KR102586847B1 - 시퀀싱 프라이머 및 비-시퀀싱 존재물을 포함하는 어레이 - Google Patents

시퀀싱 프라이머 및 비-시퀀싱 존재물을 포함하는 어레이 Download PDF

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Abstract

어레이의 일 예는 복수의 개별 웰을 포함하는 지지체, 개별 웰 각각에 위치되는 젤 물질, 젤 물질에 접목된 시퀀싱 프라이머, 및 젤 물질에 접목된 비-시퀀싱 존재물을 포함한다. 시퀀싱 프라이머 및 비-시퀀싱 존재물 각각은 접목된 그대로의 형태로 존재한다.

Description

시퀀싱 프라이머 및 비-시퀀싱 존재물을 포함하는 어레이
관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 2016년 12월 22일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/438,294호의 이익을 주장한다.
서열 목록에 대한 참조
EFS-Web을 통해 본원에 제출된 서열 목록은 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다. 파일명은 ILI102BPCT_IP-1486-PCT_sequence_listing_ST25.txt이고, 파일의 크기는 647 바이트이며, 파일의 생성일은 2017년 12월 20일이다.
생물학적 어레이는 데옥시리보핵산(DNA) 및 리보핵산(RNA)을 포함하는 분자를 검출하고 분석하기 위해 이용되는 광범위한 도구 중 하나이다. 이들 적용에서, 어레이는 인간 및 다른 유기체의 유전자에 존재하는 뉴클레오티드 서열에 대한 프로브를 포함하도록 조작된다. 특정 적용에서, 예를 들어, 개별적 DNA 및 RNA 프로브는 어레이 지지체 상에 기하학적 격자로(또는 무작위적으로) 작은 위치에 부착될 수 있다. 예를 들어, 공지된 사람 또는 유기체로부터의 시험 샘플은 격자에 노출되어, 상보적 단편이 어레이 내의 개별 부위의 프로브에 하이브리드화될 수 있다. 이후, 어레이는 단편이 하이브리드화된 부위의 형광에 의해 어떠한 단편이 샘플에 존재하는지 확인하기 위해 상기 부위 상에서 빛의 특정 주파수를 스캐닝함으로써 검사될 수 있다.
생물학적 어레이는 유전학적 시퀀싱을 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, 유전학적 시퀀싱은 DNA 또는 RNA의 단편과 같은 유전 물질의 길이에서 뉴클레오티드 또는 핵산의 순서를 결정하는 것을 포함한다. 염기쌍의 점점 증가하는 더 긴 서열이 분석되고, 결과적인 서열 정보가 단편이 유래된 광범위한 길이의 유전 물질의 서열을 신뢰성 있게 결정하기 위해 단편들을 함께 논리적으로 적합화시키기 위해 다양한 생물정보학 방법에서 사용될 수 있다. 특징적인 단편의 자동화된 컴퓨터 기반 검사가 개발되었고, 유전체 맵핑, 유전자 및 이의 기능의 확인, 특정 질환 및 질병 상태의 위험 평가 등에서 사용되어 왔다. 이들 적용을 넘어서, 생물학적 어레이는 광범위한 분자, 분자의 계열, 유전적 발현 수준, 단일 뉴클레오티드 다형태, 및 유전형의 검출 및 평가에 사용될 수 있다.
어레이의 일 예는 복수의 개별 웰을 포함하는 지지체, 개별 웰 각각에 위치된 젤 물질, 젤 물질에 접목된 시퀀싱 프라이머, 및 젤 물질에 접목된 비-시퀀싱 존재물을 포함한다. 시퀀싱 프라이머 및 비-시퀀싱 존재물 각각은 접목된 그대로의 형태로 존재한다.
어레이의 또 다른 예는 복수의 개별 웰을 포함하는 지지체, 개별 웰 각각에 위치된 젤 물질, 젤 물질에 접목된 시퀀싱 프라이머, 및 젤 물질에 접목된 스페이서를 포함한다. 스페이서는 덴드리머, 폴리덱스트란, 메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 이민), 폴리-L-리신, 프로파길 메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(에틸렌 글리콜) 아크릴레이트, 폴리(프로필렌 이민), 폴리(비닐 알콜), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 폴리아크릴산, 폴리(트롤록스 에스테르), 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
방법의 일 예에서, 젤은 지지체의 복수의 개별 웰 각각에 위치되고, 시퀀싱 프라이머는 젤 물질에 접목되고; 비-시퀀싱 존재물은 젤 물질에 접목된다.
본 발명의 개시의 예의 특징 및 장점은 유사한 참조 번호가 유사하지만 아마도 동일하지 않은 구성요소에 해당하는 하기 상세한 설명 및 도면을 참조로 하여 명백해질 것이다. 간결함을 위해, 이전에 기재된 기능을 갖는 참조 번호 또는 특징은 이들이 나타나는 다른 도면과 관련하여 설명되거나 설명되지 않을 수 있다.
도 1은 어레이의 전반적인 레이아웃을 예시하고, 개별적 부위의 배열을 상술하는 본 발명의 개시에 따른 예시적 어레이의 도식적 표현이다;
도 2a 내지 2d는 본원에 개시된 방법의 예를 함께 예시하는 단면도이다;
도 3은 도 1 및 2d에 제시된 개별적 부위 중 하나의 확대 투시 단면도이다;
도 4는 일 예에서 상이한 몰 비의 비-시퀀싱 프라이머 대 시퀀싱 프라이머를 포함하는 레인에 대한 강도의 측면에서의 테트라클로로 플루오레세인(TET) 품질 관리(QC) 결과를 도시하는 그래프이다;
도 5는 일 예에서 상이한 몰 비의 비-시퀀싱 프라이머 대 시퀀싱 프라이머에 대한 판독2 C1A 강도를 도시하는 그래프이다;
도 6a 및 6b는 일 예에서 상이한 몰 비의 중합체 가닥 비-시퀀싱 존재물 대 시퀀싱 프라이머에 대한 필터를 통해 통과하는 클러스터의 백분율을 도시하는 그래프이다;
도 7a 및 7b는 일 예에서 상이한 몰 비의 중합체 가닥 비-시퀀싱 존재물 대 시퀀싱 프라이머에 대한 패드 호핑(pad hopping)의 백분율을 도시하는 그래프이다.
본원에 개시된 어레이의 제1 양태에서, 어레이는 복수의 개별 웰을 포함하는 지지체, 개별 웰 각각에 위치된 젤 물질, 젤 물질에 접목된 시퀀싱 프라이머, 및 젤 물질에 접목된 비-시퀀싱 존재물을 포함하며, 시퀀싱 프라이머 및 비-시퀀싱 존재물 각각은 이의 접목된 그대로의 형태로 존재한다.
어레이의 제1 양태에서, 비-시퀀싱 존재물 대 시퀀싱 프라이머의 몰 비는 약 0.25:1 내지 약 5:1 범위이다.
어레이의 제1 양태의 일 예에서, 비-시퀀싱 존재물은 덴드리머, 폴리덱스트란, 메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 이민), 폴리-L-리신, 프로파길 메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(에틸렌 글리콜) 아크릴레이트, 폴리(프로필렌 이민), 폴리(비닐 알콜), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 폴리아크릴산, 폴리(트롤록스 에스테르), 펩티드, 및 비-기능성 프라이머로 구성된 군으로부터 선택된다. 비-시퀀싱 존재물은 말단 작용기를 통해 젤 물질에 접목된다. 일부 예에서, 작용기는 알킨, 노르보르닐, 구리 비함유 클릭 모이어티, 및 티올로 구성된 군으로부터 선택된다. 이러한 제1 양태에서의 일 예로서, 비-시퀀싱 존재물은 비-기능성 프라이머이고, 비-기능성 프라이머는 폴리T 또는 폴리A이다. 이러한 제1 양태에서의 또 다른 예로서, 비-시퀀싱 존재물은 약 0.5 KDa 내지 약 10 KDa 미만의 범위의 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)이다.
어레이의 제1 양태의 또 다른 예에서, 비-시퀀싱 존재물은 링커 및 링커에 결합된 삼중항 상태 켄처(triplet state quencher) 또는 항산화제를 포함한다. 일부 예에서, 링커는 덴드리머, 폴리덱스트란, 메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 이민), 폴리-L-리신, 프로파길 메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(에틸렌 글리콜) 아크릴레이트, 폴리(프로필렌 이민), 폴리(비닐 알콜), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 폴리아크릴산, 및 폴리(트롤록스 에스테르)로 구성된 군으로부터 선택된다. 이러한 양태의 일부 예에서, 삼중항 상태 켄처는 사이클로-옥틸테트라엔(COT), 트롤록스, 및 니트로벤질 알콜(NBA)로 구성된 군으로부터 선택되고; 일부 예에서, 항산화제는 아스코르베이트, 글루타티온, 갈산, 카테킨, 트롤록스, 및 비타민 E로 구성된 군으로부터 선택된다.
어레이의 제1 양태의 또 다른 예에서, 비-시퀀싱 존재물은 링커 및 링커에 결합된 형광 공명 에너지 전달(FRET) 공여체를 포함한다. 일부 예에서, 링커는 덴드리머, 폴리덱스트란, 메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 이민), 폴리-L-리신, 프로파길 메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸렌 글리콜) 아크릴레이트, 폴리(프로필렌 이민), 폴리(비닐 알콜), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 폴리아크릴산, 및 폴리(트롤록스 에스테르)로 구성된 군으로부터 선택된다. 이러한 양태의 일부 예에서, FRET 공여체는 녹색-방출 염료를 갖는 FRET에 대한 공여체 염료 및 적색-방출 염료를 갖는 FRET에 대한 공여체 염료로 구성된 군으로부터 선택된다.
어레이의 제1 양태의 임의의 특징은 임의의 바람직한 방식 및/또는 구성으로 함께 조합될 수 있음이 이해되어야 한다.
본원에 개시된 어레이의 제2 양태에서, 어레이는 복수의 개별 웰을 포함하는 지지체, 개별 웰 각각에 위치된 젤 물질, 젤 물질에 접목된 시퀀싱 프라이머, 및 젤 물질에 접목된 스페이서를 포함한다. 일부 예에서, 스페이서는 덴드리머, 폴리덱스트란, 메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 이민), 폴리-L-리신, 프로파길 메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸렌 글리콜) 아크릴레이트, 폴리(프로필렌 이민), 폴리(비닐 알콜), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 폴리아크릴산, 폴리(트롤록스 에스테르), 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
어레이의 제2 양태에서, 스페이서 대 시퀀싱 프라이머의 몰 비는 약 0.25:1 내지 약 5:1 범위이다.
어레이의 제2 양태의 일 예는 스페이서에 결합된 삼중항 상태 켄처, 항산화제, 또는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 공여체를 추가로 포함한다. 이러한 양태의 일부 예에서, 삼중항 상태 켄처는 사이클로-옥틸테트라엔(COT), 트롤록스, 및 니트로벤질 알콜(NBA)로 구성된 군으로부터 선택된다. 이러한 양태의 일부 예에서, 항산화제는 아스코르베이트, 글루타티온, 갈산, 카테킨, 트롤록스, 및 비타민 E로 구성된 군으로부터 선택된다. 이러한 양태의 일부 예에서, FRET 공여체는 녹색-방출 염료를 갖는 FRET에 대한 공여체 염료 및 적색-방출 염료를 갖는 FRET에 대한 공여체 염료로 구성된 군으로부터 선택된다.
어레이의 제2 양태의 일 예에서, 스페이서는 말단 작용기를 통해 젤 물질에 접목된다. 일부 예에서, 작용기는 알킨, 노르보르닐, 구리 비함유 클릭 모이어티, 및 티올로 구성된 군으로부터 선택된다.
어레이의 제2 양태의 임의의 특징은 임의의 바람직한 방식으로 함께 조합될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 제1 양태 및/또는 제2 양태의 특징의 임의의 조합이 함께 사용될 수 있고/있거나, 이들 양태 중 어느 하나 또는 둘 모두로부터의 임의의 특징이 본원에 개시된 임의의 실시예와 조합될 수 있음이 이해되어야 한다.
상기 방법의 일 양태는 지지체의 복수의 개별 웰 각각에 젤 물질을 배치하고, 시퀀싱 프라이머를 젤 물질에 접목하고, 비-시퀀싱 존재물을 젤 물질에 접목하는 것을 포함한다.
상기 방법의 이러한 양태의 일 예에서, 시퀀싱 프라이머는 비-시퀀싱 존재물이 젤 물질에 접목되기 전 또는 후에 젤 물질에 접목된다.
상기 방법의 이러한 양태의 또 다른 예에서, 시퀀싱 프라이머 및 비-시퀀싱 존재물은 젤 물질에 공동 접목된다. 공동 접목은 시퀀싱 프라이머 및 비-시퀀싱 존재물의 혼합물을 위에 젤 물질을 갖는 지지체에 침착시키고; 소정의 온도에서 지지체를 인큐베이션함으로써 달성된다.
