KR20220047687A - 겔 패턴 형성된 표면 - Google Patents

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KR20220047687A
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스티븐 엠. 바르나드
엠. 셰인 보웬
마리아 칸델라리아 로게르트 바시갈루포
웨인 엔. 조지
앤드류 에이. 브라운
제임스 태시
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일루미나, 인코포레이티드
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Abstract

본원에서는 겔 물질을 함유하는 복수의 웰들을 지니는 표면을 지닌 고형 지지체 및 상기 겔 물질 내에 있는 표적 핵산의 라이브러리를 포함하는 어레이로서, 상기 웰들이 표면 상의 사이 영역에 의해서 서로 분리되어 있고, 상기 사이 영역이 웰들 각각에서의 겔 물질을 복수의 다른 웰들 내의 겔 물질로부터 격리시키고, 웰들 각각에서의 겔 물질이 라이브러리의 표적 핵산의 명확한 단일 종을 포함하고 있는 어레이가 제공된다. 본원에서는 또한 상기 어레이를 제조하고 사용하는 방법이 제공된다.

Description

겔 패턴 형성된 표면{GEL PATTERNED SURFACES}
관련 출원에 대한 참조
본원은 2013년 2월 26일자 출원된 미국 가출원 제61/769,289호 및 2013년 3월 6일자 출원된 미국 축원 제13/787,396호의 우선권을 주장한다. 상기 출원 각각은 본원에서 그 전체 내용이 참고로 포함된다.
배경
본 개시내용은 일반적으로 고형-상 분석화학에 관한 것이고, 대용량 게놈 분석(high throughput genomics analysis)을 위한 핵산 어레이(nucleic acid array)에 대한 특이적 적용 가능성이 있다.
인간의 유전적 변이의 카탈로그를 작성하고 그러한 변이를 질환에 대한 민감성과 상관시키는 작업은 전체 게놈 시퀀싱 방법(genome wide sequencing methodologies)에서의 진보로부터 이익을 얻는다. 이러한 카탈로그 작성 노력은 질환에 대한 각 개인의 민감성, 특정의 치료요법, 예컨대, 처방 약물에 대한 반응성, 위험한 약물 부작용에 대한 민감성 및 그 밖의 의학적 활동 가능한 특성을 의학 전문가가 측정하는 것을 돕게 될 그러한 각 개인의 게놈 내의 마커(marker)를 확인할 가능성이 있다. 그러한 카탈로그 작성 노력은 잘 되어가고 있다. 이것은 대체로 피실험자가 연구 환경에서 평가되게 하기에 충분히 비용 효과적인 상업적으로 이용 가능한 게놈 시퀀싱 방법 때문이다. 시퀀싱 방법에서의 개선은 카탈로그 작성 노력을 촉진시키기 위해서 요구된다. 게다가, 시퀀싱의 비교적 높은 비용은 그러한 기술이 연구 센터를 넘어서, 일반 대중의 환자에 대한 서열을 의사가 얻을 수 있는 임상으로 가는 것을 방해한다.
이들을 수행하기 위해서 이용되는 시퀀싱 방법 및 시스템은 기술들의 종합적인 모음을 이용한다. 이들 기술 중 일부에서의 개선은 실질적인 비용 감소를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 개선이 있다고 하더라도, 비용 감소 개선을 가능하게 하는 지를 예측하는 것은 어렵다. 시퀀싱 시스템에서의 기술들 사이의 의존성을 고려하면, 방법 또는 시스템의 전체 성능에 악영향을 주지 않으면서 변경될 수 있는 지를 예측하는 것이 더욱더 어렵다. 따라서, 게놈 연구의 가능성을 삶을 개선시킬 수 있고 많은 경우에는 구해낼 수 있는 임상으로 진전시킬 수 있는 개선을 확인할 필요가 있다. 본 발명은 이러한 요구를 충족시키고 있으며, 또한 관련된 이점을 제공한다.
간단한 요약
본 개시내용은 겔 물질을 함유하는 복수의 웰(well)들을 지닌 표면을 지니는 고형 지지체 및 상기 겔 물질 내에 있는 표적 핵산의 라이브러리(library)를 포함하는 어레이로서, 상기 웰들이 표면 상의 사이 영역(interstitial region)에 의해서 서로 분리되어 있고, 상기 사이 영역이 웰들 각각에서의 겔 물질을 복수의 다른 웰들 내의 겔 물질로부터 격리시키고, 웰들 각각에서의 겔 물질이 라이브러리의 표적 핵산의 단일 종을 포함하고 있는 어레이를 제공한다.
일부 구체예에서, 기판이 웰들의 어레이로서 구성되고, 분석물은 핵산이다. 따라서, 본 개시내용은 겔 물질을 함유하는 복수의 웰들을 지닌 표면을 지니는 고형 지지체 및 상기 겔 물질 내에 있는 표적 핵산의 라이브러리(library)를 포함하는 어레이로서, 상기 웰들이 표면 상의 사이 영역에 의해서 서로 분리되어 있고, 상기 사이 영역이 웰들 각각에서의 겔 물질을 복수의 다른 웰들 내의 겔 물질로부터 격리시키고, 웰들 각각에서의 겔 물질이 라이브러리의 표적 핵산의 단일 종을 포함하고 있는 어레이를 제공한다.
본 개시내용은 또한 기판을 제조하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 (a) 평탄 표면을 포함하는 고형 지지체를 제공하는 단계로서, 상기 평탄 표면이 하나 이상의 오목 특징부(concave feature)에 의해서 중단되어 있고 하나 이상의 오목 특징부가 평탄 표면 상의 하나 이상의 사이 영역과 접해있게 하여 고형 지지체를 제공하는 단계; (b) 고형 지지체의 일부 또는 전부를 겔 물질로 코팅시키는 단계로서, 상기 일부 또는 전부가 오목 특징부 중 하나 이상 및 사이 영역 중 하나 이상을 포함하게 하여 고형 지지체의 일부 또는 전부를 겔 물질로 코팅시키는 단계; 및 (c) 하나 이상의 사이 영역으로부터 겔 물질을 제거하고 하나 이상의 오목 특징부 내의 겔 물질을 유지시키기 위해서 평탄 표면을 폴리싱(polishing)하는 단계를 포함할 수 있다.
어레이를 제조하는 방법은 (a) 겔 물질을 함유하는 복수의 웰들을 지닌 표면을 지니는 고형 지지체를 제공하는 단계로서, 웰들이 표면 상의 사이 영역에 의해서 서로 분리되고, 사이 영역이 웰들 각각에서의 겔 물질을 복수의 다른 웰들에서의 겔 물질로부터 격리시키도록 하여 고형 지지체를 제공하는 단계; (b) 각각의 웰들 내의 겔 물질에 부착된 표적 핵산의 단일 종을 지니는 웰들의 어레이를 생성시키기 위해서 고형 지지체의 웰들에 표적 핵산의 라이브러리를 전달하는 단계로서, 어레이 내의 상이한 웰들은 라이브러리로부터의 상이한 표적 핵산 종을 지니게 하여 표적 핵산의 라이브러리를 전달하는 단계; 및 (c) 어레이의 웰들의 각각에서 개별적인 표적 핵산의 클론 집단을 생성시키기 위해서 어레이의 웰들 내의 겔 물질에 부착된 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 추가로 분석물을 검출하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 (a) 평탄 표면을 지닌 고형 지지체를 제공하는 단계로서, 상기 평탄 표면이 하나 이상의 오목 특징부에 의해서 중단되고, 오목 특징부가 겔 물질을 함유하고, 하나 이상의 오목 특징부가 평탄 표면상의 하나 이상의 사이 영역과 경계를 이루고 있고, 사이 영역이 실질적으로 겔 물질을 함유하지 않고, 겔 물질이 표적 분석물에 부착되거나 이를 함유하게 하여 고형 지지체를 제공하는 단계: (b) 표적 분석물이 프로브와 특별히 상호작용하는 조건하에 고형 지지체를 그러한 프로브와 접촉시키는 단계; 및 (c) 프로브 중 하나 이상과 상호작용하는 표적 분석물의 적어도 서브셋(subset)을 구분하기 위해서 고형 지지체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
특정의 구체예에서, 핵산이 검출되는 분석물이고 오목 특징부가 웰이다. 예를 들어, 핵산을 검출하는 방법은 (a) 표면과 핵산의 라이브러리를 지니는 고형 지지체를 제공하는 단계로서, 표면이 복수의 웰들을 지니고, 웰들이 겔 물질을 함유하고, 웰들이 표면상의 사이 영역에 의해서 서로 분리되고, 사이 영역이 웰들 각각에서의 겔 물질을 복수의 다른 웰들에서의 겔 물질로부터 격리시키고, 라이브러리의 표적 핵산의 단일 종이 웰들의 각각 내의 겔 물질에 부착되게 하여 고형 지지체를 제공하는 단계; (b) 고형 지지체를 표적 핵산에 결합하는 하나 이상의 프로브와 접촉시키는 단계; 및 (c) 하나 이상의 프로브에 결합하는 표적 핵산 종을 지니는 웰을 구분하기 위해서 고형 지지체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 조성물, 장치 및 방법이 겔 물질과 관련하여 본원에서 예시되고 있다. 겔 물질은 예시적인 것이며, 예를 들어, 표면 코팅을 형성할 수 있으며 그 자체로는 겔로서 반드시 여겨지지는 않을 수 있는 폴리머를 포함한 다른 유기 물질로 대체될 수 있음이 이해될 것이다. 겔 물질을 표면에 적용하고, 사이 영역으로부터 겔 물질을 제거하고, 분석물을 겔 물질에 부착시키고, 분석 또는 분취 방법(analytical or preparative method) 등에서 생성되는 어레이를 사용하는 등등의 본원에 기재된 방법은 겔 물질을 비-겔 물질로 대체시킴으로써 용이하게 개조될 수 있다.
도 1은 DNA 특징부의 패턴 형성된 어레이를 제조하고 이를 사용하는 방법의 도식적 표현으로서, 각각의 특징부가 DNA의 클러스트(cluster)에 부착되는 겔 물질을 지닌 웰이고 어레이가 시퀀싱 기술에서 사용되게 하는 방법의 도식적 표현을 도시하고 있다.
도 2는 비드 대신 웰에 겔 물질을 지니도록 변화된 BeadChip 기판의 이미지를 도시하고 있다. 도 2a: 폴리싱 전에 얻은 명시야 이미지(bright field image). 도 2b 및 도 2c: 폴리싱 및 형광 표지된 올리고누클레오티드에의 혼성화 후의 형광 이미지.
도 3에서 도 3a는 기판에 오목 특징부를 제조하기 위해서 반응성 이온 에칭과 함께 포토리소그래피(photolithography) 및 Cr 하드 마스크를 이용하는 개략적인 공정 흐름을 나타내고 있으며, 도 3b는 유기 기판 내 기점의 웰 또는 그 일부의 예시적인 SEM 이미지를 나타내고, 도 3c는 웨이퍼의 이미지, 즉 기점과 웰의 어레이를 포함하는 웨이퍼의 일부의 이미지 및 웰을 포함하는 어레이의 일부로부터의 이미지를 나타내고 있다.
도 4는 기판이 PAZAM으로 코팅되고 실리카 비드 슬러리로 폴리싱된 후에 나노웰 기판 상의 패턴 형성된 겔 특징부를 나타내는 나노웰 기판의 고해상도 형광 현미경 이미지를 도시하고 있다. PAZAM은 가시화 목적으로 염료로 표지된다.
도 5는 패턴 형성된 클러스터를 지니는 1.5㎛ 피치 나노웰 기판의 HiSeq 시퀀싱 사이클로부터 얻은 다중-색상 이미지 병합(multi-color image merge)을 도시하고 있다. 도 5a는 4 개의 불스-아이 기점(bulls-eye fiducial)과 함께 겔-함유 웰에서 패턴 형성된 클러스터의 필드를 나타내고 있는 이미지를 도시하고 있다. 도 5b는 단일 블스-아이 기점 내의 색상들의 혼합(앰플리콘(amplicon)의 혼합된 집단으로 인함)을 나타내는 더 높은 해상도의 이미지를 도시하고 있다.
도 6에서 도 6a는 750nm 피치 나노웰 기판을 이용한 Hiseq 시퀀싱 작업에서의 패턴 형성된 클러스터의 다중-색상 병합을 도시하고 있으며, 도 6b는 어레이가 정돈되어 있고 클러스터가 퀄리티 필터(quality filter)를 통과함을 나타내는 가장 가까운 이웃 곡선을 도시하고 있고, 도 6c는 160만 클러스터/mm2의 밀도에서 퀄리티 필터가 성공적으로 통과됨을 나타내는 시퀀싱 퀄리티 매트릭스를 도시하고 있다.
도 7은 클론 분률 대 점유된 분율의 플롯(plot)을 도시하고 있는 도면으로, 푸아송 분포(Poisson distribution)에 대해서 예상된 곡선, 이상적 클론 형성율 및 점유율에 대해서 예상되는 직선 및 겔-함유 나노웰의 패턴을 지니는 기판을 이용한 시퀀싱 작업으로부터 얻은 평균 측정에 대한 X를 도시하고 있다.
상세한 설명
본 개시내용은 구조화된 기판, 구조화된 기판을 제조하는 방법 및 구조화된 기판을 사용하는 방법을 제공한다. 특정의 구체예에서, 기판은 겔 물질을 함유하는 오목 영역, 예컨대, 웰(예, 겔 물질로 코팅됨)을 지니는 고형 지지체를 포함한다. 겔 물질은 이어서 관심 분석물, 예컨대, 핵산에 부착될 수 있다. 특정의 구체예에서, 겔-함유 영역은 관심 분석물과 부착하는 능력이 결여된 사이 영역에 의해서 분리되어 있는 이산형이다. 예를 들어, 사이 영역은 겔 물질이 결여될 수 있다. 대안적으로, 사이 영역 내의 겔 물질은 불활성화되거나, 달리, 오목 영역에서의 겔 물질의 활성 또는 특성, 예컨대, 분석물 결합을 지지하는 능력이 결여되도록 변화될 수 있다. 그에 의해서 생성되는 겔 영역의 격리는 분석물에 대한 반응을 수행시키고/거나 분석물을 검출하는 때에 이점을 제공한다. 예시적인 이점은 겔-함유 웰 중에 분배된 표적 핵산의 어레이의 예에서 입증될 수 있다. 여기서, 증폭 반응이 겔 내에서 또는 겔(예, 어레이의 핵산 특징부) 상에서 성장하는 핵산 콜로니를 형성시키기 위해서 주형으로서 핵산을 사용하는 구조화된 기판상에서 수행될 수 있다. 사이 영역은 콜로니에 대한 성장의 영역을 한정하는 기능을 한다. 생성되는 어레이의 개별적인 특징부는 겔-함유 웰에 의해서 생성되는 이산 패턴으로 인해서 비교적 용이하게 구분될 수 있다. 그러한 패턴은 또한 특징부의 밀도를 증가시키고 무작위 핵산 어레이에 비해서 이미지 등록을 위한 처리 요건을 감소시키는 이익을 제공할 수 있다.
핵산의 패턴 형성된 어레이를 제조하는 예시적인 과정이 도 1에 도시되어 있다. 웰-패턴 형성된 기판의 측면도가 도식적으로 도시되어 있다. 웰은 1.5 ㎛의 피치(pitch: 중심 대 중심 거리)를 지니며 각각의 웰의 직경은 실례로 0.5㎛이다. 웰 패턴 형성된 기판은 겔 물질로 코팅되어서 그러한 겔 물질이 웰에 진입하고 사이 영역을 코팅하게 한다. 생성되는 겔-코팅된 기판은 웰에는 겔 물질을 남기면서 사이 영역으로부터 겔 물질을 제거하여 겔-패턴 형성된 기판을 형성시키기 위해서 폴리싱될 수 있다. 그러한 겔은 DNA 주형의 포획 및 주형의 증폭을 지지하기 위한 기능을 할 수 있다. 예를 들어, 겔은 표면 코팅 전에, 표면 코팅 후에 및 폴리싱 전에, 또는 폴리싱 후에 올리고누클레오티드 프라이머로 그라프팅될 수 있다. 프라이머는 DNA 주형을 포획하고 포획된 주형을 사용하여 증폭을 프라이밍(priming)하는 기능을 할 수 있다. 생성되는 DNA-패턴 형성된 기판은, 예를 들어, 시퀀싱 기술로 분석될 수 있다.
겔-함유 웰 중의 핵산의 패턴 형성된 어레이는 DNA 시퀀싱을 위한 복수의 이점을 제공한다. 무작위 어레이(즉, 무작위 특징부의 패턴을 지니는 어레이)에 비한 이점의 예는 증가된 특징부 팩킹 밀도, 농도-독립적 주형 씨딩(concentration-independent template seeding)을 사용한 특징부 밀도의 증가된 조절 및 조정, 이미지 등록에 대한 감소된 처리 요건 및 증가된 신호 추출의 용이성을 포함한다. 추가의 이점은 각각의 특징부에 의해서 제공된 핵산 집단의 공간 제한으로부터 유래될 수 있다. 본 개시내용의 패턴 형성된 어레이의 특징부는 핵산 콜로니가 그 안에서 성장(예를 들어, 클러스터 증폭을 통해서)하게 될 면적 또는 체적을 제한하는 기능을 할 수 있다. 면적 또는 체적 제한이 없다면, 일부 핵산 콜로니는 상대적인 증폭율에 영향을 주는 그들 서열에서의 구아닌 및 시토신의 함량 백분율(즉, GC 함량)에서의 차이로 인해서 다른 것들보다 더 큰 크기로 증폭할 수 있다. 본원에서 기재된 방법 및 조성물의 경우에, 개별적인 특징부의 체적 또는 면적은 증폭되는 주형 종들 사이에서 GC 함량에서의 차이로 인해서 증폭 반응에서 달리 발생할 수 있는 핵산 콜로니 크기에서의 차이를 방지하거나 최소화하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 특징부의 체적 또는 면적은 더 느리게 성장하는 콜로니가 증폭 반응의 완료시에 특징부에 효과적으로 충진되게 하면서 더 빠르게 성장하는 콜로니의 성장을 억제하기에 충분히 작을 수 있다.
