CN114207128A - 试剂盒、系统和流通池 - Google Patents

Abstract

公开了一种试剂盒的示例，其包括文库制备流体、样品流体和富集流体。文库制备流体包括文库制备珠粒，其中每个文库制备珠粒包括第一固体载体和附接至第一固体载体的转座体。流体包括基因组脱氧核糖核酸序列。富集流体包括靶捕获珠粒，其中每个靶捕获珠粒包括第二固体载体和附接至第二固体载体的捕获探针。这些捕获探针中的每个捕获探针包括与样品流体中的基因组脱氧核糖核酸的靶向区域互补的单链脱氧核糖核酸序列。

Description

试剂盒、系统和流通池

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年1月27日提交的美国临时申请序列号62/966,351的权益，该临时申请的内容全文以引用方式并入本文。

背景技术

流通池用于多种方法和应用(诸如基因测序、基因分型等)中。在一些方法和应用中，希望由双链DNA(dsDNA)靶分子产生片段化和带标签的脱氧核糖核酸(DNA)分子的文库。通常，目的是由较大dsDNA分子生成较小DNA分子(例如，DNA片段)以用作DNA测序反应中的模板。这些模板可使得能够获得短读取长度。在数据分析过程中，可以将重叠短序列读段进行比对，以重建较长的核酸序列。在一些情况下，可以使用预测序步骤(诸如对特定核酸分子进行条形码编码)来简化数据分析。

发明内容

本文所公开的第一方面是一种试剂盒，其包括：包括文库制备珠粒的文库制备流体，每个文库制备珠粒包括第一固体载体和附接至第一固体载体的转座体；包括基因组脱氧核糖核酸序列的样品流体；和包括靶捕获珠粒的富集流体，每个靶捕获珠粒包括第二固体载体和附接至第二固体载体的捕获探针，所述捕获探针中的每个捕获探针包括与样品流体中的基因组脱氧核糖核酸的靶向区域互补的单链脱氧核糖核酸序列。

本文所公开的第二方面是另一种试剂盒，其包括：将RNA转化为cDNA的子试剂盒；和包括靶捕获珠粒的富集流体，每个靶捕获珠粒包括固体载体和附接至固体载体的捕获探针，所述捕获探针中的每个捕获探针包括与使用将RNA转化为cDNA的子试剂盒产生的cDNA的靶向区域互补的单链脱氧核糖核酸序列。

本文所公开的第三方面是一种系统，其包括：基底；限定在所述基底上的第一区域处的制备通道，所述制备通道包括用于固定文库制备珠粒的制备捕获位点；限定在所述基底上的第二区域处且在所述制备通道下游的富集通道，所述富集通道包括扩增引物和用于固定靶捕获珠粒的富集捕获位点；以及输送通道，所述输送通道选择性地且以流体方式连接所述制备通道和所述富集通道。

本文所公开的第四方面是一种流通池，其包括：限定在两个表面之间的富集通道，所述富集通道包括附接至所述两个表面中的至少一个表面的扩增引物和固定在所述两个表面中的至少一个表面上的靶捕获珠粒，每个靶捕获珠粒包括固体载体和附接至固体载体的捕获探针，所述捕获探针中的每个捕获探针包括与基因组脱氧核糖核酸的靶向区域或互补脱氧核糖核酸的靶向区域互补的单链核酸序列。

本文所公开的第五方面是一种方法，其包括：将靶捕获珠粒引入到富集通道中，该富集通道包括至少一个含有扩增引物和富集捕获位点的表面，由此靶捕获珠粒中的至少一些变得固定在富集捕获位点处，所述靶捕获珠粒中的每个靶捕获珠粒包括固体载体和附接至固体载体的捕获探针，所述捕获探针中的每个捕获探针包括与基因组脱氧核糖核酸的靶向区域或互补脱氧核糖核酸的靶向区域互补的单链核酸序列。

应当理解，这些方面中的任一个方面的任何特征可以以任何期望的方式组合在一起。此外，应当理解，第一方面和/或第二方面和/或第三方面和/或第四方面和/或第五方面的特征的任何组合可以与本文所公开的任何示例组合，以实现本公开中所述的益处，包括例如对流通池富集的益处。

附图说明

通过参考以下具体实施方式和附图，本公开的示例的特征将变得显而易见，其中类似的附图标号对应于类似但可能不相同的部件。为了简洁起见，具有先前描述的功能的附图标号或特征可结合或可不结合它们出现的其他附图来描述。

图1A是流通池的一个示例的顶视图；

图1B是富集通道和非图案化测序表面的一个示例的沿图1A的1B-1B线截取的放大剖视图；

图1C是富集通道和非图案化测序表面的一个示例的沿图1A的1C-1C线截取的放大剖视图；

图2是展示一个示例的文库制备方法的示意性流程图；

图3A是展示另一个示例的文库制备方法的示意性流程图；

图3B是为了清楚起见重新绘制的由图3A的方法产生的桥的示意图；

图4是包括具有机载文库制备室的流通池的一个示例的一个示例系统的示意图；

图5是描绘本文所公开的富集方法的一个示例的示意图；

图6是描绘当使用比较富集方法时和当使用实施例富集方法时在流通池表面上的靶文库片段的相对覆盖率图的图形；并且

图7是描绘具有不同探针密度的靶捕获珠粒的靶向簇计数的柱形图。

具体实施方式

一些测序技术利用流通池表面上的捕获引物来捕获和扩增DNA文库片段。可以利用流通池架构和扩增过程来在流通池的不同区域中产生相应DNA文库片段的扩增子的各个单克隆群体。在分析所有或大部分DNA样品(从其产生DNA文库片段)时，这可能是期望的，因为每个单克隆群体可以为每个DNA文库片段提供大量数据。

在一些情况下，可能期望分析DNA样品的靶部分，例如给定样品中的特定基因变体，而不是整个样品。对于这种类型的分析，可以富集靶部分或感兴趣区域，例如，这有助于将靶部分与DNA样品的其余部分分离。这使得测序读段能够专用于靶部分。本文所公开的富集技术利用了流通池上杂交和捕获对应于靶部分的文库片段。

定义

除非另外指明，否则本文所用的术语应理解为具有其在相关领域中的普通含义。下面列出本文所用的若干术语及其含义。

如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括单数和复数两者，除非上下文另有明确指示。如本文所用，术语“包含”与“包括”、“含有”或“特征在于”同义，并且是包括性的或开放式的，并且不排除另外的未列举的要素或方法步骤。

本说明书通篇提及的“一个示例”、“另一个示例”、“示例”等意指结合该示例描述的特定要素(例如，特征、结构、组成、构型和/或特性)包括在本文所述的至少一个示例中，并且可或可不存在于其他示例中。此外，应当理解，用于任何示例的所述元素可以任何合适的方式组合在各种示例中，除非上下文另有明确说明。

在本公开(包括权利要求)通篇中使用的术语“基本上”和“约”用于描述和说明有小波动，诸如由于处理中的变化引起的。例如，这些术语可以指小于或等于规定值的±10％，诸如小于或等于规定值的±5％，诸如小于或等于规定值的±2％，诸如小于或等于规定值的±1％，诸如小于或等于规定值的±0.5％，诸如小于或等于规定值的±0.2％，诸如小于或等于规定值的±0.1％，诸如小于或等于规定值的±0.05％。

接头：可以例如通过连接或标签片段化(tagmentation)与核酸分子融合的线性寡核苷酸序列。接头可以是展现用于预期目的的序列的标签。在一些示例中，接头可以展现与引物(例如，包含通用核苷酸序列(诸如P5或P7序列)的引物)的至少一部分互补的序列。作为一个具体示例，转座体复合物可以包括以下多核苷酸和接头：该多核苷酸具有包含转座子末端序列的3’部分，并且该接头包含适于与引物杂交以用于簇扩增反应的一个或多个区域。在另一个具体示例中，在片段的一个末端处的接头包括与第一流通池引物的至少一部分互补的序列，并且在该片段的另一个末端处的接头包括与第二流通池引物的至少一部分相同的序列。互补接头可与第一流通池引物杂交，并且该相同接头是用于其互补拷贝的模板，该互补拷贝可在簇生成期间与第二流通池引物杂交。在其他示例中，接头可以包括测序引物序列或测序结合位点(例如，适于与引物杂交以用于测序反应的一个或多个区域)。可将不同接头的组合掺入核酸分子(诸如DNA片段)中。合适的接头长度可在约10个核苷酸至约100个核苷酸或约12个核苷酸至约60个核苷酸或约15个核苷酸至约50个核苷酸的范围内。接头可包括核苷酸和/或核酸的任何组合。

捕获探针：一种单链脱氧核糖核酸序列，其与基因组脱氧核糖核酸的靶向区域或来源于核糖核酸样品的互补脱氧核糖核酸的靶向区域互补。

捕获位点：流通池表面的已被改性为具有允许特定材料(例如，靶捕获珠粒、复合物、蛋白质生物标志物等)定位的化学特性的一部分。在一个示例中，捕获位点可以包括能够附接、保留或结合至特定分子的化学捕获剂(即，材料、分子或部分)。一种示例的化学捕获剂包括受体-配体结合对的成员(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸结合蛋白、表位、抗体等)，其能够与特定材料结合(或者与附接至特定材料的连接部分结合)。化学捕获剂的又一个示例是能够与特定材料形成静电相互作用、氢键或共价键(例如，硫醇-二硫化物交换、点击化学、Diels-Alder反应等)的化学试剂。被设计成附接靶捕获珠粒的捕获位点在本文中被称为“富集捕获位点”。被设计成附接用于文库制备的固体载体的捕获位点在本文中被称为“制备捕获位点”。

沉积：任何合适的施加技术，其可为手动的或自动的，并且在一些情况下，导致表面特性的改性。一般来讲，可使用气相沉积技术、涂覆技术、接枝技术等进行沉积。一些具体示例包括化学气相沉积(CVD)、喷涂(例如，超声喷涂)、旋涂、厚涂或浸涂、刮涂刀涂覆、搅打分配、流动通过涂覆(flow through coating)、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷、喷墨印刷等。

凹入部：是指基底或图案化树脂中的离散凹面特征部，该离散凹面特征部具有至少部分地被基底或图案化树脂的间隙区域包围的表面开口。凹入部可在其表面中的开口处具有多种形状中的任一种，包括例如圆形、椭圆形、正方形、多边形、星形(具有任何数量的顶点)等。与该表面正交截取的凹入部的横截面可为弯曲的、正方形、多边形、双曲线形、圆锥形、角形等。例如，凹入部可以是一个孔或两个互连的孔。凹入部还可具有更复杂的结构，诸如脊、台阶特征部等。

每个：当参考项目的集合使用时，每个识别集合中的单个项目，但不一定是指集合中的每个项目。如果明确公开或上下文另有明确规定，则可能会出现例外情况。

富集通道：限定在两个粘合或以其他方式连接的部件之间的区域，其包括固定在其中的靶捕获珠粒，或者可以在其中接收和固定靶捕获珠粒。在一些示例中，富集通道可以限定在两个图案化或非图案化的测序表面之间，并且因此可以与测序表面的一个或多个部件流体连通。

流通池：具有其中可以进行反应的室(例如，其可以包括富集通道)、用于将试剂递送到室的入口以及用于从室中移除试剂的出口的容器。在一些示例中，室使得能够检测在该室中发生的反应。例如，室可包括允许对阵列、光学标记分子等进行光学检测的一个或多个透明表面。

片段：遗传物质的一部分或片(例如，DNA、RNA等)。

核酸分子或样品：任何长度的核苷酸的聚合物形式，并且可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、它们的类似物或它们的混合物。该术语可指单链或双链多核苷酸。