상기 방법의 이러한 양태에서 비-시퀀싱 존재물은 덴드리머, 폴리덱스트란, 메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 이민), 폴리-L-리신, 프로파길 메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸렌 글리콜) 아크릴레이트, 폴리(프로필렌 이민), 폴리(비닐 알콜), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 폴리아크릴산, 폴리(트롤록스 에스테르), 펩티드, 및 비-기능성 프라이머로 구성된 군으로부터 선택되며; 비-시퀀싱 존재물은 말단 작용기를 통해 젤 물질에 접목된다. 일부 예에서, 말단 작용기는 알킨, 노르보르닐, 구리 비함유 클릭 모이어티, 및 티올로 구성된 군으로부터 선택된다.
상기 방법의 일부 양태에서, 비-시퀀싱 존재물은 이에 결합된 삼중항 상태 켄처, 항산화제, 또는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 공여체를 추가로 포함한다.
상기 방법의 이러한 양태의 임의의 특징은 임의의 바람직한 방식으로 함께 조합될 수 있음이 이해되어야 한다. 또한, 상기 방법의 이러한 양태의 특징의 임의의 조합은 어레이의 임의의 양태 및/또는 본원에 개시된 임의의 실시예와 조합될 수 있음이 이해되어야 한다.
상세한 설명
본원에 개시된 어레이의 예는 몇 개의 부위를 포함하며, 이들 각각은 젤 물질에 부착된 시퀀싱 프라이머 및 비-시퀀싱 존재물을 갖는다. 시퀀싱 프라이머는 데옥시리보핵산(DNA) 또는 리보핵산(RNA)을 결합시키고 증폭시키는데 사용될 수 있는 반면, 비-시퀀싱 존재물은 결합 또는 증폭에 관여하지 않는다. 오히려, 비-시퀀싱 존재물은 시퀀싱 프라이머 사이의 스페이서로 작용한다. 시퀀싱 프라이서 사이에 간격을 두는 것은 증폭 과정과 관련된 단백질에 대한 입체 장애를 제한함으로써 증폭을 향상시킬 수 있다.
스페이서로서 작용하는 것에 더하여, 비-시퀀싱 존재물은 또한 어레이에 다른 기능을 도입할 수 있다. 예로서, 비-시퀀싱 존재물은 i) 증폭 및 시퀀싱 동안 젤 물질에 대한 효소, 단백질, 및/또는 다른 소분자의 비특이적 결합을 제한하고/하거나; ii) 건조 조건하에서 붕괴를 방지하는 것을 도울 수 있는 젤 물질의 친수성을 증가시키고/시키거나; iii) 젤 물질에 연결된 염료의 형광 특성을 향상시키고/시키거나; iv) i, ii, 및/또는 iii의 조합 작용을 할 수 있다. 또한, 비-시퀀싱 존재물은 표면으로부터 기능성 표면 프라이머를 노출시키는 것을 도울 수 있다.
본원에서 사용되는 용어는 달리 명시되지 않는 한 관련 기술에서의 이들의 통상적인 의미를 가질 것이 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 몇몇 용어 및 이들의 의미는 하기에 설명된다.
단수 형태는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
본원에서 사용되는 "알킬"은 완전히 포화된(즉, 이중 또는 삼중 결합을 함유하지 않는) 선형 또는 분지형 탄화수소 사슬을 나타낸다. 알킬기는 1 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 예시적인 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 3차 부틸, 펜틸, 헥실 등을 포함한다. 예로서, "C1-4 알킬"이라는 명칭은 알킬 사슬 내에 1 내지 4개의 탄소 원자가 존재하고, 즉, 알킬 사슬이 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소부틸, sec-부틸, 및 t-부틸로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 나타낸다.
본원에서 사용되는 "알케닐"은 하나 이상의 이중 결합을 함유하는 선형 또는 분지형 탄화수소 사슬을 나타낸다. 알케닐기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 예시적인 알케닐기는 에테닐, 프로페닐, 부테닐, 펜테닐, 헥세닐 등을 포함한다. 알케닐기는, 예를 들어, 알케닐 사슬에 2 내지 4개의 탄소 원자가 존재하는 것을 나타내는 "C2-4 알케닐"로 명명될 수 있다.
본원에서 사용되는 "알키닐"은 하나 이상의 삼중 결합을 함유하는 선형 또는 분지형 탄화수소 사슬을 나타낸다. 알키닐기는 2 내지 20개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 알키닐기는, 예를 들어, 알키닐 사슬에 2 내지 4개의 탄소 원자가 존재하는 것을 나타내는 "C2-4 알키닐"로 명명될 수 있다.
"아미노" 작용기는 -NRaRb 기를 나타내며, 여기서 Ra 및 Rb는 각각 독립적으로 본원에 정의된 바와 같은 수소, C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5-10원 헤테로아릴, 및 5-10원 헤테로사이클릴로부터 선택된다.
본원에서 사용되는 "아릴"은 고리 백본에 탄소만을 함유하는 방향족 고리 또는 고리 시스템(즉, 2개의 인접한 탄소 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)을 나타낸다. 아릴이 고리 시스템인 경우, 시스템 내의 각각의 고리는 방향족이다. 아릴기는 6 내지 18개의 탄소 원자를 가질 수 있으며, 이는 C6-18로 명명될 수 있다. 아릴기의 예는 페닐, 나프틸, 아줄레닐, 및 안트라세닐을 포함한다.
어구 "접목된 그대로의 형태"는 임의의 변경 없이 접목의 결과로서 젤 물질에 부착되는 바와 같은 프라이머 및/또는 비-시퀀싱 존재물의 상태를 나타낸다. 본원에 개시된 예에서, 접목된 그대로의 형태의 비-시퀀싱 존재물은 DNA 또는 RNA 시퀀싱을 수행할 수 없다. 달리 말하면, 비-시퀀싱 존재물이 젤 물질에 접목되는 시점으로부터 시퀀싱될 수 없다. 이와 같이, 시퀀싱 동안 비-시퀀싱 존재물을 비-반응성이 되도록 하기 위해 추가적인 처리 단계가 수행될 필요는 없다. 오히려, 비-시퀀싱 존재물이 접목되는 경우, 시퀀싱될 수 없다.
본원에서 사용되는 용어 "부착된"은 서로 이어지거나, 고정되거나, 접착되거나, 연결되거나, 결합되는 두 개의 물체의 상태를 나타낸다. 예를 들어, 핵산은 공유 또는 비-공유 결합에 의해 물질, 예를 들어, 젤 물질에 부착될 수 있다. 공유 결합은 원자 사이의 전자쌍을 공유하는 것을 특징으로 한다. 비-공유 결합은 전자쌍의 공유를 수반하지 않는 화학적 결합이며, 예를 들어, 수소 결합, 이온 결합, 반 데르 발스 힘, 친수성 상호작용 및 소수성 상호작용을 포함할 수 있다.
"아지드" 또는 "아지도" 작용기는 -N3를 나타낸다.
본원에서 사용되는 "카르보사이클릴"은 고리 시스템 백본에 탄소 원자만 함유하는 비-방향족 사이클릭 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 카르보사이클릴이 고리 시스템인 경우, 2개 이상의 고리가 융합되거나, 브릿징되거나, 스피로-연결된 방식으로 함께 연결될 수 있다. 카르보사이클릴은 임의의 포화도를 가질 수 있으나, 단 고리 시스템 내의 적어도 하나의 고리는 방향족이 아니다. 따라서, 카르보사이클릴은 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 및 사이클로알키닐을 포함한다. 카르보사이클릴기는 3 내지 20개의 탄소 원자(즉, C3-20)를 가질 수 있다. 카르보사이클릴 고리의 예는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 2,3-디하이드로-인덴, 바이사이클로[2.2.2]옥타닐, 아다만틸, 및 스피로[4.4]노나닐을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "카르복실산" 또는 "카르복실"은 -C(O)OH를 나타내도록 본원에서 사용된다.
본원에서 사용되는 "사이클로알킬"은 완전히 포화된 카르보사이클릴 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 예로는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 및 사이클로헥실을 포함한다.
본원에서 사용되는 "사이클로알킬렌"은 2개의 부착점을 통해 분자의 나머지에 부착된 완전히 포화된 카르보사이클릴 고리 또는 고리 시스템을 의미한다.
본원에서 사용되는 "사이클로알케닐" 또는 "사이클로알켄"은 적어도 하나의 이중 결합을 갖는 카르보사이클릴 고리 또는 고리 시스템을 의미하며, 여기서 고리 시스템 내의 고리는 방향족이 아니다. 예로는 사이클로헥세닐 또는 사이클로헥센 및 노르보르넨 또는 노르보르네닐을 포함한다. 본원에서 또한 사용되는 "헤테로사이클로알케닐" 또는 "헤테로사이클로알켄"은 적어도 하나의 이중 결합을 갖는 고리 백본 내에 적어도 하나의 헤테로원자를 갖는 카르보사이클릴 고리 또는 고리 시스템을 의미하며, 여기서 고리 시스템 내의 고리는 방향족이 아니다.
본원에서 사용되는 "사이클로알키닐" 또는 "사이클로알킨"은 적어도 하나의 삼중 결합을 갖는 카르보사이클릴 고리 또는 고리 시스템을 의미하며, 여기서 고리 시스템 내의 고리는 방향족이 아니다. 예로는 사이클로옥틴이 있다. 또 다른 예로는 바이사이클로노닌이 있다. 본원에서 또한 사용되는 "헤테로사이클로알키닐" 또는 "헤테로사이클로알킨"은 적어도 하나의 삼중 결합을 갖는 고리 백본 내에 적어도 하나의 헤테로원자를 갖는 카르보사이클릴 고리 또는 고리 시스템을 의미하며, 여기서 고리 시스템 내의 고리는 방향족이 아니다.
본원에서 사용되는 용어 "침착"은 수작업이거나 자동화될 수 있는 임의의 적합한 적용 기술을 나타낸다. 일반적으로, 침착은 증착 기술, 코팅 기술, 접목 기술 등을 이용하여 수행될 수 있다. 일부 특정 예는 화학 기상 증착(CVD), 스프레이 코팅, 스핀 코팅, 덩크(dunk) 또는 딥(dip) 코팅, 퍼들 분배(puddle dispensing) 등을 포함한다.
용어 "각각"은 항목의 수집물과 관련하여 사용되는 경우 수집물 내의 개별적 항목을 확인하기 위한 것이나, 수집물 내의 모든 항목을 반드시 나타내는 것은 아니다. 명백한 개시 또는 문맥이 달리 명시하는 경우 예외가 발생할 수 있다.
"형광 증강제"는 형광의 특성을 개선시킬 수 있거나, 광에 의해 유도되는 손상을 감소시킬 수 있는 임의의 분자이다. 예를 들어, 형광 증강제는 형광 염료(또는 합성(SBS) 공정에 의한 시퀀싱에 포함되는 완전 기능성 뉴클레오티드(FFN))의 광안정성을 개선시키는 항산화제일 수 있다. 또 다른 예로서, 형광 증강제는 흡수 스펙트럼의 한 영역에서 에너지를 흡수하고, 또 다른 영역에서 염료(에를 들어, 뉴클레오티드(들)에 부착될 수 있음)를 여기시키기 위해 에너지를 제공하는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 공여체일 수 있다. FRET 공여체는 FRET에 대한 공여체 염료일 수 있으며, 상기 염료는 합성(SBS) 워크플로우에 의한 시퀀싱에서 혼입되고 검출된다. 또 다른 예로서, 형광 증강제는 고도로 반응성인 삼중항-상태 형광단에 의해 야기될 수 있는 광-유도 손상(예를 들어, 핵산에 대한 손상)을 완화시킬 수 있는 삼중항 상태 켄처일 수 있다. 삼중항 상태 켄처는 삼중항 상태에서 여기된 화합물의 수명을 단축시켜, 삼중항-상태 화합물이 젤 물질에 부착된 또 다른 구성요소에 대한 광-유도 손상을 야기시킬 수 있는 시간의 양을 감소시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "젤 물질"은 액체 및 기체에 대해 투과성인 반-강성 물질을 의미하고자 하는 것이다. 통상적으로, 젤 물질은 액체가 흡수되는 경우에 팽창할 수 있고, 액체가 건조에 의해 제거되는 경우에 수축할 수 있는 하이드로겔이다.
