JP6505608B2 - ゲルパターン化した表面 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年２月２６日出願の米国仮特許出願第６１／７６９２８９号および２０１３年３月６日出願の米国出願第１３／７８７３９６号の利益を主張する。上記の出願はいずれも、その全体を本明細書に参照として組み込む。

本開示は、一般的に、固相分析化学に関し、ゲノミクスのハイスループット解析向けの核酸アレイへの特定の適用性を有する。

ヒト遺伝的変異を分類し、この変異を病気に対する感受性と互いに関係づけるタスクは、ゲノム規模での配列決定法における進歩の恩恵を受ける立場にある。この分類の取り組みは、各人のゲノム中のマーカーの同定が期待でき、その人の疾患に対する感受性、処方薬などの具体的な療法に対する反応性、危険な薬の副作用およびその他の医学的に作用可能な特性に対する感受性を決定する上で医療専門家の助けとなるであろう。分類の取り組みは、かなり進歩してきている。これは主に、十分に高い費用対効果で、研究の場で評価する対象を検査することを可能にする、商用のゲノム解読法に起因する。分類の取り組みを加速するためにも配列決定法における改善が必要とされている。その上、比較的高価なシークエンシングは、技術が、研究センターを超えて医師が一般集団の患者の配列を得ることができる医院に移行するのを妨害している。

配列決定法およびそれを実施するために使用する系は、複雑な技法の集まりを活用する。実質的なコスト削減をもたらす改善が、これらの技法のいくつかで示されている。しかし、たとえあったとしても、どの技法がコスト削減につながる改善があるかを推定することは困難である。配列決定系における技法間の依存状態から判断して、どの技法が、手法または系の全体的性能に悪影響を与えずに、修正することができるかを推定することはさらにより困難である。そのため、ゲノミクス研究の可能性を、生命を改善し、多くの場合、救助することができる医院に移すことができる改善点を特定する必要がある。本発明は、この要望を満たし、関連の利点も同様に提供する。

本開示は、表面を有する固体支持体であって、該表面に複数のウェルがあり、該ウェルがゲル材料を含有し、該ウェルが表面上の間隙領域によって互いに分けられ、該間隙領域が各ウェルのゲル材料を他の複数のウェルのゲル材料から隔離する、固体支持体と、ゲル材料中の標的核酸のライブラリーであって、各ウェルのゲル材料がライブラリーの単一種の標的核酸を含む、ライブラリーとを含むアレイを提供する。

一部の実施形態において、基板をウェルのアレイとして配置し、検体は核酸である。これに応じて、本開示は、表面を有する固体支持体であって、該表面に複数のウェルがあり、該ウェルがゲル材料を含有し、該ウェルが表面上の間隙領域によって互いに分けられ、該間隙領域は各ウェルのゲル材料を他の複数のウェルのゲル材料から隔離する、固体支持体と、ゲル材料中の標的核酸のライブラリーであって、各ウェルのゲル材料がライブラリーの単一種の標的核酸を含む、ライブラリーとを含むアレイを提供する。

本開示はまた、基板を作製する方法も提供する。本方法は、（ａ）平面を有する固体支持体を設けるステップであって、該平面が１つ以上の凹状フィーチャーによって断続され、１つ以上の凹状フィーチャーが、平面上の１つ以上の間隙領域に隣接しているステップと、（ｂ）固体支持体の少なくとも一部をゲル材料でコーティングするステップであって、該一部が少なくとも１つの凹状フィーチャーおよび少なくとも１つの間隙領域を含むステップと、（ｃ）平面を研磨して、少なくとも１つの間隙領域からゲル材料を除去し、かつゲル材料を少なくとも１つの凹状フィーチャーに保持させるステップとを含むことができる。

アレイを作製する方法は、（ａ）複数のウェルを含む表面を有する固体支持体を設けるステップであって、該ウェルがゲル材料を含有し、該ウェルが表面上の間隙領域によって互いに分けられ、該間隙領域が各ウェルのゲル材料を他の複数のウェルのゲル材料から隔離するステップと、（ｂ）標的核酸のライブラリーを固体支持体のウェルに送達して、各ウェルのゲル材料に付着している単一種の標的核酸を有するウェルのアレイを作製するステップであって、アレイ中の異なるウェルがライブラリー由来の異なる標的核酸種を有するステップと、（ｃ）アレイのウェル中のゲル材料に付着している標的核酸を増幅して、アレイの各ウェルで個々の標的核酸のクローン集団を作製するステップとを含むことができる。

本開示はさらに、検体を検出する方法を提供する。本方法は、（ａ）平面を有する固体支持体を設けるステップであって、該平面が１つ以上の凹状フィーチャーによって断続され、該凹状フィーチャーがゲル材料を含有し、１つ以上の凹状フィーチャーが、平面上の１つ以上の間隙領域に隣接し、該間隙領域が実質的にゲル材料を含まず、該ゲル材料が標的検体に付着しているまたは標的検体を含有するステップと、（ｂ）標的検体が特異的にプローブと相互作用する条件下で、固体支持体をプローブに接触させるステップと、（ｃ）固体支持体を検出して、プローブの１つ以上と相互作用する標的検体の少なくともサブセットを識別するステップとを含むことができる。

特定の実施形態において、核酸が検出する検体であり、凹状フィーチャーはウェルである。例えば、核酸を検出する方法は、（ａ）表面および核酸ライブラリーを有する固体支持体を設けるステップであって、該表面が複数のウェルを有し、該ウェルがゲル材料を含有し、該ウェルが表面上の間隙領域によって互いに分けられ、該間隙領域が各ウェルのゲル材料を他の複数のウェルのゲル材料から隔離し、ライブラリーの単一種の標的核酸が、各ウェルのゲル材料に付着しているステップと、（ｂ）固体支持体を、標的核酸に結合した少なくとも１つのプローブに接触させるステップと、（ｃ）固体支持体を検出して、少なくとも１つのプローブに結合する標的核酸種を有するウェルを識別するステップとを含むことができる。

本開示の組成、装置、および方法は、ゲル材料に関連して本明細書中で実証されている。ゲル材料は、代表例であり、例えば、表面コーティングを形成することができ、それ自体が必ずしもゲルと見なされないポリマーなどの他の有機材料との置き換えが可能であることを理解されたい。分析方法または調製方法などにおいて作製したアレイを使用して、表面にゲル材料を適用し、間隙領域からゲル材料を除去し、検体をゲル材料に付着させる、本明細書に記載の方法は、ゲル材料を非ゲル材料と置き換えることによって容易に適応させることができる。

ＤＮＡフィーチャーのパターン化アレイを作製し、使用する方法であって、各フィーチャーが、ＤＮＡクラスターに付着しているゲル材料を有するウェルであり、アレイを配列決定法において使用する方法の図式を示す。 ウェル中にビーズの代わりにゲル材料を有するように変更したＢｅａｄＣｈｉｐ基板からの画像を示す。パネルＡ：研磨する前に得た明視野画像。パネルＢ〜Ｃ：研磨し、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼーションした後に得た蛍光画像。 パネルＡでは、フォトリソグラフィーおよびＣｒハードマスクを、反応性イオンエッチングと共に利用して、基板中に凹状フィーチャーを製造する概略的プロセスフローを示し、パネルＢでは、ガラス基板中のウェルおよび基準部分のＳＥＭ画像の例を示す。 パネルＣでは、ウエハーの画像、基準およびウェルのアレイを含むウエハーの一部の画像、ならびにウェルを含むアレイの一部からの画像を示す。 基板をＰＡＺＡＭでコーティングし、シリカビーズスラリーで研磨した後の、ナノウェル基板上のパターン化ゲルフィーチャーを示す、ナノウェル基板の高解像度蛍光顕微鏡画像を示す。視覚化するために、ＰＡＺＡＭは色素で標識する。 パターン化クラスターを有する１．５μｍピッチのナノウェル基板のＨｉＳｅｑ配列決定サイクルから得られる多色融合画像を示す。パネルＡ：４つのブルズアイ基準と並ぶゲル含有ウェル中のパターン化クラスターの範囲を示す画像。パネルＢ：単一のブルズアイ基準中の色の混合（アンプリコンの混合集団のため）を示す高解像度画像。 パネルＡでは、７５０ｎｍピッチのナノウェル基板で実施したＨｉｓｅｑ配列決定におけるパターン化クラスターの多色融合を示す パネルＢでは、アレイが配列し、クラスターが品質フィルターを通ることを示す最隣接曲線を示す。 パネルＣでは、１６０万個のクラスター／ｍｍ２の密度で品質フィルターを成功裏に通過したことを示すシークエンシング品質測定基準を示す。 曲線をポアソン分布とし、直線を理想のクローン性および占有率とし、×がゲル含有ナノウェルのパターンを有する基板を用いたシークエンシングから得られる平均尺度である、クローン率対占有率のグラフである。

本開示は、構造化基板、構造化基板を作製する方法、構造化基板を使用する方法を提供する。特定の実施形態では、基板は、ゲル材料を含有する（例えば、ゲル材料でコーティングされた）ウェルなどの凹状領域を有する固体支持体を含む。ゲル材料は、次いで、対象の検体、例えば核酸に付着させることができる。特定の実施形態では、ゲル含有領域は離散しており、対象の検体を付着する能力を欠く間隙領域によって分けられる。例えば、間隙領域は、ゲル材料を欠く場合がある。あるいは、間隙領域中のゲル材料が不活性であり得る、またはそうでなければ凹状領域中のゲル材料の活性もしくは特性、例えば検体付着を助ける能力がないように修正され得る。結果として生じるゲル領域の隔離は、検体への反応を行うときおよび／または検体を検出するとき、利点をもたらす。代表的な利点は、ゲル含有ウェルの内で分布する標的核酸のアレイの例で実証することができる。本明細書では、鋳型として核酸を使用して構造化基板上で増幅反応を実施して、ゲル中またはゲル上で成長する核酸コロニー（例えば、アレイの核酸フィーチャー）を形成することができる。間隙領域は、コロニーが成長する面積を限定する働きをする。得られたアレイの個々のフィーチャーは、ゲル含有ウェルによって作られた個別のパターンのために、相対的に容易に区別できる。パターンは、フィーチャーの密度を高め、核酸のランダムアレイと比較して画像レジストレーションの処理要件を減らす利点をももたらし得る。

核酸のパターン化アレイを作製する代表プロセスを図１に示す。ウェルパターン化基板の断面図を、図によって示す。例において、ウェルは１．５μｍのピッチ（中心間スペーシング）を有し、各ウェルの直径は０．５μｍである。ウェルパターン化基板は、材料がウェルに入り、間隙領域を被覆するように、ゲル材料でコーティングすることができる。結果として得られるゲルコーティング基板を研磨して、ウェル中にゲル材料を残したまま間隙領域からゲル材料を除去することにより、ゲルパターン化基板を形成することができる。ゲルは、ＤＮＡ鋳型の捕捉および鋳型の増幅を支持する働きをすることができる。例えば、表面コーティングの前、表面コーティングの後および研磨の前、または研磨の後に、ゲルをオリゴヌクレオチドプライマーでグラフト化することができる。プライマーは、ＤＮＡ鋳型を捕捉し、捕捉した鋳型を使用して主要な増幅のために機能することができる。得られるＤＮＡパターン化基板は、例えば配列決定法において分析することができる。

ゲル含有ウェル中の核酸のパターン化アレイは、ＤＮＡ配列決定法に複数の利点をもたらす。ランダムアレイ（すなわち、ランダムなフィーチャーパターンを有するアレイ）と比較したときの利点の例として、高密度のフィーチャーパッキン、濃度非依存性鋳型播種を利用したフィーチャー密度の向上した制御およびチューニング、削減された画像レジストレーションに要する処理、および容易化された信号抽出が挙げられる。各フィーチャーが与える核酸集団の空間的閉じ込めからさらなる利点がもたらされ得る。本開示のパターン化アレイのフィーチャーは、核酸コロニーが成長する（例えば、クラスターの増幅によって）面積または体積を制限する働きができる。面積または体積の制限なしに、いくつかの核酸コロニーは、他よりも大きなサイズに増幅し得るが、その理由は、その配列中のグアニンおよびシトシンのパーセント含有率（すなわちＧＣ含有率）の差異により、これは相対的な増幅率に影響する。本明細書に記載の方法および組成物の場合、個々のフィーチャーの体積または面積は、別の考え方として、増幅する鋳型種間のＧＣ含有率の差異が原因の増幅反応から生じると考えられる核酸コロニーのサイズの差異を防止または最小化するように選択することができる。例えば、フィーチャーの体積または面積は、最高速で成長するコロニーの成長を制限するのに十分小さくすることができ、その一方で、ゆっくり成長するコロニーが、増幅反応の完了時に効果的にフィーチャーを埋めるようにすることができる。

特定の実施形態では、本開示は、共有結合しているパターン化ゲル、例えばポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−コ−アクリルアミド）（ＰＡＺＡＭ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／７５３８３３号を参照）を有する、ガラス、シリコン、プラスチックまたはその他の好適な固体支持体上のウェル（例えばマイクロウェルまたはナノウェル）の製造を提供する。プロセスは、配列決定に使用されるゲルパッドを作製し、これは多数回のサイクルの配列決定を実施する間ずっと安定性であることができる。ポリマーのウェルへの共有結合は、様々に使用される中、構造化基板の寿命を通して、構造化フィーチャー中のゲルを保持するのに役立つ。しかし、多くの実施形態では、ゲルは必ずしもウェルに共有結合していなくてもよい。例えば、いくつかの条件下では、構造化基板のいかなる部分にも共有結合していないシラン非含有アクリルアミド（ＳＦＡ、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５号を参照）をゲル材料として使用してもよい。

