BR112015014793B1 - arranjo, método para produzir o mesmo, método para produzir um substrato e método de detectar ácidos nucleicos - Google Patents

arranjo, método para produzir o mesmo, método para produzir um substrato e método de detectar ácidos nucleicos Download PDF

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Abstract

ARRANJO, MÉTODO PARA PRODUZIR O MESMO, MÉTODO PARA PRODUZIR UM SUBSTRATO e MÉTODO DE DETECTAR ÁCIDOS NUCLEICOS. É fornecido um arranjo incluindo um suporte sólido tendo uma pluralidade de vasos, os vasos contendo um material em gel, os vasos sendo separados um do outro por regiões intersticiais na superfície, as regiões intersticiais segregando o material em gel em cada um dos vasos do material em gel nos outros vasos da pluralidade; e uma biblioteca de ácidos nucleicos alvos no material em gel, em que o material em gel em cada um dos vasos compreende uma única espécie dos ácidos nucleicos alvos da biblioteca. Métodos para fazer e usar o arranjo também são fornecidos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA COM PEDIDOS RELACIONADOS
[001] O presente pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório US 61/769,289, depositado em 26 de fevereiro de 2013, e do Pedido US 13/787,396, depositado em 6 de março de 2013. Cada um dos pedidos acima se encontra inteiramente incorporado ao presente a título de referência.
FUNDAMENTOS
[002] A presente divulgação se refere em geral à química analítica de fase sólida, e tem aplicabilidade específica para arranjos de ácido nucleico para análise genômica de alto rendimento.
[003] A tarefa de catalogar variação de genética humana e correlacionar essa variação à suscetibilidade a doença se beneficia dos avanços nas amplas metodologias de sequenciamento de genoma. Esse esforço de catalogação promete identificar os marcadores no genoma de cada pessoa o que irá ajudar os profissionais médicos a determinar a suscetibilidade daquela pessoa à doença, a resposta às terapias específicas tais como prescrição de medicamentos, suscetibilidade a efeitos colaterais perigosos de medicamento e outras características que podem ser levadas a juízo no âmbito médico. O esforço de catalogação está bem encaminhado. Isso se deve em grande parte às metodologias de sequenciamento de genoma comercialmente disponíveis que possuem custo efetivo suficiente para permitir a avaliação de cobaias em um ambiente de pesquisa. Os aperfeiçoamentos das metodologias de sequenciamento são necessários para acelerar o esforço de catalogação. Além disso, o custo relativamente alto do sequenciamento impediu que a tecnologia fosse além dos centros de pesquisa e para a clínica onde os médicos podem obter sequências para pacientes na população geral.
[004] As metodologias de sequenciamento e os sistemas usados para reali- zá-las, exploram uma complexa biblioteca de tecnologias. Os aperfeiçoamentos em algumas dessas tecnologias mostraram fornecer reduções de custo substanciais. Entretanto, é difícil prever qual, se houver algum, é responsável por aperfeiçoamentos na redução do custo. Devido às dependências entre as tecnologias nos sistemas de sequenciamento é ainda mais difícil prever qual pode ser modificada sem ter um impacto adverso no desempenho geral da metodologia ou sistema. Portanto, é ne-cessário identificar aperfeiçoamentos que possam trazer a promessa de pesquisa genômica para a clínica onde vidas podem ser melhoradas e em muitos casos salvas. A presente invenção atende essa necessidade e também fornece vantagens relacionadas.
SUMÁRIO
[005] A presente divulgação fornece um arranjo que inclui um suporte sólido que tem uma superfície, a superfície tendo uma pluralidade de poços que contém um material em gel, os poços estando separados um do outro por regiões intersticiais na superfície, as regiões intersticiais segregando o material em gel em cada dos poços do material em gel em outros poços da pluralidade; e uma biblioteca de ácidos nucleicos alvos no material em gel, em que o material em gel em cada poço compreende uma espécie única dos ácidos nucleicos alvos da biblioteca.
[006] Em algumas concretizações, o substrato é configurado como um arranjo de poços e os analitos são ácidos nucleicos. Portanto, a presente divulgação fornece um arranjo que inclui um suporte sólido que tem uma superfície, a superfície tendo uma pluralidade de poços, os poços contendo um material em gel, os poços estando separados um do outro por regiões intersticiais na superfície, as regiões intersticiais segregando o material em gel em cada poço do material em gel em outros poços da pluralidade; e uma biblioteca de ácidos nucleicos alvos no material em gel, em que o material em gel em cada um dos poços inclui uma única espécie de ácidos nucleicos alvos da biblioteca.
[007] A presente divulgação também fornece um método para produzir um substrato. O método pode incluir as etapas de (a) fornecer um suporte sólido que tem uma superfície plana, em que a superfície plana é interrompida por um ou mais recursos côncavos e em que o um ou mais recursos côncavos são limitados por uma ou mais regiões intersticiais na superfície plana; (b) revestir pelo menos uma parte do suporte sólido com um material em gel, em que a parte inclui pelo menos um dos recursos côncavos e pelo menos uma das regiões intersticiais; e (c) polir a superfície plana para remover o material em gel de pelo menos uma das regiões intersticiais e para manter o material em gel no pelo menos um recurso côncavo.
[008] Um método para produzir um arranjo pode incluir as etapas de (a) fornecer um suporte sólido que tem uma superfície com uma pluralidade de poços, os poços contendo um material em gel, os poços estando separados um do outro por regiões intersticiais na superfície, as regiões intersticiais segregando o material em gel em cada poço do material em gel em outros poços da pluralidade; (b) liberar uma biblioteca de ácidos nucleicos alvos para os poços do suporte sólido para produzir um arranjo de poços que possuem espécies únicas de ácido nucleico alvo para o material em gel em cada poço, em que os poços diferentes no arranjo possuem espécies de ácido nucleico alvo diferentes da biblioteca; e (c) amplificar os ácidos nucleicos alvos fixados ao material em gel nos poços do arranjo para produzir uma po-pulação de clones de um ácido nucleico alvo individual em cada poço do arranjo.
[009] A presente divulgação também fornece um método de detecção de analitos. O método pode incluir as etapas de (a) fornecer um suporte sólido que possua uma superfície plana, em que a superfície plana é interrompida por um ou mais recursos côncavos, em que os recursos côncavos contêm material em gel, em que o um ou mais recursos côncavos são delimitados por uma ou mais regiões intersticiais na superfície plana, as regiões intersticiais estando substancialmente desprovidas do material em gel, e em que o material em gel é fixado a ou contém analitos alvos; (b) contatar o suporte sólido com sondas em condições em que os analitos alvos interagem especificamente com as sondas; e (c) detectar o suporte sólido para distinguir pelo menos um subconjunto dos analitos alvos que interagem com uma ou mais das sondas.
[010] Em concretizações específicas, os ácidos nucleicos são os analitos que são detectados e recursos côncavos são poços. Por exemplo, um método de detecção de ácidos nucleicos pode incluir as etapas de (a) fornecer um suporte sólido que tem uma superfície e uma biblioteca de ácidos nucleicos, a superfície tendo uma pluralidade de poços, os poços contendo um material em gel, os poços estando separados um do outro por outras regiões intersticiais na superfície, as regiões intersticiais segregando o material em gel em cada poço do material em gel em outros poços da pluralidade, uma única espécie de ácidos nucleicos alvos da biblioteca de sendo fixada ao material em gel em cada poço; (b) detectar o suporte sólido para distinguir os poços que possuem uma espécie de ácido nucleico alvo que liga à pelo menos uma sonda.
[011] As composições, aparelho, e métodos da presente divulgação estão exemplificados aqui com relação ao material em gel. Deve ser compreendido que o material em gel é exemplificativo e pode ser substituído por outros materiais orgânicos incluindo, por exemplo, polímeros que podem formar um revestimento de superfície e não que podem não ser necessariamente considerados como géis, por si. Os métodos aqui revelados para aplicar material em gel em uma superfície, remover o material em gel das regiões intersticiais, fixar os analitos ao material em gel, usando os arranjos resultantes nos métodos analíticos ou preparativos, etc., podem ser prontamente adaptados substituindo o material em gel por matérias que não são gel.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[012] A Figura 1 ilustra uma representação diagramática de um método para produzir e usar um arranjo padronizado de recursos de DNA, em que cada recurso é um poço que tem material em gel que é fixado a um grupamento de DNA e o arranjo é usado em uma técnica de sequência.
[013] A Figura 2 ilustra uma imagem de um substrato “BeadChip” modificado para ter um material em gel nos poços em vez de grânulos. Painel A: imagens de campo claro, obtidas antes do polimento. Painéis B a C: imagens fluorescentes obtidas após o polimento e hibridização para oligonucleotídeos marcados de maneira fluorescente.
[014] A Figura 3 ilustra no Painel A: um fluxo de processo esquemático que utiliza fotolitografia e uma máscara rígida de Cr juntamente com estampa de íon reativo para fabricar recursos côncavos em um substrato; no Painel B imagens de poços SEM de exemplo e partes de um fiducial em um substrato de vidro; e no Painel C uma imagem de uma pastilha que inclui um fiducial e um arranjo de poços, e uma imagem de uma parte do arranjo que inclui poços.
[015] A Figura 4 ilustra imagens microscópicas fluorescentes de alta resolução de substratos de nanopoço que ilustram recursos de gel padronizados no substrato de nanopoço após o substrato ser revestido com PAZAM e polido com pasta de grânulos de sílica. O PAZAM é marcado com um corante para fins de visualização.
[016] A Figura 5 ilustra fundição de imagem multicolorida obtida de um ciclo de sequência HiSeq de um substrato de nanopoço de passo de 1,5 pm que tem grupamentos padronizados. Painel A: imagem que ilustra um campo de grupamentos padronizados em poços contendo gel juntamente com quatro fiduciais de centro de mira. Painel B: uma imagem de resolução mais alta que ilustra a mistura de cores (devido a uma população mista de amplicons) em um único fiducial centro de mira.
[017] A Figura 6 ilustra no Painel A: uma fundição multicolorida de grupamentos padrões em um ensaio de sequenciamento Hiseq que consome um substrato de nanopoço de passo de 750 nm; Painel B: a curva adjacente mais próxima que ilustra o arranjo é ordenada e os grupamentos estão passando filtros de qualidade; e o Painel C: medidas de qualidade de sequência que ilustram que uma densidade de 1,6 milhão grupamentos/ mm2 filtros de qualidade foram passados com sucesso.
[018] A Figura 7 é uma representação de Fração clonal versus Fração ocupada com a curva esperada para uma distribuição Poisson, uma linha reta esperada para clonalidade e ocupância ideal e um X para a medição média obtida de uma ensaio de sequenciamento que consome um substrato que tem nanopoços contendo gel.
DIVULGAÇÃO DETALHADA
[019] A presente divulgação fornece substratos estruturados, métodos para fazer os substratos estruturados e métodos para usar os substratos estruturados. Em concretizações específicas os substratos incluem um suporte sólido que tem regiões côncavas, tais como poços, que contêm material em gel (por exemplo, sendo revestido pelo material em gel). O material em gel pode por sua vez ser fixado a um analito de interesse, tal como um ácido nucleico. Em concretizações específicas as regiões que contêm gel são separadas, estando separadas por regiões intersticiais que não possuem a habilidade de fixar o analito de interesse. Por exemplo, as regiões intersticiais podem não ter material em gel. Alternativamente, o material em gel nas regiões intersticiais pode ser inativado ou modificado de outra maneira para não ter uma atividade ou característica do material em gel nas regiões côncavas, tal como a habilidade para suporta fixação de analito. A segregação resultante das regiões de gel fornece vantagens ao realizar reações nos analitos e/ou detectar os analitos. Uma vantagem exemplificative pode ser demonstrada no caso de um arranjo de ácidos nucleicos alvos distribuídos entre os poços contendo gel. Aqui, uma reação de amplificação pode ser realizada no substrato estruturado usando ácidos nucleicos como padrões para formar colônias de ácido nucleico que crescem no ou sobre o gel (por exemplo, recursos de ácidos nucleicos do arranjo). As regiões intersticiais funcionam para confinar a área de crescimento para a colônia. Os recursos individuais do arranjo resultante podem ser distinguidos com relativa facilidade devido ao padrão separado criado pelos poços contendo gel. O padrão também pode fornecer os benefícios de aumento de densidade dos recursos e redução de exigências de processamento para registro de imagem conforme comparado a arranjos aleatórios de ácidos nucleicos.
[020] Um processo exemplificativo para fazer um arranjo padronizado de ácidos nucleicos está ilustrado na Figura 1. Uma vista de perfil de um substrato de poço padronizado está ilustrada diagramaticamente. Os poços possuem um passo (espaçamento de centro a centro) de 1,5 pm e o diâmetro de cada poço é de 0,5 pm no exemplo. O substrato de poço padronizado pode ser revestido com um material em gel de maneira que o material entre nos poços e revista as regiões intersticiais. O substrato revestido com gel resultante pode ser polido para remover o material em gel das regiões intersticiais, deixando o material em gel nos poços, desse modo formando um substrato padronizado com gel. O gel pode funcionar para suportar a captura de um modelo de DNA e amplificação do modelo. Por exemplo, o gel pode ser enxertado com iniciadores oligonucleotídeos antes de revestir a superfície, após o revestimento da superfície e antes do polimento, ou após o polimento. Os iniciadores podem funcionar para capturar os modelos de DNA e para amplificação de iniciadores usando os padrões capturados. O substrato padronizado com DNA resultante pode ser analisado, por exemplo, em uma técnica de sequeciamento.
[021] Um arranjo padronizado de ácidos nucleicos em poços contendo gel fornece muitas vantagens para sequenciamento de DNA. Exemplos de vantagens comparados aos arranjos aleatórios (isto é, arranjos que possuem um padrão de recursos aleatório) incluem aumento de densidade de embalagem de recurso, aumento de controle e sintonia de densidade de recurso usando semeadura padrão independente de concentração, redução de exigências de processamento para registro de imagem e aumento da facilidade para extração de sinal. Uma vantagem adicional pode ser derivada do confinamento espacial das populações de ácido nucleico por cada recurso. Um recurso de um arranjo padronizado da presente divulgação pode funcionar para restringir a área ou volume dentro do qual uma colônia de ácido nucleico irá crescer (por exemplo, por meio da amplificação de grupamento). Na ausência de restrições de área ou volume, algumas colônias de ácido nucleico podem amplificar para um tamanho maior do que outros devido às diferenças no conteúdo perene de guanina e citosina em suas sequências (isto é, conteúdo GC) que influencia as taxas de amplificação relativas. Para os métodos e composições descritos aqui, o volume ou área de recursos individuais pode ser selecionado para impedir ou minimizar as diferenças nos tamanhos da colônia de ácido nucleico que de outro modo ocorreriam a partir da reação de amplificação devido às diferenças no conteúdo GC entre as espécies padrões sendo amplificadas. Por exemplo, o volume ou área dos recursos pode ser pequeno o suficiente para limitar o crescimento das colônias que crescem mais rápido embora permita que as colônias de crescimento mais lento preencham efetivamente o recurso mediante o término da reação de amplificação.
