CN107532205B - 模板的表面连环化 - Google Patents

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Abstract

本文中呈现了用于在桥接扩增过程期间串联模板链的方法和组合物。所述方法可用于以改善的密度进行表面扩增。本文中提供的方法和组合物实现簇的创建，所述簇是较亮的，但是与目前使用标准簇扩增实现的密度为相同的密度。

Description

模板的表面连环化
发明背景
对人遗传变异编目录并且将此变异与对疾病的易感性相关联的任务是艰巨且昂贵的。此成本的大幅降低对于促进对健康和疾病的理解是必要的。测序成本的降低将需要该领域中的许多技术进步。可以降低基因组分析成本的技术进步包括：(1)文库生成；(2)高度并行克隆扩增和分析；(3)稳健循环测序生物化学的开发；(4)超快成像技术的开发；和(5)用于从短读段的序列组装的算法的开发。
以高度并行的方式创建克隆扩增对于划算的测序是重要的。通常对传统上由从挑选个别细菌菌落培养的质粒制备的DNA分子的克隆群体进行测序。在人基因组计划中，将每个克隆单独挑出，培养，并从克隆中提取或扩增出DNA。近年来，已经有了许多创新来实现DNA克隆的高度并行化分析，特别是使用基于阵列的方法。在最简单的方法中，可以在单分子水平上分析文库，所述单分子水平就其本质而言是克隆的。单分子测序的主要优点是循环测序可以异步发生，因为分别读出每个分子。相比之下，对克隆扩增的分析需要每个测序循环的近定量完成，否则背景噪声随着每个随后的循环逐渐增加，严重限制读段长度。因此，克隆分析对测序生物化学的稳健性(robustness)造成较大的负担，并且可能潜在地限制读段长度。
因此，需要开发改善基因组学分析的方法并提供更划算的序列分析方法。本发明满足了此需要并且也提供了相关的优点。
发明概述
本文中提供的方法和组合物使得能够以改善的密度进行表面扩增。本文中描述了在桥接扩增过程期间串联模板链的方法，使得每个流动池表面引物可以以延伸到其上的模板链的多个拷贝结束。本文中提供的方法和组合物使得能够创建簇，所述簇是较亮的，但与当前使用标准簇扩增实现的密度为相同的密度。较亮的簇可以具有许多优点，例如，较好的读段质量、支持较长的读段长度、较快的测序扫描时间、和增加的系统稳健性。
本文中呈现了制备用于核酸测序反应的固定化模板的方法，所述方法包括：(a)提供固体支持物，所述固体支持物具有在其上固定的正向和反向扩增引物；(b)提供靶核酸，其中所述靶核酸包含：(i)与所述正向扩增引物互补的已知序列的第一区域；(ii)第一模板区；(iii)与所述反向扩增引物基本上相同的已知序列的第二区域，其中所述第一模板区在所述已知序列的第一区域和所述已知序列的第二区域之间；和(iv)与所述正向扩增引物互补的已知序列的第三区域，其中所述第一模板区和所述已知序列的第二区域在所述已知序列的第一区域和所述已知序列的第三区域之间；(c)在适合于杂交的条件下将所述靶核酸应用于所述固体支持物，从而所述已知序列的第一区域与所述正向扩增引物杂交；并且(d)延伸杂交的正向扩增引物以产生包含所述靶核酸的互补拷贝的固定化模板。
在一些实施方案中，所述方法还可以包括：(e)使来自所述固定化模板的所述靶核酸变性；(f)使所述固定化模板与所述反向扩增引物杂交，从而第二侧翼序列的互补拷贝与所述反向扩增引物杂交；并且(g)延伸杂交的反向扩增引物以产生第二固定化链，所述第二固定化链包含位于所述已知序列的第一区域和所述已知序列的第二区域之间的第一模板区域。
在一些实施方案中，所述方法还可以包括：(h)使来自所述第一固定化模板的所述第二固定化链变性；(i)使所述第二固定化链与所述第一固定化模板杂交，从而所述第二固定化链的所述已知序列的第一区域与所述固定化模板中的所述已知序列的第一区域的互补拷贝杂交；(j)延伸所述已知序列的第一区域的3’OH以产生所述第二固定化链的多联体；并且(k)延伸所述已知序列的第一区域的互补拷贝的3’OH以产生所述第一固定化模板的多联体。
在一些实施方案中，所述方法还可以包括：(l)使所述多联体变性并且重复步骤(i)、(j)和(k)以产生每条链的进一步的多联体。
在上述实施方案的一些方面中，正向扩增引物可以包含正向互补性区，所述正向互补性区与所述反向扩增引物的反向互补性区具有互补性。
在一些方面中，第一互补性区直接位于与所述靶核酸的所述已知序列的第一区域具有互补性的区域的5’。
在一些方面中，反向互补性区直接位于与所述靶核酸的所述已知序列的第二区域具有基本上相同的序列的区域的5’。
在一些方面中，正向互补性区和第二互补性区配置为使得杂交和延伸的重复循环产生所述第一固定化链的多联体，所述多联体中的每个拷贝与接着的拷贝通过来自所述正向互补性区的序列分开。
在一些方面中，正向互补性区和第二互补性区配置为使得杂交和延伸的重复循环产生所述第二固定化链的多联体，所述多联体中的每个拷贝与接着的拷贝通过来自所述反向互补性区的序列分开。
在一些方面中，多联体包含至少10、20、50、100、200、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或至少10,000个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
在一些方面中，固体支持物是平面的。在一些方面中，固体支持物包含微孔。
在一些方面中，靶核酸具有至少10、20、50、100、200或至少500个核苷酸的长度。
在一些方面中，靶核酸还包含与所述反向扩增引物基本上相同的已知序列的第四区域，其中所述已知序列的第一区域、所述第一模板区和所述已知序列的第二区域在所述已知序列的第三区域和所述已知序列的第四区域之间。
在一些方面中，正向扩增引物包含非核苷酸化学接头部分，所述非核苷酸化学接头部分定位为防止作为所述非核苷酸化学接头部分的5’的任何核苷酸的复制。在一些方面中，反向扩增引物包含非核苷酸化学接头部分，所述非核苷酸化学接头部分定位为防止作为所述非核苷酸化学接头部分的5’的任何核苷酸的复制。在任何上述实施方案的方面中，非核苷酸化学接头部分可以包含二醇部分。在一些方面中，非核苷酸化学接头部分包含将所述引物栓系到所述固体支持物的非核苷酸接头。
在一些实施方案中，方法还可以包括对所述靶核酸测序。例如，在一些方面中，对所述靶核酸测序包括：使一个或多个测序引物与所述第一固定化模板或所述第二固定化链杂交；通过将一个或多个标记的核苷酸掺入新生链中来延伸所述测序引物；并且检测所述标记的核苷酸，从而获得关于所述靶核酸的序列信息。
在一些实施方案中，通过用配置为具有结合部分的引物对扩增来制备所述靶核酸，从而能将使用所述引物对产生的扩增产物的一条链与相反链分开。在一些方面中，结合部分包含生物素，并且可以通过结合包含链霉亲合素的固体支持物分开。
一个或多个实施方案的细节在附图和下面的描述中阐述。其它特征、目的和优点将从描述和附图以及权利要求书中是显而易见。
附图简述
图1是显示根据一个实施方案的固相扩增的示意图。
图2是显示用于固相扩增的备选文库构建体的示意图。
图3是显示根据一个实施方案的固相扩增的示意图。
图4A是与本文中呈现的一个实施方案相比，根据标准方案的扩增簇的荧光显微镜图像。
图4B是来自图4A中描述的流动池的簇数目对SYBR信号强度的图。
图5是将荧光核苷酸C、T和G掺入根据标准方案或根据本文中呈现的一个实施方案扩增的簇中的一组荧光图像。
图6显示了根据标准方案或根据本文中呈现的一个实施方案扩增的簇的荧光图像(顶部)和直方图(底部)。
