JP2001517948A

JP2001517948A - 核酸配列決定法

Info

Publication number: JP2001517948A
Application number: JP54130998A
Authority: JP
Inventors: エリック、エイチ．カワシマ; ローラン、ファリネリ; パスカル、メイエ
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1997-04-01
Filing date: 1998-04-01
Publication date: 2001-10-09
Also published as: EP0975802A1; EP1498494A3; ATE269908T1; EP1498494A2; WO1998044152A1; US20020055100A1; DE69824716D1; AU6846798A; EP0975802B1

Abstract

(57)【要約】異なるロケーションにある異なる核酸分子を、同時並行して配列決定することができる。核酸分子にアニーリングしたプライマーを提供することができる。次に、それぞれのロケーションは、核酸ポリメラーゼおよびヌクレオチドを備えることができる。ついで、ヌクレオチドがプライマー伸張に用いられたかどうかを決定することができ、この工程を繰返すことができる。プライマーを用いる代替法として、二本鎖核酸分子のニックが３’−ＯＨ基を提供し、鎖伸張を行うことができる。

Description

【発明の詳細な説明】核酸配列決定法本発明は、核酸配列決定に関する。核酸配列決定法は、長年にわたって知られている。最善の既知の方法の２つは、Sangerの「ジデオキシ」法およびMaxam-Gilbert法である。 Sangerのジデオキシ法は、チェインターミネーターとしてジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを用いることによっている。ＤＮＡポリメラーゼを用いてプライマーを伸張して、標的分子の配列の少なくとも一部に相補的なＤＮＡ配列を合成する。プライマー伸張反応は、４種類の異なるバッチであって、それぞれのバッチが放射性デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートとデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの１個のジデオキシ類似体を含むもので行う。ジデオキシ類似体は、各バッチにおける異なるデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの類似体である。類似体が取込まれてしまうと、それ以上プライマー伸張は起きず、形成した鎖長は固定される。次に、４種類のバッチのそれぞれで形成した異なる長さの鎖を、（４種類の異なるバッチに相当する）ゲルの４種類の異なるレーンのそれぞれにおいてサイズ分別する。これにより、配列をオートラジオグラフから読取ることができる。 Sangerジデオキシ法とは対照的に,Maxam-Gilbert法は、標識したＤＮＡの化学開裂によるものである。この場合には、数本の同一ＤＮＡ鎖をそれぞれ一端において放射性標識で標識する。次に、鎖を４種類の異なる基に開裂させる。これらの基を、各基について異なる特定の反応条件に置く。反応条件は、特定の塩基が存在する場所の鎖当たり平均して約１個の化学開裂反応を引起すように選択される。次に、４種類の基の開裂生成物を、（４種類の異なる塩基のそれぞれにおける開裂に相当する）ゲルの４種類の異なるレーンでサイズ分別する。オートラジオグラフィーを用いてゲルを読取ることによって、元のＤＮＡで塩基が表れる順序を決定することができる。これらの方法は広汎に用いられてきたが、時間がかかるゲルからの配列決定に依存しているので、多くの異なる試料を同時並行して配列決定するためのものではない。従って、ゲルを用いる必要がない他の方法が同時並行配列決定を目的として設計されてきた。ＷＯ９６／１２０３９号明細書(Lynx Therapeutics，Inc.)には、標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の決定法が開示されている。標的ポリヌクレオチドをカバーする複数の断片を標的ポリヌクレオチドから生成させ、タグのレパトアからのオリゴヌクレオチドタグを複数の断片のそれぞれに付着させ、実質的に総ての同じ断片は同じオリゴヌクレオチドタグを付着し、実質的に総ての異なる断片は異なるオリゴヌクレオチドタグを付着し、オリゴヌクレオチドタグは長さが１０〜２０ヌクレオチドの範囲の長さを有する天然ヌクレオチドモノマーのオリゴヌクレオチド、または複数のサブユニットを含んでなり、複数のサブユニットのそれぞれが３〜６個のヌクレオチドの長さを有する天然ヌクレオチドモノマーのオリゴヌクレオチドからなり、サブユニットが最小限のクロス−ハイブリダイジングセットから選択されるようにし、オリゴヌクレオチドタグをそれぞれのタグ補体で特異的にハイブリダイズすることによって断片をソートし、複数の断片のそれぞれの部分のヌクレオチド配列を決定し、断片の配列を照合することによって標的ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定する工程を含んでなる。ＷＯ９６／１２０３９号明細書に開示されている方法の１態様では、断片のヌクレオチド配列を決定する工程は単一塩基配列決定法によって複数の断片について同時に行われる。適当な単一塩基配列決定法は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／０３６７８号明細書(ＷＯ９５／２７０８０−Lynx Therapeutics，Inc.として公表)に開示されている方法であるといわれている。この方法は、プローブをポリヌクレオチドの末端に連結し、プローブはヌクレアーゼ認識部位を有し、ポリヌクレオチドの末端の１個以上のヌクレオチドを同定し、ポリヌクレオチドをプローブのヌクレアーゼ認識部位を認識するヌクレアーゼで開裂してポリヌクレオチド１個以上のヌクレオチドだけ短縮するようにする工程を含んでなる。ＷＯ９６／１２０１４(Lynx Therapeutics，Inc.）号明細書にも、ＷＯ９６／１２０３９号明細書に記載されている分子タギングシステムが記載されている。しかしながら、この明細書では、シークエンス法の他に様々な用途が検討されている。ＷＯ９３／２１３４０号明細書（The Medical Research Council）には、シークエンス法が開示されている。この方法は、配列決定を行う核酸を含んでなる一本鎖鋳型を形成し、プライマーを鋳型にハイブリダイズして鋳型／プライマー複合体を形成し、単一標識ヌクレオチドの付加によってプライマーを伸張し、プライマーに付加した標識ヌクレオチドの型を決定し、標識を除去または中和し、上記２工程を順次繰返して、標識ヌクレオチドの組込みの順序を記録する工程を含んでなる。この方法は、多数の鋳型を同時に配列決定する自動化手続きで用いるのに適しているといわれる。ＤＥ−Ａ−４１４１１７８号明細書(EMBL)には、ＷＯ９３／２１３４０号明細書に開示されているのと同様な方法が開示されている。これも、数種類の核酸の同時配列決定に適するといわれている。この方法は、鋳型として用いられる少なくとも部分的に一本鎖核酸を配列決定のためのものであり、標識形態での４種類のヌクレオチドと共に適当なポリメラーゼを用いる。プライマーまたは二本鎖核酸断片から出発し、相補鎖を標識ヌクレオチドを用いて段階的に合成する。この方法は、プライマーを備えたまたは部分的に二本鎖である核酸を、ポリメラーゼ、４種類の標識ヌクレオチドの１個、および連鎖重合で、鋳型鎖の次に利用可能なヌクレオチドが標識ヌクレオチドに相補的である場合に標識ヌクレオチドを成長する相補鎖に組込むのに必要な他の物質からなるインキュベーション混合物とインキュベーションし、前工程において１個のヌクレオチドだけ伸張することができた核酸鎖を分離して、既知の方法で１回以上の洗浄を行い、ヌクレオチドがその標識によって組込まれたかどうかを決定し、ヌクレオチドが良好に組込まれた場合には、標識を除去する工程を含んでいる。前記工程は４種類総てのヌクレオチドについて循環的に行われる。上記の説明から、数種類の同時配列決定法が知られていることを理解されるであろう。しかしながら、既知の同時配列決定法は所定時間で配列決定することができる試料数を著しく増加したが、試料の処理量を更に一層高める必要がある。多くのグループが、極めて多数の核酸分子試料および完全なゲノム（例えば、ヒトゲノム配列決定プロジェクトにおけるような）の配列決定を試みている。しかしながら、彼らは、利用可能なシークエンス法の効率によって制限を受けている。更に、ほとんどの現在用いられている同時配列決定法は費用がかかり、多数の試薬を用いる必要がありおよび／または多くの工程段階を必要とすることが多い。多数の様々な試薬が存在しかつ多数の工程段階を用いることは、配列決定の過誤を生じることがあるという点で不利である。本発明は、既知の同時配列決定法の欠点の１個以上を軽減することを目的としている。本発明によれば、核酸分子の配列決定法であって、ａ）第一のロケーションに、互いに同じ配列を有し、かつヌクレオチドと核酸ポリメラーゼの存在下でプライマー伸張を行うことができるやり方でプライマーにハイブリダイズしている複数の一本鎖核酸分子を提供し、ｂ）第一のロケーションとは異なる第二のロケーションに、互いに同じ配列を有するが、第一のロケーションの一本鎖核酸分子の配列とは異なる配列を有し、かつまたヌクレオチドと核酸ポリメラーゼの存在下でプライマー伸張を行うことができるやり方でプライマーにハイブリダイズしている複数の一本鎖核酸分子を提供し、ｃ）相補的塩基または複数の相補的塩基が一本鎖核酸分子中の適当な位置に存在するとき、各ロケーションが、プライマーを伸張することができる条件下で核酸ポリメラーゼおよび所定の標識ヌクレオチドを備え、ｄ）上記標識ヌクレオチドが各ロケーションでのプライマー伸張に用いられたかどうかを、上記ヌクレオチド上に存在する標識が伸張プライマーに取込まれたかどうかを決定することによって検出し、ｅ）工程ｃ）およびｄ）を１回以上繰返して、複数の標識を含んでなる伸張したプライマーが提供されるようにする工程を含んでなる、方法が提供される。