
異なる励起源を有することを望まず、このことは、蛍光標識で達成される多様性
を大いに狭くする。しかし、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９８）２８１：２０１３−２
０１６に記載されるような蛍光半導体ナノ粒子は、広い一致した励起帯を有し調
整可能な狭い発光帯を有する蛍光標識としての用途の蛍光半導体ナノ粒子であり
得る。また、４色蛍光タグセットがＤＮＡ配列決定適用のために開発されている
。

【００３８】移動性タグとして、オリゴマー（例えば、ペプチド）、オリゴヌクレオチド、
有機オリゴマー（例えば、ポリエチル、ポリエステルおよびポリアミド）、ポリ
ハロアルカンあるいはハロ以外の置換基（例えば、シアノ、オキシ、チオ、ニト
ロなど）を使用し得る。本発明により、１つまたは数個の容器に非常に多くの標
的配列をアドレスできるようにするために、差異の特性の組み合わせを利用して
、多くの異なる属性をプライマーや識別子に与え得る。

【００３９】本方法を実行する際、標的種は一本鎖核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡである。この
核酸は、原核生物ゲノムまたは真核生物ゲノム、原核生物供給源および真核生物
供給源由来のｃＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、合成ＤＮ
Ａプラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスなどのような任意の好都合な供給源
から得られる。ＤＮＡが二重鎖である場合は、一鎖ＤＮＡを得るために変性させ
る。ＤＮＡは、機械的フラグメント化または制限酵素消化によって、さらにプロ
セスされ得る。好都合なことに、フラグメントは約１センチモルガン未満であり
得、通常約１０⁵ヌクレオチド未満であり得る。核酸改変条件下（通常は伸長ま
たは制限条件下）で、標的核酸は、プライマーオリゴヌクレオチドと組み合わさ
れる。

【００４０】本方法では、改変薬剤系として、各標的核酸に対するプライマーと並べて、ポ
リメラーゼ活性を有する酵素（その酵素はまた、５’−３’ヌクレアーゼ活性（
例えば、ＤＮＡポリメラーゼのクレノーフラグメント、ＤＮＡポリメラーゼ１、
ならびにＴａｑポリメラーゼなど）を有し得る）、５’ヌクレアーゼ活性（例え
ば、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標））、リガーゼ活性、制限エンドヌクレアーゼ
活性、ヌクレアーゼ活性またはトランスプリプターゼ活性を持つ酵素を用いる。
従って、プライマー改変について、改変薬剤系は増幅、配列決定、小型の配列決
定（ｍｉｎｉ−ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）、ＳＮＰ決定、鎖切断、連結、制限、転
写あるいは多数の標的核酸配列を特徴づける目的を含む他の目的を含み得る。通
常、標識核酸の増幅もまた存在し、これは必要とされる場合、ｄＮＴＰを加え、
そして熱サイクルを行う、従来の方法に従って行われ、それによりプライマーが
伸長する。熱サイクルはプライマーを伸長する低温段階および得られる二重鎖を
変性させる高温段階を含み、その後冷却され、プライマー伸長の別の段階に備え
て、標的に非伸長プライマーをハイブリダイズさせる。ポリメラーゼを利用する
核酸伸長を行う方法として、例えば、ＰＣＲＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔ
ｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９９４
）；Ｐａｓｔｉｎｅｎ，Ｃｌｉｎ，Ｃｈｅｍ．（１９９６）４２：１３９１；米
国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，
１５９号、同第４，９５６，１８８号ならびに同第５，００８，１８２号を参照
のこと。

【００４１】核酸改変を行うための特別な方法は本発明に必須ではなく、任意の多種の方法
が利用され得る。その方法は、標識された転写ターミネータ−、標識ｄＮＴＰ、
標識ｄｄＮＴＰ、Ｃｌｅａｖａｓｅ（登録商標）、リガーゼ、ニックアーゼ、制
限エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡなどのような目的の特性と関連する種々の薬剤を
さらに含み得る。例えば、米国特許第５，４２２，２５３号および同第５，７１
２，１２４号参照のこと。

【００４２】配列決定とＳＮＰ決定、および添加された特定のヌクレオチドを知ることを望
む場合の他のアッセイについて、標識された終結ヌクレオチドを利用するか、ま
たは標識されたプライマーを利用するかいずれかであるが、後者の場合は、４つ
の反応容器が使用され、各々特定の蛍光標識プライマーに結合される異なるター
ミネータ−を有する。従って、４つの終結ヌクレオチドの各々は異なる標識に結
合して、その標識はその区別を可能にする。好都合なことに、ＦＡＭ、ＲＯＸ、
ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴならびにＪＯＥなどのような蛍光標識を使用するか、または
「ＢＩＧ」蛍光材が使用される。フルオレセインは、ＦＡＭ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲ
Ａ、ＴＥＴ、ＪＯＥならびに他のローダミンまたはジクロロローダミン誘導体の
ような別の蛍光材に結合し、そして得られた化合物は単一エネルギー移動分子と
いわれる。エネルギー移動色素セットのまた別のファミリーは、プライマーエネ
ルギードナーとしてシアニンを組み込む。使用され得る色素は米国特許第４，９
９７，９２８号、同第４，８５５，２２５号およびＰＣＴ出願番号第ＵＳ９０／
０６６０８および同第ＵＳ９０／０５５６５に記載されている。ターミネータ−
は使用されているポリメラーゼによって認識される任意の分子であり、特に、標
的に存在する相補的ヌクレオチドに結合し、伸長し得ない。従って、種々の改変
されたまたはキャップされたヌクレオチドアナログは、ジデオキシヌクレオチド
が容易に利用でき、種々の標識を付属し、そしてその使用の条件が良く確立して
いる程度まで用いられ得、それらは選り抜きのターミネータ−である。

【００４３】配列決定のために、複数のプライマーオリゴヌクレオチドを使用する。配列に
対する標的は、長さが１ｋｂ以上の塩基であり得る１つの連続した鎖に由来し得
る。系のフィデリティとアッセイ方法の能力に依存して、プライマーは約０．５
ｋｂ離れて配置されており、系がそのようなスペーシングでの正確な分解能を許
すならば、好ましくは０．８ｋｂかそれ以上離れて配置される。

【００４４】あるいは、配列決定についての標的は、複数の鎖フラグメント、プラスミド、
あるいはベクターに由来し得る。反応は、その複数の標的において同時に行われ
るか、または異なる標的で別個の捕捉配列を会合するための必要性に従って分離
した容器内で行い得る。例えば、標的の各々は、固有のプラスミドに含まれ、次
いで固有のプライマーオリゴヌクレオチドが同じ容器内で使用され得る。しかし
、同じプラスミドベクターまたはベクターのセットが多くの構築物のために利用
される場合、酵素的反応は各生成物に特有の捕捉配列を付着させるために、分離
した容器内で、各プラスミドまたはプラスミドのセットを使用して、都合よく行
われる。分離した容器もまた、標識されたプライマーが色素標識ターミネータ−
よりも望ましい配列決定反応において、利用され得る。本発明は、分析のために
異なるセット由来の異なる生成物を別個かまたは組み合わせて操作することを可
能にする。

【００４５】複数のプライマーオリゴヌクレオチドを使用した単一塩基プライマー伸長方法
を使用して、ＳＮＰ、トリプレット欠失または挿入を同定するために、単一塩基
位置を遺伝子型分類するには、標的は、連続した核酸鎖に存在し得るか、または
多数の鎖、鎖フラグメント、染色体、プラスミドあるいはゲノムなどから派生し
得る。さらに、各位置での遺伝子型決定の特異性を高めるために、各鎖を標的と
するプライマーオリゴヌクレオチドによって、サンプルに存在するセンス鎖とア
ンチセンス鎖の両方を介在させ得る。