特定の実施形態では、ウェル（例えばマイクロウェルまたはナノウェル）を有する固体支持材料をパターン化し、パターン化支持体をゲル材料（例えばＰＡＺＡＭ、ＳＦＡまたはこれらの化学的に修飾した変異体、例えばＳＦＡのアジド化タイプ（ａｚｉｄｏｌｙｚｅｄ ｖｅｒｓｉｏｎ）（アジド−ＳＦＡ））でコーティングし、ゲルコーティング支持体を、例えば化学的または機械的に研磨することによって研磨し、これによりウェル中にゲルを保持しながら、ウェル間の構造化基板の表面上の間隙領域から実質的にすべてのゲルを除去または不活性化することによって、構造化基板を作製することができる。プライマー核酸をゲル材料に付着させることができる。次いで、標的核酸（例えば断片化したヒトゲノム）の溶液を、研磨した基板と接触させることができ、その結果、個々の標的核酸が、ゲル材料に付着しているプライマーと相互作用することによって個々のウェルに播種するが、間隙領域はゲル材料が不在または不活性であるため、標的核酸が間隙領域を占めることはない。間隙領域のゲルが不在または不活性であることにより、成長した核酸コロニーの外への移動が防止されるため、標的核酸の増幅はウェルの範囲内にとどめられるであろう。本プロセスは、好都合に製造可能であり、拡張可能であり、従来のマイクロまたはナノ加工法を利用する。

特定の実施形態では、基準マーカーは、個々のフィーチャー（例えばウェルまたはその他のゲル含有凹状フィーチャー）の同定および局在化のために構造化基板に含まれる。基準マーカーは、他のフィーチャーの相対的位置のための基準点を与えるので、基準マーカーは、空間的に整列されたパターンのフィーチャーを有する構造化基板に特に有用である。基準マーカーは、ランダムアレイの画像のレジストレーションにも使用できるが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．社（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ州）製のＨｉＳｅｑ、Ｇｅｎｏｍｅ ＡｎａｌｙｚｅｒまたはＭｉＳｅｑプラットフォームなどの市販の配列プラットフォーム上で生じるランダムアレイで使用する場合、代わりに固有のクラスターの乱れを使用してもよい。基準マーカーは、構造化基板を繰り返し検出して、個々フィーチャーで経時的に起こる変化を追跡する応用例にとりわけ有益である。基準マーカーは、複数の配列決定サイクルを通して得た連続画像によって個々の核酸クラスターの追跡を可能にし、その結果、個々のクラスターの配列を個別に決定することができる。

本開示は、凹状領域および間隙領域のパターンを有する基準マーカーを提供する。基準マーカーの代表的な設計は、以下：凹リング、間隙リングおよびウェルまたは他の凹状フィーチャー（例えば「ブルズアイ」）のリングのうち２つ以上の代替パターンを有する同心円のセットである。一部の実施形態では、基準マーカーの凹状領域はゲル材料を含有し、一方で間隙領域は含有していない。この表面上のゲルの特異的な位置は、本明細書に記載のゲルコーティング法および研磨法を使用して実現できる。典型的には、ゲル含有領域を間隙領域から区別できる検出法を使用する。一部の例では、識別は、間隙領域では存在しないゲル領域中の特定の検体の存在に基づくものでもよい。例えば、核酸アレイの場合、基準マーカーのゲル含有領域は、アレイ上の標的核酸を標識化するために使用するものと同じ方法によって標識化される核酸を含有することができる。したがって、基準マーカーは、検体フィーチャーを製造するために使用したものと同じ方法を使用して好都合に製造することができる。これに応じて、必要であれば、基準マーカーおよび検体フィーチャーを１つ以上のステップを経て同時に製造してもよい。本明細書に記載の構造化基板および方法において使用できる別の有用な基準マーカーは、サブ領域を有するものであり、１つのサブ領域中のウェル（または他の凹状フィーチャー）のパターンが、別のサブ領域中のパターンを基準にして回転するものである。このような基準格子は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／２６７５６５号に記載されるような画像レジストレーション向けに設定および使用することができる。

さらなる例として、ビーズを基準として使用してもよい。ビーズは、フルオロフォアなどの標識を含むことができる。この場合、表面には少なくとも２種類のウェル（または他の凹状フィーチャー）を有し得る。相対的に大きなウェルは、１つ以上の基準ビーズを収容でき、一方で小さいウェルはビーズを含有するのは小さ過ぎていて、ゲル材料のみ含有する。したがって、小さい方のウェルは分析のための分析フィーチャーとして働き、より大きい、ビーズが充填されたウェルは基準として働く。ウェルの代替として、基準フィーチャーが、上記に例示したブルズアイの構成に存在するようなチャンネルであってもよく、該チャンネルはビーズを収容する寸法を有することができる。そういうものとして、いくつかのビーズがチャンネル中に位置して、例えば、はっきりとした一連のビーズの形状の基準を作製することができる。

パターン化アレイ、その製造方法およびその使用方法が、対象の検体に付着するように使用されるゲル材料に関連して、本明細書において実証されている。ゲル材料は、典型的なものであり、検体の表面上のフィーチャーへの局所化を介在するように使用できる他の有機材料と置き換えてもよいことを理解されたい。このような有機材料は、例えば、表面コーティングを形成することができ、それ自体が必ずしもゲルとは見なさなくてもよいポリマーを含む。具体例は、ＡＴＲＰ（原子移動ラジカル重合）法または表面開始重合法によって形成されるポリマーである。分析法または調製法などで得られるアレイを使用して、ゲル材料を表面に適用し、間隙領域からゲル材料を除去する、本明細書に記載の方法は、非ゲル材料の使用にも容易に適合させることができる。

本明細書で使用する用語は、別段指定されない限り、関連技術における普通の意味でとらえられると理解されたい。本明細書で使用されるいくつかの用語およびそれらの意味を以下に記載する。

本明細書では、「付着した」という用語は、２つのものが互いにつながる、固定される、接着する、接続する、または結合する状態を意味する。例えば、核酸などの検体は、共有結合または非共有結合によって、ゲルまたは固体支持体などの材料に付着することができる。共有結合は、原子間の電子対の共有を特徴とする。非共有結合は、電子対の共有を必要としない化学結合であり、例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、親水性相互作用および疎水性相互作用を挙げることができる。

本明細書では、「クローン集団」という用語は、特定のヌクレオチド配列に対して均一な核酸の集団を意味する。均一な配列は通常、少なくとも１０ヌクレオチド長であるが、さらに長いこともあり、例えば、少なくとも５０、１００、２５０、５００、１０００または２５００ヌクレオチド長を含む。クローン集団は、単一の標的核酸または鋳型核酸に由来したものでもよい。クローン集団は、標的ヌクレオチド配列のコピーを少なくとも２、５、１０、１００、１０００以上含んでもよい。コピーは、例えばコンカテマーとして、単一の核酸分子中に存在していてもよく、またはコピーは、単独の核酸分子上に存在していてもよい（すなわち、クローン集団は、同じ標的ヌクレオチド配列を有する核酸分子を少なくとも２、５、１０、１００、１０００個以上含むことができる）。典型的には、クローン集団中のすべての核酸が同じヌクレオチド配列を有することになる。クローン性から逸脱することなく、ごく僅かな数の不純核酸または突然変異体（例えば、増幅人工産物（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｒｔｉｆａｃｔｓ）が原因）がクローン集団中で生じ得ることを理解されたい。したがって、集団は、少なくとも８０％、９０％、９５％または９９％のクローンであり得る。一部の例では、１００％純粋なクローン集団が存在することもある。

本明細書では、「コーティング」という用語は、動詞として用いる場合、表面上に層または被覆物を付与することを意味するよう意図されている。少なくとも表面の一部は、層または被覆物を備えていてもよい。一部の例では、全表面が、層または被覆物を備えていてもよい。代替の例では、表面の一部のみが層または被覆物を備えることになる。「コーティング」という用語は、表面および材料間の関係を説明するために使用される場合、材料が表面上に層または被覆物として存在することを意味するよう意図されている。材料は、表面を封止していてもよく、例えば、液体またはガスが表面に接触するのを防止する。しかし、材料は必ずしもシールを形成しなくてもよい。例えば、材料は、液体、ガス、または液体もしくはガス中に担持される１種以上の成分に対して浸透性であってもよい。表面をコーティングできる典型的な材料として、これらに限定されないが、ゲル、ポリマー、有機ポリマー、液体、金属、第２の表面、プラスチック、シリカ、またはガスが挙げられる。

本明細書では、「凹状フィーチャー」という用語は、固体支持体に関連して用いられる場合、固体支持体中の窪みまたは圧痕を意味する。典型的な凹状フィーチャーとして、これらに限定されないが、ウェル、ピッチ、孔、へこみ、チャンネル、またはトラフが挙げられる。凹状フィーチャーは、任意選択により曲断面（固体支持体の表面と直交する寸法）を有することがあるが、１つ以上の線形断面、角または隅部を有する横断面も可能である。曲断面および線形断面の組み合わせを有する横断面も可能である。一般的には、凹状フィーチャーは必ずしも完全に固体支持体を通過していなくてもよく、むしろ例えば、基板中で底面または底部を有する。

本明細書では、「異なる」という用語は、核酸に関連して用いられる場合、核酸が、互いに同じではないヌクレオチド配列を有することを意味する。２つ以上の核酸は、それらの全長の中で異なるヌクレオチド配列を有することができる。あるいは、２つ以上の核酸は、それらの長さの本質的部分の中で異なるヌクレオチド配列を有することができる。例えば、２つ以上の核酸は、２つ以上の分子で異なる標的ヌクレオチド配列部分を有するが、一方、２つ以上分子で同じ普遍的配列部分をも有することができる。

本明細書では、「各」という用語は、項目のコレクションに関連して用いられる場合、コレクション中の個々の項目を特定することを意図するが、必ずしもコレクション中の全項目を指すわけではない。明確な開示または文脈が別段はっきりと指示していれば、例外もあり得る。

本明細書では、「流体アクセス（ｆｌｕｉｄｉｃ ａｃｃｅｓｓ）」という用語は、流体中の分子および流体に接触する位置に関連して用いられる場合、分子が流体の中にまたは流体を通って移動して、その位置に接触するまたは入る能力を指す。この用語は、分子がその位置から分かれるまたはその位置から出ていき、溶液に入る能力をも指すことができる。流体アクセスは、分子がその位置に入り、その位置と接触し、その位置から分かれ、かつ／またはその位置を出るのを防止するバリアがないときに生じ得る。しかし、流体アクセスが絶対的に防止されていない限り、拡散が停滞、低減または変更したとしても、流体アクセスは存在すると理解される。

本明細書では、「ゲル材料」という用語は、液体およびガスに浸透性の半剛性材料を意味するよう意図されている。通常、ゲル材料は、液体が取り込まれるときには膨張し、乾燥によって液体が除去されるときには収縮し得る。典型的なゲルには、これらに限定されないが、アガロースなどのコロイド構造、ゼラチンなどのポリマーメッシュ構造、またはポリアクリルアミド、ＳＦＡ（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５号を参照）もしくはＰＡＺＡＭ（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／７５３８３３号を参照）などの架橋ポリマー構造を有するものが挙げられる。特に有用なゲル材料は、それがあるウェルまたは他の凹状フィーチャーの形状に合う。一部の有用なゲル材料は、（ａ）それがあるウェルまたは他の凹状フィーチャーの形状に適合でき、また（ｂ）それがあるウェルまたは凹状フィーチャーの体積を実質的に超えない体積を有することもできる。

本明細書では、「間隙領域」という用語は、基板または表面の他の面積を分離する基板中または表面上の面積を指す。例えば、間隙領域は、アレイの一凹状フィーチャーを、アレイの別の凹状フィーチャーから分離することができる。互いに分離する２つの領域は、離散し得、互いに接触がない。別の例では、間隙領域は、第１のフィーチャー部分を、第２のフィーチャー部分から分離することができる。多くの実施形態では、間隙領域は連続的である一方で、例えば、別に連続する表面内のウェルのアレイの場合のように、各フィーチャーは離散している。間隙領域によってもたらされる分離は、一部の分離でも完全な分離でもよい。間隙領域は、通常、表面上のフィーチャーの表面物質とは異なる表面物質を有するであろう。例えば、アレイのフィーチャーは、間隙領域で存在する量または濃度を超える量または濃度のゲル材料または検体を有することができる。一部の実施形態では、ゲル材料または検体は間隙領域に存在しなくてもよい。

本明細書では、「ライブラリー」という用語は、検体に関連して用いられる場合、異なる化学組成を有する検体のコレクションを意味する。典型的には、ライブラリー中の検体は、属またはクラスの共通の特徴または特性を有するが、別の部分で何らか異なっている、異なる種であろう。例えば、ライブラリーは、ヌクレオチド配列が異なるが、糖−リン酸の骨格を有する面では類似している核酸種を含むことができる。

本明細書では、「核酸」および「ヌクレオチド」の用語は、当技術分野におけるこれらの使用と一致し、天然起源の種またはその機能的類似体を含むよう意図されている。特に有用な核酸の機能的類似体は、配列特異的なやり方で核酸にハイブリダイズすることができる、または特定のヌクレオチド配列の複製のための鋳型として使用することができる。天然起源の核酸は、一般的に、リン酸ジエステル結合を含有する骨格を有する。類似体構造は、当技術分野で公知のもののいずれかを有する代替の骨格連結を有することができる。天然起源の核酸は、一般的に、デオキシリボース糖（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中にあるもの）またはリボース糖（例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）中にあるもの）を有する。核酸は、当技術分野で公知のこれらの糖部分の種々の類似体のいずれかを有するヌクレオチドを含有することができる。核酸は、天然または非天然のヌクレオチドを含むことができる。これに関連し、天然デオキシリボ核酸は、アデニン、チミン、シトシンまたはグアニンからなる群から選択される１種以上の塩基を有することができ、リボ核酸は、ウラシル、アデニン、シトシンまたはグアニンからなる群から選択される１種以上の塩基を有することができる。核酸またはヌクレオチドに含まれ得る有用な非天然の塩基は、当技術分野で知られている。「プローブ」または「標的」の用語は、核酸に関連して用いられる場合、本明細書に記載の方法または組成との関連で、核酸の意味識別子（ｓｅｍａｎｔｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ）を意図し、核酸の構造または機能を、必ずしも別段明確に指示するものを超えて限定しなくてもよい。「プローブ」および「標的」の用語は、タンパク質、小分子、細胞などの他の検体にも同様に適用することができる。

本明細書では、「ランダムパターン」という用語は、表面上のウェルに関連して用いられる場合、表面の一領域中のウェルのサブセットの相対的位置が知られていない、または表面の別の領域中のウェルのサブセットの位置から予測不可能であることを意味する。測定法に使用されるサブセットは、一般的に、少なくとも３個のウェルを含むが、少なくとも４、５、６、１０個以上のウェルを含むことができる。ランダムパターンは、一般的に、任意のサブパターンの多重反復を含まない。この用語は、ウェルの他に別の凹状フィーチャーに適用できる。