[022] Em concretizações específicas, a presente divulgação fornece fabricação de poços (por exemplo, micropoços ou nanopoços) em vidro, silício, plástico ou outros suportes sólidos adequados com gel ligado covalentemente e padronizado tal como poli(N-(5-azidoacetamidilpentil) acrilamida-co-acrilamida) (PAZAM, ver, por exemplo, Pedido de Patente Provisório US 61/753.833, cuja divulgação encontra-se incorporada ao presente a título de referência). O processo cria almofadas de gel usadas para sequência que pode ser estável durante execuções de sequência com um grande número de ciclos. A ligação covalente do polímero com os poços é útil para manter o gel nos recursos estruturados por toda a vida do substrato estruturado durante vários usos. Entretanto, em muitas concretizações, o não precisa ser ligado de modo covalente aos poços. Por exemplo, em algumas condições a acrilamida sem silano (SFA, ver, por exemplo, a Publicação do Pedido de Patente US 2011/0059865 A1, cuja divulgação encontra-se incorporada ao presente a título de referência) que não é fixada de modo covalente a nenhuma parte do substrato estruturado, pode ser usada como o material em gel.
[023] Em concretizações específicas, um substrato estruturado pode ser preparado padronizando um material de suporte sólido com os poços (por exemplo, microprocessador poços ou nanopoços), revestindo o suporte padronizado com um material em gel (por exemplo, PAZAN, SFA ou variações dos mesmos modificadas quimicamente, tais como a versão “azidolizada” de SFA (azido-SFA)) e polindo o suporte revestido com gel, por exemplo, por meio de polimento químico ou mecânico, desse modo retendo o gel nos poços, mas removendo ou inativando substancialmente todo gel das regiões intersticiais na superfície do substrato estruturado entre os poços. Os ácidos nucleicos iniciadores podem ser fixados ao material em gel. Uma solução de ácidos nucleicos alvos (por exemplo, um genoma humano fragmentado) pode ser então contatada com o substrato polido de maneira que os ácidos nucleicos alvos individuais semearão poços individuais por meio de interações com iniciadores fixados ao material em gel, entretanto, os ácidos nucleicos alvos não irão ocupar as regiões intersticiais devido à ausência ou inatividade do material em gel. A amplificação dos ácidos nucleicos alvos será confinada aos poços porque a ausência ou inatividade de gel nas regiões intersticiais impede a saída da colônia de ácido nucleico em crescimento. O processo pode ser fabricado de modo conveniente, podendo ser escalado e utilizando métodos de micro ou nanofabricação convencional.
[024] Em concretizações específicas, os marcadores fiduciais são incluídos em um substrato estruturado para facilitar a identificação e localização de recursos individuais (por exemplo, poços ou outros recursos côncavos contendo gel). Os marcadores fiduciais são particularmente úteis para substratos estruturados que possuem padrão de recursos ordenados espacialmente porque os marcadores fiduciais fornecem um ponto de referência para locais relativos de outros recursos. Os marcadores fiduciais podem ser também usados para registrar imagens de arranjos aleatórios bem como, mas, em vez disso, pode ser usada a desordem inerente dos grupamentos com arranjos aleatórios gerados em plataformas de sequência comerciais tais como HiSeq, Analisador de Genoma ou plataformas MíSeq de Illumina, Inc. (SanDiego, CA). Os marcadores fiduciais são especialmente benéficos para aplicações onde o substrato estruturado é detectado repetidamente para seguir as altera-ções que ocorrem nos recursos individuais ao longo de tempo. Os marcadores fiduciais permitem que os grupamentos de ácido nucleico individuais sejam seguidos através de imagens sequenciais obtidas durante ciclos de sequência múltipla, de maneira que a sequência dos grupamentos individuais possa ser determinada separadamente.
[025] A divulgação fornece um marcador fiducial que tem um padrão de re- gião(s) côncava(s) e região(s) intersticial(s). Um projeto exemplificativo para um marcador fiducial é um conjunto de círculos concêntricos que tem um padrão alternado de dois ou mais do que se segue: um aro côncavo, um aro intersticial e um aro de poços ou outros recursos côncavos (por exemplo, um “centro de mira”). Em algumas concretizações, a(s) região(s) côncava(s) de um marcador fiducial contém (contêm) material em gel, enquanto as regiões intersticiais não. Esse local diferencial do gel na superfície pode ser alcançado usando o revestimento com gel e métodos de polimento aqui relatados. Tipicamente é usado um método de detecção que pode distinguir regiões que contêm gel de regiões intersticiais. Em alguns casos, a distinção pode ser baseada na presença de um analito específico nas regiões de gel que não é encontrado nas regiões intersticiais. Por exemplo, no caso de arranjos de ácido nucleico, a região que contém gel de um marcador fiducial pode conter ácidos nucleicos que são etiquetados por meio dos mesmos métodos que são usados para etiquetar ácidos nucleicos alvos no arranjo. Portanto, os marcadores fiduciais podem ser fabricados de maneira conveniente usando os mesmos métodos usados para fabricar recursos de analito. Portanto, se desejado, os marcadores fiduciais e os recursos de analito podem ser fabricados simultaneamente através de uma ou mais etapas. Outro marcador fiducial útil que pode ser usado nos substratos estruturados e métodos descritos aqui é aquele que tem subregiões onde o padrão dos poços (ou outros recursos côncavos) em uma região é girado com respeito ao padrão em outra sub-região. Tais grades fiduciais podem ser configuradas e usadas para registro de imagem conforme descrito no Documento US 13/267.565, cuja divulgação encontra- se incorporada ao presente a titulo de referência.
[026] Como um exemplo adicional, podem ser usados grânulos como um fiducial. Os grânulos podem incluir uma etiqueta tal como um fluoróforo. Nesse caso, uma superfície pode ser dotada de pelo menos dois tipos de poços (ou outros recursos côncavos). Os poços relativamente grandes podem acomodar um ou mais grânulos fiduciais, enquanto os poços menores, sendo pequenos demais para conter um grânulo, terão apenas material em gel. Portanto, os poços menores funcionam como recursos analíticos para análise e os poços maiores preenchidos com grânulos funcionam como fiduciais. Como uma alternativa para os poços os recursos fiduciais podem ser canais, tais como aqueles presentes na configuração centro de mira exemplificada acima, e os canais podem ter dimensões que acomodam os grânulos. Como tal, podem ser colocadas vários grânulos no canal para criar um fiducial, por exemplo, no formato aparente de uma cadeia de grânulos.
[027] Os arranjos padronizados, métodos para sua fabricação e métodos para seu uso estão exemplificados aqui com relação a um material em gel que é usado para fixar analitos de interesse. Deve ser compreendido que o material em gel é exemplificativo e pode ser substituído por outro material orgânico que possa ser usado para localização indireta de analitos para recursos em uma superfície. Tais materiais orgânicos incluem, por exemplo, polímeros que possam formar um reves- timento de superfície e não possam ser necessariamente considerados como géis. Um exemplo específico é um polímero formado por ATRP (polimerização radical de transferência de átomo) ou processos de polimerização iniciados em superfície. Os métodos descritos aqui para aplicar material em gel em uma superfície, remover o material em gel das regiões intersticiais, usando os arranjos resultantes nos métodos analíticos ou preparatórios, etc., podem ser prontamente adaptados para uso com materiais não gel.
[028] Os termos usados aqui devem ser compreendidos em seu significado comum na técnica relevante a menos que especificado de outra maneira. Vários termos usados aqui e seu significado estão descritos abaixo.
[029] Conforme usado aqui, o termo “fixado” se refere ao estado de duas coisas que estão unidas, presas, aderidas, conectadas ou ligadas entre si. Por exemplo, um analito, tal como um ácido nucleico, pode ser fixado a um material, tal como um gel ou suporte sólido, por uma ligação covalente ou não covalente. Uma ligação covalente é caracterizada pelo compartilhamento de pares de elétrons entre átomos. Uma ligação não covalente é uma ligação química que não envolve o compartilhamento de pares de elétrons e pode incluir, por exemplo, ligações de hidrogênio, ligações iônicas, forças van der Waals, interações hidrófilas e interações hidro- fóbicas.
[030] Conforme usado aqui, o termo “população clonal” se refere a uma população de ácidos nucleicos que é homogênea com respeito a uma sequência nu- cleica específica. A sequência homogênea tem tipicamente pelo menos 10 nucleotídeos de comprimento, mas pode ser ainda mais longa incluindo, por exemplo, pelo menos 50, 100, 250, 500, 1.000 ou 2500 nucleotídeos de comprimento. Uma população clonal pode ser derivada de um único ácido nucleico alvo ou ácido nucleico modelo. Uma população clonal pode incluir pelo menos 2, 5, 10, 100, 1.000 ou mais cópias de uma sequência de nucleotídeo alvo. As cópias podem estar presentes em uma única molécula de ácido nucleico, por exemplo, como um concatâmero ou as cópias podem estar presentes em moléculas de ácido nucleico separadas (isto é, uma população clonal pode incluir pelo menos 2, 5, 10, 100, 1.000 ou mais moléculas de ácido nucleico que tem a mesma sequência de nucleotídeo alvo). Tipicamente, todos os ácidos nucleicos em uma população clonal terão a mesma sequência de nucleotídeo. Será compreendido que um número insignificante de ácidos nucleicos contaminantes ou mutações (por exemplo, devido aos artefatos de amplificação) pode ocorrer em uma população clonal sem se afastar da clonalidade. Portanto, uma população pode ser pelo menos 80%, 90%, 95% ou 99% clonal. Em alguns casos podem estar presentes 100% de população clonal pura.
[031] Conforme usado aqui, o termo “revestir”, quando usado como um verbo, pretende significar fornecer uma camada ou cobertura em uma superfície. Pelo menos uma parte da superfície pode ser provida de uma camada ou cobertura. Em alguns casos, toda a superfície pode ser dotada de uma camada ou cobertura. Em casos alternativos apenas uma parte da superfície será dotada de uma camada ou cobertura. O termo “revestir”, quando usado para descrever a relação entre uma superfície e um material, pretende significar que o material está presente como uma camada ou cobertura na superfície. O material pode vedar a superfície, por exemplo, impedindo o contato de líquido ou gás com a superfície. Entretanto, o material não precisa formar uma vedação. Por exemplo, o material pode ser poroso para líquido, gás, ou um ou mais componentes portados em um líquido ou gás. Materiais exemplos que podem revestir uma superfície incluem, mas não se limitam a, um gel, polímero, polímero orgânico, líquido, metal, uma segunda superfície, plástico, sílica, ou gás.
[032] Conforme usado aqui, o termo “recurso côncavo”, quando usado com referência a um suporte sólido, se refere a uma reentrância ou entalhe no suporte sólido. Recursos côncavos exemplificativos incluem, mas não se limitam a, um poço, cova, furo, depressão, canal ou cavado. Um recurso côncavo pode ter opcionalmente uma seção transversal curva (na dimensão ortogonal à superfície do suporte sólido); entretanto, uma seção transversal com uma ou mais seções lineares, os ângulos ou cantos é também possível. São também possíveis as seções transversais com combinações de seções curvas e lineares. Geralmente, um recurso côncavo não precisa passar completamente através do suporte sólido, por exemplo, em vez de ter uma superfície ou ponto inferior no substrato.
[033] Conforme usado aqui, o termo “diferente”, quando usado com referência a ácidos nucleicos, significa que os ácidos nucleicos possuem sequências de nucleotídeos diferentes que não são as mesmas entre si. Dois ou mais ácidos nucleicos podem ter sequências de nucleotídeos que são diferentes ao longo de toda sua extensão. Alternativamente, dois ou mais ácidos nucleicos podem ter sequências de nucleotídeos que sejam diferentes ao longo de uma parte substancial de sua extensão. Por exemplo, dois ou mais ácidos nucleicos podem ter partes de sequência de nucleotídeos que são diferentes para duas ou mais moléculas embora também tendo uma parte de sequência universal que é a mesma nas duas ou mais moléculas.
[034] Conforme usado aqui, o termo “cada”, quando usado com referência a uma coleção de itens, pretende identificar um item individual na coleção, mas não se refere necessariamente a cada item na coleção. Podem ocorrer exceções se a divulgação ou o contexto ditar claramente de outra maneira.
[035] Conforme usado aqui, o termo “acesso fluídico”, quando usado com referência a uma molécula e um local em contato com o fluido, refere-se à habilidade da molécula para se mover no ou através do fluido para contatar ou entrar no local. O termo pode também se referir à habilidade da molécula para se separar do ou sair do local para entrar na solução. O acesso fluídico pode ocorrer quando não há barreiras que impeçam a entrada da molécula no local, contatando o local, separando do local e/ou saindo do local. Entretanto, compreende-se que o acesso fluídico exista mesmo que a difusão seja retardada, reduzida ou alterada desde que o acesso não seja absolutamente impedido.
[036] Conforme usado aqui, o termo “material em gel” pretende significar um material semirrígido que seja permeável a líquidos e gases. Tipicamente o material em gel pode dilatar quando o líquido é absorvido e pode contrair quando o líquido é removido por secagem. Géis exemplificativos incluem, mas não se limitam àqueles que possuem uma estrutura colonial, tais como agarose, estrutura de malha de polímero, tal como gelatina; ou estrutura de polímero de ligação cruzada, tal como poli- acrilamida, SFA (ver, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente US 2011/0059865 A1, cuja divulgação encontra-se incorporada ao presente a título de referência) ou PAZAM (ver, por exemplo, Pedido de Patente Provisório US 753.833, cuja divulgação encontra-se incorporada ao presente a título de referência). O material em gel particularmente útil estará em conformidade com o formato de um poço ou outro recurso côncavo onde o mesmo residir. Alguns materiais em gel úteis podem (a) estar em conformidade com o formato do poço ou outro recurso côncavo onde residir e (b) possuir um volume que não exceda substancialmente o volume do poço ou recurso côncavo onde residir.