異なる鋳型分子を異なるロケーションに提供することによって、本発明は様々な核酸分子の配列決定を平行して行うことができる。本発明は、標識ヌクレオチドをプライマー伸張により核酸分子に段階的に組込むことができる。しかしながら、分子中に１個の標識ヌクレオチドが含まれていることは、他の標識ヌクレオチド（たとえ、隣接標識ヌクレオチドが同じであっても）の検出を妨げない。従って、ＷＯ９３／２１３４０号明細書およびＤＥ− Ａ−４１４１１７８号明細書に開示されている方法などの多くの従来技術分野における平行配列決定法とは異なり、標識ヌクレオチドを更に付加する前にポリヌクレオチド鎖から標識を除去する必要はない(幾つかの態様では、標識を定期的に除去するのが望ましいことがあるが)。従って、複数の標識をプライマー伸張を介して核酸分子に組込み、in situで検出することができる。更に、後で更に詳しく説明するように、一態様では、本発明は隣接した同一塩基の１個以上のストレッチ（ポリＡ、ポリＴ、ポリＣ、ポリＵ、またはポリＧストレッチ）を含んでなる核酸鎖の配列決定に特に有利である。これは、これらの鎖を配列決定するのに必要な工程数をかなり減少させることができるからである。本発明は、ＷＯ９６／１２０１４号明細書およびＷＯ９６／１２０３９号明細書に開示されている方法のようなヌクレオチド配列の決定に様々なオリゴヌクレオチドタグを多数用いることに依存する従来技術の方法と比較しても有利である。これらの方法は、一般に時間がかかりまた特異的なタグを供給する必要がある。それらはまた、制限酵素消化または検出工程の後にタグまたはその部分を除去する他の手段を用いることもある。本発明は、これらの欠点を被らないものである。様々な従来技術による方法と比較して本発明のもう一つの利点は、単一ロケーションに存在する複数の同一核酸分子に標識を直接組込むことができるため、高感度を得ることができる点である。後述するように、標識ヌクレオチド（例えば、傾向標識ヌクレオチド）の組込みおよび感受性のある低温ＣＣＤカメラによる検出により、シャープなシグナルを生成し、in situで検出することができる。ＣＣＤカメラは、倒立顕微鏡上に設けるのが好ましい。本発明の方法の工程ａ）およびｂ）においてプライマーにハイブリダイズする一本鎖分子は、本明細書では「鋳型」と呼ばれる。これらは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子であることがある。それらは、天然に存在するおよび／または天然に存在しないヌクレオチドを含んでなることがある。鋳型は表面上に固定されるのが好ましく、すなわちそれらは、本発明を行うことができるのに十分な時間共有または非共有的相互作用によって表面上の所定位置に保持される。それらは、直接または間接的に表面に結合することができる。配列決定は、完全であることがあり、または部分的であることがある。鋳型に相補的な鎖またはその部分の配列を、最初に得ることができる。しかしながら、この配列は（塩基対則を用いて）転換して、鋳型またはその部分の配列を提供することができる。この転換は、コンピューターによりまたは人手により行うことができる。これは、プライマー伸張の各工程の後にまたは後の工程で行うことができる。本発明の方法は、標識ヌクレオチドが（後述のように、洗浄工程を介する）プライマー伸張によって組込まれない場合には、第一および第二のロケーションから標識ヌクレオチドを除去する工程を含むのが望ましい。鋳型を固定することによって、組込まれていない標識ヌクレオチドは、鋳型を所定位置に保持したまま鋳型のロケーションから除去することができる。核酸分子を固定するため、任意の適当な表面を提供することができる。「支持体」という用語は、本明細書ではこのような表面を有する材料を記載するのに用いられる。支持体は、固形材料または半固形材料（例えば、ゲルまたは脂質性単層／二層）であるのが好ましい。核酸を表面に結合するための様々なプロトコールが知られている。例えば、それらは、ガラスまたはポリマー支持体の表面に共有結合させることができる(Joo s，B.，Kuster，H.，and Cone，R．(1997)の「ガラス支持体へのハイブリダイゼーション可能なオリゴヌクレオチドの共有付着」という標題の文献，Analytical Biochemistry，247，96-101;Oroskar AA，Rasmussen SE，Rasmussen HN，Rasmus sen SR，Sullivan BM，Johansson A，（1996 ）「Ｅｌｉｓａ様手法による固定アンプリコンの検出」という標題の文献，Clinical Chemistry，42(9):1547-1555;K handjian EWの「ナイロン膜へのＲＮＡのＵＶ架橋はハイブリダイゼーションシグナルを増大する」という標題の文献，Molecular Biology Reports，11(2):107 -15，1986を参照されたい)。核酸分子は、非共有結合によって支持体に固定することもできる。非共有結合は、例えばビオチン化核酸と（ストレプト）アビジンをコーティングした表面との相互作用によってまたは疎水性鎖の脂質単層または二層への固定によって行うことができる。実際に、この方法の各種工程を行うことができる表面と核酸分子との任意の相互作用を、結合に用いることができる。例えば、鋳型分子を、単に既に表面に結合しているプライマーとの塩基対形成によって表面に結合させることができる。好ましい態様では、鋳型分子を固定する単一表面を設ける。余り好ましくない態様では、それぞれがそれ自身の表面を有する個別単位を設けることができる。例えば、回転楕円体（例えば、ガラスビーズ／別のポリマー材料から形成したビーズ）を設けることができる。あるいは、他の三次元単位を設けることができる。個別単位は、磁性や、例えば洗浄工程中にこれらの単位の他の成分からの分離を容易にする他の特性を有することができる。（磁性ビーズは、Dynabeads^TM M- 280，Dynal A.S.，オスロー，ノルウェーから得ることができる。それらはHultm an，T.，Bergh，S.，Moks，T.，Uhlen，M.,「in vitroで増幅したプラスミドＤＮＡの二方向性固層シークエンス法」，BioTechniques，10:84-93，1991に記載の方法で用いることができる。）異なる単位は、異なる特性を有し、様々な範疇の単位に容易に分離することができる(例えば、１つの型のプライマーを所定の特性を有する単位に結合させ、別の型のプライマーを異なる特性を有するまたは少なくとも所定の特性を持たない単位に結合させることができる)。平坦な表面を（例えば、膜であるかまたはガラススライドである支持体によって）提供するのが望ましい。高密度の固定化鋳型分子および／またはプライマーを提供するのが好ましい。高密度を小さな面積に提供するのが望ましい。これは、ロボット工学系を用いて行うことができる。このような圧電送達系または他の送達系に依存し、少量（例えば、ナノリットルまたはピコリットル）の材料を小面積に送達することかできる。小面積は、配列（規則的または不規則的であることがある）の形態であることがある。送達装置の作業を制御することによって、様々な型の配列を提供することができる。余り好ましくない態様では、配列は、鋳型および／またはプライマー分子が表面に結合した後に行うことができる。このような場合には、分子を（例えば、上記したような）支持体の個別単位に固定した後、配列を行うことができる。従って、それぞれの単位は、固定化核酸が存在する表面を有することができる。同じ初期鋳型分子のコピーを多数、所定のロケーションに設けるのが望ましい。例えば、１０，０００個を上回る分子を設けることができる。ロケーションは、（好ましくは平坦な）単一の明確な範囲の形態をしていることができる。好ましくは、この範囲は、最大寸法に対して測定したときに、長さが１００ｎｍ〜２ｃｍであり、更に好ましくは５００ｎｍ〜５ｍｍである。通常は円形のペリメーターによって画定された範囲の場合には、この測定は、円の直径となる。余り好ましくはないが、ロケーションは、容器またはその部分の内容物（例えば、試験管またはマイクロプレートウェル中の鋳型に結合したビーズ）を含んでなることができる。前節に記載した特徴の１個以上を有する複数の(２個以上の)ロケーションが、一般に提供される。多数の鋳型分子をロケーションに設ける場合には、これにより提供される配列データーの信頼性を高めることができる。これは、混入物の存在によって提供される過誤読み取りの確率を最小限にすることができるからである。好ましい態様では、配列決定は、高感度検出法を用いる場合には、少数の鋳型分子上で行うことができる。蛍光標識分子を検出することができる高感度検出法は、例えば、ａ）低温チャージ・カップルド・デバイス（Charge Coupled Device(ＣＣＤ) ）カメラ(例えば、Princeton Instruments)、ｂ）共焦点顕微鏡(例えば、Carl Zeiss Jena)、またはｃ）高速度ＤＮＡシークエンス法：単一分子の蛍光検出に基づいた方法（Jour nal of Biomolecular Structure & Dynamics，7:301-309，Jett，J.H.，Keller ，R.A.，Martin，J.C.，Marrone，B.I.，Moyzis，R.K.，Ratliff，R.L.，Seitzi nger，N.K.，Brooks Shera，E.，Stewart，C.C．(1989)）を用いることができる。異なるロケーションに供給された鋳型分子は、異なる供給源からの核酸分子であることができる。これらは、その長さに沿って１個以上の同一／相同配列を有することもまたは持たないこともある。例えば、異なる生物から同様な試料が提供されるときには(例えば、関連生物からの同様な遺伝子領域)、異なる鋳型分子はそれらの長さの全部／一部に亙り同一／相同配列を有することができる。あるいは、同一生物からの異なる試料（例えば、異なる種類の細胞、組織または器官からの試料）を提供することもできる。