本明細書では、「繰り返しパターン」という用語は、表面上のウェルに関連して用いられる場合、表面の一領域中のウェルのサブセットの相対的位置が、表面の少なくとも１つの他の領域中のウェルのサブセットの相対的位置と同じであることを意味する。したがって、繰り返しパターンの１つの領域中のウェルの相対的位置は、一般的に、繰り返しパターンの別の領域中のウェルの相対的位置から予測可能である。測定法に使用されるサブセットは、一般的に、少なくとも３個のウェルを含むが、少なくとも４、５、６、１０個以上のウェルを含むことができるであろう。代表的な繰り返しパターンは、直線パターンおよび六角形パターンを含む。繰り返しパターンは、サブパターンの多重反復を含んでもよい。この用語は、ウェルの他に別の凹状フィーチャーに適用できる。

本明細書では、「隔離」という用語は、２つのウェル（または２つの他のフィーチャー）中のゲル材料に関連して用いられる場合、ウェルの１つ（またはフィーチャーの１つ）の中のゲル材料を、他のウェル（または他のフィーチャー）中のゲル材料から分離または単離することを意味する。したがって、第１のウェル（または第１のフィーチャー）中のゲル材料は、他のウェル（または他のフィーチャー）中のゲル材料と直接接触しない。一部の実施形態では、２つのウェル（または２つのフィーチャー）中のゲル材料は、例えば、２つのウェル（またはフィーチャー）に接触する溶液を介して、間接的に接触する。あるいは、２つのウェル（または２つのフィーチャー）中のゲル材料は、間接的な接触ですらしていない。表面上の間隙領域は、ゲル材料を有さないことによって、２つのウェル（または２つのフィーチャー）中のゲル材料を隔離することができる。特定の実施形態では、ゲル材料は、表面上で不連続的であってもよく、ウェルなどの凹状フィーチャーに存在するが、各フィーチャー間の間隙領域には存在しない。

本明細書では、「表面」という用語は、固体支持体またはゲル材料の外部または外層を意味するよう意図されている。表面は、ガス、液体、ゲル、ポリマー、有機ポリマー、類似のもしくは異なる材料の第２の表面、金属、またはコートなどの別の材料と接触させてもよい。表面またはその領域は、実質的に平らであってもよい。表面は、ウェル、ピッチ、チャンネル、隆起部、盛り上がった領域、ペグ、ポストなどの表面フィーチャーを有していてもよい。

本明細書では、「単一種」という用語は、実質的に１つの、また１種のみの特定の属を意味する。この用語は、存在する単一種を表す数を制限するものとは必ずしも意図しない。例えば、それぞれが同じヌクレオチド配列を有する核酸分子の集団は、単一種の核酸を含む。これに関連する「単一の」という用語は、関連の属の範囲内にない他のものの存在を除外することを意図するものではない。例えば、ライブラリーからの単一種の標的核酸を含有するウェルは、同じ配列を有する複数の核酸を含んでもよく、ライブラリーからの他の標的核酸を除外するが、他の任意の非核酸成分は必ずしも除外しないであろう。明確な単一種の集団が、当業者が集団の特定用途向けには無視できるレベルの不純物または人工物と考えるレベルで存在する少量の別の種を有することができることを理解されたい。例えば、第１の配列を有する単一の鋳型に由来する核酸クラスターは、第１の配列を検出した際に、第２の配列を有する任意の核酸分子の量が検出不可であるまたは無視されるほど十分に低い場合、明らかに単一種有するものと考えられるであろう。あるいは、絶対的に単一種の集団は、１つ、また１種のみ有するであろう。

本明細書では、「固体支持体」という用語は、水性液体に不溶性の高剛性の物質を指す。基板は無孔であっても多孔質であってもよい。基板は、任意選択により、液体を取り込むことができる（例えば多孔性のため）が、通常は、基板が、液体を取り込む際に実質的に膨張せず、乾燥によって液体が除去される際に実質的に収縮することがないほど十分に剛性であろう。無孔の固体支持体は、概して、液体またはガスに対して不浸透性である。固体支持体は、任意選択により、ゲルを修飾するために用いられる化学反応に対し不活性であってもよい。例えば、固体支持体は、本明細書に記載の方法において核酸などの検体をゲルに付着させるために用いる化学反応に対して不活性であってもよい。代表的な固体支持体として、これらに限定されないが、ガラスおよび変性または機能性ガラス、プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレンならびにスチレンと他の材料、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、環状オレフィン、ポリイミドなどとのコポリマーなど）、ナイロン、セラミック、樹脂、Ｚｅｏｎｏａ、シリコンおよび変性シリコンなどのシリカまたはシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、光ファイバー束、ならびにポリマーが挙げられる。一部の実施形態に特に有用な固体支持体は、フローセル装置内部に配置される。代表的なフローセルを、以下でさらに詳細に記述する。

本明細書では、「ウェル」という用語は、表面の間隙領域で完全に囲まれた表面開口部を有する固体支持体中の離散した凹状フィーチャーを指す。ウェルは、表面中のその開口部に様々な形状のうちいずれかを有することができ、これらに限定されないが、円形、楕円形、正方形、多角形、星形（任意の数の頂点を有する）などが挙げられる。表面に直交して見たウェルの横断面は、曲線、正方形、多角形、双曲線、円錐形、角などがあってもよい。

以下に記載し、特許請求の範囲で列挙する実施形態は、上記の定義を考慮して理解することができる。

本開示は、表面を有する固体支持体を含む基板を提供するものであり、該表面は、少なくとも１つの凹状フィーチャーを有し、該少なくとも１つの凹状フィーチャーはゲル材料を含有し、該少なくとも１つの凹状フィーチャーは、表面上の少なくとも１つの間隙領域に隣接し、また本開示は、ゲル材料中の検体ライブラリーを提供するものであり、各ウェル中のゲル材料は、ライブラリーの検体を単一種含む。

一部の実施形態では、基板はウェルのアレイとして構成され、検体は核酸である。これに応じて、本開示は、表面を有する固体支持体を含むアレイを提供し、該表面は、複数のウェルを有し、該ウェルは、ゲル材料を含有し、該ウェルは、表面上の間隙領域によって互いに分離され、該間隙領域は、各ウェル中のゲル材料を他の複数のウェル中のゲル材料から隔離するものであり、また本開示は、ゲル材料中の標的核酸のライブラリーを提供するが、各ウェル中のゲル材料は、ライブラリーの標的核酸を単一種含む。

本明細書に記載の構造化基板中で使用される固体支持体は、本明細書に記載の、例えば、上記の定義、下記の実施例またはすぐ後に記述する様々な材料のうちいずれかで作製され得る。特に有用な材料はガラスである。その他の好適な基板材料は、ポリマー材料、プラスチック、シリコン、石英（溶融シリカ）、ボロフロートガラス、シリカ、シリカ系材料、炭素、金属、光ファイバーまたは光ファイバー束、サファイア、またはＣＯＣおよびエポキシ樹脂などのプラスチック材料を含むことができる。特定の材料を、特定の使用に望まれる特性に基づいて選択することができる。例えば、所望の波長の放射線に透明な材料は、所望の波長の放射線を利用する分析法、例えば本明細書に記載の１つ以上の技法に有用である。反対に、特定の波長の放射線を通過しない（例えば不透明、吸収性または反射性である）材料を選択することが望ましいこともある。これは、本明細書に記載の方法など、構造化基板の製造中に使用する、または本明細書に記載のものなど、構造化基板を使用して実施する化学反応もしくは分析的検出に使用する、マスクの形成に有用であり得る。活用できる材料の他の特性は、本明細書に記載のものなど、下流プロセスにおいて使用する特定の試薬に対する不活性もしくは反応性であり、または本明細書に記載のものなど、製造工程中の操作の容易さもしくは低コストである。本開示の構造化基板または方法において使用できる材料のさらなる例は、参照により本明細書にそれぞれ組み込まれる米国特許出願第１３／６６１５２４号および米国特許出願第２０１２／０３１６０８６号に記載されている。

特定の実施形態では、ゾル−ゲルベースの基板を作製し、使用することができる。ゾル−ゲルベースのパターン成形は、例えば、スピンコーティング、ディッピングまたは吹き付けコーティングによって、ガラス、シリコン、プラスチック、金属などの剛性または可撓性基板をゾル−ゲルコーティング剤でコーティングすることによって実現できる。ゾル−ゲルは、基板に適用されるときに液体状態で供給され得、ゾル−ゲルを光または熱に晒すことによって硬化することができる（液体をゲルにすることができる）光開始剤または熱開始剤のいずれかを含有することができる。基板をゾル−ゲルでコーティングした後に続いて、材料を硬化する前、ゾル−ゲルを、単一または複数の隆起型フィーチャーを有する鋳型（三次元のスタンプ）で刻印付けすることができる。鋳型は、例えば、シリコン、ガラス（石英など）、金属（ニッケルなど）、プラスチックまたはポリマー（ＰＤＭＳなど）で作製されているものでよい。ゾル−ゲルへのスタンプの刻印付けは、鋳型をゾル−ゲルと接触するように配置することによって実現できる。鋳型がゾル−ゲルと接触すると、ゾル−ゲルは、再分配して、等角的に鋳型の構造を囲む。鋳型がゾル−ゲルと接触すると、外力が鋳型または基板にかかることによって、またはパターン化鋳型の性質に固有の毛管力によって、ゾル−ゲルの再分配が促進され得る。鋳型がゾル−ゲルと接触すると、基板＋ゾル−ゲル＋鋳型のスタックが光または熱に曝露されてゾル−ゲルを硬化し、元々鋳型中にあったパターンをゾル−ゲル中に固定できる。このパターン成形法は、従来より、ナノインプリントリソグラフィーと呼ばれている。ゾル−ゲルの硬化後、鋳型は、基板＋ゾル−ゲルのスタックから分離でき、この鋳型は廃棄してもよいが、別の未硬化ゾル−ゲルでコーティングした基板をパターン化成形するために再利用してもよい。硬化済みのパターン化ゾル−ゲルを有する基板は、次いで化学蒸着法にかけることができる、または純ガラス様の表面が望まれる場合は、基板＋パターン化ゾル−ゲルのスタックを、ゾル−ゲル中に元々存在していた有機材料を除去する熱工程（焼結）にかけることができる。これは必要条件ではないが、基板を特定の化学的付加スキームにおいてメリットのある純ＳｉＯ_２材料にすることができる。

パターン化基板を製造する別の手法は、ＣＯＣまたはＣＯＰ（ＺｅｏｎｏｒまたはＴｏｐａｓなど）などのプラスチック材料を使用し、熱エンボス加工を実施して圧痕アレイを作るものである。この方法は、ナノインプリントリソグラフィーに似ている。プラスチックの基板を、温度制御できるチャックの上にマウントしてもよい。次いで、プラスチック基板を、プラスチックの外板がガラス転移温度を上回る温度まで加熱することができる。基板が高温にある間、鋳型を鋳型（例えば、石英、シリコン、ポリマーの、または金属のもの）と密接させる。鋳型は、典型的には、プラスチックが等角的に構造化鋳型をコーティングすることを確実にするために、外力が加えられる。高温で接触する間、プラスチックはそれ自体が再分配し、鋳型のネガティブレプリカとなり、例えば鋳型がポストアレイを有すると、エンボス加工したプラスチックはウェルのアレイになる。鋳型がプラスチック基板と接触する間、基板の温度は低減し、したがってエンボス加工したパターンが基板中に固定される。

基板上にある凹状フィーチャーは、様々な形状のうちいずれかを有することができる。基板上の形状の観点から、フィーチャーは、湾曲側面、線状側面、隅部またはこれらの組み合わせを有することができる。例えば、フィーチャーは、円形、楕円形、正方形、多角形、星形（任意の数の頂点を有する）、または不規則な形状の開口部を表面に有するウェルであってもよい。フィーチャーは、チャンネルであってもよく、表面上のチャンネルの形状は、湾曲、線状、角のある、またはこれらの組み合わせの側面を含むことができる。その他のチャンネルフィーチャーは、線状、ヘビ状、長方形、正方形、三角形、円形、楕円形、双曲線状、またはこれらの組み合わせであることができる。チャンネルは、１つ以上の分岐または隅部を有することができる。チャンネルは、表面上の２点をつなぐことができ、その片方がまたは両方ともが基板の端部であってもよい。図３Ｂおよび図３Ｃは、ブルズアイ基準の範囲内およびその周囲のウェルと共に、ブルズアイ基準中の代表的なチャンネルフィーチャーを示す。

表面に直交して見た凹状フィーチャーの横断面の形状は、湾曲、線状、またはこの２つの組み合わせの壁を有していてもよい。したがって、横断面の形状は、円形もしくは楕円形の一部（例えばＵ字形）であってもよく、または隅部で合わさる２つ以上の線状側面（例えば、Ｖ字形、正方形、多角形、または星形）を有していてもよい。横断面の形状の観点から、凹状フィーチャーの底部は狭くなっていても、広がっていても、表面上の開口部と概ね同じでもよい。これらの横断面の形状を、凹状フィーチャーがウェルであり、ウェルが円筒断面を有するとき、表面にある開口部がウェルの底部と概して同じ面積であり、一方でウェルが円錐断面を有するとき、ウェルの底部が、表面上の開口部の面積とは異なる（通常は小さくなる）場合について説明することができる。当然ながら、横断面は、ウェルについて説明したが、チャンネルにも該当し得る。

凹状フィーチャーがウェルを形成する実施形態では、各ウェルは、液体を閉じ込めることができる任意の体積を有することができる。最小または最大の体積は、例えば、基板の下流使用に適した、スループット（例えば、多重度）、解像度、検体組成、または検体反応性に対応するように選択することができる。例えば、体積は、少なくとも１×１０^−３μｍ^３、１×１０^−２μｍ^３、０．１μｍ^３、１μｍ^３、１０μｍ^３、１００μｍ^３以上でよい。あるいは、または追加的には、この体積は、最大１×１０^４μｍ^３、１×１０^３μｍ^３、１００μｍ^３、１０μｍ^３、１μｍ^３、０．１μｍ^３以下でもよい。ゲル材料は、全体積または一部の体積のウェルを満たすことができることを理解されたい。個々のウェル中のゲルの体積は、上記で指定した値より大きくても、小さくても、またはこれらの値の間であってもよい。