“模板”核酸分子(或链)可指待分析的序列。

核酸样品中的核苷酸可包括天然存在的核酸及其功能类似物。功能类似物的示例能够以序列特异性方式与核酸杂交或能够用作复制特定核苷酸序列的模板。天然存在的核苷酸通常具有含有磷酸二酯键的主链。类似结构可以具有替代的主链键，包括本领域已知的多种主链键中的任一种。天然存在的核苷酸通常具有脱氧核糖(例如，存在于DNA中)或核糖(例如，存在于RNA中)。类似结构可以具有替代的糖部分，包括本领域已知的多种糖部分中的任一种。核苷酸可以包括天然或非天然碱基。天然DNA可以包括腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和/或鸟嘌呤中的一种或多种，并且天然RNA可以包括腺嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和/或鸟嘌呤中的一种或多种。可使用任何非天然碱基，诸如锁核酸(LNA)和桥核酸(BNA)。

引物：可以与特定序列杂交的核酸分子。作为一个示例，扩增引物可以与附接至文库片段的接头杂交，并且可以充当模板扩增和簇生成的起始点。又如，合成的核酸(模板)链可包括引物(例如，测序引物)可以与之杂交的位点，以便引发与合成的核酸链互补的新链的合成。任何引物可以包括核苷酸或其类似物的任何组合。在一些示例中，引物是单链寡核苷酸或多核苷酸。引物长度可以是任何数目的碱基长度并且可包括多种非天然核苷酸。在一个示例中，测序引物为短链，范围为10至60个碱基，或20至40个碱基。

测序就绪核酸片段：遗传物质在3'端和5'端具有接头的一部分。在测序就绪核酸片段中，每个接头包括已知的通用序列(例如，其与流通池上的引物的至少一部分互补或相同)和测序引物序列。两个接头还可包括索引(条形码或标签)序列。在一个示例中，一侧(例如，包括P5’或P5序列)可以包含固体载体索引，并且另一侧(包括P7或P7’序列)可以包含样品索引。

测序表面：具有接枝到其上的一种或多种类型的扩增引物的聚合物水凝胶。测序表面还可以包括用于固定靶捕获珠粒的富集捕获剂。

固体载体：由刚性或半刚性材料制成的小体，其形状的特征在于例如球形、椭圆形、微球形或其他公认的颗粒形状，无论是具有规则还是不规则的尺寸。固体载体的一些示例可以具有附接至其上的文库片段。固体载体的其他示例可以具有附接至其上的捕获探针。

靶捕获珠粒：具有附接至其上的捕获探针的固体载体。

靶文库片段：i)基因组脱氧核糖核酸序列的单链部分或ii)来源于核糖核酸样品的互补脱氧核糖核酸的单链部分靶文库片段的序列与靶捕获珠粒的捕获探针互补。靶文库片段的序列可以是感兴趣区域，例如特定的基因组小组，诸如外显子组或肿瘤相关基因。

转移链：两个转座子末端的转移部分。类似地，术语“非转移链”是指两个转座子末端的非转移部分。在体外转座反应中，转移链的3’末端接合或转移至靶DNA。在体外转座反应中，展现与转移的转座子末端序列互补的转座子末端序列的非转移链不接合或转移至靶DNA。

在一些示例中，转移链和非转移链共价接合。例如，在一些实施方案中，转移链序列和非转移链序列在单个寡核苷酸上提供，例如以发夹构型提供。因此，尽管非转移链的自由端未通过转座反应直接接合至样品DNA，但是非转移链间接地附接至DNA片段，因为非转移链通过发夹结构的环连接至转移链。

转座子末端：一种双链核酸DNA，其仅展现与在体外转座反应中起作用的转座酶或整合酶形成复合物所必需的核苷酸序列(“转座子末端序列”)。在一些示例中，转座子末端能够在转座反应中与转座酶形成功能性复合物。作为示例，转座子末端可以包括由野生型或突变型Tn5转座酶识别的19碱基对(bp)外端(“OE”)转座子末端、内端(“IE”)转座子末端，或“镶嵌末端”(“ME”)转座子末端。转座子末端可包括适用于在体外转座反应中与转座酶或整合酶形成功能性复合物的任何核酸或核酸类似物。例如，转座子末端可以包括DNA、RNA、修饰碱基、非天然碱基、修饰主链，并且可以在一条链或两条链中包含切口。尽管术语“DNA”在本公开通篇中可以与转座子末端的组合物结合使用，但是应当理解，任何合适的核酸或核酸类似物均可以用于转座子末端中。

转座酶：一种酶，其能够与含有转座子末端的组合物(例如，转座子、转座子末端、转座子末端组合物)形成功能性复合物，并且能够例如在体外转座反应中，催化含有转座子末端的组合物插入或转座到与其一起温育的双链靶DNA中。如本文所示的转座酶还可包括来自逆转录转座子和逆转录病毒的整合酶。虽然本文所述的许多示例涉及Tn5转座酶和/或高活性Tn5转座酶，但是应当理解，可以使用能够以足够高的效率将转座子末端插入到5’-标签并且将靶DNA片段化以用于其预期目的的任何转座体系。在具体示例中，优选的转座体系能够以随机或几乎随机的方式将转座子末端插入到5’-标签并且将靶DNA片段化。

转座体复合物：非共价结合至双链核酸的转座酶。例如，转座体复合物可以是在支持非共价复合物形成的条件下与双链转座子DNA一起预温育的转座酶。双链转座子DNA可以包括例如Tn5 DNA、Tn5 DNA的一部分、转座子末端组合物、转座子末端组合物的混合物或者能够与转座酶(诸如高活性Tn5转座酶)相互作用的其他双链DNA。

在本文所公开的示例中，靶捕获珠粒用于流通池的富集通道中，该富集通道还包括测序表面。靶捕获珠粒包括能够选择性地捕获感兴趣的文库片段的捕获探针。因此，靶捕获珠粒使得能够在流通池内进行定制富集。

靶捕获珠粒

靶捕获珠粒在图1B和图1C中以附图标号36示出。靶捕获珠粒36包括固体载体38和附接至固体载体的捕获探针40。

固体载体38可以是但不限于玻璃(例如，受控孔玻璃珠粒)；磁响应材料；塑料，诸如丙烯酸、聚苯乙烯或苯乙烯与另一种材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯或聚四氟乙烯(得自The Chemours Co的

)；多糖或交联多糖，诸如琼脂糖或

珠粒(交联珠状形式的琼脂糖，购自Cytivia)；尼龙；硝化纤维；树脂；二氧化硅或基于二氧化硅的材料，包括硅和改性硅；碳纤维；金属；无机玻璃；光纤束；或多种其他聚合物。

“磁响应”材料对磁场有响应。磁响应固体载体的示例包括磁响应材料或由磁响应材料构成。磁响应材料的示例包括顺磁材料、铁磁材料、亚铁磁材料和变磁材料。合适的顺磁材料的示例包括铁、镍和钴，以及金属氧化物，诸如Fe₃O₄、BaFe₁₂O₁₉、CoO、NiO、Mn₂O₃、Cr₂O₃和CoMnP。一个可商购获得的示例包括得自ThermoFisher Scientific的DYNABEADS^TM M-280链霉抗生物素蛋白(涂覆有链霉抗生物素蛋白的超顺磁珠)。在一些示例中，磁响应材料嵌入聚合物小珠的外壳中。在其他示例中，磁响应材料呈小珠形式并且涂覆有钝化材料，诸如氧化硅或亚硝酸硅。

固体载体38的任何示例可以具有固体珠粒、多孔珠粒或空心珠粒的形式。

在一些示例中，固体载体38可以用结合对的一个成员官能化。“结合对”是指能够彼此附接的两种试剂(例如，材料、分子、部分)。在该示例中，固体载体38上的成员与位于流通池10(图1A)的测序表面(参见图1B中的12、12’和图1C中的14、14’)上的另一个成员形成结合对。在一些示例中，固体载体38上的成员可以是多官能的，因为其可以i)与附接至捕获探针40的成员结合，并且ii)在流通池10的测序表面12、12’或14、14’上与富集捕获位点(参见图1B和图1C中的32、32’)结合。在其他示例中，固体载体38可以用两个不同的结合对成员官能化，所述结合对成员例如：i)可以与附接至捕获探针40的成员结合的一个成员，和ii)可以与流通池10的12、12’或14、14’上的富集捕获位点32、32’结合的另一个成员。

固体载体38的官能化可以涉及用结合对成员涂覆固体载体38，或者在结合对成员与固体载体38的表面处的官能团之间形成键。结合对成员的一个示例包括受体-配体结合对的成员(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸结合蛋白、表位、抗体等)，其能够结合至位于流通池的测序表面上的另一个结合对成员。结合对成员也可以是能够形成静电相互作用、氢键或共价键(例如，硫醇-二硫化物交换、点击化学、Diels-Alder等)的化学试剂。

在其他示例中，固体载体38不包括结合对的成员，而是固体载体38可以能够化学缀合至富集捕获位点32、32’。可以使用任何形式的化学偶联将固体载体38附接至富集捕获位点32、32’。

在许多情况下，期望在固体载体38与富集捕获位点32、32’之间具有可逆或可裂解的相互作用，使得可以在测序之前将靶捕获珠粒36移除。

靶捕获珠粒36还包括附接至固体载体38的捕获探针40。固体载体38上的每个捕获探针40包括相同的单链脱氧核糖核酸序列。对该序列进行选择，使得每个捕获探针40选择性地与包括感兴趣(例如，待分析)序列的靶文库片段杂交。在一些示例中，捕获探针序列与基因组脱氧核糖核酸的靶向区域互补。在其他示例中，捕获探针序列与来源于核糖核酸样品的靶向区域的互补脱氧核糖核酸(cDNA)互补。

捕获探针40中的核苷酸的数量可以取决于靶文库片段中的核苷酸的数量。在一些情况下，捕获探针40小于靶文库片段。捕获探针40可以包括约50个核苷酸至约200个核苷酸。在一个示例中，捕获探针40包括约80个核苷酸至约120个核苷酸。在另一个示例中，捕获探针40包括69个核苷酸。

捕获探针40可以使用任何寡核苷酸合成技术制备。

捕获探针40的一端可以与结合对的另一个成员结合，使得其可以与附接至固体载体38的成员结合。例如，捕获探针40可以生物素化，以在固体载体38的表面处与链霉抗生物素蛋白结合。

捕获探针40可以通过在含有捕获探针40的混合物中温育固体载体38，来附接至固体载体38。捕获探针40可以混合到盐缓冲液中。可以使用促进或启动捕获探针40与固体载体38之间的反应的任何合适的盐缓冲液。在一个示例中，盐缓冲液可以促进生物素-链霉抗生物素蛋白反应，使得生物素化捕获探针40与固体载体38上的链霉抗生物素蛋白结合。作为示例，盐缓冲液是包含氯化钠、柠檬酸钠或它们的组合的水性溶液。在一个具体示例中，盐缓冲液包括约0.75M氯化钠和约75mM柠檬酸钠的水溶液。混合物中的捕获探针40的数量可以取决于待添加到混合物中的固体载体38的数量和靶捕获珠粒36的期望探针密度。在一个示例中，靶捕获珠粒36的期望探针密度在每个固体载体约2*10⁵个捕获探针至每个固体载体约5*10⁶个捕获探针的范围内。可以通过调节用于温育的混合物中的捕获探针的浓度来控制靶捕获珠粒36的捕获探针密度。

用于形成靶捕获珠粒36的一种示例方法包括合成捕获探针40，该捕获探针具有附接至每个捕获探针40的末端的结合对的第一成员；以及将捕获探针40与固体载体38一起温育，其中固体载体38涂覆有该结合对的第二成员。

流通池

靶捕获珠粒36可以用于流通池10中，该流通池具有图案化测序表面14、14’或非图案化测序表面12、12’。应当理解，靶捕获珠粒36可以包括本文所述的固体载体38和捕获探针40的任何示例。