本発明の主要な利点の一つは、配列を、全部または一部でも、複数の異なるロケーションから同時かつ効率的に読取ることができることである。（本発明は、上記の第一および第二のロケーションだけに適用を限定されない。）例えば、１０を上回る、１００を上回る、１０００を上回る、または１，０００，０００を上回る異なるロケーションを提供することができる。従って、多数の異なる配列を、比較的短時間で決定することができる。所望ならば、それぞれの型の鋳型分子を、複数の異なるロケーションに（好ましくは、各ロケーションで増幅形で）提供し、豊富な配列データーを生成させることができる。この豊富な量により制御を行い、生成する配列データーの(accur acy)をチェックすることができる。オリゴヌクレオチドが、本発明で用いるのに適したプライマーとして好ましい。これらは、長さが典型的には６〜６０、例えば１５〜２５ヌクレオチドである核酸分子である。それらは、天然に存在するおよび／または天然に存在しないヌクレオチドを含んでなることがある。所望ならば、長めの核酸鎖のような他の分子をプライマーとして用いることもできる。プライマーを鋳型分子にアニール（ハイブリダイズ）することができる。溶液のままであるかまたは鋳型に特異的にアニールしないプライマーは、アニーリングの後に除去するのが好ましい。好ましいアニーリング条件（温度および緩衝液組成）により、非特異的ハイブリダイゼーションを防止する。これらは、ストリンジェントな条件であることがある。このような条件は、典型的には所定塩濃度 (例えば、５０％ＧＣ含量を有する２０−マーのオリゴヌクレオチドに対して、５５℃で２００ｍＭＮａＣｌ中５０ｎＭプライマー)でのプライマーのＴｍ(融点)に近いアニーリング温度である。（所定の系についてのストリンジェント条件は、当業者が決定することができる。それらは、塩基組成、ＧＣ含量、使用プライマーの長さ、および塩濃度によって変化する。５０％ＧＣの２０塩基のオリゴヌクレオチドに対して、平均アニーリング温度の計算値は５５〜６０℃であるが、実際には３５〜７０℃の間で変化することがある。）プライマーは、鋳型分子について上記した手法によって表面に直接結合させることによって固定することができる。あるいは、それらは、例えばそれ自身表面に結合している鋳型分子にアニーリングさせることによって表面に間接的に結合させることができる。いずれの場合にも、鋳型分子は、（好ましくは「ストリンジェント条件」下で）プライマーとハイブリダイズする部分を含んでなる。この部分は、鋳型を提供するため当業者に知られている手法を用いて（完全に／部分的に未知の配列であっても）所定の分子に付加することができる。例えば、これを人工的に完全に／部分的に未知の配列の分子にリガーゼを介して結合することができる。これにより、一本鎖または二本鎖分子を生じることができる。二本鎖分子が生成するときには、加熱によりアニールした鎖を分離して一本鎖鋳型を提供し、次いでこれをプライマーにアニーリングさせることができる。上記のプライマーにアニーリングした鋳型を提供する方法の他に、プライマーにアニーリングした鋳型は、二本鎖分子から出発し、次に鎖の一方の部分を除去することによって提供することもできる。これにより、長鎖にアニーリングした一方の鎖（プライマー）の一部が残る。ここでは、長鎖は、配列決定を行う一本鎖部分を含んでなる。鎖の一方の部分を除去する工程は、例えば１種類以上のヌクレアーゼを用いて行うことができる。これを行う一つの方法は、３’→５’エキソヌクレアーゼで制限消化して、長鎖（鋳型）にハイブリダイズした遊離の３’ＯＨ基（プライマー）を有する短鎖を残すことによる。（長鎖をその３’末端でキャッピングして、エキソヌクレアーゼによる消化を防止することができる。）もう一つの方法は、一方の鎖にエンドヌクレアーゼでニック（切れ目）を入れた後、その鎖の５’ →３’エキソヌクレアーゼで除去することである。これにより、長鎖（鋳型）にハイブリダイズした短鎖（プライマー）上に遊離の３’ＯＨ基が残る。（長鎖をその５’末端でキャッピングして、エキソヌクレアーゼによる消化を防止することができる。）上記のように、鋳型にアニーリングしたプライマーを提供するどのような手段によっても、プライマーまたは鋳型分子を固定するのが好ましい。固定は、鋳型にアニーリングしたプライマーの提供の前または後のいずれに行うこともできる。プライマーにアニーリングした鋳型が提供されると、プライマー伸張を行うことができる。ＲＮＡまたはＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。しかしながら、ＤＮＡポリメラーゼは、好ましい態様について選択した酵素である。これらの幾つかは市販されている。３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼを用いることができ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩの小さな（Klenow）断片を用いることができる[例えば、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼSequenase^TM2.0(Amersham)またはKlenow断片(３’→５’エキソ，New England Biolabs)]。しかしながら、このようなポリメラーゼを用いることは本質的なことではない。実際に、ポリメラーゼがプルーフリーディング活性を有することが望ましい場合には、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼは用いられない。ある種の用途には、ThermoSequenase^TM（Amersham）またはTaquenase^TM（Scie nTech，セントルイス，ミズーリー）のような熱安定ポリメラーゼの使用が必要となることがある。任意のヌクレオチド（天然に存在するまたは天然に存在しない）を用いて、プライマー伸張反応を行うことができる。好ましいヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド；ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰ（幾つかの用途には、ｄＴＴＰ類似体であるｄＵＴＰが好ましい）またはリボヌクレオチドＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、およびＣＴＰであり、それらの少なくとも幾つかは標識形態で提供される。プライマー伸張の際に標識ヌクレオチドを用いると、検出が容易になる。（「標識」という用語は広義に用いられ、適当な検出装置を用いて同定することができる任意の残基を示す。標識は、天然に存在するヌクレオチド中には存在しないのが好ましい。）理想的には、標識はプライマー伸張を効率的に検出できる蛍光体(fluorophore s)のような非放射性物質である。幾つかの用途では、各鋳型分子の多数のコピーをそれぞれのロケーションで固定できることを考慮して、標識と非標識ヌクレオチドの組合せを用いることができる。この場合には、少量の組込みヌクレオチドが標識（例えば、蛍光標識）されているときには、各ロケーションの標識の数は検出装置によって検出を行うのに十分とすることができる。例えば、標識：非標識ヌクレオチドの比は、標識ヌクレオチドがプライマー伸張に５０％未満、２０％未満、または１０％未満の時間用いられるように選択することができる。従って、本発明の一態様では、核酸分子の配列決定法であって、ａ）第一のロケーションに、互いに同じ配列を有し、かつヌクレオチドと核酸ポリメラーゼの存在下でプライマー伸張を行うことができるやり方でプライマーにハイブリダイズしている複数の一本鎖核酸分子を提供し、ｂ）第一のロケーションとは異なる第二のロケーションに、互いに同じ配列を有するが、第一のロケーションの一本鎖核酸分子の配列とは異なる配列を有し、かつまたヌクレオチドと核酸ポリメラーゼの存在下でプライマー伸張を行うことができるやり方でプライマーにハイブリダイズしている複数の一本鎖核酸分子を提供し、ｃ）相補的塩基または複数の相補的塩基が一本鎖核酸分子中の適当な位置に存在するとき、各ロケーションが、プライマーを伸張することができる条件下で核酸ポリメラーゼおよび標識および未標識形態での所定のヌクレオチドを備え、ｄ）上記標識ヌクレオチドが各ロケーションでのプライマー伸張に用いられたかどうかを、上記ヌクレオチド上に存在する標識が伸張プライマーに取込まれたかどうかを決定することによって検出し、ｅ）工程ｃ）およびｄ）を１回以上繰返す、工程を含んでなる、方法が提供される。本発明のこの態様は、標識ヌクレオチドを余り必要としないので、経費を節減することができる。ある種の標識からのシグナルが互いに干渉しあう場合にこれらの標識を用いるときに、消光効果が問題となる場合には、これを用いて消光効果を減少させることもできる。本明細書に記載した本発明の他の態様の側面は、本発明の上記態様に必要な変更を加えて適用される。本発明の他の態様では、用いるヌクレオチドの総てまたはほとんどを標識することができ、従ってプライマー伸張は標識塩基の隣接組込みを生じることができる。これらの他の態様の一つでは、１種類の標識だけがプライマーの伸張に用いられる４種類のヌクレオチド上に存在する。従って、それぞれのヌクレオチド組込みにより、同一シグナル（例えば、特定の波長で測定したシグナル）を累積的に増加させることができる。複数の標識ヌクレオチドをプライマー伸張により核酸鎖に組込む数段階の配列決定の後に、シグナルを初期水準または少なくとも幾分か減少させるのが望ましいことがある。これは、１個以上の標識を既に組込まれたヌクレオチドから(例えば、蛍光体のレーザー漂白(laser bleaching)によって)除去することによって行うことができる。あるいは、重合工程を、最初に用いた標識から他の種類の標識に代えて(例えば、フルオレセインからローダミンへ変更して）進行させることもできる。余り好ましくない態様では、それぞれの種類のヌクレオチドに対して異なる標識を用いることができる。例えば、各ｄＮＴＰに対して異なる蛍光体を用いることができる。他の余り好ましくない態様では、プライマー自身およびその伸張生成物を除去して、他のプライマーと代えることができる。