【００４６】多重化した遺伝子型決定のための移動性タグとして働く識別子を持つプライマ
ー薬剤の具体例を図１に示す。単一塩基伸長反応においてプライマーオリゴヌク
レオチドを改変することによって、遺伝子型が決定される。プライマーは、目的
の位置に隣接する相同標的配列に対してハイブリダイズする。ポリメラーゼ酵素
および４つのヌクレオチドのうちの少なくとも１つの終結誘導体の存在下では、
酵素は標的の隣の位置に見い出される塩基に相補的な塩基をこのプライマーの末
端に付加する。プライマーの終端の新しい塩基は伸長し得ず、よって、各プライ
マーは１塩基ずつ長さが増す。

【００４７】プライマー試薬はセットに分けられる複数のプライマーオリゴヌクレオチドか
ら構成され、各セット内では、プライマーオリゴヌクレオチドは１捕捉オリゴヌ
クレオチドに相同な同じプライマーの第２の部分配列（捕捉配列）を持つ。識別
子が各プライマーの第一の部分配列に結合しており、その識別子は各セット内で
特有であることのみが必要である。同じ識別子を異なるセットで使用し得る。識
別子はｎユニットの配列から成り得、ｎは少なくとも１で、通常は約２０より大
きくないが、識別子が５０ユニットもの数で得る。利便性のために、ユニットは
ヌクレオチド塩基であり、このヌクレオチド塩基は、標準的な自動化ＤＮＡ合成
技術によってプライマーオリゴヌクレオチドに組み入れられ得る。プライマーの
第一の部分配列は同じ長さであるように好都合に設計されており、その結果、オ
リゴヌクレオチドの全長、および、それ故の移動性は、識別子の長さによって区
別される。

【００４８】プライマーオリゴヌクレオチドの調製における便利性のために、ならびに放出
されたプライマーの分離および検出のために、識別子の長さを第一に選択する。
単一塩基分解は、通常、一般の移動度ベースのアッセイ方法、すなわち電気泳動
、によって達成されるので、各識別子は少なくとも一塩基で長さが異なり得る。
改変プライマーと未改変プライマーとの間の検出および区別を容易にするために
、識別子は２塩基ユニットで異なり得る。

【００４９】識別子の数は、各セット内のプライマーオリゴヌクレオチドの数を決定する。
図１において、ｘはセット内のそのような識別子の数を表す。１つのセット内の
識別子の数を掛けたセットの数は、多重決定の合計数である。

【００５０】遺伝子型決定におけるより大きな特異性のために、二重鎖標的の両方の鎖の上
で、同じ型の分析が行われ得る。よって、塩基とその補体の両方が、目的の各位
置に対して決定される。その分析に関してプライマ−オリゴヌクレオチドを設計
する多くの方法がある。例えば、プライマーオリゴヌクレオチドの各セット（図
１を参照）が標的の一本鎖に供され得るか、または各セットが目的の位置の所定
の群に対する両方の鎖を分析するためのプローブを含み得る。

【００５１】一旦、プライマー改変が行われると、それから改変プライマーオリゴヌクレオ
チドが収集され得る。以前示したように、増幅は通常、ポリメラーゼと共にプラ
イマーを伸長し、標的配列から伸長されたプライマーを分離し（これは通常、温
度変性を含む）、再びハイブリダイズ条件を作り（ここでは、伸長されていない
プライマーが標的上の利用可能な部位にハイブリダイズする）、そしてこの伸長
を繰り返すことに依存する。このプロセスは、十分な時間繰り返され得、所望の
量の伸長プライマーを提供する。伸長反応の性質に依存して、一本鎖の伸長プラ
イマーを提供するために、二本鎖は変性されなければならないかもしれない。

【００５２】改変プライマーを混合物に存在する改変されていないプライマーおよび他のＤ
ＮＡから分離することを所望し得る。このことは通常、必ずしも必要でないが、
そのような分離は、例えば、プライマーが伸長によって改変される場合、結合メ
ンバー標識されたターミネーターを持つことによって、達成され得る。そこでは
結合メンバーは、支持体に結合する相補的結合メンバーを有し、直ぐに放出する
ことができる。反応混合物を支持体に結合させることで、結合メンバー標識され
たターミネーターで終結された伸長プライマーのみが捕捉され得、そして結合し
ていないＤＮＡおよび非特異的結合ＤＮＡを洗い流す。それから、捕捉された伸
長プライマーが放出され得る。この２番目の結合および放出プロセスは、多重化
された鎖の捕捉および放出プロセスの前または後、好ましくは前に、起こり得る
。使用され得る多くの異なる特定の結合対が存在するが、特に、置換による放出
を引き起こすビオチン付加を伴う、デスチオビオチンおよびストレプトアビジン
の使用は便利である。他のリガンド−レセプター対は、以下を含む：ジゴキシン
−アンチジゴキシン；フルオレセイン−抗フルオレセイン；糖類およびレクチン
、基質／阻害剤および酵素；など。

【００５３】逆に、プライマーを制限によって改変する場合、結合メンバー標識は改変プラ
イマーオリゴヌクレオチドおよび未改変プライマーオリゴヌクレオチドを分離す
るために使用され得る。プライマーの一部分に結合メンバー標識を配置すること
によって、捕捉配列、および、存在するならば、識別子を含む部分から切り離し
、それから不改変プライマーおよび改変反応副産物を反応産物から分離し得る。
上述の特定の結合対が使用され得る。

【００５４】異なる捕捉配列の数は、通常、少なくとも約３であり、より通常には、少なく
とも約５であり、そして、１００以上であり得るが、通常には約５０より多くな
い。捕捉配列の各群には、通常には少なくとも約５つのメンバーであり、しばし
ば少なくとも約１０個のメンバーであり、１，０００以上であり得る。捕捉配列
の数は、サンプルの複雑性および区別され得る異なる伸長プライマー数に関係す
る。例えば、大きなＤＮＡサンプルの配列決定を行い、５００の異なる伸長した
配列を確実に区別し得るならば、その時はプライマー数はだいたい、配列決定さ
れるヌクレオチドを５００で割った総数である。１０ｋｂが配列決定されるなら
ば、約２０のプライマーを使用し、各プライマーは異なる捕捉配列を持ち、そし
て各プライマーは約５００の異なる伸長した配列と結合している。ＳＮＰの場合
、５，０００のＳＮＰに関心があり、１００の区別可能な識別子を有するならば
、（各部位に１つのＳＮＰがあると仮定すると）５，０００のプライマーを有す
るだろう。つまり、５０の捕捉配列があり、各捕捉配列が１００の異なる識別子
に結合していることになる。または、同じ数の識別子と捕捉配列を使用して、２
，５００のＳＮＰを決定する場合に両方の鎖を分析し得る。従って、識別可能な
タグの数によって、分析される各群のサイズが決定し、この群のサイズで割った
標的の複雑性によって、プライマー上の異なる捕捉配列の数が決定する。改変プ
ライマーの数は、いかに多くの異なる事象が特定のプライマーに結合し得るかに
よって決定され、ＳＮＰの場合の１つから配列決定の場合の５００以上まで変化
する。