流通池10的一个示例的顶视图在图1A中示出。如将参考图1B和图1C所讨论的，流通池10的一些示例包括两个相对的测序表面。非图案化测序表面12、12’的一个示例在图1B中示出，图案化测序表面14、14’的一个示例在图1C中示出。每个测序表面12、12’或14、14’均由基底(在图1A中一般性地示为16)支撑，并且富集通道(在图1A中一般性地示为18)限定在测序表面12、12’或14、14’之间。在其他示例中，流通池10包括由基底16支撑的一个测序表面和附接到基底16的封盖。在这些示例中，富集通道18限定在测序表面12或14与封盖之间。

在这些示例中的任一个中，基底16可以是单个层/单种材料。单层基底的示例在图1B中以附图标号16A和16A’示出。合适的单层基底16A、16A’的示例包括环氧硅氧烷、玻璃、改性的或官能化的玻璃、塑料(包括丙烯酸、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、聚四氟乙烯(诸如得自Chemours的

)、环烯烃/环烯烃聚合物(COP)(诸如得自Zeon的

)、聚酰亚胺等)、尼龙(聚酰胺)、陶瓷/陶瓷氧化物、二氧化硅、熔融二氧化硅或基于二氧化硅的材料、硅酸铝、硅和改性的硅(例如，硼掺杂的p+硅)、氮化硅(Si₃N₄)、氧化硅(SiO₂)、五氧化二钽(Ta₂O₅)或其他钽氧化物(TaO_x)、氧化铪(HfO₂)、碳、金属、无机玻璃等。

基底16也可以是多层结构。多层基底的示例在图1C中以附图标号16B和16B’示出。多层结构16B、16B’的一些示例包括玻璃或硅，在表面处具有钽氧化物或另一种陶瓷氧化物的涂层。具体参考图1C，多层结构16B、16B’的其他示例包括其上具有图案化树脂22、22’的基础载体20、20’。多层基底16B、16B’的其他示例可以包括绝缘体上硅(SOI)基底。

在一个示例中，基底16(无论是单层还是多层)可以具有在约2mm至约300mm范围内的直径，或者为最大尺寸高达约10英尺(约3米)的矩形片材或面板。在一个示例中，基底16为直径在约200mm至约300mm范围内的晶片。在另一个示例中，基底16为宽度在约0.1mm至约10mm范围内的管芯。尽管已提供了示例的尺寸，但是应当理解，可以使用具有任何合适尺寸的基底16。又如，可使用作为矩形支持物的面板，该面板具有比300mm圆形晶片更大的表面积。

在图1A、图1B和/或图1C所示的示例中，流通池10包括富集通道18。虽然示出了若干个富集通道18，但是应当理解，流通池10中可以包括任何数量的通道18(例如，单个通道18、四个通道18，等等)。在本文所公开的示例中的一些示例中，每个富集通道18是由两个附接的基底(例如，16A和16A’或16B和16B’)限定在两个测序表面(例如，12和12’或14和14’)之间的区域。在本文所公开的示例中的其他示例中，每个富集通道18是限定在一个测序表面(例如，12或14)与封盖之间的区域。可以将本文所述的流体引入到富集通道18中并且从该富集通道中移除。每个富集通道18可以与流通池10中的每个其他富集通道18隔离，使得被引入到任何特定富集通道18中的流体不流到任何相邻的富集通道18中。

可以使用部分地取决于基底16的材料的任何合适的技术将富集通道18的一部分限定在基底16中。在一个示例中，将富集通道18的一部分蚀刻到玻璃基底16中。在另一个示例中，可以使用光刻法、纳米压印光刻法等将富集通道18的一部分图案化为多层基底16B、16B’的树脂22、22’。在又一个示例中，可以将单独材料(例如，图1B和图1C中的材料24)施加至基底16，使得该单独材料限定富集通道18的壁的至少一部分。

在一个示例中，富集通道18具有直线构型。富集通道18的长度和宽度可以分别小于基底16的长度和宽度，使得基底表面的围绕富集通道18的部分可用于附接到另一个基底16。在一些情况下，每个富集通道18的宽度可以为至少约1mm、至少约2.5mm、至少约5mm、至少约7mm、至少约10mm或更大。在一些情况下，每个富集通道18的长度可以为至少约10mm、至少约25mm、至少约50mm、至少约100mm或更大。每个富集通道18的宽度和/或长度可以大于、小于上文指定的值，或者介于上文指定的值之间。在另一个示例中，富集通道18为正方形(例如，10mm×10mm)。

例如，当使用微接触、气溶胶或喷墨印刷来沉积限定流动通道壁的单独材料时，每个富集通道18的深度可以小至几个单层厚。对于其他示例，每个富集通道18的深度可以为约1μm、约10μm、约50μm、约100μm或更大。在一个示例中，深度可在约10μm至约100μm的范围内。在另一个示例中，深度为约5μm或更小。应当理解，每个富集通道18的深度大于、小于上文指定的值，或者介于上文指定的值之间。例如，当使用图案化测序表面14、14’时，富集通道18的深度也可以沿流通池10的长度和宽度变化。

图1B展示了包括非图案化的相对测序表面12、12’的流通池10的剖视图。在一个示例中，这些表面12、12’中的每个表面可以在基底16A、16A’上制备，然后基底16A、16A’可以彼此附接以形成流通池10的一个示例。可以使用任何合适的粘结材料24(诸如粘合剂、有助于粘结的辐射吸收材料等)将基底16A、16B粘结在一起。

在图1B所示的示例中，富集通道18的一部分限定在单层基底16A、16A’中的每个单层基底中。例如，每个基底16A、16A’可以具有限定在其中的凹面区域26、26’，可以在这些凹面区域中引入测序表面12、12’的部件。应当理解，凹面区域26、26’内未被测序表面12、12’的部件占据的任何空间可以被认为是富集通道18的一部分。

测序表面12、12’包括聚合物水凝胶28、28’、附接到聚合物水凝胶28、28’的扩增引物30、30’，以及富集捕获位点32、32’。

聚合物水凝胶28、28’的一个示例包括丙烯酰胺共聚物，诸如聚(N-(5-叠氮基乙酰氨基戊基)丙烯酰胺-共-丙烯酰胺)(PAZAM)。PAZAM和丙烯酰胺共聚物的一些其他形式由以下结构(I)表示：

其中：

R^A选自叠氮基、任选地取代的氨基、任选地取代的烯基、任选地取代的炔烃、卤素、任选地取代的腙、任选地取代的肼、羧基、羟基、任选地取代的四唑、任选地取代的四嗪、腈氧化物、硝酮、硫酸盐和硫醇；

R^B为H或任选地取代的烷基；

R^C、R^D和R^E各自独立地选自H和任选地取代的烷基；

-(CH₂)_p-中的每一者可任选地被取代；

p为在1至50范围内的整数；

n为在1至50,000范围内的整数；以及

m为在1至100,000范围内的整数。

本领域的普通技术人员将认识到，结构(I)中反复出现的“n”和“m”特征的布置是代表性的，并且单体亚单元可以任何顺序存在于聚合物结构中(例如，无规、嵌段、图案化或它们的组合)。

丙烯酰胺共聚物的其他形式和PAZAM的分子量可在约5kDa至约1500kDa或者约10kDa至约1000kDa的范围内，或者在一个具体示例中可为约312kDa。

在一些示例中，丙烯酰胺共聚物的其他形式和PAZAM为直链聚合物。在一些其他示例中，丙烯酰胺共聚物的其他形式和PAZAM为轻度交联的聚合物。

在其他示例中，聚合物水凝胶28、28’可以为结构(I)的变型。在一个示例中，丙烯酰胺单元可用N,N-二甲基丙烯酰胺

替换。在该示例中，结构(I)中的丙烯酰胺单元可用

替换，其中R^D、R^E和R^F各自为H或C1-C6烷基，并且R^G和R^H各自为C1-C6烷基(而不是H，如丙烯酰胺的情况)。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。在另一个示例中，除了丙烯酰胺单元之外，还可使用N,N-二甲基丙烯酰胺。在该示例中，除了反复出现的“n”和“m”特征之外，结构(I)还可包括

其中R^D、R^E和R^F各自为H或C1-C6烷基，并且R^G和R^H各自为C1-C6烷基。在该示例中，q可为1至100,000范围内的整数。

作为又一个示例，聚合物水凝胶28、28’可以包括结构(III)和(IV)中的每一者的重复出现的单元：

其中R^1a、R^2a、R^1b和R^2b中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基或任选地取代的苯基；R^3a和R^3b中的每一者独立地选自氢、任选地取代的烷基、任选地取代的苯基或任选地取代的C7-C14芳烷基；并且每个L¹和L²独立地选自任选地取代的亚烷基连接基或任选地取代的杂亚烷基连接基。

应当理解，其他分子可以用于形成聚合物水凝胶28、28’，只要它们被官能化以使寡核苷酸引物30、30’与其接枝即可。合适的聚合物层的其他示例包括具有胶态结构的那些，诸如琼脂糖；或具有聚合物网状结构的那些，诸如明胶；或具有交联聚合物结构的那些，诸如聚丙烯酰胺聚合物和共聚物、不含硅烷的丙烯酰胺(SFA)或SFA的叠氮化版本。合适的聚丙烯酰胺聚合物的示例可由丙烯酰胺和丙烯酸或含有乙烯基基团的丙烯酸合成，或由形成[2+2]光环加成反应的单体合成。合适的聚合物水凝胶28、28’的另外其他示例包括丙烯酰胺和丙烯酸酯的混合共聚物。含有丙烯酸类单体(例如，丙烯酰胺、丙烯酸酯等)的多种聚合物架构可用于本文所公开的示例中，诸如支链聚合物，包括星型聚合物、星形或星型嵌段聚合物、树枝状体等。例如，单体(例如，丙烯酰胺等)可以无规或嵌段方式掺入到星形聚合物的支链(臂)中。

为了将聚合物水凝胶28、28’引入到凹面区域26、26’中，可以生成聚合物水凝胶28、28’的混合物，然后将其施加至相应的基底16A、16A’(具有限定在其中的凹面区域26、26’)。在一个示例中，聚合物水凝胶28、28’可以存在于混合物(例如，与水的混合物或者与乙醇和水的混合物)中。然后可以使用旋涂、浸渍或浸涂、正压或负压下的材料流或者另一种合适的技术将该混合物施加至相应的基底表面(包括在凹面区域26、26’中)。这些类型的技术将聚合物水凝胶28、28’毯覆式地沉积在相应的基底16A、16A’上(例如，在凹面区域26、26’中，以及在与其相邻的间隙区域34、34’上)。可以使用其他选择性沉积技术(例如，涉及掩模、受控印刷技术等)来将聚合物水凝胶28、28’特别地沉积在凹面区域26、26’中，而不是沉积在间隙区域34、34’上。

在一些示例中，可以将基底表面(包括凹面区域26、26’)活化，然后可以向其施加混合物(包括聚合物水凝胶28、28’)。在一个示例中，可使用气相沉积、旋涂或其他沉积方法将硅烷或硅烷衍生物(例如，降冰片烯硅烷)沉积在基底表面上。在另一个示例中，可以将基底表面暴露于等离子体灰化，以产生可以附着至聚合物水凝胶28、28’的表面活化剂(例如，-OH基团)。

取决于聚合物水凝胶28、28’的化学性质，所施加的混合物可以暴露于固化过程。在一个示例中，固化可在室温(例如，约25℃)至约95℃范围内的温度下进行约1毫秒至约几天范围内的时间。

然后可以进行抛光，以便从凹面区域26、26’的周界处的间隙区域34、34’移除聚合物水凝胶28、28’，同时使在表面上的聚合物水凝胶28、28’在凹面区域26、26’中至少基本上完整。