본원에서 사용되는 "헤테로아릴"은 고리 백본 내에 하나 이상의 헤테로원자, 즉, 질소, 산소 및 황을 포함하나 이에 제한되지는 않는 탄소가 아닌 원소를 함유하는 방향족 고리 또는 고리 시스템(즉, 2개의 인접한 원자를 공유하는 2개 이상의 융합된 고리)을 나타낸다. 헤테로아릴이 고리 시스템인 경우, 시스템 내의 모든 고리는 방향족이다. 헤테로아릴기는 5-18개의 고리 일원을 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 "헤테로사이클릴"은 고리 백본에 적어도 하나의 헤테로원자를 함유하는 비-방향족 사이클릭 고리 또는 고리 시스템을 의미한다. 헤테로사이클릴은 융합되거나, 브릿징되거나, 스피로-연결된 방식으로 함께 연결될 수 있다. 헤테로사이클릴은 임의의 포화도를 가질 수 있으나, 단 고리 시스템 내의 적어도 하나의 고리는 방향족이 아니다. 고리 시스템에서, 헤테로원자(들)은 비-방향족 또는 방향족 고리에 존재할 수 있다. 헤테로사이클릴기는 3 내지 20개의 고리 일원(즉, 탄소 원자 및 헤테로원자를 포함하는 고리 백본을 구성하는 원자의 수)을 가질 수 있다. 헤테로사이클릴기는 "3-6원 헤테로사이클릴" 또는 유사한 명칭으로 명명될 수 있다. 일부 예에서, 헤테로원자(들)은 O, N, 또는 S이다.
본원에서 사용되는 용어 "하이드라진" 또는 "하이드라지닐"은 -NHNH2 기를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "하이드라존" 또는 "하이드라조닐"은 Ra 및 Rb가 본원에서 이전에 정의된 기를 나타내기 위해 본원에서 사용된다.
본원에서 사용되는 "하이드록실"은 -OH 기이다.
본원에서 사용되는 용어 "사이 영역(interstitial region)"은 기판 또는 표면의 다른 영역을 분리하는 기판/지지체 내 또는 표면 상의 영역을 나타낸다. 예를 들어, 사이 영역은 어레이의 한 특징부를 어레이의 또 다른 특징부로부터 분리시킬 수 있다. 서로 분리된 2개의 특징부는 별개이며, 즉, 서로 접촉이 결여되어 있을 수 있다. 또 다른 예에서, 사이 영역은 특징부의 제1 부분을 특징부의 제2 부분으로부터 분리시킬 수 있다. 많은 예에서, 사이 영역은 연속적인 반면, 특징부는, 예를 들어, 달리 연속적인 표면에 정의된 복수의 웰의 경우에서와 같이 별개이다. 사이 영역에 의해 제공된 분리는 부분적 또는 완전한 분리일 수 있다. 사이 영역은 표면에 정의된 특징부의 표면 물질과 상이한 표면 물질을 가질 수 있다. 예를 들어, 어레이의 특징부는 사이 영역에 존재하는 양 또는 농도를 초과하는 젤 물질, 시퀀싱 프라이머(들), 및 비-시퀀싱 존재물의 양 또는 농도를 가질 수 있다. 일부 예에서, 젤 물질, 시퀀싱 프라이머(들), 및 비-시퀀싱 존재물은 사이 영역에 존재하지 않을 수 있다.
본원에서 사용되는 "니트릴 옥사이드"는 Ra가 본원에서 이전에 정의된 "RaC≡N+O-" 기를 의미한다. 니트릴 옥사이드의 제조 예는 클로르아미드-T를 이용한 처리에 의하거나 이미도일 클로라이드 [RC(Cl)=NOH]에 대한 염기의 작용을 통해 알독심으로부터의 제자리 생성을 포함한다.
본원에서 사용되는 "니트론"은 Ra 및 Rb가 본원에서 이전에 정의되고, Rc가 본원에 정의된 바와 같은 C1-6 알킬, C2-6 알케닐, C2-6 알키닐, C3-7 카르보사이클릴, C6-10 아릴, 5-10원 헤테로아릴, 및 5-10원 헤테로사이클릴로부터 선택되는 "RaRbC=NRc +O-" 기를 의미한다.
본원에서 사용되는 "뉴클레오티드"는 질소 함유 헤테로사이클릭 염기, 당, 및 하나 이상의 포스페이트기를 포함한다. 뉴클레오티드는 핵산 서열의 단량체 단위이다. RNA에서, 당은 리보스이고, DNA에서는 데옥시리보스, 즉, 리보스의 2' 위치에 존재하는 하이드록실기가 결여된 당이다. 질소 함유 헤테로사이클릭 염기는 퓨린 염기 또는 피리미딘 염기일 수 있다. 퓨린 염기는 아데닌(A) 및 구아닌(G), 및 이들의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 피리미딘 염기는 시토신(C), 티민(T), 및 우라실(U), 및 이들의 변형된 유도체 또는 유사체를 포함한다. 데옥시리보스의 C-1 원자는 피리미딘의 N-1 또는 퓨린의 N-9에 결합된다.
본원에서 언급되는 "비-시퀀싱 존재물"은 DNA 또는 RNA 합성에서 적극적으로 관여하지 않는 임의의 방관자(spectator) 분자일 수 있다. 비-시퀀싱 존재물은 접목된 시퀀싱 프라이머 사이에 간격을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 비-시퀀싱 존재물은 또한 비특이적 결합을 제한하거나, 젤 물질의 친수성을 증가시키거나, 형광 특성을 향상시키거나, 이들의 조합과 같은 다른 기능(들)을 가질 수 있다. 이와 같이, 비-시퀀싱 존재물은 일-기능성, 이-기능성, 또는 다-기능성일 수 있다. 비-시퀀싱 존재물의 예는 비-기능성 프라이머, 중합체 가닥, 펩티드, 및/또는 형광 증강제를 포함한다.
"비-기능성 프라이머"는 DNA 또는 RNA 합성에 관여하지 않는 임의의 단일 가닥 핵산 서열이다. 비-기능성 프라이머의 예는 폴리 T 서열 또는 폴리 A 서열을 포함한다. 비-기능성 프라이머의 길이는 비-특이적 하이브리드화가 발생하지 않도록 선택될 수 있다. 예로서, 비-기능성 프라이머 길이는 3 내지 10의 범위일 수 있다. 일부 예에서, 비-기능성 프라이머 길이는 10개 미만의 염기이다.
"중합체 가닥"은 소수의 반복된 단량체 단위(즉, 올리고머) 또는 많은 반복된 단량체 단위(즉, 중합체)로 구성된 분자이다. 중합체 가닥은 선형이거나, 분지형이거나, 과분지형일 수 있다. 분지된 중합체의 예는 성상 중합체, 빗형 중합체, 솔형 중합체, 덴드론화 중합체, 사다리형, 및 덴드리머를 포함한다. 본원에 개시된 예에서, 중합체 가닥은 젤 물질과 반응할 수 있는 말단 작용기를 한 말단에 포함한다. 일부 예에서, 중합체 가닥의 다른 말단은 삼중항 상태 켄처, 항산화제, 또는 염료를 부착시키는 말단 작용기를 포함할 수 있다. 이들 예에서, 중합체 가닥은 젤 물질에 삼중항 상태 켄처, 항산화제, 또는 염료를 연결(부착)시키는 링커로 작용할 수 있다.
"펩티드"는 펩티드(아미드) 결합에 의해 연결된 아미노산 단량체의 짧은 사슬이다.
본원에서 사용되는 "시퀀싱 프라이머"는 DNA 또는 RNA 합성을 위한 시작점으로 작용하는 단일 가닥 핵산 서열(예를 들어, 단일 가닥 DNA 또는 단일 가닥 RNA)로 정의된다. 시퀀싱 프라이머의 5' 말단은 젤 물질과의 커플링 반응을 가능하게 하도록 변형될 수 있다. 시퀀싱 프라이머 길이는 임의의 수의 염기 길이일 수 있으며, 다양한 비-천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일 예에서, 시퀀싱 프라이머는 20개의 염기 내지 40개의 염기를 포함하는 짧은 가닥이다.
본원에서 사용되는 "부위"는 젤 물질, 시퀀싱 프라이머, 및 비-시퀀싱 존재물이 부착될 수 있는 지지체 상에 또는 지지체 내에 정의된 위치를 나타낸다.
용어 "기판" 및 "지지체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 부위가 위치되는 표면을 나타낸다. 지지체는 일반적으로 강성이고, 수성 액체에서 불용성이다. 지지체는 젤 물질을 변형시키기 위해 사용되는 화학물질에 대해 비활성일 수 있다. 예를 들어, 고체 지지체는 본원에 기재된 방법에서 젤 물질에 시퀀싱 프라이머 및 비-시퀀싱 존재물을 부착시키기 위해 사용되는 화합물질에 대해 비활성일 수 있다. 적합한 지지체의 예는 유리 및 변형되거나 기능화된 유리, 플라스틱(아크릴, 폴리스티렌 및 스티렌과 다른 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE)(예를 들어, Chemours로부터의 TEFLON®), 사이클릭 올레핀/사이클로-올레핀 중합체(COP)(예를 들어, Zeon으로부터의 ZEONOR®), 폴리이미드 등), 나일론, 세라믹, 실리카 또는 실리카-기반 물질, 실리콘 및 변형된 실리콘, 탄소, 금속, 무기 유리, 및 광섬유 다발을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 "테트라진" 및 "테트라지닐"은 4개의 질소 원자를 포함하는 6원 헤테로아릴기를 나타낸다. 테트라진은 선택적으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 "테트라졸"은 4개의 질소 원자를 포함하는 5원 헤테로사이클릭기를 나타낸다. 테트라졸은 선택적으로 치환될 수 있다.
용어 "말단 작용기"는 비-시퀀싱 존재물 상의 부속속물이어서 젤 물질과의 반응을 위해 접근 가능한 작용기를 나타낸다.
"티올" 작용기는 -SH를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "웰"은 지지체 표면의 사이 영역(들)에 의해 완전히 둘러싸인 표면 개구를 갖는 지지체 내의 별개의 오목한 특징부를 나타낸다. 웰은, 예를 들어, 원형, 타원형, 정사각형, 다각형, 성상 형태(임의의 수의 정점을 가짐) 등을 포함하는 표면 내의 개구부에서의 임의의 다양한 형태를 가질 수 있다. 표면과 직각으로 취해진 웰의 단면은 곡선, 정사각형, 다각형, 쌍곡선, 원뿔형, 각형 등일 수 있다.
본원에 기재되고 청구항에 열거된 양태 및 예는 상기 정의를 고려하여 이해될 수 있다.
도 1을 이제 참조하여, 어레이(10)의 예가 도시된다. 일반적으로, 어레이(10)는 기판 또는 지지체(12) 및 지지체(12)를 가로지르는 라인 또는 유동 채널(14)을 포함한다. 유동 채널(14) 각각은 사이 영역(18)에 의해 서로 분리되는 다수의 부위(16)를 포함한다. 각각의 부위(16)에서, 시퀀싱 프라이머(들)(20) 및 비-시퀀싱 존재물/존재물들(22)은 젤 물질(예를 들어, 도 2d의 24, 24')에 침착되고 부착된다.
도 1에 예시되고, 본 발명의 개시에서 논의된 어레이(10)는 다양한 담체 유체, 시약 등이 유동될 수 있는 고체 표면을 포함하는 챔버인 플로우 셀의 일부로서 배치되거나 형성될 수 있다. 일 예에서, 플로우 셀은 밀봉 물질(예를 들어, 흑색 폴리이미드 또는 또 다른 적합한 결합 물질)을 통해 상부 기판에 결합된 어레이(10)를 포함할 수 있다. 결합은 지지체(12), 밀봉 물질, 및 상부 기판의 결합 영역에서 발생한다. 결합 영역은 밀봉 물질이 인접한 유동 채널(14)로부터 하나의 유동 채널(14)을 물리적으로 분리(교차-오염을 방지하기 위함)시키도록 유동 채널 사이에 위치될 수 있고, 플로우 셀의 주변부에 위치(외부 오염으로부터 플로우 셀을 밀봉하기 위함)될 수 있다. 그러나, 결합 영역 및 밀봉 물질이 구현에 따라 임의의 원하는 영역에 배치될 수 있음이 이해되어야 한다. 결합은 레이저 결합, 확산 결합, 애노드 결합, 공융 결합, 플라즈마 활성화 결합, 유리 프릿 결합, 또는 당 분야에 공지된 다른 방법을 통해 달성될 수 있다.
어레이(10)와 통합될 수 있고/있거나 본 발명의 개시의 방법에서 용이하게 사용될 수 있는 플로우 셀 및 관련 유체 시스템 및 검출 플랫폼의 다른 예는, 예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)], WO 04/018497호; US 7,057,026호; WO 91/06678호; WO 07/123744호; US 7,329,492호; US 7,211,414호; US 7,315,019호; US 7,405,281호, 및 US 2008/0108082호에 기재되어 있다.
일부 적용에서, 플로우 셀은 반응 자동화 장치, 예를 들어, 뉴클레오티드 시퀀서에서 조절된 화학적 또는 생화학적 반응을 수행하기 위해 사용된다. 포트(26)가 지지체(12)를 통해 천공될 수 있다. 포트(26)에 연결함으로써, 반응 자동화 장치는 밀봉된 유동 채널(14) 내의 시약(들) 및 생성물(들)의 흐름을 제어할 수 있다. 반응 자동화 장치는, 일부 적용에서, 플로우 셀의 압력, 온도, 가스 조성 및 다른 환경적 조건을 조정할 수 있다. 또한, 일부 적용에서, 포트(26)는 상부 기판 내 또는 지지체(12)와 상부 기판 둘 모두에서 천공될 수 있다. 일부 적용에서, 밀봉된 유동 채널(14)에서 발생하는 반응은 열, 광 방출 및/또는 형광의 영상화 또는 측정에 의해 상부 기판 및/또는 지지체(12)를 통해 모니터링될 수 있다.