图7显示了各种扩增方案的簇强度和大小的比较。
图8显示了在含有多联体的表面簇(surface concatemer-containing cluster)对标准簇中在100个循环内的信号强度的比较。
发明详述
用于核酸模板表面扩增(“聚簇(clustering)”)的标准技术已经在典型的流动池上实现了非常高的密度(500-600k/mm2)。然而，仍然需要改善的用于核酸模板的表面扩增的方法。本文中提供的方法和组合物使得能够以改善的密度进行表面扩增。本文中描述了用于在桥接扩增过程期间串联模板链的方法，使得每个流动池表面引物可以以延伸到其上的模板链的多个拷贝结束。本文中提供的方法和组合物使得能够创建簇，所述簇是较亮的，但与当前使用标准簇扩增实现的密度为相同的密度。较亮的簇可以具有许多优点，例如，较好的读段质量、支持较长的读段长度、较快的测序扫描时间、和升高的系统稳健性。
图1中例示了一个实施方案，其阐述了形成靶核酸的多联体的方法。如图1的框示部分中所示，提供固体支持物，在其上固定有多个正向和反向扩增引物，图中指定为P5和P7。还提供靶核酸，其具有与P5引物互补的已知序列的第一区域(P5’)、与反向扩增引物(P7)基本上相同的已知序列的第二区域和与P5引物互补的已知序列的第三区域(P5’)。第一模板区域位于已知序列的第一(P5’)和第二(P7)区域之间。在适合于杂交的条件下将靶核酸应用于固体支持物，使得P5’序列与固定化引物的P5序列杂交。在有利于延伸的条件下扩增引物，例如在存在DNA聚合酶和dNTP的情况下。得到的延伸产物是包含靶核酸的互补拷贝的固定化模板，如图1中在第一次延伸后所示。
进一步的桥接扩增轮次可以包括使来自固定化模板的靶核酸变性，并允许固定化模板与反向扩增引物杂交。在图1中所示的例子中，第二已知序列的互补拷贝(P7’)与反向引物(P7)杂交，并在上述延伸条件下延伸。所产生的延伸产物是第二固定化链，其包含位于已知序列的第一区域和已知序列的第二区域之间的第一模板区域，如图1中在第二次延伸后所示。变性、杂交和延伸的后续循环允许该过程继续，使得第二固定化链可以与第一固定化模板杂交，并且将第二固定化链和/或第一固定化模板的3’OH之一或两者延伸以产生进一步的延伸产物。源自这些额外循环的进一步的延伸产物是第二固定化链和/或第一固定化模板之一或两者的多联体，如图1中在下一循环后所示。多联体可以包含位于已知序列之间的模板区(或其互补物)的2或更多个拷贝。在一些实施方案中，多联体可以包括位于已知序列之间的模板区(或其互补物)的2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、200、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或超过10,000个拷贝。在扩增轮次后，可以将溶液中的测序引物与已知序列的区域杂交并延伸。测序引物将与相同固定化链和/或固定化模板上的多个位置杂交。因此，多个测序反应可以在同一条链上发生，导致相对于先前方法(其中每条链仅产生一个信号)大大放大的信号。
如本文中所用，术语“多联体”是指长连续核酸分子，其含有串联连接的相同序列的多个拷贝。多个拷贝可以通过其它序列分开，例如通过在3’和/或5’端的连环化序列(concatemerized sequence)侧翼的已知序列分开。可以在连环化序列之间散布任意数目的侧翼序列。在一些实施方案中，多联体在单个多联体上可以包含模板区(或其互补物)的2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、200、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000个拷贝。在一些实施方案中，多联体可以包含已知序列的2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、200、500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或大于10,000个拷贝，其以重复方式位于已知序列的拷贝之间。在下面的实施例1中阐述了此实施方案的进一步的例示。
图2显示了备选的实施方案，其中提供了与靶核酸互补的链。这可以自然导致其中以双链形式提供靶核酸的实施方案。如图2所示，相反链与反向扩增引物杂交并得到延伸。然而，与图1所示的实施方案相反，产生了靶核酸的单拷贝。如图2所示，进一步的扩增循环不会产生多联体。为了避免此结果，可以产生备选的文库构建体，其在双链构建体的3’端和5’端两者上包含第一和第二已知区域两者，如图2所示。顶部链或底部链的扩增将以类似于图1所示的方式产生多联体。
图3显示了另一个实施方案，其中正向和反向扩增引物包含位于与已知序列杂交的序列的5’的额外序列。在一些实施方案中，正向引物的额外序列与反向引物的额外序列互补。例如，如图3所示，表面引物包含位于P5和P7序列(称为20T-P7和20A-P5)的5’的寡聚物dA和寡聚物dT序列。因此，在第一个延伸循环后，固定化模板包括在模板的5’端固定化的互补性序列(20聚体A)，如图1中在第一次延伸后所示。在随后的延伸后，所得到的拷贝包含在复制链的5’端和再次在延伸产物的3’端固定化的互补性序列的互补物(20聚体T)。随着发生进一步的扩增轮次，在已知序列(例如P5和P7)侧翼串联掺入互补性序列，如图3所示。在下面的实施例2中阐述了此实施方案的其它例示。
簇扩增
本文中描述了在桥接扩增过程期间串联模板链的方法。桥接扩增在本文中也称为“簇扩增”。在一些实施方案中，使用簇扩增方法来扩增固定化的DNA片段，如由美国专利号7,985,565和7,115,400的公开内容例示，其各自的内容通过引用整体并入本文。美国专利号7,985,565和7,115,400的并入材料描述了固相核酸扩增的方法，其允许扩增产物在固体支持物上固定化，以形成由固定化核酸分子的簇或“集落”组成的阵列。此阵列上的每个簇或集落由多个相同的固定化多核苷酸链和多个相同的固定化互补多核苷酸链形成。如此形成的阵列在本文中通常称为“簇集阵列”。固相扩增反应(如美国专利号7,985,565和7,115,400中描述)的产物是通过将固定化多核苷酸链和固定化互补链的对退火而形成的所谓“桥接”结构，这两条链都在固体支持物上在5’末端固定化，优选通过共价附着。簇扩增方法是其中使用固定化核酸模板产生固定化扩增子的方法的实例。也可以使用其它合适的方法从根据本文中提供的方法制备的固定化DNA片段产生固定化的扩增子。例如，可以通过固相PCR形成一个或多个簇或集落，无论每对扩增引物的一个引物或两个引物是否是固定化的。
在其它实施方案中，在溶液中扩增固定化的DNA片段。例如，在一些实施方案中，将固定化的DNA片段切割或以其它方式从固体支持物释放，然后扩增引物在溶液中与释放的分子杂交。在其它实施方案中，对于一个或多个初始扩增步骤，扩增引物与固定化的DNA片段杂交，，随后是溶液中随后的扩增步骤。因此，在一些实施方案中，可以使用固定化的核酸模板来产生溶液相扩增子。
应当理解，本文所述或本领域通常已知的任何扩增方法可以与通用或靶物特异性引物一起利用以扩增固定化的DNA片段。适合于扩增的方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)，如美国专利号8,003,354所述，其全部内容通过引用并入本文。可以使用上述扩增方法来扩增一种或多种感兴趣的核酸。例如，可以使用PCR，包括多重PCR、SDA、TMA、NASBA等来扩增固定化的DNA片段。在一些实施方案中，在扩增反应中包括特异性针对感兴趣的核酸的引物。