【００５５】加工された反応混合物または全く加工なしの反応混合物のいずれかを、ハイブ
リダイゼーション条件下で捕捉オリゴヌクレオチドとあわせる。通常、ストリン
ジェントな条件が用いられ、ストリンジェンシーの程度は配列の複雑性、配列の
長さ、および配列のＴ_mなどに依存する。ストリンジェンシーは、塩（緩衝液）
濃度、溶媒、温度などにおける変化によって達成され得る。ストリンジェンシー
の選択は、伸長プライマー混合物に存在する個々のプライマー間の違いを特異的
に識別する能力によって決定される。一般的に、支持体に結合した捕捉オリゴヌ
クレオチドの密度は、支持体の型、所望の濃度、決定される異なる配列の数など
に依存して、１ｍｍ²あたり１０⁵〜１０¹⁵の範囲内で、より代表的には１ｍｍ²
あたり約１０⁸〜１０¹²である。ここでは、捕捉配列のプライマー配列に対する
割合は、少なくとも約２：１で、好ましくは少なくとも約５：１で、通常、約１
０³：１を超えることはない。

【００５６】反応および洗浄のために、種々の洗浄緩衝液および反応緩衝液が用いられ得る
。緩衝液は生理食塩水、ホスフェート、カルボネート、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＳ、Ｔ
ｒｉｓ、ＴＥなどを含む。一般的には、緩衝液濃度は、約１〜５００ｍＭの範囲
内で、より通常には、約５〜２００ｍＭの範囲内である。個々の緩衝液の使用は
慣習的であり、特定の適用に従って、特定の緩衝液が使用される。いくつかの場
合、洗浄緩衝液は最小限の塩濃度を含むか、または全く塩を含まない。低塩洗浄
液は、例えば、キャピラリー電気泳動の適用に対する動電学的注入のような動電
学的輸送において、捕捉プライマーの放出の直前に使用するのが特に望ましい。

【００５７】反応後、プライマーオリゴヌクレオチドの一部分は、改変プライマー産物の混
合物に変換される。プライマーと支持体は結合され、適切なストリンジェンシー
の条件下で、プライマーと捕捉オリゴヌクレオチドの間とのハイブリダイゼーシ
ョンに十分な時間インキュベートされる。次いで、物理的分離、遠心分離、濾過
、磁気分離などを用いて、支持体は液体培地から分離され得、そしてこの支持体
は適切な緩衝液で洗浄される。液体培地から支持体を離すことは、出口から原液
を押出しながら支持体領域に緩衝液を注ぎ入れるという形をとり得る。それから
、特異的に結合していないＤＮＡ、過剰な塩、テンプレート、標的、モノマー、
酵素などから放出された支持体は、捕捉プライマーの放出に備えて、適切な緩衝
液中に再分散されるビーズのために、適切な緩衝液とあわせられる。

【００５８】放出に対するストリンジェンシーな条件が、置換に関して高度の特異性を提供
するために選択される。条件のストリンジェンシーは、置換開始配列の性質およ
び長さ、捕捉配列の長さ、これらの配列のＴ_m、プライマー配列中の変化などに
ある程度依存する。一般的に、放出のための塩濃度は約０．１ｍＭ〜１００ｍＭ
の範囲内であり、温度は約２０〜９０℃の範囲内であり、より通常には、２５〜
６０℃である。水以外の溶媒が存在し得るが、それらは通常必要とされず、存在
しても、一般的に約２０％未満の体積で存在する。明らかに、鎖の放出に関して
所望の区別を得るために、異なるパラメータが選択される。代表的には、一度に
少なくとも１つの鎖置換オリゴヌクレオチドが支持体に結合し、放出を引き起こ
す。鎖置換オリゴヌクレオチド対予測最大数の捕捉プライマーの割合は、少なく
とも１：１で、通常、少なくとも５：１で、１０:１以上のこともあり得る。こ
れは、置換を実行すための費用、選択性および時間に依存する。

【００５９】異なる鎖放出を実行する際、少なくとも１つの鎖置換オリゴヌクレオチドが、
捕捉された改変プライマーを構成する支持体に加えられる。インキュベーション
は、置換される置換鎖配列を持つ改変プライマーの実質的な部分が置換されるの
に十分な時間行われる。一旦、改変プライマーが放出されると、次いでこの改変
プライマーは、収集され処理され得る。残りの伸長プライマーにまで置換を引き
起こす同様の手法で、少なくとも１つの鎖置換オリゴヌクレオチドを、残りの捕
捉された伸長プライマーを含む支持体と結合させることを続け得る。好ましくは
、鎖置換オリゴヌクレオチドを連続して１つずつ支持体に添加し、プライマーの
放出に備える。

【００６０】伸長プライマーの放出は、メンブラン底面を持ち、伸長プライマーの適切な群
が放出されるのに十分な時間置換鎖をビーズと共にインキュベートするウェル上
に、ビーズを持つ形を取り得る。容器が透過可能な底部を持つ場合、置換が起こ
るのに十分な時間の後、透過性メンブランには異なる圧力が生み出され、その結
果、放出された伸長プライマーを含む液体がビーズから分離される。あるいは、
メンブランを通して液体を移動させる力が遠心分離によって生み出され得る。そ
の液体は分離され、それから次の工程に利用される。各置換に関して、所望の異
なる伸長プライマー全てが実質的に放出されるまで、このプロセスが繰り返され
る。ビーズは異なる置換鎖の添加の間に洗浄され得る。あるいは、ビーズが透過
性のメンブラン底面を持つ容器と実質的に同じ方法で充填されたカラムを使用し
得る。別の方法は、攪拌しながらビーズと共に置換鎖をインキュベートし、遠心
分離し、それから上清を除くことである。あるいは、ビーズが磁心を含む場合、
磁場の適用によってこれらをペレットにし得、上清の液体を除去するを補助する
。再び、各所望の連続した鎖置換を用いてこのプロセスを繰り返す。ビーズの代
わりに、キャピラリーの壁に結合した捕捉配列を持つキャピラリーをとり得る。
あるいは、チャネルの表面、チャネル区分内に含まれたビーズ、またはチャネル
内に拘束された支持体に結合した捕捉配列を持つ平面基板にフローチャネルを有
し得る。キャピラリー、またはフローチャネルによって、鎖置換オリゴヌクレオ
チドを流路に加え得る。他の支持体もまた、適宜使用が見出される。

【００６１】放出された伸長プライマーの性質に依存して、種々の方法で分離し加工し得る
。異なる伸長プライマーの移動度が異なる場合、必要な時は、検出のための検出
可能な標識に依存して、伸長プライマーを異なる移動度によって分離し得る。電
気泳動、クロマトグラフィー（ガスまたは液体）、および質量分光法などによっ
て、分離が行われ得る。電気泳動およびクロマトグラフィーに対して、改変プラ
イマーの個々のバンドの検出のために、蛍光タグがプライマーまたはターミネー
ターに提供され得る。従来の条件が分離には利用される。最近の総説（例えば、
Ｍｏｌ．Ｐａｔｈｏｌ．（１９９９）５２：１１７−１２４）を参照のこと。

【００６２】本方法は、大量の決定が目的である場合に利用可能である。これらは、核酸の
配列決定、ＳＮＰの検出、および核酸フラグメントの同定などを含む。目的の個
々の性質の数は少なくとも約１０で、より通常には約５０で、通常には少なくと
も約５００で、１０，０００以上であり得る。ほとんどの部分で、１つの容器が
使用されるが、いくつかの場合は、決定を４つの容器、つまり各終結ヌクレオチ
ドに１つ、または同様のクローニングベクターが特有に位置し得る多くの容器、
に分け得る。その結果、物理的分離は多重化された多様性に寄与する。配列決定
の際、例えば、同じファミリーのプライマー（しかし、異なる終結ヌクレオチド
）を各容器に加えて、全ての４つのｄＮＴＰの存在下で伸長を実行し得、ここで
各終結ヌクレオチドは別々に標識される。伸長完了後、４つの容器から産物を合
わせ、異なる伸長プライマーの移動性によって配列を読み得、異なる標識によっ
て終結ヌクレオチドを検出し得る。あるいは、全ての４つの終結ヌクレオチドが
存在する状態で、単一容器内伸長反応を実行し得る。