必要ならば、数段階の逐次的無標識ヌクレオチド付加を行った後、標識ヌクレオチドの存在下で実際の配列決定を再開することができる。それぞれのプライマー伸張工程の後に洗浄工程を組込み、後の工程を妨げることがある組込まれていないヌクレオチドを除去するのが好ましい。好ましい洗浄溶液は、ポリメラーゼ活性と適合し、プライマー分子および鋳型のアニーリングを妨げないほど十分に高い塩濃度を有する。余り好ましくない態様では、洗浄溶液がポリメラーゼ活性を妨げることがある。この場合には、更に重合が起こる前に洗浄溶液を除去する必要がある。様々な検出装置を用いて、標識を検出することができる(しかし、ある種の態様では、検出は単に目で見ることによって可能なことがあり、検出装置は必要ない)。蛍光標識の好ましい検出装置は、チャージ・カップルド・デバイス（Charg e Coupled Device(ＣＣＤ)）カメラであり、場合によっては拡大装置に連結されているものである。表面上で蛍光の検出および好ましくは定量も行う任意の他の装置を用いることができる。蛍光イメージャー(fluorescent imager)または共焦点顕微鏡のような装置を選択することができる。余り好ましくない態様では、標識は放射性であることがあり、その場合には放射能検出装置が必要となる。理想的には、このような装置は、同時放射能画像形成装置である。検出についてリン光スクリーン(Molecular Dynamics)またはオートラジオグラフィーに依存する他の装置は、余り好ましくない。鋳型分子を容器（例えば、ウェル）中で固定する方法の態様では、シークエンス反応をそれぞれの容器について監視することができる。これは、マイクロプレートリーダーを用いて行い、高次の平行関係を達成することができる。このようなリーダーは、蛍光または放射能の測定の目的で市販されている(例えば、Disco very^TM，FluoroCount^TMまたはTopCount^TMマイクロプレートリーダー、Packard I nstrument Company製)。シグナルの検出が望ましいロケーションの数によっては、スキャニング装置がデーター収集に好ましいことがある。（代替法は、総てのロケーションをカバーすることができる複数の検出器を設けることであるが。）このような装置では、分析を行う複数のロケーションに対して検出器を移動させることができる。これは、シグナルを提供する総てのロケーションが検出器の視野の範囲内にはないときには有用である。検出器を固定位置に保持し、分析を行うロケーションを（例えば、移動可能なプラットフォームによって）検出器の視野に移動することができる。あるいは、ロケーションを固定位置に保持し、検出装置を移動させて視野の中に入れることができる。検出装置は、分析装置と組み合わせて用い、各工程の後にそれぞれのロケーションでプライマー伸張によって組込まれる塩基の数（および好ましくは正常）を決定するのが好ましい。この分析は、記録データーを用いて各工程の直後または後で行うことができる。次に、所定のロケーションで固定化される鋳型分子の配列を、各工程の後に加えられたヌクレオチドの数および種類から推定することができる。検出装置は、他の成分を含んでなる装置の一部であるのが好ましい。本発明は、複数の標識ヌクレオチド、核酸ポリメラーゼ、およびプライマー伸張によって核酸分子に組込まれるとき標識ヌクレオチドを検出するための検出手段を含んでなる装置を包含し、検出手段は異なるロケーションで組込まれる標識ヌクレオチドによって提供されるシグナルを識別するのに適合している。この装置は、温度制御、溶媒送達および洗浄装置も含むことができる。これは、自動化することができる。上記の装置を、本発明の極めて好ましい態様で用いることができる。ここにおいて、様々な鋳型分子を、下記のようにして配列決定することができる。１．それぞれの型のＤＮＡ分子を配列させ、平坦な固体表面の異なるロケーションに共有結合させる；２．分子を変性させて、一本鎖ＤＮＡを生成させる；３．オリゴヌクレオチドプライマーを一本鎖ＤＮＡ鋳型分子に特異的にアニーリングさせ、未結合プライマーを除去し；４．ヌクレオチド伸張のための試薬混合物（例えば、単一型のデオキシリボヌクレオチドトリホスフェート、蛍光標識されているものの少なくとも一部、ＤＮＡポリメラーゼ、および適当な反応緩衝剤を含む）をＤＮＡ配列に適用し；５．ＤＮＡ配列を洗浄して、組込まれていないヌクレオチドを除去し、６．それぞれのロケーションにおける蛍光の量を測定して，記録する。反応は、十分な量の配列データーが生成するまで、別の型のヌクレオチドを用いて工程４）まで続ける。本発明の範囲内にある方法および装置を、・未同定の鋳型分子(すなわち、de novoシークエンス法)、および・配列決定を行い、既知配列に対して１個以上の差異があるかどうかをチェックする鋳型（例えば、多型の同定）の配列決定に用いることができる。これは、「リシークエンス法」と呼ばれることがある。 de novoシークエンス用途には、所定のロケーションに適用されるヌクレオチドの順序は、所望の通りに選択することができる。例えば、ヌクレオチドｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ；ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰなどの逐次付加を選択することができる。（一般に、４個のヌクレオチドの単一の順序が反復されるが、これは本質的ではない。）ｎ個の塩基の配列をde novoで配列決定するのに必要な工程数は、鋳型配列によって変化し、隣接ストレッチで反復される同一塩基の数が高くなると、工程数が減少し、反対に少数のこれらの縦列反復配列を有する鋳型配列は工程数を増加する。隣接反復した同一塩基が全くなければ、必要なde novoシークエンス工程の最大数は３ｎ＋１である。（所定の塩基が組込まれた後に、付加される次の塩基は、３種類の他の塩基の一つである。これの例外は、最初の塩基が４種類の塩基のいずれかであるプライマー伸張の第一工程である。）従って、反復塩基の全くない鋳型に対しては、ｎ個の塩基を配列決定するのに必要な有望な平均工程数は（所定のサイクルで組込むことができる３種類の塩基のいずれもが等しい確率で付加されることを考慮し、従って平均して２サイクル毎に１個の塩基が付加されることになれば）２ｎに極めて近い。従って、一般にタンデムに多数の塩基を含む生物学的鋳型については、de novoシークエンスに要する実際のサイクル数は、配列決定される塩基の数の２倍より低くなる。真にランダムな配列については、ｎ個の塩基を配列決定するのに要する工程数は平均して１．５ｎ工程であることを示すことができる。リシークエンス用途については、各工程で付加されるヌクレオチドの順序は、既知配列に従って選択するのが好ましい。リシークエンス法は、配列の違いを検出して同定するための多数の同様な鋳型分子の分析にとって（例えば、位置指定突然変異誘発の後の候補クローンにおける組換えプラスミドの分析、または更に重要なことには、集団における多形スクリーニングにとって）特に興味深いことがある。所定の配列からの差異は、プライマー伸張の特定工程における所定の配列に存在する１個以上のヌクレオチドの組込みの欠如によって検出することができる。極めて普通に用いられる手法とは対照的に、本発明の方法は、点突然変異、挿入または欠失のような任意の型の突然変異を検出することができる。更に、既知の現存する突然変異だけでなく、以前は同定されなかった突然変異を配列情報の提供によって特性決定することができる。本発明の方法の幾つかの態様では、長い鋳型分子を、数個のシークエンス反応であって、それぞれの反応が完全配列の一部を決定することができるものによってリシークエンスしなければならないことがある。これらの反応は、異なるロケーションで(例えば、鋳型は同一であるがプライマーは異なる各ロケーション)、または連続サイクルで（例えば、各サイクルの間に、プライマーと伸張生成物を洗浄除去し、異なるプライマーに代える）行うことができる。本発明を、添付図面に関して説明するが、例示のためだけのものである。特に断らない限り、ＤＮＡ分子に関して記載した手法は、ＲＮＡ分子にも適用可能であると考えるべきである。第１図は、２個の異なるＤＮＡ分子であって、四角形または円形によって示されるように、それぞれが特定のロケーションの多数のコピー中に存在する分子の in situシークエンス法を模式的に示す。第２図は、in situでＤＮＡ配列を決定するのに用いることができる蛍光読取り法を示す。第３、４、５および６図は、本発明の装置を示す。第７、８および９図は、本発明によって行ったin situシークエンス法を、（所望ならば）ゲルを用いる標準的手法によって確認することができることを示す。第１０および１１図は、蛍光標識を用いるin situシークエンスをを示す。第１図第１図について説明すれば、個々のスポットまたは配列したＤＮＡ鋳型は異なるロケーションに提供され、それぞれは同一核酸分子を多数含んでなる。第1(a)図は、蛍光標識したヌクレオチドを加える前のＤＮＡ鋳型を示す。この例では、２個の異なるＤＮＡ鋳型が、鋳型１は四角形で、鋳型２は円形で示されている。第1(b)図は、蛍光標識ｄＧＴＰをＤＮＡポリメラーゼの存在下で加え、ＤＮＡ鋳型を洗浄して、プライマー伸張に用いられなかった総ての標識ｄＧＴＰを除去した後のＤＮＡ鋳型を示す。１個以上の標識Ｇを組込んだＤＮＡ鋳型は、黒塗り四角形で示す。第1(c)，(d)および(e)図は、それぞれ標識ヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰを用いて繰返した第1(b)図に示した手続き（およびプライマー伸張に用いられないヌクレオチドを除去するための各工程の後の洗浄）を示す。蛍光検出を用いて、各ロケーションにおける蛍光の組込みを識別することができる。プライマー伸張による所定ロケーションで組込まれる最後の塩基を、第1(b)〜1( e)図で異なる塩基について異なる外観によって示す(Ｇは黒色で、Ａは斜線陰影で、Ｔは白色で、Ｃは点で示す)。第1(f)図は、第1(a)〜(e)図で示した方法によって決定した２つの部分配列を示す。レーン１に示した配列はＧＡＣであり、レーン２に示したものはＡＴＣである。