用于扩增核酸的其它合适的方法可以包括寡核苷酸延伸和连接、滚环扩增(RCA)(Lizardi et al.,Nat.Genet.19:225-232(1998)，其通过引用并入本文)和寡核苷酸连接测定法(OLA)(参见美国专利号7,582,420,5,185,243,5,679,524和5,573,907；EP 0 320308 B1；EP 0 336 731 B1；EP 0 439 182 B1；WO 90/01069；WO 89/12696；和WO 89/09835，所有这些都通过引用并入)技术。应当理解，可以设计这些扩增方法来扩增固定化的DNA片段。例如，在一些实施方案中，扩增方法可以包括连接探针扩增或寡核苷酸连接测定(OLA)反应，其含有特异性针对感兴趣的核酸的引物。在一些实施方案中，扩增方法可以包括引物延伸连接反应，其含有特异性针对感兴趣核酸的引物。作为可以特异性设计用于扩增感兴趣核酸的引物延伸和连接引物的非限制性实例，扩增可以包括用于GoldenGate测定(Illumina,Inc.,San Diego,CA)的引物，如由美国专利号7,582,420和7,611,869例示，其全部内容通过引用并入本文。
可用于本公开方法的示例性等温扩增方法包括但不限于如例如Dean et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99:5261-66(2002)例示的多重置换扩增(MDA)或由例如美国专利号6,214,587例示的等温链置换核酸扩增，每篇的全部内容通过引用并入本文。可用于本公开的其它非基于PCR的方法包括例如Walker et al.,Molecular Methods for VirusDetection,Academic Press,Inc.,1995；美国专利号5,455,166和5,130,238，以及Walkeret al.,Nucl.Acids Res.20:1691-96(1992)中描述的链置换扩增(SDA)或例如Lage etal.,Genome Research 13:294-307(2003)中描述的超分支链置换扩增，每篇的全部内容通过引用并入本文。等温扩增方法可以与链置换Phi 29聚合酶或Bst DNA聚合酶大片段，(5’→3’外切)一起用于基因组DNA的随机引物扩增。这些聚合酶的使用利用其高的持续性和链置换活性。高持续性允许聚合酶产生长度为10-20kb的片段。如上所阐述，可以在等温条件下使用具有低持续性和链置换活性的聚合酶如Klenow聚合酶来产生较小的片段。在美国专利号7,670,810的公开内容中详细阐述了扩增反应、条件和组分的其它描述，其全部内容通过引用并入本文。
在本公开中有用的另一种核酸扩增方法是加标签的PCR(Tagged PCR)，其使用具有恒定5’区，随后是随机3’区的双域引物群体，如描述于例如Grothues et al.NucleicAcids Res.21(5):1321-2(1993)，其全部内容通过引用并入本文。进行第一轮扩增以基于来自随机合成的3’区域的单独杂交允许对热变性DNA的多次启动。由于3’区域的性质，考虑启动位点在整个基因组中是随机的。此后，可以除去未结合的引物，并且可以使用与恒定5’区互补的引物发生进一步的复制。
测序方法
本文中所述的方法可结合多种核酸测序技术使用。特别适用的技术是如下那些，其中在阵列中的固定位置处附着核酸，使得它们的相对位置不改变并且其中将阵列重复成像。在不同颜色通道(例如，与用于将一种核苷酸碱基类型与另一种区分开的不同标记物一致)中获得图像的实施方案是特别适用的。在一些实施方案中，确定靶核酸的核苷酸序列的方法可以是自动化过程。优选实施方案包括合成测序(sequencing-by-synthesis)(“SBS”)技术。
SBS技术通常涉及通过对模板链反复加入核苷酸酶促延伸新生核酸链。在SBS的传统方法中，可以在每次递送中在存在聚合酶的情况下将单核苷酸单体提供给靶核苷酸。然而，在本文中所述的方法中，可以在递送中在存在聚合酶的情况下对靶核酸提供超过一类核苷酸单体。
SBS可以利用具有终止剂部分的核苷酸单体或缺少任何终止剂部分的核苷酸单体。使用缺少终止剂的核苷酸单体的方法包括例如焦磷酸测序和使用γ-磷酸标记的核苷酸的测序，如下文更为详细阐述。在使用缺乏终止剂的核苷酸单体的方法中，每个循环中添加的核苷酸数目通常是可变的，并且取决于模板序列和核苷酸递送的模式。对于利用具有终止剂部分的核苷酸单体的SBS技术，终止剂可以在使用的测序条件下是有效不可逆转的，利用双脱氧核苷酸的传统Sanger测序就是如此，或者终止剂可以是可逆的，由Solexa(现为Illumina,Inc.)开发的测序方法就是如此。
SBS技术可以利用具有标记物部分的核苷酸单体或缺乏标记物部分的核苷酸单体。因此，可以基于标记物的特性，如标记物的荧光；核苷酸单体的特征如分子量或电荷；核苷酸掺入的副产物，如焦磷酸盐的释放等来检测掺入事件。在测序试剂中存在两种或更多种不同核苷酸的实施方案中，不同的核苷酸可以彼此区分，或者备选地，两种或更多种不同的标记物在所使用的检测技术下可以是不可区分的。例如，测序试剂中存在的不同核苷酸可以具有不同的标记物，并且可以使用合适的光学来区分它们，如由Solexa(现在的Illumina,Inc.)开发的测序方法例示。
优选实施方案包括焦磷酸测序技术。焦磷酸测序检测无机焦磷酸盐(PPi)的释放，因为特定的核苷酸被掺入新生链中(Ronaghi,M.,Karamohamed,S.,Pettersson,B.,Uhlen,M.and Nyren,P.(1996)“Real-time DNA sequencing using detection ofpyrophosphate release.”Analytical Biochemistry 242(1),84-9；Ronaghi,M.(2001)"Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing."Genome Res.11(1),3-11；Ronaghi,M.,Uhlen,M.and Nyren,P.(1998)"A sequencing method based on real-timepyrophosphate."Science 281(5375),363；美国专利号6,210,891；美国专利号6,258,568和美国专利号6,274,320，其公开内容通过引用整体并入本文)。在焦磷酸测序中，可以通过ATP硫酸化酶被立即转化为三磷酸腺苷(ATP)释放的PPi，并且通过萤光素酶产生的光子检测产生的ATP水平。可以将要测序的核酸附着到阵列中的特征，并且可以对阵列进行成像以捕获由于在阵列的特征处掺入核苷酸而产生的化学发光信号。在用特定核苷酸类型(例如A、T、C或G)处理阵列后，可以获得图像。在添加每种核苷酸类型后获得的图像就阵列中检测的那些特征而言将有所不同。图像中的这些差异反映了阵列上特征的不同序列内容。然而，每个特征的相对位置在图像中将保持不变。可以使用本文中阐述的方法来存储、处理和分析图像。例如，可以以下述方式处理用每种不同核苷酸类型处理阵列后获得的图像，所述方式与本文中对从基于可逆终止剂的测序方法的不同检测通道获得的图像的例示相同。