유동 채널(14), 부위(16) 등의 특정 배향은 도 1에 예시된 것과 상이할 수 있음이 이해되어야 한다. 일부 예에서, 부위(16)는 연속적이며, 따라서 사이 영역(18)에 의해 분리될 필요는 없다.
도 1의 어레이(10), 및 어레이(10)가 제조될 수 있는 방법의 예는 이제 도 2a 내지 2d를 참조로 하여 더욱 상세히 기재될 것이다.
도 2a는 지지체 내에 정의되고, 사이 영역(18)에 의해 분리된 부위(16)를 갖는 지지체(12)를 도시한다. 이러한 지지체(12)는 패턴화된 표면을 갖는다. "패턴화된 표면"은 고체 지지체(12)의 노출된 층 내 또는 층 상의 상이한 영역(즉, 부위(16))의 배열을 나타낸다. 예를 들어, 부위(16) 중 하나 이상은 하나 이상의 시퀀싱(증폭) 프라이머(20) 및 비-시퀀싱 존재물(22)이 존재하는 특징부일 수 있다. 상기 특징부는 시퀀싱 프라이머(20) 및 비-시퀀싱 존재물(22)이 존재하지 않는 사이 영역(18)에 의해 분리될 수 있다. 규칙적, 반복, 및 비-규칙적 패턴을 포함하는 부위(16)의 많은 상이한 레이아웃이 예견될 수 있다. 일 예에서, 부위(16)는 밀접한 패킹 및 개선된 밀도를 위해 육각형 격자로 배치된다. 다른 레이아웃은, 예를 들어, 직선형(즉, 직사각형) 레이아웃, 삼각형 레이아웃 등을 포함할 수 있다. 예로서, 레이아웃 또는 패턴은 열 및 행에 있는 부위(16)의 x-y 포맷일 수 있다. 일부 다른 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 부위(16) 및/또는 사이 영역(18)의 반복 배열일 수 있다. 또 다른 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 부위(16) 및/또는 사이 영역(18)의 무작위 배열일 수 있다. 패턴은 점, 패드, 웰, 기둥, 줄무늬, 소용돌이, 선, 삼각형, 직사각형, 원, 호, 체크, 격자무늬, 대각선, 화살표, 사각형, 및/또는 십자선을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 예에서 사용될 수 있는 패턴화된 표면의 또 다른 예는 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 8,778,849호; 9,079,148호; 8,778,848호; 및 미국 특허 공개 번호 2014/0243224호에 기재되어 있다.
레이아웃 또는 패턴은 정의된 영역에서 부위(16)의 밀도(즉, 부위(16)의 수)와 관련하여 특징지어질 수 있다. 예를 들어, 부위(16)는 ㎟ 당 약 200만개의 밀도로 존재할 수 있다. 밀도는, 예를 들어, ㎟ 당 적어도 약 100개, ㎟ 당 약 1,000개, ㎟ 당 약 10만개, ㎟ 당 약 100만개, ㎟ 당 약 200만개, ㎟ 당 약 500만개, ㎟ 당 약 1000만개, ㎟ 당 약 5000만개, 또는 그 초과의 밀도를 포함하는 상이한 밀도로 조정될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 밀도는 ㎟ 당 약 5000만개 이하, ㎟ 당 약 1000만개, ㎟ 당 약 500만개, ㎟ 당 약 200만개, ㎟ 당 약 100만개, ㎟ 당 약 10만개, ㎟ 당 약 1,000개, ㎟ 당 약 100개, 또는 그 미만이 되도록 조정될 수 있다. 지지체(12) 상의 부위(16)의 밀도가 상기 범위로부터 선택되는 낮은 값 중 하나와 높은 값 중 하나 사이일 수 있음이 추가로 이해되어야 한다. 예로서, 고밀도 어레이는 약 15 ㎛ 미만으로 분리된 부위(16)를 갖는 것으로 특징지어질 수 있고, 중간 밀도 어레이는 약 15 ㎛ 내지 약 30 ㎛로 분리된 부위(16)를 갖는 것으로 특징지어질 수 있고, 저밀도 어레이는 약 30 ㎛ 초과로 분리된 부위(16)를 갖는 것으로 특징지어질 수 있다.
레이아웃 또는 패턴은 또한 또는 대안적으로 평균 피치(pitch), 즉, 부위(16)의 중심으로부터 인접한 사이 영역(18)의 중심까지의 간격(중심-대-중심 간격)에 의해 특징지어질 수 있다. 패턴은 평균 피치 주변의 변동 계수가 작도록 규칙적일 수 있거나, 패턴은 불규칙적일 수 있으며, 이 경우 변동 계수는 비교적 클 수 있다. 어느 경우든, 평균 피치는, 예를 들어, 적어도 약 10 ㎚, 약 0.1 ㎛, 약 0.5 ㎛, 약 1 ㎛, 약 5 ㎛, 약 10 ㎛, 약 100 ㎛, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 평균 피치는, 예를 들어, 최대 약 100 ㎛, 약 10 ㎛, 약 5 ㎛, 약 1 ㎛, 약 0.5 ㎛, 약 0.1 ㎛, 또는 그 미만일 수 있다. 부위(16)의 특정 패턴에 대한 평균 피치는 상기 범위로부터 선택되는 낮은 값 중 하나와 높은 값 중 하나 사이일 수 있다. 일 예에서, 부위(16)는 약 1.5 ㎛의 피치(중심-대-중심 간격)를 갖는다.
일부 예에서, 부위(16)는 웰(16')이며, 따라서 지지체(12)는 그 표면에 웰(16')의 어레이를 포함한다. 웰(16')(또는 형태, 단면 등과 같은 상이한 구성을 갖는 다른 부위(16))은, 예를 들어, 포토리쏘그래피(photolithography), 나노임프린트 리쏘그래피, 스탬핑 기술, 엠보싱 기술, 몰딩 기술, 마이크로에칭 기술, 프린팅 기술 등을 포함하는 다양한 기술을 이용하여 제작될 수 있다. 당업자에 의해 인식되는 바와 같이, 사용되는 기술은 지지체(12)의 조성 및 형태에 의존할 것이다.
웰(16')은 마이크로웰(마이크론 규모, 예를 들어, 약 1 ㎛ 내지 약 1000 ㎛의 적어도 하나의 치수를 가짐) 또는 나노웰(나노규모, 예를 들어, 약 1 ㎚ 내지 약 1000 ㎚의 적어도 하나의 치수를 가짐)일 수 있다. 각각의 웰(16')은 이의 부피, 웰 개구 영역, 깊이, 및/또는 직경에 의해 특징지어질 수 있다.
각각의 웰(16')은 액체를 가둘 수 있는 임의의 부피를 가질 수 있다. 최소 또는 최대 부피는, 예를 들어, 어레이(10)의 다운스트림 사용에 대해 예상되는 처리량(예를 들어, 다중화), 분해능, 분석물 조성, 또는 분석물 반응성을 수용하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 부피는 적어도 약 1×10-3 ㎛3, 약 1×10-2 ㎛3, 약 0.1 ㎛3, 약 1 ㎛3, 약 10 ㎛3, 약 100 ㎛3, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 부피는 최대 약 1×104 ㎛3, 약 1×103 ㎛3, 약 100 ㎛3, 약 10 ㎛3, 약 1 ㎛3, 약 0.1 ㎛3, 또는 그 미만일 수 있다. 젤 물질(24)은 웰(16')의 부피의 전부 또는 일부를 채울 수 있음이 이해되어야 한다. 개별 웰(16') 내의 젤 물질(24)의 부피는 상기 명시된 값보다 크거나, 작거나, 그 사이일 수 있다.
표면 상의 각각의 웰 개구에 의해 점유된 영역은 웰 부피에 대해 상기 기재된 것과 유사한 기준을 기초로 하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 표면 상의 각각의 웰 개구에 대한 영역은 적어도 약 1×10-3 ㎛2, 약 1×10-2 ㎛2, 약 0.1 ㎛2, 약 1 ㎛2, 약 10 ㎛2, 약 100 ㎛2, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 영역은 최대 약 1×103 ㎛2, 약 100 ㎛2, 약 10 ㎛2, 약 1 ㎛2, 약 0.1 ㎛2, 약 1×10-2 ㎛2, 또는 그 미만일 수 있다.
각각의 웰(16')의 깊이는 적어도 약 0.1 ㎛, 약 1 ㎛, 약 10 ㎛, 약 100 ㎛, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 깊이는 최대 약 1×103 ㎛, 약 100 ㎛, 약 10 ㎛, 약 1 ㎛, 약 0.1 ㎛, 또는 그 미만일 수 있다.
일부 예에서, 각각의 웰(16')의 직경은 적어도 약 50 ㎚, 약 0.1 ㎛, 약 0.5 ㎛, 약 1 ㎛, 약 10 ㎛, 약 100 ㎛, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 직경은 최대 약 1×103 ㎛, 약 100 ㎛, 약 10 ㎛, 약 1 ㎛, 약 0.5 ㎛, 약 0.1 ㎛, 약 50 ㎚, 또는 그 미만일 수 있다.
형성된 어레이(10)에서, 젤 물질(24)은 별개의 웰(16') 각각에 위치된다. 각각의 웰(16')에 젤 물질(24)을 위치시키는 것은 도 2b에 제시된 바와 같이 젤 물질(24)로 지지체(12)의 패턴화된 표면을 먼저 코팅시킨 후, 웰(16') 사이의 구조화된 지지체(12)의 표면 상의 적어도 사이 영역(18)으로부터 젤 물질(24)을, 예를 들어, 화학적 또는 기계적 연마를 통해 제거함으로써 달성될 수 있다. 일부 예에서, 젤 물질은 화학적 또는 기계적 연마를 필요로 하지 않는 세척 단계에 의해 사이 영역으로부터 제거될 수 있다. 이들 공정은 웰(16') 내에 젤 물질(24)의 적어도 일부를 보유시키나, 웰(16') 사이의 구조화된 지지체(12)의 표면 상의 사이 영역(18)으로부터 젤 물질(24)의 적어도 실질적으로 전부를 제거하거나 비활성화시킨다. 이와 같이, 이들 공정은 많은 수의 사이클을 갖는 시퀀싱 실행에 걸쳐 안정적일 수 있는 시퀀싱에 사용되는 젤 패드(24')(도 2d)를 생성시킨다. 다른 예에서, 젤 물질(24)은 사이 영역으로부터 젤 물질을 제거하기 위한 화학적 또는 기계적 연마를 마찬가지로 필요로 하지 않는 선택적 침착 기술에 의해 각각의 웰(16')에 위치된다.
특히 유용한 젤 물질(24)은 그것이 존재하는 부위(16)의 형태를 따를 것이다. 일부 유용한 젤 물질(24)은 (a) 그것이 존재하는 부위(16)(예를 들어, 웰(16') 또는 다른 오목한 특징부)의 형태를 따를 수 있고, (b) 그것이 존재하는 부위(16)의 부피를 적어도 실질적으로 초과하지 않는 부피를 가질 수 있다.
적합한 젤 물질(24)의 일 예는 하기 화학식 (I)의 반복 단위를 갖는 중합체를 포함한다:
상기 식에서,
R1은 H 또는 선택적으로 치환되는 알킬이고;
R A 는 아지도, 선택적으로 치환되는 아미노, 선택적으로 치환되는 알케닐, 선택적으로 치환되는 하이드라존, 선택적으로 치환되는 하이드라진, 카르복실, 하이드록시, 선택적으로 치환되는 테트라졸, 선택적으로 치환되는 테트라진, 니트릴 옥사이드, 니트론, 및 티올로 구성된 군으로부터 선택되고; R5는 H 및 선택적으로 치환되는 알킬로 구성된 군으로부터 선택되고;
-(CH2)p- 각각은 선택적으로 치환될 수 있고;
p는 1 내지 50의 범위 내의 정수이고;
n은 1 내지 50,000의 범위 내의 정수이고;
m은 1 내지 100,000의 범위 내의 정수이다.
화학식 (I)로서 적합한 중합체는, 예를 들어, 각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 공개 번호 2014/0079923 A1호, 또는 2015/0005447 A1호에 기재되어 있다. 화학식 (I)의 구조에서, 당업자는 "n" 및 "m" 서브유닛이 중합체 전체에 걸쳐 무작위 순서로 존재하는 반복 서브유닛임을 이해할 것이다.