参照を容易にするため、第1(a)図に示したＤＮＡ鋳型を第1(f)図に示したレーン番号に相当する番号で同定した。従って、２つの異なる種類のＤＮＡ鋳型は第1(a)図にあることが分かる(すなわち、所定のＤＮＡ分子は、実質的に均一な形態で「１」に関して同定したＤＮＡ鋳型に存在し、異なるＤＮＡ分子は、これもまた実質的に均一な形態で「２」に関して同定したＤＮＡ鋳型に存在する) 。本発明は、多くの２個を上回る異なる核酸分子配列を配列決定するのに用いることができ、ＲＮＡ並びにＤＮＡを配列決定するのに用いることができる。第２図第２図については、鋳型にアニールした特定のプライマーを用いるin situシークエンスを示す。第2(a)図は、鋳型にアニールしたプライマーを示す。プライマーは、プライマー伸張に利用可能な３’末端を有することが分かる。第2(b)図は、第2(a)図に示した下線付き塩基に相補的な蛍光標識塩基を、蛍光標識ヌクレオチドを用いて段階的プライマー伸張によって組込むことができる方法を示す。第2(c)図は、プライマー伸張によって組込むことができる蛍光標識を有する塩基を蛍光測定によりin situで検出する方法を示す。グラフは、所定のロケーションにおける蛍光強度の値を示す。第３図第３図については、本発明を行うための装置を示す。示された特徴を、下記に挙げる。１．配列したＤＮＡ試料および透明なカバープレート。２．カバープレートの周りのシール。３．ボトムプレート。４．試薬の入口(複数の導管を設けることができた)。５．電子制御弁。６．試薬溜。７．検出装置(例えば、ＣＣＤカメラ)。８．試薬出口。９．電子制御弁。１０．試薬溜。注意：試薬は、試薬溜に直接再循環させることができる。使用においては、鋳型分子をプレート上に配列し、透明カバー（例えば、石英プレートやカバースリップを提供することができる）によって被覆する。プレートの両側およびカバーを封印して、液体がそれらの間を循環することができるようにする。再使用することができる試薬を、導管および電子制御弁の系を介して分配する。理想的には、コンピューターを用いて、試料を適当な試薬と共に適当な条件下で逐次インキュベーションを行う。同一または別のコンピューターにより、検出系（例えば、ＣＣＤカメラ、および場合によっては鋳型分子に対してカメラを移動するための手段）を制御し、データー解析を行うこともできる。第４図第４図は、本発明を行うためのもう一つの装置を示す。この装置は、手動制御の段階的シークエンス法に好ましい。例示した特徴を、以下に挙げる。１．配列したＤＮＡ試料。２．プライマー伸張に用いる適当な種類のヌクレオチドを含む変形性吸収剤材料。３．洗浄装置。使用においては、変形性吸収剤材料（例えば、アガロースゲルまたはセルロースゲル）によりシークエンス試薬（例えば、ポリメラーゼ、緩衝剤、および一度に１種類のヌクレオチド）を保持する。変形性吸収剤材料を、鋳型分子が配列されている表面に軽く押しつけることによってプライマー伸張反応を起こすための十分な試薬を放出し、試薬の浪費を最小限にすることができる。次いで、洗浄工程を、洗浄装置を用いて液体を配列したＤＮＡ試料上に流すことによって行うことができる。第５図第５図に示される自動化装置であって、変形性吸収剤材料とそれに保持された試薬とを用いる装置を設計することもできる。理想的には、４種類の試薬混合物（ヌクレオチドの各種類について１個）を、変形性吸収剤材料の分離した部分によって設ける。変形性吸収剤材料は、通常は形状が円筒形であることができ、円筒の外表面上に設けた４個の異なる領域を有することができる。鋳型分子を、別の円筒の表面に配列することができる。鋳型円筒は、直径が小さくてもよく(例えば、dt=1/4dr、但しdtは鋳型円筒の直径であり、drは試薬円筒の直径)、または直径が大きくてもよい(例えば、dt=dr+1/4またはdt=dr+3/4)。反応は、試薬および試料円筒を互いに反対方向に回転することによって連続的に反復することができる。洗浄および検出も、鋳型円筒の表面に沿って連続的に行うことができる。第５図に示した自動化装置を、更に詳細に説明する。（第5A図は、装置の斜視図を示す。第5B図は、装置の平面図を示す。）成分は下記の通りである。１．配列決定試薬を含む変形性吸収剤材料で被覆した円筒。ここでは、それぞれが異なる試薬（例えば、重合混合物であって、それぞれが異なるヌクレオチドを有するもの）を含む４個の部分を有する円筒の例を示す。２．試料を配列した小さな直径の円筒(例えば、ここに示すように、円筒１の直径の１／４)。３．洗浄装置。４．検出装置(例えば、ＣＣＤカメラ)。典型的には、これらの円筒は互いに反対方向に回転し、円筒１上の試薬が円筒２の表面に適用されるようにする。試薬の適用の順序は、円筒１でのそれらの付着に対応する。本発明の他の態様では、試薬適用のこの順序を修正することができる(例えば、リシークエンス法)。例えば、付属装置を用いて１種類以上の試薬の円筒２への適用を省くことができる。これは、円筒１に対する円筒２の回転を、これらの円筒の接触を回避しながら制御することによって行うことができる。第６図第６図に示されるような、他の装置を設計することができる。試薬は、マイクロスプレーによって分配することができる。従って、各工程で用いることが必要な試薬の容積は最小限である。例えば、自動化圧電装置を設計して、画定したロケーションにナノリットル（またはピコリットル）の試薬を分配することができる(例えば、インキージェット印刷法)。異なる鋳型、または異なるプライマーからの同様な鋳型のリシークエンス法は、適当な試薬（例えば、アニーリング溶液中のプライマーまたはポリメラーゼ、緩衝剤およびヌクレオチド）を画定されたロケーションで分配することによって行うことができる。シークエンス反応を行うため連続的に用いることができる３つの装置を、第６図に示す。Ａ．適当な試薬を画定したロケーションに分配するための圧電装置。この装置を、電子制御装置および試薬溜に連結する。Ｂ．洗浄装置。Ｃ．検出装置。第７図実施例１に記載の、32Ｐで標識したプライマーを用いるシークエンス法を示す。鋳型は、磁性ビーズに固定した。シークエンスサイクルは、任意の順序で指示したヌクレオチド（Ａ，Ｔ，Ｇ，Ｃ,...）を用いて行い、de novoシークエンス法を模倣した。反応生成物は、変性アクリルアミドゲル上で電気泳動を行った後、オートラジオグラフィーによって可視化した。断片サイズを予想配列と共に右側に示す。第８図実施例２に記載の、32Ｐで標識したヌクレオチドを用いるシークエンス法を示す。鋳型は、磁性ビーズに固定した。シークエンス工程は、任意の順序で指示したヌクレオチドを用いて予想組込みの順序で行った。プライマーは非標識であった。反応生成物は、変性アクリルアミドゲル上で電気泳動を行った後、オートラジオグラフィーによって可視化した。断片サイズを予想配列と共に右側に示す。第９図実施例３に記載の、ゲル電気泳動なしのシークエンス法を示す。シークエンス工程は、32Ｐで標識したヌクレオチドを予想した組込みの順序で用いて行った。プライマーは非標識であった。それぞれのウェルにおける放射能の蓄積を、それぞれのサイクルの後に記録し、付加した塩基の予想数（右尺度）と共にグラフ（左尺度）上に示す。第１０図実施例４に記載の、蛍光標識ヌクレオチドを用いるシークエンス法を示す。鋳型はマイクロプレートで固定し、プライマーは未標識であった。ヌクレオチドを、予想配列に相当するＴ，Ｃ，Ｔ，Ｃ，Ｔ，Ｃ，Ｔの順序で用いた。それぞれの工程の後の蛍光増加を記録し(任意単位)、付加塩基の予想数と共にグラフに示す。第一工程は、非特異的シグナルに相当する。第１１図実施例５に記載の、蛍光標識ヌクレオチドを用いる平行シークエンス法を示す。鋳型はマイクロプレート上に固定し、異なる未標識プライマーを２つのロケーションで用いた。ヌクレオチドを、これら両ロケーションでＴ，Ｃ，Ｔ，Ｃの任意順序で用いた。それぞれの工程の後の蛍光の増加をそれぞれのロケーションについて記録し、グラフに示す。それぞれのプライマーに付加した塩基の予想数を、第１１表に示す。実施例実施例１この実施例では、本発明の方法を用いるヌクレオチドの段階的組込みを良好に行うことができる指示を提供する。この実施例では、シークエンスゲルがシークエンス法に日常的に用いられているので、例示目的のためのシークエンスゲルを用いる。しかしながら、本発明は、核酸分子のin sisuシークエンス法に好ましく用いられ、従ってシークエンスゲルを用いる必要がない。実験手続き１．シークエンスサイクルを、磁性ビーズに結合した一本鎖鋳型分子上で行った。１７４個の塩基対ＤＮＡ断片を、pBlueScript SK-(Stratagene)の多重クローニングからＰＣＲによって増幅した。正プライマー（５’−ビオチン−ＧＣＧＣＴＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ−３’）および復帰プライマー（５’−ＣＧＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡ−３’をそれぞれ位置６２１および７９１に配置した。増幅した二本鎖ＤＮＡをストレプトアビジンをコーティングした磁性ビーズ(Dynabeads M-280,Dynal,オスロー）に結合し、ＮａＯＨで変性した。洗浄の後、ビーズに結合した一本鎖ＤＮＡを、10ｍＭトリス，ｐＨ8.0に保持した。２．復帰プライマーをシークエンス法に用いた。その５’末端を放射性リン酸塩で標識し、一本鎖ＤＮＡ鋳型にアニールした。プライマー分子は、下記の塩基で伸張することが予想される。ＧＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＣＴＧＧＡＧプライマー末端標識は、製造業者によって記載されているように、［γ-32Ｐ］ＡＴＰの存在下でポリヌクレオチドキナーゼ(Pharmacia)で行った。Sephadex G-25スピンカラム上で精製した後、プライマーを-20℃で保存した。アニーリングは、プライマーと鋳型分子とを１×Sequcnase緩衝液[40ｍＭトリス，ｐＨ7.5,20ｍＭＭｇＣｌ２，50ｍＭＮａＣｌ］中で混合したものを70℃ で５分間加熱した後、２時間徐冷することによって行った。３．