在另一种示例性类型的SBS中，循环测序通过逐步添加可逆终止剂核苷酸来完成，所述可逆终止剂核苷酸含有例如可切割或光可漂白染料标记物，如记载于例如WO 04/018497和美国专利号7,057,026，其公开内容通过引用并入本文。此方法正得到Solexa(现在为Illumina Inc.)商业化，并且还记载于WO 91/06678和WO 07/123,744，其各自通过引用并入本文。荧光标记的终止剂(其中既可以逆转终止又可以切割荧光标记物)的可用性有助于有效的循环可逆终止(CRT)测序。聚合酶也可以共工程化改造为有效地掺入这些修饰的核苷酸并且从这些修饰的核苷酸延伸。
优选地，在基于可逆终止剂的测序实施方案中，标记物在SBS反应条件下基本上不抑制延伸。然而，检测标记物可以是可除去的，例如通过切割或降解。可以在将标记物掺入排列的核酸特征后捕获图像。在具体实施方案中，每个循环涉及将四种不同核苷酸类型同时递送至阵列，并且每种核苷酸类型具有光谱独特的标记物。然后，可以获得四个图像，每个图像使用对四种不同标记物之一具有选择性的检测通道。或者，可以顺序添加不同的核苷酸类型，并且可以在每个添加步骤之间获得阵列的图像。在此类实施方案中，每个图像将显示已经掺入特定类型的核苷酸的核酸特征。由于每个特征的不同序列内容，不同的图像中将存在或不存在不同的特征。然而，特征的相对位置在图像中将保持不变。可以如本文中阐述的那样储存、处理和分析从此类可逆终止剂-SBS方法获得的图像。在图像捕获步骤后，可以除去标记物，并且可以除去可逆终止剂部分，用于核苷酸添加和检测的随后循环。标记物当它们在特定循环中以及后续循环前被检出后的除去可以提供降低背景信号和循环之间串扰的优点。下文阐述了有用的标记物和除去方法的实例。
在具体实施方案中，一些或全部核苷酸单体可以包括可逆终止剂。在此类实施方案中，可逆终止剂/可切割荧光团(fluors)可以包括通过3’酯连接与核糖部分连接的荧光团(Metzker,Genome Res.15:1767-1776(2005)，其通过引用并入本文)。其它方法已经将终止剂化学与荧光标记物的切割分开(Ruparel et al.,Proc Natl Acad Sci USA 102:5932-7(2005)，其全部内容通过引用并入本文)。Ruparel等人描述了可逆终止剂的开发，所述可逆终止剂使用小的3’烯丙基封闭延伸，但是可以通过用钯催化剂的短处理容易地解封闭。通过光可切割接头将荧光团附着到基底，该光可切割接头可以通过对长波长UV光的30秒暴露而容易地切割。因此，可以使用二硫化物还原或光切割作为可切割接头。可逆终止的另一种方法是使用在dNTP上放置大体积染料后发生的自然终止。dNTP上带电荷的大体积染料的存在可通过空间和/或静电阻碍起有效终止剂作用。一个掺入事件的存在防止进一步的掺入，除非除去染料。染料的切割除去荧光团，并且有效逆转终止。经修饰的核苷酸的实例也描述于美国专利号7,427,673和美国专利号7,057,026，其公开的内容通过引用整体并入本文。
可以与本文中所述的方法和系统一起利用的另外的例示性SBS系统和方法记载于美国专利申请公开号2007/0166705、美国专利申请公开号2006/0188901、美国专利号7,057,026、美国专利申请公开号2006/0240439、美国专利申请公开号2006/0281109、PCT公开号WO 05/065814、美国专利申请公开号2005/0100900、PCT公开号WO 06/064199、PCT公开号WO 07/010,251、美国专利申请公开号2012/0270305和美国专利申请公开号2013/0260372，其公开内容通过引用完整并入本文。
一些实施方案可以利用使用少于四种不同标记物检测四种不同核苷酸。例如，可以利用美国专利申请公开号2013/0079232的并入材料中描述的方法和系统来进行SBS。作为第一个实例，可以在相同波长处检测一对核苷酸类型，但是基于该对中的一名成员与另一成员相比的强度差异，或者基于对该对中的一名成员的改变(例如通过化学修饰、光化学修饰或物理修饰)来区分一对核苷酸类型，所述改变引起与对所述对中的另一名成员检测的信号相比引起明显信号出现或消失。作为第二个实例，可以在特定条件下检测四种不同核苷酸类型中的三种，而第四种核苷酸类型缺乏在那些条件下可检测的标记物，或者在那些条件下被最小程度检测(例如，由于背景荧光引起的最小程度检测，等等)。将前三种核苷酸类型掺入核酸中可以基于其各自信号的存在来确定，并且将第四种核苷酸类型掺入核酸中可以基于任何信号的不存在或最小程度检测来确定。作为第三个实例，一种核苷酸类型可以包括在两个不同通道中检测到的标记物，而仅在通道之一中检测到其它核苷酸类型。认为上述三种示例性配置不是相互排斥的，并且可以以各种组合使用。组合所有三个实例的示例性实施方案是基于荧光的SBS方法，其使用第一通道中检测的第一核苷酸类型(例如，具有当通过第一激发波长激发时在第一通道中检测到的标记物的dATP)、在第二通道中检测到的第二核苷酸类型(例如具有当通过第二激发波长激发时在第二通道中检测到的标记物的dCTP)、在第一和第二通道两者中检测到的第三核苷酸类型(例如具有当通过第一和/或第二激发波长激发时在这两个通道中检测到的标记物的dTTP)和缺乏在任一通道中检测不到或最小程度检测的标记物的第四种核苷酸类型(例如，没有标记物的dGTP)。
此外，如美国专利申请公开号2013/0079232的并入材料所述，可以使用单通道获得测序数据。在此类所谓的单染色测序方法中，第一种核苷酸类型是标记的，但在产生第一图像之后除去标记物，并且第二种核苷酸类型仅在产生第一图像后被标记。第三种核苷酸类型在第一和第二图像两者中保留其标记物，并且第四种核苷酸类型在这两个图像中保持未标记。
一些实施方案可以利用连接测序技术。此类技术利用DNA连接酶掺入寡核苷酸并鉴定此类寡核苷酸的掺入。寡核苷酸通常具有不同标记物，所述标记物同与寡核苷酸杂交的序列中的特定核苷酸的身份相关。与其它SBS方法一样，可以在用标记的测序试剂处理核酸特征阵列后获得图像。每个图像将显示已经并入特定类型的标记物的核酸特征。由于每个特征的不同序列内容，在不同图像中将存在或不存在不同的特征，但是特征的相对位置在图像中将保持不变。可以存储、处理和分析从基于连接的测序方法获得的图像，如本文阐述的。可以与本文中描述的方法和系统一起使用的示例性SBS系统和方法记载于美国专利号6,969,488、美国专利号6,172,218、和美国专利号6,306,597，其公开内容通过引用整体并入本文。
一些实施方案可以利用纳米孔测序(Deamer,D.W.&Akeson,M."Nanopores andnucleic acids:prospects for ultrarapid sequencing."Trends Biotechnol.18,147-151(2000)；Deamer,D.and D.Branton,"Characterization of nucleic acids bynanopore analysis".Acc.Chem.Res.35:817-825(2002)；Li,J.,M.Gershow,D.Stein,E.Brandin,and J.A.Golovchenko,"DNA molecules and configurations in a solid-state nanopore microscope"Nat.Mater.2:611-615(2003)，其公开内容通过引用整体并入本文)。在此类实施方案中，靶核酸通过纳米孔。纳米孔可以是合成孔或生物膜蛋白，如α-溶血素。当靶核酸通过纳米孔时，可以通过测量孔的电导率的波动来鉴定每个碱基对。(美国专利号7,001,792；Soni,G.V.&Meller,"A.Progress toward ultrafast DNAsequencing using solid-state nanopores."Clin.Chem.53,1996-2001(2007)；Healy,K."Nanopore-based single-molecule DNA analysis."Nanomed.2,459-481(2007)；Cockroft,S.L.,Chu,J.,Amorin,M.&Ghadiri,M.R."A single-molecule nanopore devicedetects DNA polymerase activity with single-nucleotide resolution."J.Am.Chem.Soc.130,818-820(2008)，其公开内容通过引用整体并入本文)。可以存储、处理和分析从纳米孔测序获得的数据，如本文中阐述。特别地，根据本文所阐述的光学图像和其它图像的示例性处理，数据可以作为图像处理。