[037] Conforme usado aqui, o termo “região intersticial” se refere a uma área em um substrato ou em uma superfície que separa outras áreas do substrato ou superfície. Por exemplo, uma região intersticial pode separar um recurso côncavo de um arranjo de outro recurso côncavo do arranjo. As duas regiões que são separadas uma da outra podem ser separadas, sem contato entre si. Em outro exemplo, uma região intersticial pode separar uma primeira parte de um recurso de uma segunda parte de um recurso. Em muitas concretizações, a região intersticial é contínua enquanto os recursos são separados, por exemplo, como no caso para um arranjo de poços em superfície contínua nos outros aspectos. A separação fornecida por uma região intersticial pode ser separação parcial ou total. As regiões intersticiais tipicamente terão um material de superfície que difere do material de superfície dos recursos na superfície. Por exemplo, os recursos de um arranjo podem ter uma quantidade ou concentração de material em gel ou analitos que exceda a quantidade ou concentração presente nas regiões intersticiais. Em algumas concretizações, o material em gel ou analitos podem não estar presentes nas regiões intersticiais.
[038] Conforme usado aqui, o termo “biblioteca”’, quando usado com referência aos analitos, refere-se a uma coleção de analitos que possuem composições químicas diferentes. Tipicamente, os analitos em uma biblioteca serão de espécies diferentes que possuem um recurso ou característica de um gênero ou classe, mas nos outros aspectos diferentes de alguma maneira. Por exemplo, uma biblioteca pode incluir espécies de ácido nucleico que diferem na sequência de nucleotídeos, mas que são similares com respeito a serem dotados de uma estrutura de fosfato de açúcar.
[039] Conforme usado aqui, o termo “ácido nucleico” e “nucleotídeo” pretendem ser consistentes com seu uso na técnica e incluir espécies que ocorram naturalmente ou análogos funcionais. Os análogos funcionais particularmente úteis de ácidos nucleicos são capazes de hibridização para um ácido nucleico em um modo específico de sequência ou capazes de serem usados como um padrão para replicação de uma sequência de nucleotídeo específica. Os ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente geralmente possuem uma estrutura que contém ligações fosfodi- ester. Uma estrutura análoga pode ter uma ligação de estrutura que inclui qualquer variedade daqueles conhecidos na técnica. Os ácidos nucleicos que ocorrem naturalmente geralmente possuem um açúcar desoxirribose (por exemplo, encontrado no ácido desoxirribonucleico (DNA)) ou um açúcar ribose (por exemplo, encontrado no ácido ribonucleico (RNA)). Um ácido nucleico pode conter nucleotídeos que possuam qualquer variedade de análogos dessas metades de açúcar que são conhecidas na técnica. Um ácido nucleico pode incluir nucleotídeos nativos ou não nativos. A esse respeito, um ácido desoxirribonucleico pode ter uma ou mais bases selecionadas de um grupo que consiste de adenina, timina, citosina ou guanina e um ácido ribonucleico pode ter uma ou mais bases selecionadas do grupo que consiste de uracila, adenina, citosina ou guanina. As bases não nativas úteis que podem ser incluídas em um ácido nucleico ou nucleotídeo são conhecidas na técnica. Os termos “sonda” ou “alvo”, quando usados com referência a um ácido nucleico, pretendem ser identificadores semânticos para o ácido nucleico no contexto de um método ou composição revelados aqui e não limitam necessariamente a estrutura ou função do ácido nucleico além do que em outros aspectos está explicitamente indicado. Os termos “sonda” e “alvo” podem ser similarmente aplicados a outros analitos tais como proteínas, moléculas pequenas, células ou similares.
[040] Conforme usado aqui, o termo “padrão aleatório”, quando usado em referência a poços em uma superfície, significa que os locais relativos de um subconjunto de poços em uma região da superfície não são conhecidos ou previsíveis a partir dos locais de um subconjunto de poços em outra região da superfície. O subconjunto utilizado para a medida irá geralmente incluir pelo menos 3 poços, mas pode incluir pelo menos 4, 5, 6 10 ou mais poços. Um padrão aleatório geralmente não inclui múltiplas repetições de nenhum subpadrão. O termo pode ser aplicado a outros recursos côncavos além de poços.
[041] Conforme usado aqui, o termo “padrão de repetição”, quando usado com referência a poços em uma superfície, significa que os locais relativos de um subconjunto de poços em uma região da superfície são os mesmos dos locais relativos de um subconjunto de poços em pelo menos outra região da superfície. Portanto, os locais relativos para poços em uma região de um padrão de repetição são geralmente previsíveis a partir dos locais relativos dos poços em outra região do padrão de repetição. O subconjunto usado para a medição irá geralmente incluir 3 po- ços, mas pode incluir pelo menos 4, 5, 6, 10 ou mais poços. Os padrões de repetição podem incluir múltiplas repetições de um subpadrão. O termo pode ser aplicado a outros recursos côncavos além de poços.
[042] Conforme usado aqui, o termo “segregar”, quando usado com referência a material em gel em dois poços (ou em dois outros recursos), significa separar ou isolar o material em gel em um dos poços (ou em um dos recursos) do material em gel no outro poço (ou no outro recurso). Portanto, o material em gel no primeiro poço (ou no primeiro recurso) não está em contato direto com o material em gel no outro poço (ou no outro recurso). Em algumas concretizações, o material em gel em dois poços (ou em dois recursos) está em contato direto, por exemplo, através de uma solução que contata os dois poços (ou recursos). Alternativamente, o material em gel nos dois poços (ou nos dois recursos) não é nivelado em contato direto. Uma região intersticial em uma superfície pode segregar o material em gel em dois poços (ou em dois recursos) sendo desprovido do material em gel. Em concretizações particulares, um material em gel pode ser descontínuo em uma superfície, estando presente em recursos côncavos, tais como poços, mas não presente em regiões intersticiais entre os recursos.
[043] Conforme usado aqui, o termo “superfície” pretende significar uma parte externa ou camada externa de um suporte sólido ou material em gel. A superfície pode estar em contato com outro material tal como um gás, líquido, gel, polímero, polímero orgânico, segunda superfície de um material, metal ou revestimento diferente. A superfície ou regiões da mesma, podem ser substancialmente planas. A superfície pode ter recursos de superfície tais como poços, covas, canais, rugas, regiões elevadas, cavilhas, colunas ou similares.
[044] Conforme usado aqui, o termo “espécie única” significa substancialmente uma e apenas uma espécie de um gênero específico. O termo não pretende necessariamente limitar o número de representantes de uma espécie única que esteja presente. Por exemplo, uma população de moléculas de ácido nucleico cada uma tendo a mesma sequência de nucleotídeos compreende uma única espécie de ácido nucleico. O termo “único(a)” nesse contexto não pretende excluir a presença de outras coisas que não estejam dentro de gêneros relevantes. Por exemplo, um poço que contém uma única espécie de ácido nucleico alvo de uma biblioteca pode incluir vários ácidos nucleicos que possuam a mesma sequência, irá excluir outro nucleico alvo da biblioteca, mas não precisa necessariamente excluir nenhum outro componente que não seja ácido nucleico. Será compreendido que uma população de espécie única aparente pode ter uma pequena quantidade de outra espécie presente em um nível que é considerado por aqueles versados na técnica como um nível insignificante de contaminação ou artefato para o uso específico da população. Por exemplo, um grupamento de ácido nucleico, derivado de um único padrão que tem uma primeira sequência, será considerado tendo uma única espécie aparente se a quantidade de moléculas de ácido nucleico que tem uma segunda sequência for suficientemente baixa para não ser detectada ou ignorada quando a primeira sequência for detectada. Alternativamente, uma população de única espécie absoluta terá uma e apenas uma espécie.
[045] Conforme usado aqui, o termo “suporte sólido” se refere a um substrato rígido que é insolúvel em líquido aquoso. O substrato pode ser não poroso ou poroso. O substrato pode ser opcionalmente capaz de absorver um líquido (por exemplo, devido à porosidade), mas tipicamente será rígido o suficiente para não aumentar substancialmente ao absorver o líquido e não se contrair substancialmente quando o líquido for removido por secagem. Um suporte sólido não poroso é geralmente impermeável a líquidos ou gases. Os suportes sólidos podem ser opcionalmente inertes a uma química que seja usada para modificar um gel. Por exemplo, um suporte sólido pode ser inerte a uma química usada para fixar analitos, tais como ácidos nucleicos, para géis em um método revelado aqui. Suportes sólidos exemplifica- tivos incluem, mas não estão limitados a, vidro e modificado ou vidro funcionalizado, plásticos (incluindo acrílicos, poliestireno e copolímeros de estireno e outros materiais, polipropileno, polietileno, polibutileno, poliuretanos, Teflon™, olefinas cíclicas, poliimidas, etc.), náilon, resinas, Zeonor, sílica ou materiais baseados em sílica incluindo silício e silício modificado, carbono, metais, vidros inorgânicos, feixes de fibra ótica, e polímeros. Particularmente úteis para algumas concretizações os suportes sólidos são situados dentro de um aparelho de célula de fluxo. Células de fluxo exemplificativas estão reveladas em maiores detalhes abaixo.
[046] Conforme usado aqui, o termo “poço” se refere a um recurso côncavo separado em um suporte sólido que tem uma abertura de superfície que é completamente circundada por região intersticial da superfície. Os poços podem ter qualquer um de uma variedade de formatos em sua abertura em uma superfície que inclui, mas não está limitada a redonda, quadrada, poligonal, em forma de estrela (com qualquer número de vértices) etc. A seção transversal de um poço tomada ortogonalmente com a superfície pode ser curva, quadrada, poligonal, hiperbólica, cônica, angular, etc.
[047] As concretizações reveladas abaixo e relatadas nas reivindicações podem ser compreendidas em vista das definições acima.
[048] A presente divulgação fornece um substrato que inclui um suporte sólido que tem uma superfície, a superfície tendo pelo menos um recurso côncavo, o pelo menos um recurso côncavo contendo um material em gel, o pelo menos um recurso côncavo sendo limitado por pelo menos uma região intersticial na superfície; e uma biblioteca de analitos no material em gel, em que o material em gel em cada poço inclui uma única espécie de analito da biblioteca.
[049] Em algumas concretizações, o substrato é configurado como um arranjo de poços e os analitos são ácidos nucleicos. Portanto, essa divulgação fornece um arranjo que inclui um suporte sólido que tem uma superfície, a superfície tendo uma pluralidade de poços, os poços contendo um material em gel, os poços sendo separados um do outro por regiões intersticiais na superfície, as regiões intersticiais segregando o material em gel em cada poço do material em gel em outros poços da pluralidade, e a biblioteca de ácidos nucleicos alvos no material em gel, em que o material em gel em cada poço inclui uma única espécie dos ácidos nucleicos alvos da biblioteca.
[050] Um suporte sólido usado em um substrato estruturado revelado aqui pode ser feito a partir de qualquer um de uma variedade de materiais revelada aqui, por exemplo, nas definições acima, abaixo nos exemplos ou imediatamente seguinte. Um material particularmente útil é vidro. Outros materiais de substrato adequados podem incluir materiais poliméricos, plásticos, silício, quartzo (sílica fundida), vidro BOROFLOAT®, sílica, materiais baseados em sílica, carbono, metais, uma fibra ótica ou feixes de fibra ótica, safira, ou materiais plásticos tais como COCs e epóxis. O material específico pode ser selecionado com base ns propriedades desejadas para um uso específico. Por exemplo, os materiais que são transparentes para um comprimento de onda de radiação desejado são úteis para técnicas analíticas que irão utilizar radiação do comprimento de onda desejado, tal como uma ou mais das técnicas reveladas aqui. Ao contrário, pode ser desejável selecionar um material que não passe radiação para um determinado comprimento de onda (por exemplo, sendo opaco, absorvível ou flexível). Isso pode ser útil para a formação de uma máscara a ser usada durante a fabricação do substrato estruturado, tal como um método revelado aqui; ou a ser usado para uma reação química ou detecção analítica realizada usando o substrato estruturado, tal como aqueles revelados aqui. Outras propriedades de material que podem ser exploradas são inércia ou reatividade para determinados reagentes usados em um processo a jusante, tal como aqueles revelados aqui; ou fácil de manipular ou barato durante a fabricação de um processo de fabricação, tais como aqueles revelados aqui. Exemplos adicionais de materiais que podem ser usados nos substratos estruturados ou métodos da presente divulgação estão descritos no Documento US 13/661.524 e a Publicação do Pedido de Patente US 2012/0316086 A1, cujas descrições encontram-se incorporadas ao presente a título de referência.
[051] Em uma concretização específica, pode ser feito e usado um substrato baseado em Sol-Gel. A padronização baseada em Sol-Gel pode ser realizada revestindo um substrato rígido ou flexível, tal como vidro, silício, plástico, metal ou similares, com um revestimento Sol-Gel pode ser realizado, por exemplo, através de revestimento por centrifugação, revestimento por imersão ou pulverização. O Sol-Gel pode ser fornecido em um estado líquido quando aplicado ao substrato e pode conter ou iniciadores foto ou térmicos que possibilitam a cura (tornado um líquido em um gel) através da exposição do Sol-Gel à luz ou a calor. Subsequente ao revestimento o substrato com o Sol-Gel, e antes da cura do material, o Sol-Gel pode ser impresso com um padrão (estampa tridimensional) que tem ou uma pluralidade de recurso(s) saliente(s). O padrão pode ser feito, por exemplo, de silício, vidro (tal como quartzo), metal (tal como níquel), plástico ou polímero (tal como PDMS). A impressão da estampa no Sol-Gel pode ser realizada colocando o padrão em contato com o Sol-Gel. Quando o padrão está em contato com o Sol-Gel, o Sol-Gel redistribui para circundar em conformidade a estrutura do padrão. Quando o padrão está em contato com o Sol-Gel, a redistribuição do Sol-Gel pode ser acionada ou através de uma força externa aplicada ao padrão ou ao substancialmente, ou através de forças capilares intrínsecas à natureza do padrão padronizado. Quando o padrão está em contato com o Sol-Gel, a pilha de substrato + Sol-Gel + padrão pode ser exposta à luz ou calor para curar o Sol-Gel e bloquear o padrão originalmente no padrão no Sol-Gel. Esse processo de padronização é convencionalmente referido como litografia de nano impressão. Seguindo a cura do Sol-Gel, o padrão pode ser separado do substrato + pilha de Sol-Gel, e o padrão podem ser descartado ou reutilizado para padronizar outro substrato revestido com um Sol-Gel. 0 substrato com o Sol-Gel padronizado curado pode ser então tomado para um processo de depósito químico, ou se for desejado um vidro puro tipo superfície, o substrato + pilha de Sol-Gel padronizado podem ser tomados através de um processo térmico (sinterização) que irá remover material orgânico que estava originalmente presente no Sol-Gel. Isso não é requerido, mas pode elaborar o substrato um material SÍO2 puro que tem vantagens em determinados esquemas de fixação.