シークエンス反応は、（ヌクレオシドトリホスフェートの１つの型だけの存在下で）プライマー伸張、分析のための少量の採取、および洗浄のの連続サイクルによって行った。それぞれのサイクルは、異なるデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの溶液を用いて、ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，dＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰなどの任意の順序を用いて行った。反応混合物は、0.1ｕ／μl(T7 Sequenase II,Amersham)および通常のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの単一型１×Sequenase緩衝液に溶解した100 ｎＭを含んでいた。４種類の異なる混合物であって、それぞれ異なる型のヌクレオシドトリホスフェートを含むものを調製した。サイクルは、鋳型に結合したビーズから磁石を用いて緩衝剤を除去して出発した。氷冷反応混合物を加えた。５秒後、少量を集め、90％ホルムアミドおよび20 ｍＭＥＤＴＡを含む停止緩衝液10容中で氷中に保持した。洗浄緩衝液（10ｍＭトリス，ｐＨ8.0）10容を、残っている反応混合物に加え、鋳型に結合したビーズを磁石で分離した後直ちに除去した。洗浄を繰返し、次のサイクルを開始した。それぞれのサイクルにおいて、少量採取および洗浄による損失の後に鋳型の残量に従って、新しい反応混合物の少量を用いた。４．次いで、それぞれのサイクルを変性シークエンスゲル上で分析した後、少量を集めた。移動の後、ゲルをオートラジオグラフィーにより分析して、それぞれのバンドの位置を明らかにした。停止緩衝液中の少量を95℃で５分間変性し、氷で直ちに冷却した後、１×ＴＢＥ緩衝液と７Ｍ尿素を含む0.75×180×320ｍｍの15％アクリルアミドゲル(SE420 ,Hoefer Scientific Instruments)に加えた。移動は2000Ｖで５分間および250Ｖで一晩であった。コントロールとして、未反応のオリゴヌクレオチド(レーン１)、並びに総ての４種類のデオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下で行った反応の生成物（レーン２）をゲルに適用し、完全に伸張した分子を生じた。移動の後、ゲルを10％氷酢酸および10％メタノール中で30分間固定した。湿りのあるうちに、これをオートラジオグラフィーカセット中のプラスチックバッグに移し、25℃で９時間Kodak X-OMAT ARフィルムに暴露した。それぞれのサイクルの後の伸張した断片のゲル分析に伴う放射性標識が極めて感受性が高いことにより、反応を慎重に監視することができた。第７図に示されるように、・デオキシヌクレオシドトリホスフェートの１つの型だけの存在下で正確に重合を行うことができる条件を確認した。重合は、組込まれる最後の塩基まで完全に進行するが(レーン５)、相補的塩基が鋳型分子上に存在しないときには（それ以上の）伸張はブロックされる(レーン３，４または５)。・レーン３，４または６でみられるように、過誤組込みはない。・３’−５’エキソヌクレアーゼ活性はない(例えば、短いサイズの断片は、レーン３または４では検出されない)。・良好なサイクルを、正確に行うことができる。正確なサイズの断片だけを観察する。３つの例外がある。すなわち、(1) 小比率のプライマー分子は、オリゴヌクレオチドの３’末端に損傷があるため、最初のサイクル中には伸張しなかった。(2) サイクル13の後に、完全な長さの分子がある比率で観察され、これは、洗浄が完全ではなくかつ４−デオキシヌクレオシドトリホスフェートが溶液に含まれていることを示している。この問題は、サイクル４と１２の間には、４個の異なるデオキシヌクレオシドトリホスフェートは既に反応に使用されてしまっていても、観察されなかったので、適切なものとは考えられない。実験をプラスチック表面に結合した鋳型分子を用いて繰返すときには、洗浄工程も促進される。(3) 予想したものより小さなサイズのバンドをかすかに観察することができ、これは反応が完了していないことを示している。しかしながら、その比率は極めて低く、in situ検出を妨げるものではない。この予備実験では19サイクルだけを行ったが、それ以上のサイクル(50まで、または100サイクル以上まで)を良好に行えないという理由は全くない。この実験は、リシークエンス法（予想デオキシヌクレオシドトリホスフェートだけを重合に用いるとき）だけでなく、de novoシークエンス法もこの方法で効率的に行うことができることを示していた。未知鋳型分子のde novoシークエンス法を20サイクル行ったところ、配列決定することができる塩基の最小数は６であり、最大数は塩基の順序および連続した同一塩基の存在によって変化する。このde novoシークエンス実験では、19サイクルで17程度の塩基が読取られた。本発明で用いられる鋳型分子は、一本鎖ＤＮＡで二次構造を生じるパリンドローム領域の含量が高いため配列決定が困難であると思われることも述べるべきである。この潜在的困難は、本発明者らの実験では問題とはならなかった。実施例２：非標識プライマーを用いるリシークエンス法この実施例では、標識したデオキシヌクレオシドトリホスフェートの良好な段階的組込みは、本発明の方法を用いて行うことができることも示す。実施例１と同様に、シークエンスゲルを例示目的に用いた(第８図)。しかしながら、本発明は、核酸分子のin situシークエンスに好ましく用いられるので、シークエンスゲルを使用する必要はないことを理解されるであろう。鋳型調製 pBlueScrip SK-プラスミドのポリリンカーに挿入した608塩基対のＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅した。正プライマー(５’−ＧＣＧＣＧＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡ−３’の５’末端をビオチン化し、復帰プライマー (５’−ＧＣＡＡＴＴＡＡＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡＡ−３’）は官能化しなかった(すなわち、−ＯＨ)。増幅した二本鎖ＤＮＡを、スピンカラム(Pha rmacia MicroSpin S-400 HR)上で精製し、未使用プライマーを除去した。次に、精製ＤＮＡ100μlを、総容量400μlに希釈して、同容量のストレプトアビジンをコーティングした磁性ビーズ(10ｍｇ／ｍｌ)に製造業者のプロトコールに従って結合した(Dynabeads M-280,Dynal,オスロー)。ＤＮＡを0.1ＮＮａＯＨの存在下で変性し、ビーズを洗浄して相補鎖を除去した。ビーズに結合した一本鎖ＤＮＡを100μlの10ｍＭトリス，ｐＨ8.0に再懸濁し、４℃で保存した。プライマーアニーリングプライマー５’−ＴＡＣＣＡＧＴＴＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＣ−３ ’を用いて、シークエンスを行った。アニーリングは、プライマーと鋳型との混合物を95℃で５分間加熱し、60℃で30分間冷却することによって行った。典型的には、20μlのビーズを10ピコモルのプライマーを100μlの１×Sequenase緩衝液（40ｍＭトリス，ｐＨ7.5，20ｍＭＭｇＣｌ₂，50ｍＭＮａＣｌ）に溶解したものでアニーリングした。プライマーは、鋳型配列に相補的な下記の塩基：ＣＧＣＴＧＧＧＧＴＧＧＴＴＴ...で伸張されると予想された。プライマー伸張反応は、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの１つの型だけの存在下で行った。各工程は、異なるデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの溶液を用いて、ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰなどの予想された順序で行った(第一のｄＡＴＰおよびｄＴＴＰは組込まれず、過誤組込みがないことを示す働きをする)。Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼSequenase2.0(Amersham)を、重合反応に選択した。反応混合物は、0.2u／μl Sequenase、5ｍＭＤＴＴ、250ｎＭの通常のデオキシリボヌクレオチドの単一型、および5ｎＭの[α-32Ｐ]で標識したデオキシリボヌクレオチド（50ｎＣｉ／μl,Amersham）の同一型を１×Sequen ase緩衝液に溶解したものを含んでいた。４種類の異なる混合物であって、それぞれが異なる型のデオキシヌクレオシドトリホスフェートを有するものを調製した。第一の重合工程は、20μlの鋳型に結合したビーズを沈降させることによって開始した。ビーズを25μlの氷冷反応混合物に再懸濁し、反応を10秒間行った。ビーズを磁石により直ちに沈降し、１×Sequenase緩衝液10容で１分間３回洗浄した。最後の洗浄の後、ビーズを１×Sequenase緩衝液の初期容積に再懸濁した。各サイクルの後、１μlの分量を集め、10μlの停止緩衝液（90％ホルムアルデヒド、１×ＴＢＥ緩衝液、20ｍＭＥＤＴＡ、0.1％ブロモフェノールブルー、0.1％キシレンシアノールＦＦ）に保存した。次の重合および洗浄工程を、適当量の試薬を用いて上記した通りに行った(すなわち、各工程は、分量除去を補償するためより少量を用いる)。最終洗浄工程の後、試料をゲル電気泳動によって分析した。停止緩衝液中の分量を95℃で５分間変性し、直ちに氷令した後、１×ＴＢＥ緩衝液および７Ｍ尿素を含む0.75×180×320ｍｍの15％アクリルアミドゲルに加えた。電気泳動装置は、Hoefer Scientific Instruments製SE400型であった。移動は、2000Ｖで５分間および250Ｖで一晩であった。移動の後、ゲルを直ちにプラスチックバッグに移し、オートラジオグラフィーカセット中でKodak X-OMAT ARフィルムを25℃で16 時間暴露した。