KR20220131819A - 키트, 시스템 및 유동 셀 - Google Patents

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KR20220131819A
KR20220131819A KR1020217042260A KR20217042260A KR20220131819A KR 20220131819 A KR20220131819 A KR 20220131819A KR 1020217042260 A KR1020217042260 A KR 1020217042260A KR 20217042260 A KR20217042260 A KR 20217042260A KR 20220131819 A KR20220131819 A KR 20220131819A
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capture probe
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KR1020217042260A
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타일러 첸
팔라비 다구마티
타룬 쿠마르 쿠라나
이르-슈안 우
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일루미나, 인코포레이티드
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Abstract

키트의 예는 라이브러리 제조 유체, 샘플 유체 및 농축 유체를 포함한다. 라이브러리 제조 유체는 라이브러리 제조 비드를 포함하며, 각 라이브러리 제조 비드에는 제1 고체 지지체, 및 제1 고체 지지체에 부착된 트랜스포솜을 포함한다. 유체는 게놈 데옥시리보핵산 서열을 포함한다. 농축 유체는 표적 포획 비드를 포함하고, 각각의 표적 포획 비드는 제2 고체 지지체 및 제2 고체 지지체에 부착된 포획 프로브를 포함한다. 각각의 포획 프로브는 샘플 유체에서 게놈 데옥시리보핵산의 표적화 영역에 상보적인 단일 가닥 데옥시리보핵산 서열을 포함한다.

Description

키트, 시스템 및 유동 셀
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 1월 27일자로 출원된 미국 가출원 일련 제62/966,351호의 이익을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
유동 셀은 유전자 서열분석, 유전자형분석 등과 같은 다양한 방법 및 응용에서 사용된다. 일부 방법 및 응용에서, 이중 가닥 DNA(dsDNA) 표적 분자로부터 단편화되고 태깅된 데옥시리보핵산(DNA) 분자의 라이브러리를 생성하는 것이 바람직한다. 종종, 목적은 DNA 서열분석 반응에서 템플릿으로 사용하기 위해 더 큰 dsDNA 분자에서 더 작은 DNA 분자(예를 들어, DNA 단편)를 생성하는 것이다. 템플릿을 사용하면 짧은 판독치 길이를 얻을 수 있다. 데이터 분석 동안, 중첩 짧은 서열 판독치를 정렬하여 더 긴 핵산 서열을 재구성할 수 있다. 일부 경우에, 사전 서열분석 단계(예를 들어, 특정 핵산 분자의 바코딩)를 사용하여 데이터 분석을 단순화할 수 있다.
본 명세서에 개시된 제1 양태는 하기를 포함하는 키트이다: 라이브러리 제조 비드를 포함하는 라이브러리 제조 유체로서, 각각의 라이브러리 제조 비드는 제1 고체 지지체 및 제1 고체 지지체에 부착된 트랜스포솜을 포함하는 라이브러리 제조 유체; 게놈 데옥시리보핵산 서열을 포함하는 샘플 유체; 및 표적 포획 비드를 포함하는 농축(enrichment) 유체로서, 각각의 표적 포획 비드는 제2 고체 지지체 및 제2 고체 지지체에 부착된 포획 프로브를 포함하고, 각각의 포획 프로브는 샘플 유체에서 게놈 데옥시리보핵산의 표적화 영역에 상보적인 단일 가닥 데옥시리보핵산 서열을 포함하는 농축 유체.
본 명세서에 개시된 제2 양태는 하기를 포함하는 또 다른 키트이다: RNA에서 cDNA로의 전환 하위-키트; 및 표적 포획 비드를 포함하는 농축 유체로서, 각각의 표적 포획 비드는 고체 지지체 및 고체 지지체에 부착된 포획 프로브를 포함하고, 각각의 포획 프로브는 RNA에서 cDNA로의 전환 하위-키트를 사용하여 생성된 cDNA의 표적화 영역에 상보적인 단일 가닥 데옥시리보핵산 서열을 포함하는 농축 유체.