测序表面12、12’还包括附接到聚合物水凝胶28、28’的扩增引物30、30’。

可以执行接枝过程，以将扩增引物30、30’接枝到凹面区域26、26’中的聚合物水凝胶28、28’。在一个示例中，扩增引物30、30’可以通过引物30、30’的5′末端处或附近的单点共价附接而固定至聚合物水凝胶28、28’。该附接使得：i)引物30、30’的接头特异性部分自由地退火至其同源测序就绪核酸片段，以及ii)3′羟基基团自由地用于引物延伸。任何合适的共价附接均可用于此目的。可以使用的封端引物的示例包括炔烃封端引物(例如，其可以附接至聚合物水凝胶28、28’的叠氮化物表面部分)，或叠氮化物封端引物(例如，其可以附接至聚合物水凝胶28、28’的炔烃表面部分)。

合适的引物30、30’的具体示例包括在Illumina Inc.销售的商业流通池的表面上使用的P5引物和P7引物，其用于在HiSeq^TM、HiSeqX^TM、MiSeq^TM、MiSeqDX^TM、MiNISeq^TM、NextSeq^TM、NextSeqDX^TM、NovaSeq^TM、Genome Analyzer^TM、ISEQ^TM和其他仪器平台上进行测序。P5引物和P7引物均可以接枝到聚合物水凝胶28、28’中的每一者上。

在一个示例中，接枝可以涉及流过式沉积(例如，使用暂时结合的封盖)、泡涂、喷涂、搅打分配，或通过将引物30、30’附接至聚合物水凝胶28、28’的另一种合适方法。这些示例技术中的每一种均可以利用引物溶液或混合物，该引物溶液或混合物可以包含引物30、30’、水、缓冲液和催化剂。采用这些接枝方法中的任一种时，引物30、30’与凹面区域26、26’中的聚合物水凝胶28、28’的反应性基团反应，并且对周围基底16A、16A’不具有亲和力。因此，引物30、30’选择性地接枝到聚合物水凝胶28、28’。

在图1B所示的示例中，富集捕获位点32、32’包括附接至聚合物水凝胶28、28’的至少一部分或者施加在其上的化学捕获剂。可以使用本文所公开的化学捕获剂的任何示例。在一些示例中，该化学捕获剂可以是生物素，其可以将含有链霉抗生物素蛋白的靶捕获珠粒36附接至流通池测序表面12、12’或14、14’。在其他示例中，化学捕获剂可以是结合对(例如，除生物素-链霉抗生物素蛋白结合对之外的结合对)的另一个成员。在这些其他示例中的一些示例中，靶捕获珠粒36可以包括两个不同的结合对成员，例如，i)链霉抗生物素蛋白(其与生物素结合以附接捕获探针40)和ii)另一个成员，其可以与流通池10的测序表面12、12’或14、14’上的富集捕获位点32、32’的化学捕获剂结合。在这些其他示例中，化学捕获剂可以是结合对的非生物素成员，其中该结合对的另一个成员除链霉抗生物素蛋白之外还附接至固体载体38。

在一些示例中，聚合物水凝胶28、28’的游离官能团(例如，未附接至引物30、30’的那些)可以用化学捕获剂来官能化，使得在聚合物水凝胶28、28’的整个表面上形成若干个富集捕获位点32、32’。在一个示例中，可以使用点击化学将炔烃-PEG-生物素接头或不含炔烃-生物素的叠氮基团共价附接至聚合物水凝胶28、28’上的游离叠氮化物。在其他示例中，与扩增引物30、30’互补的引物可以具有附接至其上的化学捕获剂(例如，生物素或结合对的另一个成员)。这些互补引物可以与扩增引物30、30’中的一些杂交，以形成富集捕获位点32、32’。

在另一个示例中，可以使用微接触印刷、气溶胶印刷等将化学捕获剂沉积在所需位置中，以形成富集捕获位点32、32’。在又一个示例中，掩模(例如，光致抗蚀剂)可以用于限定将沉积化学捕获剂的空间/位置，并且因此限定将形成富集捕获位点32、32’的空间/位置。然后可沉积化学捕获剂，并且移除掩模(例如，通过剥离、溶解或另一种合适的技术)。在该示例中，富集捕获位点32、32’可以包括单层或薄层的化学捕获剂。

图1C展示了包括图案化的相对测序表面14、14’的流通池10的剖视图。在一个示例中，这些表面14、14’中的每个表面可以在基底16B、16B’上制备，然后基底16B、16B’可以彼此附接(例如，经由材料24)以形成流通池10的一个示例。

在图1C所示的示例中，流通池10包括多层基底16B、16B’，其中的每个多层基底包括载体20、20’和定位在载体20、20’上的图案化材料22、22’。图案化材料22、22’限定由间隙区域34、34’隔开的凹入部42、42’。

在图1C所示的示例中，图案化材料22、22’分别定位在载体20、20’上。应当理解，可以选择性地沉积或者沉积并且图案化以形成凹入部42、42’和间隙区域34、34’的任何材料均可以用于图案化材料22、22’。

例如，可以经由气相沉积、气溶胶印刷或喷墨印刷将无机氧化物选择性地施加至载体20、20’。合适的无机氧化物的示例包括氧化钽(例如Ta₂O₅)、氧化铝(例如Al₂O₃)、氧化硅(例如SiO₂)、氧化铪(例如HfO₂)等。

又如，可以将树脂施加至载体20、20’，然后图案化。合适的沉积技术包括化学气相沉积、浸涂、泡涂、旋涂、喷涂、搅打分配、超声喷涂、刮涂刀涂覆、气溶胶印刷、丝网印刷、微接触印刷等。合适的图案化技术包括光刻法、纳米压印光刻法(NIL)、压印技术、压花技术、模制技术、微蚀刻技术、印刷技术等。合适树脂的一些示例包括基于多面体低聚倍半硅氧烷树脂(可从Hybrid Plastics以商品名

商购获得)的树脂、非多面体低聚倍半硅氧烷环氧树脂、聚(乙二醇)树脂、聚醚树脂(例如，开环环氧化物)、丙烯酸树脂、丙烯酸酯树脂、甲基丙烯酸酯树脂、无定形含氟聚合物树脂(例如，得自Bellex的

)，以及它们的组合。

如本文所用，术语“多面体低聚倍半硅氧烷”是指作为二氧化硅(SiO₂)与有机硅(R₂SiO)之间的杂交中间体(例如RSiO_1.5)的化学组合物。多面体低聚倍半硅氧烷的一个示例可以是Kehagias等人在Microelectronic Engineering 86(2009)第776至第778页中所述的，该文献全文以引用方式并入。在一个示例中，组合物为具有化学式[RSiO_3/2]_n的有机硅化合物，其中R基团可以是相同或不同的。多面体低聚倍半硅氧烷的示例性R基团包括环氧基、叠氮化物/叠氮基、硫醇、聚(乙二醇)、降冰片烯、四嗪、丙烯酸酯和/或甲基丙烯酸酯，或另外例如烷基、芳基、烷氧基和/或卤代烷基基团。本文所公开的树脂组合物可包括一个或多个不同的笼或芯结构作为单体单元。

如图1C所示，图案化材料22、22’包括分别限定在其中的凹入部42、42’，以及将相邻凹入部42、42’分开的间隙区域34、34’。可以设想凹入部42、42’的许多不同布局，包括规则的、重复的和非规则的图案。在一个示例中，凹入部42、42’设置在六边形网格中，以便紧密装填和改善密度。其他布局可包括例如直线(矩形)布局、三角形布局等。在一些示例中，布局或图案可以为呈行和列形式的凹入部42、42’的x-y格式。在一些其他示例中，布局或图案可以为凹入部42、42’和/或间隙区域34、34’的重复布置。在另外的其他示例中，布局或图案可以是凹入部42、42’和/或间隙区域34、34’的随机布置。图案可以包括孔、条、漩涡、线、三角形、矩形、圆形、弧形、格纹、格子、对角线、箭头、正方形和/或交叉影线。

凹入部42、42’的布局或图案可以相对于限定区域中的凹入部42、42’的密度(例如，凹入部42、42’的数量)来表征。例如，凹入部42、42’可以以大约200万个/mm²的密度存在。可将密度调整为不同的密度，包括例如约100个/mm²、约1,000个/mm²、约0.1百万个/mm²、约1百万个/mm²、约2百万个/mm²、约5百万个/mm²、约1千万个/mm²、约5千万个/mm²或更大或更小的密度。还应当理解，图案化材料22、22’中的凹入部42、42’的密度可以介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间。作为示例，高密度阵列可以被表征为具有间隔小于约100nm的凹入部42、42’，中密度阵列可以被表征为具有间隔约400nm至约1μm的凹入部42、42’，并且低密度阵列可以被表征为具有间隔大于约1μm的凹入部42、42’。虽然已提供示例性密度，但应当理解，可使用任何合适的密度。凹入部42、42’的密度可以部分地取决于凹入部42、42’的深度。在一些情况下，可能期望凹入部42、42’之间的间距甚至大于本文所列出的示例。

凹入部42、42’的布局或图案也可以根据或替代性地根据从凹入部42、42’的中心到相邻凹入部42、42’的中心的平均节距或间距(中心到中心间距)或者从一个凹入部42、42’的右边缘到相邻凹入部42、42’的左边缘的平均节距或间距(边缘到边缘间距)来表征。图案可以是规则的，使得围绕平均节距的变异系数较小，或者图案可以是非规则的，在这种情况下变异系数可以相对较大。在任一种情况下，平均节距可为例如约50nm、约0.1μm、约0.5μm、约1μm、约5μm、约10μm、约100μm或更大或更小。凹入部42、42’的特定图案的平均节距可以介于选自上述范围的下限值中的一个值与上限值中的一个值之间。在一个示例中，凹入部42、42’具有约1.5μm的节距(中心到中心间距)。虽然已经提供了示例性平均节距值，但应当理解，可使用其他平均节距值。

每个凹入部42、42’的尺寸可以通过其体积、开口面积、深度和/或直径来表征。

每个凹入部42、42’可以具有能够限制引入到流通池10中的至少一些流体的任何体积。可以选择最小或最大体积，例如，以适应流通池10的下游用途所预期的通量(例如复用度)、分辨率、核苷酸或分析物反应性。例如，体积可为至少约1×10^-3μm³、至少约1×10^-2μm³、至少约0.1μm³、至少约1μm³、至少约10μm³、至少约100μm³或更大。另选地或除此之外，体积可为至多约1×10⁴μm³、至多约1×10³μm³、至多约100μm³、至多约10μm³、至多约1μm³、至多约0.1μm³或更小。

每个凹入部开口所占据的面积可基于与上文针对体积所述的标准类似的标准来选择。例如，每个凹入部开口的面积可为至少约1×10^-3μm²、至少约1×10^-2μm²、至少约0.1μm²、至少约1μm²、至少约10μm²、至少约100μm²或更大。另选地或除此之外，面积可为至多约1×10³μm²、至多约100μm²、至多约10μm²、至多约1μm²、至多约0.1μm²、至多约1×10^-2μm²或更小。每个凹入部开口所占据的面积可以大于、小于上文指定的值或介于它们之间。

每个凹入部42、42’的深度可以大到足以容纳聚合物水凝胶28、28’中的一些。在一个示例中，深度可以为至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。另选地或除此之外，深度可以为至多约1×10³μm、至多约100μm、至多约10μm或更小。在一些示例中，深度为约0.4μm。每个凹入部42、42’的深度可以大于、小于上文指定的值，或者介于上文指定的值之间。

在一些情况下，每个凹入部42、42’的直径或长度和宽度可以为至少约50nm、至少约0.1μm、至少约0.5μm、至少约1μm、至少约10μm、至少约100μm或更大。另选地或除此之外，直径或长度和宽度可以为至多约1×10³μm、至多约100μm、至多约10μm、至多约1μm、至多约0.5μm、至多约0.1μm或更小(例如，约50nm)。在一些示例中，直径为约0.4μm，或者长度和宽度中的每一者为约0.4μm。每个凹入部42、42’的直径或长度和宽度可以大于、小于上文指定的值，或者介于上文指定的值之间。