一些实施方案可以利用涉及DNA聚合酶活性的实时监测的方法。可以通过携带荧光团的聚合酶和γ-磷酸标记的核苷酸之间的荧光共振能量转移(FRET)相互作用来检测核苷酸掺入，如记载于例如美国专利号7,329,492和美国专利号7,211,414(其各自通过引用并入本文)，或者可以用如记载于例如美国专利号7,315,019(其通过引用并入本文)的零模式波导，并且使用如例如美国专利号7,405,281和美国专利申请公开号2008/0108082(其各自通过引用并入本文)中所述的荧光核苷酸类似物和工程化聚合酶来检测核苷酸掺入。照明可以限于表面栓系的聚合酶周围的仄升(zeptoliter)量级体积，使得可以在低背景下观察到荧光标记的核苷酸的掺入(Levene,M.J.et al."Zero-mode waveguides for single-molecule analysis at high concentrations."Science 299,682-686(2003)；Lundquist,P.M.et al."Parallel confocal detection of single molecules in realtime."Opt.Lett.33,1026-1028(2008)；Korlach,J.et al."Selective aluminumpassivation for targeted immobilization of single DNA polymerase molecules inzero-mode waveguide nano structures."Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105,1176-1181(2008)，其公开内容通过引用整体并入本文)。可以存储、处理和分析从此类方法获得的图像，如本文中阐述。
一些SBS实施方案包括在将核苷酸掺入延伸产物中时释放的质子的检测。例如，基于释放的质子的检测的测序可以使用可从Ion Torrent(Guilford，CT，Life Technologies子公司)商购的电检测器和相关技术或US 2009/0026082 A1；US 2009/0127589 A1；US2010/0137143 A1；或US 2010/0282617 A1(其各自通过引用并入本文)中描述的测序方法和系统。本文中阐述的使用动力学排除来扩增靶核酸的方法可以容易地应用于用于检测质子的基底。更具体地，本文阐述的方法可用于产生用于检测质子的扩增子的克隆群体。
可以有利地以多重形式进行上述SBS方法，使得同时操作多个不同的靶核酸。在具体实施方案中，可以在常见的反应容器中或在特定基底的表面上处理不同的靶核酸。这允许以多重方式方便地递送测序试剂、除去未反应的试剂和检测掺入事件。在使用表面结合靶核酸的实施方案中，靶核酸可以为阵列形式。在阵列形式中，靶核酸通常可以以空间上可区分的方式结合到表面。靶核酸可以通过直接共价附着、附着于珠或其它颗粒或结合到附着于表面的聚合酶或其它分子来结合。阵列可以包括每个位点(也称为特征)处的靶核酸的单一拷贝，或者可以在每个位点或特征处存在具有相同序列的多个拷贝。可以通过扩增方法如桥式扩增或乳液PCR产生多个拷贝，如下文进一步详述。
本文中阐述的方法可以使用以多种密度之任一具有特征的阵列，包括例如至少约10个特征/cm2、100个特征/cm2、500个特征/cm2、1,000个特征/cm2、5,000个特征/cm2、10,000个特征/cm2、50,000个特征/cm2、100,000个特征/cm2、1,000,000个特征/cm2、5,000,000个特征/cm2、或更高。
本文中阐述的方法的优点在于它们提供并行的多个靶核酸的快速和有效检测。因此，本公开提供了能够使用本领域已知的技术(如上面例示的那些)制备和检测核酸的集成系统。因此，本公开的集成系统可以包括能够将扩增试剂和/或测序试剂递送到一个或多个固定化DNA片段的流体组分，该系统包括诸如泵、阀、储器、流体线等的部件。流动池可以在用于检测靶核酸的集成系统中配置和/或使用。示例性流动池记载于例如US 2010/0111768A1和美国序列号13/273,666，其各自通过引用并入本文。如对流动池示例，集成系统的一个或多个流体部件可用于扩增方法和检测方法。以核酸测序实施方案为例，集成系统的一种或多种流体部分可用于本文中阐述的扩增方法并且用于递送测序方法(如上文例示的测试方法)中的测序试剂。或者，集成系统可以包括用于实施扩增方法和实施检测方法的分开的流体系统。能够创建扩增核酸并确定核酸序列的集成测序系统的实例包括但不限于MiSeqTM平台(Illumina,Inc.,San Diego,CA)和美国序列号13/273,666中描述的装置，其通过引用并入本文。
在本文中呈现的方法和组合物中，将多核苷酸固定化于固体支持物。在一些实施方案中，将多核苷酸共价固定化于支持物。当提及将分子(例如核酸)固定化于固体支持物时，术语“固定化”和“附着”在本文中可互换使用，并且这两个术语旨在涵盖直接或间接、共价或非共价附着，除非明确或根据上下文另有指示。在本发明的某些实施方案中，共价附着可以是优选的，但通常所需要的只是分子(例如核酸)在意图使用支持物的条件下保持固定化或附着到支持物，例如在需要核酸扩增和/或测序的应用中。
本发明的某些实施方案可以利用由惰性基底或基质(例如玻璃载片，聚合物珠等)组成的固体支持物，所述惰性基底或基质已例如通过应用包含反应性基团的中间材料的层或涂层材料官能化，所述反应性基团允许共价附着到生物分子，如多核苷酸。此类支持物的实例包括但不限于在惰性基底，如玻璃，特别是如WO 2005/065814和US 2008/0280773(其内容通过引用完整并入本文)中所述的聚丙烯酰胺水凝胶上支持的聚丙烯酰胺水凝胶。在此类实施方案中，可以将生物分子(例如多核苷酸)直接共价附着到中间材料(例如水凝胶)，但是中间材料本身可以非共价附着到基底或基质(例如玻璃基底)。因而，术语“共价附着到固体支持物”应当解释为涵盖此类排列。
示例性的共价连接包括例如由使用点击化学技术产生的那些连接。示例性非共价连接包括但不限于非特异性相互作用(例如氢键键合、离子键键合、范德华相互作用等)或特异性相互作用(例如亲和力相互作用、受体-配体相互作用、抗体-表位相互作用、亲合素-生物素相互作用、链霉亲合素-生物素相互作用、凝集素-碳水化合物相互作用等)。在美国专利号6,737,236；7,259,258；7,375,234和7,427,678；和美国专利公开号2011/0059865A1中阐述了示例性的连接，其各自通过引用并入本文。