본 명세서에 개시된 제3 양태는 하기를 포함하는 시스템이다: 기판; 기판 상의 제1 영역에 마련된 제조 채널로서, 라이브러리 제조 비드를 고정하기 위한 제조 포획 부위를 포함하는 제조 채널; 제조 채널의 하류의 기판 상의 제2 영역에 마련된 농축 채널로서, 표적 포획 비드를 고정하기 위해 증폭 프라이머 및 농축 포획 부위를 포함하는 농축 채널; 및 제조 채널과 농축 채널을 선택적으로 그리고 유체적으로 연결하는 수송 채널.
본 명세서에 개시된 제4 양태는 하기를 포함하는 유동 셀이다: 2개의 표면 사이에 마련된 농축 채널로서, 2개의 표면 중 적어도 하나에 부착된 증폭 프라이머를 포함하는 농축 채널 및 2개의 표면 중 적어도 하나의 표면에 고정화된 표적 포획 비드를 포함하고, 각각의 표적 포획 비드는 고체 지지체 및 고체 지지체에 부착된 포획 프로브를 포함하고, 각각의 포획 프로브는 게놈 데옥시리보핵산 또는 상보성 데옥시리보핵산의 표적화 영역에 상보적인 단일 가닥 핵산 서열을 포함하는 농축 채널.
본 명세서에 개시된 제5 양태는 증폭 프라이머 및 농축 포획 부위를 함유하는 적어도 하나의 표면을 포함하는 농축 채널 내로 표적 포획 비드를 도입함으로써, 표적 포획 비드의 적어도 일부는 농축 포획 부위에서 고정화되는 것을 포함하는 방법이고, 각각의 표적 포획 비드는 고체 지지체 및 고체 지지체에 부착된 포획 프로브를 포함하고, 각각의 포획 프로브는 게놈 데옥시리보핵산 또는 상보성 데옥시리보핵산의 표적화 영역에 상보적인 단일 가닥 핵산 서열을 포함한다.
양태들 중 어느 하나의 임의의 특징은 임의의 바람직한 방식으로 함께 결합될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 제1 양태 및/또는 제2 양태 및/또는 제3 양태 및/또는 제4 양태 및/또는 제5 양태의 특징들의 임의의 조합은 예를 들어 유동 셀 농축을 포함하는 본 개시내용에 기재된 바와 같은 이점을 달성하기 위해 본 명세서에 개시된 임의의 예와 조합될 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명의 실시예의 특징들은 다음의 상세한 설명 및 도면을 참조하여 명백해질 것이며, 동일한 참조 번호는 동일하지만 동일하지는 않은 유사한 구성요소에 상응한다. 간략함을 위해, 이전에 설명된 기능을 갖는 참조 번호들 또는 특징들은 그들이 나타나는 다른 도면과 관련하여 설명될 수 있거나 설명되지 않을 수 있다.
도 1a는 유동 셀의 예의 평면도이다.
도 1b는 도 1a의 1b-1b 선을 따라 취한, 농축 채널 및 비-패턴화된 서열분석(sequencing) 표면의 예에 대한 확장 단면도이다.
도 1c는 도 1a의 1c-1c 선을 따라 취한, 농축 채널 및 패턴화된 서열분석 표면의 예에 대한 확장 단면도이다.
도 2는 예시적인 라이브러리 제조 방법을 예시하는 개략적인 흐름도이다.
도 3a는 다른 예시적인 라이브러리 제조 방법을 예시하는 개략적인 흐름도이다.
도 3b는 명료함을 위해 다시 그린 도 3a의 방법으로부터 생성된 브릿지의 개략도이다.
도 4는 온보드 라이브러리 제조 챔버를 갖는 유동 셀의 예를 포함하는 예시적인 시스템의 개략도이다.
도 5는 본 명세서에 개시된 농축 방법의 예를 도시하는 개략도이다.
도 6은 비교 농축 방법이 사용될 때 및 예시적인 농축 방법이 사용될 때 유동 셀 표면 상의 표적 라이브러리 단편의 상대적 적용범위 플롯을 도시하는 그래프이고; 그리고
도 7은 상이한 프로브 밀도를 갖는 표적 포획 비드에 대한 표적 클러스터 수를 도시하는 막대 그래프이다.