【００６３】各工程で放出された異なる改変プライマーの数は、通常、少なくとも４であり
、より通常には少なくとも約１５で、決定の性質に依存し得て、少なくとも約１
００であり得、少なくとも約１，０００以上であり得るが、通常約５００より多
くない。同時に放出された伸長プライマーの数は、要求された複雑性、検出方法
、異なる伸長したプライマーが検出され得る感度と信頼性、利用できる装置など
に依存する。

【００６４】ＳＮＰの検出に関して、伸長プライマーの鎖置換の使用によって、大量、しば
しば５０以上、のＳＮＰの検出が実行され得る。ここでは、伸長ための単一反応
容器内で、１００以上、通常２５０以上、そして１０，０００以上まで、に対し
てアッセイがされる。次いで、経時的な放出を使用して、ＳＮＰの数を実質的に
減少するために、アッセイを分割し得る。第１の変数を第２の変数としての異な
る識別子と組み合わせた、独立した放出の組み合わせを用いることで、順列と組
み合わせの数が大いに増える。説明のために、５０の異なる識別子を有する場合
、これらの５０の識別子のセットを異なる捕捉配列の数で多重化し得るとする。
従って、１００の異なる捕捉配列を使うと、５０００の異なる検出可能な事象が
生成する。これによって、蛍光剤、ガスクロマトグラフィー標識などのような、
限定された多様性を有し得る識別子が使用される。

【００６５】本発明は、１つまたはいくつかの容器内での高度に多重化された反応を実行す
るのを大いに容易にし、多くの反応の高度に多重化された分析を大いに容易にす
る。２つの異なる変数、つまり捕捉オリゴヌクレオチドおよび識別子、を有する
ことで、識別子の選択においてより高い可撓性が得られ、異なる識別子の検出に
おいてより明確な区別を得うる。また、個々の事象の同定に対して必要とされる
多様性を依然として達成しながら、より少ないレパートリーの識別子を利用し得
るので、合成に必要とされる異なる分子の数は減らされる。以下の実施例を、限
定のためではなく、例示のために提供する。

【００６６】（実験）（実施例１）鎖置換法を、二段階プロセスを用いて示し、これは、ビーズに表面結合した捕
捉オリゴヌクレオチドへの蛍光オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、
続いて、鎖置換オリゴヌクレオチドの付加のための、蛍光オリゴヌクレオチドの
溶液への置換を含む。

【００６７】（ハイブリダイゼーション）材料：ストレプトアビジン−コートされた磁気ビーズ（Ｓｅｒａｄｙｎ、１μｍ直径
）ＴＥＮＳＳハイブリダイゼーション緩衝液（０．１ＭＴｒｉｓ．ｐ８．２
、０．３ＭＮａＣｌ、２５ｍＭＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔ−
５００デキストラン、４０μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）プライマーオリゴヌクレオチド：配列番号１捕捉オリゴヌクレオチド：配列番号２マイクロプレート蛍光メーター（ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒ）ｆｍａｘ（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）黒い、Ｃボトムのプレート「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｏｒ」（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）方法：等モル量のプライマーオリゴヌクレオチドおよび捕捉オリゴヌクレオチド（配
列番号１および配列番号２）を、ＴＥＮＳＳ緩衝液中で合わせた。この溶液を７
０℃で１０分間インキュベートして二次構造を取り除き、そして室温で１時間放
置してオリゴをアニーリングさせた。ストレプトアビジンコートされた磁気ビー
ズを、この溶液に添加し、そしてこの混合物を、室温で１時間タンブリングさせ
た。５μｌのアリコートを、取り出し、そして、バックグラウンドの蛍光強度を
決定するために蛍光を測定した。次いで、鎖置換を実施した。

【００６８】（鎖置換）材料：低塩緩衝液ＬＯＳＳＴ（０．１ＭＴｒｉｓｐＨ８．２、０．０１ＭＮａ
Ｃｌ、０．０２５ＭＥＤＴＡ、０．１％ＢＳＡ、０．１％Ｔ−５００デキ
ストラン、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ）鎖置換オリゴヌクレオチド：配列番号３方法：５〜２０μｇのビーズを含む混合物のアリコートを、２０μｌの冷ＬＯＳＳＴ
緩衝液で洗浄した。この後直ちに、３４０ｐｍｏｌ（Ａ₂₆₀＝０．１）の鎖置換
オリゴヌクレオチドを含む２０μｌのＬＯＳＳＴ緩衝液を添加し、この混合物を
簡単にボルテックスし、そして３７℃で３０分間インキュベートした。５μｌの
アリコートを取り出し、そして蛍光強度を測定した。表１に、置換オリゴヌクレ
オチド（配列番号３）を、結合二重鎖を有する変化する量のビーズに添加した結
果を示す。上清中の蛍光の増加は、プライマーオリゴヌクレオチドが、プライマ
ー／捕捉物の二重鎖結合からビーズへ放出されたことを示す。

【００６９】（表１）

【００７０】

【表１】（実施例２）実施例１と同じ二段階プロセスを、置換の間の温度における変化の効果を調べ
るために利用した。

【００７１】（ハイブリダイゼーション）実施例１と同じ。

【００７２】（鎖置換）方法：２０μｇのビーズ−ハイブリッド二重鎖を含むアリコートを２０μｌの冷ＬＯ
ＳＳＴ緩衝液で洗浄した。この後直ちに、３４ｐｍｏｌ（Ａ₂₆₀＝０．０１）の
鎖置換オリゴヌクレオチドを含む６０μｌの冷ＬＯＳＳＴ緩衝液を添加し、この
ビーズ溶液を、ピペッティングによって混合し、そして特定の温度でインキュベ
ートした。示された時間間隔において、２０μｌのアリコートを除去し、このビ
ーズをペレットにし、そして５μｌのサンプルを蛍光分析のために取り除いた。
この結果を、表２に示す。このデータにより、プライマー／捕捉物の二重鎖結合
からビーズへのプライマーの放出に起因する増加した蛍光が示される。

【００７３】（表２）

【００７４】

【表２】（実施例３）連続かつ同時の放出を伴なう多重鎖置換を、４つのＰＣＲアンプリコンを用い
て実施した。この置換は、微量流体チャネルの規定された領域における捕捉オリ
ゴヌクレオチド表面結合のセットへのこのアンプリコンのハイブリダイゼーショ
ン、続いて、適切な鎖置換オリゴヌクレオチドの添加に起因する、各アンプリコ
ンの溶液中への連続した置換を含む。

【００７５】微量流体デバイスを、平面のポリメチルメタクリレート基板で作製した。簡単
に言うと、５０μｍのディープチャネルで１２０μｍ幅を形成し、２つのレザバ
ー（各々、５μＬの容量）に接続した。チャネルの一部を、以下に記載されるよ
うに表面固定試薬で処理した後、このチャネルを、アクリルフィルムで熱結合に
よって覆い、デバイスの製造を完了した。