화학식 (I)과 같은 중합체 코팅의 특정 예는, 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2014/0079923 A1호, 또는 2015/0005447 A1호에 기재된 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아미드-코-아크릴아미드(PAZAM)이며, 이는 하기 제시된 구조를 포함한다:
상기 식에서, n은 1-20,000의 범위 내의 정수이고, m은 1-100,000의 범위 내의 정수이다. 화학식 (I)에서와 같이, 당업자는 "n" 및 "m" 서브유닛이 중합체 구조 전체에 걸쳐 무작위 순서로 존재하는 반복 단위임을 인지할 것이다.
화학식 (I) 중합체 또는 PAZAM 중합체의 분자량은 약 10 kDa 내지 약 1500 kDa의 범위일 수 있거나, 특정 예에서, 약 312 kDa일 수 있다.
일부 예에서, 화학식 (I) 중합체 또는 PAZAM 중합체는 선형 중합체이다. 일부 다른 구현예에서, 화학식 (I) 또는 PAZAM 중합체는 가볍게 가교 결합된 중합체이다. 다른 예에서, 화학식 (I) 또는 PAZAM 중합체는 분지를 포함한다. 다른 적합한 중합체는 SFA 및 브로모-아세트아미드기(예를 들어, BRAPA)로 유도체화된 SFA의 공중합체, 또는 SFA 및 아지도-아세트아미드기로 유도체화된 SFA의 공중합체이다.
적합한 젤 물질(24)의 다른 예는 아가로스와 같은 콜로이드 구조; 또는 젤라틴과 같은 중합체 메쉬 구조; 또는 폴리아크릴아미드 중합체 및 공중합체, 실란 비함유 아크릴아미드(SFA, 예를 들어, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 공개 번호 2011/0059865호 참조), 또는 SFA의 아지드 분해된 형태와 같은 가교 결합된 중합체 구조를 갖는 것을 포함한다. 적합한 폴리아크릴아미드 중합체의 예는, 예를 들어, WO 2000/031148호(전체내용이 참조로서 본원에 포함됨)에 기재된 바와 같은 아크릴아미드 및 아크릴산 또는 비닐기를 함유하는 아크릴산으로부터 형성되거나, 예를 들어, WO 2001/001143호 또는 WO 2003/0014392호(각각의 전체내용이 참조로서 본원에 포함됨)에 기재된 바와 같은 [2+2] 광-고리첨가 반응을 형성하는 단량체로부터 형성될 수 있다.
젤 물질(24)은 미리 형성된 젤 물질일 수 있다. 미리 형성된 젤 물질은 스핀 코팅, 또는 디핑, 또는 양압 또는 음압 하에서의 젤의 유동, 또는 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 번호 9,012,022호에 기재된 기술을 이용하여 코팅될 수 있다. 디핑 또는 딥 코팅은 사용되는 지지체(12) 및 젤 물질(24)에 따라 선택적 침착 기술일 수 있다. 일 예로서, 패턴화된 지지체(12)가 미리 형성된 젤 물질(24)에 디핑되고, 젤 물질(24)이 선택적으로 부위(16)를 채울 수 있고(즉, 젤 물질(24)이 사이 영역(18) 상에 침착되지 않음), 연마(또는 또 다른 제거 공정)가 필요하지 않을 수 있다.
미리 형성된 중합체 또는 PAZAM은 스핀 코팅, 또는 디핑, 또는 양압 또는 음압 하에서의 젤의 유동, 또는 미국 특허 번호 9,012,022호에 기재된 기술을 이용하여 패턴화된 지지체(12)에 코팅될 수 있다. 중합체 또는 PAZAM의 부착은 또한 실란화된 표면으로의 표면 개시 원자 전달 라디칼 중합(SI-ATRP)을 통해 발생할 수 있다. 이러한 예에서, 지지체(12) 표면은 표면 상의 하나 이상의 산소 원자에 실리콘을 공유적으로 연결(메커니즘에 의해 유지되도록 의도하지 않음, 각각의 실리콘은 1, 2 또는 3개의 산소 원자에 결합할 수 있음)시키기 위해 APTS(메톡시 또는 에톡시 실란)로 전처리될 수 있다. 이러한 화학적으로 처리된 표면은 소성되어 아민기 단층을 형성한다. 이후, 아민기는 Sulfo-HSAB와 반응하여 아지도 유도체를 형성한다. 1 J/cm2 내지 30 J/cm2의 에너지를 이용한 21℃에서의 UV 활성화는 PAZAM을 이용하여 다양한 삽입 반응을 용이하게 겪을 수 있는 활성 니트렌 종을 생성시킨다.
지지체(12) 상에 PAZAM을 코팅시키기 위한 다른 예는 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 공개 번호 2014/0200158호에 기재되어 있으며, 이는 아민-작용기화된 표면에 대한 PAZAM 단량체의 자외선(UV) 매개 연결, 또는 이후의 PAZAM의 침착 및 열의 적용을 갖는 활성기(아크릴로일 클로라이드 또는 다른 알켄 또는 알킨-함유 분자)를 수반하는 열 결합 반응을 포함한다. 일부 예에서, 표면은 클릭 화학과 같은 조건하에서 PAZAM 또는 아지도-유도체화 SFA를 포함하는 것과 같은 아지도-작용기화 중합체와 이후에 반응하여 변형된 표면과 중합체 사이에 공유 결합을 형성할 수 있는 알케닐 또는 사이클로알케닐기로 변형된다.
또 다른 예에서, PAZAM은 표면에 PAZAM의 작용기에 부착할 수 있는 실란 또는 실란 유도체를 포함하는 지지체(12) 상에 침착될 수 있다. 예를 들어, 실란 또는 실란 유도체는 PAZAM의 작용기에 공유적으로 부착할 수 있는 불포화 모이어티(예를 들어, 사이클로알켄, 사이클로알킨, 헤테로사이클로알켄, 헤테로사이클로알킨, 이들의 치환된 변이체, 및 이들의 조합물)를 함유할 수 있다. 사이클로알켄 불포화 모이어티의 예는 노르보르넨, 노르보르넨 유도체(예를 들어, 탄소 원자 중 하나 대신에 산소 또는 질소를 포함하는 (헤테로)노르보르넨), 트랜스사이클로옥텐, 트랜스사이클로옥텐 유도체, 트랜스사이클로펜텐, 트랜스사이클로헵텐, 트랜스-사이클로노넨, 바이사이클로[3.3.1]논-1-엔, 바이사이클로[4.3.1]데크-1(9)-엔, 바이사이클로[4.2.1]논-1(8)-엔, 및 바이사이클로[4.2.1]논-1-엔을 포함한다. 이들 사이클로알켄 중 임의의 것은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 미국 특허 공개 번호 2015/0005447호에 기재된 바와 같이 치환될 수 있다. 노르보르넨 유도체의 예는 [(5-바이사이클로[2.2.1]헵트-2-에닐)에틸]트리메톡시실란을 포함한다. 사이클로알킨 불포화 모이어티의 예는 사이클로옥틴, 사이클로옥틴 유도체, 또는 바이사이클로노닌(예를 들어, 바이사이클로[6.1.0]논-4-인 또는 이의 유도체, 바이사이클로[6.1.0]논-2-인, 또는 바이사이클로[6.1.0]논-3-인)을 포함한다. 이들 사이클로알킨은 또한 미국 특허 공개 번호 2015/0005447호에 기재된 바와 같이 치환될 수 있다.
이들 예에서, PAZAM은 스핀 코팅, 또는 디핑 또는 딥 코팅, 또는 양압 또는 음압 하에서의 작용기화된 분자의 유동, 또는 미국 특허 번호 9,012,022호에 기재된 기술을 이용하여 실란화된 지지체(12)의 표면 상에 침착될 수 있다. 침착을 위해, PAZAM은 용액(예를 들어, 에탄올 및 물 혼합물)에 존재할 수 있다. 침착된 후, PAZAM 용액은 또한 경화 공정에 노출되어 젤 물질(24)을 형성할 수 있다.
젤 물질(24)은 이후에 젤 물질(24)을 형성하는 액체일 수 있다. 젤 물질(24)을 이후에 형성하는 액체를 적용하는 예는 액체 형태이며, 시약이 표면 상에서의 중합화에 의해 젤을 형성하는 것을 가능하게 하는 실란 비함유 아크릴아미드 및 N-[5-(2-브로모아세틸)아미노펜틸]아크릴아미드(BRAPA)를 이용한 부위(16)의 어레이의 코팅이다. 또 다른 예는 액체 형태이며, 시약이 표면 상에서의 중합화에 의해 젤을 형성하는 것을 가능하게 하는 PAZAM 단량체를 이용한 부위(16)의 어레이의 코팅을 포함한다. 이러한 방식의 어레이의 코팅은 미국 특허 공개 번호 2011/0059865호에 기재된 바와 같은 화학 시약 및 절차를 이용할 수 있다.
젤 물질(24)은 지지체(12)에 공유적으로 연결될 수 있거나(부위 (16)에서), 지지체(12)에 공유적으로 연결되지 않을 수 있다. 부위(16)에 대한 젤 물질(24)의 공유적 연결은 다양한 사용 동안 어레이(10)의 수명 전체에 걸쳐 구조화된 부위(16)에 젤을 유지시키는데 도움이 된다. 하기는 공유 결합을 유도하는 지지체(12)의 일부 예에서 PAZAM과 실란 또는 실란 유도체 사이에 발생할 수 있는 반응의 일부 예이다.
지지체(12) 상의 실란 또는 실란 유도체가 불포화 모이어티로서 노르보르넨 또는 노르보르넨 유도체를 포함하는 경우, 노르보르넨 또는 노르보르넨 유도체는 i) PAZAM의 아지드/아지도기와 1,3-양극성 고리첨가 반응을 겪거나; ii) PAZAM에 부착된 테트라진기와 커플링 반응을 겪거나; PAZAM에 부착된 하이드라존기와 고리첨가 반응을 겪거나; PAZAM에 부착된 테트라졸기와 광-클릭 반응을 겪거나; PAZAM에 부착된 니트릴 옥사이드기와 고리첨가를 겪을 수 있다.
지지체(12) 상의 실란 또는 실란 유도체가 불포화 모이어티로서 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴 유도체를 포함하는 경우, 사이클로옥틴 또는 사이클로옥틴 유도체는 i) PAZAM의 아지드/아지도와 변형-촉진된 아지드-알킨 1,3-고리첨가(SPAAC) 반응을 겪거나, ii) PAZAM에 부착된 니트릴 옥사이드기와 변형-촉진된 알킨-니트릴 옥사이드 고리첨가 반응을 겪을 수 있다.
지지체(12) 상의 실란 또는 실란 유도체가 불포화 모이어티로서 바이사이클로노닌을 포함하는 경우, 바이사이클로노닌은 바이사이클릭 고리 시스템에서의 변형으로 인해 PAZAM에 부착된 아지드 또는 니트릴 옥사이드와 유사한 SPAAC 알킨 고리첨가를 겪을 수 있다.
지지체(12)와 젤 물질(24) 사이의 공유 결합의 몇 가지 예가 제공되나, 상기 및 많은 예에서 기재된 바와 같이, 젤 물질(24)은 부위(16)에 공유적으로 연결될 필요는 없다. 예를 들어, 실란 비함유 아크릴아미드, SFA는 지지체(12)의 어느 부분에도 공유적으로 부착되지 않는다.
상기 언급된 바와 같이, 도 2c는 사이 영역(18)으로부터의 젤 물질(24)의 제거를 예시한다. 제거는 연마를 통해 달성될 수 있다. 연마는 기계적 및/또는 화학적 처리 공정일 수 있다.
기계적 연마는 고체 지지체(12)의 표면(그 위에 젤 물질(24)을 가짐)에 연마력을 적용함으로써 수행될 수 있다. 예시적 방법은 비드의 슬러리를 이용한 마모, 시트 또는 천으로 닦음, 긁음 등을 포함한다. 연마에 사용되는 비드는 구형이거나 구형이 아닐 수 있고, 불규칙한 형태, 다각형 형태, 난형(ovoid) 형태, 신장된 형태, 원통형 형태 등을 가질 수 있음이 이해될 것이다. 비드의 표면은 부드럽거나 거칠 수 있다. 임의의 다양한 입자가 연마용 비드로 유용할 수 있다. 연마의 일 예는 사이 영역(18)으로부터 젤 물질(24)을 제거하기 위해 3 ㎛ 실리카 비드 슬러리(물 중 10% w/v)로 코팅된 린트가 없는(무균실 등급) 와이프를 이용하는 것을 포함한다. 연마 휠/분쇄기가 또한 상기 또는 또 다른 슬러리와 함께 사용될 수 있다.
기계적 연마의 또 다른 예는 또한 사이 영역(18)으로부터 젤을 제거하기 위해 유체 제트 또는 가스(예를 들어, 공기 또는 비활성 가스, 예를 들어, 아르곤 또는 질소) 제트를 이용하여 달성될 수 있다.