일부 서열분석 기술은 DNA 라이브러리 단편을 포획 및 증폭하기 위해 유동 셀 표면의 포획 프라이머를 이용한다. 유동 셀 구조 및 증폭 프로세스를 이용하여 유동 셀의 서로 상이한 영역에서 각 DNA 라이브러리 단편의 앰플리콘의 개별 단일클론 집단을 생성할 수 있다. 이것은, 각각의 단일클론 집단이 각각의 DNA 라이브러리 단편에 대한 많은 데이터를 제공할 수 있기 때문에 (DNA 라이브러리 단편이 생성되는) DNA 샘플의 전체 또는 많은 부분을 분석할 때 바람직할 수 있다.
일부 경우에, DNA 샘플의 표적 부분, 예를 들어, 전체 샘플과 대조적으로 주어진 샘플의 특정 유전적 변이체를 분석하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 유형의 분석의 경우, 표적 부분 또는 관심 영역이 농축될 수 있으며, 이는 예를 들어 DNA 샘플의 나머지에서 표적 부분을 분리하는 데 도움이 된다. 이를 통해 서열분석 판독을 표적 부분에 전용할 수 있다. 본 명세서에 개시된 농축 기술은 표적 부분에 상응하는 라이브러리 단편의 온-플로우 셀 혼성화 및 포획을 이용한다.
정의
본 명세서에서 사용된 용어는 달리 명시되지 않는 한 관련 기술 분야에서 통상적인 의미를 취하는 것으로 이해될 것이다. 본원에 사용된 여러 용어 및 그의 의미는 하기에 제시된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한 단수 및 복수 둘 다를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "포함하는(comprising)"은 "비롯한(including)", "함유하는(containing)" 또는 "특징으로 하는(characterized by)"과 동의어이며, 포괄적이거나 제한이 없으며, 추가의 언급되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다.
명세서 전체에 걸쳐 "하나의 예", "다른 예" 및 "예" 등에 대한 언급은 예와 관련하여 설명된 특정 요소(예를 들어, 특징, 구조, 조성, 구성 및/또는 특성)가 본 명세서에 설명된 적어도 하나의 예에 포함되고, 다른 예에 존재하거나 존재하지 않을 수 있음을 의미한다. 또한, 문맥상 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 임의의 예에 대해 설명된 요소가 다양한 예에서 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있음을 이해해야 한다.
청구범위를 포함하여 본 개시내용 전체에 걸쳐 사용된 "실질적으로" 및 "약"이라는 용어는 처리의 변동으로 인한 것과 같은 작은 변동을 설명하고 설명하는 데 사용된다. 예를 들어, 이러한 용어는 명시된 값에서 ±10% 이하, 예를 들어 명시된 값에서 ±5% 이하, 예를 들어 명시된 값에서 ±2% 이하, 예를 들어 명시된 값에서 ±1% 이하, 예를 들어 명시된 값에서 ±0.5% 이하, 예를 들어 명시된 값에서 ±0.2% 이하 또는 명시된 값에서 ±0.1% 이하, 예를 들어 명시된 값에서 ±0.05% 이하를 지칭한다.
어댑터. 예를 들어 결찰 또는 태그부착에 의해 핵산 분자에 융합될 수 있는 선형 올리고뉴클레오타이드 서열. 어댑터는 의도된 목적을 위한 서열을 나타내는 태그일 수 있다. 일부 예에서, 어댑터는 프라이머, 예를 들어 범용 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, P5 또는 P7 서열)을 포함하는 프라이머의 적어도 일부에 상보적인 서열을 나타낼 수 있다. 하나의 구체적인 예로서, 트랜스포솜 복합체는 트랜스포손 말단 서열을 포함하는 3' 부분을 갖는 폴리뉴클레오타이드, 및 클러스터 증폭 반응을 위한 프라이머와의 혼성화에 적합한 하나 이상의 영역을 포함하는 어댑터를 포함할 수 있다. 또 다른 구체적인 예로서, 단편의 한 말단에 있는 어댑터는 제1 유동 셀 프라이머의 적어도 일부에 상보적인 서열을 포함하고, 단편의 다른 말단에 있는 어댑터는 제2 유동 셀 프라이머의 적어도 일부와 동일한 서열을 포함한다. 상보적 어댑터는 제1 유동 셀 프라이머에 혼성화할 수 있으며, 동일한 어댑터는 클러스터링 동안 제2 유동 셀 프라이머에 혼성화할 수 있는 상보적 카피에 대한 템플릿이다. 다른 예에서, 어댑터는 서열분석 프라이머 서열 또는 서열분석 결합 부위(예를 들어, 서열분석 반응을 위한 프라이머와의 혼성화에 적합한 하나 이상의 영역)를 포함할 수 있다. 상이한 어댑터의 조합은 DNA 단편과 같은 핵산 분자에 통합될 수 있다. 적합한 어댑터 길이는 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드, 또는 약 12 뉴클레오타이드 내지 약 60개의 뉴클레오타이드, 또는 약 15개의 뉴클레오타이드 내지 약 50개의 뉴클레오타이드의 범위일 수 있다. 어댑터는 뉴클레오타이드 및/또는 핵산의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
포획 프로브: 게놈 데옥시리보핵산 또는 리보핵산 샘플에서 유래된 상보적 데옥시리보핵산의 표적화 영역에 상보적인 단일 가닥 데옥시리보핵산 서열.