【００７６】第１に、ビオチンコートの表面を、ベンゾフェノン−アルブミン−ビオチン（
ＢＡＢ）結合体を用いて調製した。このＢＡＢ結合体を、各々１０ｍｇ／ｍＬで
あるビオチン−Ｘ−Ｘ−ＮＨＳ（Ｓｉｇｍａ）および４−ベンゾイル安息香酸の
無水ジメチルホルムアミド溶液と、ＰＢＳ中の１７ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）溶液との反応によって調製した。この生成物を、水に対して透析
することによって精製した。この溶液は、この反応および透析の間、室内光から
保護した。１×ＰＢＳ緩衝液中の１０ｍｇ／ｍＬのＢＡＢ溶液を、チャネル中に
導入し、そして、視準された１００Ｗ水銀ランプを用いて１．５ｃｍ長のチャネ
ルを規定するマスクを介して２０分間照射した。ＢＡＢのＰＭＭＡ基板に対する
表面固定化は、ポリマーへのベンゾフェノンの光付加を介して生じた。この反応
後、チャネルをまず０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液を用いてリン
スし、次いで、蒸留水を用いてリンスした。

【００７７】ビオチンコートされた表面を０．１ｍｇ／ｍＬストレプトアビジンとＴＥ緩衝
液中３０分間インキュベートすることによって、ストレプトアビジンコートされ
た表面を調製した。このチャネルを、０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水
溶液を用いてリンスし、次いで、滅菌水を用いてリンスした。

【００７８】ＰＣＲ反応を、４つの標的配列（βアクチン、ジストロフィンエキソン３、ジ
ストロフィンエキソン１３、およびジストロフィンエキソン４７）の増幅に関し
て、４つのプライマー対（表１を参照のこと）を用いて実施した。各標的に関し
て、プライマーオリゴヌクレオチドとしていわれる、１つのＰＣＲプライマーを
、固定化された捕捉オリゴヌクレオチドに結合するように設計した。アンプリコ
ンを、Ｒ１１０−ｄＵＴＰおよびＲ１１０−ｄＣＴＰの単量体をｄＮＴＰミック
スに含めることによって、蛍光タグによって標識した。３つのジストロフィン標
的を、以下の温度プロフィールを用いて増幅した：９４℃で５分間、および９４
℃で２分間、５６℃で１分間、６５℃で４分間を３０サイクル。βアクチン標的
を、以下の温度プロフィール：９４℃で２分間、および９４℃で１分間、５６℃
で３０秒間、７２℃で３０秒間を３０サイクル、および７２℃で５分間の伸長に
よって増幅した。増幅後、この生成物を、アガロースゲル電気泳動によって分離
し、水中への溶出を伴なうゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した
。

【００７９】捕捉オリゴヌクレオチドを、各アンプリコン（各々は、その５’末端にビオチ
ン部分を有する）（表３を参照のこと）について調製した。各捕捉オリゴヌクレ
オチドを、二倍モル過剰で適切なアンプリコンに添加し、９５℃で１０分間加熱
し、次いで、冷えるまで室温で１時間放置した。これらの溶液を合わせ、そして
チャネルに注入し、そして１０分間インキュベートして多量体の、ビオチン−ス
トレプトアビジン付加体形成を介して表面に結合した捕捉オリゴヌクレオチド／
プライマー−アンプリコン複合体の形成を可能にした。次いで、チャネルを、１
ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、０．０１％Ｔｗｅｅ
ｎ２０、を用いて洗浄し、そして、１ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＴｒｉｓ（
ｐＨ８．０）を用いて最終洗浄した。

【００８０】捕捉されたプライマーオリゴヌクレオチド（すなわち、プライマー−アンプリ
コン）を、分離実験において同時かつ連続の両方で放出した。手順は、放出緩衝
液中に含まれる鎖置換オリゴヌクレオチドの数以外は、同じであった。上流のレ
ザーバーに対して、１ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、
および５μＭ鎖置換オリゴヌクレオチド（表３を参照のこと）を添加した。下
流のレザーバーは、同じ緩衝液中に６０〜４００ｂｐのＣＸＲ蛍光ラダー（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）を含んだ。電極を、２つのレザーバーと接続し、そして置換溶液を
、電気運動によって固定領域上をわたって下流のレザーバーに移動させた。任意
の置換プライマー−アンプリコンを、サイズラダー（ｓｉｚｉｎｇｌａｄｄｅ
ｒ）を含むプールに結合させた。鎖置換オリゴヌクレオチドを１つずつ添加した
後、チャネルを、１ｍＭＭｇＣｌ₂、５０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）で洗
浄し、そしてレザーバーの中の緩衝液を、各放出の間に交換した。鎖置換オリゴ
ヌクレオチドの導入の順序は、配列番号１４、１０、１８、次いで６であった。

【００８１】次いで、この溶液を、米国特許第５，５７０，０１５号に記載されるように、
ポリメチルメタクリレート基質中、微量チャネルにおけるキャピラリー電気泳動
によって分析した。電気泳動図において、プライマー−アンプリコンに関するピ
ークを、サイズラダーによって確認したように、予想した時間に観察した。同時
放出を伴なうサンプルに関する電気泳動図を、図２に示し、そして単一放出を伴
なう連続サンプルに関する電気泳動図を、図３に示す。

【００８２】（表３）

【００８３】

【表３】（実施例４） βアクチン遺伝子の２９０ｂｐ領域のサイクル配列決定反応の生成物の多重鎖
置換を、実施し、そして、市販のＤＮＡシークエンサーにおいてこの置換された
プライマー／伸長プライマーを配列決定することによって確認した。２つの型の
捕捉オリゴヌクレオチド構造をまた、比較した。

【００８４】微量流体デバイス、ＢＡＢの調製物および固定、ならびにアビジン処理は、実
施例３に記載されるものであった。本実験においてストレプトアビジンをアビジ
ンと置換していたことに注意すること。

【００８５】 βアクチン遺伝子の２９０ｂｐ領域のサイクル配列決定反応を、配列決定プラ
イマーとしてプライマーオリゴヌクレオチド（配列番号１９）、およびテンプレ
ートとしてＰＣＲ産物を用いて実施した。この反応は、標準的なプロトコールに
従って、９．６ｐｍｏｌの配列決定プライマーおよび４０％（容量）のＢｉｇ
ＤｙｅＲｅａｄｙＭｉｘを用いて実施した。サイクル反応の後、８．５μＬ
のアリコートを０．７５μＬの４ＭＮａＣｌおよび０．７５μＬの５μＭ捕捉
オリゴヌクレオチドと合わせた。２つの捕捉オリゴヌクレオチド（配列番号２０
（これは、捕捉配列と置換開始配列との間にスペーサー部分を有する）、および
配列番号２１（これは、ビオチンと捕捉配列との間にスペーサー部分を有する）
）を使用した。この溶液を、９５℃に５分間加熱し、そして室温で１時間冷却し
た。捕捉オリゴヌクレオチド／サイクル配列決定された産物の複合体を、実施例
３に記載されるようにチャネル中に捕捉した。

【００８６】サイクル配列決定産物の放出は、１×ＴＥ溶液を９５℃まで加熱し、この溶液
を、チャネルを介して通過させ、そしてこの溶液を収集することによって実施し
た。

【００８７】この溶液を、ＡＢＩ３１０ＤＮＡシークエンサーにおいて（標準的な操作
手順に従って、ＰＯＰ−６マトリックスを有する４７ｃｍ長の５０μｍキャピラ
リー中で）サイクル配列決定産物に関して分析した。全長の配列決定産物を、配
列番号２０を捕捉オリゴヌクレオチドとして使用した場合に得た。