[052] Outra abordagem para produzir um substrato padronizado é usar um material plástico tal como COC ou COP (tal como Zeonor ou Topas) e realizar um processo de estampagem térmica para criar o arranjo de entalhes. O processo é similar à litografia de nano impressão. Um substrato de plástico pode ser montado em um mandril que possa ter a temperatura controlada. O substrato de plástico pode ser então aquecido para uma temperatura de maneira que a crosta externa do plástico exceda a temperatura de transição do vidro. Embora o substrato esteja na temperatura elevada, o padrão é colocado em contato rígido com um padrão (por exemplo, quarta, silício, polimérico ou metálico). O padrão tipicamente tem uma força externa aplicada para assegurar que o plástico revista em conformidade completamente o padrão estruturado. Embora em contato na temperatura elevada, o plástico se redistribui para tornar-se uma réplica negativa do padrão; por exemplo, se o padrão possuir um arranjo de colunas então o plástico modelado resulta em arranjos de poços. Embora o padrão esteja em contato com o substrato de plástico, a temperatura do substrato é reduzida, reduzindo, assim o padrão modelado no substrato.
[053] Um recurso côncavo que está em um substrato pode ter qualquer um de uma variedade de formatos. Em termos do formato no substrato, o recurso pode ter lados curvos, lados lineares, cantos ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, os recursos podem ser poços que possuem aberturas na superfície que são circulares, ovais, quadradas, poligonais, em formato de estrela (com qualquer número de vértices), ou formatos irregulares. Os recursos podem ser canais e o formato dos canais na superfície pode incluir lados que são curvos, lineares, angulados ou uma combinação dos mesmos. Outros recursos de canal podem ser lineares, de serpentina, retangulares, quadrados, triangulares, circulares, ovais, hiperbólicos ou uma combinação dos mesmos. Os canais podem ter uma ou mais ramificações ou cantos. Os canais podem conectar dois pontos em uma superfície, um dos quais ou ambos podem ser a borda do substrato. A Figura 3B e a Figura 3C mostram recursos de canal exemplificativos em fiduciais de centro de mira juntamente com poços dentro e circundando os fiduciais de centro de mira.
[054] O formato em seção transversal de um recurso côncavo, tomado ortogonal à superfície, pode ter paredes que são curvas, lineares ou uma combinação das duas. Portanto, o formato em corte transversal pode ser uma parte de um círculo ou oval (por exemplo, em forma de U), ou pode ter dois ou mais lados lineares que se encontram em cantos (por exemplo, em forma de V, quadrado, poligonal ou de estrela). Em termos de formato em corte transversal, a parte inferior do recurso côncavo pode ser mais estreita, mais amplo, ou aproximadamente a mesma como a abertura na superfície. Esses formatos em corte transversal podem ser ilustrados para o caso onde o recurso côncavo é um poço, em cujo caso, a abertura na superfície será aproximadamente a mesma área da parte inferior do poço quando o poço tem uma seção transversal cilíndrica, enquanto a parte inferior do poço terá uma área diferente (tipicamente menor) do que a área da abertura na superfície quando o poço tem uma seção transversal cônica. Naturalmente, as seções transversais, apesar de ilustradas para poços, podem também se aplicar a canais.
[055] Para as concretizações onde os recursos côncavos formam poços, cada poço pode ter qualquer volume que possa confinar um líquido. O volume mínimo ou máximo pode ser selecionado, por exemplo, para acomodar o rendimento (por exemplo, multiplicidade), resolução, composição de analito, ou reatividade de analito esperada para usos a jusante do substrato. Por exemplo, o volume pode ser pelo menos 1 x 10’3 pm3, 1 x 10’2 pm3 , 0,1 pm3, 1 pm3, 10 pm3, 100 pm3, ou mais. Alternativa ou adicionalmente, o volume pode ser no máximo 1 x 104 pm3, 1 x 103 pm3, 100 pm3, 10 pm3, 1 pm3, 0,1 pm3ou menos. Será compreendido que o material em gel pode preencher todo ou parte do volume de um poço. O volume do gel em um poço individual pode ser maior do que, menor do que ou entre os valores especificados acima.
[056] A área ocupada por cada abertura de poço em uma superfície pode ser selecionada com base em critérios similares aos revelados para o volume do poço. Por exemplo, a área para cada abertura de poço em uma superfície pode ser pelo menos 1 x 10’3 pm2, 1 x 10’2 pm2, 0,1 pm2, 1 pm2, 10 pm2, 100 pm2, ou mais. Alternativa ou adicionalmente, a área pode ser no máximo 1 x 103 pm2, 100 pm2, 10 pm2, 1 pm2, 0,1 pm2, 1 x 10‘2 pm2, ou menos. A profundidade de cada poço pode ser pelo menos 0,1 pm, 1 pm, 10 pm, 100 pm ou mais. Alternativa ou adicionalmente, a profundidade pode ser no máximo 1 x 103 pm, 100 pm, 10 pm, 0,1 pm ou menos.
[057] Podem ser concebidos muitos posicionamentos diferentes de poços outros recursos côncavos, incluindo padrões regulares, de repetição, e não regulares. Por exemplo, os poços podem ser dispostos em uma grade hexagonal para embalagem compacta e densidade aperfeiçoada. Outros posicionamentos podem incluir, por exemplo, posicionamentos retilíneos (isto é retangulares), posicionamentos triangulares, e assim por diante. Os posicionamentos específicos, e diferenças entre os posicionamentos de domínios diferentes, se usados, podem seguir os ensinamentos da Patente US 7.813.013, e/ou Pedido de Patente US 13/267.565, cujas descrições encontram-se incorporadas ao presente a titulo de referência. Qualquer um de uma variedade de padrões cristalinos ou policristalinos pode ser útil.
[058] Um padrão de poços pode ser caracterizado em termos de passo médio (isto é, espaçamento centro a centro) para os poços. Novamente, o padrão pode ser regular de maneira que o coeficiente de variação em volta do passo médio é pequeno ou o padrão pode não ser regular, em cujo caso o coeficiente de variação pode ser relativamente grande. Em qualquer caso, o passo médio pode ser, por exemplo, pelo menos 10 nm, 0,1 pm, 0,1 pm, 0,5 pm, 1 pm, 5 pm, 10 pm, 100 pm ou mais. Alternativa ou adicionalmente, o passo médio pode ser, por exemplo, no máximo 100 pm, 5 pm, 1 pm, 0,5 pm, 0,1 pm ou menos. Naturalmente, o passo médio para um padrão específico de poços pode ser entre um dos valores mais baixos e um dos valores mais altos selecionado das variações acima.
[059] Um padrão de poços pode ser caracterizado com respeito à densidade de poços (isto é, o número de poços) em uma área definida. Por exemplo, os poços podem estar presente em uma densidade de aproximadamente 2 milhões por mm2 De acordo com os métodos de fabricação revelados aqui, a densidade pode ser facilmente sintonizada para densidades diferentes incluindo, por exemplo, uma densidade de pelo menos 100 por mm2, 1,000 por mm2, 0,1 milhão por mm21 milhão por mm2, 2 milhões por mm2, 5 milhões por mm2 ou mais. Alternativa ou adicionalmente,, a densidade pode ser sintonizada para não ser maior do que 5 milhões por mm2, 2 milhões por mm2, 1 milhão por mm2, 0,1 milhão por mm2, 1.000 por mm2, 100 por mm2, ou menos. Naturalmente, a densidade dos poços em um substrato pode ser entre os valores mais baixos e um dos valores mais altos selecionado das variações acima.
[060] Em concretizações específicas, é usado um material em gel. Em alguns casos, um material de formação de gel (por exemplo, passível de ser polimeri- zado) é fornecido para um suporte sólido em um estado líquido e subsequentemente convertidos para um gel. Exemplos de materiais passíveis de serem polimerizados incluem, sem limitação, acrilamida, metacrilamida, hidroxilmetacrilato, pirrolidona N- vinílica ou derivados dos mesmos. Tais materiais são úteis para fazer hidrogéis. Em algumas concretizações, o material passível de ser polimerizado pode incluir duas ou mais espécies diferentes de compostos que formam um copolímero. Por exemplo, duas ou mais espécies diferentes de acrilamida, metacrilamida, hidroxilmetacri- lato, pirrolidona N-vinílica ou derivados dos mesmos podem funcionar como como- nômeros que polimerizam para um hidrogel de copolímero. Os hidrogéis úteis incluem, mas não estão limitados a, polímero acrilamida sem silano (SFA) (ver Publicação do Pedido de Patente US 2011/0059865 A1, cuja divulgação encontra-se incorporada ao presente a título de referência), poli(N-(5-azidoacetamidilpentil) acrilami- da-co-acrilamida) (PAZAM, ver, por exemplo, Pedido de Patente Provisório US 61/753.833, cuja divulgação encontra-se incorporada ao presente a título de referência), polímeros de poliacrilamida formados de acrilamida um ácido acrílico ou um ácido acrílico que contém um grupo vinila conforme descrito, por exemplo, no Documento WO 00/31148 (cuja divulgação encontra-se incorporada ao presente a título de referência); polímeros de poliacrilamida formados a partir de monômeros que formam reações de foto-cicloadição [2+2], por exemplo, conforme descrito no WO 01/01143 ou WO 03/014392 (cujas descrições encontram-se incorporadas ao presente a titulo de referência); ou copolímeros poliacrilamida descritos na Patente US 6.465.178, WO 01/62982 ou WO 00/53812 (cujas descrições encontram-se incorporadas ao presente a titulo de referência). As variações quimicamente tratadas desses materiais em gel são também úteis, tais como SFA quimicamente tratado feito para reagir com oligonucleotídeos que possuem um grupo reativo correspondente (tais como a azidólise de SFA para produzir azido-SFA que é reativo com 5’ - ou 3’ - oligonucleotídeos modificados com alquinila). Hidrogéis e materiais passíveis de serem polimerizados exemplificativos que podem ser usados para formar hidrogéis estão descritos, por exemplo, no Documento US 753.833 ou Publicação do Pedido de Patente US 2011/0059865 A1, cujas descrições encontram-se incorporadas ao pre-sente a título de referência. Outros géis úteis são aqueles formados por uma alteração que depende de temperatura em estado de líquido para gelatinoso. Os exem- pios incluem, mas não se limitam a, ágar-ágar, agarose ou gelatina.
[061] O material em gel que está em um poço ou outro recurso côncavo na superfície de um substrato estruturado pode ser fixado de modo covalente à superfície. Por exemplo, PAZAM pode ser fixado de modo covalente à superfície usando materiais de superfície e outros reagentes revelados no Documento US 753.833, cuja divulgação encontra-se incorporada ao presente a título de referência, conforme revelados a seção de Exemplos aqui. Entretanto, o material em gel não precisa ser fixado de modo covalente aos poços ou outros recursos côncavos conforme exemplificado para SFA na seção dos Exemplos abaixo.
[062] Um ou mais analitos podem estar presentes no ou sobre o material em gel que esteja presente em um substrato estruturado. Os substratos que contêm gel da presente revelação são particularmente úteis para a detecção de analitos, ou para realizar reações sintéticas com analitos. Portanto, qualquer um de uma variedade de analitos que deva ser detectado, caracterizado, modificado, sintetizado, ou coisa parecida pode estar presente no ou sobre o material em gel de um substrato revelado aqui. Os analitos exemplificativos incluem, mas não se limitam a, ácidos nucleicos (por exemplo, DNA, RNA ou análogos dos mesmos), proteínas, polissacarídeos, células, anticorpos, epitopos, receptores, ligantes, enzimas (por exemplo, quinase, fos- fatase ou polimerase), candidatos a droga de molécula pequena, ou similares. Um substrato estruturado pode incluir múltiplas espécies diferentes de uma biblioteca de analitos. Por exemplo, as espécies podem ser anticorpos diferentes de uma biblioteca de anticorpo, ácidos nucleicos que possuem sequências diferentes de uma biblio-teca de ácidos nucleicos, proteínas que possuem estrutura diferente e/ou função de uma biblioteca de proteínas, candidatos à droga de uma biblioteca de combinação de pequenas moléculas, etc.
[063] Em algumas concretizações, os analitos podem ser distribuídos em um substrato estruturado de maneira que possam ser resolúveis individualmente. Por exemplo, uma única molécula de cada analito pode estar presente em cada poço contendo gel de um substrato estruturado. Alternativamente, os analitos podem estar presentes como colônias ou populações de maneira que as moléculas individuais não sejam necessariamente resolvidas. As colônias ou populações podem ser homogêneas com respeito a conter apenas uma única espécie de analito (embora em múltiplas cópias). Tomando os ácidos nucleicos como um exemplo, cada poço em um substrato estruturado pode incluir uma colônia ou população de ácidos nucleicos e cada ácido nucleico na colônia ou população pode ter a mesma sequência de nucleotídeos (seja padrão simples ou padrão duplo). Tais colônias podem ser criadas por amplificação de grupamento ou amplificação de ponte conforme revelado em maior detalhe em outro local aqui. Múltiplas repetições de uma sequência alvo podem estar presentes em uma única molécula de ácido nucleico, tal como um con- catenador criado usando um procedimento de amplificação de círculo rolante. Portanto, o material em gel em cada poço em um substrato estruturado pode conter múltiplas cópias de uma única espécie de um analito. Alternativamente, uma colônia ou população de analitos que estão em um poço pode incluir duas ou mais espécies diferentes. Por exemplo, um ou mais poços em um substrato estruturado pode conter uma colônia mista que possua duas ou mais espécies de ácido nucleico diferentes (isto é, moléculas de ácido nucleico com sequências diferentes). As duas ou mais espécies de ácido nucleico diferentes em uma colônia mista podem estar presentes em quantidades não insignificantes, por exemplo, permitindo mais de um ácido nucleico a ser detectado na colônia mista.