특정의 구체예에서, 본 개시내용은 패턴 형성된 공유결합 겔, 예컨대, 폴리(N-(5-아지도아세타미딜펜틸)아크릴아미드-코-아크릴아미드)(PAZAM, 참조예, 본원에서 참조로 포함되는 미국 가특허출원 제61/753,833호)을 지니는 유리, 규소, 플라스틱, 또는 다른 적합한 고형 지지체 상의 웰(예, 마이크로웰 또는 나노웰)의 제법을 제공한다. 이러한 공정은 다수의 사이클에 의한 시퀀싱 가동 동안 안정할 수 있는 시퀀싱에 사용되는 겔 패드(gel pad)를 생성시킨다. 웰에 대한 폴리머의 공유 결합은 다양한 사용 동안에 구조화된 기판의 수명 전체에 걸쳐서 구조화된 특징부에 겔을 유지시키기에 도움이 된다. 그러나, 많은 구체예에서, 겔은 웰에 공유결합될 필요가 없다. 예를 들어, 어떠한 조건에서, 구조화된 기판의 어떠한 부분에 공유결합되지 않는 실란 비함유 아크릴아미드(SFA, 참조예, 본원에서 참조로 포함되는 미국특허 공보 제2011/0059865 Al)가 겔 물질로서 사용될 수 있다.
특정의 구체예에서, 구조화된 기판은 고형 지지 물질을 웰(예, 마이크로웰 또는 나노웰)로 패턴 형성시키고, 패턴 형성된 지지체를 겔 물질(예, PAZAM, SFA 또는 이들의 화학적으로 개질된 변이체, 예컨대, SFA의 가아지도 분해된(azidolyzed) 변이체(azido-SFA))로 코팅시키고, 예를 들어, 화학적 또는 기계적 폴리싱을 통해서, 겔 코팅된 지지체를 폴리싱하여 웰 내에는 겔을 보유시키지만 웰 들 사이의 구조화된 기판의 표면 상의 사이 영역로부터는 겔의 실질적인 전부를 제거하거나 불활성화시킴으로써 제조될 수 있다. 프라이머 핵산이 겔 물질에 부착될 수 있다. 이어서, 표적 핵산(예, 단편화된 인간 게놈)의 용액이 폴리싱된 기판과 접촉되어서 개별적인 표적 핵산이 겔 물질에 부착된 프라이머와의 상호작용을 통해서 개별적인 웰을 씨딩하게 할 수 있지만; 표적 핵산은 겔 물질의 부재 또는 불활성으로 인해서 사이 영역을 점유하지 않을 것이다. 표적 핵산의 증폭은 웰로 한정될 것인데, 그 이유는 사이 영역 내의 겔의 부재 또는 불활성이 성장하는 핵산 콜로니의 외향 이동을 방지하지 때문이다. 그러한 과정은 통상적으로 제조 가능하고, 확대 가능하며, 통상의 마이크로- 또는 나노-제작 방법을 이용한다.
특정의 구체예에서, 기점 마커(fiducial marker)가 구조화된 기판상에 포함되어 개개의 특징부(예, 웰 또는 다른 겔-함유 오목 특징부)의 확인 및 위치추적(localization)을 용이하게 한다. 기점 마커는 공간적으로 정돈된 특징부 패턴을 지니는 구조화된 기판에 특히 유용한데, 그 이유는 기점 마커가 다른 특징부의 상대적인 위치에 대한 기준점을 제공하기 때문이다. 기점 마커는 또한 무작위 어레이의 이미지를 등록하기 위해서 사용될 수 있지만, 예를 들어, 상업적 서열 플랫폼(sequence platform), 예컨대, Illumina, Inc.(San Diego, CA)로부터의 HiSeq, 게놈 분석기(Genome Analyzer) 또는 MiSeq 플랫폼 상에서 생성되는 무작위 어레이와 함께 사용되는 바와 같이, 클러스터의 고유한 무질서가 대신 사용될 수 있다. 기점 마커는 구조화된 기판이 시간에 따른 개별적인 특징부들에서 발생하는 변화를 따르기 위해서 반복적으로 검출되는 적용에 특히 유익하다. 기점 마커는 개별적인 핵산 클러스터가 복수의 시퀀싱 사이클에 걸쳐서 얻은 순차적 이미지를 따라가게 하여, 개별적인 클러스터의 서열이 이산적으로 측정될 수 있다.
본 개시내용은 오목 영역(들)과 사이 영역(들)의 패턴을 지니는 기점 마커를 제공한다. 기점 마커를 위한 예시적인 설계는 다음 고리, 즉, 오목 고리, 사이 고리 및 웰 또는 다른 오목 특징부의 고리(예, "불스-아이") 중 둘 이상의 교대 패턴을 지니는 동심원의 세트이다. 일부 구체예에서, 기점 마커의 오목 영역(들)이 겔 물질을 함유하는 반면에, 사이 영역들은 그렇지 않다. 표면상의 겔의 이러한 차별적 위치는 본원에 기재된 겔 코팅 및 폴리싱 방법을 이용하여 달성될 수 있다. 전형적으로, 사이 영역으로부터 겔-함유 영역을 구별할 수 있는 검출 방법이 이용된다. 일부의 경우에, 구별은 사이 영역에는 부재하는 겔 영역 내의 특정의 분석물의 존재를 기반으로 할 수 있다. 예를 들어, 핵산 어레이의 경우에, 기점 마커의 겔-함유 영역은 어레이 상의 표적 핵산을 표지하기 위해서 사용되는 동일한 방법을 통해서 표지되는 핵산을 함유할 수 있다. 따라서, 기점 마커는 통상적으로는 분석물 특징부를 제작하기 위해서 이용된 방법과 동일한 방법을 이용하여 제작될 수 있다. 따라서, 요망되는 경우에, 기점 마커 및 분석물 특징부는 하나 이상의 단계 전체에 걸쳐서 동시에 제작될 수 있다. 본원에 기재된 구조화된 기판 및 방법에 사용될 수 있는 또 다른 유용한 기점 마커는 한 서브영역(subregion)에서의 웰의 패턴이 또 다른 서브영역에서의 패턴에 대해서 회전되는 서브-영역을 지니는 마커이다. 그러한 기점 그리드(fiducial grid)는 본원에서 참조로 포함되는 미국 출원 제13/267,565호에 기재된 바와 같은 이미지 등록을 위해서 구성되고 사용될 수 있다.
추가의 예로서, 비드(bead)가 기점으로서 사용될 수 있다. 그러한 비드는 형광단과 같은 표지를 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 표면은 둘 이상의 유형의 웰(또는 다른 오목 특징부)를 지닐 수 있다. 상대적으로 큰 웰은 하나 이상의 기점 비드를 수용할 수 있는 반면에, 비드를 함유하기에는 너무 작은 더 작은 웰은 단지 겔 물질만을 지닐 것이다. 따라서, 더 작은 웰은 분석을 위한 분석 특징부로서 기능하고, 더 큰 비드-충진된 웰은 기점으로서 기능한다. 웰에 대한 대안으로서, 기점 특징부는 상기 예시된 불스-아이 형태로 존재하는 것들과 같은 채널일 수 있으며, 그러한 채널은 비드를 수용하는 치수를 지닐 수 있다. 그와 같이, 여러 비드가 채널에 놓여서, 예를 들어, 일련의 비드의 명백한 모양으로, 기점을 생성시킬 수 있다.
패턴 형성된 어레이, 이들의 제조 방법 및 이들의 사용 방법이 관심 분석물을 부착시키기 위해서 사용되는 겔 물질과 관련하여 본원에서 예시되고 있다. 겔 물질은 예시적이며 표면상의 특징부에 대한 분석물의 위치추적을 가능하게 하기 위해서 사용될 수 있는 다른 유기 물질로 대체될 수 있음이 이해될 것이다. 그러한 유기 물질은, 예를 들어, 표면 코팅을 형성할 수 있으며, 그 자체로는 겔로서 반드시 여겨지지 않을 수 있는 폴리머를 포함한다. 특정의 예는 ATRP(원자 전달 라디칼 중합: atom transfer radical polymerization) 또는 표면 개시된 중합(surface initiated polymerization) 과정에 의해서 형성된 폴리머이다. 겔 물질을 표면에 적용하고, 사이 영역으로부터 겔 물질을 제거하고, 분석 또는 분취에서 생성되는 어레이를 사용하는 등등을 위한 본원에 기재된 방법은 비-겔 물질과 함께 사용하기 위해서 용이하게 개조될 수 있다.
본원에서 사용된 용어는 달리 명시되지 않는 한 관련 분야에서의 그들의 통상적인 의미를 채택하는 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 여러 용어 및 그들의 의미가 이하 기재된다.
본원에서 사용된 용어 "부착된"은 서로 접합, 고정, 접착, 연결 또는 결합되는 두 개의 물건의 상태를 나타낸다. 예를 들어, 분석물, 예컨대, 핵산이 물질, 예컨대, 겔 또는 고형 지지체에 공유 또는 비공유 결합에 의해서 부착될 수 있다. 공유 결합은 원자들 사이에 전자쌍을 공유하는 것이 특징이다. 비공유 결합은 전자쌍의 공유가 연루되지 않는 화학적 결합이며, 예를 들어, 수소 결합, 이온 결합, 판데르발스 힘, 친수성 상호작용 및 소수성 상호작용을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "클론 집단"은 특정의 누클레오티드 서열과 관련하여 동종인 핵산의 집단을 나타낸다. 동종 서열은 전형적으로는 10 이상의 누클레오티드 길이이지만, 50, 100, 250, 500, 1000 또는 2500 이상의 누클레오티드 길이를 포함하는 더 긴 길이일 수 있다. 클론 집단은 단일의 표적 핵산 또는 주형 핵산으로부터 유래될 수 있다. 클론 집단은 표적 누클레오티드 서열의 적어도 2, 5, 10, 100, 1000 또는 그 초과의 카피를 포함할 수 있다. 그러한 카피는, 예를 들어, 콘카테머(concatamer)로서, 단일의 핵산 분자로 존재할 수 있거나, 카피는 별도의 핵산 분자 상에 존재할 수 있다(즉, 클론 집단은 동일한 표적 누클레오티드 서열을 지니는 적어도 2, 5, 10, 100, 1000 또는 그 초과의 핵산 분자를 포함할 수 있다). 전형적으로, 클론 집단 내의 핵산의 전부가 동일한 누클레오티드 서열을 지닐 수 있다. 무시할 만한 수의 오염 핵산 또는 돌연변이(예, 증폭 인공물에 기인)가 클론 형성능을 벗어나지 않으면서 클론 집단에서 발생할 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 집단은 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 클론성일 수 있다. 일부의 경우에, 100% 순수한 클론 집단이 존재할 수 있다.
본원에서 사용된, 동사로서 사용되는 때의 용어 "코팅하다"는 표면 상에 층 또는 피막을 제공함을 의미하기 위한 것이다. 표면의 적어도 일부에 층 또는 피막이 제공될 수 있다. 일부의 경우에, 전체 표면에 층 또는 피막이 제공될 수 있다. 다른 경우로, 표면의 단지 일부에 층 또는 피막이 제공될 것이다. 표면과 물질 사이의 상호관계를 기재하기 위해서 사용되는 경우의 용어 "코팅"은 물질이 표면상에 층 또는 피막으로서 존재함을 의미하기 위한 것이다. 물질은 표면을 밀봉하여, 예를 들어, 표면과의 액체 또는 기체의 접촉을 방지할 수 있다. 그러나, 물질은 밀봉부를 형성할 필요는 없다. 예를 들어, 물질은 액체, 기체, 또는 액체 또는 기재 중에 운반된 하나 이상의 성분에 투과성일 수 있다. 표면을 코팅시킬 수 있는 예시적인 물질은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 겔, 폴리머, 유기 폴리머, 액체, 금속, 두 번째 표면, 플라스틱, 실리카 또는 기체를 포함한다.
고형 지지체를 참조로 하여 사용되는 때의 본원에서 사용된 용어 "오목 특징부"는 고형 지지체 내의 리세스(recess) 또는 함입부(indentation)를 나타낸다. 예시적인 오목 특징부는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 웰, 피트(pit), 홀(hole), 오목부(depression), 채널, 또는 트로프(trough)를 포함한다. 오목 특징부는 임의로 굴곡된 횡단면(고형 지지체의 표면에 대해서 직각의 치수에서)을 지닐 수 있지만, 하나 이상의 선형 단면, 각 또는 코너를 지니는 횡단면이 또한 가능하다. 굴곡된 단면과 선형 단면의 조합을 지니는 횡단면이 또한 가능하다. 일반적으로는, 오목 특징부는 고형 지지체를 완전히 관통하여 지날 필요가 없으며, 예를 들어, 그 대신에, 기판 내에 하부 표면 또는 하부 점을 지닌다.
핵산을 참조로 하여 사용되는 때의 본원에서 사용된 용어 "상이한"은 핵산들이 서로 동일하지 않은 누클레오티드 서열을 지님을 의미한다. 둘 이상의 핵산은 서열의 전체 길이를 따라서 상이한 누클레오티드 서열을 지닐 수 있다. 대안적으로, 둘 이상의 핵산은 이들의 길이의 실질적인 부분을 따라서 상이한 누클레오티드 서열을 지닐 수 있다. 예를 들어, 둘 이상의 핵산은 둘 이상의 분자에 대해서 다른 표적 누클레오티드 서열 부분을 지니면서 둘 이상의 분자에 동일한 전반적인 서열 부분을 또한 지닐 수 있다.
항목들의 모음을 참조로 하여 사용되는 때의 본원에서 사용된 용어 "각각"은 모음 중의 개별적인 항목을 확인하기 위한 것이지만, 모음 중의 모든 항목을 반드시 나타내지는 않는다. 명확한 개시 또는 문맥이 달리 명확하게 나타내고 있다면, 예외가 있을 수 있다.
유체 내의 분자 및 유체와 접촉되어 있는 부위를 참조로 하여 사용되는 때의 본원에서 사용된 용어 "유동적 접근"은 유체 내에서 또는 유체를 통해서 이동하여 그러한 부위와 접촉하거나 그러한 부위에 진입하는 분자의 능력을 나타낸다. 그러한 용어는 또한 그러한 부위로부터 분리되거나 그러한 부위를 빠져나가서 용액에 진입하는 분자의 능력을 나타낼 수 있다. 유동적 접근은 분자가 그 부위에 진입하고/거나, 그 부위와 접촉하고/거나, 그 부위로부터 분리되고/거나 그 부위를 빠져나가는 것을 막는 장벽이 없는 때에 발생할 수 있다. 그러나, 유동적 접근은, 접근이 절대적으로 방지되지 않는 한, 확산이 저지되거나, 감소되거나, 변화되는 경우에도 존재하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용된 용어 "겔 물질"은 액체 및 기체에 투과성인 반-강성 물질을 의미하는 것이다. 전형적으로는, 겔 물질은 액체가 흡수되는 때에 팽윤될 수 있고 액체가 건조에 의해서 제거되는 때에 수축될 수 있다. 예시적인 겔은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 콜로이드 구조를 지니는 것들, 예컨대, 아가로스(agarose); 메쉬 구조 폴리머(polymer mesh structure), 예컨대, 젤라틴; 또는 가교된 폴리머 구조물, 예컨대, 폴리아크릴아미드, SFA(참조예, 본원에서 참조로 포함되는 미국 특허공보 제2011/0059865 A1) 또는 PAZAM(참조예, 본원에서 참조로 포함되는 미국 특허출원 제61/753,833호)를 포함한다. 특히 유용한 겔 물질은 이것이 자리하게 되는 웰 또는 그 밖의 오목 특징부의 모양에 순응할 것이다. 일부 유용한 겔 물질은 (a) 이것이 자리하게 되는 웰 또는 그 밖의 오목 특징부의 모양에 순응하는 것과 (b) 이것이 자리하게 되는 웰 또는 그 밖의 오목 특징부의 체적을 실질적으로 초과하지 않는 체적을 지니는 것 둘 모두를 충족시킬 것이다.
본원에서 사용된 용어 "사이 영역"은 기판 또는 표면의 다른 영역을 분리시키는 기판 내의 또는 표면상의 영역을 나타낸다. 예를 들어, 사이 영역은 어레이의 하나의 오목 특징부를 어레이의 또 다른 오목 특징부로부터 분리시킬 수 있다. 서로 분리되는 두 영역은 이산적이어서, 서로 접촉이 없을 수 있다. 또 다른 예에서, 사이 영역은 특징부의 첫 번째 부분을 특징부의 두 번째 영역으로부터 분리시킬 수 있다. 많은 구체예에서, 사이 영역은 연속적인 반면에, 특징부들은, 예를 들어, 달리 연속적인 표면 내의 웰들의 어레이에 대한 경우와 같이, 이산적이다. 사이 영역에 의해서 제공되는 격리는 부분적 또는 전체적인 격리일 수 있다. 사이 영역은 전형적으로는 표면 상의 특징부의 표면 물질과는 다른 표면 물질을 지닐 것이다. 예를 들어, 어레이의 특징부는 사이 영역에 존재하는 양 또는 농도를 초과하는 겔 물질 또는 분석물의 양 또는 농도를 지닐 수 있다. 일부 구체예에서, 겔 물질 또는 분석물은 사이 영역에 존재하지 않을 수 있다.