【００８８】上記の結果から、本方法が、多数の事象のスコア付けにおいて、確実かつ正確
な様式で卓越した汎用性を提供することは、明らかである。識別子のレパートリ
ーを伴って個々に放出され得る種々のオリゴヌクレオチドの組み合わせを使用す
ることにより、同業者は、種々のオリゴヌクレオチド数とともに識別子の数を増
加させることができ、これにより、単純な分析方法をなお可能にしたままで、ス
コア付けされ得る個々の事象の数を大きく増加させ得る。１つの決定においてア
ッセイされなければならない分子の数は、決定される事象の全数の一部分にしか
すぎないので、当業者は、識別子間の実質的な区別を提供することができ、これ
より、この事象のスコア付けにおける信頼度および正確度を増強する。

【００８９】本明細書中に記載されるすべての刊行物および特許出願は、本発明に関連する
分野の当業者の技術水準を示す。すべての刊行物および特許出願は、各個々の刊
行物または特許出願が参考として援用されると具体的かつ個別に示されたのと同
じ程度まで、本明細書中で参考として援用される。

【００９０】上記の発明は、明確な理解を目的として例示および例によっていくらか詳細に
記載されたが、添付の特許請求の範囲の精神および範囲から逸脱しないで、特定
の変更および改変が、本発明になされ得ることが、本発明の教示より当業者に容
易に理解される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、識別子および捕捉配列によって差別化された多重化したプライマーの
セットを示す。