表面上の各ウェル開口部が占める面積は、ウェル体積に対する上記のものと同様の基準に基づいて選択してもよい。例えば、表面上の各ウェル開口部の面積は、少なくとも１×１０^−３μｍ^２、１×１０^−２μｍ^２、０．１μｍ^２、１μｍ^２、１０μｍ^２、１００μｍ^２以上でよい。あるいは、または追加的には、この面積は、最大１×１０^３μｍ^２、１００μｍ^２、１０μｍ^２、１μｍ^２、０．１μｍ^２、１×１０^−２μｍ^２以下でもよい。各ウェルの深さは、少なくとも０．１μｍ、１μｍ、１０μｍ、１００μｍ以上でもよい。あるいは、または追加的には、この深さは、最大１×１０^３μｍ、１００μｍ、１０μｍ、１μｍ、０．１μｍ以下でもよい。

規則的パターン、繰り返しパターン、および不規則的パターンなど、多くの異なるウェルまたは他の凹状フィーチャーのレイアウトが想定され得る。例えば、ウェルは、最密充填および密度の改善のために六角格子中に配置してもよい。その他のレイアウトには、例えば、直線（すなわち長方形の）レイアウト、三角形レイアウトなどを挙げることができる。特定のレイアウト、およびドメインの異なる（使用する場合）レイアウト間の差異は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７８１３０１３号および／または米国特許出願第１３／２６７５６５号の各教示に従ったものでもよい。様々な結晶パターンまたは非結晶パターンのいずれかが有用となり得る。

ウェルのパターンは、ウェルの平均ピッチ（すなわち中心間のスペーシング）の観点で特徴付けることができる。パターンは、平均ピッチ前後の変動係数が小さくなるように規則的であってもよく、またはパターンは、変動係数が相対的に大きくなる不規則なものであってもよい。どちらの場合でも、平均ピッチは、例えば、少なくとも１０ｎｍ、０．１μｍ、０．５μｍ、１μｍ、５μｍ、１０μｍ、１００μｍ以上であってもよい。あるいは、または追加的には、平均ピッチは、例えば、最大１００μｍ、１０μｍ、５μｍ、１μｍ、０．５μｍ、０．１μｍ以下でもよい。当然ながら、ウェルの特定のパターンでの平均ピッチは、上記の範囲から選択される最小値の１つと最大値の１つとの間であってもよい。

また、ウェルのパターンは、画定された面積内のウェルの密度（すなわちウェルの数）を基準にして特徴付けることもできる。例えば、ウェルは、約２百万／ｍｍ^２の密度で存在してもよい。本明細書に記載の製造方法によれば、密度は、例えば少なくとも１００／ｍｍ^２、１０００／ｍｍ^２、１０００００／ｍｍ^２、１００００００／ｍｍ^２、２００００００／ｍｍ^２、５００００００／ｍｍ^２以上の密度など、異なる密度に容易に調整できる。あるいは、または追加的には、この密度は、５００００００／ｍｍ^２以下、２００００００／ｍｍ^２、１００００００／ｍｍ^２、１０００００／ｍｍ^２、１０００／ｍｍ^２、１００／ｍｍ^２以下に調整してもよい。当然ながら、基板上のウェルの密度は、上記の範囲から選択される最小値の１つと最大値の１つとの間であってもよい。

特定の実施形態では、ゲル材料を使用する。一部の例では、ゲル形成（例えば重合性）材料を液体状態の固体支持体に供給し、次いでゲルに変換される。重合性材料の例として、これらに限定されないが、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−ビニルピロリジノンまたはこれらの誘導体が挙げられる。このような材料は、ヒドロゲルを調製する上で有用である。一部の実施形態では、重合性材料は、コポリマーを形成する２つ以上の異なる種の化合物を含むことができる。例えば、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシエチルメタクリレート、Ｎ−ビニルピロリジノンまたはこれらの誘導体のうち２つ以上の異なる種は、重合によりコポリマーヒドロゲルを形成するコモノマーとして機能することができる。有用なヒドロゲルは、これらに限定されないが、シラン非含有アクリルアミド（ＳＦＡ）ポリマー（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５号を参照）、ポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−コ−アクリルアミド）（ＰＡＺＡＭ、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／７５３８３３号を参照）、例えば、ＷＯ００／３１１４８（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のアクリルアミドおよびアクリル酸もしくはビニル基を含有するアクリル酸から形成されるポリアクリルアミドポリマー、例えば、ＷＯ０１／０１１４３もしくはＷＯ０３／０１４３９２（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に記載の、［２＋２］光付加環化反応を形成するモノマーから形成されるポリアクリルアミドポリマー、または米国特許第６４６５１７８号、ＷＯ０１／６２９８２もしくはＷＯ００／５３８１２（それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に記載のポリアクリルアミドコポリマーを含む。これらのゲル材料の化学的に処理した変異体、例えば対応する反応性基を有するオリゴヌクレオチドと反応させた化学的に処理したＳＦＡ（例えば５’−または３’−アルキニル修飾オリゴヌクレオチドと反応するアジド−ＳＦＡを生成するＳＦＡのアジドリシス）も有用である。代表的なヒドロゲルおよびヒドロゲルを形成するために使用できる重合性材料は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／７５３８３３号または米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５号に記載されている。その他の有用なゲルは、液体からゼラチン状への温度依存性変化によって形成されるものである。例えば、これらに限定されないが、寒天、アガロース、またはゼラチンが挙げられる。

構造化基板の表面上のウェルまたは他の凹状フィーチャー中にあるゲル材料は、表面に共有結合することができる。例えば、ＰＡＺＡＭは、表面物質および参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／７５３８３３号および本明細書の実施例の項に記載の他の試薬を使用して表面に共有結合することができる。しかし、ゲル材料は、以下の実施例の項のＳＦＡについて実証されるように、ウェルまたは他の凹状フィーチャーに必ずしも共有結合しなくてもよい。

１種以上の検体が、構造化基板上に存在するゲル材料の中またはその上に存在していてもよい。本開示のゲル含有基板は、検体の検出または検体との合成反応の実施に特に有用である。したがって、検出、特徴付け、修飾、合成などが実施される様々な任意の検体が、本明細書に記載の基板のゲル材料中またはゲル材料上に存在することができる。代表的な検体には、これらに限定されないが、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらの類似体）、タンパク質、多糖、細胞、抗体、エピトープ、レセプター、リガンド、酵素（例えばキナーゼ、ホスファターゼまたはポリメラーゼ）、小分子薬剤候補などが挙げられる。構造化基板は、検体のライブラリーからの複数の異なる種を含むことができる。例えば、種は、抗体ライブラリーからの種々の抗体、核酸のライブラリーからの異なる配列を有する核酸、タンパク質のライブラリーからの異なる構造および／または機能を有するタンパク質、小分子などの組み合わせライブラリーからの薬剤候補であってもよい。

一部の実施形態では、検体は、個別に溶解できるように、構造化基板上に分配することができる。例えば、各検体の単一分子は、構造化基板の各ゲル含有ウェル中に存在することができる。あるいは、検体は、コロニーまたは集団として存在し得、その結果、個々の分子は必ずしも溶解されない。コロニーまたは集団は、（複数のコピーだが）単一種のみの検体の含有に対して均一であることができる。核酸を例にすると、構造化基板上の各ウェルは、核酸のコロニーまたは集団を含むことができ、コロニーまたは集団中の核酸はすべて、同じヌクレオチド配列（一本鎖または二本鎖のいずれか）を有することができる。このようなコロニーは、本明細書中の別の箇所でさらに詳細に記載するクラスター増幅またはブリッジ増幅によって作製され得る。標的配列の多重反復、例えばローリングサークル増幅手法を用いて作製されるコンカテマーは、核酸単一分子中に存在できる。したがって、構造化基板上の各ウェル中のゲル材料は、単一種の検体の複数のコピーを含有してもよい。あるいは、ウェル中の検体のコロニーまたは集団は２つ以上の異なる種を含むことができる。例えば、構造化基板上の１つ以上のウェルはそれぞれ、２種以上の異なる核酸種（すなわち、異なる配列を有する核酸分子）を有する混合コロニーを含有することができる。混合コロニー中の２種以上の核酸種は、無視できない量で存在し得、例えば、混合コロニー中の複数の核酸を検出することを可能にする。

検体は、ゲル材料に付着させてもよい。この付着は、共有であっても非共有であってもよい。核酸をゲルに付着させるための代表的な方法および反応物質は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５号または米国仮特許出願第６１／７５３８３３号に記載されている。検体は、核酸であってもよく、核酸は、その長さ上にあるその３’酸素、５’酸素、またはその他の位置を介して、例えば３’末端ヌクレオチドの塩基部分、５’ヌクレオチドの塩基部分、および／または分子中の別の箇所にある１つ以上の塩基部分を介して、ゲルに付着することができる。非共有様式の付着は、例えば、核酸およびゲル間のイオン相互作用、ゲルの孔内部の核酸の取り込み、タンパク質間相互作用、ゲルおよび／または核酸上のレセプターおよびリガンド間の結合、ならびにその他の公知の様式を含む。

一部の実施形態では、表面に適用するゲルコーティングは、１種以上の検体を含有し、その後、ゲル材料を間隙領域から除去する。したがって、ゲル材料は、間隙領域に存在し、間隙領域にあるゲル材料は、１種以上の異なる検体に付着することができる。あるいは、間隙領域からゲル材料を除去した後に、検体を凹状フィーチャー中のゲル材料に加える。

本開示の構造化基板は、フローセル中で起こり得る。代表的なフローセル、その製造方法およびその使用方法は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１１１７６８号または同第２０１２／０２７０３０５号、またはＷＯ０５／０６５８１４に記載されている。フローセルは、本開示の方法によって作製されるアレイを収容するのに好都合なフォーマットを設け、合成時解読（ＳＢＳ）またはサイクル中で試薬の繰り返し送達を要するその他の技法（例えば、反復ステップまたは循環ステップを有する合成法または検出法）にかける。代表的な検出法は、以下でさらに詳細に記載する。

一部の実施形態では、フローセルまたは多重表面を有するその他の容器を使用する。単一の表面のみにゲル含有凹状フィーチャー（例えばウェル）があるような多重表面を有する容器を使用してもよい。あるいは容器中に存在する２つ以上の表面にゲル含有凹状フィーチャーがあってもよい。フローセルの１つ以上の表面を選択的に検出することができる。例えば、フローセル内部の向かい合う表面を、共焦点法などの当技術分野において公知の方法を用いて、集束放射によって選択的に対処することができる。有用な共焦点法および容器（例えばフローセル）の多重表面に放射線を選択的に向かわせる装置は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／０２７２９１４号または米国特許第８０３９８１７号に記載されている。

本開示は、基板を作製する方法を提供する。この方法は、（ａ）平面を有する固体支持体を設けるステップであって、該平面が１つ以上の凹状フィーチャーによって断続され、該１つ以上の凹状フィーチャーが平面上の１つ以上の間隙領域に隣接するステップと、（ｂ）固体支持体の少なくとも一部をゲル材料でコーティングするステップであって、該一部が少なくとも１つの凹状フィーチャーおよび少なくとも１つの間隙領域を含むステップと、（ｃ）平面を研磨して、ゲル材料を少なくとも１つの間隙領域から除去し、少なくとも１つの凹状フィーチャー中にゲル材料を保持するステップとを含むことができる。

当技術分野において公知の様々な技法のいずれかを用いて、基板を、凹状フィーチャーを有するように製造することができる。多くの実施形態では、凹状フィーチャーは、ナノメートルまたはマイクロメートルの寸法の配列上にある小型のものであるであろう。このような場合、ナノ加工法またはマイクロ加工法を使用できる。これらの技法の例は、以下の実施例２など、本明細書中の別の箇所に記載されている。さらなる代表的なナノ加工法およびマイクロ加工法の技法は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／６６１５２４号および米国特許出願公開第２０１２／０３１６０８６号に記載されている。

１つ以上の凹状フィーチャー、例えばウェルは、予め生成しておいたゲル材料と、または次いでゲル材料を生成する液体でコーティングすることができる。従来の手法の例は、スピンコーティング、ディッピング、陽圧もしくは陰圧下のゲルの流れ、または参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／７５３８３３号に記載の技法を用いた、予め生成しておいたＰＡＺＡＭによる基板のコーティングである。予め生成しておいたＰＡＺＡＭによるウェルのアレイのコーティングは、以下の実施例３で実証している。次いでゲル材料を生成する液体を適用する例として、液体状態のシラン非含有アクリルアミドおよびＮ−［５−（２−ブロモアセチル）アミノペンチル］アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）によるウェルアレイのコーティングがあり、試薬を表面上で重合させることによってゲルを生成させる。このような方法によるアレイのコーティングは、以下の実施例１で示し、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５号に記載の化学試薬および手法を使用することができる。一部の実施形態では、例えば、ウェル含有基板を予め生成しておいたゲル材料に浸すと、ゲル材料がウェルを選択的に満たすことができ、研磨の必要をなくすことができる。

検体をゲル材料に加えるのは、固体支持体と接触させる前でも後でもよい。さらに、検体をゲルに添加しても（すなわち、ゲルがその前駆試薬から生成された後）、検体をゲル生成試薬溶液に添加してもよい（すなわち、ゲル生成前）。一部の実施形態では、ゲル生成前に種々の検体を添加して、ゲル生成後にその他を添加してもよい。一実施例において、プライマー核酸をゲル生成溶液に添加し、次いで溶液をゲル生成させる（例えば、ＳＦＡおよびＰＡＺＡＭで起きた重合によって）。ゲル生成は、固体支持体上で発生してもよく、またはゲルを予め生成し、次いで固体支持体上にコーティングしてもよい。どちらの方法でも、プライマーは、ウェルなどの凹状フィーチャー中に存在するゲルに付着するであろう。次いで、プライマーに補完的な標的核酸を、プライマー含有ゲルに添加し、その結果、ゲル材料が固体支持体上にコーティングされた後で、（ハイブリダイゼーションを介して）標的核酸をゲルに付着させることができる。標的核酸のハイブリダイゼーションは、研磨ステップが実施された後に、任意選択により生じ得る（研磨については、以下でさらに詳細に記載する）。先行の実施例は、構造化基板の異なる製造段階で、核酸（プライマーまたは標的のいずれかとして機能する）をゲルに添加するいくつかの事例を記載している。