아크릴아미드의 가수분해 또는 라디칼-기반 분해(예를 들어, 벤조일 퍼옥사이드 또는 희석된 과산화수소에 대한 노출을 통함)와 같은 화학적 연마 기술이 또한 사용될 수 있다. 이러한 형태의 연마 동안, 화학물질은 고체, 액체, 가스 또는 플라즈마 상태로 제공될 수 있다. 따라서, 플라즈마 연마는 일부 예에서 유용할 수 있다.
연마는 또한 입자의 콜로이드성 현탁액을 함유하는 화학적 슬러리를 사용하여 사이 영역(18)으로부터 젤 물질(24)의 변위된 부분을 기계적으로 박리시킨 후 화학적으로 용해시키는 화학적 및 기계적 연마 방법의 조합을 포함할 수 있다. 일 예에서, 화학적 기계적 연마 시스템, 예를 들어, Strasbaugh ViPRR II 또는 다른 적합한 연마 헤드를 포함하는 웨이퍼 연마제가 사이 영역(18)의 밑에 있는 지지체(12)에 유해하게 영향을 미치지 않고 사이 영역(18)으로부터 젤 물질(24)을 제거하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 유형의 연마 시스템은 이전에 기재된 실리카 비드 슬러리, 또는 보다 부드러운 화학적 슬러리와 함께 사용될 수 있다. 일 예에서, 부드러운 화학적 슬러리는 칼슘 카르보네이트(CaCO3) 및 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA)로 구성된 군으로부터 선택되는 연마제 입자를 포함하는 염기성의 수성 슬러리이다. CaCO3의 평균 입자 크기는 약 15 ㎚ 내지 약 5 ㎛의 범위일 수 있으며, 일 예에서, 약 700 ㎚이다. CaCO3에 더하여, 염기성의 수성 슬러리는 또한 완충제, 킬레이트제, 계면활성제, 및/또는 분산제를 포함할 수 있다. 완충제의 예는 약 9의 pH를 갖는 용액에 존재할 수 있는 트리스 염기(즉, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄)을 포함한다. 킬레이트제의 예는 약 8의 pH를 갖는 용액에 존재할 수 있는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)이다. 계면활성제의 예는 소듐 도데실 설페이트이다. 상이한 분자량을 갖는 폴리아크릴레이트 분산제가 사용될 수 있다. 분산제의 예는 폴리(아크릴산 소듐 염)이다.
사이 영역(18)을 연마하거나 세척하기 위한 다른 방법은 접착제 기반 기술, 예를 들어, 젤 물질(24)에 대한 친화성을 갖는 강성의 평면 접착 필름이 적용됨으로써 사이 영역(18) 내의 젤 물질(24)과 밀접한 접촉(예를 들어, 화학적 결합을 통함)을 이루는 기술을 포함한다. 이러한 접착 필름의 기계적 제거/박리는 사이 영역(18)으로부터의 젤 물질(24)의 기계적 제거를 발생시킬 반면, 상기 부위(16)에 젤 물질(24)을 남긴다.
일 예에서, 티오포스페이트-접목된 SFA는 다음과 같이 지지체(12) 표면 상의 사이 영역(18)으로부터 제거될 수 있다: 물을 적신 Whatman 와이프를 알루미늄 옥사이드(약 100 ㎎, 0.3 ㎛) 또는 강철 비드에 가볍게 두드릴 수 있고, 그 후 형성된 슬러리가 균일한 압력을 이용하여 작은 동심원으로 지지체의 표면(그 위에 티오포스페이트-접목된 SFA를 가짐) 상에 문질러질 수 있고, 그 후 깨끗한 물에 적신 Whatman 와이프가 표면으로부터 슬러리 및 티오포스페이트-접목된 SFA를 제거하기 위해 사용될 수 있다.
사이 영역(18)으로부터 젤 물질(24)을 제거하기 위해 본원에 예시된 기계적 및 화학적 연마 방법은 또한 젤 물질(24)이 제거되는지 아니든지 간에 사이 영역(18)에서 젤 물질을 비활성화시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 젤 물질(24)은 시퀀싱 프라이머(20) 및 비-시퀀싱 존재물(22)을 부착시키는 능력에 대해 불활성화될 수 있다.
젤 물질(24)이 각각의 웰(16')에 위치된 후, 시퀀싱 프라이머(들)(20) 및 비-시퀀싱 존재물/존재물들(22)이 젤 물질(24)에 접목된다. 일부 예에서, 프라이머(들)(20)은 비-시퀀싱 존재물/존재물들(22)이 젤 물질(24)에 접목되기 전 또는 후에 접목될 수 있다. 다른 예에서, 프라이머(들)(20) 및 비-시퀀싱 존재물/존재물들(22)은 젤 물질(24)에 공동 접목된다.
순차적 접목은 지지체(12)(부위(16)에 젤 물질(24)을 가짐)를 시퀀싱 프라이머(들)(20)를 함유하는 용액 또는 혼합물에 노출시키고, 인큐베이션시킨 후, 비-시퀀싱 존재물(22)을 함유하는 용액 또는 혼합물에 노출시키고, 인큐베이션시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 순차적 접목은 지지체(12)(부위(16)에 젤 물질(24)을 가짐)를 비-시퀀싱 존재물(22)을 함유하는 용액 또는 혼합물에 노출시키고, 인큐베이션시킨 후, 시퀀싱 프라이머(들)(20)을 함유하는 용액 또는 혼합물에 노출시키고, 인큐베이션시킴으로써 달성될 수 있다.
공동-접목은 지지체(12)(부위(16)에 젤 물질(24)을 가짐)를 시퀀싱 프라이머(들)(20) 및 비-시퀀싱 존재물(22)을 함유하는 용액 또는 혼합물에 노출시킨 후, 인큐베이션시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 용액 또는 혼합물에 대한 지지체(12)의 노출은 시퀀싱 프라이머(들)(20) 및 비-시퀀싱 존재물(22)의 혼합물을 지지체(12) 상에 침착시킴으로써 달성될 수 있다. 일 예에서, 용액 또는 혼합물은 젤 물질(24) 코팅된 지지체(12)를 가로 질러 끌어당겨질 수 있다(도 2c에 제시됨).
임의의 접목 예에서, 인큐베이션은 사용되는 시퀀싱 프라이머(들)(20) 및 비-시퀀싱 존재물(22)에 부분적으로 의존하는 소정의 온도에서 발생한다. 예로서, 인큐베이션은 실온(즉, 약 25℃) 내지 약 60℃ 범위의 온도에서 달성될 수 있다.
또한, 임의의 접목 예에서, 용액은 시퀀싱 프라이머(들)(20) 및/또는 비-시퀀싱 존재물(22), 물, 완충제, 및 촉매를 포함할 수 있다. 동일 용액/혼합물 또는 별도의 용액/혼합물에 존재하는지의 여부에 상관 없이 비-시퀀싱 존재물(22) 대 시퀀싱 프라이머(20)의 몰 비는 약 0.25:1 내지 약 5:1의 범위이다.
적합한 시퀀싱 프라이머(20)의 예는 정방향 증폭 프라이머 또는 역방향 증폭 프라이머를 포함한다. 적합한 시퀀싱 프라이머(20)의 예는 P5 또는 P7 프라이머를 포함한다. P5 및 P7 프라이머는 HiSeq®, HiSeqX®, MiSeq®, NextSeq® 및 Genome Analyzer® 기계 플랫폼에서의 시퀀싱을 위해 Illumina Inc.에 의해 판매되는 상업적 플로우 셀의 표면에서 사용된다. P5 및 P7 프라이머 서열은 하기를 포함한다:
P5: 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGA(dU)CTACAC (SEQ. ID NO. 1)
P7: 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG*AT (SEQ. ID NO. 2)
여기서, G*은 8-옥소구아닌이다.
선택적으로, P5 및 P7 프라이머 중 하나 또는 둘 모두는 폴리 T 꼬리를 포함할 수 있다. 폴리 T 꼬리는 일반적으로 서열의 5' 말단에 위치하나, 일부 경우에, 3' 말단에 위치할 수 있다. 폴리 T 서열은 임의의 수, 예를 들어, 2 내지 20개의 T 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
P5 및 P7 프라이머뿐만 아니라 다른 시퀀싱 프라이머(20)는 5' 말단에서 젤 물질(24)의 작용기와 반응할 수 있는 기로 변형될 수 있다. 적합한 작용기의 일 예는 젤 물질(24)의 아지드와 반응할 수 있는 바이사이클로[6.1.0] 논-4-인(BCN)이다. 다른 예시적인 말단화 프라이머는 테트라진 말단화 프라이머, 노르보르넨 말단화 프라이머, 알킨 말단화 프라이머, 아미노 말단화 프라이머, 에폭시 또는 글리시딜 말단화 프라이머, 티오포스페이트 말단화 프라이머, 및 트리아졸린디온 말단화 프라이머를 포함한다. 일부 구현예에서, 말단화 프라이머는 알킨 말단화 프라이머를 포함한다. 다른 구현예에서, 말단화 프라이머는 티오포스페이트 말단화 프라이머를 포함한다. 당업자는 본원에 제시된 바와 같은 핵산의 포획 및 증폭에 적합한 시퀀싱 프라이머(20)를 설계하고 사용하는 방법을 이해할 것이다.
적합한 비-시퀀싱 존재물(22)의 예는 비-기능성 프라이머, 중합체 가닥, 펩티드, 및/또는 형광 증강제를 포함한다.
상기 언급된 바와 같이, 비-기능성 프라이머는 이의 접목된 그대로의 형태로 DNA 또는 RNA 합성에 관여하지 않는 임의의 단일 가닥 핵산 서열이다. 예로는 폴리 T 서열 또는 폴리 A 서열을 포함한다.
중합체 가닥의 예는 덴드리머(예를 들어, 폴리(아미도) 아민 또는 PAMAM), 폴리덱스트란, 메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린(PCA), 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG, 즉, 폴리(에틸렌 옥사이드) 또는 PEO), 폴리(에틸렌 이민)(PEI), 폴리-L-리신(PLL), 프로파길 메타크릴레이트(PMA), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAM), 폴리(에틸렌 글리콜)아크릴레이트(POEGA), 폴리(프로필렌 이민)(PPI, 덴드리머 코어임), 폴리(비닐 알콜)(PVA), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 폴리아크릴산(PAA), 및 폴리(트롤록스 에스테르)를 포함한다.
이들 중합체 가닥 물질 각각은 젤 물질(24)에 부착된 시퀀싱 프라이머(20) 사이에 추가 공간을 생성시키기 위한 스페이서로서 작용할 수 있다. 이들 중합체 가닥 물질의 일부는 또한 젤 물질(24)에 친수성을 부여할 수 있고, 젤 물질(24) 상의 비특이적 결합을 제한할 수 있는 특성을 갖는다. 이러한 중합체 가닥 물질의 예는 PEG를 포함한다. 본원에 개시된 예에서, PEG는 약 0.5 KDa 내지 약 10 KDa의 범위의 분자량을 갖는다. 다른 중합체 가닥 물질은 또한 다기능성이며, 예를 들어, 폴리(트롤록스 에스테르)는 스페이서일 수 있고, 항산화제일 수 있다.
중합체 가닥은 젤 물질(24)의 기(들)와 반응할 수 있는 작용기를 포함하거나, 젤 물질(24)의 기(들)와 반응할 수 있는 작용기를 포함하도록 변형된다. 상기 작용기의 예는 알킨, 노르보르닐, 구리 비함유 클릭 모이어티(예를 들어, 디벤조사이클로옥틴(DIBO) 또는 에테르), 및 티올을 포함한다. 알킨, 노르보르닐, 및 구리 비함유 클릭 모이어티는 클릭 반응을 통해 PAZAM의 아지드와 반응할 수 있다. 티올은 SFA와 반응할 수 있다. 나열된 작용기 중 하나를 포함하는 중합체 가닥 물질의 예는 PMA이며, 이는 알킨을 포함한다. 변형된 중합체 가닥의 예는 알킨 말단화 PEG, 알킨 말단화 PMMA, 노르보르닐 말단화 PMMA, 티올 말단화 PNIPAM, 알킨 말단화 PVA, 티올 말단화 PVA, 알킨 말단화 PAA, 및 티올 말단화 PAA를 포함한다.
일부 예에서, 기재된 바와 같은 중합체 가닥은 비-시퀀싱 존재물(22)로서 젤 물질(24)에 접목될 수 있다.
다른 예에서, 기재된 바와 같은 중합체 가닥은 젤 물질(24)에 삼중항 상태 켄처, 항산화제, 또는 FRET 공여체와 같은 형광 증강제를 부착시키는 링커 분자일 수 있다. 예를 들어, 중합체 가닥은 젤 물질(24)에 부착시키기 위해 한 말단에서 알킨으로 말단화될 수 있고, 삼중항 상태 켄처, 항산화제, 또는 FRET 공여체에 부착시키기 위해 다른 말단에서 작용기(예를 들어, 티올, 아민, 알데하이드, 또는 카르복실산)로 말단화될 수 있다.