[064] Os analitos podem ser fixados a um material em gel. A fixação pode ser covalente ou não covalente. Os métodos e reagentes exemplificativos para fixar ácidos nucleicos a géis estão descritos, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente US 2011/0059865 A1 ou Pedido de Patente Provisório US 61/753.833, cujas descrições encontram-se incorporadas ao presente a título de referência. Os analitos podem ser ácidos nucleicos e os ácidos nucleicos podem ser fixados ao gel por meio de 3’ oxigênio, 5’ hidrogênio ou em outros locais ao longo de sua extensão tal como por meio de uma metade de base do 3’ terminal nucleotídeo, uma metade de base do 5’ nucleotídeo, e/ou uma ou mais metades em outro local na molécula. Os modos não covalentes de fixação incluem, por exemplo, interações iônicas entre ácido nucleico e gel, aprisionamento de ácido nucleico dentro de poros de um gel, interações de proteína - proteína, ligação entre receptores e ligantes no gel e/ou ácido nucleico, e outros modos conhecidos.
[065] Em algumas concretizações, um revestimento em gel que é aplicado a uma superfície contém um ou mais analitos antes de remover material em gel das regiões intersticiais. Portanto, o material em gel pode estar presente nas regiões intersticiais e o material em gel nas regiões intersticiais pode ser fixado a um ou mais analitos diferentes. Alternativamente, os analitos são adicionados a um material em gel em recursos côncavos após a remoção das regiões intersticiais.
[066] Um substrato estruturado da presente divulgação pode ocorrer em uma célula de fluxo. Células de fluxo exemplificativas, métodos para sua fabricação e métodos para seu uso estão descritos na Publicação dos Pedidos de Patente US 2010/0111768 A1 ou 2012-0270305 A1; ou WO 05/065814, cujas descrições encon- tram-se incorporadas ao presente a título de referência; As células de fluxo fornecem um formato conveniente para alojar um arranjo que seja produzido pelos métodos da presente divulgação para uma sequência por síntese (SBS) ou outra técnica que envolva distribuições repetidas de reagentes nos ciclos (por exemplo, técnicas de síntese ou técnicas de detecção que possuem etapas repetitivas ou cíclicas). Os métodos de detecção exemplificativos estão revelados em maior detalhe abaixo.
[067] Em algumas concretizações é usada uma célula de fluxo ou outro recipiente que possua múltiplas superfícies. Os recipientes que possuem múltiplas superfícies podem ser usados de maneira que apenas uma única superfície possua recursos côncavos contendo gel (por exemplo, poços). Alternativamente, duas ou mais superfícies presentes no recipiente podem ter recursos côncavos contendo gel. Uma ou mais superfícies de uma célula de fluxo pode ser detectada seletivamente. Por exemplo, superfícies opostas dentro de uma célula de fluxo podem ser seletivamente tratadas com radiação focada usando métodos conhecidos na técnica tais como técnicas confocais. As técnicas confocais úteis e dispositivos para direcionar seletivamente a radiação para múltiplas superfícies de um recipiente (por exemplo, uma célula de fluxo) são descritas, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente US 2009/0272914 A1 ou Patente US 8.039.817, cujas descrições encontram-se incorporadas ao presente a título de referência.
[068] A presente divulgação fornece um método de elaboração de um substrato. O método pode incluir as etapas de (a) fornecer um suporte sólido que possua uma superfície plana, em que a superfície plana é interrompida por um ou mais recursos côncavos e em que o um ou mais recursos côncavos são limitados por uma ou mais regiões intersticiais na superfície plana; (b) revestir uma parte do suporte sólido com material em gel, em que a parte inclui pelo menos um dos recursos côncavos e pelo menos uma das regiões intersticiais; e (c) polir a superfície plana para remover o material em gel da pelo menos uma das regiões intersticiais e manter o material em gel no pelo menos um recurso côncavo.
[069] Pode ser fabricado um substrato para ser dotado de recursos côncavos usando qualquer uma de uma variedade de técnicas conhecidas na técnica. Em muitas concretizações, os recursos côncavos serão pequenos, na ordem das dimensões nanomedidas ou micromedidas. Em tais casos podem ser usadas técnicas de nanofabricação ou microfabricação. Exemplos dessas técnicas estão revelados em outro ponto deste pedido tal como no Exemplo II abaixo. Técnicas de nanofabricação ou microfabricação adicionais estão descritas no Documento US 13/661.524 e Publicação do Pedido de Patente US 2012/0316086 A1, cujas descrições encon- tram-se incorporadas ao presente a título de referência.
[070] Um ou mais recursos côncavos, tais como poços, podem ser revestidos com material em gel pré-formado ou com um líquido que subsequentemente forme um material em gel. Um exemplo da abordagem anterior é o revestimento de um substrato com PAZAM pré-formado usando revestimento de rotação, mergulho, fluxo do gel sob pressão positiva ou negativa ou técnicas reveladas no Pedido de Patente Provisório US 61/753.833, cuja divulgação encontra-se incorporada ao presente a título de referência. O revestimento de um arranjo de poços com PAZAM pré-formado está demonstrado abaixo no Exemplo III. Um exemplo de aplicação de líquido que subsequentemente forma um material em gel é o revestimento de um arranjo de poços com silano sem acrilamida e N-[5-(2-bromoacetil) aminopentil] acri- lamida (BRAPA) em forma líquida e permitindo que os reagentes formem um gel por polimerização na superfície. O revestimento de um arranjo dessa maneira está de-monstrado no Exemplo I abaixo e pode usar reagentes químicos e procedimentos conforme revelados na Publicação do Pedido de Patente US 2011/0059865 A1, cuja divulgação encontra-se incorporada ao presente a título de referência. Em algumas concretizações, por exemplo, quando um substrato contendo poço é mergulhado em um material em gel pré-formado, o material em gel pode preencher os poços seletivamente e o polimento pode não ser necessário.
[071] Podem ser adicionados analitos em um material em gel antes de contatar com um suporte sólido ou posteriormente. Além disso, os analitos podem ser adicionados a um gel (isto é, após o gel ser formado a partir de seus reagentes precursores) ou os analitos podem ser adicionados a uma solução reagente de formação de gel (isto é, antes da formação de gel). Em algumas concretizações vários analitos podem ser adicionados antes da formação de gel e outros podem ser adicionados após a formação do gel. Em um exemplo, os ácidos nucleicos iniciadores são adicionados a uma solução de formação de gel e a solução é então permitida a formar em um gel (por exemplo, por polimerização como ocorre para SFA e PAZAM). A formação de gel pode ocorrer em um suporte sólido ou o gel pode ser pré-formado e então revestido em um suporte sólido. De qualquer modo, os iniciadores serão fixados ao gel que esteja presente nos recursos côncavos tais como poços. Os ácidos nucleicos alvos que são complementares para os iniciadores podem ser então adicionados ao gel que contém iniciador de maneira que os ácidos nucleicos alvos se tornam fixados ao gel (via hibridização) após o material em gel ter sido revestido no suporte sólido. A hibridização dos ácidos nucleicos alvos pode opcionalmente ocorrer após uma etapa de polimento ter ser realizada (polimento está descrito em maior detalhe abaixo). O exemplo precedente descreve vários casos onde os ácidos nucleicos (funcionam como iniciadores ou alvos) são adicionados ao gel em estágios diferentes da fabricação de um substrato estruturado.
[072] Em várias concretizações, os ácidos nucleicos iniciadores que são fixados a um gel (ou presentes de outro modo no ou sobre um gel) podem ser usados para capturar e/ou amplificar os ácidos nucleicos padrões. Os iniciadores podem ser iniciadores universais que hibridizam para uma sequência adaptadora universal que é fixada em ácidos nucleicos alvos diferentes em uma biblioteca (isto é, cada ácido nucleico alvo inclui uma região alvo que difere de outros ácidos nucleicos alvos na biblioteca e vários ácidos nucleicos alvos na biblioteca possuem a mesma sequência adaptadora universal). Em algumas concretizações, um ácido nucleico alvo pode ser fixado ao material em gel, e os iniciadores (se em solução ou também fixado ao gel) podem ser usados para amplificar o ácido nucleico alvo fixado (por exemplo, o ácido nucleico alvo pode servir como um padrão para amplificação).
[073] Um método revelado aqui pode usar qualquer uma de uma variedade de técnicas de amplificação. Técnicas exemplificativas que podem ser usadas incluem, mas não se limitam a, reação de cadeia polimerase (PCR), amplificação de circulo rolante (RCA), amplificação de deslocamento múltiplo (MDA), ou amplificação de início aleatório (RPA). Em concretizações especificas, um ou mais iniciadores usados para amplificação podem ser fixados a um material em gel. Nas concretizações PCR, um ou ambos iniciadores usados para amplificação podem ser fixados a um material em gel. Os formatos que utilizam duas espécies de iniciador fixado são frequentemente referidos como amplificação de ponte porque um amplicão de cadeia dupla forma uma estrutura tipo ponte entre os dois iniciadores fixados que orlam a sequência padrão que foi copiada. Reagentes e condições exemplificativos que podem ser usados para amplificação de ponte estão descritos, por exemplo,, na Patente US 5.641.658; na Publicação de Patente US 2002/0055100; na Patente US 7.115.400; Publicação de Patente US 2004/0096853; Publicação de Patente US N° 2004/0002090; Publicação de Patente US N° 2007/0128624; e Publicação de Patente US N° 2008/0009420, cujas descrições encontram-se incorporadas ao presente a título de referência. A amplificação PCR pode ser também realizada com um dos iniciadores de amplificação fixado ao material em gel e o segundo iniciador em solução. Um formato exemplificativo que usa uma combinação de um iniciador fixado de fase sólida e um iniciador de fase de solução é emulsão PCR conforme descrito, por exemplo, em Dressman etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003), WO 05/010145, ou Publicação de Patente US 2005/0130173 ou 2005/0064460, cujas descrições encontram-se incorporadas ao presente a título de referência. A emulsão PCR é ilustrativa do formato e será compreendido que para os propósitos dos métodos revelados aqui o uso de uma emulsão é opcional e, na verdade, para várias concretizações não é usada uma emulsão. Além disso, os iniciadores não precisam ser fixados diretamente aos suportes sólidos conforme revelado nas referências e PCR e podem, em vez disso, ser fixados ao material em gel conforme revelado aqui. Em alguns formatos de PCR de fase sólida ou amplificação de ponte, um ácido nucleico alvo pode ser fixado a um material em gel e usado como um padrão para amplificação.
[074] As técnicas RCA podem ser modificadas para uso em um método da presente divulgação. Os componentes exemplificativos que podem ser usados em uma reação RCA e princípios pelos quais RCA produz amplicons estão descritos, por exemplo, em Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998) e Publicação do Pedido de Patente US 2007/0099208 A1, cujas descrições encontram-se incorporadas ao presente a título de referência. Os iniciadores usados para RCA podem estar em solução ou fixados ao material em gel.
[075] As técnicas MDA podem ser modificadas para serem usadas em um método da presente divulgação. Alguns princípios básicos e condições úteis para MDA estão descritos, por exemplo, em Dean et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2202); Pesquisa de Genoma 13:294-307 (2003); Walker et al., Métodos Moleculares para Detecção de Vírus, Academic Press, Inc., 1995; Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992), Patentes US 5.455.166; 5.130.238 e 6.214.587, cujas descrições encontram-se incorporadas ao presente a título de referência. Os iniciadores usados para MDA podem estar em solução ou fixados a um material em gel.
[076] Em concretizações específicas, pode ser usada uma combinação das técnicas de amplificação exemplificadas acima. Por exemplo, RCA e MDA podem ser usadas em uma combinação em que RCA é usada para gerar um amplicon con- catamérico em solução (por exemplo, usando iniciadores de fase de solução). O amplicon pode ser então usado como um padrão para MDA usando iniciadores que são fixados ao material em gel. Nesse exemplo, os amplicons produzidos após as etapas RCA e MDA combinadas serão fixados ao material em gel. Os amplicons geralmente contêm repetições concataméricas de uma sequência de nucleotídeos alvo.
[077] As técnicas de amplificação, tais como aquelas explicadas acima, podem ser usadas para produzir recursos que contêm gel que possuem múltiplas cópias de ácidos nucleicos alvos. Um recurso individual, tal como um poço, pode ter uma população clonal de sequências de nucleotídeos na forma de um único conca- tâmero de molécula, tais como aqueles produzidos por RCA, ou na forma de muitas moléculas de ácido nucleico que possuem a mesma sequência tais como aquelas produzidas por ponte PCR. Geralmente o(s) ácido(s) nucleico(s) que possuem várias cópias do alvo amplificado será fixado ao material em gel.
[078] Para algumas aplicações, um poço individual que contém gel (ou outro recurso côncavo) pode ser predominantemente povoado com amplicons provenientes de um primeiro ácido nucleico alvo e pode também possuir um nível baixo de amplicons de contaminação provenientes de um segundo ácido nucleico alvo ou de uma mutação espontânea que ocorra durante a amplificação. Um arranjo pode ter um ou mais locais de amplificação que possuem um nível suficientemente baixo de amplicons de contaminação de modo a ter um impacto inaceitável em um uso subsequente do arranjo. Por exemplo, quando um arranjo deva ser usado em uma aplicação de detecção, um nível aceitável de contaminação poderia ser um nível que não impacta sinal para ruído ou resolução da técnica de detecção em uma maneira inaceitável. Portanto, a clonalidade aparente será geralmente relevante para um uso específico ou aplicação de um arranjo feito pelos métodos revelados aqui. Níveis exemplificativos de contaminação que podem ser aceitáveis em um poço individual ou outro recurso para aplicações específicas incluem, mas não estão limitados a, no máximo 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10% ou 25% de amplicons contaminantes. Um arranjo pode incluir um ou mais poços ou outros recursos que possuam esses níveis exemplificativos de amplicons contaminantes. Por exemplo, até 5%, 10%, 25% 50%, 75% ou até 100% dos recursos em um arranjo pode ter alguns amplicons contaminantes.