포획 부위: 특정 물질 (예를 들어, 표적 포획 비드, 복합체, 단백질 바이오마커, 등)의 국소화를 허용하는 화학적 특성으로 변형된 유동 셀 표면의 일부. 예에서, 포획 부위는 특정 분자에 부착, 보유 또는 결합할 수 있는 화학적 포획제(즉, 물질, 분자 또는 모이어티)를 포함할 수 있다. 한 예시적인 화학적 포획제는 특정 물질 (또는 특정 물질에 부착된 연결 모이어티)에 결합할 수 있는 수용체-리간드 결합 쌍 (예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘, 바이오틴, 렉틴, 탄수화물, 핵산 결합 단백질, 에피토프, 항체 등)의 구성원을 포함한다. 화학적 포획제의 또 다른 예는 특정 물질과 정전기 상호작용, 수소 결합 또는 공유 결합(예를 들어, 티올-이황화물 교환, 클릭 화학, 딜스-알더(Diels-Alder) 등)을 형성할 수 있는 화학 시약이다. 표적 포획 비드를 부착하도록 설계된 포획 부위는 본원에서 " 농축 포획 부위"로 지칭된다. 라이브러리 제조를 위한 고체 지지체를 부착하도록 설계된 포획 부위는 여기에서 "제조 포획 부위"라고 한다.
증착: 수동 또는 자동화될 수 있는 임의의 적절한 적용 기술 및 일부 경우에 표면 특성의 수정을 초래한다. 일반적으로, 증착은 기상 증착 기술, 코팅 기술, 그래프팅 기술 등을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 특정 예는 화학 기상 증착(CVD), 스프레이 코팅(예를 들어, 초음파 스프레이 코팅), 스핀 코팅, 덩크 또는 딥 코팅, 닥터 블레이드 코팅, 퍼들 디스펜싱, 플로우 스루 코팅, 에어로졸 프린팅, 스크린 프린팅, 미세 접촉 프린팅, 잉크젯 프린팅 등을 포함한다.
함몰부: 기판 또는 패턴화된 수지의 간극 영역(들)에 의해 적어도 부분적으로 둘러싸인 표면 개구를 갖는 기판 또는 패턴화된 수지의 별개의 오목 형상. 함몰부는 예를 들어 원형, 타원형, 정사각형, 다각형, 별 모양(정점 수에 관계 없음) 등을 포함하여 표면의 개구부에서 다양한 모양을 가질 수 있다. 표면과 직각으로 취한 함몰부의 단면은 곡선, 정사각형, 다각형, 쌍곡선, 원추형, 각진 등이 될 수 있다. 예를 들어, 함몰부는 웰 또는 두 개의 상호 연결된 웰일 수 있다. 함몰부는 능선, 계단 형상 등과 같은 더 복잡한 구조를 가질 수도 있다.
각각: 품목의 집합과 관련하여 사용될 때, 각각은 집합 내의 개별 품목을 식별하지만, 반드시 집합 내의 모든 품목을 지칭하는 것은 아니다. 명시적 공개 또는 컨텍스트가 달리 명시하는 경우 예외가 발생할 수 있다.