분석물을 참조로 하여 사용되는 때의 본원에서 사용되는 용어 "라이브러리(library)"는 상이한 화학적 조성을 지니는 분석물의 모음을 나타낸다. 전형적으로는, 라이브러리 내의 분석물은 공통의 속(genus) 또는 강(class)의 특징 또는 특성을 지니지만 달리 어떠한 점에서 다른 상이한 종일 것이다. 예를 들어, 라이브러리는 누클레오티드 서열에서 다르지만, 당 인산(sugar-phosphate) 골격을 지니는 것과 관련하여 유사한 핵산 종을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "핵산" 및 "누클레오티드"는 본 기술 분야에서의 이들의 사용과 일치하는 것으로 의도되며, 천연 종 또는 이들의 기능적 유사체를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산의 특히 유용한 기능적 유사체는 서열 특이적 양상으로 핵산에 혼성화될 수 있거나, 특정의 누클레오티드 서열의 복제를 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 천연 핵산은 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유하는 골격을 지닌다. 유사체 구조물은 본 기술분야에 공지된 다양한 것들 중 어떠한 것을 포함한 대체 골격 연결을 지닐 수 있다. 천연 핵산은 일반적으로는 데옥시리보오스 당(deoxyribose sugar; 예, 데옥시리보핵산(DNA)에서 발견됨), 리보오스 당(예, 리보핵산(RNA)에서 발견됨)을 지닌다. 핵산은 본 기술분야에서 공지된 이들 당 부분(sugar moiety)의 다양한 유사체 중 어떠한 것을 지니는 누클레오티드를 함유할 수 있다. 핵산은 천연 또는 비-천연 누클레오티드를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 천연 데옥시리보핵산은 아데닌, 티민, 시토신 또는 구아닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기를 지닐 수 있고, 리보핵산은 우라실, 아데닌, 시토신 도는 구아닌으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기를 지닐 수 있다. 핵산 또는 누클레오티드에 포함될 수 있는 유용한 비-천연 염기는 본 기술분야에서 공지되어 있다. 핵산을 참조로 하여 사용되는 때의 용어 "프로브" 또는 "표적"은 본원에 기재된 방법 또는 조성물의 맥락에서 핵산에 대한 의미상 식별자로서 의도되며, 달리 명확히 지시되지 않은 것을 넘어서 핵산의 구조 또는 기능을 반드시 제한하지는 않는다. 용어 "프로브" 및 "표적"은 다른 분석물, 예컨대, 단백질, 저분자(small molecule), 또는 세포 등에 유사하게 적용될 수 있다.
표면상의 웰을 참조로 하여 사용되는 때의 본원에서 사용된 용어 "무작위 패턴"은 표면의 한 영역에서의 웰의 서브셋의 상대적인 위치가 표면의 또 다른 영역에서의 웰의 서브셋의 위치로부터 알려져 있지 않거나 예측 가능하지 않음을 의미한다. 측정을 위해서 사용된 서브셋은 일반적으로는 3 개 이상의 웰을 포함하지만, 4, 5, 6, 10 개 또는 그 초과의 웰을 포함할 수 있다. 무작위 패턴은 일반적으로는 어떠한 서브-패턴의 복수의 반복을 포함하지 않는다. 상기 용어는 웰 이외의 오목한 특징부에 적용될 수 있다.
표면 상의 웰을 참조로 하여 사용되는 때의 본원에서 사용된 용어 "반복 패턴"은 표면의 한 영역 내의 웰들의 서브셋의 상대적 위치가 표면의 다른 하나 이상의 영역 내의 웰들의 서브셋의 상대적 위치와 동일함을 의미한다. 따라서, 반복 패턴의 한 영역 내의 웰들의 상대적인 위치는 일반적으로 반복 패턴의 또 다른 영역 내의 웰들의 상대적인 위치로부터 예측 가능하다. 측정을 위해서 사용되는 서브셋은 일반적으로는 3 개 이상의 웰을 포함하지만, 4, 5, 6, 10 개 또는 그 초과의 웰을 포함할 수 있다. 예시적인 반복 패턴은 직선 패턴 및 육각형 패턴을 포함한다. 반복 패턴은 서브-패턴의 복수의 반복을 포함할 수 있다. 상기 용어는 웰 이외의 오목한 특징부에 적용될 수 있다.
두 개의 웰(또는 두 개의 다른 특징부)에서의 겔 물질을 참조로 하여 사용되는 때의 본원에서 사용되는 용어 "격리"는 웰들 중 하나(또는 특징부들 중 하나)에서의 겔 물질을 다른 웰(또는 다른 특징부)에서의 겔 물질로부터 분리 또는 단절시키는 것을 의미한다. 따라서, 첫 번째 웰(또는 첫 번째 특징부)에서의 겔 물질은 다른 웰(또는 다른 특징부)에서의 겔 물질과 직접 접촉되지 않는다. 일부 구체예에서, 두 개의 웰(또는 두 개의 특징부)에서의 겔 물질은, 예를 들어, 두 웰(또는 특징부)과 접촉되어 있는 용액을 통해서 간접적으로 접촉된다. 대안적으로, 두 개의 웰(또는 두 개의 특징부)에서의 겔 물질은 간접적으로도 접촉되지 않는다. 표면 상의 사이 영역은 겔 물질이 없음에 의해서 두 웰(또는 두 특징부)에서의 겔 물질을 격리시킬 수 있다. 특정의 구체예에서, 겔 물질은 표면상에서 불연속적이이서, 오목 특징부, 예컨대, 웰에는 존재하지만, 특징부들 사이의 사이 영역에는 존재하지 않을 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "표면"은 고형 지지체 또는 겔 물질의 외부 또는 외부층을 의미하는 것이다. 표면은 또 다른 물질, 예컨대, 기체, 액체, 겔, 폴리머, 유기 폴리머, 유사하거나 상이한 물질의 두 번째 표면, 금속 또는 코팅과 접촉되어 있을 수 있다. 표면 또는 이의 영역들은 실질적으로 평탄할 수 있다. 그러한 표면은 표면 특징부, 예컨대, 웰, 피트(pit), 채널, 리지(ridge), 융기된 영역, 페그(peg), 또는 포스트(post) 등을 지닐 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "단일 종"은 특정의 속의 실질적으로 하나 및 단지 하나의 종을 의미한다. 그러한 용어는 존재하는 단일 종의 대표의 수를 제한하는 것을 반드시 의도하지는 않는다. 예를 들어, 동일한 누클레오티드 서열을 각각 지니는 핵산 분자들의 집단은 핵산의 단일 종을 포함한다. 이러한 문맥에서의 용어 "단일"은 관련 속 내에 없는 다른 것의 존재를 배제시키는 것을 의도하지는 않는다. 예를 들어, 라이브러리로부터 표적 핵산의 단일 종을 함유하는 웰은 동일한 서열을 지니는 복수의 핵산들을 포함할 수 있으며, 라이브러리로부터의 다른 표적 핵산을 배제할 것이지만, 어떠한 다른 비-핵산 성분을 반드시 배제할 필요는 없다. 명확한 단일 종 집단은 당업자가 그 집단의 특정의 사용에 대한 무시할 만한 오염 또는 인공물 수준인 것으로 여기는 수준으로 존재하는 소량의 또 다른 종을 지닐 수 있음이 이해될 것이다. 예를 들어, 첫 번째 서열을 지니는 단일 주형으로부터 유래되는 핵산 클러스터는, 두 번째 서열을 지니는 어떠한 핵산 분자의 양이 첫 번째 서열이 검출되는 때에 검출 불가능하거나 무시되기에 충분히 낮다면, 명확한 단일 종을 지니는 것으로 여겨질 것이다. 대안적으로, 절대적인 단일 종 집단은 하나 및 단지 하나의 종을 지닐 것이다.
본원에서 사용된 용어 "고형 지지체"는 수성 액체에 불용성인 강성 기판을 나타낸다. 그러한 기판은 비-다공성이거나 다공성일 수 있다. 기판은 임의로 액체를 흡수할 수 있지만(예, 다공성으로 인해서), 전형적으로는 그러한 기판이 액체를 흡수하는 때에 실질적으로 팽윤되지 않고 액체가 건조에 의해서 제거되는 때에 실질적으로 수축되지 않도록 충분히 강성일 것이다. 비다공성 고형 지지체는 일반적으로는 액체 또는 기체에 불투성이다. 고형 지지체는 임의로 겔을 개질시키기 위해서 사용되는 화학물질에 불활성일 수 있다. 예를 들어, 고형 지지체는 분석물, 예컨대, 핵산을 본원에 기재된 방법으로 겔이 부착시키기 위해서 사용되는 화학물질에 불활성일 수 있다. 예시적인 고형 지지체는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 유리, 개질된 유리 또는 기능화된 유리, 플라스틱(아크릴, 폴리스티렌 및 스티렌과 다른 물질의 코폴리머, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, Teflon™, 사이클릭 올레핀, 폴리아미드 등을 포함함), 나일론, 세라믹, 레진, 제오노아(Zeonor), 실리카 또는 규소 및 개질된 규소를 포함한 실리카-기반 물질, 탄소, 금속, 무기 글라스(inorganic glass), 광섬유 다발(optical fiber bundle), 및 폴리머를 포함한다. 일부 구체예에 특히 유용한 고형 지지체는 흐름 셀 장치(flow cell apparatus) 내에 위치된다. 예시적인 흐름 셀은 이하 추가로 상세히 기재된다.
본원에서 사용된 용어 "웰"은 표면의 사이 영역(들)에 의해서 완전히 둘러싸인 표면 개구를 지니는 고형 지지체 내의 이산 오목 특징부를 나타낸다. 웰은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 둥근 모양, 타원형, 사각형, 다각형, 별 모양(어떠한 수의 꼭지점을 지님) 등을 포함하는, 표면내의 이들의 개구의 다양한 모양 중 어느 모양을 지닐 수 있다. 표면에 직각으로 취한 웰의 횡단면은 굴곡되거나, 사각형이거나, 다각형이거나, 쌍곡선형이거나, 콘형이거나, 각진 모양 등등일 수 있다.
이하 기재되고 청구범위에서 열거된 구체예는 상기 정의를 고려하여 이해될 수 있다.
본 개시내용은 겔 물질을 함유하는 하나 이상의 오목 특징부를 지닌 표면을 지니는 고형 지지체 및 겔 물질 중의 분석물의 라이브러리를 포함하는 기판으로서, 상기 하나 이상의 오목 특징부가 표면 상의 하나 이상의 사이 영역에 의해서 경계를 이루고 있고, 웰들의 각각에 있는 겔 물질이 라이브러리의 분석물의 단일 종을 포함하고 있는 기판을 제공한다.
일부 구체예에서, 기판은 웰들의 어레이로서 구성되며, 분석물은 핵산이다. 따라서, 본 개시내용은 겔 물질을 함유하는 복수의 웰들을 지닌 표면을 지니는 고형 지지체 및 상기 겔 물질 내에 있는 표적 핵산의 라이브러리를 포함하는 어레이로서, 상기 웰들이 표면 상의 사이 영역에 의해서 서로 분리되어 있고, 상기 사이 영역이 웰들 각각에서의 겔 물질을 복수의 다른 웰 내의 겔 물질로부터 격리시키고, 웰들 각각에서의 겔 물질이 라이브러리의 표적 핵산의 단일 종을 포함하고 있는 어레이를 제공한다.
본원에서 기재된 구조화된 기판에 사용되는 고형 지지체는 본원에서, 예를 들어, 상기 정의에서, 하기 실시예에서 또는 바로 다음에 기재되는 다양한 물질 중 어떠한 물질로부터 제조될 수 있다. 특히 유용한 물질은 유리이다. 다른 적합한 기판 물질은 폴리머 물질, 플라스틱, 규소, 석영(용융 실리카), 보로플로트 유리(borofloat glass), 실리카, 실리카-기반 물질, 탄소, 금속, 광섬유 또는 광섬유 다발, 사파이어, 또는 플라스틱 물질, 예컨대, COC 및 에폭시를 포함할 수 있다. 특정의 용도에 요구되는 성질을 기반으로 하는 특정의 물질이 선택될 수 있다. 예를 들어, 요망되는 방사선 파장에 투명한 물질은 요망되는 파장의 방사선을 이용하게 될 분석 기술, 예컨대, 본원에서 기재된 기술중 하나 이상의 기술에 유용하다. 역으로, 특정의 파장의 방사선을 통과시키지 않는(예, 불투명한, 흡수성 또는 반사성인) 물질을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 구조화된 기판의 제조, 예컨대, 본원에 기재된 방법 동안에 사용될 마스크, 또는 구조화된 기판을 사용하여 수행된 화학반응 또는 분석학적 검출, 예컨대, 본원에 기재된 것들을 위해서 사용될 마스크의 형성에 유용할 수 있다. 사용될 수 있는 물질의 다른 성질은 다운스트림 공정, 예컨대, 본원에 기재된 것들에서 사용되는 특정의 시약에 대한 불활성 또는 반응성; 또는 제조 공정, 예컨대, 본원에 기재된 것들 동안의 조작의 용이 또는 낮은 비용이다. 본 개시내용의 구조화된 기판 또는 방법에서 사용될 수 있는 물질의 추가의 예는 본원에서 참조로 포함되는 미국 출원 일련번호 제13/661,524호 및 미국 특허출원 공보 제2012/0316086 A1에 기재되어 있다.
특정의 구체예에서, 졸-겔 기반 기판이 제조되고 사용될 수 있다. 졸-겔 기반 패턴 형성은 강성 또는 가요성 기판, 예컨대, 유리, 규소, 플라스틱, 또는 금속 등을 코팅시킴으로써 달성될 수 있으며, 졸-겔 코팅이, 예를 들어, 스핀 코팅, 침지 또는 스프레이 코팅을 통해서 수행될 수 있다. 졸-겔은 기판에 적용되는 때에는 액체로 제공될 수 있으며, 빛 또는 열 중 하나에 대한 졸-겔의 노출을 통해서 경화(액체를 겔이 되게 함)될 수 있는 광- 또는 열-개시제 중 하나를 함유할 수 있다. 졸-겔에 의한 기판의 코팅 후에, 및 물질을 경화시키기 전에, 졸-겔은 단일 또는 복수의 돌출 특징부(들)을 지니는 주형(3 차원 스템프)으로 임프린팅(imprinting)될 수 있다. 주형은, 예를 들어, 규소, 유리(예컨대, 석영), 금속(예컨대, 니켈), 플라스틱 또는 폴리머(예컨대, PDMS)로 제조될 수 있다. 졸-겔 내로의 스템프의 임프린팅은 주형을 졸-겔과 접촉시켜 놓음으로써 달성될 수 있다. 주형이 졸-겔과 접촉되어 있는 때에, 졸-겔은 주형의 구조물을 컨포멀하게(conformally) 둘러싸도록 재분배된다. 주형이 졸-겔과 접촉되어 있는 때에, 졸-겔의 재분배는 주형 또는 기판에 가해진 외부 힘을 통해서, 또는 패턴 형성된 주형의 본질에 고유한 모세관 힘을 통해서 유도될 수 있다. 주형이 졸-겔과 접촉되어 있는 때에, 기판 + Sol-Gel + 주형의 스택(stack)이 빛 또는 열에 노출되어 졸-겔을 경화시키고 본래 주형에 있는 패턴을 졸겔 내로 옮길 수 있다. 이러한 패턴 형성 과정은 통상적으로는 나노임프린트 리소그래피(nanoimprint lithography)로 일컬어진다. 졸-겔의 경화 후에, 주형은 기판 + Sol-Gel 스택으로부터 분리될 수 있고, 주형은 비-경화된 졸-겔로 코팅된 또 다른 기판을 패턴 형성시키기 위해서 재사용되거나 버려질 수 있다. 이어서, 경화된 패턴 형성된 졸-겔을 지닌 기판은 화학 증착 공정에 보내질 수 있거나, 순수한 유리 유사 표면이 요구되면, 기판 + 패턴 형성된 졸-겔 스택이 졸-겔에 본래 존재하였던 유기 물질을 제거하게 될 열 공정(소결(sintering))을 통해서 처리될 수 있다. 이것은 요구되지는 않지만 기판이 특정의 화학적 부착 방식에서 이점을 지니는 순수한 SiO2 물질이 되게 할 수 있다.
패턴 형성된 기판을 생산하기 위한 또 다른 방법은 플라스틱 물질, 예컨대, COC 또는 COP(예컨대, 제오노아 또는 토파스(Topas))를 사용하고 열적 엠보싱 공정을 수행하여 함입부들의 어레이를 생성시키는 것이다. 그러한 공정은 나노임프린트 리소그래피와 유사하다. 플라스틱의 기판이 온도 조절되는 기능을 지니는 척(chuck) 상에 장착될 수 있다. 이어서, 플라스틱 기판은 플라스틱의 외부 표면이 유리 전이 온도를 초과하도록 하는 온도로 가열될 수 있다. 기판이 상승된 온도에 있는 동안에, 주형이 주형(예, 석영, 규소, 폴리머 또는 금속)과 강한 접촉에 처해진다. 주형은 전형적으로는 플라스틱이 구조화된 주형을 완전히 컨포멀하게 코팅하는 것을 보장하도록 적용된 외부 힘을 지닌다. 승온에서 접촉되어 있는 동안에, 플라스틱은 그 자체가 재분배되어 주형의 역 복사체가 되며; 예를 들어, 주형이 포스트의 어레이를 지닌다면, 엠보싱된 플라스틱은 웰의 어레이를 생성시킨다. 주형이 플라스틱 기판과 접촉되어 있는 동안에, 기판의 온도는 감소되어 엠보싱된 패턴을 기판에 맞붙어 있게 한다.
기판 상에 있는 오목 특징부는 다양한 모양 중 어떠한 모양을 지닐 수 있다. 표면상의 모양 면에서, 특징부는 굽은 면, 선형 면, 코너 또는 이들의 조합을 지닐 수 있다. 예를 들어, 특징부는 원형, 타원형, 사각, 다각, 별-모양(어떠한 수의 꼭지점을 지님), 또는 불규칙적인 모양인 표면에 개구를 지니는 웰일 수 있다. 특징부는 채널일 수 있으며, 표면상의 채널의 모양은 굽어있거나, 선형이거나, 각져 있거나, 이들의 조합으로 있는 면을 포함할 수 있다. 다른 채널 특징부는 선형이거나, 구불구불하거나, 직사각이거나, 사각이거나, 삼각이거나, 원형이거나, 타원형이거나, 쌍곡선형이거나, 이들의 조합일 수 있다. 채널은 하나 이상의 분기부분 또는 코너를 지닐 수 있다. 채널은 표면상의 두 지점을 연결할 수 있고, 그러한 두 지점 중 하나 또는 둘 모두는 기판의 가장자리일 수 있다. 도 3b 및 도 3c는 불스-아이 기점내에 그를 둘러싼 웰과 함께 불스-아이 기점에서의 예시적인 채널 특징부를 나타내고 있다.