[079] Um material em gel que tenha sido revestido na superfície de um suporte sólido pode ser fixado de modo covalente ao suporte. Conforme revelado acima, a etapa de fixação de um analito, tal como um ácido nucleico, ao material em gel pode ser realizada em vários estágios diferentes na fabricação de um substrato es- truturado. Portanto, um material em gel pode ser fixado ao suporte sólido antes ou após a fixação de um analito ao material em gel. A fixação de material em gel a um suporte sólido pode ser realizada usando qualquer química útil incluindo sem limitação aquelas reveladas no Pedido de Patente Provisório US 753.833, cuja divulgação encontra-se incorporada ao presente a título de referência, ou demonstrada no Exemplo III abaixo. Será compreendido que a fixação covalente de material em gel a um suporte sólido não está necessariamente em todas as concretizações. Portanto, as etapas subsequentes de polimento de um suporte revestido com gel ou usando um substrato polido podem ser realizadas para um substrato que possua material em gel que seja opcionalmente, mas não necessariamente, fixado de modo covalente aos recursos côncavos, tais como poços.
[080] Um método revelado aqui pode incluir uma etapa de remoção de material em gel da superfície de um suporte sólido. O material em gel que é revestido em um suporte sólido pode ser seletivamente removido das regiões intersticiais usando qualquer uma de uma variedade de técnicas. Por exemplo, o material em gel pode ser removido de um suporte sólido que contém recursos côncavos e regiões intersticiais por uma técnica de polimento mecânico. O polimento mecânico pode ser realizado pela aplicação de forças abrasivas à superfície do suporte sólido. Métodos exemplificativos incluem abrasão com pasta de grânulos, esfregando com uma lâmina ou pano, fragmentando ou coisa parecida. Um exemplo de polimento inclui o uso de toalhas sem fiapos (grau de sala limpa) revestidas de pasta de grânulo de sílica 3 pm (10% em peso/volume em água) para remover gel intersticial. Pode ser também usado um polimento roda / amolador com essa pasta fluida. O polimento mecânico pode ser também alcançado usando um jato fluido ou jato de ar para remover gel das regiões intersticiais.
[081] O polimento pode envolver polimento químico tal como hidrólise ou degradação baseada em radical de acrilamida (por exemplo, por meio da exposição a peróxido benzeno ou peróxido de hidrogênio diluído conforme descrito em Kuren- kov, et al., Jornal Russo de Química aplicada, 75:1039-1050 (2002); Caulfield et al., Polym. 44:1331-1337 (2003); e Caulfield et al., Chem. Rev. 102:3067-3038 (2002)).
[082] O polimento pode também envolver uma combinação de métodos de polimento químico e mecânico onde uma pasta química contendo uma suspensão coloidal de partículas é usada para esfoliar mecanicamente e então dissolver quimicamente parte de material em gel das regiões intersticiais. Outros métodos para polir ou limpar as regiões intersticiais incluem técnicas baseadas em adesivo, por exemplo, técnicas em que um filme adesivo planar rígido com afinidade com material em gel é revestido na superfície, desse modo fazendo um contado íntimo (por exemplo, através de ligação química) com o material em gel nas regiões intersticiais. A remo- ção/escamação mecânica desse filme adesivo irá resultar na remoção mecânica do material em gel das regiões intersticiais, embora deixando material em gel nos recursos côncavos.
[083] Em outro exemplo, SFA enxertado de tiofosfato pode ser removido das regiões intersticiais em uma superfície como se segue. Um lenço Whatman umedecido com água pode ser esfregado em óxido de Alumínio (~100mg, 0,3pm) ou grânulos de aço. Então, a pasta formada pode ser esfregada na superfície de um suporte sólido, em pequenos círculos concêntricos, usando a mesma pressão. Um lenço Whatman umedecido com água limpa pode ser então usado para remover a pasta na superfície. Os métodos de polimento mecânico e químico exemplificados aqui para remover material em gel de regiões intersticiais podem ser também usados para inativar material em gel em regiões intersticiais, seja ou não o material em gel removido. Por exemplo, o material em gel pode ser inativado com respeito à habilidade de fixar analitos tais como ácidos nucleicos ou com respeito à habilidade para suportar amplificação de ácido nucléico.
[084] Um método para produzir um arranjo pode incluir as etapas de (a) fornecer um suporte sólido tendo uma superfície com uma pluralidade de poços, os poços contendo um material em gel, os poços sendo separados um do outro por regiões intersticiais na superfície, as regiões intersticiais segregando o material em gel em cada um dos poços do material em gel em outros poços dentre a pluralidade; (b) entregar uma biblioteca de ácidos nucleicos alvos nos poços do suporte sólido para produzir um arranjo de poços que têm uma única espécie de ácido nucleico preso ao material em gel em cada poço, em que diferentes poços no arranjo têm diferentes espécies de ácido nucleico alvo da biblioteca; e (c) amplificar os ácidos nucleicos alvos presos no material em gel nos poços do arranjo para produzir uma população clonal de um ácido nucleico alvo individual em cada um dos poços do arranjo.
[085] Em diversas concretizações, os substratos estruturados revelados aqui fornecem a vantagem de entrega conveniente de múltiplos analitos diferentes a partir de uma mistura de locais individualizados no substrato, desse modo formando um arranjo. Os substratos estruturados facilitam captura seletiva de um único analito em cada poço (ou outro recurso côncavo) contendo gel individual a partir de uma mistura de analitos em contato com o substrato. O padrão de poços (ou outros recursos côncavos) contendo gel no substrato estruturado e a eficiência de carregamento podem ser ajustados para se obter arranjos tendo características desejadas tais como densidade de analito e pureza de cada recurso com respeito a ter uma única espécie de analito. Por exemplo, uma densidade mais alta de poços pode ser usada para se obter uma densidade mais alta de analitos no arranjo e, de modo oposto, uma densidade mais baixa de poços pode ser usada para se obter uma densidade mais baixa de analitos no arranjo. Alternativamente ou adicionalmente, a concentração de quantidade de analito na solução pode ser aumentada para se obter uma densidade mais alta de analitos no arranjo ou diminuída para se obter uma densidade mais baixa de analitos no arranjo. A pureza média de analitos em cada poço (ou outro recurso côncavo) contendo gel pode ser ajustada alterando-se as propriedades do subs- trato ou condições para entrega de analito como revelado em maior detalhe abaixo e demonstrado na seção de Exemplos.
[086] Em concretizações particulares, o tamanho ou volume das paredes (ou outros recursos côncavos) podem ser ajustados para influenciar a pureza de analitos capturados. Por exemplo, um poço pode ter uma área ou volume de material em gel que acomode apenas um único analito de um tipo particular de modo que exclusão estérica impeça que mais de uma molécula de analito seja capturada no ou semeie o poço. A exclusão estérica pode ser particularmente útil para analitos grandes tais como ácidos nucleicos. Mais especificamente, poços (ou outros recursos côncavos) podem apresentar uma superfície de gel tendo uma área que é equivalente ao ou menor que o diâmetro do volume excluído dos ácidos nucleicos alvos que devem ser semeados no substrato. O volume excluído para um ácido nucleico alvo e seu diâmetro pode ser determinado, por exemplo, a partir do comprimento do ácido nucleico alvo. Métodos para determinar o volume excluído de ácidos nucleicos alvo e seu diâmetro são descritos, por exemplo, na patente US 7.785.790; Rybenkov e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. US A. 90:5307-5311 (1993); Zimmerman e outros; J. Mol. Biol. 222:599-620; ou Sobel e outros, Bioploymers 31:1559-1564 (1991), cada um dos quais é incorporado aqui como referência. As condições para exclusão estérica estão reveladas no documento US 13/661.254 e patente US 7.785.790, cada um dos quais é incorporado aqui como referência, e podem ser prontamente usadas para substratos estruturados da presente divulgação.
[087] Será entendido que em algumas concretizações, poços (ou outros recursos côncavos) podem apresentar uma superfície de gel tendo uma área que é substancialmente maior que o diâmetro do volume excluído dos ácidos nucleicos alvos que são transportados para os locais de amplificação. Assim, a área para os recursos pode ser suficientemente grande para que a exclusão estérica não ocorra.
[088] Em algumas concretizações, tais como as concretizações de exclusão reveladas acima, uma biblioteca de ácidos nucleicos alvos pode ser enviada para os poços (ou outros recursos côncavos) contendo gel de um suporte sólido antes da iniciação de um processo de amplificação. Por exemplo, ácidos nucleicos alvos po-dem ser enviados para um substrato estruturado sob condições para semear o mate-rial em gel no substrato com os ácidos nucleicos alvos. O substrato pode opcional-mente pode ser lavado para remover ácidos nucleicos alvos que não semeiam o gel e também quaisquer outros materiais que sejam indesejados para subsequente pro-cessamento ou uso do substrato. A amplificação pode incluir uma ou mais das técni-cas reveladas anteriormente aqui.
[089] Em concretizações alternativas, uma biblioteca de ácidos nucleicos alvos pode ser enviada para os poços (ou outros recursos côncavos) de um suporte sólido e um processo de amplificação pode ocorrer simultaneamente ao evento de semeadura. Por exemplo, a semeadura pode ocorrer sob um regime que explore exclusão cinética conforme descrito, por exemplo, no documento US 67/715.478, que é incorporado aqui como referência. A exclusão cinética pode ocorrer quando um processo ocorre a uma taxa suficientemente rápida para efetivamente excluir a ocorrência de outro evento ou processo. No caso de um arranjo de poços contendo gel, os poços podem ser semeados aleatoriamente com ácidos nucleicos alvos a partir de uma solução e cópias do ácidos nucleicos alvos podem ser geradas em um processo de amplificação para preencher cada um dos locais semeados por inteiro. Os processos de semeadura e amplificação podem prosseguir simultaneamente sob condições em que a taxa de amplificação excede a taxa de semeadura. Sendo assim, a taxa relativamente rápida à qual cópias são feitas em um local que foi semeado por um primeiro ácido nucleico alvo não vai efetivamente excluir a semeadura do local para amplificação por um segundo ácido nucleico. Similarmente, exclusão cinética pode explorar uma taxa relativamente baixa para fazer uma primeira cópia de um ácido nucleico alvo em oposição a uma taxa relativamente rápida para fazer có- pias subsequentes do ácido nucleico alvo ou da primeira cópia. Por exemplo, exclusão cinética pode ocorrer devido a um retardo na formação de uma primeira cópia de um ácido nucleico alvo que tenha semeado um poço contendo gel (por exemplo, ativação retardada ou lenta) em oposição à taxa relativamente rápida à qual cópias subsequentes são feitas para preencher o local. Nesse exemplo, um poço contendo gel individual pode ter sido semeado com diversos ácidos nucleicos alvos diferentes (por exemplo, diversos ácidos nucleicos alvos podem estar presentes em cada local antes da amplificação). Entretanto, a formação de primeira cópia para qualquer ácido nucleico alvo dado pode ser ativada aleatoriamente de maneira que a taxa média da primeira formação de cópia seja relativamente lenta comparada à taxa em que cópias subsequentes são geradas. Nesse caso, embora um poço contendo gel individual possa ter sido semeado com diversos ácidos nucleicos alvos diferentes, a exclusão cinética vai permitir que apenas um desses ácidos nucleicos alvos seja amplificado. Geralmente, um poço contendo gel (ou outro recurso côncavo) pode servir de local para amplificação e formação de arranjo em um método revelado no documento US 61/715.478, que é incorporado aqui por referência.
[090] Como uma alternativa ao enfio de diferentes analitos a partir de uma mistura de recursos côncavos individuais contendo gel, analitos podem ser enviados separadamente para recursos individuais de estoques puros. Similarmente, analitos podem ser sintetizados em recursos individuais por envio separado de blocos de construção sintéticos (por exemplo, precursores nucleotídeos podem ser enviados em sequência para sintetizar ácidos nucleicos). Métodos exemplificativos para envio de analitos puros ou blocos de construção para sintetizar analitos em seu lugar natural incluem, mas não estão limitados a, identificação de arranjo por jato de tinta e síntese de arranjo fotolitográfico. Métodos litográficos úteis incluem aqueles usados comercialmente pela Affymetrix (Santa Clara, CA) para manufaturar microarranjos GeneChip® ou descritos nas patentes US 5.324.633; 5.744.305; 5.624.711; 6.022.963; 6.291.183; e 6.416.949, cada uma das quais é aqui incorporada como referência. Também úteis são técnicas de identificação por jato de tinta como aquelas comercializadas por Agilent (Santa Clara, CA) par imprimir arranjos SurePrint ™ ou descritas nas patentes US 6.337.393; 6.419.883; 6.240.180 ou 6.689.319, cada uma das quais é incorporada aqui como referência. Esses métodos podem ser prontamente modificados para direcionar a entrega dos recursos contendo gel da presente divulgação.
[091] O material em gel em um recurso côncavo particular não precisa conter apenas uma única espécie de analito. Ao contrário, em algumas concretizações um recurso côncavo pode conter diversas espécies diferentes de analito no gel na mesma. Um exemplo é demonstrado pelos marcadores fiduciais centro de mira na Figura 5. Os marcadores fiduciais incluem dois canais “claros” em forma de anel, cada um dos dois canais contém material em gel, e o material em gel em cada canal claro está preso a uma pluralidade de colônias de ácido nucleico diferentes. As colônias de ácido nucleico nos canais claros foram formadas pela semeadura de cada anel com diversas espécies diferentes de ácido nucleico alvo que funcionaram como modelo em um procedimento de amplificação. O marcador fiducial também inclui duas regiões “escuras” em forma de anel. Os anéis escuros são formados por padrões de superfície intersticiais. O centro de mira exemplificativo é formado alternando-se anéis escuros e claros em um padrão concêntrico. No exemplo da Figura 5 o substrato estruturado também inclui poços contendo gel que contêm, cada um, uma população clonal derivada de um único ácido nucleico alvo. Os poços ocorrem e uma fita em forma de anel entre os anéis claro e escuro. Assim, os fiduciais têm um padrão alternado de anel intersticial, fita que contém poço e anel de canal. O mesmo procedimento de amplificação foi usado para simultaneamente desenvolver as colônias de ácido nucleico nos poços e a população mista no marcador fiducial (ver Exemplo III, abaixo). Outros exemplos de fiduciais tendo padrões alternativos de anéis são mostrados na Figura 3B e Figura 3C.