농축 채널: 2개의 결합되거나 부착된 구성요소 사이에 마련된 영역으로, 내부에 고정화된 표적 포획 비드를 포함하거나 표적 포획 비드를 수용 및 고정할 수 있다. 일부 예에서, 농축 채널은 2개의 패턴화되거나 비-패턴화된 서열분석 표면 사이에 마련될 수 있으며, 따라서 서열분석 표면의 하나 이상의 구성요소와 유체 연통할 수 있다.
유동 셀: 반응이 수행될 수 있는 챔버(예를 들어, 이는 농축 채널을 포함할 수 있음), 시약(들)을 챔버로 전달하기 위한 유입구 및 챔버로부터 시약(들)을 제거하기 위한 배출구를 갖는 용기. 일부 예에서, 챔버는 챔버에서 발생하는 반응의 검출을 가능하게 한다. 예를 들어, 챔버는 어레이, 광학적으로 표지된 분자 등의 광학적 검출을 허용하는 하나 이상의 투명 표면을 포함할 수 있다.
단편: 유전 물질(예를 들어, DNA, RNA 등)의 부분 또는 조각.
핵산 분자 또는 샘플: 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체성 형태로, 리보뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 이의 유사체 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 상기 용어는 단일 가닥 또는 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드를 지칭할 수 있다.
"템플릿" 핵산 분자(또는 가닥)는 분석될 서열을 나타낼 수 있다.
핵산 샘플의 뉴클레오타이드는 자연 발생 핵산 및 이의 기능적 유사체를 포함할 수 있다. 기능적 유사체의 예는 서열 특이적 방식으로 핵산에 혼성화할 수 있거나 특정 뉴클레오타이드 서열의 복제를 위한 템플릿으로 사용될 수 있다. 자연 발생 뉴클레오타이드는 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 포함하는 골격을 가지고 있다. 유사체 구조는 당업계에 공지된 임의의 다양한 것을 포함하는 대안적인 골격 연결을 가질 수 있다. 자연 발생 뉴클레오타이드는 일반적으로 데옥시리보스 당(예를 들어, DNA에서 발견됨) 또는 리보스 당(예를 들어, RNA에서 발견됨)을 가지고 있다. 유사체 구조는 당업계에 공지된 임의의 다양한 것을 포함하는 대안적인 당 모이어티를 가질 수 있다. 뉴클레오타이드는 천연 또는 비천연 염기를 포함할 수 있다. 천연 DNA는 아데닌, 티민, 시토신 및/또는 구아닌 중 하나 이상을 포함할 수 있고, 천연 RNA는 아데닌, 우라실, 시토신 및/또는 구아닌 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 잠금 핵산(LNA) 및 가교 핵산(BNA)과 같은 임의의 비천연 염기가 사용될 수 있다.
프라이머. 특정 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 분자. 한 예로서, 증폭 프라이머는 라이브러리 단편에 부착된 어댑터에 혼성화할 수 있으며, 템플릿 증폭 및 클러스터 생성을 위한 시작점으로 작용할 수 있다. 또 다른 예로서, 합성된 핵산(템플릿) 가닥은 합성된 핵산 가닥에 상보적인 새로운 가닥의 합성을 프라이밍하기 위해 프라이머(예를 들어, 서열분석 프라이머)가 혼성화할 수 있는 부위를 포함할 수 있다. 임의의 프라이머는 뉴클레오타이드 또는 그의 유사체의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 프라이머는 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드이다. 프라이머 길이는 임의의 수의 염기 길이일 수 있으며 다양한 비천연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 예에서, 서열분석 프라이머는 10 내지 60개 염기, 또는 20 내지 40개 염기 범위의 짧은 가닥이다.
서열분석 준비된 핵산 단편: 3' 및 5' 말단에 어댑터를 갖는 유전 물질의 일부. 서열분석 준비된 핵산 단편에서, 각 어댑터는 공지된 범용 서열(예를 들어, 유동 셀 상의 프라이머의 적어도 일부에 상보적이거나 동일함) 및 서열분석 프라이머 서열을 포함한다. 두 어댑터는 또한 인덱스(바코드 또는 태그) 서열을 포함한다. 예에서, 한 쪽(예를 들어, P5' 또는 P5 서열 포함)은 견고한 지지 인덱스를 포함할 수 있고 다른 쪽(P7 또는 P7' 서열 포함)은 샘플 인덱스를 포함할 수 있다.