적합한 삼중항 상태 켄처의 예는 사이클로-옥틸테트라엔(COT), 트롤록스(6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산(Hoffmann-La Roche AG)), 및 니트로벤질 알콜(NBA)로 구성된 군으로부터 선택된다. 적합한 항산화제의 예는 아스코르베이트, 글루타티온, 갈산, 카테킨, 트롤록스, 및 비타민 E로 구성된 군으로부터 선택된다. 부착된 FRET 공여체는 완전 기능성 뉴클레오티드(FFN)(시퀀싱에서 검출되는 염료, 합성에 의한 시퀀싱(SBS)에서 혼입됨)와 함께 최적의 스펙트럼 중첩 및 FRET 효율을 갖도록 맞춤화되거나 선택된다. FRET 공여체의 예는 녹색 방출 염료(시퀀싱 워크플로우에서 뉴클레오티드에 혼입됨)를 갖는 FRET에 대한 공여체 염료 및 적색 방출 염료(시퀀싱 워크플로우에서 뉴클레오티드에 혼입됨)를 갖는 FRET에 대한 공여체 염료로 구성된 군으로부터 선택된다. 녹색 방출 완전 기능성 뉴클레오티드(FFN)를 갖는 FRET에 대한 공여체 염료의 특정 예는 Cy2®(시아닌 염료, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), Alexa Fluor® 염료(예를 들어 488)(ThermoFisher Scientific), 및 Atto 염료(예를 들어, 465, 488, 및 490)(Atto-Tec)를 포함하며; 적색 방출 FFN을 갖는 FRET에 대한 공여체 염료의 특정 예는 Cy3®(시아닌 염료, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.), Alexa Fluor® 염료(예를 들어, 546, 555, 568, 및 594)(ThermoFisher Scientific), 및 Atto 염료(예를 들어, 532)(Atto-Tec)를 포함한다. FRET 공여체는 542 ㎚, 550 ㎚, 565 ㎚(흡수 파장) 및/또는 Rhodamine 6G를 포함하는 합성 형태에 의해 1개 또는 2개 염료 시퀀싱에 사용하기에 적합할 수 있다.
이들 다른 예에서, 중합체 가닥 및 부착된 형광 증강제는 함께 비-시퀀싱 존재물(22)을 구성한다. 이들 다른 예에서, 중합체 가닥의 다른 말단(예를 들어, 젤 물질(24)에 부착되는 말단에 대향하는 말단)은 형광 증강제의 기(들)을 혼입하거나 이와 반응할 수 있는 작용기를 포함하거나, 형광 증강제의 기(들)을 혼입하거나 이와 반응할 수 있는 작용기를 포함하도록 변형된다. 상기 작용기의 예는 티올, 아민, 알데하이드, 및 카르복실산을 포함한다. 중합체 가닥에 형광 증강제를 부착시킬 수 있는 다른 작용기가 또한 사용될 수 있다.
예로서, 비타민 E는 PAA에 컨쥬게이션될 수 있고, 글루타티온, 아스코르브산, 갈산 또는 카테킨은 PEG 또는 PMMA에 컨쥬게이션될 수 있다.
다른 예로서, FRET 공여체는 알킨기를 갖거나 알킨기로 변형된 중합체 가닥 중 임의의 것에 컨쥬게이션될 수 있다.
비-시퀀싱 존재물의 또 다른 예는 펩티드이다.
접목된 그대로의 시퀀싱 프라이머(들)(20) 및 비-시퀀싱 존재물/존재물들(22)이 도 2d 및 3에 제시된다. 접목된 비-시퀀싱 존재물(22) 대 접목된 시퀀싱 프라이머(20)의 몰 비는 약 0.25:1 내지 약 5:1의 범위이다. 또 다른 예에서, 접목된 비-시퀀싱 존재물(22) 대 접목된 시퀀싱 프라이머(20)의 몰 비는 약 0.5:1 내지 약 2:1의 범위이다. 접목된 그대로의 비-시퀀싱 존재물/존재물들(22)은 후속적으로 수행되는 시퀀싱 기술에 관여하지 않을 것이며, 오히려 부위(16)에서 시퀀싱 프라이머(들)(20)를 이격시키고, 부위(16)에 추가 기능을 제공할 수 있다.
본원에 개시된 어레이(10)는 합성에 의한 시퀀싱(SBS), 라이게이션에 의한 시퀀싱, 피로시퀀싱(pyrosequencing) 등으로 종종 언급되는 기술을 포함하는 다양한 시퀀싱 접근법 또는 기술에서 사용될 수 있다. 이들 기술 중 임의의 기술로, 젤 물질(24) 및 부착된 시퀀싱 프라이머(20)가 부위(16)에 존재하고, 사이 영역(18)에 존재하지 않으므로, 증폭은 다양한 부위(16)에 한정될 것이다.
간단히, 합성에 의한 시퀀싱(SBS) 반응은 Illumina(San Diego, CA)로부터의 HiSeq®, HiSeqX®, MiSeq® 또는 NextSeq® 시퀀서 시스템과 같은 시스템에서 실행할 수 있다. 시퀀싱될 표적 DNA 분자의 세트는 결합된 시퀀싱 프라이머(20)에 하이브리드화되고(비-시퀀싱 존재물(22)에는 하이브리드화되지 않음), 이후 브릿지 증폭 또는 동역학 배제 증폭에 의해 증폭된다. 변성은 젤 물질(24)에 고정된 단일-가닥 주형을 남기고, 이중 가닥 DNA의 수백만 개의 밀집 클러스터가 생성된다(즉, 클러스터 생성). 시퀀싱 반응이 수행되고, 일부 예에서, 시퀀싱 프라이머(20) 및 비-시퀀싱 존재물(22)(및 증폭 단계 동안 연장되어 표적 DNA의 카피를 포함하는 프라이머를 포함하는 앰플리콘)이 이후 젤 물질(24)로부터 결합되지 않아 표면이 향후 시퀀싱 반응에서 재사용 가능하다. 따라서, 시퀀싱 프라이머(20) 및 비-시퀀싱 존재물(22)을 젤 물질(24)에 부착시키고, 표적 DNA 분자를 시퀀싱 프라이머(20)에 하이브리드화시키고, 브릿지 증폭시키고, 표적 DNA를 시퀀싱하고, 시퀀싱 프라이머(20) 및 비-시퀀싱 존재물(22) 및 앰플리콘을 제거하는 단계 중 하나 이상이 반복될 수 있다. 하나 이상의 반복이 수행될 수 있다.
본 발명의 개시를 추가로 예시하기 위해, 실시예가 본원에 제공된다. 이들 실시예는 예시 목적으로 제공되며, 본 발명의 개시의 범위를 제한하는 것으로 해석되어선 안되는 것이 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1
시퀀싱 프라이머(예를 들어, 폴리 T 꼬리를 갖는 P5/P7)를 Illumina, Inc.로부터 이용 가능한 플로우 셀의 웰에서 비-시퀀싱 프라이머(즉, NSP로 언급되는 5'-헥신-TTT)와 접목시켰다. 비-시퀀싱 프라이머 대 시퀀싱 프라이머의 몰 비는 샘플 사이에서 다양하였다. 2개의 대조군 샘플에 대해서는 비-시퀀싱 프라이머 없이 시퀀싱 프라이머를 사용하였다.
각각의 샘플에 대해 혼합물을 제조하였다. 혼합물은 초순수, 완충제, 및 과량의 촉매(예를 들어, CuSO4(20 mM-200 mM), 아스코르베이트(20 mM-200 mM), 및 펜타메틸디에틸렌트리아민(PMDTA)(105 mM-1050 mM)을 포함하였다. 시퀀싱 프라이머(들)의 농도는 약 1 μM이었다. 촉매의 전체량은 각각의 샘플에서 동일하였다. 비-시퀀싱 프라이머(NSP) 대 시퀀싱 프라이머(P5/P7)의 몰 비는 표 1에 제시된다.
표 1
각각의 혼합물을 각각의 플로우 셀 레인에 적용시키고, 약 60℃에서 인큐베이션하였다. 플로우 셀을 세척하여 결합되지 않은 프라이머를 제거하였다.
완충제 및 TET 올리고(즉, P5/P7 프라이머에 대한 상보적 서열을 갖는 염료 표지된 올리고뉴클레오티드)를 포함하는 테트라클로로-플루오레세인(TET) 혼합물을 플로우 셀 레인에 적용시켜 표면 시퀀싱 프라이머를 염색시켰다. TET는 표면 상의 P5/P7 프라이머에 하이브리드화될 수 있고; 과량의 TET는 세척될 수 있고, 부착된 염료 농도(강도의 측면에서)는 Typhoon Scanner(General Electric)와 같은 스캐닝 기계를 이용하여 형광 검출에 의해 측정될 수 있다. 강도 데이터로부터, 공간 분포 및 프라이머 밀도가 결정될 수 있다. 결과는 도 4에 제시된다. 결과는 시퀀싱 프라이머와 비-시퀀싱 프라이머의 접목이 10:1 미만의 몰 비에서 비-시퀀싱 프라이머가 없는 시퀀싱 프라이머의 접목과 동등한 것을 나타낸다.
실시예 2
시퀀싱 프라이머(예를 들어, 폴리 T 꼬리를 갖는 P5/P7)를 Illumina, Inc.로부터 이용 가능한 플로우 셀의 웰에서 비-시퀀싱 프라이머(즉, 5'-헥신-TTT)와 접목시켰다. 비-시퀀싱 프라이머 대 시퀀싱 프라이머의 몰 비는 샘플 사이에서 다양하였다. 하나의 대조군 샘플에 대해서는 비-시퀀싱 프라이머 없이 시퀀싱 프라이머를 사용하였다.
각각의 샘플에 대해 혼합물을 제조하였다. 혼합물은 초순수, 완충제, 및 과량의 촉매(예를 들어, CuSO4(20 mM-200 mM), 아스코르베이트(20 mM-200 mM), 및 펜타메틸디에틸렌트리아민(PMDTA)(105 mM-1050 mM)을 포함하였다. P5/P7 시퀀싱 프라이머의 농도는 약 1 μM이었다. 촉매의 전체량은 혼합물의 일부에 대해 다양하였다. 비-시퀀싱 프라이머 대 시퀀싱 프라이머의 몰 비 및 촉매량에서의 변동이 표 2에 제시된다.
표 2
각각의 혼합물을 각각의 플로우 셀 레인에 적용시키고, 약 60℃에서 인큐베이션하였다. 플로우 셀을 세척하여 결합되지 않은 프라이머를 제거하였다.
플로우 셀을 영상화, 클러스터링, 및 시퀀싱을 위해 하이브리드화에 노출시켰다. 판독 2 C1A 강도를 측정하였고, 이들 결과는 도 5에 제시된다. 이들 결과는 과량의 촉매 없이 시퀀싱 프라이머와 비-시퀀싱 프라이머의 접목이 시퀀싱 강도를 증가시킬 수 있음을 예시한다.
실시예 3
폴리 T 꼬리를 갖는 P5/P7 시퀀싱 프라이머를 Illumina Inc.로부터 이용 가능한 2개의 플로우 셀에 비-시퀀싱 존재물(비-시퀀싱 중합체 가닥 또는 NSPS로 언급됨)로서 중합체 가닥과 함께 접목시켰다. 중합체 가닥은 PEG-알킨이었고, PEG 알킨의 분자량은 샘플 사이에서 다양하였다. 비-시퀀싱 중합체 가닥 대 시퀀싱 프라이머의 몰 비는 또한 샘플 사이에서 다양하였다. 4개의 대조군 샘플에 대해서는 비-시퀀싱 중합체 가닥 없이 시퀀싱 프라이머를 사용하였다.
2개의 혼합물을 제조하였다. 시퀀싱 프라이머 혼합물은 초순수, 완충제, 및 과량의 촉매(예를 들어, CuSO4(20 mM-200 mM), 아스코르베이트(20 mM-200 mM), 및 펜타메틸디에틸렌트리아민(PMDTA)(105 mM-1050 mM)을 포함하였다. P5/P7 시퀀싱 프라이머의 농도는 약 1 μM이었다. 새로이 제조된 PEG-알킨 용액을 사용하였다(예를 들어, 상이한 분자량의 PEG-알킨이 물에 용해되었다).
시퀀싱 프라이머 혼합물을 표 3에 제시된 바와 같이 원하는 몰 비로 비-시퀀싱 중합체 가닥 용액 중 하나와 함께 또는 이것 없이 각각의 플로우 셀 레인에 적용시켰다. 표 3은 또한 각각의 레인에서 사용된 PEG-알킨 분자량을 나타낸다. 플로우 셀을 약 60℃에서 인큐베이션하고, 세척하여, 결합되지 않은 물질을 제거하였다.