いくつかの実施形態では、ゲルに付着する（またはそうでなければゲル中またはゲル上に存在する）プライマー核酸を、鋳型核酸の捕捉および／または増幅のために使用することができる。プライマーは、ライブラリー中の種々の標的核酸に付着するユニバーサルアダプター配列にハイブリダイズするユニバーサルプライマーであってもよい（すなわち、各標的核酸は、ライブラリー中の他の標的核酸とは異なる標的領域を含み、ライブラリー中のいくつかの標的核酸は、同じユニバーサルアダプター配列を有する）。一部の実施形態では、標的核酸はゲル材料に付着させることができ、プライマー（溶液中のもの、またはゲルに付着したもののいずれも）を使用して付着した標的核酸を増幅することができる（すなわち、標的核酸は、増幅の鋳型として働くことができる）。

本明細書に記載の方法は、様々な増幅法のいずれを使用してもよい。使用できる代表的な技法には、これらに限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）、多置換増幅法（ＭＤＡ）、またはランダムプライム増幅法（ＲＰＡ）が挙げられる。特定の実施形態では、増幅に使用される１つ以上のプライマーをゲル材料に付着させることができる。ＰＣＲ実施形態では、増幅に使用される片方または両方のプライマーをゲル材料に付着させることができる。２種の付着プライマーを利用するフォーマットは、ブリッジ増幅と呼ばれることが多いが、その理由は、二本鎖のアンプリコンが、コピーされた鋳型配列の側面に位置する２つの付着プライマー間にブリッジ様構造を形成するためである。ブリッジ増幅に使用できる代表的な試薬および条件は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５６４１６５８号、米国特許公開第２００２／００５５１００号、米国特許第７１１５４００号、米国特許公開第２００４／００９６８５３号、米国特許公開第２００４／０００２０９０号、米国特許公開第２００７／０１２８６２４号、および米国特許公開第２００８／０００９４２０号に記載されている。ＰＣＲ増幅は、ゲル材料に付着している増幅プライマーおよび溶液中の第２のプライマーのうち１つを用いて実施することもできる。一固相付着プライマーと液相プライマーとの組み合わせを使用する代表的なフォーマットは、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＤｒｅｓｓｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００：８８１７〜８８２２（２００３）、ＷＯ０５／０１０１４５、または米国特許公開第２００５／０１３０１７３号もしくは同第２００５／００６４４６０号に記載のエマルションＰＣＲである。エマルションＰＣＲは、フォーマットの実例であり、本明細書に記載の方法を目的として、エマルションの使用が任意選択によるものであり、実際にいくつかの実施形態ではエマルションは使用されていないことを理解されたい。さらに、プライマーは、ｅＰＣＲリファレンスに記載の固体支持体に直接付着する必要はなく、むしろ本明細書に記載のゲル材料に付着させることができる。一部の固相ＰＣＲまたはブリッジ増幅フォーマットでは、標的核酸は、ゲル材料に付着でき、増幅の鋳型として使用することができる。

ＲＣＡ技法は、本開示の方法において使用するために変更してもよい。ＲＣＡがアンプリコンを生成するＲＣＡ反応および原理において使用することができる代表的な成分は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＬｉｚａｒｄｉら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１９：２２５〜２３２（１９９８）および米国特許出願公開第２００７／００９９２０８号に記載されている。ＲＣＡに使用されるプライマーは、溶液中にあってもゲル材料に付着していてもよい。

ＭＤＡ技法は、本開示の方法に使用するために変更してもよい。ＭＤＡについてのいくつかの基本原理および有用な条件を、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＤｅａｎら、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：５２６１〜６６（２００２）；Ｌａｇｅら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：２９４〜３０７（２００３）；Ｗａｌｋｅｒら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｖｉｒｕｓ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、１９９５；Ｗａｌｋｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：１６９１〜９６（１９９２）；米国特許第５４５５１６６号；同第５１３０２３８号；および同第６２１４５８７号に記載されている。ＭＤＡに使用するプライマーは、溶液中にあってもゲル材料に付着していてもよい。

特定の実施形態では、上記に例示された増幅法の組み合わせを使用することができる。例えば、ＲＣＡおよびＭＤＡを組み合わせて使用してもよく、ＲＣＡは、（例えば液相プライマーを使用して）溶液中にコンカテマーのアンプリコンを生じるために使用する。次いで、ゲル材料に付着しているプライマーを使用するＭＤＡのために、アンプリコンを鋳型として使用することができる。この例では、ＲＣＡおよびＭＤＡを組み合わせたステップの後に生成されたアンプリコンは、ゲル材料に付着するであろう。アンプリコンは、一般的に、標的ヌクレオチド配列のコンカテマー反復を含有するであろう。

上記に例示された増幅法は、標的核酸の多重コピーを有するゲル含有フィーチャーを生成するために使用することができる。ウェルなどの個々のフィーチャーは、ＲＣＡによって生成されるものなどの単一分子コンカテマーの形態またはブリッジＰＣＲによって生成されるものなどの同じ配列を持つ多数の核酸分子の形態のヌクレオチド配列のクローン集団を有することができる。一般的に、増幅した標的のコピーをいくつか有する核酸は、ゲル材料に付着するであろう。

一部の応用例では、個々のゲル含有ウェル（または他の凹状フィーチャー）は、大部分が第１の標的核酸由来のアンプリコンで占有され、また第２の標的核酸または増幅中に生じた自然突然変異由来の汚染アンプリコンが低レベルで占有し得る。アレイは、十分低レベルの汚染アンプリコンを有する１つ以上の増幅位置を有することがあり、これによって後続するアレイの使用に許容できない衝撃を与えることがある。例えば、アレイを検出用途に使用する場合、許容可能なレベルの汚染は、検出技法の信号対雑音または解像度に許容できないやり方で衝撃を与えることがないレベルと思われる。これに応じて、明白なクローン性は、一般的に、本明細書に記載の方法によって作製されたアレイの特定の使用または用途に関連するであろう。特定の用途向けの個々のウェルまたは他のフィーチャーで許容され得る代表的な汚染レベルは、これらに限定されないが、最大０．１％、０．５％、１％、５％、１０％または２５％の汚染アンプリコンを含む。アレイは、これらの代表的な汚染レベルのアンプリコンを有する１つ以上ウェルまたは他のフィーチャーを含むことができる。例えば、アレイ中の最大５％、１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％のフィーチャーが、いくらかの汚染アンプリコンを有し得る。

固体支持体の表面上にコーティングしたゲル材料は、支持体に共有結合されてもよい。上記の通り、核酸などの検体をゲル材料に付着させるステップは、構造化基板の様々な異なる製造段階で実施することができる。したがって、検体をゲル材料に付着させる前またはその後でゲル材料を固体支持体に付着させることができる。ゲル材料の固体支持体への付着は、任意の有用な化学反応、例えば限定されないが、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／７５３８３３号に記載のもの、または以下の実施例３で実証されているものを使用して実施することができる。固体支持体へのゲル材料の共有結合は、必ずしもすべての実施形態におけるものではないことを理解されたい。したがって、後続するゲルコーティング支持体を研磨するステップまたは研磨した基板を使用するステップは、任意選択によるものであり必須ではないが、ウェルなどの凹状フィーチャーに共有結合しているゲル材料を有する基板に対して実施することができる。

本明細書に記載の方法は、ゲル材料を固体支持体の表面から除去するステップを含むことができる。固体支持体上にコーティングされているゲル材料は、様々な技法のいずれかを使用して、間隙領域から選択的に除去することができる。例えば、ゲル材料は、機械的研磨法によって、凹状フィーチャーおよび間隙領域を有する固体支持体から除去できる。機械的研磨は、固体支持体の表面に研磨力を加えることによって実施することができる。代表的な方法は、ビーズのスラリーによる研磨、シートまたは布を用いたワイピング、擦過などを含む。研磨の一例は、３μｍのシリカビーズスラリー（水中１０％ｗ／ｖ）でコーティングされたリントフリー（クリーンルーム級）ワイプを使用して格子間のゲルを除去することを含む。ポリッシングホイール／グラインダーをこのスラリーと共に使用してもよい。機械的研磨はまた、流体ジェットまたは空気ジェットを使用して実現でき、間隙領域からゲルを除去する。

研磨は、加水分解またはアクリルアミドの基をベースにした分解（例えば、Ｋｕｒｅｎｋｏｖら、Ｒｕｓｓｉａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７５：１０３９〜１０５０（２００２）；Ｃａｕｌｆｉｅｌｄら、Ｐｏｌｙｍ．４４：１３３１〜１３３７（２００３）；およびＣａｕｌｆｉｅｌｄら、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０２：３０６７〜３０８３（２００２）に記載の過酸化ベンゾイルまたは希釈過酸化水素に曝露することを介する）などの化学的研磨を要することがある。

研磨はまた、化学的および機械的研磨法の組み合わせをも要し、これにより粒子のコロイド懸濁液を含有する化学的スラリーを使用して機械的に剥離し、次いで間隙領域から離れた部分のゲル材料を化学的に溶解する。間隙領域を研磨または掃除する他の方法には、接着ベースの技法、例えば、ゲル材料と親和性がある剛性平面接着膜を表面上に被覆し、これによって（例えば化学結合を介して）間隙領域中のゲル材料と密接させる技法が挙げられる。この接着膜の機械的除去／剥離は、間隙領域からゲル材料を機械的に除去させるが、同時に凹状フィーチャー中のゲル材料を残留させるであろう。

別の例では、チオホスフェートグラフト化ＳＦＡを、以下のように表面上の間隙領域から除去することができる。水で湿ったワットマンワイプを酸化アルミニウム（約１００ｍｇ、０．３ｕｍ）またはスチールビーズに塗り込んでもよい。次いで、均一な圧力を用いて、形成したスラリーを固体支持体の表面上の小さい同心円中に擦り込んでもよい。次いで清浄な水で湿ったワットマンワイプを使用して、表面上のスラリーを除去することができる。ゲル材料を間隙領域から除去するための、本明細書に例示された機械的および化学的研磨法を使用して、ゲル材料が除去されていようとなかろうと、間隙領域でゲル材料を不活性化させることもできる。例えば、ゲル材料は、核酸などの検体に付着する能力について、または核酸の増幅を助長する能力について不活性化することができる。

アレイを作製する方法は、（ａ）複数のウェルがある表面を有する固体支持体を設け、該ウェルがゲル材料を含有し、該ウェルが表面上の間隙領域によって互いに分かれており、該間隙領域が各ウェル中のゲル材料を他の複数のウェル中のゲル材料から隔離するステップと、（ｂ）標的核酸のライブラリーを固体支持体のウェルに送達し、各ウェル中のゲル材料に付着している単一種の標的核酸を有するウェルのアレイを作製するステップであって、アレイ中の異なるウェルがライブラリー由来の異なる標的核酸種を有するステップと、（ｃ）アレイのウェル中のゲル材料に付着している標的核酸を増幅し、アレイの各ウェルで個々の標的核酸のクローン集団を作製するステップとを含むことができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の構造化基板は、混合物から複数の異なる検体を基板上の個別の位置に好都合に送達することによって、アレイを構成する利点をもたらす。構造化基板は、それぞれの個々のゲル含有ウェル（または他の凹状フィーチャー）で、基板と接触している検体混合物から単一検体を選択的に捕捉することを促進する。構造化基板上のゲル含有ウェル（または他の凹状フィーチャー）のパターンおよび充填効率は、検体密度および単一種の検体を有することを基準にしたときの各フィーチャーの純度などの所望の特性を有するアレイを得るように調節することができる。例えば、高密度のウェルは、アレイ上に高密度の検体を得るために使用され、反対に、低密度のウェルは、アレイ上に低密度の検体を得るために使用される。あるいは、または追加的には、溶液中の検体の濃度もしくは量を増やしてアレイ上に高密度の検体を得てもよく、または減らしてアレイ上に低密度の検体を得てもよい。各ゲル含有ウェル（または他の凹状フィーチャー）の検体の平均純度は、以下にさらに詳細に記載され、また実施例の項で実証される基板または検体を送達するための条件の特性を変更することによって調節することができる。

特定の実施形態では、ウェル（または他の凹状フィーチャー）のサイズまたは体積を調節して、捕捉した検体の純度に影響させることができる。例えば、ウェルは、特定のタイプの単一検体のみを収容するゲル材料の面積または体積を有することができ、したがって立体排除によって複数の検体分子が捕捉されるのを防止する、またはウェルに播種するのを防止する。立体排除は、核酸などの大きな検体に特に有用であり得る。より具体的には、ウェル（または他の凹状フィーチャー）は、基板上に播種される標的核酸の排除体積の直径以下の面積を有するゲル表面を存在させることができる。標的核酸の排除体積およびその直径は、例えば、標的核酸の長さから決定することができる。核酸の排除体積および排除体積の直径を求める方法は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７７８５７９０号；Ｒｙｂｅｎｋｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５３０７〜５３１１（１９９３）；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５９９〜６２０（１９９１）；またはＳｏｂｅｌら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ３１：１５５９〜１５６４（１９９１）に記載されている。立体排除の条件は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第１３／６６１５２４号および米国特許第７７８５７９０号に記載されており、本開示の構造化基板に容易に使用できる。

一部の実施形態において、ウェル（または他の凹状フィーチャー）が、増幅位置に輸送された標的核酸の排除体積の直径より実質的に大きい面積を有するゲル表面を与え得ることを理解されたい。したがって、フィーチャーの面積は、立体排除が起こらないほど十分に大きい可能性がある。

一部の実施形態、例えば上記の立体排除の実施形態において、標的核酸のライブラリーは、増幅工程が始まる前に、固体支持体のゲル含有ウェル（または他の凹状フィーチャー）に送達されてもよい。例えば、標的核酸は、基板中のゲル材料に標的核酸を播種する条件下で、構造化基板に送達することができる。基板は、任意選択により、洗浄して、ゲルに播種されない標的核酸ならびに後続の工程または基板の使用に不要な任意の他の材料を除去することができる。増幅は、本明細書中で先に記載した１つ以上の技法を含むことができる。