在该示例中，可以将测序表面14、14’的至少一些部件引入到凹入部42、42’中。应当理解，凹入部42、42’内未被测序表面14、14’的部件占据的任何空间可以被认为是富集通道18的一部分。

在图1C所示的示例中，聚合物水凝胶28、28’定位在凹入部42、42’中的每个凹入部内。聚合物水凝胶28、28’可以如参考图1B所述那样施加，使得聚合物水凝胶28、28’存在于凹入部42、42’中并且不存在于周围的间隙区域34、34’或富集捕获位点32、32’上。

在图1C所示的示例中，可以将引物30、30’接枝到凹入部42、42’中的每个凹入部内的聚合物水凝胶28、28’。引物30、30’可以参考图1B所述那样施加，因此将接枝到聚合物水凝胶28、28’而不是接枝到周围的间隙区域34、34’或富集捕获位点32、32’。

在图1C所示的示例中，富集捕获位点32、32’为施加在间隙区域34、34’中的至少一些上的化学捕获剂。例如，可以使用微接触印刷、气溶胶印刷等将化学捕获剂沉积在间隙区域34、34’中的至少一些上，以形成富集捕获位点32、32’。在又一个示例中，掩模(例如，光致抗蚀剂)可以用于限定将沉积化学捕获剂的空间/位置，并且因此限定将形成富集捕获位点32、32’的空间/位置。然后可沉积化学捕获剂，并且移除掩模(例如，通过剥离、溶解或另一种合适的技术)。

在其他示例中，富集捕获位点32、32’为附接到聚合物水凝胶28、28’的游离官能团(例如，未附接到引物30、30’的那些官能团)的化学捕获剂。在另外的其他示例中，富集捕获位点32、32’为附接到引物的化学捕获剂，这些引物与扩增引物30、30’中的一些杂交。在这些示例中，富集捕获位点32、32’将存在于凹入部42、42’中而不存在于间隙区域34、34’上。

本文所公开的化学捕获剂的任何示例可以用于图1C所示的示例中。化学捕获剂可以是生物素或结合对的另一个成员，这部分地取决于靶捕获珠粒36的固体载体38是如何官能化的。

如图1B和图1C所示，基底16A和16A’或16B和16B’彼此附接，使得测序表面12和12’或14和14’面向彼此，且其间限定有富集通道18。

基底16A和16A’或16B和16B’可以在间隙区域34、34’中的一些或全部间隙区域处彼此结合。在基底16A和16A’或16B和16B’之间形成的结合可以是化学结合或机械结合(例如，使用紧固件等)。

可以使用任何合适的技术诸如激光结合、扩散结合、阳极结合、共晶结合、等离子体活化结合、玻璃料结合或本领域已知的其他方法将基底16A和16A’或16B和16B’结合在一起。在一个示例中，间隔层(例如，材料24)可以用于结合基底16A和16A’或16B和16B’。间隔层可以是将基底16A和16A’或16B和16B’中的至少一些部分密封在一起的任何材料24。在一些示例中，间隔层可以是有助于粘结的辐射吸收材料。

尽管未示出，但是应当理解，封盖可以结合到基底16A或16A’中的一个基底，使得流通池10具有一个测序表面12或14。

流通池外文库制备

对于图1A、图1B和图1C所示的流通池10，文库片段的制备可以发生在流通池10的外部。当文库制备发生在流通池10的外部时，可以使用任何合适的文库制备技术，其将较长的一段遗传物质片段化并且将期望的接头掺入片段的末端。

DNA文库制备技术的一个示例涉及固体载体上的标签片段化。在该示例中，固体载体可以是本文示出的用于靶捕获珠粒36的示例中的任一个，并且加标签的文库片段固定在固体载体的表面上。

在该文库制备示例中，固体载体具有固定在其上的转座体复合物，其中每个转座体复合物包括结合到第一多核苷酸的转座酶，其中第一多核苷酸包括：(i)包含转座子末端序列的3’部分和(ii)第一标签(接头)。在通过转座体复合物将DNA样品片段化的条件下，将DNA样品暴露于固体载体，然后将第一多核苷酸的3’转座子末端序列转移到片段的一条链的5’末端。这产生了双链片段的固定文库，其中至少一条链用第一标签在5’末端加标签。

图2一般性地展示了这种文库制备方法。在该示例中，固体载体38’包括表面结合的转座体复合物44。转座体复合物44包括寡核苷酸(其接枝到固体载体38’，并且其中一些含有ME序列)和非共价结合至寡核苷酸的转座酶。这些表面结合的转座体44的密度可以通过改变含有ME序列的接枝寡核苷酸的密度或者通过添加到固体载体38’的转座酶的量来调节。例如，在一些实施方案中，转座体复合物44以至少10³、10⁴、10⁵或至少10⁶个复合物/mm²的密度存在于固体载体38’上。

在将双链DNA样品37添加到固体载体38’时，转座体复合物44将对添加的DNA进行标签片段化，从而产生在两端与固体载体38’的表面偶联(例如，经由插入的标签)的双链片段46。在一些示例中，桥接片段46的长度可以通过改变表面上的转座体复合物44的密度来改变。在一些示例中，所得桥接片段的长度小于100个碱基对(bp)、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1,000bp、1,100bp、1,200bp、1,300bp、1,400bp、1,500bp、1,600bp、1,700bp、1,800bp、1,900bp、2,000bp、2,100bp、2,200bp、2,300bp、2,400bp、2,500bp、2,600bp、2,700bp、2,800bp、2,900bp、3,000bp、3,100bp、3,200bp、3,300bp、3,400bp、3,500bp、3,600bp、3,700bp、3,800bp、3,900bp、4,000bp、4,100bp、4,200bp、4,300bp、4,400bp、4,500bp、4,600bp、4,700bp、4,800bp、4,900bp、5,000bp、10,000bp、30,000bp或小于100,000bp。在其他示例中，所得桥接片段46的长度较长。在特定实施方案中，所得桥接片段46的长度可以在由选自上文例示的那些的上限和下限限定的范围内。

双链DNA样品37的应用可以涉及将生物样品添加到固体载体38’。生物样品可以是包含DNA并且能够沉积到固体表面38’上以进行标签片段化的任何类型。例如，样品可以含有多种纯化状态的DNA，包括纯化的DNA。然而，样品不需要完全纯化，并且可以包含例如与蛋白质、其他核酸物质、其他细胞组分和/或任何其他污染物混合的DNA。例如，生物样品可以包含以与体内发现的大致相同的比例存在的DNA、蛋白质、其他核酸物质、其他细胞组分和/或任何其他污染物的混合物。所述组分可以与完整细胞中发现的比例相同。在一些示例中，生物样品具有小于2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7或小于0.60的260/280比率。在一些实施方案中，生物样品具有至少2.0、1.9、1.8、1.7、1.6、1.5、1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7或至少0.60的260/280比率。因为本文所提供的方法允许DNA与固体载体38’结合，所以能够在表面结合的标签片段化发生后仅通过洗涤固体载体来移除其他污染物。生物样品可以包括例如粗制细胞裂解物或全细胞。例如，在该示例的文库制备方法中施加至固体载体38’的粗制细胞裂解物不需要经受传统上用于从其他细胞组分分离核酸的一个或多个分离步骤。

因此，在一些示例中，生物样品可以包括例如血液、血浆、血清、淋巴、粘液、痰液、尿液、精液、脑脊液、支气管抽吸物、粪便和浸渍组织，或它们的裂解产物，或包含DNA的任何其他生物样本。

图3A和图3B展示了根据一个示例的标签片段化反应。如图3A所示，转座体44包括Tn5的二聚体，其中每个单体50结合双链分子，例如ME衔接子。ME衔接子的一条链48共价附接至固体载体38’的表面。转座体44结合样品DNA并且在DNA主链中产生两个切口，从而产生片段46。在图3A所示的示例中，切口在任一条链上相隔9个碱基。应当理解，转座体44可以在切口之间产生7、8、9、10、11或12bp的空隙。每个ME衔接子的两条链中的一条链(例如，链48)在每个切口位置处连接至每个片段46的5’末端。该链48被称为“转移链”，并且经由其5’末端接枝到固体载体38’的表面。图3A的表面标签片段化的所得桥在图3B中重新绘制，以阐明所得桥的性质。

转移链48可以包括第一测序引物序列(例如读段1测序引物序列)和第一序列(P5’)，该第一序列与流通池测序表面12、14上的扩增引物中的一个扩增引物(例如P5)的至少一部分互补。因此，标签片段化将一个接头(或标签)引入每个DNA片段46。

在标签片段化之后，可以经由十二烷基硫酸钠(SDS)处理或加热或蛋白酶K消化来移除转座酶。移除转座酶留下了附接到固体载体38’的片段46。

ME衔接子的非转移链48’是这样的接头：其在标签片段化期间未掺入到DNA片段46中，而是可以随后连接至每个片段46的另一端。在标签片段化期间，非转移链48’可以经由碱基配对附接到转移链48。在一些示例中，非转移链48’为这样的接头(或标签)：其包括第二测序引物序列(例如，读段2测序引物序列)和第二序列(P7)，该第二序列与流通池测序表面12、14上的扩增引物中的另一个扩增引物(P7)的至少一部分相同。在扩增期间，相同序列使得能够形成与流通池测序表面12、14上的扩增引物中的一个扩增引物(例如P7)的至少一部分互补的拷贝。如图3B中所描绘，可以执行连接L以将非转移链48’掺入到每个DNA片段46中与掺入转移链48的末端相对的末端。

尽管已详细描述了一种文库制备技术，但是应当理解，也可以使用其他文库制备技术。

在另一个文库制备示例中，接头之一(例如，包括第一测序引物序列和第一序列(P5’)，该第一序列与流通池测序表面12、14上的扩增引物中的一个扩增引物(例如P5)的至少一部分互补)可以结合至固体载体38’的表面。

在该示例中，转座体复合物也可以结合至固体载体38’。在将转座体复合物装载到固体载体16上之前，可以将部分Y-接头与转座酶(例如包括两个Tn5分子)混合，以形成转座体复合物的一个示例。部分Y-接头可包括彼此杂交的两个镶嵌末端序列。所述镶嵌末端序列中的一个镶嵌末端序列具有能够在标签片段化期间附接至片段化DNA链46的自由端，因此类似于图3A和图3B中的转移链48。所述镶嵌末端序列中的另一个镶嵌末端序列可以附接至第二测序引物序列(例如，读段2测序引物序列)和第二序列(P7)，该第二序列具有与流通池测序表面12、14上的扩增引物中的另一个扩增引物(P7)的至少一部分相同的序列，使得其拷贝(例如，P7’)与扩增引物(P7)互补。在该示例中，所述镶嵌末端序列中的另一个镶嵌末端序列、第二测序引物序列和第二序列构成在标签片段化期间未附接至片段化DNA链的接头序列，因此类似于图3A和图3B中的非转移链48’。

将该转座体复合物装载到固体载体38’上可以涉及将该转座体复合物与固体载体38’混合，并且使该混合物暴露于用于将部分Y-接头的镶嵌末端连接至固体载体38’上的接头序列的3’末端的合适条件。

在该示例中，然后可以执行标签片段化过程。在标签片段化期间，可以将DNA样品37施加至固体载体38’。当样品接触转座体复合物时，较长的核酸样品37被标签片段化。在该标签片段化示例期间，样品36被片段化为片段64，并且片段64中的每个片段在其5’末端处均用部分Y-接头的镶嵌末端的自由端加标签。较长核酸样品37的连续标签片段化导致转座体复合物之间的多个桥接分子。桥接分子包裹在固体载体38’周围。可以移除转座酶，并且进行进一步的延伸和连接，以确保样品片段附接至未附接的接头序列部分Y-接头。