上記に記載され、第８図に示すように、この実施例は、本発明のシークエンス法が非標識プライマーからの段階的シークエンスに良好に適合させることができることを示している。実施例３：マイクロプレートウェルに結合したシークエンス鋳型鋳型調製この実施例では、約700塩基のＤＮＡ分子を鋳型として用いた。それらを、製造業者によって記載されているように、改質マイクロタイタープレートのプラスチック表面に結合させた(NucleoLinkTM,Nunc A/S製,ロスキルデ，デンマーク)。２つの型のＤＮＡ鋳型（ＡおよびＢと命名）を、個別にまたは（50％ずつの）混合物としてウェルに結合した。プライマーアニーリング 20塩基長のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ鋳型Ｂに特異的なシークエンスプライマー（５’−ＧＧＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＧＡＡＣＴ−３’ ）として用いた。アニーリングは、100ｎＭプライマー（ウェル当たり20μlの５ ×ＳＳＣ緩衝液+0.1％Tween（商品名）20中）の存在下で、鋳型をコーティングしたマイクロタイタープレートを94℃で４分間加熱し、60℃まで30分間で冷却することによって行った。プライマーは、鋳型配列に相補的な下記の塩基：ＣＣＣＴＡＣＣＴＣＡ...を用いて伸張されることが予想された。重合工程プライマー伸張反応は、１種類だけのデオキシヌクレオシドトリホスフェートの存在下にて行った。各工程は、異なるデオキシヌクレオシドトリホスフェートの溶液を用いて、ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＴＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰの予想順序を用いて行った。ＤＮＡ Polymerase I(New England Bi olabs)のクレノウ断片を、重合反応に用いた。反応混合物は、0.25ｕ／μlのクレノウエキソー、50ｎＭの単一型の通常のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、および20ｎＭの同じ型の[α-32P]で標識したデオキシリボヌクレオシドトリホスフエート(50ｎＣｉ／μl,Amersham)Polymerase I緩衝液（10ｍＭトリス，ｐＨ7.5，５ｍＭＭｇＣｌ₂，7.5ｍＭジチオトレイトール）中に含んでいた。４種類の異なる混合物は、それぞれ異なる型のデオキシヌクレオシドトリホスフェートで調製した。典型的な反応は、12μlで行った。重合工程は、ウェルから試薬を除去することによって開始した。適量の反応混合物を加え、反応を室温で30秒間継続した。洗浄工程ウェルを、ＴＮＴ緩衝液(100ｍＭトリス，ｐＨ7.5,150ｍＭＮａＣｌ，0.1％ Tween（商品名）20)中で直ちに３回１分間洗浄した。検出工程各洗浄工程の後、それぞれのウェルに組込まれた放射能を測定し、シンチレーションカウンターを用いて記録した。シークエンスサイクルこの実施例では、重合、洗浄および検出工程を順次繰返した。第９図に示す結果は、プライマー伸張が予想通りに起きたことを示している。段階的計数増加は、鋳型Ｂの存在下で特異的に起こり、ウェルに結合した量によって変化した(例えば、50％の鋳型Ｂの存在下でよりも100％鋳型Ｂの存在下では計数は約２倍程度となる)。各工程の後、検出した計数の数値は、加えた塩基の数にほぼ比例して増加した。実施例４：蛍光標識を用いるシークエンス法この実施例では、シークエンス法を蛍光標識したヌクレオシドトリホスフェートを段階的に取込むことによってin situで行うことができることを示す。加えた塩基の数は、付加の各サイクルの後の蛍光の増加を測定することによって決定される。従って、ＤＮＡ配列決定は、電気泳動による分離法を必要とせずに行われる。鋳型調製この実施例では、157ｂｐのＤＮＡ断片を、ストレプトアビジンをコーティングした９６穴のマイクロタイタープレートに結合した。断片は、５’-ビオチン化した正プライマーでＰＣＲ増幅によって調製した。復帰プライマーは、官能化しなかった。組込まれていないプライマーを、スピンカラム(Pharmacia MicorSp in S-400 HR)上でＰＣＲ生成物を精製することによって除去した。ストレプトアビジンをコーティングしたマイクロタイタープレートウェル(LabSystems,ヘルシンキ)に結合した後、ＰＣＲ断片をＮａＯＨ処理によって変性した。洗浄の後、正鎖だけがウェルに結合したままであった。プライマーアニーリングプライマー５’−ＡＣＡＣＧＡＧＣＣＡＣＡＣＴＧＴＣＣＣＡＧＧＧＧＣ−３’を用いて配列決定を行った。アニーリングは、0.5μＭのプライマーを５×ＳＳＣ緩衝液で25℃で行った。プライマー伸張鋳型上の予想プライマー伸張は、Ｃ，Ｔ，Ｃ，Ｃ，Ｔ，Ｃ，Ｔである。反応混合物［１×Sequenase緩衝液，0.15ｕ／μl Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ(Sequenase 2.0,Amcrsham)，0.1％ＢＳＡ，５ｍＭＤＴＴ］は、0.5μＭのｄＵＴＰまたはｄＣＴＰ［Ｃｙ５標識(Amersham)および非標識デオキシヌクレオチドトリホスフェートの60％混合物として］を含んでいた。反応は、ｄＵＴＰまたはｄＣＴＰの存在下にて25℃で１分間行った。各工程の後、ウェルを１×Sequenase緩衝液で２回洗浄し、それぞれのウェルの蛍光強度を蛍光顕微鏡(Zeiss Axiovert TV100) に設置した低温ＣＣＤカメラ(Princeton Instruments)で測定した。ｄＴＴＰはｄＵＴＰで置換することができ、２個のヌクレオチドは同一特異性を有する点に留意されたい。第10図に示した結果は、ｄＮＴＰ付加の各サイクルの後、蛍光の測定増加量は組込まれる塩基の数に比例することを示している。あるいは、連続反応をｄＵＴＰまたはｄＣＴＰの存在下で行った。非特異的伸張のコントロールとして用いられるｄＵＴＰを第一工程に用いた。この実施例では、８個の塩基を本発明の方法を用いて配列決定した。実施例５：蛍光標識ｄＮＴＰを用いる平行シークエンス法この実施例では、蛍光標識したデオキシヌクレオシド−トリホスフェートの段階的組込みによるin situシークエンス法を異なるロケーションで平行して行うことができることを示す。従って、幾つかの試料を、同時に配列決定することができる。鋳型調製この実施例では、131ｂｐのＤＮＡ断片をストレプトアビジンをコーティング9 6穴マイクロタイタープレートに結合した。断片は、５’−ビオチン化した正プライマーでＰＣＲ増幅することによって調製した。復帰プライマーは官能化しなかった。組込まれていないプライマーは、スピンカラム(Pharmacia MicroSpin S -400 HR)上でＰＣＲ生成物を精製することによって除去した。ストレプトアビジンをコーティングしたマイクロタイタープレートウェル(LabSystems,ヘルシンキ)に結合した後、ＰＣＲ断片をＮａＯＨ処理によって変性した。洗浄の後、正鎖だけがウェルに結合したままであった。プライマーアニーリング２個のプライマーを異なるロケーションの鋳型にアニールした。プライマー79 （５’−ＧＧＧＧＴＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＧＧＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣ−３’）をマイクロタイタープレート上の第一のロケーションでアニーリングし、プライマー94（５’−ＴＧＧＴＣＡＧＧＣＴＧＧＴＣＴＣＧＡＡＣＴＣＣＣＴＡＣ−３’）をマイクロタイタープレートの第二のロケーションでアニーリングした。アニーリングは、５×ＳＳＣ緩衝液中0.5 μＭを用いて25℃で行った。プライマー伸張プライマー79に対する予想伸張はＴＣＧ...であり、プライマー94に対してはＣＴＣＡ...である。反応混合物［１×Sequenase緩衝液，0.15ｕ／μl Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ(Sequenase 2.0,Amersham),0.1％ＢＳＡ，５ｍＭＤＴＴ］は、0.5μＭのｄＵＴＰまたはｄＣＴＰ［Ｃｙ５−標識(Amersham)および非標識デオキシヌクレオチド］を含む。反応は、ｄＵＴＰまたはｄＣＴＰの存在下にて25 ℃で１分間行った。それぞれの工程の後、ウェルを１×Sequenase緩衝液で２回洗浄し、それぞれのウェルにおける蛍光強度を、上記のように、蛍光顕微鏡上に設置した低温ＣＣＤカメラを用いて測定した。第11図に示した結果は、各工程の後および各プライマーについて、蛍光の増加量は組込まれた塩基の数に比例することを示している。あるいは、ｄＵＴＰまたはｄＣＴＰの存在下にて連続犯を行った。プライマー79については、工程１および２で、１個の塩基がこれらの工程で付加されるので(表を参照)、蛍光が増加した。しかしながら、プライマー94については、塩基は工程２、３および４だけで組込まれた。予想されたように、工程３および４でのプライマー79について、および工程１でのプライマー94については、蛍光の増加は検出されなかった。この実施例は、方法の特異性および異なるロケーションで動じ並行的に配列決定を行うためのその使用を示している。二本鎖のニックのある分子の使用上記実施例は、一般にプライマーを一本鎖核酸分子にハイブリダイズした後、プライマーを伸張する方法に基づいているが、ニックを有する二本鎖分子を提供する代替法を用いることができる(ニックは二本鎖ＤＮＡ分子の一方の鎖におけるギャップであり、遊離の３’−ＯＨ末端を提供することができる)。ニックは、適当なポリメラーゼおよびヌクレオチドの供給の存在下にて鎖の伸張のための出発点として３’−ＯＨ基を提供する。従って、ニックによって提供された３’−ＯＨ基は、上記の方法におけるプライマーの末端における３’−ＯＨ基と同等な機能を有する。ニックは、任意の適当な手段によって提供することができる。