【図２】図２は、鎖置換によって同時に放出された４プレックス（ｆｏｕｒ−ｐｌｅｘ
）混合物の電気泳動図を示す。

【図３】図３Ａ〜３Ｄは、鎖置換によって独立に放出された同じ４プレックス（ｆｏｕ
ｒ−ｐｌｅｘ）混合物の連続した電気泳動図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者イナンダー，アニタアメリカ合衆国カリフォルニア 94086，サニーベイル，グレシャムアベニュー 527 (72)発明者ウルマン，エドウィンエフ．アメリカ合衆国カリフォルニア 94027，アザートン，セルバイレーン 135 (72)発明者カオ，リチンアメリカ合衆国カリフォルニア 95051，サンタクララ，クラマスアベニューナンバー７ 2006 (72)発明者アルバグリ，デイビッドアメリカ合衆国カリフォルニア 94030，ミルブラエ，ヒルクレストブールバード 1155 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA20 CA01 CA11 HA19 4B063 QA13 QA18 QQ41 QQ42 QR08 QR31 QR32 QR42 QR62 QS03 QS16 QS34 QS36 QX02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】改変プライマー試薬が捕捉され、そして選択的に放出される
標的核酸の多重決定を行うための方法であって、各プライマー試薬は、標的にハ
イブリダイズするための第１配列、および捕捉のための第２配列を含み、捕捉試
薬は、該第２配列の各々に相同な配列を含み、そして置換試薬は、該捕捉配列の
各々に相同な核酸配列を含み、そしてここで改変試薬系は、標的核酸に結合した
プライマー試薬を改変するために使用され、該方法は、以下：標的核酸を、異なる第１配列のための異なる第２配列を含む複数の該プライマ
ー試薬と、アッセイ混合物中で該改変試薬系の存在下でハイブリダイズする条件
下で組合わせ、それによって標的核酸に結合したプライマー試薬が改変される、
工程；改変されたプライマー試薬を、１つの部位で該捕捉試薬と組合わせ、それによ
って改変されたプライマー試薬は、該アッセイ混合物中の他の成分から分離され
る、工程；該置換試薬を用いて該捕捉された改変プライマー試薬を順次放出する工程；お
よび該改変プライマー試薬を決定する工程、を包含する、方法。
【請求項２】前記改変試薬系が配列決定反応系である、請求項１に記載の
方法。
【請求項３】前記多重決定が、前記標的核酸における１塩基位置の多重遺
伝子型決定である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】試薬の組合わせを使用して、標的核酸の多重決定を行うため
の方法であって、該試薬の組合わせは、（１）プライマーオリゴヌクレオチドの
混合物を含むプライマー試薬であって、該プライマーオリゴヌクレオチドの各々
は、（ａ）標的核酸配列に相同な独特のプライマー第１部分配列、（ｂ）捕捉配
列に相同な配列を有するプライマー第２部分配列を有し、該プライマー試薬は、
複数の第２部分配列を含むが、但し、各々の該第２部分配列がプライマーオリゴ
ヌクレオチドの群内で独特である場合、必要に応じて該第１部分は、該プライマ
ー第１部分配列およびプライマー第２部分配列として役立つ、プライマー試薬；
（２）該プライマーオリゴヌクレオチドを隔離するための捕捉試薬であって、各
々が、プライマー第２部分配列に相同な捕捉配列を有する複数の捕捉オリゴヌク
レオチドを含む、捕捉試薬；ならびに（３）鎖置換試薬であって、各々が、該プ
ライマーオリゴヌクレオチドの置換のための、異なる該捕捉オリゴヌクレオチド
に相同な配列を有する鎖置換オリゴヌクレオチドを含む、鎖置換試薬を含み；該
方法は、以下の工程：（ａ）該標的核酸と該プライマー試薬とをハイブリダイズする条件下で組合わせ
、それによって該プライマーオリゴヌクレオチドは、該標的内に存在する相同な
配列にハイブリダイズして、プライマー二重鎖を形成する、工程；（ｂ）該プライマー二重鎖における該プライマーオリゴヌクレオチドを酵素学的
に改変し、該プライマーオリゴヌクレオチドを少なくとも１ヌクレオチド変化さ
せて、改変プライマーオリゴヌクレオチドを産生する、工程；（ｃ）該捕捉オリゴヌクレオチドを用いて、該改変プライマーオリゴヌクレオチ
ドを隔離する工程；（ｄ）鎖置換条件下で、鎖置換試薬を添加し、それによってプライマーオリゴヌ
クレオチドが、隔離部分から放出されて、共通の捕捉配列を有する改変プライマ
ーの混合物を含む分離された部分を提供する工程であって、該共通の捕捉配列は
また、該添加された鎖置換試薬に共通である、工程；ならびに（ｅ）改変プライマーの該分離された部分をアッセイし、該多重決定を提供する
、工程、を包含する、方法。
【請求項５】工程（ｄ）および（ｅ）が、各工程（ｄ）において異なる前
記鎖置換試薬を使用して複数回繰り返される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】請求項５に記載の方法であって、工程（ｂ）に続いて、該方
法は、以下のさらなる工程：前記プライマー二重鎖を変性させる工程；および工程（ａ）、（ｂ）、および変性させてさらなる改変プライマー配列を産生す
る工程を繰り返す工程、を包含する、方法。
【請求項７】試薬の組合わせを使用して、標的ＤＮＡの多重決定を行うた
めの方法であって、該試薬の組合せは：（１）プライマーオリゴヌクレオチドの
混合物を含むプライマー試薬であって、該プライマーオリゴヌクレオチドの各々
は、（ａ）標的核酸配列に相同な独特のプライマー第１部分配列、（ｂ）捕捉配
列に相同な配列を有するプライマー第２部分配列を有し、該プライマー試薬は、
複数の第２部分配列を含むが、但し、該第２部分配列の各々が、プライマーオリ
ゴヌクレオチドの群内で独特である場合、必要に応じて該第１部分は、プライマ
ー第１部分配列およびプライマー第２部分配列として役立つ、プライマー試薬；
（２）該プライマーオリゴヌクレオチドを隔離するための捕捉試薬であって、複
数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、該捕捉オリゴヌクレオチドは、（ａ）プラ
イマー第２部分配列に相同な捕捉第１部分配列、および（ｂ）鎖置換オリゴヌク
レオチドの一部に相同な捕捉第２部分配列を有する、捕捉試薬；ならびに（３）
鎖置換試薬であって、各々が、該プライマーオリゴヌクレオチドの置換のための
、異なる該捕捉オリゴヌクレオチドに相同な配列を有する鎖置換オリゴヌクレオ
チドを含む、鎖置換試薬を含み、該方法は以下の工程：（ａ）該標的ＤＮＡと該プライマー試薬とをハイブリダイズする条件下で組合わ
せ、それによって、該プライマーオリゴヌクレオチドが、該標的内に存在する相
同な配列にハイブリダイズして、プライマー二重鎖を形成する、工程；（ｂ）該プライマー二重鎖における該プライマーオリゴヌクレオチドを酵素学的
に改変して、該プライマーオリゴヌクレオチドを少なくとも１ヌクレオチド変化
させて、改変プライマーオリゴヌクレオチドを産生する、工程；（ｃ）該改変プライマーオリゴヌクレオチドを、該捕捉オリゴヌクレオチドを用
いて隔離する工程；（ｄ）鎖置換条件下で、鎖置換試薬を添加し、それによって、プライマーオリゴ
ヌクレオチドが、隔離定部分から放出されて、共通の捕捉配列を有する改変プラ
イマーの混合物を含む分離された部分を提供する、工程；（ｅ）該鎖置換試薬のすべてが添加されるまで、工程（ｄ）を繰り返す工程；な
らびに（ｆ）改変プライマーの該分離された部分をアッセイして、該多重決定を提供す
る工程、を包含する、方法。
【請求項８】前記アッセイ方法が電気泳動である、請求項７に記載の方法
。
【請求項９】請求項７に記載の方法であって、支持体と前記捕捉オリゴヌ
クレオチドとを連結する前に、該捕捉オリゴヌクレオチドが、前記改変プライマ
ーオリゴヌクレオチドと組み合わされて、プライマー／捕捉二重鎖を形成する、
方法。
【請求項１０】前記捕捉オリゴヌクレオチドが、前記改変プライマーオリ
ゴヌクレオチドと組み合わされる前に支持体に連結される、請求項７に記載の方
法。
【請求項１１】前記プライマーオリゴヌクレオチドが、各々の該プライマ
ーオリゴヌクレオチドに特異的な識別部分を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】前記プライマーオリゴヌクレオチドの改変が、少なくとも
１ヌクレオチドの伸長である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】請求項１２に記載の方法であって、前記伸長が、４つの異
なる容器内で行われ、各容器は異なる終結ヌクレオチドおよび少なくとも１つの
前記プライマー試薬を有し、そして該終結ヌクレオチドは該伸長されたプライマ
ーの終結ヌクレオチドを同定するために標識される、方法。
【請求項１４】試薬の組合わせを使用して、１つの位置で約５０より大き
い多数の遺伝子型を決定するための標的ＤＮＡの多重決定を行うための方法であ
って、該試薬の組合せは、：（１）プライマーオリゴヌクレオチドの混合物を含
むプライマー試薬であって、該プライマーオリゴヌクレオチドの各々は（ａ）標
的核酸配列に相同な独特のプライマー第１部分配列であって、ここで３’末端ヌ
クレオチドが、目的の１塩基位置に直接隣接する、配列；（ｂ）捕捉配列に相同
なプライマー第２部分配列；および（ｃ）該プライマーオリゴヌクレオチドを同
定する識別部分を有し、ここで該プライマーオリゴヌクレオチドが複数の異なる
プライマー第２部分配列を有する、プライマー試薬；（２）該プライマーオリゴ
ヌクレオチドを隔離するための捕捉試薬であって、複数の捕捉オリゴヌクレオチ
ドを含み、該捕捉オリゴヌクレオチドは、（ａ）該プライマー第２部分配列に相
同な捕捉第１部分配列、および（ｂ）鎖置換オリゴヌクレオチドの一部に相同な
捕捉第２部分配列を有する、捕捉試薬；ならびに（３）鎖置換試薬であって、各