在又一个文库制备示例中，在管中产生其上附接有接头的核苷酸文库，然后通过接头与固体载体38’上的引物杂交，来将文库附接至固体载体38’。在又一个文库制备示例中，可以将具有结合对的一个成员的接头序列添加到管中的文库片段中，然后将测序就绪文库片段结合至管中的固体载体38’。

流通池外发生的文库制备也可以涉及核糖核酸(RNA)样品。

在这些示例中，首先将RNA样品转化为互补脱氧核糖核酸(cDNA)样品。这可使用逆转录进行，该逆转录利用逆转录酶。在一些示例中，使用用于逆转录和第二链合成的试剂盒。在这些示例中，可使用得自ThermoFisher Scientific的高容量cDNA逆转录试剂盒。在其他示例中，使用用于逆转录和模板转换(用于第二链)的试剂盒。在这些示例中，可使用得自New England Biolabs的模板转换RT酶混合物。

一旦由RNA样品产生双链DNA，就可以使用任何DNA文库制备方法(包括本文所述的那些)将接头/标签添加至片段46，以产生附接至固体载体38’的测序就绪核酸片段。

流通池上文库制备

图1A、图1B和图1C所示的流通池10的示例也可以被包括在组合文库制备和分析系统52中。该系统52和其中包括的流通池10’在图4中示意性地示出。流通池10’包括在富集通道18上游的一个或多个制备通道54、54’。富集通道18可以是本文所公开的用于流通池10的示例中的任一个，其包括测序表面12或14和富集捕获位点32、32’。

如图4所示，系统52包括流通池试剂系统56，该流通池试剂系统至少与富集通道18选择性地流体连通。流通池试剂系统56可以包括贮液器58、60、62，流体通道(例如，输送通道64)、泵、阀和其他流体装置部件，所述流体装置部件可以控制试剂流入和流出流通池10’的不同通道18、54、54’。

制备通道54、54’用于流通池上文库制备。在将要分析DNA时，流通池10’可以包括DNA文库制备通道54，该DNA文库制备通道在富集通道18的上游并且与该富集通道选择性地流体连通。在将要分析RNA时，流通池10’可以既包括RNA文库制备通道54’，又包括DNA文库制备通道54(它们彼此流体连通)。在该示例中，DNA文库制备通道54在富集通道18的上游并且与该富集通道选择性地流体连通；并且RNA文库制备通道54’在DNA文库制备通道54的上游并且与该DNA文库制备通道选择性地流体连通。

流通池10’可以包括基底16的任何示例，其中制备通道54、54’被限定在第一区域中，并且富集通道18被限定在第二区域中。因为它们被限定在基底16的不同区域中，所以通道54、54’和/或18内的架构和部件可以是不同的。

类似于富集通道18，DNA文库制备通道54可以限定在两个基底16之间，或一个基底16与封盖之间。基底16中的限定DNA文库制备通道54的区域可以是非图案化的(类似于基底16B、16B’)，并且可以被官能化以包括制备捕获位点(未示出)，所述制备捕获位点暂时地附接用于文库制备的固体载体38’。

在一个示例中，限定DNA文库制备通道54的基底区域的表面涂覆有结合对成员(例如，抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、生物素、凝集素、碳水化合物、核酸结合蛋白、表位、抗体等)，其能够结合至位于用于文库制备的固体载体38’上的另一个结合对成员。每个结合对成员都是一个制备捕获位点。在另一个示例中，限定DNA文库制备通道54的基底区域的表面涂覆有具有与其杂交的生物素化寡核苷酸的寡核苷酸。在该示例中，生物素化寡核苷酸是能够暂时地附接用于文库制备的固体载体38’的制备捕获位点。在其他示例中，制备捕获位点可以能够进行任何其他形式的化学偶联，该化学偶联可以将固体载体38’附接到DNA文库制备通道54的表面。

DNA文库制备可以在DNA文库制备通道54中进行，因此DNA文库制备通道54不包括扩增引物30、30’。

贮液器58被示出为与DNA文库制备通道54选择性地流体连通。该贮液器58可以包括不同的室，以选择性地将DNA样品37和文库制备流体递送至DNA文库制备通道54，使得文库制备可以在通道54内进行。在一些示例中，文库制备流体可以包括文库制备珠粒(包括固体载体38’和附接至其上的转座体44，如参考图2和图3A所述)。在将DNA样品37和文库制备流体引入到DNA文库制备通道54中时，固体载体38’可以结合至制备捕获位点，并且DNA文库制备可以例如使用本文所述的标签片段化方法进行。

应当理解，取决于将使用的文库制备方法，贮液器58还可以将不同的流体递送至DNA文库制备通道54。

流通池10’的一些示例包括在DNA文库制备通道54上游的RNA文库制备通道54’。

类似于富集通道18和DNA文库制备通道54，RNA文库制备通道54’可以限定在两个基底16之间，或一个基底16与封盖之间。基底16中的限定RNA文库制备通道54’的区域可以是非图案化的(类似于基底16B、16B’)。RNA文库制备通道54’可以用于初始制备RNA样品，因此RNA文库制备通道54’不包括扩增引物30、30’。

RNA文库制备的初始过程可以在RNA文库制备通道54’中进行。贮液器60被示出为与RNA文库制备通道54’选择性地流体连通。该贮液器60可以包括不同的室，以选择性地将RNA样品和文库制备流体递送至RNA文库制备通道54’，使得RNA可以在通道54’内转化为cDNA。在一些示例中，文库制备流体可以包括逆转录酶和用于第二链合成的试剂。在其他示例中，文库制备流体可以包括逆转录酶和用于模板切换(针对第二链)的试剂。

然后可以将RNA文库制备通道54’中制备的cDNA递送(例如，经由输送通道)至DNA文库制备通道54。在DNA文库制备通道54内，可以对cDNA进行标签片段化，以掺入接头(标签)并且产生附接至DNA文库制备通道54内的固体载体38的测序就绪核酸片段。替代性地，可以对DNA文库制备通道54中的cDNA进行任何其他合适的DNA文库制备技术。

DNA文库制备通道54与富集通道18选择性地流体连通。在一个示例中，输送通道64选择性地且以流体方式连接制备通道54和富集通道18，使得可以将测序就绪核酸片段递送至富集通道18以进行捕获、扩增和测序。

富集方法

一种示例的富集方法包括：由基因组脱氧核糖核酸或互补脱氧核糖核酸制备文库片段；将所述文库片段引入富集通道18；以及在预定温度下温育富集通道18，由此包括靶向区域的文库片段中的至少一些与捕获探针40杂交。

本文所公开的靶捕获珠粒36可以预先附接至流通池10、10’中的富集捕获位点32、32’，或者可以作为富集和测序工作流程的一部分引入(例如，通过流通池10、10’的用户)到富集通道18。

当作为测序工作流程的一部分引入时，可以将靶捕获珠粒36置于富集流体(例如，含有靶捕获珠粒36的盐缓冲液)中而包括到富集通道18中。在图4所示的示例中，富集流体可以被容纳在与富集通道18选择性地流体连通的贮液器62内。

富集流体可以从贮液器62递送至富集通道18。富集捕获位点32、32’将靶捕获珠粒36中的一些固定在富集通道18中的测序表面12、12’或14、14’处。应当理解，一些靶捕获珠粒36可以不附接至富集捕获位点32、32’，并且这些靶捕获珠粒36将在进一步处理之前从富集通道18移除。可以允许在从富集通道18移除富集流体和任何未固定的靶捕获珠粒36之前经过预定的时间。在一个示例中，预定的时间可以在约5分钟至约30分钟的范围内，以便获得期望数量的固定的靶捕获珠粒36。也可使用更长的温育时间。

然后，该示例方法包括从富集通道18洗掉富集流体和未捕集的靶捕获珠粒36。洗涤可以涉及将洗涤流体引入到富集通道18中。该流动可以将尚未固定在富集捕获位点32、32’处的任何靶捕获珠粒36通过富集通道18的出口推出。靶捕获珠粒36与富集捕获位点32、32’之间的固定机制(例如结合对、杂交、共价结合等)可以防止任何固定的靶捕获珠粒36成为排出流的一部分。

无论使用的是流通池外文库制备技术还是流通池上文库制备技术，都可以先将测序就绪核酸片段从固体载体38’释放，再将其引入到富集通道18中。

在利用流通池外文库制备技术的情况下，可以使用任何合适的技术在流通池10、10’的外部引发测序就绪核酸片段从固体载体38’释放。在一个示例中，可以引入裂解剂，并且可以施加刺激以触发该裂解剂，从而将测序就绪核酸片段从固体载体38’释放。在其他示例中，释放测序就绪核酸片段可以涉及将固体载体38’加热至高于与测序就绪核酸片段杂交的引物的解链温度。当测序就绪核酸片段为双链核酸片段时(例如，如图2和图3B所示)，可以使用加热来将碎片彼此解离。释放的测序就绪核酸片段可以与固体载体38’分离。

在利用流通池上文库制备技术的情况下，可以使用任何合适的技术(例如，裂解剂和刺激、加热等)在DNA文库制备通道54中引发测序就绪核酸片段从固体载体38’释放。固体载体38’可以保持附接至DNA文库制备通道54中的制备捕获位点，因此，释放的测序就绪核酸片段可以从DNA文库制备通道54输送到富集通道18中。

在被引入到富集通道18中之前，单链测序就绪核酸片段可以具有附接至每个末端处的接头的封阻序列(blocker)。可以选择封阻序列以减少接头与引物的杂交。因此，封阻序列可以至少减少测序就绪核酸片段与流通池引物30、30’的杂交。在一个示例中，封阻序列是购自Integrated DNA Technologies的

通用封阻序列。

图5示意性地展示了将末端封阻的测序就绪核酸片段66、66’引入具有固定在富集捕获位点32处的靶捕获珠粒36的富集通道18。末端封阻的测序就绪核酸片段66’中的一些包括靶文库片段，而末端封阻的测序就绪核酸片段66中的另一些包括非靶文库片段(例如，DNA样品的不是特定分析感兴趣的片段)。因为捕获探针40具有与靶文库片段末端封阻的测序就绪核酸片段66’互补的序列，所以末端封阻的测序就绪核酸片段66’中的至少一些分别与捕获探针40杂交。相比之下，其他末端封阻的测序就绪核酸片段66将不与捕获探针40杂交，因为其非靶文库片段的序列不与捕获探针40互补。此外，封阻序列可以防止末端封阻的测序就绪核酸片段66、66’与流通池引物30杂交。

可以允许末端封阻的测序就绪核酸片段66、66’在富集通道18中在一定的温度下温育一定的时间，使得杂交发生在靶文库片段与捕获探针40之间。温育时间可以在约5分钟至约2小时的范围内。在一个示例中，温育时间为约1.5小时。温育温度可以在约50℃至约55℃的范围内。在一个示例中，温育温度为约50℃。

在一些示例中，可以用测序就绪核酸片段66、66’来引入拥挤试剂。示例的拥挤试剂包括硫酸葡聚糖和聚乙二醇。这些拥挤试剂可以有助于使测序就绪核酸片段66、66’拥挤到靶捕获珠粒36。

在其他示例中，可以在温育测序就绪核酸片段66、66’期间将电场施加至富集通道18。电场可以使用集成到流通池10、10’中的电极或使用外部电极来施加。电场可以有助于将测序就绪核酸片段66、66’移动至靶捕获珠粒36。

在其他示例中，该方法可以包括在温育期间引起含有测序就绪核酸片段66、66’的流体的移动。在一个示例中，富集通道18可以在表面上包括能够促进流体移动的刷、柱或其他三维结构。