例えば、これは、ヘミホスホロチオエート化した認識部位を有するＤＮＡ分子上で制限酵素を用いることによって提供することができる(文献：Spear s,P.A.,Linn,C.P.,Woodard,D.L.,Walker,G.T.(1997)，「Chlamidia trachomatis ＤＮＡの同時鎖置換増幅および蛍光分極検出」,Analytical Biochemistry,247:1 30-137)。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年３月１日（１９９９．３．１）【補正内容】請求の範囲２１．標的核酸の配列決定法であって、（ａ）標的核酸をプライマーにハイブリダイズすることにより、標的核酸がプライマーの３’末端の伸張の鋳型として働くことができるようにし、（ｂ）ハイブリダイズした標的核酸／プライマーを、ポリメラーゼと、プライマーの鋳型指向的伸張を支持する条件下で標識を有するある種のヌクレオチドであって標的の相当するヌクレオチドの相補物として組み込むことができるヌクレオチド種と共にインキュベートし、（ｃ）プライマーに組み込まれる第一の標識を測定し、組込みがあれば、幾つの塩基が増加し、プライマーがヌクレオチド型の組込みによって伸張したかどうかを決定し、（ｄ）プライマーの鋳型指向的伸張を支持する条件下で標識を有する異なる型のヌクレオチドを標的の相当するヌクレオチドに相補的になるように組み込むことができる場合には、ハイブリダイズしたプライマー／標的核酸をこの異なるヌクレオチドと共にインキュベートし、（ｅ）上記インキュベーション工程によりプライマーに組込まれた標識の増加を測定して、組込まれるのであれば、いくつの塩基が増加し、プライマーが異なるヌクレオチド型の組込みによって伸張したかどうかを決定し、（ｆ）標的配列の所望な部分がプライマーの塩基付加の増加から決定することができるようになるまで工程（ｂ）〜（ｅ）を反復することを含んでなる、方法。２２．請求項１〜１４、１６または１７のいずれか１項に記載の方法である、請求項２１に記載の方法。２３．標的核酸分子をプライマーにハイブリダイズし、プライマーを標識ヌクレオチドで伸張する代わりに、ニックを二本鎖核酸分子に導入し、ニックをニックトランスレーションおよび標識ヌクレオチドを用いて伸張することが除かれる、請求項２１または２２に記載の方法。２４．本明細書に実質的に記載された発明。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者パスカル、メイエスイス国プラン、レ、ズアート、シュマン、ド、オ、14 セロノ、ファーマスーティカル、リサーチ、インスティテュート、ソシエテ、アノニム内

Claims

【特許請求の範囲】１．核酸分子の配列決定法であって、ａ）互いに同じ配列を有し、かつヌクレオチドと核酸ポリメラーゼの存在下でプライマーを伸張できるようにプライマーにハイブリダイズしている複数の一本鎖核酸分子を第一のロケーションに提供し、ｂ）互いに同じ配列を有するが、第一のロケーションの一本鎖核酸分子の配列とは異なる配列を有し、かつまたヌクレオチドと核酸ポリメラーゼの存在下でプライマーを伸張できるようにプライマーにハイブリダイズしている複数の一本鎖核酸分子を第一のロケーションとは異なる第二のロケーションに提供し、ｃ）相補的塩基または複数の相補的塩基が一本鎖核酸分子中の適当な位置に存在するとき、プライマーを伸張できる条件下で核酸ポリメラーゼおよび所定の標識ヌクレオチドを備えた各ロケーションを提供し、ｄ）上記標識ヌクレオチドが各ロケーションでのプライマー伸張に用いられたかどうかを、上記ヌクレオチド上に存在する標識が伸張プライマーに取込まれたかどうかを決定することによって検出し、ｅ）工程ｃ）およびｄ）を１回以上繰返して、複数の標識を含んでなる伸張したプライマーが提供されるようにする工程を含んでなる、方法。２．工程ｅ）で得られる配列の総てまたは一部を転換して、それに対する相補配列を提供する、請求項１に記載の方法。３．所定のヌクレオチドが工程ｄ）のプライマー伸張に用いられるとき、この工程が伸張プライマー当たりいくつの所定ヌクレオチドが用いられたかを検出する工程を包含する、請求項１または２に記載の方法。４．工程ｃ）の後、プライマー伸張に用いられなかった過剰のヌクレオチドを（例えば、洗浄により）除去する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。５．工程ｄ）が吸収または発光スペクトル分析法を用いる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。６．一本鎖核酸分子、プライマーまたはこれらの両方を固定する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。７．異なる配列を有する１０個以上の核酸分子を完全にまたは部分的に配列決定するのに用いる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。８．異なる配列を有する１００個以上の核酸分子を完全にまたは部分的に配列決定するのに用いる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。９．異なる配列を有する１０００個以上の核酸分子を完全にまたは部分的に配列決定するのに用いる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。１０．４種類の異なるヌクレオチドのそれぞれをプライマー伸張に用いる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。１１．上記の４種類の異なるヌクレオチドを繰り返しサイクルで用いる、請求項１０に記載の方法。１２．ヌクレオチドが標識した形態のｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＣＴＰである、請求項１０または１１に記載の方法。１３．ヌクレオチドが標識した形態のＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰ、およびＣＴＰである、請求項１０または１１に記載の方法。１４．検出工程を異なるロケーションから核酸分子を移動することなく行う、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。１５．プライマーにハイブリダイズした一本鎖分子の代わりにニックを有する二本鎖核酸分子を第一および／または第二のロケーションに提供することが除かれる、請求項１から１４のいずれか１項に記載の方法。１６．１個の核酸分子だけを第一および／または第二のロケーションに供給することが除かれる、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。１７．核酸分子の配列決定法であって、ａ）互いに同じ配列を有し、かつヌクレオチドと核酸ポリメラーゼの存在下でプライマーを伸張できるようにプライマーにハイブリダイズしている複数の一本鎖核酸分子を第一のロケーションに提供し、ｂ）互いに同じ配列を有するが、第一のロケーションの一本鎖核酸分子の配列とは異なる配列を有し、かつまたヌクレオチドと核酸ポリメラーゼの存在下でプライマーを伸張できるようにプライマーにハイブリダイズしている複数の一本鎖核酸分子を第一のロケーションとは異なる第二のロケーションに提供し、ｃ）相補的塩基または複数の相補的塩基が一本鎖核酸分子中の適当な位置に存在するとき、プライマーを伸張できる条件下で核酸ポリメラーゼおよび標識および未標識形態での所定のヌクレオチドを備えた各ロケーションを提供し、ｄ）上記標識ヌクレオチドが各ロケーションでのプライマー伸張に用いられたかどうかを、上記ヌクレオチド上に存在する標識が伸張プライマーに取込まれたかどうかを決定することによって検出し、ｅ）工程ｃ）およびｄ）を１回以上繰返す、工程を含んでなる、方法。１８．請求項１〜１７のいずれか１項に記載の装置であって、装置が、複数のヌクレオチド、核酸ポリメラーゼ、および請求項１の工程ｄ）または請求項１５から１７のいずれか１項に記載の等価な工程を行うための検出装置を含んでなり、検出装置が上記の異なるロケーションを識別するのに適合している、装置。１９．第一および第二のロケーションから過剰のヌクレオチドを除去する手段（例えば、洗浄手段）を含んでなる、請求項１８に記載の装置。２０．プライマー伸張および検出のサイクルを反復できるように自動化された、請求項１８または１９に記載の装置。２１．標的核酸の配列決定法であって、（ａ）標的核酸をプライマーにハイブリダイズすることにより、標的核酸がプライマーの３’末端の伸張の鋳型として働くことができるようにし、（ｂ）ハイブリダイズした標的核酸／プライマーを、ポリメラーゼと、プライマーの鋳型指向的伸張を支持する条件下で標識を有するある種のヌクレオチドであって標的の相当するヌクレオチドの相補物として組み込むことができるヌクレオチド種と共にインキュベートし、（ｃ）プライマーに組み込まれる第一の標識を測定し、組込みがあれば、幾つの塩基が増加し、プライマーがヌクレオチド型の組込みによって伸張したかどうかを決定し、（ｄ）プライマーの鋳型指向的伸張を支持する条件下で標識を有する異なる型のヌクレオチドを標的の相当するヌクレオチドに相補的になるように組み込むことができる場合には、ハイブリダイズしたプライマー／標的核酸をこの異なるヌクレオチドと共にインキュベートし、（ｅ）上記インキュベーション工程によりプライマーに組込まれた標識の増加を測定して、組込まれるのであれば、どのように塩基が増加し、プライマーが異なるヌクレオチド型の組込みによって伸張したかどうかを決定し、（ｆ）標的配列の所望な部分がプライマーの塩基付加の増加から決定することができるようになるまで工程（ｂ）〜（ｅ）を反復することを含んでなる、方法。２２．請求項１〜１４、１６または１７のいずれか１項に記載の方法である、請求項２１に記載の方法。２３．標的核酸分子をプライマーにハイブリダイズし、プライマーを標識ヌクレオチドで伸張する代わりに、ニックを二本鎖核酸分子に導入し、ニックをニックトランスレーションおよび標識ヌクレオチドを用いて伸張することが除かれる、請求項２１または２２に記載の方法。２４．本明細書に実質的に記載された発明。