术语“靶核酸”、“靶核酸分子”、“靶核酸种类”及其任何语法等同物都指期望被检测、测序或以其它方式分析的核酸分子。可以使用多种期望的靶核酸分子之任一种，包括但不限于外显子或与其互补的核酸分子；cDNA分子或与其互补的核酸分子；非翻译区(UTR)或与其互补的核酸；启动子和/或增强子区域，或与其互补的核酸分子；进化保守区(ECR)或与其互补的核酸分子；转录的基因组区域或与其互补的核酸分子。如本文中公开，可以使用多种方法之任一种来获得靶定的核酸分子。此类方法包括但不限于使用杂交-延伸捕获富集获得靶定的核酸分子；使用靶向限制性位点，例如用具有IIS型限制酶位点(例如FokI限制酶位点)和基因座特异性区域的发夹工程化改造的寡核苷酸；使用基因座特异性超支化滚环扩增；使用随机基因座特异性引物扩增；使用多重乳液PCR；使用多重桥式PCR；使用挂锁(padlock)探针扩增；和使用来自靶定文库的微型文库，如本文中公开。
如本文中所用，术语“靶核酸序列”、“样品核酸序列”等术语是指从期望分析的样品获得的核酸序列。
在本文中公开的方法中扩增、测序或以其它方式操作的核酸样品可以是例如DNA或RNA。示例性DNA种类包括但不限于基因组DNA(gDNA)、线粒体DNA、叶绿体DNA、附加体DNA、病毒DNA和拷贝DNA(cDNA)。基因组DNA亚组的一个非限制性实例是一种特定染色体或特定染色体的一个区域。示例性RNA种类包括但不限于编码RNA，如信使RNA(mRNA)，和非编码RNA(ncRNA)，如转移RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)和核糖体RNA(rRNA)。DNA或RNA的其它种类包括上文列出的种类的片段或部分或源自这些种类的扩增产物、其片段或其部分。本文中描述的方法适用于涵盖细胞中存在的整个或部分互补物的上述种类。例如，使用本文中描述的方法，可以测定基本上完整的基因组的序列，或者可以测定基本上完全的靶定核酸序列的序列，如细胞的mRNA或cDNA互补物。
可以通过混合多个(大于一个)个别DNA分子来制备不同序列的靶DNA分子。在优选的方法中，将基因组DNA片段化成小分子，优选长度小于1000个碱基对。可以通过许多方法实现DNA的片段化，包括：酶消化、化学切割、超声处理、雾化或水剪切(hydroshearing)，优选雾化。
可以使用本领域已知的多种方法之任一种将已知的序列添加到靶核酸序列的3’和5’端，如例如由美国专利号7,741,463、7,985,565和7,115,400中阐述的方法例示，其各自的全部内容通过引用并入本文。例如，在一些实施方案中，通过将衔接头连接到核酸片段来添加已知的序列。在一些实施方案中，通过使用引物扩增添加已知序列，所述扩增在其5’端具有另外的已知序列。在一些实施方案中，已知的序列可以包含与固体支持物上固定化的扩增引物相同或互补的序列。例如，在某些实施方案中，已知的序列可以包括两个通用捕获区域之一，如P5或P7区域。P5区包含核苷酸序列5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’。P7区包含核苷酸序列5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’。在某些实施方案中，已知的序列是P5区序列(“anti-P5”:5’-TCGGTGGTCGCCGTATCATT-3’)或P7区序列(“anti-P7”:5’-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3’)扩增引物的反向互补物。在某些实施方案中，寡核苷酸可以与
Figure BDA0001415888770000171
扩增引物P5(配对末端)(5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAUCTACAC-3')或P7(配对末端)(5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGA(8-oxo-G)AT-3')杂交。在某些实施方案中，寡核苷酸可以与
Figure BDA0001415888770000172
捕获引物P5("anti-P5(配对末端)":5'-GTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT-3')或P7(配对末端)("anti-P7(配对末端)":5'-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3')的反向互补物杂交。
术语“固体表面”、“固体支持物”和其它语法等同物在本文中是指适合于或可以修饰为适合于附着转座体复合物的任何材料。如本领域技术人员将理解，可能的基底的数目是非常大的。可能的基底包括但不限于玻璃和改性或官能化玻璃、塑料(包括丙烯酸脂类(acrylics)、聚苯乙烯和苯乙烯和其它材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨基甲酸酯、TeflonTM等)、多糖、尼龙或硝酸纤维素、陶瓷、树脂、二氧化硅或基于二氧化硅的材料，包括硅和改性硅、碳、金属、无机玻璃、塑料、光纤束和多种其它聚合物。对于一些实施方案特别有用的固体支持物和固体表面位于流动池装置内。在下面更为详细阐述示例性流动池。
在一些实施方案中，固体支持物包含适合于以有序模式固定化转座体复合物的图案化表面。“图案化表面”是指固体支持物的暴露层之中或之上的不同区域的排列。例如，一个或多个区域可以是存在一个或多个转座体复合物的特征。特征可以以不存在转座体复合物的间质区域分开。在一些实施方案中，图案可以是行和列中的特征的x-y形式。在一些实施方案中，图案可以是特征和/或间质区域的重复排列。在一些实施方案中，图案可以是特征和/或间质区域的随机排列。在一些实施方案中，转座体复合物在固体支持物上随机分布。在一些实施方案中，转座体复合物在图案化表面上分布。可用于本文中阐述的方法和组合物的示例性图案化表面记载于美国序列号13/661,524或美国专利公开号2012/0316086A1，其各自通过引用并入本文。
在一些实施方案中，固体支持物包含表面中的孔或凹陷(depression)的阵列。这可以如本领域中通常已知的那样使用多种技术制作，包括但不限于光刻、冲压技术、模制技术和微蚀刻技术。如本领域技术人员将理解的，所使用的技术将取决于阵列基底的组成和形状。
固体支持物的组成和几何形状可随其用途而变化。在一些实施方案中，固体支持物是诸如载玻片、芯片、微芯片和/或阵列的平面结构。因此，基底的表面可以为平面层的形式。在一些实施方案中，固体支持物包括流动池的一个或多个表面。如本文中所用，术语“流动池”是指包括一种或多种流体试剂可以流过的固体表面的室。可容易地用于本公开的方法中的流动池和相关流体系统和检测平台的实例记载于例如Bentley et al.,Nature456:53-59(2008),WO 04/018497；US 7,057,026；WO 91/06678；WO 07/123744；US 7,329,492；US 7,211,414；US 7,315,019；US 7,405,281,和US 2008/0108082，其各自通过引用并入本文。