代替の実施形態では、標的核酸のライブラリーを固体支持体のゲル含有ウェル（または他の凹状フィーチャー）に送達してもよく、増幅プロセスは播種事象と同時に起こり得る。例えば、播種は、例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／７１５４７８号に記載される速度論的除外（ｋｉｎｅｔｉｃ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）を活用する方式下で生じ得る。速度論的除外は、別の事象または作用が発生するのを効果的に遮断するのに十分速い速度で作用が生じるときに起こり得る。ゲル含有ウェルのアレイの場合、ウェルに、溶液からランダムに標的核酸が播種され、標的核酸のコピーが増幅作用で生じ、各播種位置を容量いっぱいに満たすことができる。増幅速度が播種速度を超える条件下で播種および増幅工程を同時に進めることができる。そのようなものとして、第１の標的核酸が播種された位置で相対的に速い速度でコピーが作製され、これにより第２の核酸が増幅位置に播種されるのを効果的に遮断する。同様に、速度論的除外は、後続する標的核酸のコピーまたは第１のコピーを作製する相対的に速い速度に対して、標的核酸の第１のコピーを作製する相対的に遅い速度を活用することができる。例えば、速度論的除外は、後続のコピーが作製されてその位置を満たす相対的に速い速度に対し、ゲル含有ウェルに播種した標的核酸の第１のコピーの形成における遅延（例えば遅延またはゆっくりな活性化）によって起こり得る。この例では、個々のゲル含有ウェルは、いくつもの異なる標的核酸によって播種されたものであってもよい（例えば、いくつもの標的核酸が、増幅前に各位置に存在することができる）。しかし、どのような標的核酸であっても第１のコピー形成はランダムに活性化され得、その結果、第１のコピー形成の平均速度は、後続のコピーが生成される速度よりも相対的に遅くなる。この場合、個々のゲル含有ウェルに、いくつかの異なる標的核酸が播種され得たが、速度論的除外により、これらの標的核酸のうち１種のみが増幅される。一般的に、ゲル含有ウェル（または他の凹状フィーチャー）は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／７１５４７８号に記載の方法における増幅およびアレイ構成の場所として機能し得る。

複数の異なる検体を混合物から個々のゲル含有凹状フィーチャーに送達する代替として、検体を純粋な原料から個々のフィーチャーに離散的に送達してもよい。同様に、合成構成要素の離散的送達によって、個々のフィーチャーで検体を合成してもよい（例えば、ヌクレオチド前駆体を連続的に送達して核酸を合成することができる）。純粋な検体または検体をインサイチュで合成するための構成要素の代表的な送達方法は、これらに限定されないが、インクジェットアレイ位置決定法およびフォトリソグラフィーアレイ合成法が挙げられる。有用なフォトリソグラフィー法は、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）マイクロアレイを製造するためにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒｅ，ＣＡ州）によって商業ベースで利用されているもの、またはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５３２４６３３号、同第５７４４３０５号、同第５６２４７１１号、同第６０２２９６３号、同第６２９１１８３号、および同第６４１６９４９号に記載されているものを含む。また、インクジェット位置決定法、例えばＳｕｒｅＰｒｉｎｔ（登録商標）アレイを印刷するための、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ州）によって商品化されているもの、またはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６３３７３９３号、同第６４１９８８３号、同第６４２０１８０号または同第６６８９３１９号に記載されているものも有用である。このような方法は、本開示のゲル含有フィーチャーへの送達に誘導するように容易に変更できる。

特定の凹状フィーチャー中のゲル材料は、単一種の検体のみを含有しなければいけないわけではない。むしろ、一部の実施形態では、凹状フィーチャーは、いくつかの異なる種の検体をその中のゲル中に含有し得る。例えば、図５のブルズアイ基準マーカーによって実証される。基準マーカーは、２つの「明るい」リング形状のチャンネルを含み、これら２つのチャンネルはそれぞれゲル材料を含有し、それぞれの明るいチャンネル中のゲル材料は、複数の異なる核酸コロニーに付着する。明るいチャンネルの中の核酸コロニーは、増幅手法において鋳型として機能するいくつかの異なる種の標的核酸を各リングに播種することによって形成された。また、基準マーカーは、２つの「暗い」リング形状の領域も含む。暗いリングは、間隔表面パターンによって構成されている。代表的なブルズアイは、同心パターン中の暗いリングと明るいリングを交代にすることによって形成される。図５の例において、構造化基板は、それぞれ一般的に単一の核酸標的物に由来するクローン集団を含有するゲル含有ウェルをも含む。ウェルは、明るいリングと暗いリングとの間のリング形状のバンド中に存在する。したがって、基準は、間隙リングの交互パターン、ウェル含有バンドおよびチャンネルリングを有する。同じ増幅手法を使用して、ウェル中のクローン性核酸コロニーおよび基準マーカー中の混合集団を同時に成長させた（以下の実施例３を参照）。リングの交互パターンを有する基準の他の例を図３Ｂおよび図３Ｃに示す。

本開示は、検体を検出する方法をさらに提供する。この方法は、（ａ）平面を有する固体支持体を設けるステップであって、該平面が１つ以上の凹状フィーチャーによって断続され、該凹状フィーチャーがゲル材料を含有し、１つ以上の凹状フィーチャーが平面上で１つ以上の間隙領域に隣接し、該間隙領域が実質的にゲル材料を含まず、ゲル材料が標的検体に付着する、またはこれを含有するステップと、（ｂ）標的検体が特異的にプローブと相互作用する条件下で固体支持体をプローブと接触させるステップと、（ｃ）固体支持体を検出して、プローブの１つ以上と相互作用する少なくとも標的検体のサブセットを識別するステップとを含むことができる。

特定の実施形態では、核酸が、検出する検体であり、凹状フィーチャーはウェルである。例えば、核酸を検出する方法は、（ａ）表面および核酸ライブラリーを有する固体支持体を設けるステップであって、該表面は複数のウェルを有し、該ウェルはゲル材料を含有し、該ウェルが表面上の間隙領域によって互いに分けられ、該間隙領域が各ウェルのゲル材料を他の複数のウェルのゲル材料から隔離し、ライブラリーのうち単一種の標的核酸が各ウェルのゲル材料に付着するステップと、（ｂ）固体支持体を、標的核酸に結合する少なくとも１つのプローブと接触させるステップと、（ｃ）固体支持体を検出して、少なくとも１つのプローブに結合する標的核酸種を有するウェルを識別するステップとを含むことができる。

核酸アレイを含有する本開示の構造化基板は、様々な目的のうちいずれかのために使用することができる。核酸の特に望ましい使用法は、相補配列を有する標的核酸にハイブリダイズする捕捉プローブとして働くことである。いったん捕捉プローブにハイブリダイズした標的核酸は、例えば、捕捉プローブに補充した標識によって検出することができる。捕捉プローブに対するハイブリダイゼーションを介した標的核酸の検出法は、当技術分野で知られており、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７５８２４２０号、同第６８９０７４１号、同第６９１３８８４号もしくは同第６３５５４３１号または米国特許出願公開第２００５／００５３９８０号、同第２００９／０１８６３４９号もしくは同第２００５／０１８１４４０号に記載されているものを含む。例えば、捕捉プローブを、標識を持つ標的プローブにハイブリダイズすることによって、標識を捕捉プローブに補充することができる。別の例では、標的プローブを捕捉プローブにハイブリダイズさせて、その結果、標識オリゴヌクレオチドにライゲーションすることによって（例えばリガーゼ活性によって）または標識ヌクレオチドを追加することによって（例えばポリメラーゼ活性によって）、捕捉プローブが延長できるようにして、標識を捕捉プローブに補充することができる。

核酸アレイは、配列決定手法、例えば合成時解読（ＳＢＳ）においても使用することができる。簡潔に説明すると、ＳＢＳは、標的核酸を１つ以上の標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼなどと接触させることによって開始できる。標的核酸を鋳型として使用してプライマーが伸長されるフィーチャーは、検出可能な標識ヌクレオチドを導入する。任意選択により、標識ヌクレオチドは、可逆的終止（ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）特性をさらに含むことができ、これは、ヌクレオチドがプライマーに加えられたら、さらなるプライマー伸長を終止する特性である。例えば、可逆的終止部分を有するヌクレオチド類似体をプライマーに加え、これによって脱ブロック剤が送達されて該部分を除去するまで、後続の伸長が生じ得なくすることができる。したがって、可逆的終止法を利用する実施形態では、脱ブロック化薬剤をフローセルに送達してもよい（検出は前または後で行う）。種々の送達ステップ間で洗浄を実施してもよい。次いで、サイクルをｎ回繰り返して、ｎヌクレオチド分、プライマーを伸長し、これにより長さｎの配列を検出することができる。代表的なＳＢＳ手法、流体系、および検出プラットフォームは、本開示の方法によって製作されるアレイと共に使用する上で容易に適応させることができ、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＢｅｎｔｌｅｙら、Ｎａｔｕｒｅ４５６：５３〜５９（２００８）、ＷＯ０４／０１８４９７、ＷＯ９１／０６６７８、ＷＯ０７／１２３７４４、米国特許第７０５７０２６号、同第７３２９４９２号、同第７２１１４１４号、同第７３１５０１９号または同第７４０５２８１号、および米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号に記載されている。

サイクル反応を利用する他のシーケンシング手法、例えばパイロシーケンシングを用いてもよい。パイロシーケンシングは、特定のヌクレオチドが新生核酸鎖に導入されると、無機ピロリン酸塩（ＰＰｉ）の放出を検出する（それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＲｏｎａｇｈｉら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２４２（１）、８４〜９（１９９６）；Ｒｏｎａｇｈｉ、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（１）、３〜１１（２００１）；Ｒｏｎａｇｈｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１（５３７５）、３６３（１９９８）；米国特許第６２１０８９１号；同第６２５８５６８号および同第６２７４３２０号）。パイロシーケンシングにおいて、放出されたＰＰｉは、ＡＴＰスルフリラーゼによってアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に変換することによって検出でき、生じたＡＴＰはルシフェラーゼ発光光子を介して検出できる。したがって、シーケンシング反応は、ルミネセンス検出系を介してモニタリングすることができる。蛍光ベースの検出系に使用される励起放射線源は、パイロシーケンシング手法には必要ではない。有用な流体系、検出器および手法は、本開示のアレイに対してパイロシーケンシングを適用するために使用でき、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＷＩＰＯ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ第１１／５７１１１号、米国特許出願公開第２００５／０１９１６９８号、米国特許第７５９５８８３号、および米国特許第７２４４５５９号に記載されている。

ライゲーション時解読も有用であり、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＳｈｅｎｄｕｒｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０９：１７２８〜１７３２（２００５）；米国特許第５５９９６７５号；および米国特許第５７５０３４１号に記載されているものを含む。一部の実施形態は、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み込まれるＢａｉｎｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １３５（３）、３０３−７（１９８８）；Ｄｒｍａｎａｃら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １６、５４〜５８（１９９８）；Ｆｏｄｏｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１（４９９５）、７６７〜７７３（１９９５）；およびＷＯ１９８９／１０９７７に記載のハイブリダイゼーション時解読を含むことができる。ライゲーション時解読およびハイブリダイゼーション時解読の両方において、ゲル含有ウェル（または他の凹状フィーチャー）中に存在する核酸を、オリゴヌクレオチド送達および検出の繰り返しサイクルにかける。本明細書に記載のまたは本明細書に列挙される文献中のＳＢＳ法のための流体系は、ライゲーション時解読またはハイブリダイゼーション時解読のための試薬送達に容易に適応させることができる。典型的には、オリゴヌクレオチドを蛍光標識し、本明細書中のまたは本明細書に列挙する文献中のＳＢＳ手法に関して記載されるものと同様の蛍光検出器を用いて検出することができる。

一部の実施形態は、ＤＮＡポリメラーゼ活性のリアルタイムモニタリングを要する方法を利用することができる。例えば、ヌクレオチドの取り込みは、フルオロフォア担持ポリメラーゼおよびγ−ホスフェート標識ヌクレオチド間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）相互作用によって、またはｚｅｒｏｍｏｄｅ ｗａｖｅｇｕｉｄｅｓ法によって検出できる。ＦＲＥＴベースのシークエンシングの技法および試薬は、例えば、開示が参照により本明細書に組み込まれるＬｅｖｅｎｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９、６８２〜６８６（２００３）；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔら、Ｏｐｔ．Ｌｅｔｔ．３３、１０２６〜１０２８（２００８）；Ｋｏｒｌａｃｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０５、１１７６〜１１８１（２００８）に記載されている。

一部のＳＢＳ実施形態は、ヌクレオチドを伸長生成物に取り込んだ際に放出する光子の検出を含む。例えば、放出光子の検出に基づいたシークエンシングは、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ、ＣＴ州、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓの子会社）から市販されている電気的検出器および関連技術またはそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号；同第２００９／０１２７５８９号；同第２０１０／０１３７１４３号；または同第２０１０／０２８２６１７号に記載のシークエンシングの方法および系を使用してもよい。特定の実施形態では、放出光子を検出するために使用する電気的検出器を変更してウェルを含んでもよく、該ウェルは本明細書に記載のゲル材料含有することができる。

本開示のアレイに有用な別の応用例は、遺伝子発現解析である。遺伝子発現は、ＲＮＡ配列決定法、例えばデジタルＲＮＡ配列決定法と呼ばれるものを利用して検出または定量化することができる。ＲＮＡ配列決定法は、当技術分野において知られている配列決定法、例えば上記のものを用いて実施することができる。遺伝子発現は、ハイブリダイゼーション法を用いて検出または定量化することもでき、これは、アレイに直接ハイブリダイズすることによって、またはマルチプレックスアッセイを用いて実施することができ、その生成物はアレイ上で検出される。本開示のアレイは、１つ以上の個体由来のゲノムＤＮＡサンプルの遺伝子型を決定するために使用することもできる。本開示のアレイ上で実施可能な、アレイをベースとした発現および遺伝子型の解析のための代表的な方法は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７５８２４２０号、同第６８９０７４１号、同第６９１３８８４号もしくは同第６３５５４３１号、または米国特許出願公開第２００５／００５３９８０号、同第２００９／０１８６３４９号もしくは同第２００５／０１８１４４０号に記載されている。