[092] Essa divulgação fornece ainda um método de detectar analitos. O método pode incluir as etapas de (a) fornecer um suporte sólido tendo uma superfície plana, em que a superfície plana é interrompida por um ou mais recursos côncavos, em que os recursos côncavos contêm material em gel, em que o um ou mais recursos côncavos são delimitados por uma ou mais regiões intersticiais na superfície plana, as regiões intersticiais sendo substancialmente desprovidas do material em gel, e em que o material em gel está preso a ou contém analitos alvos; (b) contatar o suporte sólido com sondas sob condições em que os analitos alvos interagem especificamente com as sondas; e (c) detectar o suporte sólido para distinguir pelo menos um subconjunto dos analitos alvos que interagem com uma ou mais das sondas.
[093] Em concretizações particulares ácidos nucleicos são os analitos que são detectados e os recursos côncavos são poços. Por exemplo, um método de detectar ácidos nucleicos pode incluir as etapas de (a) fornecer um suporte sólido tendo uma superfície e de uma biblioteca de ácidos nucleicos, a superfície tendo uma pluralidade de poços, os poços contendo um material em gel, os poços sendo separados um do outro por regiões intersticiais na superfície, as regiões intersticiais segregando o material em gel em cada um dos poços do material em gel em outros poços da pluralidade, uma única espécie dos ácidos nucleicos alvos da biblioteca sendo presos ao material em gel em cada um dos poços; (b) contatar o suporte sólido com pelo menos uma sonda que se liga aos ácidos nucleicos alvo; e (c) detectar o suporte sólido para distinguir os poços tendo uma espécie de ácido nucleico que se liga à pelo menos uma sonda.
[094] Substratos estruturados da presente divulgação que contêm arranjos de ácidos nucleicos podem ser usados para qualquer um dentre uma variedade de propósitos. Um uso particularmente desejável para o ácido nucleico é servir como sondas de captura que hibridizam em ácidos nucleicos alvos tendo sequências com- plementares. Os ácidos nucleicos alvos uma vez hibridizados para as sondas de captura podem ser detectadas, por exemplo, por meio de uma etiqueta recrutada para a sonda de captura. Métodos para detecção de ácidos nucleicos alvos por meio de hibridização para capturar sondas são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, aqueles descritos nas patentes US 7.582.420; 6.890.741; 6.913.884 ou 6.355.431 ou patente US 2005/00553980 A1; 2009/0186349 A1 ou 2005/0181440 A1, cada uma das quais é incorporada aqui como referência. Por exemplo, uma etiqueta pode ser recrutada para uma sonda de captura em virtude de hibridização da sonda de captura para uma sonda alvo que porta a etiqueta. Em outro exemplo, uma etiqueta pode ser recrutada para uma sonda de captura pela hibridização de uma sonda alvo para a sonda de captura de modo que a sonda de captura possa ser estendida pela ligação a um oligonucleotídeo etiquetado (por exemplo, por meio de uma atividade de ligase) ou pela adição de um nucleotídeo etiquetado (por exemplo, via atividade de polimerase).
[095] Um arranjo de ácido nucleico também pode ser usado em um procedimento de sequenciamento, tal como uma técnica de sequenciamento-por-síntese (SBS). Em resumo, SBS pode ser iniciado pelo contato dos ácidos nucleicos alvos com um ou mais nucleotideos etiquetados, polimerase de DNA, etc. Esses recursos onde um iniciador é estendido usando-se o ácido nucleico alvo como modelo irão incorporar um nucleotídeo etiquetado que pode ser detectado. Opcionalmente, os nucleotideos etiquetados podem incluir ainda uma propriedade de terminação reversível que termina a extensão de iniciador adicional uma vez que um nucleotídeo tenha sido adicionado a um iniciador. Por exemplo, um nucleotídeo análogo tendo uma metade de terminadora reversível pode ser adicionada a um iniciador de maneira que extensão subsequente não possa ocorrer até que um agente de desbloqueio seja entregue para remover a metade. Assim, para concretizações que usam terminação reversível, um agente de desbloqueio pode ser enviado para a célula de fluxo (antes ou depois de ocorrer a detecção). Lavagens podem ser realizadas entre as várias etapas de entrega. O ciclo podem então ser repetidas n vezes para estender um iniciador por n nucleotídeos, deste modo detectando uma sequência de comprimento n. Procedimentos SBS exemplificativos, sistemas fluidos e plataformas de detecção que podem ser prontamente adaptados para uso com um arranjo produzido pelos métodos da presente divulgação são descritos, por exemplo, em Bentley e outros, Nature 456:53-59 (2008), WO 04/018497; WO 91/06678; WO 07/123744, patentes US 7.057.026; 7.329.492; 7.211.414; 7.315.019 ou 7.405.281, e pedido de patente US 2008/0108082 A1 , cada um dos quais é incorporado aqui como referência.
[096] Outros procedimentos de sequenciamento que usam reações cíclicas podem ser usados, tais como pirosequenciamento. Pirosequenciamento detecta a liberação de pirofosfato inorgânico (PPi) como nucleotídeos particulares estão incorporados em uma fita de ácido nucleico nascente (Ronaghi, Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi et al. Science 281 (5375), 363 (1998); Patente US 6.210.891; 6.258.568 e 6.274.320, cada um dos quais é incorporado aqui como referência). No pirosequenciamento, PPi liberado pode ser detectado sendo convertido em trifosfato de adenosina (ATP) por sulfurila- se de ATP, e a ATP resultante pode ser detectada por meio de fótons produzidos por luciferase. Assim, a reação de sequenciamento pode ser monitorada por meio de um sistema de detecção de luminescência. Fontes de radiação de excitação usadas para sistemas de detecção com base em fluorescência não são necessários para procedimentos de pirosequenciamento. Sistemas fluidos úteis, detectores e procedimentos que podem ser usados para aplicação de pirosequenciamento em arranjos da presente divulgação estão descritos, por exemplo, na publicação de pedido de patente WIPO PCT/US11/5711, pedido de patente publicado US 2005/0191698A1, patente US 7.595.883 e patente US 7.244.559, cada um dos quais é incorporado aqui como referência.
[097] Reações de sequenciamento por ligação também são úteis incluindo, por exemplo, aquelas descritas em Shendure e outros Science 309:1728-17732 (2005); patente US 5.599.675; e patente US 5.750.341, cada uma das quais é incorporada aqui como referência. Algumas concretizações podem incluir procedimentos de hibridização por sequenciamento conforme descrito, por exemplo, em Bains e outros, Journal of Theoretical Biology 135(3), 303-7 (1988); Drmanac e outros, Nature Biotechnology 16, 54-58 (1998); Fodor e outros, Science 251 (4995), 767-773 (1995); e WO 1989/10977, cada um dos quais é incorporado aqui como referência. Tanto em procedimentos de sequenciamento por ligação quanto de sequenciamento por hibridização, ácidos nucleicos que estão presentes em poços contendo gel (ou outros recursos côncavos) são submetidos a ciclos repetidos de entrega e detecção de nucleotídeo. Sistemas fluidos para métodos SBS conforme revelados aqui, ou em referências citadas aqui, podem ser prontamente adaptados para entrega de reagentes para procedimentos de sequenciamento por ligação ou sequenciamento por hibridização. Tipicamente, os oligonucleotídeos são fluorescentemente etiquetados e podem ser detectados usando-se detectores de fluorescência similares àqueles descritos com relação aos procedimentos de SBS descritos aqui ou em referências citadas aqui.
[098] Algumas concretizações podem utilizar métodos envolvendo o monitoramento em tempo real de atividade de polimerase de NA. Por exemplo, incorporações de nucleotídeo podem ser detectadas através de interações de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) entre uma polimerase que porta fluoroforo e nucleotídeos etiquetados com /-fosfato, ou com guias de onda modo zero. Técnicas e reagentes para sequenciamento com base em FRET dão descritos, por exemplo, em Levene e outros Science 299, 682-686 (2003); Lundquist e outros Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach e outros Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008), cujas revelações são incorporados aqui como referência.
[099] Algumas concretizações de SBS incluem detecção de um próton liberado mediante incorporação de um nucleotídeo no interior de um produto de extensão. Por exemplo, sequenciamento com base na detecção de prótons liberados pode usar um detector elétrico e técnicas associadas que estão comercialmente disponíveis da Ion Torrent (Guilford, CT, uma subsidiária da Life Technologies) ou métodos e sistemas de sequenciamento descritos nos pedidos de patente publicados 2009/0026082 A1; 2009/0127589 A1; 2010/0137143 A1; ou 2010/0282617 A1, cada um dos quais é incorporado aqui como referência. Em concretizações particulares, os detectores elétricos que são usados para detectar os prótons liberados podem ser modificados para incluir poços e os poços podem conter material em gel como revelado aqui.
[0100] Outra aplicação útil para um arranjo da presente divulgação é análise de expressão gênica. A expressão gênica pode ser detectada ou quantificada usan- do-se técnicas de sequenciamento de RNA, tais como aquelas, chamadas de sequenciamento digital de RNA. Técnicas de sequenciamento digital de RNA podem ser realizadas usando-se metodologias de sequenciamento conhecidas na técnica como aquelas apontadas acima. A expressão gênica também pode ser detectada ou quantificada usando-se técnicas de hibridização realizadas por hibridização direta para um arranjo ou usando-se um ensaio multiplex, cujos produtos são detectados em um arranjo. Um arranjo da presente divulgação também pode ser usado para determinar genótipos para uma amostra de DNA genômico de um ou mais indivíduos. Métodos exemplificativos para análise de expressão e genotipificação com base em arranjo que podem ser realizados em um arranjo da presente invenção são descritos nas patentes US 7.582.420; 6.890.741; 9.913.884 ou 6.335.431 ou pedidos de patente publicados US 2005/0053980 A1; 2009/0186349 A1 ou 2005/0181440 A1, cada um dos quais é incorporado aqui com referência.
[0101] Diversas aplicações para arranjos da presente divulgação foram exemplificadas acima aqui de detecção de conjunto, em que múltiplas cópias de um ácido nucleico alvo estão presentes em cada recurso e são detectadas juntas. Em concretizações alternativas, um único ácido nucleico, seja este um ácido nucleico alvo ou amplicon do mesmo, pode ser detectado em cada recurso. Por exemplo, um poço contendo gel (ou outro recurso côncavo) pode ser configurado para conter uma única molécula de ácido nucleico tendo uma sequência de nucleotídeo alvo que deve ser detectada. Qualquer uma dentre uma variedade de técnicas de detecção de molécula única pode ser usada incluindo, por exemplo, modificações das técnicas de detecção conjuntas reveladas acima para detectar os locais em resolução aumentada ou usando mais etiquetas sensíveis. Outros exemplos de métodos de detecção de molécula única que podem ser usados são revelados no pedido de patente publi-cado US 2011/0312529 A1; US 61/578.684; e US 61/540.714 cada um dos quais é incorporado aqui como referência.
[0102] Será entendido que um substrato contendo gel da presente divulgação, por exemplo, tendo sido produzido por um método revelado aqui, não precisa ser usado para um método de detecção. Ao contrário, o substrato estruturado pode ser usado para armazenar uma biblioteca de ácido nucleico. Consquentemente, o substrato estruturado pode ser armazenado em um estado que preserva os ácidos nucleicos no mesmo. Por exemplo, um substrato tendo poços contendo gel que estão presos a ácidos nucleicos podem ser armazenados em um estado dessecado, estado congelado (por exemplo, em nitrogênio líquido, ou em uma solução que é protetora de ácidos nucleicos. Alternativamente ou adicionalmente, o substrato estruturado pode ser usado para replicar uma biblioteca de ácido nucleico. Por exemplo, um substrato tendo poços que contêm gel que estão presos a ácidos nucleicos podem ser usados para criar amplicons replicados a partir de um ou mais dos poços no arranjo.
[0103] Os seguintes exemplos se destinam a ilustrar, mas não limitar a presente invenção.
EXEMPLO I
[0104] Substratos Multipoço Revestidos com Acrilamida Sem Silano
[0105] Esse exemplo demonstra o revestimento de substratos de nanopoço com acrilamida sem silano (SFA), seguido de enxerto com iniciadores tiofosfato em oligonucleotídeo fluorescente complementar para confirmar o sucesso da abordagem de funcionalização.
[0106] Substratos de chips normalmente usados para fabricação de Bead- Chips foram obtidos com Illumina (San Diego, CA). Os chips foram feitos de silício ou Zeonor (Zeon Corp., Tóquio, Japão) tendo poços de 0,5 pm posicionados em um padrão hexagonal tendo um passo de 1,5 pm, mas os poços não continham grânulos. Os chips foram padronizados com almofadas de gel como revelado abaixo e diagramado na Figura 1.
[0107] Os chips foram encerrados em uma câmara vedada por gaxeta e oxigênio foi removido por deslocamento com reagentes fluidos para formação de SFA. SFA foi polimerizado nos chips na câmara. Os reagentes para formação de SFA e condições para polimerização foram nos outros aspectos como descrito no pedido de patente publicado 2011/0059865 A1, o qual é incorporado aqui como referência. A câmara vedada foi usada para colocar a mistura de polimerização em contato direto com o chip e assegurar eliminação completa de ar uma vez que a polimerização de SFA de radical livre é um processo sensível ao ar. Após a polimerização, iniciadores foram enxertados no polímero de SFA na câmara vedada como revelado no pedido de patente publicado US 2011/0059865 A1 conforme a seguir. Uma solução contendo os iniciadores foi extraída através da superfície revestida com polímero da BeadChip e a mistura foi então incubada por 1,25h a 65°C (todo o conjunto vedado foi colocado em um forno grande).
[0108] Essa abordagem gerou substratos revestidos uniformemente. Uma imagem de amostra é mostrada na Figura 2, Painel A. A fim de criar regiões de polímero separadas, o polímero em excesso situado entre os poços no substrato foi removido usando-se uma técnica de polimento mecânico usando uma pasta de na- nopartículas de óxido de alumínio (300 mm de diâmetro) em água de Dl. Uma pasta de 10% empeso de partículas de sílica de 3 microns (Kisker Biotech GmbH, Stein- furt, Alemanha) também pode ser usada. A superfície foi manualmente esfregada com a pasta de nanopartícula usando-se um tecido óptico sem algodão. Após lavar para remover a pasta e o detrito de polímero, uma solução de sondas etiquetadas foi hibridizada em chip. Imagens capturadas usando um microscópio de fluorescência mostraram que essa abordagem foi capaz de proporcionar recursos de polímero com regiões intersticiais limpas (Figura 2, Painéis B a C).