々が、該プライマーオリゴヌクレオチドの置換のための異なる該捕捉オリゴヌク
レオチドに相同な配列を有する鎖置換オリゴヌクレオチドを含む、鎖置換試薬で
を含み；該方法は以下：（ａ）該標的ＤＮＡと該プライマー試薬とをハイブリダイズする条件下で組み合
わせ、それによって該プライマーオリゴヌクレオチドが、該標的ＤＮＡ内に存在
する相同な配列にハイブリダイズして、プライマー二重鎖を形成する工程；（ｂ）ポリメラーゼを用いて、該プライマー二重鎖における該プライマーオリゴ
ヌクレオチドを伸長させ、１つの終結ヌクレオチドを、該プライマーオリゴヌク
レオチドに添加して、伸長したプライマー配列を形成する工程；（ｃ）該伸長したプライマー配列を相同な配列から解離させる工程；（ｄ）工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を繰り返し、さらなる伸長したプライマ
ー配列を産生する、工程；（ｅ）該捕捉オリゴヌクレオチドを用いて該伸長したプライマー配列を隔離する
工程；（ｆ）鎖置換試薬を、鎖置換条件下で添加し、それによってプライマーオリゴヌ
クレオチドが、隔離部分から放出されて、共通の捕捉配列を有する伸長したプラ
イマーの混合物の分離された部分を提供する工程；（ｇ）該鎖置換試薬の全てが添加されるまで、工程（ｆ）を繰り返す工程；なら
びに（ｈ）伸長したプライマーの該分離された部分をアッセイし、該遺伝子型の決定
を提供する工程を包含する、方法。
【請求項１５】請求項１４に記載の方法であって、ここで前記伸長は、４
つの異なる容器内で行われ、各容器は、異なる終結ヌクレオチドおよび少なくと
も１つの前記プライマー試薬を有し、そして該終結ヌクレオチドは、該終結ヌク
レオチドを同定するために標識される、方法。
【請求項１６】請求項１４に記載の方法であって、ここで該伸長が、４つ
の異なる終結ヌクレオチドを有する１つの容器内で行われ、各終結ヌクレオチド
は該終結ヌクレオチドを同定するために異なる標識で標識される、方法。
【請求項１７】前記識別子が電気泳動分離のための移動度タグである、請
求項１４に記載の方法。
【請求項１８】前記遺伝子型が、試験される各１位置について二本鎖標的
の両方の鎖で決定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】試薬の組合わせを使用して、少なくとも約５ｋｂフラグメ
ントを含む標的ＤＮＡの多重配列決定を行うための方法であって、該試薬の組合
せは、（１）プライマーオリゴヌクレオチドの混合物を含むプライマー試薬であ
って、該プライマーオリゴヌクレオチドの各々が（ａ）標的核酸配列に相同な独
特のプライマー第１部分配列、および（ｂ）捕捉配列に相同なプライマー第２部
分配列を有し、該プライマーオリゴヌクレオチドは、複数の第２部分配列を含む
が、但し、必要に応じて、該第１部分は、該プライマー第１部分およびプライマ
ー第２部分として役立つ、プライマー試薬；（２）該プライマーオリゴヌクレオ
チドを隔離するための捕捉試薬であって、複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み
、該オリゴヌクレオチドは（ａ）該プライマー第２部分配列に相同な捕捉第１部
分配列、および（ｂ）鎖置換オリゴヌクレオチドの一部に相同な捕捉第２部分配
列を有する、捕捉試薬；ならびに（３）鎖置換試薬であって、各々が、該プライ
マーオリゴヌクレオチドの置換のための異なる該捕捉オリゴヌクレオチドに相同
な配列を有する鎖置換オリゴヌクレオチドを含む、鎖置換試薬；ならびに（４）
鋳型依存性伸長ターミネーターを含み、該方法は、以下の工程：（ａ）該標的ＤＮＡと該プライマー試薬とをハイブリダイズする条件下で組合わ
せ、それによって、該プライマーオリゴヌクレオチドが、該標的ＤＮＡ内に存在
する相同な配列にハイブリダイズして、プライマー二重鎖を形成する工程；（ｂ）ｄＮＴＰおよび少なくとも１つのターミネーターヌクレオチドの存在下で
、ポリメラーゼを用して、該プライマー二重鎖における該プライマーオリゴヌク
レオチドを伸長して、該ｄＮＴＰおよび該少なくとも１つのターミネーターヌク
レオチドを、該プライマーオリゴヌクレオチドに添加して、該ＤＮＡ標的配列に
相補的な配列を有する該プライマーオリゴヌクレオチドを伸長させ、伸長したプ
ライマー配列を形成するが、但し、該伸長工程は、４つの異なるターミネーター
ヌクレオチドを同じ容器または異なる容器に含む、工程；（ｃ）該伸長したプライマー配列を相同な配列から解離させる工程；（ｄ）工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を繰り返して、さらなる伸長したプライ
マー配列を産生する、工程；（ｅ）該捕捉オリゴヌクレオチドを用いて、該伸長したプライマー配列を隔離す
る工程；（ｆ）該鎖置換試薬を、鎖置換条件下で順次添加し、それによってプライマーオ
リゴヌクレオチドが隔離部分から放出されて、共通の捕捉配列を有する異なる長
さの伸長したプライマーの混合物の分離された部分を提供する工程；ならびに（ｇ）伸長したプライマーの該分離された部分をアッセイして、該標的ＤＮＡの
配列を決定する、工程、を包含する、方法。
【請求項２０】前記標的ＤＮＡが１つの連続するＤＮＡ鎖に由来する、請
求項１９に記載の方法。
【請求項２１】前記標的ＤＮＡが少なくとも２つの別のＤＮＡ鎖に由来す
る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】請求項１９に記載の方法であって、ここで前記伸長工程が
、４つの異なる容器内で行われ、各容器が、異なる終結ヌクレオチドおよび１つ
の前記プライマー試薬を有するか、または該終結ヌクレオチドが該終結ヌクレオ
チドを同定するために標識される、方法。
【請求項２３】請求項１９に記載の方法であって、前記伸長工程が、４つ
の異なる終結ヌクレオチドを有する１つの容器内で行われ、各終結ヌクレオチド
は、該終結ヌクレオチドを同定するために異なる標識で標識される、方法。
【請求項２４】試薬の組合わせを使用して、標的ＤＮＡを多重配列決定す
るための方法であって、該試薬の組合せは、（１）複数のプライマーオリゴヌク
レオチドを含むプライマー試薬であって、該プライマーオリゴヌクレオチドの各
々が、（ａ）標的核酸配列に相同な独特のプライマー第１部分配列を有し、該プ
ライマー第１部分配列が、捕捉配列としても役立つ、プライマー試薬；（２）該
プライマーオリゴヌクレオチドを隔離するための捕捉試薬であって、該捕捉試薬
は、複数の捕捉オリゴヌクレオチドを有し、該複数のオリゴヌクレオチドは（ａ
）該プライマー第１部分配列に相同な捕捉第１部分配列、および（ｂ）鎖置換オ
リゴヌクレオチドの一部に相同な捕捉第２部分配列を有し、そして（ｃ）隔離部
分に連結されている、捕捉試薬；（３）鎖置換試薬であって、各々は、該プライ
マーオリゴヌクレオチドの置換のための異なる該捕捉オリゴヌクレオチドに相同
な配列を有する鎖置換オリゴヌクレオチドを含む、鎖置換試薬；ならびに（４）
鋳型依存性伸長ターミネーターを含むが、但し、該プライマーオリゴヌクレオチ
ドまたは該伸長ターミネーターの一方は、検出可能な標識で標識されており、該
方法は、以下の工程：（ａ）該標的ＤＮＡ、該プライマー試薬および該鋳型依存性伸長ターミネーター
を、ハイブリダイゼーションおよび鎖伸長のための条件下で組合わせ、それによ
って、該プライマーオリゴヌクレオチドは、該標的ＤＮＡにハイブリダイズし、
そして該標的ＤＮＡに沿って伸長して、該標的ＤＮＡにハイブリダイズした伸長
したプライマーを形成する、工程；（ｂ）該伸長したプライマーを、該標的ＤＮＡから解離させる工程；（ｃ）該組合わせる工程および解離する工程を繰り返して、該標的ＤＮＡの隔離
のために十分な数の伸長したプライマーを提供する、工程；（ｄ）該捕捉オリゴヌクレオチドを用いて該伸長したプライマー配列を隔離する
工程；（ｅ）該鎖置換試薬を、鎖置換条件下で順次添加して、それによって、該鎖置換
オリゴヌクレオチドに対応する該伸長したプライマーが、該隔離部分とは別の部
分において放出される工程；ならびに（ｆ）該伸長プライマーの分離された部分をアッセイして、該多重配列決定を提
供する工程、を包含する、方法。
【請求項２５】隔離された成分を備えたキットであって、該成分は、プラ
イマー試薬および捕捉試薬の各々少なくとも１つ、ならびに鎖置換試薬のセット
を含み、ここで：（１）該プライマー試薬は、プライマーオリゴヌクレオチドの
混合物を含み、該プライマーオリゴヌクレオチドの各々は（ａ）標的核酸配列に
相同な独特のプライマー第１部分配列、（ｂ）捕捉配列に相同な配列を有するプ
ライマー第２部分配列を有し、該プライマー試薬は、複数の第２部分配列を含む
が、但し、該第２部分配列が、プライマーオリゴヌクレオチドの群内で独特であ
る場合、必要に応じて該第１部分は、該プライマー第１部分配列およびプライマ
ー第２部分配列として役立ち；（２）該捕捉試薬は、該プライマーオリゴヌクレ
オチドを隔離するために役立ち、各々が、該プライマー第２部分配列に相同な捕
捉配列を有する複数の捕捉オリゴヌクレオチドを含み、そして（３）該鎖置換試
薬は、各々が、該プライマーオリゴヌクレオチドの置換のために、異なる該捕捉
オリゴヌクレオチドに相同な配列を有する鎖置換オリゴヌクレオチドを含む、キ
ット。
【請求項２６】前記捕捉オリゴヌクレオチドがさらに、前記鎖置換オリゴ
ヌクレオチドの一部に相同な捕捉第２部分配列を含む、請求項２５に記載のキッ
ト。
【請求項２７】さらに、（４）微量流体デバイスを含み、ここで前記隔離
する工程が、該微量流体デバイス内で行われる、請求項２５に記載のキット。
【請求項２８】前記プライマー試薬が、別の容器内での使用のための４つ
の異なる識別子を有する４つの別の容器内に提供される、請求項２５に記載のキ
ット。
【請求項２９】前記プライマーオリゴヌクレオチドが、各プライマーオリ
ゴヌクレオチドに特異的な識別部分を含む、請求項２５に記載のキット。