本開示のアレイのいくつかの用途は、アンサンブル検出との関連において上記に例示したが、ここで標的核酸の複数のコピーが各フィーチャーに存在し、一緒に検出される。代替の実施形態では、単一核酸が、標的核酸またはそのアンプリコンのどちらでも、各フィーチャーで検出され得る。例えば、ゲル含有ウェル（または他の凹状フィーチャー）は、検出される標的ヌクレオチド配列を有する単一核酸分子を含有するように構成することができる。様々な単一分子検出法のうちのいずれかを使用することができ、例えば、解像度を上げた位置で検出するように、またはより感受性の標識を使用するように、上記のアンサンブル検出法を変更したものを含む。使用可能な他の単一分子検出法の例は、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／０３１２５２９号、米国特許出願第６１／５７８６８４号、および米国特許出願第６１／５４０７１４号に記載されている。

例えば、本明細書に記載の方法によって作製された、本開示のゲル含有基板が、必ずしも検出法に使用するわけではないことを理解されたい。むしろ、構造化基板は、核酸ライブラリーを保存するために使用することができる。これに応じて、構造化基板は、その中に核酸を保管する状態で保存することができる。例えば、核酸に付着するゲル含有ウェルを有する基板は、乾燥状態、凍結状態（例えば液体窒素中）、または核酸を保護する溶液中で保存してもよい。あるいは、または追加的には、構造化基板は、核酸ライブラリーを複製するために使用することができる。例えば、核酸に付着するゲル含有ウェルを有する基板は、アレイ上の１つ以上のウェルから複製アンプリコンを作製するために使用してもよい。

以下の実施例は、説明することを目的としたものであるが、本発明を制限するものではない。

シラン非含有アクリルアミドでコーティングしたマルチウェル基板
この実施例は、シラン非含有アクリルアミド（ＳＦＡ）でナノウェル基板をコーティングし、その後、チオホスフェートプライマーによりグラフト化し、ゲルグラフト化プライマーを相補的な蛍光オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、機能化手法の成功を裏付けることを実証している。

ＢｅａｄＣｈｉｐｓの製造に普通に使用されるチップ基板は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ州）から入手した。チップは、シリコンまたはＺｅｏｎｏｒ（Ｚｅｏｎ Ｃｏｒｐ．、日本、東京）で構成され、ピッチ１．５μｍの六角形パターンに配置された０．５μｍのウェルを有するが、該ウェルはビーズを含有していなかった。以下に記載するように、また図１に示すように、チップをゲルパッドでパターン化した。

チップをガスケット密封式チャンバに入れ、ＳＦＡ生成用の流体試薬で置き換えることによって酸素を除去した。チャンバ中のチップ上でＳＦＡを重合した。ＳＦＡを生成する試薬および重合の条件は、別に、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５号に記載されていた。密封チャンバを、重合混合物をチップに直接接触させて置くために使用し、ＳＦＡのフリーラジカル重合は空気不安定性の工程であるため、空気の完全除去を徹底した。重合後、米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５号および以下に記載の通り、密封チャンバ中で、プライマーをＳＦＡポリマーにグラフト化した。プライマーを含有する溶液をポリマーコーティングしたＢｅａｄＣｈｉｐｓの表面全体にわたって展開し、次いで混合物を６５℃で１．２５時間インキュベートした（密封アセンブリ全体を大きなオーブン中に入れた）。

この手法は、均一にコーティングされた基板をもたらす。サンプル画像を図２のパネルＡに示す。不連続なポリマー領域を作製するために、基板上のウェル間に位置している「過剰」ポリマーを、蒸留水中の酸化アルミニウムナノ粒子（直径３００ｎｍ）のスラリーを使用した機械的な研磨法によって除去した。３ミクロンのシリカ粒子の１０ｗｔ％スラリー（Ｋｉｓｋｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｆｕｒｔ、ドイツ）も使用できる。糸くずの出ない光学ティッシュを使用してナノ粒子スラリーで表面を手でこすった。スラリーおよびポリマー残骸を除去するために洗浄した後、蛍光標識したプローブの溶液をチップにハイブリダイズした。蛍光顕微鏡を用いて撮影した画像は、この手法が、間隙領域が空のポリマーフィーチャーを作製できたことを示した（図２、パネルＢ〜Ｃ）。

これらの結果は、ゲルが充填されたウェルの蛍光強度が、間隙領域からの信号がないこととは対照的に、空間的に離散していたことを示す。また、これらの結果は、ナノ加工されたウェルを有する基板上の非共有結合したゲル材料を使用してゲルパターン化が実現できることをも実証した。

ゲル含有ナノウェルを有する基板の製造
複数の技法を使用して、次いでゲル材料をローディングすることができる構造化アレイを製造できる。

このプロセスは、ブランクの基板／ウエハーで開始し、マイクロまたはナノ加工法によってパターンを基板に導入することができる。基板／ウエハーの材料は、普通のシリコン、ガラス、プラスチック、ＣＯＣまたは構築可能な種々の材料のいずれかであってよい。基板にパターン化を取り入れるための代表的な技法は、フォトリソグラフィー、ナノインプリントリソグラフィー、プラスチック／ＣＯＣベースの材料への構造のエンボス、およびパターン化された構造を有するマスター型へのプラスチックまたはＣＯＣの射出成形を含む。フォトリソグラフィーをベースとした手法は、典型的には、フォトレジストの使用を必要とし、ステッパーまたはマスクアライナーでパターン化され、放射線で曝露され、これによりレチクル／フォトマスク上に存在するパターンをフォトレジストに移し、次いでレジストを現像して、基板の上部に構造化膜（フォトレジスト）を得る。構造化レジストは、場合により、後続のゲルコーティングに使用できる最終基板である、またはレジスト中のパターンを、後続する処理によって、基板に移してもよい。後続する処理ステップは、典型的には、反応性エッチング（プラズマベースエッチング）またはウェットエッチング（化学的に基づいた）方法を含む。パターンを基板に移す場合、パターン化フォトレジストを次いで除去して、後続のゲルコーティングのためのパターン化基板を得る。クロムまたはチタン（金属）などの犠牲材料膜をフォトレジスト下に使用することが望ましい場合があり、先ずフォトレジストのパターンを金属膜に移し、次いでこの膜をハードマスクとして使用することによって、パターンを基板に移す。パターンを基板に移した後、膜を取り除き、したがって加工プロセスに対して犠牲的と考えられる。ナノインプリントリソグラフィーを用いた場合、刷り込みフォトレジストが犠牲物質になり得、パターン化レジストを基板に移す中間ツールとして同様に使用できる、または刷り込みレジストが後続のコーティングステップへのインプットとして働くようにレジストのばらつきを使用できる。以下のパターン化を残すと思われるレジストの例は、ゾル−ゲルベースの材料であろう。

構造化基板がどのように製造され得るかを示した図面を図３に示し、以下に説明する。パターン化基板の画像を、様々な倍率レベルで、図３Ｂおよび図３Ｃに示す。

シークエンシング基板／フローセル上で化学的に特異的なゲルパッドを作製することは、本実施例の中で先に説明した１つ以上のナノ加工法を必要とし得る。そしてプロセスには、任意選択により、１つ以上の化学処理ステップ、例えば次いでシランを介してゲルポリマーを基板に結合させるシラン化処理を含まれ得る。次いで化学的／機械的研磨（ＣＭＰ）によって、基板の表面上の間隙ポリマーをすべて除去する。研磨工程は、トップダウン様式で材料を除去し、基板中の構造化フィーチャーは、アレイの間隙領域の平面から効果的にオフセットされるので、構造化フィーチャーを除く前に、研磨によって間隙からポリマーが除去される。研磨工程を最適時間経過後に止めれば、構造はポリマーコーティングを保持し、間隙領域にはポリマーは含まれなくなる。次いでパターン化ゲルパッド基板をプライマーにグラフト化し、標的核酸をゲルパッドで播種し、標的核酸を、ゲルパッドで核酸クラスターを作製するための鋳型として使用する。

ＰＡＺＡＭでコーティングしたマルチウェル基板
この実施例は、ゲル含有ウェルのアレイの製造、ウェル中の核酸クラスターの増幅、およびクラスター中の核酸のシークエンシングを示す。

基板は、以下のように製造した。ナノウェル基板（直径４００ｎｍ、ピッチ１．５μｍ、深さ３００ｎｍのウェル）を、ナノインプリントリソグラフィーを用いて製造した。アミノシラン（ＡＰＴＥＳまたはＡＰＴＭＳ）単層／多層を、化学蒸着法を用いて、基板の表面全体に蒸着させた。次に、１ｍｌのＮＨＳアクリレート溶液を表面に添加し、それを薄い硝子製のカバースリップで覆い、室温で１時間反応を進行させることによって、濃度１００ｍＭのアクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ａｌｄｒｉｃｈ ＰＮ８０６０）のリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）を、アミノシラン表面と反応させた。次いで、５００μｌの２ｗｔ％ＰＡＺＡＭ水溶液を、新規に形成したアクリルアミド機能化表面上にスピンコーティングすることによって、ポリマー（ＰＡＺＡＭ）を表面に適用した。ＰＡＺＡＭは、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／７５３８３３号に記載の通りに合成した。次いでＰＡＺＡＭコーティングした基板を６０℃で１時間加熱した結果、ポリマーと表面との間に共有結合をもたらした。間隙の共有結合したポリマーは、１０ｗｔ％の水中に３μｍＳｉＯ_２微粒子を溶かしたスラリーで表面を研磨することによって除去した。Ｊａｎｅｗａｙ表面（塩化アクリロイル＋ＤＩＰＥＡ（ＭｅＣＮ中））を、上記の手法において、アミノシランでコーティングした表面の代わりに使用してもよい。

次いで、参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第６１／７５３８３３号に記載の通り、パターン化ポリマー基板をプライマーにグラフト化した。次に、色素標識（Ｃｙ５）したグラフト化プライマーの逆相補配列（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔ）を、相補配列の濃度２０μＭで１ＸＰＢＳ緩衝液中の表面に曝露し、次いで表面を、噴射ボトルを用いて、５０ｍｌの１ＰＢＳ緩衝液で洗浄した。基板上の標識相補体を、Ｃｙ５スキャンチャンネルに設定し、ＰＭＴ設定４５０を利用したＦＬＡ９５００Ｔｙｐｈｏｏｎ Ｉｍａｇｅｒで画像化した。基板上の標識相補体は、高解像度顕微鏡によっても画像化し、間隙にポリマー／プライマーが残っていないパターン化またはポリマー／プライマーを示した（図４）。次いで基板にｐｈｉＸ ＤＮＡを播種し、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６１／７１５４７８号に記載の通り、クラスターが成長した。

クラスター含有基板を含むフローセルをＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ州）上で配列決定した。パターン化シークエンシングクラスターの位置を取り出すアルゴリズム（剛体レジストレーション）を用いて、成功裏に高品質のシークエンシング測定基準（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｍｅｔｒｉｃｓ）を得た（図５および図６）。シークエンシングの結果は、クローン性に対する占有率が、標準ポアソン分布で予測したものよりも驚くほど高かったことを示す。とりわけ、図７に「×」で示した、実行したシークエンシングについて測定したクローン性に対する平均占有率は、ポアソン曲線の境界の上にあり、理想的クローン率の直線に近づく。

本出願全体を通して、様々な刊行物、特許、または特許出願が参照されてきた。これらの刊行物の開示は、その内容全体が、参照により本出願に組み込まれ、本発明が関わる最新技術をより完全に説明する。

「含む」という用語は、本明細書において、制約がなく、列挙した要素のみ含むのではなく、任意の追加の要素もさらに包含することを意図する。

本発明は、上記の実施例を参照して説明されたが、本発明から逸脱することなく様々な変更が可能であることを理解すべきである。したがって、本発明は、特許請求の範囲のみに限定される。

Claims (93)