서열분석 표면: 하나 이상의 유형의 증폭 프라이머가 그래프팅된 중합체성 하이드로겔. 서열분석 표면은 또한 표적 포획 비드를 고정시키기 위한 농축 포획제를 포함할 수 있다.
고체 지지체: 예를 들어, 구형, 타원형, 미소구체 또는 규칙적 또는 불규칙적 치수를 갖는 다른 인식된 입자 형상으로 특성화된 형상을 갖는 단단한 또는 세미-경질 물질로 만들어진 작은 본체. 고체 지지체의 일부 예는 라이브러리 단편이 부착될 수 있다. 고체 지지체의 다른 예는 포획 프로브가 부착될 수 있다.
표적 포획 비드: 포획 프로브가 부착된 고체 지지체.
표적 라이브러리 단편: i) 게놈 데옥시리보핵산 서열 또는 ii) 리보핵산 샘플에서 유래된 상보적 데옥시리보핵산의 단일 가닥 부분. 표적 라이브러리 단편의 서열은 표적 포획 비드의 포획 프로브와 상보적이다. 표적 라이브러리 단편의 서열은 관심 영역, 예를 들어 엑솜 또는 종양 관련 유전자와 같은 특정 게놈 패널일 수 있다.
전달된 가닥: 두 트랜스포손 말단의 전달된 부분. 유사하게, "전달되지 않은 가닥"이라는 용어는 2개의 트랜스포손 말단의 비-전달 부분을 지칭한다. 전달된 가닥의 3'-말단은 시험관 내 전위 반응에서 표적 DNA에 결합되거나 전달된다. 전달된 트랜스포손 말단 서열에 상보적인 트랜스포손 말단 서열을 나타내는 비-전달 가닥은 시험관내 전위 반응에서 표적 DNA에 연결되거나 전달되지 않는다.
일부 예에서, 전달된 가닥 및 비-전달 가닥은 공유적으로 연결된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 전달된 가닥 및 비-전달 가닥 서열은 단일 올리고뉴클레오타이드 상에, 예를 들어 헤어핀 배열로 제공된다. 이와 같이, 비-전달 가닥의 자유 말단이 전위 반응에 의해 직접적으로 샘플 DNA에 결합되지는 않지만, 비-전달 가닥은 헤어핀 구조의 루프에 의해 전달된 가닥에 연결되기 때문에, 비-전달된 가닥은 DNA 단편에 간접적으로 부착된다.
트랜스포손 말단: 시험관내 전위 반응에서 기능하는 트랜스포사제 또는 인테그라제 효소와 복합체를 형성하는 데 필요한 뉴클레오타이드 서열("트랜스포손 말단 서열")만을 나타내는 이중 가닥 핵산 DNA. 일부 예에서, 트랜스포손 말단은 전위 반응에서 트랜스포사제와 기능적 복합체를 형성할 수 있다. 예로서, 트랜스포손 말단은 19-염기쌍(bp) 외부 말단("OE") 트랜스포손 말단, 내부 말단("IE") 트랜스포손 말단, 또는 야생형 또는 돌연변이체 Tn5 트랜스포사제에 의해 인식된 "모자이크 말단"("ME") 트랜스포손 말단을 포함한다. 트랜스포손 말단은 시험관내 전위 반응에서 트랜스포사제 또는 인테그라제 효소와 기능적 복합체를 형성하기에 적합한 임의의 핵산 또는 핵산 유사체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 트랜스포손 말단은 DNA, RNA, 변형된 염기, 비-천연 염기, 변형된 골격을 포함할 수 있고, 하나 또는 2개의 가닥 모두에 닉(nick)을 포함할 수 있다. 용어 "DNA"가 트랜스포손 말단의 조성과 관련하여 본 개시내용 전체에 걸쳐 사용될 수 있지만, 임의의 적합한 핵산 또는 핵산 유사체가 트랜스포손 말단에서 이용될 수 있음을 이해해야 한다.