표면에 직각으로 취한 오목 특징부의 횡단면 모양은 굽어있거나, 선형이거나 또는 이들의 조합으로 있는 웰을 지닐 수 있다. 따라서, 그러한 횡단면 모양은 원 또는 타원의 일부(예, U-자형)일 수 있거나, 코너에서 만나는 둘 이상의 선형 면(예, V-, 사각-, 다각- 또는 별-모양)을 지닐 수 있다. 횡단면 모양의 면에서, 오목 특징부의 바닥은 표면 상의 개구보다 더 좁거나, 더 넓거나, 대체로 그와 동일할 수 있다. 이들 횡단면 모양은 오목 특징부가 웰인 경우에 대해서 예시되어 있으며, 그러한 경우에, 웰이 실린더형 횡단면을 지니는 때에는, 표면에서의 개구는 웰의 바닥과 대체로 동일한 면적일 것인 반면에, 웰이 콘형 횡단면을 지니는 때에는, 웰의 바닥은 표면상의 개구에서의 면적과 상이한 면적(전형적으로는 더 작은 면적)을 지닐 것이다. 물론, 비록 웰에 대해서 예시되어 있지만, 횡단면은 채널에도 적용될 수 있다.
오목 특징부가 웰을 형성하는 구체예의 경우에, 각각의 웰은 액체를 한정할 수 있는 어떠한 체적을 지닐 수 있다. 최소 또는 최대 체적이, 예를 들어, 기판의 다운스트림 사용을 위해서 예상되는 처리량(예, 다중성(multiplexity), 해상도, 분석물 조성, 또는 분석물 반응성을 수용하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 그러한 체적은 적어도 1 x 10-3 ㎛3, 1 x 10-2 ㎛3, 0.1 ㎛3, 1 ㎛3, 10 ㎛3, 100 ㎛3 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 체적은 최대 1 x 104 ㎛3, 1 x 103 ㎛3, 100 ㎛3, 10 ㎛3, 1 ㎛3, 0.1 ㎛3 또는 그 미만일 수 있다. 겔 물질은 웰의 체적의 전체 또는 그 일부를 충진할 수 있음이 이해될 것이다. 개별적인 웰 내의 겔의 체적은 상기 특정된 값들보다 더 크거나, 그들보다 더 작거나, 그러한 값들 사이에 있을 수 있다.
표면상의 각각의 웰 개구에 의해서 점유되는 면적은 웰 체적에 대해서 상기 기재된 것들과 유사한 기준을 기반으로 하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 표면 상의 각각의 웰 개구에 대한 면적은 적어도 1 x 10-3 ㎛2, 1 x 10-2 ㎛2, 0.1 ㎛2, 1 ㎛2, 10 ㎛2, 100 ㎛2 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 그러한 면적은 최대 1 x 103 ㎛2, 100 ㎛2, 10 ㎛2, 1 ㎛2, 0.1 ㎛2, 1 x 10-2 ㎛2, 또는 그 미만일 수 있다. 각각의 웰의 깊이는 적어도 0.1 ㎛, 1 ㎛, 10 ㎛, 100 ㎛ 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 깊이는 최대 1 x 103 ㎛, 100 ㎛, 10 ㎛, 1 ㎛, 0.1 ㎛ 또는 그 미만일 수 있다.
규칙적, 반복적 및 불규칙적 패턴을 포함한 웰 또는 다른 오목 특징부의 여러 상이한 배치가 예상될 수 있다. 예를 들어, 웰은 조밀한 팩킹 및 개선된 밀도를 위해서 육각 그리드(hexagonal grid)로 배치될 수 있다. 다른 배치는, 예를 들어, 직선형(즉, 직사각) 배치, 및 삼각 배치 등등을 포함할 수 있다. 특정의 배치, 및 사용되는 경우에 있어서의 상이한 도메인의 배치들 사이의 차이는 본원에서 참조로 포함되는 미국 특허 제7,813,013호 및/또는 미국 특허출원 제13/267,565호의 교시내용을 따를 수 있다. 다양한 결정상 또는 다결정상 패턴 중 어떠한 패턴이 유용할 수 있다.
웰의 패턴은 웰에 대한 평균 피치(즉, 중심 대 중심 거리)의 면에서 특징이 있을 수 있다. 다시 설명하면, 패턴은 규칙적이어서 평균 피치 둘레의 변화 계수가 작을 수 있거나, 패턴은 불규칙적이고, 그러한 경우에, 변화 계수는 비교적 클 수 있다. 어느 경우에나, 평균 피치는, 예를 들어, 적어도 10 nm, 0.1 ㎛, 0.5 ㎛, 1 ㎛, 5 ㎛, 10 ㎛, 100 ㎛ 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 평균 피치는, 예를 들어, 최대 100 ㎛, 10 ㎛, 5 ㎛, 1 ㎛, 0.5 ㎛ 0.1 ㎛ 또는 그 미만일 수 있다. 물론, 웰의 특정 패턴을 위한 평균 피치는 상기 범위로부터 선택된 더 작은 값 중 하나와 더 큰 값 중 하나 사이에 있을 수 있다.
웰의 패턴은 또한 정의된 면적 내의 웰의 밀도(즉, 웰의 수)와 관련하여 특징이 있을 수 있다. 예를 들어, 웰은 mm2 당 대략 2 백만의 밀도로 존재할 수 있다. 본원에 기재된 제조 방법에 따르면, 밀도는, 예를 들어, 적어도 mm2 당 100, mm2 당 1000, mm2 당 10만, mm2 당 1 백만, mm2 당 2 백만, mm2 당 5 백만, 또는 그 초과를 포함하는 여러 밀도로 용이하게 조정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 밀도는 최대 mm2 당 5 백만, mm2 당 2 백만, mm2 당 1 백만, mm2 당 10 만, mm2 당 1,000, mm2 당 100 또는 그 미만인 것으로 조정될 수 있다. 물론, 기판 상의 웰의 밀도는 상기 범위로부터 선택된 더 작은 값 중 하나와 더 큰 값 중 하나 사이에 있을 수 있다.
특정의 구체예에서, 겔 물질이 사용된다. 일부 구체예에서, 겔-형성(예, 중합 가능한) 물질이 고형 지지체에 액체 상태로 제공되고, 후속하여 겔로 전환된다. 중합 가느한 물질의 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, N-비닐 피롤리디논 또는 이들의 유도체를 포함한다. 그러한 물질은 하이드로겔을 제조하기에 유용하다. 일부 구체예에서, 중합 가능한 물질은 코-폴리머를 형성하는 화합물의 둘 이상의 상이한 종을 포함할 수 있다. 예를 들어, 아크릴아미드, 메타크릴아미드, 하이드록시에틸 메타크릴레이트, N-비닐 피롤리디논 또는 이들의 유도체의 둘 이상의 상이한 종이 중합되어 코폴리머 하이드로겔을 형성시키는 코-모노머로서 기능할 수 있다. 유용한 하이드로겔은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 실란-비함유 아크릴아미드(silane-free acrylamide: SFA) 폴리머(참조, 본원에서 참조로 포함되는 미국 특허공보 제2011/0059865 A1), 폴리(N-(5-아지도아세타미딜펜틸)아크릴아미드-코-아크릴아미드)(PAZAM, 참조, 본원에서 참조로 포함되는 미국 가특허출원 제61/753,833호), 예를 들어, WO 00/31148호(본원에서 참조로 포함됨)에 기재된, 아크릴아미드 및 아크릴산 또는 비닐 기를 함유하는 아크릴산으로부터 형성된 폴리아크릴아미드; 예를 들어, WO 01/01143호 또는 WO 03/014392호(각각 본원에서 참조로 포함됨)에 기재된, [2+2] 광-고리화 첨가 반응(photo-cycloaddition)을 형성하는 모노머들로부터 형성된 폴리아크릴아미드 폴리머; 또는 미국 특허 제6,465,178호, W0 01/62982호 또는 WO 00/53812호(각각 본원에서 참조로 포함됨)에 기재된 폴리아크릴아미드 코폴리머를 포함한다. 이들 겔 물질의 화학적으로 처리된 변이체, 예컨대, 상응하는 반응성 기를 지니는 올리고누클레오티드와 반응(예컨대, 5'- 또는 3'-알키닐 개질된 올리고누클레오티드와 반응성인 아지도-SFA를 생성시키기 위한 SFA의 가아지도분해(azidolysis))시켜 제조된 화학적으로 처리된 SFA가 또한 유용하다. 예시적인 하이드로겔 및 하이드로겔을 형성시키기 위해서 사용될 수 있는 중합 가능한 물질은, 예를 들어, 본원에서 참조로 포함되는 미국 출원 일련번호 제61/753,833호 또는 미국 특허출원 공보 제2011/0059865 A1에 기재되어 있다. 다른 유용한 겔은 상태가 액체에서 겔라틴성으로 온도 의존적 변화에 의해서 형성되는 것들이다. 그러한 예는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 한천, 아가로스 또는 젤라틴을 포함한다.
구조화된 기판의 표면 상의 웰 또는 다른 오목 특징부에 있는 겔 물질은 표면에 공유 결합될 수 있다. 예를 들어, PAZAM는 본원에서 참조로 포함되는 미국 출원 일련번호 제61/753,833호에 기재되고 본원의 실시예 부분에서 기재된 표면 물질 및 다른 시약을 사용하여 표면에 공유 결합될 수 있다. 그러나, 겔 물질은 이하 실시예 부분에서 SFA에 대해서 예시되는 바와 같이 웰 또는 다른 오목 특징부에 공유 결합될 필요는 없다.
하나 이상의 분석물이 구조화된 기판 상에 존재하는 겔 물질 내에 또는 그 위에 존재할 수 있다. 본 개시내용의 겔-함유 기판은 분석물을 검출하거나 분석물과의 합성적 반응을 수행하기에 특히 유용하다. 따라서, 검출되거나, 특성화되거나, 개질되거나, 합성되는 등등의 다양한 분석물 중 어떠한 분석물이 본원에 기재된 기판의 겔 물질 상에 또는 그 내에 존재할 수 있다. 예시적인 분석물은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 핵산(예, DNA, RNA 또는 이들의 유사체), 단백질, 폴리사카라이드, 세포, 항체, 에피토프, 수용체, 리간드, 효소(즉, 카나아제, 포스파타제 또는 폴리머라제), 또는 저분자 약물 후보물질 등을 포함한다. 구조화된 기판은 분석물의 라이브러리로부터의 복수의 상이한 종을 포함할 수 있다. 예를 들어, 종들은 항체 라이브러리로부터의 상이한 항체들, 핵산의 라이브러리로부터의 상이한 서열을 지니는 핵산들, 단백질의 라이브러리로부터의 상이한 구조 및/또는 기능을 지니는 단백질들, 저분자의 조합 라이브러리로부터의 약물 후보물질들 등일 수 있다.
일부 구체예에서, 분석물은 이들이 개별적으로 분석 가능하게 구조화된 기판에 분배될 수 있다. 예를 들어, 각 분석물의 단일 분자가 구조화된 기판의 각 겔-함유 웰에 존재할 수 있다. 대안적으로, 분석물은 개별적인 분자들이 반드시 분리되지는 않게 콜로니 또는 집단으로서 존재할 수 있다. 콜로니 또는 집단은 분석물의 단일 종(비록 복수의 카피이기는 하지만) 만을 함유한다는 것과 관련하여 균일할 수 있다. 핵산을 예로 들면, 구조화된 기판 상의 각각의 웰은 핵산의 콜로니 또는 집단을 포함할 수 있고, 그러한 콜로니 또는 집단 내의 모든 핵산은 동일한 누클레오티드 서열(단일 가닥 또는 이중 가닥 중 하나)을 지닐 수 있다. 그러한 콜로니는 본원의 어느 곳에서 추가로 상세히 기재된 바와 같이 클러스터 증폭(cluster amplification) 또는 브릿지 증폭(bridge amplification)에 의해서 생성될 수 있다. 표적 서열의 복수의 반복부가 단일의 핵산 분자, 예컨대, 롤링 서클 증폭 절차(rolling circle amplification procedure)를 사용하여 생성된 콘카테머(concatamer)에 존재할 수 있다. 따라서, 구조화된 기판 상의 각각의 웰 내의 겔 물질은 분석물의 단일 종의 복수의 카피를 함유할 수 있다. 대안적으로, 웰 내에 있는 분석물의 콜로니 또는 집단은 둘 이상의 상이한 종을 포함할 수 있다. 예를 들어, 구조화된 기판 상의 하나 이상의 웰이 각각 둘 이상의 상이한 핵산 종(즉, 상이한 서열을 지니는 핵산 분자)를 지니는 혼합된 콜로니를 함유할 수 있다. 혼합된 콜로니 내의 둘 이상의 핵산 종은, 예를 들어, 하나 이상의 핵산이 혼합된 콜로니에서 검출되게 하는, 무시하지 못할만한 양으로 존재할 수 있다.
분석물은 겔 물질에 부착될 수 있다. 부착은 공유 또는 비공유 결합일 수 있다. 핵산을 겔에 부착시키기 위한 예시적인 방법 및 반응물은, 예를 들어, 본원에서 참조로 각각 포함되는 미국 특허출원 공보 제2011/0059865 A1 또는 미국 가특허출원 일련번호 제61/753,833호에 기재되어 있다. 분석물은 핵산일 수 있으며, 핵산은 이들의 3' 산소, 5' 산소를 통해서, 또는 이들의 길이를 따른 다른 위치에서, 예컨대, 3' 말단 누클레오티드의 염기 부분, 5' 누클레오티드의 염기 부분 및/또는 분자내의 어느 곳의 하나 이상의 염기 부분을 통해서 겔에 부착될 수 있다. 비공유 부착 방식은, 예를 들어, 핵산과 겔 사이의 이온성 상호작용, 겔의 기공 내의 핵산의 포집(entrapment), 단백질-단백질 상호작용, 겔 및/또는 핵산 상의 수용체와 리간드 사이의 결합, 및 그 밖의 공지된 방식을 포함한다.
일부 구체예에서, 표면에 적용되는 겔 코팅은 사이 영역으로부터 겔 물질을 제거하기 전에 하나 이상의 분석물을 함유한다. 따라서, 겔 물질은 사이 영역에 존재할 수 있으며, 그러한 사이 영역에 존재하는 겔 물질은 하나 이상의 상이한 분석물에 부착될 수 있다. 대안적으로, 분석물은 사이 영역으로부터 겔 물질을 제거한 후에 오목 특징부 내의 겔 물질에 첨가될 수 있다.
본 개시내용의 구조화된 기판은 흐름 셀(flow cell)에서 발생할 수 있다. 예시적인 흐름 셀, 이들의 제조 방법 및 이들의 사용 방법은 본원에서 각각 참조로 포함되는 미국 특허출원 공보 제2010/0111768 A1 또는 제2012-0270305 A1 또는 WO 05/065814호에 기재되어 있다. 흐름 셀은 본 개시내용의 방법에 의해서 생성되며 합성을 통한 시퀀싱(sequencing-by-synthesis: SBS) 또는 사이클 내의 시약의 반복된 전달을 포함하는 그 밖의 기술(예, 반복적 또는 사이클릭 단계를 지니는 합성 기술 또는 검출 기술)에 주어지는 어레이를 하우징(housing)하기에 편리한 포맷을 제공한다. 예시적인 검출 방법이 이하 더욱 상세하게 기재된다.
일부 구체예에서, 흐름-셀 또는 복수의 표면을 지니는 그 밖의 용기가 사용된다. 복수의 표면을 지니는 용기는 단지 하나의 표면이 겔-함유 오목 특징부(예, 웰)을 지니도록 사용될 수 있다. 대안적으로, 용기에 존재하는 둘 이상의 표면이 겔-함유 오목 특징부를 지닐 수 있다. 흐름 셀의 하나 이상의 표면이 선택적으로 검출될 수 있다. 예를 들어, 흐름 셀의 내부에 있는 반대 표면이 공초점 기술과 같은 본 기술분야에 공지된 방법을 이용하여 집중된 방사선으로 선택적으로 처리될 수 있다. 용기(예, 흐름 셀)의 복수 표면에 방사선을 선택적으로 유도하기에 유용한 공초점 기술 및 장치는, 예를 들어, 본원에서 각각 참조로 포함되는 미국 특허출원 공보 제2009/0272914 A1 또는 미국 특허 제8,039,817호에 기재되어 있다.
본 개시내용은 기판을 제조하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 (a) 평탄 표면을 지닌 고형 지지체를 제공하는 단계로서, 상기 평탄 표면이 하나 이상의 오목 특징부에 의해서 중단되고, 오목 특징부가 겔 물질을 함유하고, 하나 이상의 오목 특징부가 평탄 표면상의 하나 이상의 사이 영역과 경계를 이루고 있게 하여 고형 지지체를 제공하는 단계: (b) 고형 지지체의 적어도 일부를 겔 물질로 코팅하는 단계로서, 그러한 일부가 오목 특징부 중 하나 이상 및 사이 영역 중 하나 이상을 포함하게 하여, 고형 지지체의 적어도 일부를 겔 물질로 코팅하는 단계; 및 (c) 하나 이상의 사이 영역으로부터 겔 물질을 제거하고 하나 이상의 오목 특징부에 겔 물질을 유지시키기 위해서 평탄 표면을 폴리싱하는 단계를 포함할 수 있다.
기판은 본 기술분야에서 공지된 다양한 기술 중 어떠한 기술을 이용하여 오목 특징부를 지니도록 제작될 수 있다. 많은 구체예에서, 오목 특징부는 나노미터 또는 마이크로미터 치수 정도로 작을 것이다. 그러한 경우에, 나노제작 또는 마이크로제작 기술이 이용될 수 있다. 이들 기술의 예는 이하 실시예 II에서와 같이 본원의 어느 곳에서 기재되어 있다. 추가의 예시적인 나노제작 및 마이크로제작 기술은 본원에서 각각 참조로 포함되는 미국 가특허출원 일련번호 제13/661,524호 및 미국 특허출원 공보 제2012/0316086 A1에 기재되어 있다.