在一些实施方案中，固体支持物或其表面是非平面的，如管或容器的内表面或外表面。在一些实施方案中，固体支持物包括微球或珠。本文中的“微球”或“珠”或“颗粒”或语法等同物是指小的离散颗粒。合适的珠组成包括但不限于塑料、陶瓷、玻璃、聚苯乙烯、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、顺磁材料、氧化钍溶胶、碳石墨、二氧化钛、胶乳或交联葡聚糖如Sepharose、纤维素、尼龙、交联胶束和teflon，以及本文中对固体支持物概述的任何其它材料都可以使用。来自Bangs Laboratories,Fishers Ind.的“Microsphere DetectionGuide”是有用的指南。在某些实施方案中，微球是磁性微球或珠。
珠不需要是球形的；可以使用不规则的颗粒。或者/另外，珠可以是多孔的。珠大小范围为纳米(即100nm)到毫米(即1mm)，具有约0.2微米至约200微米的珠是优选的，并且约0.5至约5微米是特别优选的，尽管在一些实施方案中可以使用更小或更大的珠。
实施例1
本实施例描述了根据一个实施方案的固相扩增，如图1中所示。使用含有P5和P7’区域的标准通用PhiX或CT418文库来在已经制备的文库的5’端附着额外的P5’。这通过进行额外的18个PCR循环来完成。将文库稀释至200pM(最终)，并使用标准引物或P7-P5’引物扩增。每个50ul PCR反应含有22μl H2O、25μl 2X Phusion Mastermix(NEB)、各1μl合适的引物和DNA。PCR后，通过Nanodrop(Thermo Scientific)测定所得的文库浓度，并在缓冲液EB(QIAGEN)+0.05％Tween20中稀释至10nM。通过使用美国专利号8,536,477、8,715,966和美国专利申请公开号2008/0280773(其全部内容通过引用并入本文)中描述的方案接枝HEG引物(第1-4道)或标准PE引物(第5-8道)来制备流动池。使用上文生成的文库以在接枝的流动池上产生簇。
使用用于Genome Analyzer的TruSeq簇生成试剂盒(Illumina)根据制造商推荐的方案将簇扩增35个循环。用SYBR Green(Molecular Probes)染色流动池，并在荧光显微镜上成像。如图4A的顶部图中所示，用标准引物产生的簇导致正常的簇，而显示了用额外的P5修饰的引物产生的簇导致大的簇和正常的簇的混合物(图4A的底部图)。图4B中显示了来自图4A中所述的流动池的簇数目对SYBR信号强度的图。来自标准引物的簇导致低SYBR强度(顶部图)，而来自具有添加的P5的修饰引物的簇导致高10倍的强度(底图)。
然后，使用白光荧光团组来制备流动池以进行测序掺入的第一循环。C、T和G的第一循环图像显示使用经修饰的引物得到的簇比标准引物上制备的簇更亮，所述第一循环图像具有相对于经修饰的引物道上的T图像的亮度调节的图像灰度(图5)。
实施例2
本实施例描述了根据一个实施方案的固相扩增，如图3中所示。图6中报告的实验显示了来自P5/P7接枝引物(称为20T-P7/20A-P5)上20T/A接头的连环化，而不是在PCR过程期间将多联体促成引物附着到文库上的结果。在本实验中，在标准引物旁用20A/T配对末端P5/P7引物接枝流动池。遵循如美国专利号8,536,477、8,715,966、和美国专利申请公开2008/0280773的并入材料中描述的标准接枝方案，并且使用此接枝的流动池在cBOT克隆扩增系统(Illumina Cat#SY-301-2002)上进行簇扩增，其使用用于Genome Analyzer的TruSeq簇生成试剂盒(Illumina)按照制造商推荐的方案进行。CT418文库用作模板；在60℃扩增105个循环。用SYBR Green染色流动池并且成像，如图4中所述。簇数目对SYBR信号强度的图显示了使用20T-P7/20A-P5表面引物(6A)，与标准表面引物(6B)相比簇亮度增加。然而，与图4和5中给出的实例相比，观察到具有较高强度的较少簇。
温度对簇强度的影响：对从50℃到
Figure BDA0001415888770000201
的温度范围和范围为25到45个的扩增循环测试簇生成。流动池的接枝和实验程序如上面对图6所述，只是对50和
Figure BDA0001415888770000202
的温度测试35或45个循环的簇扩增。如图7所示，在50℃下扩增并用SYBR Green染色的20T/20A表面引物显示20T/20A簇比用标准表面引物(7A)得到的簇亮3-5倍。对于20T/20A表面引物和标准引物(7B)，簇直径保持相同。使用的文库是1、9和18pM PhiX和1pM CT418。本发明人发现了与标准引物相比使用20T/20A引物，在处于或低于55℃的温度和45个循环的扩增导致更亮的簇。与标准簇相比，当使用20T/20A引物时，增加Bst聚合酶浓度以及在桥式扩增期间使用从标准36秒到72秒的延伸时间增加也导致更亮的簇(数据未显示)。
图8是GA上运行的标准100个循环的测序运行期间相对于循环数目的簇强度的并行比较，显示在100个循环的运行结束时20T-P7/20A-P5引物簇的强度类似于在运行开始时用标准引物得到的簇的强度。
贯穿本申请，已经引用了各种出版物、专利和/或专利申请。这些出版物的全部内容通过引用并入本申请中。
术语包括在本文中旨在是开放式的，不仅包括所述元件，而且还涵盖任何额外的元件。
已经描述了许多实施方案。然而，应当理解，可以进行各种修改。因此，其它实施方案在所附权利要求书的范围内。

Claims (43)

1.制备用于核酸测序反应的固定化模板的方法，所述方法包括：
(a)提供固体支持物，所述固体支持物具有在其上固定化的正向和反向扩增引物；
(b)提供靶核酸，其中所述靶核酸包含：
(i)与所述正向扩增引物互补的已知序列的第一区域；
(ii)第一模板区；
(iii)与所述反向扩增引物基本上相同的已知序列的第二区域，其中所述第一模板区在所述已知序列的第一区域和所述已知序列的第二区域之间；和
(iv)与所述正向扩增引物互补的已知序列的第三区域，其中所述第一模板区和所述已知序列的第二区域在所述已知序列的第一区域和所述已知序列的第三区域之间；
(c)在适合于杂交的条件下将所述靶核酸应用于所述固体支持物，从而所述已知序列的第一区域与所述正向扩增引物杂交；
(d)延伸杂交的正向扩增引物以产生包含所述靶核酸的互补拷贝的第一固定化模板；
(e)使来自所述第一固定化模板的所述靶核酸变性；
(f)使所述第一固定化模板与所述反向扩增引物杂交，从而第二已知序列区域的互补拷贝与所述反向扩增引物杂交；并且
(g)延伸杂交的反向扩增引物以产生第二固定化链，所述第二固定化链包含位于所述已知序列的第一区域和所述已知序列的第二区域之间的第一模板区域；
(h)使来自所述第一固定化模板的所述第二固定化链变性；
(i)使所述第二固定化链与所述第一固定化模板杂交，从而所述第二固定化链的所述已知序列的第一区域与所述固定化模板中的所述已知序列的第一区域的互补拷贝杂交；
(j)延伸所述已知序列的第一区域的3’OH以产生所述第二固定化链的多联体；并且
(k)延伸所述已知序列的第一区域的互补拷贝的3’OH以产生所述第一固定化模板的多联体。
2.权利要求1的方法，所述方法还包括：
(l)使所述多联体变性并且重复步骤(i)、(j)和(k)以产生每条链的进一步的多联体。