트랜스포사제: 트랜스포손 말단 함유 조성물(예를 들어, 트랜스포손, 트란스포손 말단, 트랜스포손 말단 조성물)과 함께 기능성 복합체를 형성할 수 있고, 예를 들어 시험관내 전위 반응에서 인큐베이션되는 이중 가닥 표적 DNA 내로의 트랜스포즌 말단-포함 조성물의 삽입 또는 전위를 촉매할 수 있는 효소. 본 명세서에 제공된 트랜스포사제는 또한 레트로트랜스포손 및 레트로바이러스로부터의 인테그라제를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 많은 예가 Tn5 트랜스포사제 및/또는 과활성 Tn5 트랜스포사제를 지칭하지만, 의도된 목적을 위해 표적 DNA를 5'-태깅하고 단편화하기에 충분한 효율로 트랜스포손 말단을 삽입할 수 있는 임의의 전위 시스템이 사용될 수 있음이 인정될 것이다. 특정 예에서, 바람직한 전위 시스템은 트랜스포손 말단을 랜덤으로 또는 거의 랜덤 방식으로 5'-태그에 삽입하고 표적 DNA를 단편화할 수 있다.
트랜스포솜 복합체: 이중 가닥 핵산에 비공유 결합된 트랜스포사제 효소. 예를 들어, 트랜스포솜 복합체는 비공유 복합체 형성을 지원하는 조건 하에 이중 가닥 트랜스포손 DNA와 함께 사전 인큐베이션된 트랜스포사제 효소일 수 있다. 이중 가닥 트랜스포손 DNA는 예를 들어 Tn5 DNA, Tn5 DNA의 일부, 트랜스포손 말단 조성물, 트랜스포손 말단 조성물의 혼합물 또는 과활성 Tn5 트랜스포사제와 같은 전이효소와 상호작용할 수 있는 다른 이중 가닥 DNA를 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 예에서, 표적 포획 비드는 서열분석 표면(들)도 포함하는 유동 셀의 농축 채널에서 사용된다. 표적 포획 비드는 관심 라이브러리 단편을 선택적으로 포획할 수 있는 포획 프로브를 포함한다. 따라서 대상 포획 비드를 사용하면 유동 셀 내에서 맞춤형 농축을 수행할 수 있다.
표적 포획 비드
표적 포획 비드는 도 1b 및 도 1c에 참조 번호(36)으로 도시되어 있다. 표적 포획 비드(36)는 고체 지지체(38) 및 고체 지지체에 부착된 포획 프로브(40)를 포함한다.
고체 지지체(38)는 비제한적으로, 유리(예를 들어, 제어된 기공 유리 비드); 자기적 반응성 물질; 플라스틱, 예컨대 아크릴, 폴리스티렌 또는 스티렌 및 기타 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄 또는 폴리테트라플루오로에틸렌(Chemours Co의 TEFLON®); 다당류 또는 가교결합된 다당류 예컨대 아가로스 또는 SEPHAROSE® 비드(Cytivia로부터 입수 가능한 가교 비드 형태의 아가로스); 나일론; 니트로셀룰로스; 수지; 실리콘 및 변성 실리콘을 포함하는 실리카 또는 실리카계 물질; 탄소-섬유; 금속; 무기 유리; 광섬유 다발; 또는 다양한 다른 중합체일 수 있다.
"자기 반응성" 물질은 자기장에 반응한다. 자기 반응성 고체 지지체의 예는 자기 반응성 물질을 포함하거나 이것으로 구성된다. 자기 반응성 물질의 예로는 상자성체, 강자성 물질, 페리자성 물질, 및 메타자성 물질을 포함한다. 적합한 상자성 물질의 예는 철, 니켈 및 코발트뿐만 아니라 Fe304, BaFe120i9, CoO, NiO, Mn203, Cr203 및 CoMnP와 같은 금속 산화물을 포함한다. 상업적으로 이용 가능한 한 가지 예는 ThermoFisher Scientific의 DYNABEADSTM M-280 스트렙타비딘(스트렙타비딘으로 코팅된 초상자성 비드)을 포함한다. 일부 예에서, 자기 반응성 물질은 폴리머 비드의 쉘에 내장된다. 다른 예에서, 자기 반응성 물질은 비드 형태이고 산화규소 또는 아질산규소와 같은 부동화 물질로 코팅된다.