하나 이상의 오목 특징부, 예컨대, 웰은 사전 형성된 겔 물질로 또는 후속적으로 겔 물질을 형성하는 액체로 코팅될 수 있다. 전자의 방법의 예는 스핀 코팅, 침지, 양압 또는 음압(positive or negative pressure) 하의 겔의 유동, 또는 본원에서 참조로 포함되는 미국 가특허출원 일련번호 제61/753,833호에 기재된 기술을 이용한 사전 형성된 PAZAM에 의한 기판의 코팅이다. 사전 형성된 PAZAM에 의한 웰의 어레이의 코팅은 이하 실시예 III에서 입증되고 있다. 후속적으로 겔을 형성하는 액체를 적용시키는 예는 액체 형태의 실란 비함유 아크릴아미드 및 N-[5-(2-브로모아세틸)아미노펜틸]아크릴아미드(BRAPA)로 웰의 어레이를 코팅시키고 시약들이 표면상에서 중합에 의해서 겔을 형성하게 하는 것이다. 이러한 방법에 의한 어레이의 코팅은 이하 실시예 I에서 입증되고 있으며, 본원에서 참조로 포함되는 미국 특허출원 공보 제2011/0059865 A1에 기재된 화학적 시약 및 절차를 이용할 수 있다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 웰-함유 기판이 사전 형성된 겔 물질 내로 침지되는 때에, 그러한 겔 물질은 웰을 선택적으로 충진시킬 수 있고, 폴리싱이 필요하지 않을 수 있다.
분석물은 고형 지지체와 접촉되기 전 또는 그 후의 겔 물질에 첨가될 수 있다. 추가로, 분석물은 겔에 첨가될 수 있거나(즉, 겔이 이의 전구 시약으로부터 형성된 후에), 분석물은 겔 형성 시약 용액에 첨가될 수 있다(즉, 겔 형성 전에). 일부 구체예에서, 다양한 분석물이 겔 형성 전에 첨가될 수 있고, 다른 것들은 겔 형성 후에 첨가될 수 있다. 한 가지 예로, 프라이머 핵산(primer nucleic acid)이 겔 형성 용액에 첨가되고, 이어서, 그러한 용액이 겔을 형성하게 한다(예, SFA 및 PAZAM에 대해서 발생하는 바와 같은 중합에 의해서). 겔 형성은 고체 지지체 상에서 발생할 수 있거나, 겔이 사전 형성되고, 이어서, 고형 지지체 상에 코팅될 수 있다. 어떠한 방식이든지, 프라이머가 오목 특징부, 예컨대, 웰 내에 존재하는 겔에 부착될 것이다. 이어서, 프라이머에 상보적인 표적 핵산이 프라이머-함유 겔에 첨가되어서, 겔 물질이 고형 지지체 상에 코팅된 후에, 그러한 표적 핵산이 겔에 (혼성화(hybridization)를 통해서) 부착되게 할 수 있다. 표적 핵산의 혼성화는, 임의로, 폴리싱 단계가 수행된 후에, 발생할 수 있다(폴리싱은 이하 추가로 상세기 기재된다). 앞선 예는, 핵산(프라이머 또는 표적으로서 기능화됨)이 구조화된 기판의 상이한 제작 단계에서 겔에 첨가되는 여러 예를 기재하고 있다.
여러 구체예에서, 겔에 부착되는 프라이머 핵산(또는, 달리 겔 내에 또는 겔 상에 존재)은 주형 핵산의 포획 및/또는 증폭을 위해서 사용될 수 있다. 프라이머는 라이브러리 내의 상이한 표적 핵산에 부착되는 유니버셜 어댑터 서열에 혼성화하는 유니버셜 프라이머(universal primer)일 수 있다(즉, 각각의 표적 핵산이 라이브러리 내의 다른 표적 핵산과는 다른 표적 영역을 포함하고, 라이브러리 내의 여러 표적 핵산이 동일한 유니버셜 어댑터 서열을 지닌다). 일부 구체예에서, 표적 핵산이 겔 물질에 부착될 수 있으며, 프라이머(용액 중에 있든지 겔에 또한 결합되어 있든지)가 사용되어 부착된 표적 핵산을 증폭시킬 수 있다(즉, 표적 핵산이 증폭을 위한 주형으로서 기능할 수 있다).
본원에 기재된 방법은 다양한 증폭 기술 중 어떠한 기술을 이용할 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 기술은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification: RCA), 다중 변위 증폭(multiple displacement amplification: MDA), 또는 랜덤 프라임 증폭(random prime amplification; RPA)를 포함한다. 특정의 구체예에서, 증폭에 사용되는 하나 이상의 프라이머가 겔 물질에 부착될 수 있다. PCR 구체예에서, 증폭에 사용되는 프라이머 중 하나 또는 둘 모두가 겔 물질에 부착될 수 있다. 부착된 프라이머의 두 종을 이용하는 포맷은 흔히 브릿지 증폭(bridge amplification)으로 일컬어지는데, 그 이유는 이중 가닥 앰플리콘들이 복사되는 주형 서열의 측부에 있는 두 개의 부착된 프라이머 사이에서 브릿지-유사 구조를 형성하기 때문이다. 브릿지 증폭에 사용될 수 있는 예시적인 시약 및 조건이, 예를 들어, 본원에서 각각 참조로 포함되는 미국 특허 제5,641,658호, 미국 특허출원 공보 제2002/0055100호, 미국 특허 제7,115,400호, 미국 특허출원 공보 제2004/0096853호, 미국 특허출원 공보 제2004/0002090호; 미국 특허출원 공보 제 2007/0128624호; 및 미국 특허출원 공보 제2008/0009420호에 기재되어 있다. PCR 증폭이 또한 겔 물질에 부착된 증폭 프라이머 및 용액 중의 제 2 프라이머 중 하나에 의해서 수행될 수 있다. 하나의 고형 상-부착된 프라이머 및 용액 상 프라이머의 조합을 사용하는 예시적인 포맷은, 예를 들어, 본원에서 각각 참조로 포함되는 문헌[Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003)], WO 05/010145호, 또는 미국 특허출원 공보 제2005/0130173호 또는 미국 특허출원 공보 제2005/0064460호에 기재된 바와 같은 에멀젼 PCR이다. 에멀젼 PCR은 예시적인 포맷이며, 본원에 기재된 방법의 목적상 에멀젼의 사용은 임의적이고, 사실, 여러 구체예의 경우에 에멀젼이 사용되지 않음이 이해될 것이다. 추가로, 프라이머는 ePCR 참조에 기재된 바와 같이 고형 지지체에 직접적으로 부착될 필요가 없으며, 그 대신 본원에서 기재된 바와 같이 겔 물질에 부착될 수 있다. 일부 고형 상 PCR 또는 브릿지 증폭 포맷에서, 표적 핵산이 겔 물질에 부착되고, 증폭을 위한 주형으로서 사용될 수 있다.
RCA 기술이 본 개시내용의 방법에서의 이용을 위해서 변화될 수 있다. RCA 반응에서 사용될 수 있는 예시적인 구성요소 및 RCA가 앰플리콘을 생성시키는 원리는, 예를 들어, 본원에서 각각 참조로 포함되는 문헌[Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)] 및 미국 특허출원 공보 제2007/0099208 A1에 기재되어 있다. RCA에 사용되는 프라이머는 용액 중에 있거나 겔 물질에 부착될 수 있다.
MDA 기술이 본 개시내용의 방법에서의 이용을 위해서 변화될 수 있다. MDA를 위한 기본 원리 및 유용한 조건은, 예를 들어, 본원에서 각각 참조로 포함되는 문헌[Dean et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA 99:5261-66 (2002); Lage et al., Genome Research 13:294-307 (2003); Walker et al., Molecular Methods for Virus Detection, Academic Press, Inc., 1995; Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-96 (1992)]; 미국 특허 제5,455,166호; 미국 특허 제5,130,238호; 및 미국특허 제6,214,587호에 기재되어 있다. MDA에 사용되는 프라이머는 용액 중에 있거나 겔 물질에 부착될 수 있다.
특정의 구체예에서, 상기-예시된 증폭 기술들의 조합이 이용될 수 있다. 예를 들어, RCA와 MDA가 조합으로 사용될 수 있으며, 여기서, RCA는 용액 중의 콘카테머 앰플리콘을 생성시키기 위해서 사용된다(예, 용액-상 프라이머를 사용하여). 이어서 앰플리콘이 겔 물질에 부착되는 프라이머를 사용하는 MDA를 위한 주형으로서 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 조합된 RCA와 MDA 단계 후에 생성된 앰플리콘이 겔 물질에 부착될 것이다. 그러한 앰플리콘은 일반적으로는 표적 누클레오티드 서열의 콘카테머 반복부를 함유할 것이다.
증폭 기술들, 예컨대, 상기 예시된 것들이 이용되어 표적 핵산의 복수 카피를 지니는 겔-함유 특징부를 생성시킬 수 있다. 개별적인 특징부, 예컨대, 웰은 단일의 분자 콘카테머, 예컨대, RCA에 의해서 생산된 것들의 형태로, 또는 동일한 서열을 지니는 많은 핵산 분자들, 예컨대, 브릿지 PCR에 의해서 생산된 것들의 형태로 누클레오티드 서열의 클론 집단을 지닐 수 있다. 일반적으로는, 증폭된 표적의 여러 카피를 지니는 핵산(들)이 겔 물질에 부착될 것이다.
일부 적용의 경우에, 개별적인 겔-함유 웰(또는 다른 오목 특징부)은 첫 번째 표적 핵산으로부터의 앰플리콘으로 우세하게 집단화될 수 있고, 또한 두 번째 표적 핵산으로부터 또는 증폭 동안 발생하는 자발적 돌연변이로부터의 낮은 수준의 오염 앰플리콘을 지닐 수 있다. 어레이는 어레이의 후속 사용에 허용 가능하지 않은 영향을 주기 위해서 충분히 낮은 수준의 오염 앰플리콘을 지니는 하나 이상의 증폭 부위를 지니 수 있다. 예를 들어, 어레이가 검출 적용에서 사용되어야 하는 때에, 허용 가능한 수준의 오염은 허용 가능하지 않은 방식으로 검출 기술의 분해능 또는 노이즈에 대한 신호에 영향을 주지 않는 수준일 것이다. 따라서, 명확한 클론성이 일반적으로는 본원에 기재된 방법에 의해서 제조된 어레이의 특적의 사용 또는 적용과 관련될 것이다. 특정의 적용을 위한 개별적인 웰 또는 그 밖의 특징부에서 허용 가능할 수 있는 예시적인 오염 수준은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 최대, 0.1%, 0.5%, 1%, 5%, 10% 또는 25%의 오염 앰플리콘을 포함한다. 어레이는 이들 예시적인 수준의 오염 앰플리콘을 지니는 하나 이상의 웰 또는 그 밖의 특징부를 포함할 수 있다. 예를 들어, 어레이 중의 최대 5%, 10%, 25%, 50%, 75% 또는 또한 100%의 특징부가 어떠한 오염 앰플리콘을 지닐 수 있다.
고형 지지체의 표면 상에 코팅되는 겔 물질은 지지체에 공유 결합될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 분석물, 예컨대, 핵산을 겔 물질에 부착시키는 단계는 구조화된 기판의 제작 중 다양한 상이한 단계에서 수행될 수 있다. 따라서, 겔 물질은 분석물을 겔 물질에 부착시키기 전에 또는 그 후에 고형 지지체에 부착될 수 있다. 고형 지지체에 대한 겔 물질의 부착은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 본원에서 참조로 포함되는 미국 가특허출원 일련번호 제61/753,833호에 기재되고 이하 실시예 III에서 입증되는 것들을 포함한 어떠한 유용한 화학을 이용하여 수행될 수 있다. 고형 지지체에 대한 겔 물질의 공유 결합이 모든 구체예에서 필수적인 것은 아님이 이해될 것이다. 따라서, 겔-코팅된 지지체를 폴리싱하거나 폴리싱된 기판을 사용하는 후속 단계가 오목 특징부, 예컨대, 웰에 임의로, 그러나, 필수적이지는 않게, 공유 결합되는 겔 물질을 지니는 기판에 대해서 수행될 수 있다.
본원에 기재된 방법은 고형 지지체의 표면으로부터 겔 물질을 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 고형 지지체 상에 코팅되는 겔 물질은 다양한 기술 중 어떠한 기술을 이용하여 사이 영역으로부터 선택적으로 제거될 수 있다. 예를 들어, 겔 물질은 기계적인 폴리싱 기술에 의해서 오목 특징부 및 사이 영역을 지니는 고형 지지체로부터 제거될 수 있다. 기계적인 폴리싱은 고형 지지체의 표면에 연마력(abrasive force)을 적용함으로써 수행될 수 있다. 예시적인 방법은 비드의 슬러리에 의한 연마, 시트(sheet) 또는 천에 의한 와이핑(wiping), 또는 스크래핑(scraping) 등을 포함한다. 폴리싱의 한 가지 예는 사이 영역 겔을 제거하기 위해서 3㎛ 실리카 비드 슬러리(물 중의 10%w/v)로 코팅된 보푸라기 없는(클린룸 등급) 와이프(wipe)를 사용함을 포함한다. 폴리싱 휄/그라인더가 또한 이러한 슬러리와 함께 사용될 수 있다. 기계적인 폴리싱이 또한 사이 영역으로부터 겔을 제거하기 위해서 유체 젯 또는 공기 젯을 이용하여 달성될 수 있다.
폴리싱은 화학적 폴리싱, 예컨대, 아크릴아미드의 라디칼-기반 분해 또는 가수분해(예, 문헌[Kurenkov, et al., Russian Journal of Applied Chemistry, 75:1039-1050 (2002); Caulfield et al., Polym. 44:1331-1337 (2003); and Caulfield, et al., Chem. Rev. 102:3067-3083 (2002)]에 기재된 바와 같은 벤조일 퍼옥사이드 또는 묽은 과산화수소에 대한 노출을 통해서)를 포함할 수 있다.
폴리싱은 또한, 입자의 콜로이드성 현탁액을 함유하는 화학적 슬러리가 기계적 박리를 위해서 사용되고, 이어서, 사이 영역으로부터 겔 물질의 전위된 부분을 용해시키는, 화학적 폴리싱 방법과 기계적 폴리싱 방법의 조합을 포함할 수 있다. 사이 영역을 폴리싱하거나 세정하기 위한 다른 방법은 접착 기반 기술, 예를 들어, 겔 물질에 대한 친화성을 지니는 강성의 평탄 접찹 필름이 표면상에 코팅되어서 사이 영역 내의 겔 물질과의 친밀한 접촉(예, 화학적 연결을 통해서)을 이루게 하는 기술을 포함한다. 이러한 접착 필름의 기계적 제거/벗겨내기는 사이 영역으로부터의 겔 물질의 기계적 제거를 발생시키면서, 오목 특징부에는 겔 물질을 남길 것이다.
또 다른 예에서, 티오포스페이트-그라프팅된 SFA가 다음과 같이 표면 상의 사이 영역으로부터 제거될 수 있다. 물-적셔진 Whatman 와이프를 알루미늄 옥사이드(약 100mg, 0.3㎛) 또는 스틸 비드 내로 가볍게 두드릴 수 있다. 이어서, 형성된 슬러리를 고른 압력을 이용하여 작은 동심원으로 고형 지지체의 표면 상을 문지를 수 있다. 이어서, 세정 수-습윤 Whatman 와이프가 표면 상의 슬러리를 제거하기 위해서 사용될 수 있다. 사이 영역으로부터 겔 물질을 제거하기 위한 본원에 예시된 기계적 및 화학적 폴리싱 방법이 또한 겔 물질이, 제거되든지 그렇지 않든지 간에, 사이 영역에서의 겔 물질을 불활성화시키기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 겔 물질은 분석물, 예컨대, 핵산에 부착하는 능력과 관련하여 또는 핵산 증폭을 지지하는 능력과 관련하여 불활성화될 수 있다.
어레이를 제조하는 방법은 (a) 겔 물질을 함유하는 복수의 웰들을 지닌 표면을 지니는 고형 지지체를 제공하는 단계로서, 웰들이 표면 상의 사이 영역에 의해서 서로 분리되고, 사이 영역이 웰들 각각에서의 겔 물질을 복수의 다른 웰들에서의 겔 물질로부터 격리시키도록 하여 고형 지지체를 제공하는 단계; (b) 각각의 웰 들내의 겔 물질에 부착된 표적 핵산의 단일 종을 지니는 웰들의 어레이를 생성시키기 위해서 고형 지지체의 웰들에 표적 핵산의 라이브러리를 전달하는 단계로서, 어레이 내의 상이한 웰들이 라이브러리로부터의 상이한 표적 핵산 종을 지니게 하여 표적 핵산의 라이브러리를 전달하는 단계; 및 (c) 어레이의 웰들의 각각에서 개별적인 표적 핵산의 클론 집단을 생성시키기 위해서 어레이의 웰들 내의 겔 물질에 부착된 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 포함할 수 있다.
여러 구체예에서, 본원에 기재된 구조화된 기판은 혼합물로부터 기판 상의 개별화된 위치에 복수의 상이한 분석물를 편리하게 전달하여 어레이를 형성시키는 이점을 제공한다. 구조화된 기판은 기판과 접촉되어 있는 분석물의 혼합물로부터 각각의 개별적인 겔-함유 웰(또는 다른 오목 특징부)에서의 단일 분석물의 선택적 포착을 용이하게 한다. 구조화된 기판 상의 겔-함유 웰(또는 다른 오목 특징부)의 패턴 및 로딩 효율이 단일의 분석물 종을 지니는 것과 관련하여 각각의 특징부의 분석물 밀도 및 순도와 같은 요망되는 특징을 지니는 어레이를 얻기 위해서 조절될 수 있다. 예를 들어, 더 높은 웰의 밀도가 어레이 상의 더 높은 분석물 밀도를 얻기 위해서 사용될 수 있으며, 반대로, 더 낮은 웰 밀도는 어레이 상의 더 낮은 분석물 밀도를 얻기 위해서 사용될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 용액 중의 분석물의 농도 또는 양이 어레이 상의 더 높은 분석물 밀도를 얻기 위해서 증가될 수 있거나, 어레이 상의 더 낮은 분석물 밀도를 얻기 위해서 감소될 수 있다. 각각의 겔-함유 웰(또는 다른 오목 특징부)에서의 분석물의 평균 순도가, 이하 추가로 상세히 기재되고 실시예 부분에서 입증되는 바와 같이, 기판의 성질 또는 분석물의 전달을 위한 조건을 변경시킴으로써 조절될 수 있다.