3.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述正向扩增引物包含正向互补性区，所述正向互补性区与所述反向扩增引物的反向互补性区具有互补性。
4.权利要求3的方法，其中所述正向互补性区直接位于与所述靶核酸的所述已知序列的第一区域具有互补性的区域的5’；和/或
其中所述反向互补性区直接位于与所述靶核酸的所述已知序列的第二区域具有基本上相同的序列的区域的5’；和/或
其中所述正向互补性区和反向互补性区配置为使得杂交和延伸的重复循环产生所述第一固定化链的多联体，所述多联体中的每个拷贝与接着的拷贝通过来自所述正向互补性区的序列分开；和/或
其中所述正向互补性区和反向互补性区配置为使得杂交和延伸的重复循环产生所述第二固定化链的多联体，所述多联体中的每个拷贝与接着的拷贝通过来自所述反向互补性区的序列分开。
5.权利要求1-2中任一项的方法，其中所述多联体包含至少2个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
6.权利要求5的方法，其中所述多联体包含至少3个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
7.权利要求6的方法，其中所述多联体包含至少4个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
8.权利要求7的方法，其中所述多联体包含至少5个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
9.权利要求8的方法，其中所述多联体包含至少6个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
10.权利要求9的方法，其中所述多联体包含至少7个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
11.权利要求10的方法，其中所述多联体包含至少8个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
12.权利要求11的方法，其中所述多联体包含至少9个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
13.权利要求12的方法，其中所述多联体包含至少10个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
14.权利要求13的方法，其中所述多联体包含至少20个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
15.权利要求14的方法，其中所述多联体包含至少50个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
16.权利要求15的方法，其中所述多联体包含至少100个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
17.权利要求16的方法，其中所述多联体包含至少200个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
18.权利要求17的方法，其中所述多联体包含至少500个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
19.权利要求18的方法，其中所述多联体包含至少1000个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
20.权利要求19的方法，其中所述多联体包含至少2000个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
21.权利要求20的方法，其中所述多联体包含至少3000个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
22.权利要求21的方法，其中所述多联体包含至少4000个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
23.权利要求22的方法，其中所述多联体包含至少5000个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
24.权利要求23的方法，其中所述多联体包含至少6000个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
25.权利要求24的方法，其中所述多联体包含至少7000个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
26.权利要求25的方法，其中所述多联体包含至少8000个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
27.权利要求26的方法，其中所述多联体包含至少9000个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
28.权利要求27的方法，其中所述多联体包含至少10,000个拷贝的所述靶核酸分子的多个拷贝。
29.权利要求1-28中任一项的方法，其中所述固体支持物是平面的，或者其中所述固体支持物包含微孔或珠。
30.权利要求1-29中任一项的方法，其中所述靶核酸具有至少10个核苷酸的长度。
31.权利要求30的方法，其中所述靶核酸具有至少20个核苷酸的长度。
32.权利要求31的方法，其中所述靶核酸具有至少50个核苷酸的长度。
33.权利要求32的方法，其中所述靶核酸具有至少100个核苷酸的长度。
34.权利要求33的方法，其中所述靶核酸具有至少200个核苷酸的长度。
35.权利要求34的方法，其中所述靶核酸具有至少500个核苷酸的长度。
36.权利要求1的方法，其中所述靶核酸还包含与所述反向扩增引物基本上相同的已知序列的第四区域，其中所述已知序列的第一区域、所述第一模板区和所述已知序列的第二区域在所述已知序列的第三区域和所述已知序列的第四区域之间。
37.权利要求1-36中任一项的方法，其中所述正向扩增引物包含非核苷酸化学接头部分，所述非核苷酸化学接头部分定位为防止作为所述非核苷酸化学接头部分的5’的任何核苷酸的复制。
38.权利要求1-37中任一项的方法，其中所述反向扩增引物包含非核苷酸化学接头部分，所述非核苷酸化学接头部分定位为防止作为所述非核苷酸化学接头部分的5’的任何核苷酸的复制。
39.权利要求37-38中任一项的方法，其中所述非核苷酸化学接头部分包含二醇或者其中所述非核苷酸化学接头部分包含将所述引物栓系到所述固体支持物的非核苷酸接头。
40.权利要求1-39中任一项的方法，所述方法还包括对所述靶核酸测序。
41.权利要求40的方法，其中对所述靶核酸测序包括：
使一个或多个测序引物与所述第一固定化模板或所述第二固定化链杂交；
通过将一个或多个标记的核苷酸掺入新生链中来延伸所述测序引物；并且
检测所述标记的核苷酸，从而获得关于所述靶核酸的序列信息。
42.权利要求1-41中任一项的方法，其中通过用配置为具有结合部分的引物对扩增来制备所述靶核酸，从而能将使用所述引物对产生的扩增产物的一条链与相反链分开。
43.权利要求42的方法，其中所述结合部分包含生物素。
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