在另外的示例中，可以使用电泳来预浓缩富集通道18中的测序就绪核酸片段66、66’。在一个示例中，等速电泳(ITP)可以用于使杂交加速。ITP可以用于将测序就绪核酸片段66、66’浓缩成窄带宽，例如，比使用ITP时的浓度高1000倍的浓度。这将显著地驱动杂交动力学，从而缩短杂交时间(例如，约1.5小时至约15分钟)。

也可以使用用于增加测序就绪核酸片段66’的杂交效率的其他已知方法(例如，调节缓冲条件、高表面负电荷条件等)。

然后，该方法的任何示例可以包括从富集通道18洗掉末端封阻的测序就绪核酸片段66。洗涤可以涉及将洗涤流体引入到富集通道18中。该流动可以将尚未与捕获探针40杂交的任何片段66或66和66’通过富集通道18的出口推出。末端封阻的测序就绪核酸片段66’与靶捕获珠粒36的捕获探针40之间的固定机制(例如杂交)可以防止任何固定的末端封阻的测序就绪核酸片段66’成为排出流的一部分。

在本文所公开的整个富集方法中，应当理解，流速和/或温度可以被编程为增强：i)捕获探针40-靶文库片段杂交效率和ii)洗涤过程，以便最小化包括非靶文库片段的片段66的结合。

文库片段释放和测序

然后可以由捕获探针40使固定的末端封阻的测序就绪核酸片段66’变性。变性可以在接种试剂(例如，盐缓冲液)中以及合适的变性温度下完成。根据所利用的接种试剂，变性温度可以在约70℃至约92℃的范围内。在一个示例中，变性温度为约92℃。变性温度可以高于移除封阻序列所需的温度。因此，变性可以移除封阻序列，并且不会利用附加的移除过程。此外，由于末端封阻的测序就绪核酸片段66’在富集通道18中释放，所以释放的片段66’只有极小的损失，甚至没有损失。因此，不使用富集后PCR。

然后将洗脱的片段66’(其中的每个片段包括靶文库片段)接种在整个测序表面12、12’或14、14’上。通过在片段66’的接头/标签的序列与引物30、30’中的一个互补引物之间杂交来完成接种。接种可以在片段66’和引物30、30’的合适杂交温度下进行。

测序就绪核酸片段66’在流通池10内接种的位置部分地取决于引物30、30'的附接方式。在具有非图案化测序表面12、12’的流通池10的示例中，释放的测序就绪核酸片段66’将在凹面区域26、26’中的整个聚合物水凝胶28、28’上接种。在具有图案化测序表面14、14’的流通池10的示例中，释放的测序就绪核酸片段66’将在凹入部42、42’中的每个凹入部内的整个聚合物水凝胶28、28’上接种。

然后可以将靶捕获珠粒36的固体载体38从富集通道18移除。移除固体载体38可以涉及任何合适的技术，具体取决于用于将靶捕获珠粒36附接至富集捕获位点32、32’的机制。例如，可使用变性、键断裂等。

然后可以使用簇生成来扩增已接种的测序就绪核酸片段66’。

在簇生成的一个示例中，使用高保真DNA聚合酶通过3’延伸从杂交引物30、30’拷贝测序就绪核酸片段66’。使原始的测序就绪核酸片段66’变性，留下固定至测序表面12、12’或14、14’的拷贝。拷贝包括靶文库片段的序列。等温桥扩增或一些其他形式的扩增可用于扩增固定的拷贝。例如，拷贝的模板环回以与相邻的互补引物30、30’杂交，并且聚合酶拷贝所拷贝的模板以形成双链桥，使这些双链桥变性以形成两条单链。这两条链环回并且与相邻的互补引物30、30’杂交，然后再次延伸以形成两个新的双链环。通过等温变性和扩增循环对每个模板拷贝重复该过程，以产生密集的克隆簇。使双链桥的每个簇变性。在一个示例中，通过特异性碱基裂解移除反向链，从而留下正向模板多核苷酸链(具有靶文库片段的序列)。簇生成使得沿测序表面12、12’或14、14’形成若干条模板多核苷酸链。该簇生成示例为等温桥式扩增，并且是可以执行的扩增的一个示例。应当理解，可使用其他扩增技术，诸如排除扩增(ExAmp)工作流程(Illumina Inc.)。

可以引入与模板多核苷酸链上的互补序列杂交的测序引物。该测序引物使得模板多核苷酸链准备好用于测序。可以将模板和任何流通池结合的引物30、30’(未附接到拷贝)的3’末端封阻，以防止干扰测序反应，并且具体地讲，防止不期望的引发。

为了引发测序，可以将掺入混合物添加到富集通道18中。在一个示例中，掺入混合物包含液体载体、聚合酶和荧光标记的核苷酸。荧光标记的核苷酸可包含3'OH封端基团。在将掺入混合物引入富集通道18中时，流体进入该通道18，并且在一些示例中，进入凹入部42、42’(其中存在模板多核苷酸链)。

以模板依赖性方式将荧光标记的核苷酸添加到测序引物(从而使测序物延伸)，使得对添加到测序引物中的核苷酸的顺序和类型的检测可用于确定模板的序列。更具体地，通过相应的聚合酶将核苷酸之一掺入延伸测序引物并与模板多核苷酸链互补的新生链中。换句话讲，在整个富集通道18上的模板多核苷酸链中的至少一些中，相应的聚合酶通过掺入混合物中的核苷酸中的一种核苷酸延伸杂交的测序引物。

核苷酸的掺入可以通过成像事件来检测。在成像事件期间，照明系统(未示出)可以向相应测序表面12、12’或14、14’提供激发光。

在一些示例中，核苷酸可以进一步包括可逆终止属性(例如，3'OH封端基团)，一旦将核苷酸添加到测序引物中，该属性就会终止进一步的引物延伸。例如，可以将具有可逆终止子部分的核苷酸类似物添加到测序引物，使得随后的延伸直到递送解封闭剂以除去该部分才发生。因此，对于使用可逆终止的示例，可以在检测发生之后将解封阻试剂递送至富集通道18。

洗涤可在各种流体递送步骤之间发生。然后可以重复SBS循环n次以将测序引物延伸n个核苷酸，从而检测长度为n的序列。

在一些示例中，可以对正向链进行测序和移除，然后如本文所述对反向链进行构建和测序。

虽然已详细描述了SBS，但是应当理解，本文所述的流通池10、10’可以与其他测序方案一起用于基因分型，或者用于其他化学应用和/或生物应用中。

试剂盒

本文所公开的一些示例是试剂盒。这些试剂盒可以用于执行本文所公开的流通池上靶富集。

试剂盒的一个示例包括：包括文库制备珠粒的文库制备流体，每个文库制备珠粒包括第一固体载体38’；和附接至第一固体载体38’的转座体44；包括基因组脱氧核糖核酸序列的样品流体；以及包括靶捕获珠粒36的富集流体，每个靶捕获珠粒36包括第二固体载体38；和附接至第二固体载体38的捕获探针40，捕获探针40中的每个捕获探针包括与样品流体中的基因组脱氧核糖核酸的靶向区域互补的单链脱氧核糖核酸序列。

在该示例的试剂盒中，第一固体载体38’和第二固体载体38单独地选自由以下项组成的组：磁响应材料、玻璃、聚合物和金属。

在该示例的试剂盒中，捕获探针40可以通过结合对附接至第二固体载体38。可以使用本文所公开的结合对中的任一种。

该试剂盒的一些示例还包括封阻流体，该封阻流体包括封阻脱氧核糖核酸序列。封阻流体可以用于在将测序就绪核酸片段66、66’引入到流通池10、10’的富集通道18中之前将这些片段封阻。

试剂盒的另一个示例包括：将RNA转化为cDNA的子试剂盒；以及包括靶捕获珠粒36的富集流体，每个靶捕获珠粒36包括：固体载体38；和附接至固体载体38的捕获探针40，捕获探针40中的每个捕获探针包括与使用将RNA转化为cDNA的子试剂盒产生的cDNA的靶向区域互补的单链脱氧核糖核酸序列。

该示例的试剂盒还可以包括：包括文库制备珠粒的文库制备流体，每个文库制备珠粒包括第一固体载体38’；和附接至第一固体载体38’的转座体44。

在该示例的试剂盒中，捕获探针40可以通过结合对附接至固体载体38。可以使用本文所公开的结合对中的任一种。

为了进一步说明本公开，本文给出了实施例。应当理解，提供这些实施例是出于说明目的，而不应理解为限制本公开的范围。

非限制性工作示例

实施例1

在该实施例中，进行比较富集方法和示例富集。

选择PhiX基因组的靶区域，并且制备具有与该靶区域互补的序列的单链捕获探针。靶区域包括基因组坐标3194，并且捕获探针大小为69个核苷酸。这些捕获探针在一端生物素化。

制备NEXTERA^TMPhiX文库(来自Illumina Inc.)，并且将封阻序列(来自IntegratedDNA Technologies)添加到该文库中。封阻文库的最终浓度为约2pM。将该文库分成两个管。

对于比较富集方法，将生物素化捕获探针(0.02μM/1.5μL/总共1.8E+10个探针)与这两个管之一中的文库片段一起温育约1.5小时，以允许在包括靶区域的文库片段与生物素化捕获探针之间进行杂交。然后将管内容物暴露于链霉抗生物素蛋白珠粒(M280，6E+06个珠粒)，其中杂交的探针/片段经由捕获探针的生物素标记与珠粒结合。然后使用磁力将珠粒(具有捕获文库片段)与非捕获文库片段分离。然后将珠粒(具有捕获的杂交探针/片段)装载到用炔烃PEG-生物素和P5/P7引物官能化的非图案化流通池上。这些珠粒(具有捕获的杂交探针/片段)通过珠粒上的游离链霉抗生物素蛋白位点固定在炔烃PEG-生物素位点处。在具有十二烷基硫酸钠的柠檬酸钠盐水缓冲液中，在约92℃下将文库片段从珠粒洗脱约2分钟，然后将温度降至约40℃，持续约5分钟以进行接种。

对于实施例富集方法，将生物素化捕获探针(0.02μM/1.5μL/总共1.8E+10个探针)与链霉抗生物素蛋白珠粒(M280，6E+06个珠粒)一起温育约1(一)小时。这些生物素化捕获探针经由生物素标记与珠粒结合。然后将珠粒(具有捕获的生物素化捕获探针)装载到用炔烃PEG-生物素和P5/P7引物官能化的非图案化流通池上。这些珠粒(具有捕获的生物素化捕获探针)通过珠粒上的游离链霉抗生物素蛋白位点固定在炔烃PEG-生物素位点处。将另一个管中的文库片段装载到流通池上，并且使其温育约1.5小时，以允许在包括靶区域的文库片段与珠粒表面上的生物素化捕获探针之间进行杂交。进行洗涤过程，以移除未结合的文库片段。在具有十二烷基硫酸钠的柠檬酸钠盐水缓冲液中，在约92℃下将结合的文库片段从珠粒洗脱约2分钟，然后将温度降至约40℃，持续约5分钟以进行接种。

在比较方法和实施例方法两者中，洗涤流通池以移除珠粒。

在比较方法和实施例方法两者中，使用等温扩增进行簇生成，然后进行测序。比较方法和实施例方法均导致来自PhiX基因组的靶区域的极高数量读段(在+/-500bp窗口内的95％读段，如通过文库的大小所限定的)。

图6描绘了当使用比较富集方法时在流通池表面上以及当使用实施例富集方法时在流通池表面上的成簇靶文库片段的相对覆盖率图。相对覆盖率图是基因座处的相对读段深度(％，Y轴)与基因组坐标的关系。相对覆盖率图表明捕获探针在比较方法和实施例方法两者中均有效地杂交包括靶区域的文库片段。实施例方法简化了工作流程(与比较方法相比)，还实现了靶富集。

实施例2

在该实施例中，靶区域来自TRUSIGHT^TM肿瘤170小组(来自Illumina Inc.)。制备具有与该靶区域互补的序列的单链捕获探针。这些捕获探针在一端生物素化。