특정의 구체예에서, 웰(또는 다른 오목 특징부)의 크기 또는 체적이 포집되는 분석물의 순도에 영향을 주도록 조절될 수 있다. 예를 들어, 웰은 입체적 배제가 하나 이상의 분석물 분자가 포집되거나 웰에 씨딩되는 것을 방지하도록 특정의 유형의 단일 분석물만을 수용하는 겔 물질의 면적 또는 체적을 지닐 수 있다. 입체적 배제는 큰 분석물, 예커내, 핵산에 특히 유용할 수 있다. 더욱 특히, 웰(또는 다른 오목 특징부)는 기판에 씨딩되어야 하는 표적 핵산에 대한 배제 체적의 직경과 동등하거나 그 보다 작은 면적을 지니는 겔 표면을 나타낼 수 있다. 표적 핵산에 대한 배제 체적과 이의 직경은, 예를 들어, 표적 핵산의 길이로부터 결정될 수 있다. 핵산의 배제 체적 및 배제 체적의 직경을 결정하기 위한 방법은, 예를 들어, 본원에서 각각 참조로 포함되는 미국 특허 제7,785,790호, 또는 문헌[Rybenkov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 5307-5311 (1993); Zimmerman et al., J. Mol. Biol. 222:599-620 (1991); 또는 Sobel et al., Biopolymers 31:1559-1564 (1991)]에 기재되어 있다. 입체적 배제를 위한 조건은 본원에서 각각 참조로 포함되는 미국 가특허출원 일련번호 제13/661,524호 및 미국 특허 제7,785,790호에 기재되어 있고, 본 개시내용의 구조화된 기판을 위해서 용이하게 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 웰(또는 다른 오목 특징부)이 증폭 부위로 수송되는 표적 핵산의 배제 체적의 직경보다 실질적으로 더 큰 면적을 지니는 겔 표면을 나타낼 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 특징부에 대한 면적은 입체적 배제가 발생하지 않을 만큼 충분히 클 수 있다.
일부 구체예, 예컨대, 상기 기재된 입체적 배제 구체예에서, 표적 핵산의 라이브러리는 증폭 과정의 개시 전에 고형 지지체의 겔-함유 웰(또는 다른 오목 특징부)에 전달될 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산은 기판 내의 겔 물질을 표적 핵산으로 씨딩하기 위한 조건하에 구조화된 기판에 전달될 수 있다. 기판은 임의로 겔에 씨딩되지 않은 표적 핵산뿐만 아니라 기판의 후속 처리 또는 사용에 원치 않는 어떠한 다른 물질을 제거하기 위해서 세척될 수 있다. 증폭은 본원에서 앞서 기재된 기술들 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
대안적인 구체예에서, 표적 핵산의 라이브러리는 고형 지지체의 겔-함유 웰(또는 다른 오목 특징부)에 전달될 수 있고, 증폭 과정은 씨딩 상황과 동시에 발생할 수 있다. 예를 들어, 씨딩은, 예를 들어, 본원에서 참조로 포함되는 미국 가특허출원 일련번호 제61/715,478호에 기재된 바와 같은 역학적 배제(kinetic exclusion)를 이용하는 방식 하에 발생할 수 있다. 역학적 배제는 또 다른 상황 또는 과정이 발생하는 것을 효과적으로 배제시키기에 충분하게 신속한 속도로 과정이 발생하는 때에 발생할 수 있다. 겔-함유 웰의 어레이의 경우에, 웰은 용액으로부터 표적 핵산으로 무작위로 씨딩될 수 있고, 표적 핵산의 카피가 증폭 과정에서 생성되어 씨딩된 부위의 각각을 용량까지 충진시킬 수 있다. 씨딩과 증폭 과정은 증폭 속도가 씨딩 속도를 앞지르지 않는 조건하에 동시에 진행될 수 있다. 그와 같이, 첫 번째 표적 핵산에 의해서 씨딩된 부위에서 카피가 형성되는 비교적 신속한 속도가 두 번째 핵산이 증폭을 위한 부위를 씨딩하는 것을 효과적으로 배제시킬 것이다. 유사하게, 역학적 배제는 표적 핵산의 첫 번째 카피를 제조하기 위한 비교적 느린 속도 대 표적 핵산 또는 첫 번째 카피의 후속 카피를 제조하기 위한 비교적 빠른 속도를 이용할 수 있다. 예를 들어, 역학적 배제는 겔-함유 웰을 씨딩하는 표적 핵산의 첫 번째 카피의 형성에서의 지연(예, 지연된 활성화 또는 느린 활성화) 대 후속 복사제가 형성되어 부위를 충진시키는 비교적 빠른 속도로 인해서 발생할 수 있다. 이러한 예에서, 개별적인 겔-함유 웰은 여러 상이한 표적 핵산으로 씨딩될 수 있다(예, 여러 표적 핵산이 증폭 전에 각각의 부위에 존재할 수 있다). 그러나, 어떠한 주어진 표적 핵산을 위한 첫 번째 카피 형성은 무작위로 활성화되어서 첫 번째 카피 형성의 평균 속도가 후속 카피가 생성되는 속도에 비해서 상대적으로 느리게 할 수 있다. 이러한 경우에, 비록, 개별적인 겔-함유 웰이 여러 상이한 표적 핵산으로 씨딩되지만, 역학적 배제는 이들 표적 핵산 중 하나만이 증폭되게 할 것이다. 일반적으로는, 겔-함유 웰(또는 다른 오목 특징부)은 본원에서 참조로 포함되는 미국 가특허출원 일련번호 제61/715,478호에 기재된 방법으로 증폭 및 어레이 형성을 위한 부위로서 작용할 수 있다.
혼합물로부터 개별적인 겔-함유 오목 특징부로의 복수의 상이한 분석물의 전달에 대한 대안으로서, 분석물들이 순수한 원액으로부터 개별적인 특징부로 따로따로 전달될 수 있다. 유사하게, 분석물들은 합성 빌딩 블록(synthetic building block)의 이산 전달에 의해서 개별적인 특징부에서 합성될 수 있다(예, 누클레오티드 전구체가 핵산을 합성하기 위해서 순차적으로 전달될 수 있다). 동일반응계내(in situ)에서 분석물을 합성하기 위한 순수한 분석물 또는 빌딩 블록의 전달을 위한 예시적인 방법은, 이로 한정되는 것은 아니지만, 잉크젯 어레이 스폿팅(ink jet array spotting) 및 포토리소그래피 어레이 합성법(photolithographic array synthesis)을 포함한다. 유용한 포토리소그래피 방법은 GeneChip® 마이크로어레이를 제작하기 위한 Affymetrix(Santa Clara, CA)에 의해서 상업적으로 이용되는 것들 또는 본원에서 각각 참조로 포함되는 미국 특허 제5,324,633호; 제5,744,305호; 제5,624,711호; 제6,022,963호; 제6,291,183호; 및 제6,416,949호에 기재된 것을 을 포함한다. 잉크젯 스폿팅 기술, 예컨대, SurePrint™ 어레이를 인쇄하기 위한 Agilent(Santa Clara, CA)에 의해서 상업화된 것들 또는 본원에서 각각 참조로 포함되는 미국 특허 제6,337,393호; 제6,419,883호; 제6,420,180호 또는 제6,689,319호에 기재된 것들이 또한 유용하다. 그러한 방법은 본 개시내용의 겔-함유 특징부에 직접 전달하기 위해서 용이하게 변형될 수 있다.
특정의 오목 특징부 내의 겔 물질은 단일의 분석물 종만을 함유할 필요는 없다. 오히려, 일부 구체예에서, 오목 특징부는 그 내부에 있는 겔에 여러 상이한 분석물 종을 함유할 수 있다. 한 가지 예가 도 5에서의 불스-아이 기점 마커(bulls-eye fiducial marker)에 의해서 입증되고 있다. 기점 마커는 두 개의 "밝은" 고리 모양 채널을 포함하는데, 그러한 두 채널의 각각이 겔 물질을 함유하고, 그러한 각각의 밝은 채널 내의 겔 물질은 복수의 상이한 핵산 콜로니에 부착된다. 밝은 채널 내의 핵산 콜로니는 증폭 과정에서 주형으로서 작용한 여러 상이한 표적 핵산 종으로 각각의 고리를 씨딩함으로써 형성되었다. 기점 마커는 또한 두 개의 "어두운" 고리 모양 영역을 포함한다. 그러한 어두운 고리는 사이 표면 패턴에 의해서 형성된다. 예시적인 불스-아이는 동심원 패턴으로 어두운 고리와 밝은 고리를 교대시킴으로써 형성된다. 도 5의 예에서, 구조화된 기판은 또한 단일의 핵산 표적으로부터 유래된 클론 집단을 일반적으로 각각 함유하는 겔-함유 웰을 포함한다. 웰은 밝은 고리와 어두운 고리 사이의 고리 모양 밴드에서 발생한다. 따라서, 기점은 사이 고리, 웰-함유 밴드 및 채널 고리의 교대 패턴을 지닌다. 동일한 증폭 과정이 웰 내에서의 클론성 핵산 콜로니와 기점 마커에서의 혼합된 집단을 동시에 성장시키기 위해서 이용되었다(참조, 이하 실시예 III). 교대 고리 패턴을 지니는 기점의 다른 예는 도 3b 및 도 3c에 도시되어 있다.
본 개시내용은 추가로 분석물을 검출하는 방법을 제공한다. 그러한 방법은 (a) 평탄 표면을 지닌 고형 지지체를 제공하는 단계로서, 상기 평탄 표면이 하나 이상의 오목 특징부에 의해서 중단되고, 오목 특징부가 겔 물질을 함유하고, 하나 이상의 오목 특징부가 평탄 표면상의 하나 이상의 사이 영역과 경계를 이루고 있고, 사이 영역이 실질적으로 겔 물질을 함유하지 않고, 겔 물질이 표적 분석물에 부착되거나 이를 함유하게 하여 고형 지지체를 제공하는 단계: (b) 표적 분석물이 프로브와 특별히 상호작용하는 조건하에 고형 지지체를 프로브와 접촉시키는 단계; 및 (c) 프로브 중 하나 이상과 상호작용하는 표적 분석물의 적어도 서브셋(subset)을 구분하기 위해서 고형 지지체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
특정의 구체예에서, 핵산이 검출되는 분석물이고 오목 특징부가 웰이다. 예를 들어, 핵산을 검출하는 방법은 (a) 표면과 핵산의 라이브러리를 지니는 고형 지지체를 제공하는 단계로서, 표면이 복수의 웰을 지니고, 웰이 겔 물질을 함유하고, 웰이 표면상의 사이 영역에 의해서 서로 분리되고, 사이 영역이 웰들 각각에서의 겔 물질을 복수의 다른 웰에서의 겔 물질로부터 격리시키고, 라이브러리의 표적 핵산의 단일 종이 웰들의 각각 내의 겔 물질에 부착되게 하여 고형 지지체를 제공하는 단계; (b) 고형 지지체를 표적 핵산에 결합하는 하나 이상의 프로브와 접촉시키는 단계; 및 (c) 하나 이상의 프로브에 결합하는 표적 핵산 종을 지니는 웰을 구분하기 위해서 고형 지지체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
핵산 어레이를 함유하는 본 개시내용의 구조화된 기판은 다양한 목적 중 어떠한 목적을 위해서 사용될 수 있다. 핵산에 대한 특히 바람직한 용도는 상보성 서열을 지니는 표적 핵산에 혼성화하는 포획 프로브(capture probe)로서 작용하는 것이다. 포획 프로브에 일단 혼성화된 표적 핵산은, 예를 들어, 포획 프로브에 보충된 표지를 통해서 검출될 수 있다. 포획 프로브에의 혼성화를 통한 표적 핵산의 검출 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 본원에서 각각 참조로 포함되는 미국 특허 제7,582,420호; 제6,890,741호; 제6,913,884호 또는 제6,355,431호 또는 미국 특허출원 공보 제2005/0053980 A1; 제2009/0186349 A1 또는 제2005/0181440 A1에 기재된 것들을 포함한다. 예를 들어, 표지는 표지를 지니는 표적 프로브에 포획 프로브를 혼성화시킴에 의해서 포획 프로브에 보충된다. 또 다른 예로, 표지는 포획 프로브가 표지된 올리고누클레오티드에의 결찰(예, 리가아제 활성을 통해서)에 의해서 또는 표지된 누클레오티드의 부가(예, 중합효소 활성을 통해서)에 의해서 연장될 수 있도록 포획 프로브에 표적 프로브를 혼성화시킴으로서 포획 프로브에 보충될 수 있다.
핵산 어레이는 또한 시퀀싱 과정, 예컨대, 합성을 통한 시퀀싱(SBS) 기술에서 사용될 수 있다. 요약하면, SBS는 표적 핵산을 하나 이상의 표지된 누클레오티드, DNA 중합효소 등과 접촉시킴으로써 개시될 수 있다. 프라이머가 주형으로서 표적 핵산을 사용하여 연장되는 이들 특징부는 검출될 수 있는 표지된 누클레오티드를 포함할 것이다. 임의로, 표지된 누클레오티드는 추가로 누클레오티드가 프라이머에 첨가되면 추가의 프라이머 연장을 종료하는 가역적 종료 성질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 가역적 종료자 부분(reversible terminator moiety)을 지니는 누클레오티드 유사체가 프라이머에 부가되어서, 디블록킹제(deblocking agent)가 전달되어 그 부분을 제거할 때까지, 후속 연장이 발생될 수 없게 할 수 있다. 따라서, 가역적 종료를 이용하는 구체예의 경우에, 디블로킹 시약(deblocking reagent)이 흐름 셀(검출이 발생하기 전에 또는 그 후에)에 전달될 수 있다. 다양한 전달 단계 사이에 세척이 수행될 수 있다. 이어서, 사이클이 n 수로 반복되어 프라이머를 n 개의 누클레오티드에 의해서 연장시켜서, 길이 n의 서열을 검출할 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해서 생산되는 어레이와 함께 사용하기 위해서 용이하게 개조될 수 있는 예시적인 SBS 과정, 유체 시스템(fluidic system) 및 검출 플랫폼은, 예를 들어, 본원에서 각각 참조로 포함되는 문헌Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)], WO 04/018497호; WO 91/06678호; WO 07/123744호; 미국 특허 제7,057,026호; 제7,329,492호; 제7,211,414호; 제7,315,019호 또는 제7,405,281호, 및 미국 특허출원 공보 제2008/0108082 A1에 기재되어 있다.
순환 반응(cyclic reaction)을 이용하는 다른 시퀀싱 과정, 예컨대, 파이로시퀀싱(pyrosequencing)이 이용될 수 있다. 파이로시퀀싱은 특정의 누클레오티드가 발생기 핵산 가닥 내로 통합됨에 따른 무기 파이로포스페이트(PPi)의 방출을 검출한다(참조: 본원에서 각각 참조로 포함되는 문헌[Ronaghi, et al., Analytical Biochemistry 242(1), 84-9 (1996); Ronaghi, Genome Res. 11(1), 3-11 (2001); Ronaghi et al. Science 281(5375), 363 (1998)]; 미국 특허 제6,210,891호; 제6,258,568호 및 제6,274,320호). 파이로시퀀싱에서, 방출된 PPi는 ATP 설퍼릴라제에 의해서 아데노신 트리포스페이트(ATP)로 전환됨으로써 검출될 수 있고, 생성되는 ATP는 루시페라제-생산된 광자(luciferase-produced photon)를 통해서 검출될 수 있다. 따라서, 시퀀싱 반응은 발광 검출 시스템을 통해서 모니터링될 수 있다. 형광 기반 검출 시스템을 위해서 사용된 여기 방사선원은 파이로시퀀싱 과정의 경우에 필요하지 않다. 본 개시내용의 어레이에의 파이로시퀀싱의 적용을 위해서 사용될 수 있는 유용한 유체 시스템, 검출기 및 과정은, 예를 들어, 본원에서 각각 참조로 포함되는 WIPO 특허출원번호 PCT/US11/57111호, 미국 특허출원 공보 제2005/0191698 A1, 미국 특허 제7,595,883호 및 미국 특허 제7,244,559호에 기재되어 있다.
결찰 반응을 통한 시퀀싱(Sequencing-by-ligation reaction)이 또한 유용하고, 이러한 반응은, 예를 들어, 본원에서 각각 참조로 포함되는 문헌[Shendure et al. Science 309:1728-1732 (2005)], 미국 특허 제5,599,675호 및 미국 특허 제5,750,341호에 기재된 것들을 포함한다. 일부 구체예는, 예를 들어, 본원에서 각각 참조로 포함되는 문헌Bains et al., Journal of Theoretical Biology 135(3), 303-7 (1988); Drmanac et al., Nature Biotechnology 16, 54-58 (1998); Fodor et al., Science 251(4995), 767-773 (1995)]; 및 WO 1989/10977호에 기재된 바와 같은 혼성화 과정을 통한 시퀀싱(sequencing-by-hybridization procedure)를 포함할 수 있다. 결찰을 통한 시퀀싱과 혼성화 과정을 통한 시퀀싱 둘 모두에서, 겔-함유 웰(또는 다른 오목 특징부)에 존재하는 핵산이 올리고누클레오티드 전달 및 검출의 반복된 사이클에 주어진다. 본원 또는 본원에서 인용된 참조에서 기재된 바와 같은 SBS 방법을 위한 유체 시스템은 결찰을 통한 시퀀싱 또는 혼성화 과정을 통한 시퀀싱을 위한 시약의 전달을 위해서 용이하게 개조될 수 있다. 전형적으로는, 올리고누클레오티드가 형광적으로 표지되고 본원 또는 본원에서 인용된 참조에서의 SBS 과정에 관하여 기재된 것들과 유사한 형광 검출기를 사용하여 검출될 수 있다.