1. 表面を含む固体支持体であって、前記表面が複数のウェルを含み、前記ウェルが、ゲル材料を含有し、ゲル材料が、ウェルの表面に共有結合し、ゲル材料が存在しているウェルの形状に合っており、前記ウェルが表面上の間隙領域によって互いに分けられ、前記間隙領域が、各ウェルのゲル材料を、他の複数のウェルのゲル材料から隔離する、固体支持体と、
   ゲル材料中の標的核酸のライブラリーであって、各ウェルのゲル材料が、ＤＮＡ鋳型の捕捉および該ＤＮＡ鋳型の増幅を支持し、かつ、ライブラリーの明白な単一種の標的核酸を含む、ライブラリーと
   を含む、アレイ。
2. 各ウェルの体積が最大１０００μｍ^３である、請求項１に記載のアレイ。
3. 各ウェル中のゲルの体積が最大１０００μｍ^３である、請求項１に記載のアレイ。
4. 各ウェルが、最大１００μｍ^２の開口部を表面に含む、請求項１に記載のアレイ。
5. 複数のウェルが、繰り返しパターンを有するアレイを構成する、請求項１から４のいずれか一項に記載のアレイ。
6. パターン中のウェルが、５マイクロメートル以下のピッチを有する、請求項５に記載のアレイ。
7. 複数のウェルが、ランダムなパターンを有するアレイを構成する、請求項１から４のいずれか一項に記載のアレイ。
8. ゲルが、ヒドロゲルを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のアレイ。
9. ゲルが、シラン非含有アクリルアミド（ＳＦＡ）またはポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルベンチル）アクリルアミド−コ−アクリルアミド（ＰＡＺＡＭ）を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のアレイ。
10. 各ウェル中のゲル材料が、ライブラリー中の単一種の標的核酸を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のアレイ。
11. 単一種の複数のコピーが、各ウェル中で核酸分子のクローン集団を構成する、請求項１０に記載のアレイ。
12. 単一種の複数のコピーが、核酸分子中でコンカテマー反復として存在する、請求項１０に記載のアレイ。
13. 単一種が、単なる単一核酸分子として、各ウェル中に存在する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のアレイ。
14. 単一核酸分子が、２本の相補鎖を含む、請求項１３に記載のアレイ。
15. 表面が、少なくとも１０００個のウェル／ｍｍ^２の密度を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のアレイ。
16. （ａ）平面を含む固体支持体を設けるステップであって、前記平面が１つ以上の凹状フィーチャーによって断続され、前記１つ以上の凹状フィーチャーが、平面上の１つ以上の間隙領域に隣接するステップと、
    （ｂ）固体支持体の少なくとも一部を、ゲル材料でコーティングするステップであって、ゲル材料が、ウェルの表面に共有結合し、ゲル材料が存在しているウェルの形状に合っており、かつ、ゲル材料が、ＤＮＡ鋳型の捕捉および該ＤＮＡ鋳型の増幅を支持し、前記一部が少なくとも１つの凹状フィーチャーおよび少なくとも１つの間隙領域を含むステップと、
    （ｃ）平面を研磨し、ゲル材料を少なくとも１つの間隙領域から除去し、少なくとも１つの凹状フィーチャー中にゲル材料を保持するステップと
    を含む、基板を作製する方法。
17. 凹状フィーチャーが、間隙領域に取り囲まれるウェルを含む、請求項１６に記載の方法。
18. 各ウェルの体積が最大１０００μｍ^３である、請求項１７に記載の方法。
19. 各ウェル中のゲルの体積が最大１０００μｍ^３である、請求項１７に記載の方法。
20. 各ウェルが、表面中に最大１００μｍ^２の開口部を有する開口部を含む、請求項１７に記載の方法。
21. ウェルが、繰り返しパターンを有するアレイを構成する、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. パターン中のウェルが、５μｍ以下のピッチを有する、請求項２１に記載の方法。
23. 複数のウェルが、ランダムなパターンを有するアレイを構成する、請求項１７から２０のいずれか一項に記載の方法。
24. 表面が、少なくとも１０００個のウェル／ｍｍ^２の密度を含む、請求項１７から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. コーティングが、固体支持体を、予め生成しておいたゲル材料と接触させることを含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の方法。
26. コーティングが、固体支持体を、次いでゲル材料を生成する液体と接触させることを含む、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の方法。
27. ゲル材料が、ヒドロゲルを含む、請求項１６から２６のいずれか一項に記載の方法。
28. ゲル材料が、ポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルベンチル）アクリルアミド−コ−アクリルアミド（ＰＡＺＡＭ）を含む、請求項１６から２６のいずれか一項に記載の方法。
29. ゲル材料が、核酸にさらに付着されている、請求項１６から２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 核酸が、増幅用プライマーを含む、請求項２９に記載の方法。
31. 核酸が、鋳型核酸を含み、方法が、凹状フィーチャー中のゲル材料中の鋳型核酸を増幅することをさらに含む、請求項２９または３０に記載の方法。
32. 増幅が、鋳型核酸のコピーを複数作製し、核酸分子のクローン集団を形成する、請求項３１に記載の方法。
33. 増幅が、鋳型核酸のコピーを複数作製して、核酸分子のコンカテマー反復を形成する、請求項３１に記載の方法。
34. ゲル材料をウェルの表面に共有結合させ、かつ、前記ＤＮＡ鋳型を捕捉可能なオリゴヌクレオチドプライマーでゲル材料をグラフト化することをさらに含む、請求項１７から３３のいずれか一項に記載の方法。
35. 研磨が、ビーズのスラリーによる機械的な摩耗を含む、請求項１６から３４のいずれか一項に記載の方法。
36. 研磨が、固体支持体の表面を拭く、または擦ることによる機械的な摩耗を含む、請求項１６から３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 研磨が、化学的研磨を含む、請求項１６から３６のいずれか一項に記載の方法。
38. ゲル材料をタンパク質にさらに付着させる、請求項１６から３７のいずれか一項に記載の方法。
39. （ａ）表面を含む固体支持体を設けるステップであって、前記表面が複数のウェルを含み、前記ウェルが、ゲル材料を含有し、ゲル材料が、ウェルの表面に共有結合し、ゲル材料が存在しているウェルの形状に合っており、かつ、ゲル材料が、ＤＮＡ鋳型の捕捉および該ＤＮＡ鋳型の増幅を支持し、前記ウェルが表面上の間隙領域によって互いに分けられ、前記間隙領域が、各ウェルのゲル材料を、他の複数のウェルのゲル材料から隔離する、ステップと、
    （ｂ）標的核酸のライブラリーを固体支持体のウェルに送達して、各ウェル中のゲル材料に付着している単一種の標的核酸を有するウェルのアレイを製造するステップであって、アレイ中の種々のウェルが、ライブラリーからの種々の標的核酸種を含むステップと、
    （ｃ）アレイのウェル中のゲル材料に付着している標的核酸を増幅して、アレイの各ウェルで個々の標的核酸のクローン集団を生成するステップと
    を含む、アレイを作製する方法。
40. 各ウェル中のゲルの体積が最大１０００μｍ ^３ である、請求項３９に記載の方法。
41. 各ウェルが、表面中に最大１００μｍ^２の開口部を有する開口部を含む、請求項３９に記載の方法。
42. 複数のウェルが、表面上に繰り返しパターンを構成する、請求項３９に記載の方法。
43. パターン中のウェルが、５μｍ以下のピッチを有する、請求項４２に記載の方法。
44. 複数のウェルが、表面上にランダムなパターンを構成する、請求項３９に記載の方法。
45. ゲルがヒドロゲルを含む、請求項３９に記載の方法。
46. ゲルがポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルベンチル）アクリルアミド−コ−アクリルアミド（ＰＡＺＡＭ）を含む、請求項３９に記載の方法。
47. 表面が、少なくとも１０００個のウェル／ｍｍ^２の密度を含む、請求項３９に記載の方法。
48. ステップ（ａ）における固体支持体を設けることが、
    （ｉ）平面を含む固体支持体を設けることであって、前記表面が複数のウェルを含み、前記ウェルが表面上の間隙領域によって互いに分けられることと、
    （ｉｉ）前記ウェルおよび前記間隙領域をゲル材料でコーティングすることと、
    （ｉｉｉ）平面を研磨して、少なくとも１つの間隙領域からゲル材料を除去し、ウェル中のゲル材料を保持することと
    を含む、請求項３９から４７のいずれか一項に記載の方法。
49. コーティングが、固体支持体を、予め生成しておいたゲル材料と接触させることを含む、請求項４８に記載の方法。
50. コーティングが、固体支持体を、次いでゲル材料を生成する液体と接触させることを含む、請求項４８に記載の方法。
51. 研磨が、ビーズのスラリーによる機械的な摩耗を含む、請求項４８から５０のいずれか一項に記載の方法。
52. 研磨が、固体支持体の表面を拭く、または擦ることによる機械的な摩耗を含む、請求項４８から５１のいずれか一項に記載の方法。
53. 研磨が、化学的研磨を含む、請求項４８から５２のいずれか一項に記載の方法。
54. ステップ（ｂ）がステップ（ｃ）の前に行われる、請求項３９から５３のいずれか一項に記載の方法。
55. ステップ（ｂ）およびステップ（ｃ）が同時に行われる、請求項３９から５３のいずれか一項に記載の方法。
56. ステップ（ｂ）の送達が、ライブラリーを、流体中の標的核酸混合液として準備し、前記流体を固体支持体に接触させ、それによって、標的核酸が、ウェルおよび間隙領域への流体アクセスを有することを含む、請求項３９から５５のいずれか一項に記載の方法。
57. 増幅が、固相ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、多置換増幅（ＭＤＡ）またはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含む、請求項３９から５６のいずれか一項に記載の方法。
58. 増幅が、ウェル中のゲル材料に付着している少なくとも１つのプライマー種のポリメラーゼ伸長を含む、請求項５７に記載の方法。
59. 増幅が、ウェル中のゲル材料に付着している少なくとも２つのプライマー種を使用したブリッジ増幅を含む、請求項３９から５６のいずれか一項に記載の方法。
60. クローン集団がそれぞれ、ライブラリーからの少なくとも１０００個の標的核酸のコピーを含む、請求項３９から５９のいずれか一項に記載の方法。
61. （ａ）表面および核酸ライブラリーを含む固体支持体を設けるステップであって、前記表面が複数のウェルを含み、前記ウェルが、ゲル材料を含有し、ゲル材料が、ウェルの表面に共有結合し、ゲル材料が存在しているウェルの形状に合っており、かつ、ゲル材料が、ＤＮＡ鋳型の捕捉および該ＤＮＡ鋳型の増幅を支持し、前記ウェルが、表面上の間隙領域によって互いに分けられ、前記間隙領域が、各ウェルのゲル材料を、他の複数のウェルのゲル材料から隔離し、ライブラリーの単一種の標的核酸が、各ウェルのゲル材料に付着している、ステップと、
    （ｂ）固体支持体を、標的核酸に結合する少なくとも１つのプローブと接触させるステップと、
    （ｃ）固体支持体を検出して、少なくとも１つのプローブに結合する標的核酸種を有するウェルを識別するステップと
    を含む、核酸を検出する方法。
62. 各ウェルのゲルの体積が、最大１０００μｍ^３である、請求項６１に記載の方法。
63. 各ウェルが、表面中に最大１００μｍ ^２ の開口部を有する開口部を含む、請求項６１に記載の方法。
64. 複数のウェルが、表面上に繰り返しパターンを構成する、請求項６１に記載の方法。
65. パターン中のウェルが、５マイクロメートル以下のピッチを有する、請求項６４に記載の方法。
66. 複数のウェルが、表面上にランダムなパターンを構成する、請求項６１に記載の方法。
67. ゲルがヒドロゲルを含む、請求項６１に記載の方法。
68. ゲルがポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルベンチル）アクリルアミド−コ−アクリルアミド（ＰＡＺＡＭ）を含む、請求項６１に記載の方法。
69. 表面が、少なくとも１０００個のウェル／ｍｍ ^２ の密度を含む、請求項６１に記載の方法。
70. ステップ（ａ）における固体支持体を設けることが、
    （ｉ）平面を含む固体支持体を設けることであって、前記表面が複数のウェルを含み、前記ウェルが表面上の間隙領域によって互いに分けられることと、
    （ｉｉ）前記ウェルおよび前記間隙領域をゲル材料でコーティングすることと、
    （ｉｉｉ）平面を研磨して、少なくとも１つの間隙領域からゲル材料を除去し、ウェル中のゲル材料を保持することと
    を含む、請求項６１から６９のいずれか一項に記載の方法。
71. コーティングが、固体支持体を、予め生成しておいたゲル材料と接触させることを含む、請求項７０に記載の方法。
72. コーティングが、固体支持体を、次いでゲル材料を生成する液体と接触させることを含む、請求項７０に記載の方法。
73. 研磨が、ビーズのスラリーによる機械的な摩耗を含む、請求項７０から７２のいずれか一項に記載の方法。
74. 研磨が、固体支持体の表面を拭く、または擦ることによる機械的な摩耗を含む、請求項７０から７３のいずれか一項に記載の方法。
75. 研磨が、化学的研磨を含む、請求項７０から７４のいずれか一項に記載の方法。
76. ステップ（ａ）における固体支持体を設けることが、
    （ｉｖ）ライブラリーの単一種の標的核酸を各ウェルのゲル材料に付着させる条件下で、標的核酸のライブラリーを固体支持体のウェルに送達することと、
    （ｖ）アレイのウェル中のゲル材料に付着している標的核酸を増幅して、アレイの各ウェルで個々の標的核酸のクローン集団を生成することと
    をさらに含む、請求項７０から７４のいずれか一項に記載の方法。
77. ステップ（ｉｖ）がステップ（ｖ）の前に行われる、請求項７６に記載の方法。
78. ステップ（ｉｖ）およびステップ（ｖ）が同時に行われる、請求項７６に記載の方法。
79. ステップ（ｉｖ）における送達が、ライブラリーを、流体中の標的核酸混合液として準備し、前記流体を固体支持体に接触させ、それによって、標的核酸が、ウェルおよび間隙領域への流体アクセスを有することを含む、請求項７６から７８のいずれか一項に記載の方法。
80. 増幅が、固相ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、多置換増幅（ＭＤＡ）またはローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含む、請求項７６から７９のいずれか一項に記載の方法。
81. 増幅が、ウェル中のゲル材料に付着している少なくとも１つのプライマー種を使用する、請求項８０に記載の方法。
82. 増幅が、ウェル中のゲル材料に付着している少なくとも２つのプライマー種を使用したブリッジ増幅を含む、請求項７６から７９のいずれか一項に記載の方法。
83. クローン集団がそれぞれ、ライブラリーからの少なくとも１０００個の標的核酸のコピーを含む、請求項７６から８２のいずれか一項に記載の方法。
84. 少なくとも１つのプローブが、少なくとも１種の標的核酸の少なくとも一部に相補的な少なくとも１種の核酸を含む、請求項６１から８３のいずれか一項に記載の方法。
85. 少なくとも１つのプローブが、ステップ（ｃ）で検出される蛍光標識を含む、請求項８４に記載の方法。
86. 少なくとも１つのプローブが、ポリメラーゼおよびヌクレオチドをさらに含む、請求項８４に記載の方法。
87. ステップ（ｃ）における検出が、ヌクレオチドのプローブ中への、または標的核酸中への取り込みを検出することを含む、請求項８６に記載の方法。
88. ステップ（ｃ）における検出が、合成時解読法を含む、請求項８６に記載の方法。
89. シークエンシング法において、ステップ（ｂ）および（ｃ）を数回繰り返す、請求項６１から８８のいずれか一項に記載の方法。
90. プローブが、タンパク質と結合する核酸を含む、請求項６１から８８のいずれか一項に記載の方法。
91. 検出が、光学的検出、電気的検出、および熱検出からなる群から選択される、請求項６１から９０のいずれか一項に記載の方法。
92. 光学的検出が、蛍光、ルミネセンス、化学ルミネセンス、吸光度、および蛍光共鳴エネルギー移動からなる群から選択される、請求項９１に記載の方法。
93. （ａ）平面を含む固体支持体を設けるステップであって、前記平面が、１つ以上の凹状フィーチャーによって断続され、前記凹状フィーチャーがゲル材料を含有し、ゲル材料が、ゲル材料が存在しているウェルの形状に合っており、１つ以上の凹状フィーチャーが、平面上の１つ以上の間隙領域に隣接し、前記間隙領域がゲル材料を含まず、前記ゲル材料が、ウェルの表面に共有結合し、該ゲル材料に付着した標的検体を含む、ステップと、
    （ｂ）標的検体が特異的にプローブと相互作用する条件下で、前記固体支持体をプローブに接触させるステップと、
    （ｃ）前記固体支持体を検出して、プローブの１つ以上と相互作用する標的検体の少なくとも１つのサブセットを識別するステップと
    を含む、検体を検出する方法。

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