将这些生物素化捕获探针与链霉抗生物素蛋白珠粒(M280)一起温育约1(一)小时，以实现约3.13E+05个捕获探针/珠粒的探针密度)。这些生物素化捕获探针经由生物素标记与珠粒结合。然后将珠粒(具有捕获的生物素化捕获探针)装载到用炔烃PEG-生物素和P5/P7引物官能化的非图案化流通池上。这些珠粒(具有捕获的生物素化捕获探针)通过珠粒上的游离链霉抗生物素蛋白位点固定在炔烃PEG-生物素位点处。

将NEXTERA^TMFlex文库制备试剂盒(Illumina Inc.)与人NA 12878样品(来自Coriell Life Sciences)一起用于制备文库，并且将封阻序列(来自Integrated DNATechnologies)添加到文库中。将文库片段装载到流通池上，并且使其在约50℃下温育约2小时，以允许在包括靶区域的文库片段与固定珠粒的表面上的生物素化捕获探针之间进行杂交。

进行洗涤过程，以移除未结合的文库片段。在具有十二烷基硫酸钠的柠檬酸钠盐水缓冲液中，在约92℃下将结合的文库片段从珠粒洗脱约2分钟，然后将温度降至约40℃，持续约5分钟以进行接种。

洗涤流通池以移除珠粒，并且使用等温扩增进行簇生成。然后进行测序，并且获得测序读段。通过将读段的数目除以2来确定靶向簇计数。通过确定总读段与靶区域比对的百分比，来确定富集因子。这些结果在表1中的样品单次文库递送下示出。

重复该方法，不同的是使用回转阀以两次梭动将文库片段装载到流通池上，并且使每次梭动在约50℃下温育约2小时，以允许在包括靶区域的文库片段与固定珠粒的表面上的生物素化捕获探针之间进行杂交。在每次梭动递送和杂交之间进行约50℃下的洗涤。

在具有十二烷基硫酸钠的柠檬酸钠盐水缓冲液中，在92℃下将文库片段从珠粒洗脱约2分钟，然后将温度降至约40℃，持续约5分钟以进行接种。

洗涤流通池以移除珠粒，并且使用等温扩增进行簇生成。然后进行测序，并且获得测序读段。确定靶向簇计数和富集因子。这些结果在表1中的样品多次文库递送下示出。

表1

如表1所示，尽管两种方法均导致来自靶区域的期望数量的簇，但是多次递送方法导致富集因子增大。

实施例3

在该实施例中，靶区域来自TRUSIGHT^TM肿瘤170小组(来自Illumina Inc.)。制备具有与该靶区域互补的序列的单链捕获探针。这些捕获探针在一端生物素化。

将这些生物素化捕获探针分别与链霉抗生物素蛋白珠粒(M280)一起温育约1(一)小时，以获得具有不同探针密度的三种不同样品：样品1＝约5.78E+04个捕获探针/珠粒，样品2＝约2.98E+05个捕获探针/珠粒，样品3＝约1.16E+06个捕获探针/珠粒。对于每个样品，这些生物素化捕获探针经由生物素标记与珠粒结合。然后将珠粒样品(具有捕获的生物素化捕获探针)分别装载到用炔烃PEG-生物素和P5/P7引物官能化的三个不同的非图案化流通池上。对于每个样品，这些珠粒(具有捕获的生物素化捕获探针)通过珠粒上的游离链霉抗生物素蛋白位点固定在炔烃PEG-生物素位点处。

将NEXTERA^TMFlex文库制备试剂盒(Illumina Inc.)与人NA 12878样品(来自Coriell Life Sciences)一起用于制备文库，并且将封阻序列(来自Integrated DNATechnologies)添加到文库中。将文库片段装载到不同的流通池上，并且将其在约50℃下温育约2小时，以允许在包括靶区域的文库片段与固定珠粒的表面上的生物素化捕获探针之间进行杂交。

进行洗涤过程，以移除未结合的文库片段。在具有十二烷基硫酸钠的柠檬酸钠盐水缓冲液中，在约92℃下将结合的文库片段从珠粒洗脱约2分钟，然后将温度降至约40℃，持续约5分钟以进行接种。

洗涤流通池以移除珠粒，并且使用等温扩增进行簇生成。然后进行测序，并且获得测序读段。通过将读段的数目除以2来确定靶向簇计数。

每个样品的簇计数在图7中示出。如所描绘的，当珠粒上的探针密度增大时，富集了更多的具有靶区域的文库片段。

附加说明

此外，应当理解，本文提供的范围包括规定范围和规定范围内的任何值或子范围，如同它们被明确列举一样。例如，由约2mm至约300mm表示的范围应当解释为不仅包括明确列举的限值约2mm至约300mm，而且还包括单个值诸如约15mm、22.5mm、245mm等，以及子范围诸如约20mm至约225mm等。

应当理解，前述概念和下文更详细讨论的附加概念(假设此类概念不相互矛盾)的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。具体地讲，出现在本公开末尾的要求保护的主题的所有组合都被设想为是本文所公开的发明主题的一部分。还应当理解，本文明确采用的也可出现在以引用方式并入的任何公开中的术语应被赋予与本文所公开的特定概念最一致的含义。

虽然已经详细描述了若干示例，但是应当理解，可以对所公开的示例进行修改。因此，上述说明应被认为是非限制性的。

Claims (27)

1.一种试剂盒，包括：

包括文库制备珠粒的文库制备流体，每个文库制备珠粒包括：

第一固体载体；和

附接至所述第一固体载体的转座体；

包括基因组脱氧核糖核酸序列的样品流体；以及

包括靶捕获珠粒的富集流体，每个靶捕获珠粒包括：

第二固体载体；和

附接至所述第二固体载体的捕获探针，所述捕获探针中的每个捕获探针包括与所述样品流体中的所述基因组脱氧核糖核酸的靶向区域互补的单链脱氧核糖核酸序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述第一固体载体和所述第二固体载体单独地选自由以下项组成的组：磁响应材料、玻璃、聚合物和金属。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中所述捕获探针通过结合对附接至所述第二固体载体。

4.根据权利要求1至3中的一项所述的试剂盒，还包括封阻流体，所述封阻流体包括封阻脱氧核糖核酸序列。

5.根据权利要求1至4中的一项所述的试剂盒，其中所述靶捕获珠粒的探针密度在每个固体载体约2*10⁵个捕获探针至每个固体载体约5*10⁶个捕获探针的范围内。

6.一种试剂盒，包括：

将RNA转化为cDNA的子试剂盒；以及

包括靶捕获珠粒的富集流体，每个靶捕获珠粒包括：

固体载体；以及

附接至所述固体载体的捕获探针，所述捕获探针中的每个捕获探针包括与使用所述将RNA转化为cDNA的子试剂盒产生的cDNA的靶向区域互补的单链脱氧核糖核酸序列。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中所述捕获探针通过结合对附接至所述固体载体。

8.一种系统，所述系统包括：

基底；

限定在所述基底上的第一区域处的制备通道，所述制备通道包括用于固定文库制备珠粒的制备捕获位点；

限定在所述基底上的第二区域处且在所述制备通道下游的富集通道，所述富集通道包括：

扩增引物；和

用于固定靶捕获珠粒的富集捕获位点；

以及

输送通道，所述输送通道选择性地且以流体方式连接所述制备通道和所述富集通道。

9.根据权利要求8所述的系统，其中所述制备通道不包括所述扩增引物。

10.根据权利要求8或9所述的系统，还包括附接至所述基底的第二基底，其中所述第二基底包括：

第二制备通道，所述第二制备通道包括第二制备捕获位点；以及

第二富集通道，所述第二富集通道包括第二扩增引物和第二富集捕获位点。

11.根据权利要求8至10中的一项所述的系统，还包括流通池试剂系统，所述流通池试剂系统与所述富集通道选择性地流体连通。

12.根据权利要求11所述的系统，其中所述试剂系统包括：

贮液器；以及

容纳在所述贮液器中的富集流体，所述富集流体包括靶捕获珠粒，每个靶捕获珠粒包括：

固体载体；和

附接至所述固体载体的捕获探针，所述捕获探针中的每个捕获探针包括与基因组脱氧核糖核酸的靶向区域或者互补脱氧核糖核酸的靶向区域互补的单链脱氧核糖核酸序列。

13.根据权利要求8至12中的一项所述的系统，还包括固定在所述富集捕获位点处的所述靶捕获珠粒，每个靶捕获珠粒包括：

固体载体；以及

附接至所述固体载体的捕获探针，所述捕获探针中的每个捕获探针包括与基因组脱氧核糖核酸的靶向区域或者互补脱氧核糖核酸的靶向区域互补的单链脱氧核糖核酸序列。

14.根据权利要求13所述的系统，其中所述富集捕获位点包括结合对的第一成员，并且所述固体载体涂覆有所述结合对的第二成员。

15.根据权利要求8至14中的一项所述的系统，其中所述富集通道包括由间隙区域隔开的凹入部，并且其中所述扩增引物和富集捕获位点定位在所述凹入部中的每个凹入部内。

16.一种流通池，所述流通池包括：

限定在两个表面之间的富集通道，所述富集通道包括：

附接至所述两个表面中的至少一个表面的扩增引物；以及

固定在所述两个表面中的所述至少一个表面上的靶捕获珠粒，每个靶捕获珠粒包括：

固体载体；和

附接至所述固体载体的捕获探针，所述捕获探针中的每个捕获探针包括与基因组脱氧核糖核酸的靶向区域或者互补脱氧核糖核酸的靶向区域互补的单链核酸序列。

17.根据权利要求16所述的流通池，其中所述捕获探针通过结合对附接至所述固体载体。

18.根据权利要求16或17所述的流通池，其中所述两个表面中的每个表面包括由间隙区域隔开的凹入部，并且其中所述扩增引物和所述靶捕获珠粒定位在所述凹入部中的每个凹入部内。

19.一种方法，包括：

将靶捕获珠粒引入到富集通道中，所述富集通道包括至少一个含有扩增引物和富集捕获位点的表面，由此所述靶捕获珠粒中的至少一些变得固定在所述富集捕获位点处，所述靶捕获珠粒中的每个靶捕获珠粒包括：

固体载体；以及

附接至所述固体载体的捕获探针，所述捕获探针中的每个捕获探针包括与基因组脱氧核糖核酸的靶向区域或者互补脱氧核糖核酸的靶向区域互补的单链核酸序列。

20.根据权利要求19所述的方法，其中在引入所述靶捕获珠粒之前，所述方法还包括通过以下方式制备所述靶捕获珠粒：

合成具有附接至每个捕获探针的末端的结合对的第一成员的所述捕获探针；以及

将所述捕获探针与所述固体载体一起温育，其中所述固体载体涂覆有所述结合对的第二成员。

21.根据权利要求20所述的方法，还包括通过调节用于温育的混合物中的所述捕获探针的浓度来控制所述靶捕获珠粒的捕获探针密度。

22.根据权利要求19至21中的一项所述的方法，还包括：

由所述基因组脱氧核糖核酸或所述互补脱氧核糖核酸制备文库片段；

将所述文库片段引入所述富集通道；以及

在预定温度下温育所述富集通道，由此包括所述靶向区域的所述文库片段中的至少一些与所述捕获探针杂交。

23.根据权利要求22所述的方法，还包括在将所述文库片段引入到所述富集通道之前，用封阻寡核苷酸封阻所述文库片段的末端。

24.根据权利要求22或23所述的方法，还包括将拥挤试剂与所述文库片段一起引入。

25.根据权利要求22或23所述的方法，还包括在所述温育期间施加电场。

26.根据权利要求22或23所述的方法，还包括在所述温育期间引起含有所述文库片段的流体的移动。

27.根据权利要求22或23所述的方法，还包括使用电泳来预浓缩所述富集通道中的所述文库片段。

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