일부 구체예는 DNA 중합효소 활성의 실시간 모니터링을 포함하는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 누클레오티드 통합은 형광단-함유 중합효소와 γ-포스페이트-표지된 누클레오티드 사이의 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer: FRET) 상호작용을 통해서 또는 제로모드 도파관(zeromode waveguide)에 의해서 검출될 수 있다. FRET-기반 시퀀싱을 위한 기술 및 시약은, 예를 들어, 본원에서 전체 내용이 참조로 포함되는 문헌[Levene et al. Science 299, 682-686 (2003); Lundquist et al. Opt. Lett. 33, 1026-1028 (2008); Korlach et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105, 1176-1181 (2008)]에 기대되어 있다.
일부 SBS 구체예는 연장 생성물 내로의 누클레오티드의 통합시에 방출되는 프로톤의 검출을 포함한다. 예를 들어, 방출된 프로톤의 검출을 기반으로 하는 시퀀싱은 Ion Torrent(Guilford, CT, a Life Technologies subsidiary)로부터 상업적으로 구입가능한 전기적 검출기 및 관련 기술 또는 본원에서 각각 참조로 포함되는 미국 특허출원 공보 제2009/0026082 A1; 제2009/0127589 A1; 제2010/0137143 A1; 또는 제2010/0282617 A1에 기재된 시퀀싱 방법 및 시스템을 사용할 수 있다. 특정의 구체예에서, 방출된 프로톤을 검출하기 위해서 사용되는 전기적 검출기는 웰들을 포함하도록 변화될 수 있으며, 그러한 웰들이 본원에서 기재된 바와 같은 겔 물질을 함유할 수 있다.
본 개시내용의 어레이를 위한 또 다른 유용한 적용은 유전자 발현 분석이다. 유전자 발현은 RNA 시퀀싱 기술, 예컨대, 디지탈 RNA 시퀀싱으로 일컬어지는 것들을 이용하여 검출되거나 정량화될 수 있다. RNA 시퀀싱 기술은 본 기술 분야에서 공지된 시퀀싱 방법, 예컨대, 상기 기재된 것들을 이용하여 수행될 수 있다. 유전자 발현이 또한 어레이에 대한 직접적인 혼성화에 의해서 수행된 혼성화 기술 또는 생성물이 어레이 상에서 검출되는 멀티플렉스 검정(multiplex assay)을 이용하여 검출되거나 정량화될 수 있다. 본 개시내용의 어레이는 또한 하나 이상의 개별적인 것들로부터 게놈 DNA 샘플에 대한 유전자형을 측정하기 위해서 사용될 수 있다. 본 개시내용의 어레이에 대해서 수행될 수 있는 에러이-기반 발현 및 유전자형 분석을 위한 예시적인 방법은 본원에서 각각 참조로 포함되는 미국 특허 제7,582,420호; 제6,890,741호; 제6,913,884호 또는 제6,355,431호 또는 미국 특허출원 공보 제2005/0053980 A1; 제2009/0186349 A1 또는 제2005/0181440 A1에 기재되어 있다.
본 개시내용의 어레이에 대한 여러 적용이 표적 핵산의 복수의 카피가 각각의 특징부에 존재하며 함께 검출되는 앙상블 검출(ensemble detection)의 맥락에서 상기 예시되었다. 또 다른 구체예에서는, 표적 핵산 서열이든지 이의 앰플리콘이든지, 단일의 핵산이 각각의 특징부에서 검출될 수 있다. 예를 들어, 겔-함유 웰(또는 다른 오목 특징부)이 검출되어야 하는 표적 누클레오티드 서열을 지니는 단일의 핵산 분자를 함유하도록 구성될 수 있다. 다양한 단일의 분자 검출 기술 중 어떠한 기술이 이용될 수 있으며, 그러한 기술에는, 예를 들어, 부위를 증가된 분해능으로 검출하거나 더욱 민감한 표지를 사용하여 검출하기 위한 상기 기재된 앙상블 검출 기술의 변형예를 포함한다. 사용될 수 있는 단일의 분자 검출 방법의 다른 예는 본원에서 각각 참조로 포함되는 미국 특허출원 공보 제2011/0312529 A1호; 미국 특허출원 일련번호 제61/578,684호; 및 미국 특허출원 일련번호 제61/540,714호에 기재되어 있다.
예를 들어, 본원에서 기재된 방법에 의해서 생성되는, 본 개시내용의 겔-함유 기판은 검출 방법을 위해서 사용될 필요가 없음이 이해될 것이다. 오히려, 구조화된 기판이 사용되어 핵산 라이브러리를 저장할 수 있다. 따라서, 구조화된 기판은 그 안에 있는 핵산을 보존하고 있는 상태로 저장될 수 있다. 예를 들어, 핵산에 부착되는 겔-함유 웰을 지니는 기판이 건조된 상태, 동결 상태(예, 액체 질소 중에), 또는 핵산을 보호하는 용액에 저장될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 구조화된 기판이 핵산 라이브러리를 복제하기 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산에 부착되는 겔-함유 웰을 지닌 기판은 어레이 상의 웰들 중 하나 이상으로부터 복제 앰플리콘을 생성시키기 위해서 사용될 수 있다.
이하 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것이며 이를 제한하고자 하는 것이 아니다.
실시예 I
실란 비함유 아크릴아미드로 코팅된 다중 웰 기판
본 실시예는 나노웰 기판을 실란 비함유 아크릴아미드(SFA)로 코팅시킨 다음, 티오포스페이트 프라이머로 그라프팅시키고, 작용성화 방법의 성공을 확인하기 위한 상보성 형광 올리고누클레오티드에의 겔-그라프팅된 프라이머의 혼성화를 수행함을 입증하고 있다.
BeadChip의 제작을 위해서 일반적으로 사용되는 칩 기판을 Illumina(San Diego, CA)로부터 얻었다. 그러한 칩을 1.5㎛의 피치를 지니는 육각 패턴으로 배열된 0.5 ㎛ 웰을 지니는 규소 또는 제오노아(Zeon Corp., Tokyo, Japan)로 제조하였지만, 그러한 웰은 비드를 함유하지 않았다. 칩을 이하 기재되고 도 1에 도해된 바와 같이 겔 패드로 패턴화시켰다.
칩을 개스킷 밀봉된 챔버에 넣고 산소를 SFA의 형성을 위한 유체 시약으로 대체시킴으로써 제거하였다. SFA를 챔버내의 칩 상에서 중합시켰다. SFA의 형성을 위한 시약 및 중합 조건은 달리, 본원에서 참조로 포함되는 미국 특허출원 공보 제2011/0059865 A1에 기재된 바와 같다. 밀봉된 챔버를 사용하여 중합 혼합물을 칩과 직접 접촉시키고 공기를 완벽하게 제거하였는데, 그 이유는 SFA의 자유 라디칼 중합이 공기-민감성 공정이기 때문이다. 중합 후에, 미국 특허출원 공보 제2011/0059865 A1에 기재된 바와 같이 그리고 이하와 같이 밀봉된 챔버에서 SFA 폴리머에 그라프팅시켰다. 프라이머를 함유하는 용액을 BeadChip의 폴리머 코팅된 표면을 가로질러 유도하고, 이어서, 혼합물을 65℃에서 1.25 시간 동안 인큐베이션(incubation)시켰다(전체 밀봉된 조립체를 큰 오븐에 넣었다).
이러한 방법은 균일하게 코팅된 기판을 생성시켰다. 샘플 이미지가 도 2a에 도시되어 있다. 이산 폴리머 영역을 생성시키기 위해서, 기판상의 웰들 사이에 위치한 "과량의" 폴리머를 DI 물 중의 알루미늄 옥사이드 나노입자(300nm 직경)의 슬러리를 사용하는 기계적인 폴리싱 기술을 이용하여 제거하였다. 3 마이크론 실리카 입자(Kisker Biotech GmbH, Steinfurt, Germany)의 10 중량% 슬러리가 또한 사용될 수 있다. 표면을 보푸라기가 없는 광학등급 티슈를 사용하여 나노입자 슬러리로 수작업으로 문질렀다. 슬러리와 폴리머 단편을 제거하기 위한 세척 후에, 형광 표지된 프로브의 용액을 칩에 혼성화시켰다. 형광 현미경을 사용하여 포착한 이미지는 이러한 방법이 클린 사이 영역과 함께 폴리머 특징부를 생성시킬 수 있음을 나타냈다(도 2b 및 도 2c)
이들 결과는 겔-충진된 웰에서의 형광 세기가 사이 영역으로부터의 신호의 부재와 대조적으로 공간적으로 이산적이었음을 나타냈다. 결과는 또한 겔 패턴화가 나노제작된 웰을 지니는 기판 상의 비-공유 결합된 겔 물질을 사용하여 달성될 수 있음을 입증하였다.
실시예 II
겔-함유 나노웰을 지니는 기판의 제작
겔 물질로 후속적으로 로딩될 수 있는 구조화된 어레이를 제작하기 위해서 여러 기술이 이용될 수 있다.
공정은 블랭크 기판/웨이퍼로 시작될 수 있으며, 패턴이 마이크로- 또는 나노-제작 기술을 통해서 기판 내로 도입된다. 기판/웨이퍼의 물질은 통상적인 규소, 유리, 플라스틱, COC 또는 구조화될 수 있는 다양한 물질 중 어떠한 물질일 수 있다. 기판에 패턴을 도입하기 위한 예시적인 기술은 포토리소그래피, 나모임프린트 리소그래피, 플라스틱/COC 기반 물질 내로의 구조의 엠보싱 및 내부에 패턴화된 구조를 지니는 마스터 몰드(master mold) 내로의 플라스틱 또는 COC의 사출성형을 포함한다. 포토리소그래피 기반 방법은 전형적으로는, 레티클/포토마스크(reticle/photomask) 상에 존재하는 패턴을 포토레지스트로 전달하는 방사선에 노출된, 스텝퍼(stepper) 또는 마스크 얼라이너(mask aligner)로 패턴화되는 그러한 포토레지스트의 사용을 포함할 것이며, 이어서, 그러한 레지스트는 현상되어 기판의 상부 상에 구조화된 필름(포토레지스트)을 생성시킨다. 구조화된 레지스트는 잠재적으로는 후속 겔 코팅을 위해서 사용될 수 있는 최종 기판이거나, 레지스트 내의 패턴이 후속 공정을 통해서 기판에 전달될 수 있다. 후속 공정 단계는 전형적으로는 반응성 이온 에칭(플라즈마 기반 에칭) 또는 습식 에칭(화학 기반) 공정을 포함할 것이다. 그러한 패턴이 기판에 전달되면, 패턴화된 포토레지스트가 후속적으로 제거되어 후속 겔 코팅을 위한 패턴화된 기판을 생성시킨다. 포토레지스트 하의 크롬 또는 티타늄(금속)과 같은 물질의 희생 필름을 사용하여 먼저 포토레지스트 내의 패턴을 금속 필름에 전달하고, 이어서, 그 필름을 패턴이 기판에 전달되는 하드 마스크로서 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 패턴이 기판에 전달된 후에, 필름은 제거되며, 그에 따라서, 제작 공정에 대한 희생 필름으로 여겨진다. 나노임프린트 리소그래피가 이용되면, 임프린트된 포토레지스트가 희생 물질일 수 있으며, 유사하게 패턴화된 레지스트를 기판에 전달하기 위한 중간 도구로서 사용될 수 있거나, 레지스트의 변형이 사용되어 임프린트된 레지스트가 후속 코팅 단계에 대한 입력물의 역할을 하게 할 수 있다. 다음 패턴화를 보유할 수 있는 레지스트의 예는 졸-겔 기반 물질일 수 있다.
구조화된 기판이 어떻게 제작될 수 있는지에 대한 도해가 도 3에 도시되어 있고 이하 기재되어 있다. 패턴화된 기판의 이미지가 도 3b 및 도 3c에 다양한 확대 수준으로 도시되어 있다.
시퀀싱 기판/흐름셀(sequencing substrate/flowcell) 상의 화학적으로 특이한 겔 패드의 생성은 본 실시예에서 앞서 기재된 나노제작 기술들 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 이어서, 그러한 공정은 임의로 실란을 통한 기판에 대한 겔 폴리머의 후속 연결을 가능하게 하는 실란화와 같은 하나 이상의 화학적 처리 단계를 포함할 수 있다. 이어서, 화학적/기계적 폴리싱(CMP)이 이용되어 기판의 표면 상의 모든 사이 폴리머를 제거한다. 폴리싱 공정은 하향식 양상으로 물질을 제거할 것이며, 기판 내의 구조화된 특징부가 어레이의 사이 영역의 평탄부로부터 효과적으로 오프셋되어 있기 때문에, 폴리싱은 구조화된 특징부를 제거하기 전에 사이 영역으로부터 폴리머를 제거할 것이다. 폴리싱 공정이 최적의 시간 후에 중단되면, 구조부는 폴리머 코팅을 보유할 것이고, 사이 영역은 폴리어가 없을 것이다. 이어서, 패턴화된 겔 패드 기판이 프라이머로 그라프팅되고, 표적 핵산이 겔 패드에 씨딩되고, 표적 핵산이 겔 패드에서의 핵산 클러스터의 생성을 위한 주형으로서 사용된다.
실시예 III
PAZAM으로 코팅된 다중웰 기판
본 실시예는 겔-함유 웰의 어레이의 제작, 그러한 웰 내의 핵산 클러스터의 증폭 및 그러한 클러스터 내의 핵산의 시퀀싱을 나타내고 있다.
기판을 다음과 같이 제작하였다. 나노임트린트 리소그래피를 이용하여 나노웰 기판(400 nm 직경, 1.5㎛ 피치, 300 nm 깊이 웰)을 제작하였다. 아미노 실란APTES 또는 APTMS) 나노층/멀티층을 화학 기상 증착을 이용하여 기판의 전체 표면 상에 증착시켰다. 다음으로, 100mM 농도의 아크릴산 N-하이드록시석신이미드 에스테르(Aldrich PN 8060)의 1 x 포스페이트 완충된 염수(pH 7.4) 용액이, 1 ml의 NHS 아크릴레이트 용액을 표면에 첨가하고, 이를 얇은 유리 커버슬립(coverslip)으로 덮고, 실온에서 1 시간 동안 반응이 진행되게 함으로써, 아미노 실란 표면과 반응되었다. 이어서, 폴리머(PAZAM)를, 물 중의 500 ㎕의 2 중량% PAZAM 용액을 새롭게 형성된 아크릴아미드 작용성화된 표면 상에 스핀 코팅함으로써, 표면에 적용하였다. PAZAM은 본원에서 참조로 포함되는 미국 가특허출원 일련번호 제61/753,833호에 기재된 바와 같이 합성되었다. 60℃에서 1 시간 동안의 PAZAM-코팅된 기판의 후속 가열은 폴리머와 기판 사이의 공유 결합을 생성시켰다. 사이 영역의 공유 결합된 폴리머는 물중의 10 중량%의 3㎛ SiO2 마이크로 입자 슬러리로 표면을 폴리싱함으로써 제거되었다. 제인웨이(Janeway) 표면(MeCN 중의 DIPEA와 함께 아크릴로일 클로라이드)이 상기 과정에서의 아미노 실란 코팅된 표면 대신에 사용될 수 있다.
이어서, 패턴화된 폴리머 기판은 본원에서 참조로 포함되는 미국 가특허출원 일련번호 제61/753,833호에 기재된 바와 같이 프라이머로 그라프팅되었다. 다음으로, 그라프팅된 프라이머의 염료-표지된(Cy5) 역 상보체가 20 μM 상보체 농도의 1X PBS 완충 용액 중의 표면에 노출되고, 이어서, 표면이 분사 병으로 적용된 50ml의 1PBS 완충액으로 세척되었다. 기판 상의 표지된 상보체가 Cy5 스캔 채널(Cy5 scan channel)로 설정되고 450의 PMT 설정을 이용하는 FLA 9500Typhoon Imager에 의해서 이미지화되었다. 기판 상의 표지된 상보체가 또한 고해상 현미경에 의해서 이미지화되어서, 사이 폴리머/프라이머 보유 없이 패턴화 또는 폴리머/프라이머를 보여주고 있다(도 4). 이어서, 기판은 phiX DNA로 씨딩되고, 클러스터가 본원에서 참조로 포함되는 미국 가특허출원 일련번호 제61/715,478호에 기재된 바와 같이 성장하였다.
클러스터-함유 기판을 함유하는 흐름 셀은 HiSeq 2000(Illumina, Inc., San Diego, CA) 상에서 시퀀싱되었다. 패턴화된 시퀀싱 클러스터의 위치를 추출하기 위한 알고리즘(rigid registration: 강체 정합)을 이용하여 고품질의 시퀀싱 매트릭스를 성공적으로 생성시켰다(도 5 및 도 6). 시퀀싱 결과는 점유율(occupancy) 대 클론형성율이 표준 프와송 분포(standard Poisson distribution)에 대해서 예상되는 것에 비해서 놀랍게 더 높았음을 나타냈다. 특히, 도 7에 "x"로 나타낸 바와 같이, 시퀀싱 작업에 대한 평균 점유율 대 클론형성율 측정치가 프와송 곡선의 경계 위에 있으며, 이상적인 클론 분율에 대한 라인에 매우 접근되어 있다.
본원 전체에 걸쳐서, 다양한 공보, 특허, 또는 특허 출원이 참조되어 있다. 이들 공보의 개시내용의 전체가 본 발명이 속하는 본 기술 분야를 더욱 완전히 기재하기 위해서 본원에서 참조로 포함된다.
용어 "포함하는"은 본원에서 열거된 구성요소뿐만 아니라, 어떠한 추가의 구성요소를 추가로 포함하는 개방형인 것으로 의도된다.