[0109] Esses resultados indicaram que as intensidades fluorescentes nos poços preenchidos com gel foram espacialmente separadas em contraste com a ausência de sinal das regiões intersticiais. Os resultados também demonstraram que a padronização de gel pode ser alcançada usando-se material em gel preso em um substrato tendo poços nanofabricados.
EXEMPLO II
[0110] Fabricação de um Substrato Tendo Nanopoços Contendo Gel
[0111] Múltiplas técnicas podem ser usadas para fabricar arranjos estruturados que possam subsequentemente ser carregados com material em gel.
[0112] O processo pode começar com um substrato/pastilha em branco e um padrão é introduzido no substrato por meio de técnicas de micro ou não fabricação. O material do substrato/pastilha pode ser silício, vidro, plástico convencional, COC ou qualquer um dentre uma variedade de materiais que possam ser estruturados. Técnicas exemplificativas para introduzir a padronização no substrato incluem fotolitografia, litografia de nanoimpressão, gravar as estruturas em um material com base em plástico/COC e moldagem por injeção de um plástico ou COC em um molde principal que tern as estruturas padronizadas em si. Abordagens com base em fotolitografia irão tipicamente envolver o uso de um material fotorresistente que é padronizado com uma gravação por passos ou um alinhador de máscara, exposto com radiação que transfere o padrão presente em um retículo/uma fotomáscara para o interior do material fotorresistente, e então o material de revestimento é desenvolvido para proporcionar um filme estruturado (material fotorresistente) no topo doi substrato. O material de revestimento estruturado é potencialmente o substrato final que pode ser usado para subsequente revestimento por gel ou o padrão no material de revestimento pode ser transferido para o interior do substrato por processamento de continuação. As etapas de processo de continuação irão tipicamente incluir entalhe com íon reativo (entalhe com base em plasma) ou um processo de entalhe a úmido (com base química). Se o padrão é transferido para o interior do substrato, o material fotorresistente é subsequente removido para proporcionar o substrato padronizado para subsequente revestimento com gel. Pode ser desejável sacrificar um filme de um material tal como Cromo ou Titânio (um metal) sob o material fotorresistente, e primeiramente transferir o padrão no material fotorresistente para o filme de metal e então usar aquele filme como uma máscara rígida pelo que o padrão é trans-ferido para o interior do substrato e, portanto, considerado sacrificável para o processo de fabricação. Se litografia de nanoimpressão for usada, o material fotorresistente impresso pode ser um material sacrificável e ser similarmente usado como uma ferramenta intermediária para transferir o material de revestimento para o interior do substrato ou uma variação do material de revestimento pode ser usado de modo que o material de revestimento impresso sirva como a entrada em uma etapa de revestimento subsequente. Um exemplo de um material de revestimento que permaneceria seguindo a padronização seria um material com base em Sol-Gel.
[0113] Uma representação diagramática de como um substrato estruturado pode ser fabricado é mostrada na Figura 3 e descrita abaixo. Imagens de substratos padronizados são mostrados em vários níveis de aumento na Figura 3B e Figura 3C.
[0114] A criação de almofadas de gel quimicamente específicas em um substrato/célula de fluxo de sequenciamento pode envolver uma ou mais das técnicas de nanofabricação reveladas previamente nesse Exemplo. O processo pode opcionalmente então incluir um ou mais passos, tais como silanização para permitir a ligação subsequente de um polímero de um polímero de gel no substrato por meio do silano. A seguir polimento químico/mecânico (CMP) é usado para remover todo o polímero intersticial na superfície do substrato. O processo de polimento vai remover material em uma maneira de cima para baixo e uma vez que os recursos estruturados no substrato estão efetivamente descentralizados em relação ao plano das regiões intersticiais do arranjo, o polimento irá remover o polímero do intersticial antes de remover os recursos estruturados. Se o processo de polimento for interrompido após o tempo ideal, as estruturas vão reter o revestimento de polímero e as regiões intersticiais ficarão vazias do polímero. O substrato de almofada de gel é então en-xertado com iniciadores, ácidos nucleicos alvos são semeados nas almofadas de gel e os ácidos nucleicos alvos são usados como modelos para criação de grupamentos de genes nas almofadas de gel.
EXEMPLO III
[0115] Substratos Multipoço Revestidos com PAZAM
[0116] Esse exemplo mostra como a fabricação de um arranjo de poços contendo gel, a amplificação de grupamentos de ácido nucleico nos poços e o sequenciamento dos ácidos nucleicos nos grupamentos.
[0117] Substratos foram fabricados da maneira a seguir. Um substrato nano- poço (poço com 400nm de diâmetro, 1,5 pm de passo, 300nm de profundidade) foi fabricado usando-se litografia de nanoimpressão. Uma monocamada/multicamada de aminosilano (APTES ou APTMS) foi depositada na superfície inteira do substrato usando-se deposição de vapor químico. Em seguida, uma solução salina (pH 7,4) tamponada de fosfato de éster de ácido N-hidroxisuccinimada acrílico (Aldrich PN 8060) a uma concentração de 10mM foi reagida com a superfície de aminosilano pela adição de 1 ml da solução de acrilato NHS à superfície, cobrindo a mesma com uma cobertura de vidro com vidro fino e permitindo-se que a reação prossiga por uma hora à temperatura ambiente. Um polímero (PAZAM) é então aplicado à superfície revestindo-se por rotação 500 pl de uma solução de PAZAM em água a 2% em peso na recém-formada superfície funcionalizada de acrilamida. PAZAM foi sinteti-zado como descrito no pedido de patente provisório US 61/753.833, que é incorporada aqui como referência. O aquecimento subsequente do substrato revestido com PAZAM a 60°C por uma hora resultou em uma ligação entre o polímero e a superfície. O polímero ligado covalentemente intersticial foi removido pelo polimento da superfície com uma de pasta de micropartícula de SiO2 de 3 pm a 10% em peso em água. Uma superfície Janeway (cloreto de acriloíla com DIPEA em MeCN) pode ser usada no lugar da superfície revestida com aminosilano no procedimento acima.
[0118] O substrato de polímero foi então enxertado com iniciadores conforme descrito no pedido de patente provisório US 61/753.833, que é incorporado aqui como referência. A seguir, complementos reversos etiquetados com corante (Cy5) dos iniciadores enxertados foram expostos à superfície em uma solução tampão 1xPBS a uma concentração de complemento de 20 pM, e então a superfície foi lavada com 50 ml de tampão de 1PBS aplicado com uma garrafa de esguicho. Os complementos etiquetados no substrato tiveram sua imagem representadas em um Typhoon Imager FLA 9500 ajustado no canal de varredura Cy5 e usando uma configuração PMT de 450. Os complementos etiquetados no substrato também tiveram sua imagem representada por um microscópio de alta resolução, mostrando a padronização ou polímero/iniciadores sem que permaneçam polímero/iniciadores in-tersticiais. (Figura 4). O substrato foi então semeado com DNA phiX, e grupamentos desenvolvidos como descrito no documento US 61/715.478, que é incorporado aqui como referência.
[0119] Uma célula de fluxo contendo o substrato contendo grupamento foi sequenciada em um HiSeq 2000 (Illumina, Inc. San Diego, CA). Um algoritmo para extrair os locais dos grupamentos em sequenciamento padronizado (registro rígido) foi empregado, gerando com sucesso medidas de sequenciamento de alta qualidade (Figura 5 e Figura 6). Os resultados do sequenciamento mostraram que a relação ocupância versus clonalidade foi surpreendentemente mais alta que o esperado para uma distribuição Poisson padrão. Especificamente, a medida da relação ocupância versus clonalidade para o ensaio de sequenciamento, como indicado pelo “x” na Figura 7, está acima dos limites da curva de Poisson e se aproxima muito da linha para a fração clonal ideal.
[0120] Ao longo desse relatório, foram feitas referências a várias publicações, patentes ou pedidos de patente. As divulgações dessas publicações estão inteiramente incorporadas aqui como referência para descrever mais completamente o estado da técnica à qual esta invenção pretence.
[0121] O termo “compreendendo” se destina aqui e ser aberto, incluindo não apenas os elementos enunciados, mas abrangendo ainda quaisquer elementos adicionais.
[0122] Embora a invenção tenha sido descrita com referência aos exemplos fornecidos acima, deve ser entendido que várias modificações podem ser feitas sem que haja um afastamento da invenção. Consequentemente, a invenção está limitada apenas pelas reivindicações.

Claims (15)

1. Arranjo, CARACTERIZADO por compreender: um suporte sólido compreendendo uma superfície, a superfície compreendendo uma pluralidade de poços, os poços revestidos com um material em gel que está em conformidade com o formato do poço onde reside, os poços sendo separados um do outro por regiões intersticiais na superfície, as regiões intersticiais segregando o material em gel em cada um dos poços do material em gel em outros poços da pluralidade, em que o volume de cada um dos poços é no máximo de 1.000 pm3, e em que o volume do gel em cada um dos poços é no máximo de 1.000 pm3; e uma biblioteca de ácidos nucleicos alvos no material em gel, em que o material em gel em cada um dos poços compreende uma única espécie dos ácidos nucleicos alvos da biblioteca.
2. Arranjo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que a pluralidade de poços forma um arranjo tendo um padrão de repetição e, opcionalmente, em que os poços no padrão têm um passo de não mais que 5 micrometres.
3. Arranjo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o gel compreende um hidrogel, e, opcionalmente, em que o gel compreende acrilamida sem silano (SFA) ou poli(N-(5- azidoacetamidilpentil) acrilamida-co-acrilamida (PAZAM).
4. Arranjo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o material em gel em cada um dos poços compreende uma única espécie dos ácidos nucleicos alvos na biblioteca, e, opcionalmente, em que múltiplas cópias das únicas espécies formam uma população clonal de moléculas de ácido nucleico em cada um dos poços.
5. Arranjo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a superfície compreende uma densidade de pelo menos 1.000 dos poços por mm2.
6. Arranjo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o material em gel é covalentemente ligado à superfície dos poços.
7. Método para produzir um substrato, CARACTERIZADO por compreender (a) fornecer um suporte sólido compreendendo uma superfície plana, em que a superfície plana é interrompida por um ou mais poços e em que o um ou mais poços são delimitados por uma ou mais regiões intersticiais na superfície plana; (b) revestir pelo menos uma porção do suporte sólido com um material em gel que está em conformidade com o formato do poço onde reside, em que a porção compreende pelo menos um dos poços e pelo menos uma das regiões intersticiais; e (c) polir a superfície plana para remover o material em gel da pelo menos uma das regiões intersticiais e para manter o material em gel no pelo menos um poço.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o volume de cada um dos poços é no máximo de 1.000 pm3, ou em que o volume do gel em cada um dos poços é no máximo de 1.000 pm3.
9. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o polimento compreende uma abrasão mecânica com uma pasta de grânulos, ou em que o polimento compreende abrasão mecânica por limpeza ou raspagem da superfície do suporte sólido, ou em que o polimento compreende polimento químico.
10. Método para produzir um arranjo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: (a) fornecer um suporte sólido compreendendo uma superfície, a superfície compreendendo uma pluralidade de poços, os poços contendo um material em gel que está em conformidade com o formato do poço onde reside, os poços sendo separados um do outro por regiões intersticiais na superfície, a superfície sendo polida para remover o material em gel das regiões intersticiais, as regiões intersticiais segregando o material em gel em cada um dos poços do material em gel em outros poços da pluralidade, em que o volume de cada um dos poços é no máximo 1.000 pm3, e em que o volume de gel em cada um dos poços é de no máximo 1.000 pm3; (b) entregar uma biblioteca de ácidos nucleicos alvos aos poços do suporte sólido para produzir um arranjo de poços que têm uma única espécie de ácido nucleico alvo preso ao material em gel em cada poço, em que diferentes poços no arranjo compreendem diferentes espécies de ácido nucleico alvo a partir da biblioteca; e (c) amplificar os ácidos nucleicos alvos presos no material em gel nos poços do arranjo para produzir uma população clonal de um ácido nucleico alvo individual em cada um dos poços do arranjo.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que entregar na etapa (b) compreende fornecer a biblioteca como uma mistura dos ácidos nucleicos alvos em um fluido e contatar o fluido com o suporte sólido, atrravés do qual os ácidos nucleicos alvos têm acesso fluídico aos poços e às regiões intersticiais.
12. Método, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a amplificação compreende extensão por polimerase de pelo menos uma espécie de iniciador que está presa ao material em gel nos poços, e, opcionalmente, em que a amplificação compreende amplificação por ponte usando pelo menos duas espécies de iniciador que estão presas ao material em gel nos poços.
13. Método de detectar ácidos nucleicos, CARACTERIZADO pelo fato de compreender (a) fornecer o arranjo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6; (b) contatar o arranjo com pelo menos uma sonda que se liga aos ácidos nu- cleios alvos; e (c) detectar o arranjo para distinguir os poços tendo uma espécie de ácido nucleico alvo que se liga a pelo menos uma sonda.
14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a pelo menos uma sonda compreende (i) pelo menos um ácido nucleico que é complementar a pelo menos uma porção de pelo menos um dos ácidos nucleicos alvo, e, opcionalmente, em que a pelo menos uma sonda compreende uma etiqueta fluorecente que é detectada na etapa (c), ou (ii) uma polimerase e um nucleotídeo, e, opcionalmente, em que a detecção na etapa (c) compreende detectar a incorporação do nucleotídeo para dentro da sonda ou para dentro do ácido nucleico alvo. (c) detectar o arranjo para distinguir os poços tendo uma espécie de ácido nucleico alvo que se liga a pelo menos uma sonda.
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que a pelo menos uma sonda (i) compreende pelo menos um ácido nucleico que é complementar a pelo menos uma porção de pelo menos um dos ácidos nucleicos alvo, e opcionalmente pelo menos uma sonda compreende uma etiqueta fluorecente que é detectada na etapa (c), ou (ii) uma polimerase e um nucleotídeo, e opcionalmente a detecção na etapa (c) compreende detectar a incorporação do nucleotídeo na sonda ou no interior do ácido nucleico alvo.
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