표 3
플로우 셀을 영상화, 클러스터링, 및 시퀀싱을 위해 하이브리드화에 노출시켰다. 시퀀싱 데이터를 수집하였고, 필터를 통해 통과하는 클러스터의 백분율(필터 통과(PF) %)에 대한 결과가 도 6a(플로우 셀 1) 및 6b(플로우 셀 2)에 제시되고, 패드 호핑(PH)에 대한 결과가 도 7a(플로우 셀 1) 및 7b(플로우 셀 2)에 제시된다. 필터 통과(PF) %는 순 임계값(chastity threshold)을 통과하고, 시퀀싱 데이터의 추가 처리 및 분석에 사용되는 클러스터를 설명하는데 사용되는 메트릭(metric)이다. 패드 호핑 %는 독특한 클러스터 근처 내에 위치한 중복 클러스터의 양을 설명하는 메트릭이다. 더 높은 필터 통과 % 및 더 낮은 패드 호핑 %는 시퀀싱 데이터에 사용되는 독특한 클러스터의 증가된 수율을 발생시킨다. 이들 결과는 시퀀싱 프라이머와 더 낮은 분자량의 PEG-알킨(즉, KDa > 10)의 접목이 임의의 PEG-알킨이 없는 시퀀싱 프라이머의 접목과 동등한 것을 예시한다. 이와 같이, 중합체 가닥 비-시퀀싱 존재물의 도입은 시퀀싱 결과에 유해하게 영향을 미치지 않으며, 플로우 셀 웰 내의 젤 물질에 친수성을 부가하며, 비특이적 결합을 제한하고, 기타 작용을 한다.
추가 참고사항
상기 개념의 모든 조합(이러한 개념이 상호 불일치하지 않는다면)이 본원에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려되는 것이 인지되어야 한다. 특히, 본 발명의 개시의 말단에 나타나는 청구된 주제의 모든 조합이 본원에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려된다. 참조로서 포함되는 임의의 개시물에서 또한 나타날 수 있는 본원에서 명백히 사용되는 용어는 본원에 개시된 특정 개념과 가장 일치하는 의미에 따라야 하는 것이 또한 인지되어야 한다.
본 명세서에 인용된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 이들의 전체내용이 참조로서 본원에 포함된다.
"일 예", "또 다른 예", "예" 등에 대한 본 명세서 전체에 걸친 언급은 상기 예와 관련하여 기재된 특정 요소(예를 들어, 특징, 구조, 및/또는 특성)이 본원에 기재된 적어도 하나의 예에 포함되고, 다른 예에 존재하거나 존재하지 않을 수 있음을 의미한다. 또한, 임의의 예에 대한 기재된 요소는 문맥이 명백히 달리 지시하지 않는 한 다양한 예에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있음이 이해되어야 한다.
본원에 제공된 범위가 언급된 범위 및 언급된 범위 내의 임의의 값 또는 하위 범위를 포함하는 것이 이해되어야 한다. 예를 들어, 약 0.5 KDa 내지 약 10 KDa 미만의 범위는 약 0.5 KDa 내지 약 10 KDa 미만의 명백히 언급된 한계를 포함할 뿐만 아니라 개별적 값, 예를 들어, 약 0.8 KDa, 약 3.25 KDa, 약 5 KDa, 약 7.5 KDa 등, 및 하위 범위, 예를 들어, 약 4.25 KDa 내지 약 9 KDa, 약 5.4 KDa 내지 약 7.75 KDa 등을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 또한, "약" 및/또는 "실질적으로"가 값을 기재하기 위해 사용되는 경우, 이는 언급된 값으로부터 사소한 변화(최대 +/- 10%)를 포함하는 것을 의미한다.
몇 가지 예가 상세히 기재되었으나, 개시된 예는 변형될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 상기 기재는 비제한적인 것으로 고려되어야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Illumina, Inc. <120> ARRAY INCLUDING SEQUENCING PRIMER AND NON-SEQUENCING ENTITY <130> IP-1486-PCT <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer_bind <400> 1 aatgatacgg cgaccaccga gaductacac 30 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> primer_bind <220> <221> misc_feature <222> (22)..(22) <223> 8-oxoguanine <400> 2 caagcagaag acggcatacg anat 24

Claims (24)

  1. 복수의 개별 웰을 포함하는 지지체;
    개별 웰 각각에 위치되는 젤 물질;
    젤 물질에 접목된 시퀀싱 프라이머; 및
    젤 물질에 접목되고 링커를 통해 켄처 또는 항산화제와 연결된 비-시퀀싱 존재물을 포함하는 어레이로서,
    시퀀싱 프라이머 및 비-시퀀싱 존재물 각각이 접목된 그대로의 형태로 존재하며,
    비-시퀀싱 존재물이 덴드리머, 폴리덱스트란, 메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 이민), 폴리-L-리신, 프로파길 메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(에틸렌 글리콜) 아크릴레이트, 폴리(프로필렌 이민), 폴리(비닐 알콜), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 폴리아크릴산, 폴리(트롤록스 에스테르), 펩티드, 및 DNA 또는 RNA 합성에 관여하지 않는 임의의 단일 가닥 핵산 서열인 비-기능성 프라이머로 구성된 군으로부터 선택되는 어레이.
  2. 제1항에 있어서, 비-시퀀싱 존재물이 비-기능성 프라이머이고, 비-기능성 프라이머가 폴리T 또는 폴리A인 어레이.
  3. 제1항에 있어서, 비-시퀀싱 존재물이 0.5 KDa 내지 10 KDa의 범위의 분자량을 갖는 폴리(에틸렌 글리콜)인 어레이.
  4. 제1항에 있어서, 비-시퀀싱 존재물이 알킨, 노르보르닐, 구리 비함유 클릭 모이어티, 및 티올로 구성된 군으로부터 선택되는 말단 작용기를 통해 젤 물질에 접목되는 어레이.
  5. 제1항 또는 제4항에 있어서, 비-시퀀싱 존재물이 링커 및 링커에 결합된 삼중항 상태 켄처(triplet state quencher) 또는 항산화제를 포함하는 어레이.
  6. 제5항에 있어서,
    링커가 덴드리머, 폴리덱스트란, 메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 이민), 폴리-L-리신, 프로파길 메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(에틸렌 글리콜) 아크릴레이트, 폴리(프로필렌 이민), 폴리(비닐 알콜), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 폴리아크릴산, 및 폴리(트롤록스 에스테르)로 구성된 군으로부터 선택되고;
    삼중항 상태 켄처가 사이클로-옥틸테트라엔(COT), 트롤록스(6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산), 및 니트로벤질 알콜(NBA)로 구성된 군으로부터 선택되거나;
    항산화제가 아스코르베이트, 글루타티온, 갈산, 카테킨, 트롤록스(6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산), 및 비타민 E로 구성된 군으로부터 선택되는 것 중 하나인, 어레이.
  7. 제1항 또는 제4항에 있어서, 형광 공명 에너지 전달(FRET) 공여체가 링커에 결합된 어레이.
  8. 제7항에 있어서,
    FRET 공여체가 녹색-방출 염료를 갖는 FRET에 대한 공여체 염료 및 적색-방출 염료를 갖는 FRET에 대한 공여체 염료로 구성된 군으로부터 선택되는, 어레이.
  9. 제1항에 있어서, 비-시퀀싱 존재물 대 시퀀싱 프라이머의 몰 비가 0.25:1 내지 5:1의 범위인 어레이.
  10. 제1항에 있어서, 젤 물질이 하기 화학식 (I)의 반복 단위를 포함하는 어레이:

    상기 식에서,
    R1은 H, 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
    R A 는 아지도, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환된 하이드라존, 치환 또는 비치환된 하이드라진, 카르복실, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 테트라졸, 치환 또는 비치환된 테트라진, 니트릴 옥사이드, 니트론, 및 티올로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R5는 H, 및 치환 또는 비치환된 알킬로 구성된 군으로부터 선택되고;
    -(CH2)p- 각각은 치환 또는 비치환될 수 있고;
    p는 1 내지 50의 범위 내의 정수이고;
    n은 1 내지 50,000의 범위 내의 정수이고;
    m은 1 내지 100,000의 범위 내의 정수이다.
  11. 복수의 개별 웰을 포함하는 지지체;
    개별 웰 각각에 위치되는 젤 물질;
    젤 물질에 접목된 시퀀싱 프라이머; 및
    젤 물질에 접목되고 링커를 통해 삼중항 상태 켄처, 항산화제, 또는 형광 공명 에너지 전달(FRET) 공여체에 연결된 스페이서를 포함하며,
    스페이서는 덴드리머, 폴리덱스트란, 메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 이민), 폴리-L-리신, 프로파길 메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(에틸렌 글리콜) 아크릴레이트, 폴리(프로필렌 이민), 폴리(비닐 알콜), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 폴리아크릴산, 폴리(트롤록스 에스테르), 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는, 어레이.
  12. 제11항에 있어서,
    삼중항 상태 켄처가 스페이서에 결합되고;
    삼중항 상태 켄처가 사이클로-옥틸테트라엔(COT), 트롤록스(6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산), 및 니트로벤질 알콜(NBA)로 구성된 군으로부터 선택되는, 어레이.
  13. 제11항에 있어서,
    항산화제가 스페이서에 결합되고;
    항산화제가 아스코르베이트, 글루타티온, 갈산, 카테킨, 트롤록스(6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산), 및 비타민 E로 구성된 군으로부터 선택되는, 어레이.
  14. 제11항에 있어서,
    FRET 공여체가 스페이서에 결합되고;
    FRET 공여체가 녹색-방출 염료를 갖는 FRET에 대한 공여체 염료 및 적색-방출 염료를 갖는 FRET에 대한 공여체 염료로 구성된 군으로부터 선택되는, 어레이.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서 대 시퀀싱 프라이머의 몰 비가 0.25:1 내지 5:1의 범위인 어레이.
  16. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 스페이서가 알킨, 노르보르닐, 구리 비함유 클릭 모이어티, 및 티올로 구성된 군으로부터 선택되는 말단 작용기를 통해 젤 물질에 접목되는 어레이.
  17. 지지체의 복수의 개별 웰 각각에 젤 물질을 위치시키는 단계;
    젤 물질에 시퀀싱 프라이머를 접목하는 단계; 및
    젤 물질에 비-시퀀싱 존재물을 접목하고 링커를 통해 상기 비-시퀀싱 존재물을 켄처 또는 항산화제와 연결하는 단계를 포함하며,
    비-시퀀싱 존재물이 덴드리머, 폴리덱스트란, 메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 이민), 폴리-L-리신, 프로파길 메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드), 폴리(에틸렌 글리콜) 아크릴레이트, 폴리(프로필렌 이민), 폴리(비닐 알콜), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 폴리아크릴산, 폴리(트롤록스 에스테르), 펩티드, 및 DNA 또는 RNA 합성에 관여하지 않는 임의의 단일 가닥 핵산 서열인 비-기능성 프라이머로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 시퀀싱 프라이머가 비-시퀀싱 존재물이 젤 물질에 접목되기 전 또는 후에 젤 물질에 접목되는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 시퀀싱 프라이머 및 비-시퀀싱 존재물이 젤 물질에 공동 접목되는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 공동 접목이,
    시퀀싱 프라이머 및 비-시퀀싱 존재물의 혼합물을 위에 젤 물질을 갖는 지지체에 침착시키는 단계; 및
    소정의 온도에서 지지체를 인큐베이션하는 단계에 의해 달성되는 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    비-시퀀싱 존재물이 덴드리머, 폴리덱스트란, 메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(에틸렌 이민), 폴리-L-리신, 프로파길 메타크릴레이트, 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(에틸렌 글리콜) 아크릴레이트, 폴리(프로필렌 이민), 폴리(비닐 알콜), 폴리(2-에틸-2-옥사졸린), 폴리아크릴산, 폴리(트롤록스 에스테르), 펩티드, 및 비-기능성 프라이머로 구성된 군으로부터 선택되고;
    비-시퀀싱 존재물이 알킨, 노르보르닐, 구리 비함유 클릭 모이어티, 및 티올로 구성된 군으로부터 선택되는 말단 작용기를 통해 젤 물질에 접목되는, 방법.
  22. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 젤 물질이 하기 화학식 (I)의 반복 단위를 포함하는 방법:

    상기 식에서,
    R1은 H, 또는 치환 또는 비치환된 알킬이고;
    R A 는 아지도, 치환 또는 비치환된 아미노, 치환 또는 비치환된 알케닐, 치환 또는 비치환된 하이드라존, 치환 또는 비치환된 하이드라진, 카르복실, 하이드록시, 치환 또는 비치환된 테트라졸, 치환 또는 비치환된 테트라진, 니트릴 옥사이드, 니트론, 및 티올로 구성된 군으로부터 선택되고;
    R5는 H, 및 치환 또는 비치환된 알킬로 구성된 군으로부터 선택되고;
    -(CH2)p- 각각은 치환 또는 비치환될 수 있고;
    p는 1 내지 50의 범위 내의 정수이고;
    n은 1 내지 50,000의 범위 내의 정수이고;
    m은 1 내지 100,000의 범위 내의 정수이다.
  23. 삭제
  24. 삭제
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