비록, 본 발명이 상기 제공된 예를 참조로 하여 기재되어 있지만, 다양한 변화가 본 발명을 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명은 청구범위에 의해서만 제한된다.

Claims (96)

  1. 겔 물질을 함유하는 복수의 웰(well)들을 포함한 표면을 포함하는 고형 지지체 및 상기 겔 물질 내에 있는 표적 핵산의 라이브러리(library)를 포함하는 어레이(array)로서, 상기 웰들이 표면 상의 사이 영역(interstitial region)에 의해서 서로 분리되어 있고, 상기 사이 영역이 웰들 각각에서의 겔 물질을 복수의 다른 웰들 내의 겔 물질로부터 격리시키고, 웰들 각각에서의 겔 물질이 라이브러리의 표적 핵산의 명확한 단일 종을 포함하고 있는 어레이.
  2. 제 1항에 있어서, 웰들의 각각의 체적이 최대 1000 ㎛3인 어레이.
  3. 제 1항에 있어서, 웰들의 각각에 있는 겔의 체적이 최대 1000 ㎛3인 어레이.
  4. 제 1항에 있어서, 웰들의 각각이 최대 100 ㎛2인 표면에서의 개구를 포함하는 어레이.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 웰들이 반복 패턴을 지닌 어레이를 형성하는 어레이.
  6. 제 5항에 있어서, 패턴에서의 웰들이 5 마이크로미터 이하의 피치(pitch)를지니는 어레이.
  7. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 웰들이 부작위 패턴을 지닌 어레이를 형성하는 어레이.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 겔이 하이드로겔을 포함하는 어레이.
  9. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 겔이 SFA 또는 PAZAM을 포함하는 어레이.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 웰들 각각에서의 겔 물질이 라이브러리 내의 표적 핵산의 단일 종을 포함하는 어레이.
  11. 제 10항에 있어서, 단일 종의 복수 카피가 웰들 각각에서 핵산 분자의 클론 집단을 형성하는 어레이.
  12. 제 10항에 있어서, 단일 종의 복수 카피가 핵산 분자에 콘카테머 반복부로서 존재하는 어레이.
  13. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 종이 단일의 핵산 분자 이하로서 웰들 각각에 존재하는 어레이.
  14. 제 13항에 있어서, 단일 핵산 분자가 두 개의 상보성 가닥을 포함하는 어레이.
  15. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 표면이 mm2당 1,000 개 이상의 웰 밀도를 포함하는 어레이.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 겔 물질이 웰의 표면에 공유결합되는 어레이.
  17. (a) 평탄 표면을 포함하는 고형 지지체를 제공하는 단계로서, 상기 평탄 표면이 하나 이상의 오목 특징부(concave feature)에 의해서 중단되어 있고 하나 이상의 오목 특징부가 평탄 표면 상의 하나 이상의 사이 영역과 접해있게 하여 고형 지지체를 제공하는 단계;
    (b) 고형 지지체의 일부 또는 전부를 겔 물질로 코팅시키는 단계로서, 상기 일부 또는 전부가 오목 특징부 중 하나 이상 및 사이 영역 중 하나 이상을 포함하게 하여 고형 지지체의 일부 또는 전부를 겔 물질로 코팅시키는 단계; 및
    (c) 하나 이상의 사이 영역으로부터 겔 물질을 제거하고 하나 이상의 오목 특징부 내의 겔 물질을 유지시키기 위해서 평탄 표면을 폴리싱(polishing)하는 단계를 포함하여, 기판을 제조하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 오목 특징부가 사이 영역에 의해서 둘러싸인 웰들을 포함하는 방법.
  19. 제 18항에 있어서, 웰들의 각각의 체적이 최대 1000 ㎛3인 방법.
  20. 제 18항에 있어서, 웰들의 각각에 있는 겔의 체적이 최대 1000 ㎛3인 방법.
  21. 제 18항에 있어서, 웰들의 각각이 최대 100 ㎛2인 표면에서의 개구를 포함하는 방법.
  22. 제 18항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 웰들이 반복 패턴을 지닌 어레이를 형성하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 패턴에서의 웰들이 5 마이크로미터 이하의 피치를 지니는 방법.
  24. 제 18항 내지 제 22항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 웰들이 무작위 패턴을 지니는 어레이를 형성하는 방법.
  25. 제 18항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 표면이 mm2당 1,000 개 이상의 웰 밀도를 포함하는 방법.
  26. 제 17항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 코팅이 고형 지지체를 사전 형성된 겔 물질과 접촉시킴을 포함하는 방법.
  27. 제 17항 내지 제 24항 중 어느 한 항에 있어서, 코팅이 고형 지지체를 겔 물질을 후속적으로 형성하는 액체와 접촉시킴을 포함하는 방법.
  28. 제 17항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 겔 물질이 하이드로겔을 포함하는 방법.
  29. 제 17항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 겔 물질이 SFA 또는 PAZAM을 포함하는 방법.
  30. 제 17항 내지 제 29항 중 어느 한 항에 있어서, 겔 물질이 핵산에 추가로 부착되는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 핵산이 증폭 프라이머를 포함하는 방법.
  32. 제 30항 또는 제 31항에 있어서, 핵산이 주형 핵산을 포함하고, 방법이 오목 특징부 내의 겔 물질 중의 주형 핵산을 증폭시킴을 추가로 포함하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 증폭이 주형 핵산의 복수의 카피를 생성시켜서 핵산 분자들의 클론 집단을 형성시키는 방법.
  34. 제 32항에 있어서, 증폭이 주형 핵산의 복수의 카피를 생성시켜서 핵산 분자들의 콘카테머 반복부를 형성시키는 방법.
  35. 제 18항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 겔 물질을 웰들의 표면에 공유 결합시킴을 추가로 포함하는 방법.
  36. 제 17항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리싱이 비드의 슬러리에 의한 기계적인 연마를 포함하는 방법.
  37. 제 17항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리싱이 고형 지지체의 표면을 와이핑(wiping) 또는 스크래핑(scraping)함에 의한 기계적인 연마를 포함하는 방법.
  38. 제 17항 내지 제 37항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리싱이 화학적 폴리싱을 포함하는 방법.
  39. 제 17항 내지 제 38항 중 어느 한 항에 있어서, 겔 물질이 단백질에 추가로 부착되는 방법.
  40. (a) 겔 물질을 함유하는 복수의 웰들을 포함한 표면을 포함하는 고형 지지체를 제공하는 단계로서, 웰들이 표면 상의 사이 영역에 의해서 서로 분리되고, 사이 영역이 웰들 각각에서의 겔 물질을 복수의 다른 웰들에서의 겔 물질로부터 격리시키도록 하여 고형 지지체를 제공하는 단계;
    (b) 각각의 웰들 내의 겔 물질에 부착된 단일 종의 표적 핵산을 지니는 웰들의 어레이를 생성시키기 위해서 고형 지지체의 웰들에 표적 핵산의 라이브러리를 전달하는 단계로서, 어레이 내의 상이한 웰들이 라이브러리로부터의 상이한 표적 핵산 종을 포함하게 하여, 표적 핵산의 라이브러리를 전달하는 단계; 및
    (c) 어레이의 웰들의 각각에서 개별적인 표적 핵산의 클론 집단을 생성시키기 위해서 어레이의 웰들 내의 겔 물질에 부착된 표적 핵산을 증폭시키는 단계를 포함하여, 어레이를 제조하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 웰들의 각각의 체적이 최대 1000 ㎛3인 방법.
  42. 제 40항에 있어서, 웰들의 각각이 최대 100 ㎛2인 표면에서의 개구를 포함하는 방법.
  43. 제 40항에 있어서, 복수의 웰들이 표면 상에서 반복 패턴을 형성하는 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 패턴에서의 웰들이 5 마이크로미터 이하의 피치를 지니는 방법.
  45. 제 40항에 있어서, 복수의 웰들이 표면 상에서 무작위 패턴을 형성하는 방법.
  46. 제 40항에 있어서, 겔이 하이드로겔을 포함하는 방법.
  47. 제 40항에 있어서, 겔이 SFA 또는 PAZAM을 포함하는 방법.
  48. 제 40항에 있어서, 표면이 mm2당 1,000 개 이상의 웰 밀도를 포함하는 방법.
  49. 제 40항에 있어서, 겔 물질이 웰들의 표면에 공유 결합되는 방법.
  50. 제 40항 내지 제 49항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(a)에서의 고형 지지체의 제공이
    (i) 표면 상의 사이 영역에 의해서 서로 분리되는 복수의 웰들을 포함한 평탄 표면을 포함하는 고형 지지체를 제공하고,
    (ii) 웰들과 사이 영역을 겔 물질로 코팅하고,
    (iii) 하나 이상의 사이 영역로부터 겔 물질을 제거하고 웰들 내의 겔 물질을 유지시키기 위해서 평탄 표면을 폴리싱함을 포함하는 방법.
  51. 제 50항에 있어서, 코팅이 고형 지지체를 사전 형성된 겔 물질과 접촉시킴을 포함하는 방법.
  52. 제 50항 또는 제 51항에 있어서, 코팅이 고형 지지체를 후속적으로 겔 물질을 형성하는 액체와 접촉시킴을 포함하는 방법.
  53. 제 50항 내지 제 52항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리싱이 비드의 슬러리에 의한 기계적인 연마를 포함하는 방법.
  54. 제 50항 내지 제 53항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리싱이 고형 지지체의 표면을 와이핑 또는 스크래핑함에 의한 기계적인 연마를 포함하는 방법.
  55. 제 50항 내지 제 54항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리싱이 화학적 폴리싱을 포함하는 방법.
  56. 제 40항 내지 제 55항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(b)가 단계(c) 전에 발생하는 방법.
  57. 제 40항 내지 제 55항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(b)와 단계(c)가 동시에 발생하는 방법.
  58. 제 40항 내지 제 57항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(b)에서의 전달이 유체 내의 표적 핵산의 혼합물로서 라이브러리를 제공하고 유체를 고형 지지체와 접촉시켜서 표적 핵산이 웰들과 사이 영역에 유동적으로 접근하게 함을 포함하는 방법.
  59. 제 40항 내지 제 58항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭이 고형상 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR), 다중 변위 증폭(multiple displacement amplification: MDA), 또는 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification: RCA)을 포함하는 방법.
  60. 제 59항에 있어서, 증폭이 웰들 내의 겔 물질에 부착되는 하나 이상의 프라이머 종의 중합효소 신장(polymerase extension)을 포함하는 방법.
  61. 제 40항 내지 제 58항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭이 웰들 내의 겔 물질에 부착되는 둘 이상의 프라이머 종을 사용하는 브릿지 증폭(bridge amplification)을 포함하는 방법.
  62. 제 40항 내지 제 61항 중 어느 한 항에 있어서, 클론 집단 각각이 라이브러리로부터의 표적 핵산의 1000 이상의 카피를 포함하는 방법.
  63. (a) 표면과 핵산의 라이브러리를 포함하는 고형 지지체를 제공하는 단계로서, 표면이 복수의 웰들을 지니고, 웰들이 겔 물질을 함유하고, 웰들이 표면 상의 사이 영역에 의해서 서로 분리되고, 사이 영역이 웰들 각각에서의 겔 물질을 복수의 다른 웰들에서의 겔 물질로부터 격리시키고, 라이브러리의 표적 핵산의 단일 종이 웰들의 각각 내의 겔 물질에 부착되게 하여 고형 지지체를 제공하는 단계;
    (b) 고형 지지체를 표적 핵산에 결합하는 하나 이상의 프로브와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 하나 이상의 프로브에 결합하는 표적 핵산 종을 지니는 웰들을 구분하기 위해서 고형 지지체를 검출하는 단계를 포함하여, 핵산을 검출하는 방법.
  64. 제 63항에 있어서, 웰들의 각각에서의 겔의 체적이 최대 1000 ㎛3인 방법.
  65. 제 63항에 있어서, 웰들의 각각이 최대 100 ㎛2인 표면에서의 개구를 포함하는 방법.
  66. 제 63항에 있어서, 복수의 웰들이 표면 상에서 반복 패턴을 형성하는 방법.
  67. 제 66항에 있어서, 패턴에서의 웰들이 5 마이크로미터 이하의 피치를 지니는 방법.
  68. 제 63항에 있어서, 복수의 웰들이 표면 상에서 무작위 패턴을 형성하는 방법.
  69. 제 63항에 있어서, 겔이 하이드로겔을 포함하는 방법.
  70. 제 63항에 있어서, 겔이 SFA 또는 PAZAM을 포함하는 방법.
  71. 제 63항에 있어서, 표면이 mm2당 1,000 개 이상의 웰 밀도를 포함하는 방법.
  72. 제 63항에 있어서, 겔 물질이 웰들의 표면에 공유 결합되는 방법.
  73. 제 63항 내지 제 72항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(a)에서의 고형 지지체의 제공이
    (i) 표면 상의 사이 영역에 의해서 서로 분리되는 복수의 웰들을 포함한 평탄 표면을 포함하는 고형 지지체를 제공하고,
    (ii) 웰들과 사이 영역을 겔 물질로 코팅하고,
    (iii) 하나 이상의 사이 영역로부터 겔 물질을 제거하고 웰들 내의 겔 물질을 유지시키기 위해서 평탄 표면을 폴리싱함을 포함하는 방법.
  74. 제 73항에 있어서, 코팅이 고형 지지체를 사전 형성된 겔 물질과 접촉시킴을 포함하는 방법.
  75. 제 73항 또는 제 74항에 있어서, 코팅이 고형 지지체를 후속적으로 겔 물질을 형성하는 액체와 접촉시킴을 포함하는 방법.
  76. 제 73항 내지 제 75항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리싱이 비드의 슬러리에 의한 기계적인 연마를 포함하는 방법.
  77. 제 73항 내지 제 76항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리싱이 고형 지지체의 표면을 와이핑 또는 스크래핑함에 의한 기계적인 연마를 포함하는 방법.
  78. 제 73항 내지 제 77항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리싱이 화학적 폴리싱을 포함하는 방법.
  79. 제 73항 내지 제 77항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(a)에서의 제공이
    (iv) 라이브러리의 표적 핵산의 단일 종을 각각의 웰들 내의 겔 물질에 부착시키기 위한 조건하에 표적 핵산의 라이브러리를 고형 지지체의 웰들에 전달하는 단계; 및
    (v) 웰들의 어레이 내의 겔 물질에 부착된 표적 핵산을 증폭시켜서 어레이의 웰들 각각에서의 개별적인 표적 핵산의 클론 집단을 생성시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  80. 제 79항에 있어서, 단계(iv)가 단계(v) 전에 발생하는 방법.
  81. 제 79항에 있어서, 단계(iv)와 단계(v)가 동시에 발생하는 방법.
  82. 제 79항 내지 제 81항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(iv)에서의 전달이 유체 내의 표적 핵산의 혼합물로서 라이브러리를 제공하고 유체를 고형 지지체와 접촉시켜서 표적 핵산이 웰들과 사이 영역에 유동적으로 접근하게 함을 포함하는 방법.
  83. 제 79항 내지 제 82항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭이 고형상 중합효소 연쇄 반응(PCR), 다중 변위 증폭(MDA), 또는 롤링 서클 증폭(RCA)을 포함하는 방법.
  84. 제 83항에 있어서, 증폭이 웰들 내의 겔 물질에 부착되는 하나 이상의 프라이머 종을 사용하는 방법.
  85. 제 79항 내지 제 82항 중 어느 한 항에 있어서, 증폭이 웰들 내의 겔 물질에 부착되는 둘 이상의 프라이머 종을 사용하는 브릿지 증폭을 포함하는 방법.
  86. 제 79항 내지 제 85항 중 어느 한 항에 있어서, 클론 집단 각각이 라이브러리로부터의 표적 핵산의 1000 이상의 카피를 포함하는 방법.
  87. 제 63항 내지 제 86항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 프로브가 표적 핵산 중 하나 이상의 일부 또는 전부에 상보적인 하나 이상의 핵산을 포함하는 방법.
  88. 제 87항에 있어서, 하나 이상의 프로브가 단계(c)에서 검출되는 형광 표지를 포함하는 방법.
  89. 제 87항에 있어서, 하나 이상의 프로브가 중합효소 및 누클레오티드를 추가로 포함하는 방법.
  90. 제 89항에 있어서, 단계(c)에서의 검출이 프로브 내로의 또는 표적 핵산 내로의 누클레오티드의 통합을 검출함을 포함하는 방법.
  91. 제 89항에 있어서, 단계(c)에서의 검출이 합성 절차에 의한 시퀀싱을 포함하는 방법.
  92. 제 63항 내지 제 91항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(b)와 단계(c)가 시퀀싱 과정에서 여러회 반복되는 방법.
  93. 제 63항 내지 제 91항 중 어느 한 항에 있어서, 프로브가 핵산 결합 단백질을 포함하는 방법.
  94. 제 63항 내지 제 93항 중 어느 한 항에 있어서, 검출이 광학적 검출, 전기 검출 및 열적 검출로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  95. 제 94항에 있어서, 광학 검출이 형광, 발광, 화학발광, 흡광도, 및 형광 공명 에너지 전이로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  96. (a) 평탄 표면을 포함하는 고형 지지체를 제공하는 단계로서, 상기 평탄 표면이 하나 이상의 오목 특징부에 의해서 중단되고, 오목 특징부가 겔 물질을 함유하고, 하나 이상의 오목 특징부가 평탄 표면상의 하나 이상의 사이 영역과 경계를 이루고 있고, 사이 영역이 실질적으로 겔 물질을 함유하지 않고, 겔 물질이 표적 분석물을 포함하게 하여 고형 지지체를 제공하는 단계:
    (b) 표적 분석물이 프로브와 특별히 상호작용하는 조건하에 고형 지지체를 프로브와 접촉시키는 단계; 및
    (c) 프로브 중 하나 이상과 상호작용하는 표적 분석물의 적어도 서브셋(subset)을 구분하기 위해서 고형 지지체를 검출하는 단계를 포함하여, 분석물을 검출하는 방법.
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