고체 지지체(38)의 임의의 예는 고체 비드, 다공성 비드 또는 중공 비드의 형태를 가질 수 있다.
일부 예에서, 고체 지지체(38)는 결합 쌍의 한 구성원으로 기능화될 수 있다. "결합 쌍"은 서로 부착할 수 있는 두 가지 제제(예를 들어, 물질, 분자, 모이어티)를 의미한다. 이 예에서, 고체 지지체(38) 상의 구성원은 유동 셀(10)의 서열분석 표면(도 1b의 12, 12' 및 도 1c의 14, 14' 참조)에 위치한 다른 구성원과의 결합 쌍이다(도 1a). 일부 예에서, 고체 지지체(38) 상의 구성원은 i) 포획 프로브(40)에 부착된 구성원에 결합할 수 있고, ii) 유동 셀(10)의 서열분석 표면(12, 12' 또는 14, 14') 상의 농축 포획 부위(도 1b 및 도 1c의 32, 32' 참조)에 결합할 수 있다는 점에서 다기능일 수 있다. 다른 예에서, 고체 지지체(38)는 2개의 상이한 결합 쌍 구성원, 예를 들어, i) 포획 프로브(40)에 부착된 구성원에 결합할 수 있는 하나의 구성원, 및 ii) 유동 셀(10)의 12, 12' 또는 14, 14' 상의 농축 포획 부위(32, 32')에 결합할수 있는 또 다른 구성원으로 기능화될 수 있다.
고체 지지체(38)의 기능화는 고체 지지체(38)를 결합 쌍 구성원으로 코팅하거나, 결합 쌍 구성원과 고체 지지체(38)의 표면에서 작용기 사이에 결합을 형성하는 것을 포함할 수 있다. 결합 쌍 구성원의 한 예는 유동 셀의 서열분석 표면에 있는 다른 결합 쌍 구성원에 결합할 수 있는 수용체-리간드 결합 쌍 (예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘, 바이오틴, 렉틴, 탄수화물, 핵산 결합 단백질, 에피토프, 항체 등)의 구성원을 포함한다. 결합 쌍 구성원은 또한 정전기 상호작용, 수소 결합 또는 공유 결합(예를 들어, 티올-디설파이드 교환, 클릭 화학, 딜스-알더 등)을 형성할 수 있는 화학 시약일 수 있다.
다른 예에서, 고체 지지체(38)는 결합 쌍의 구성원을 포함하지 않지만, 고체 지지체(38)는 농축 포획 부위(32, 32')에 화학적으로 접합될 수 있다. 고체 지지체(38)를 농축 포획 부위(32, 32')에 부착하기 위해 임의의 형태의 화학적 결합이 사용될 수 있다.
많은 경우에, 표적 포획 비드(36)가 서열분석 전에 제거될 수 있도록 고체 지지체(38)와 농축 포획 부위(32, 32') 사이에 가역적이거나 절단 가능한 상호작용이 바람직하다.
표적 포획 비드(36)는 또한 고체 지지체(38)에 부착된 포획 프로브(40)를 포함한다. 고체 지지체(38) 상의 각각의 포획 프로브(40)는 동일한 단일 가닥 데옥시리보핵산 서열을 포함한다. 이 서열은, 각각의 포획 프로브(40)가 관심 서열(예를 들어, 분석될)을 포함하는 표적 라이브러리 단편에 선택적으로 혼성화되도록 선택된다. 일부 예에서, 포획 프로브 서열은 게놈 데옥시리보핵산의 표적화 영역에 상보적이다. 다른 예에서, 포획 프로브 서열은 리보핵산 샘플의 표적화 영역으로부터 유래된 상보적 데옥시리보핵산(cDNA)에 상보적이다.
포획 프로브(40) 내의 뉴클레오타이드 수는 표적 라이브러리 단편의 뉴클레오타이드 수에 따라 달라질 수 있다. 일부 예에서, 포획 프로브(40)는 표적 라이브러리 단편보다 작다. 포획 프로브(40)는 약 50개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일례에서, 포획 프로브(40)는 약 80개의 뉴클레오타이드 내지 약 120개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 다른 예에서, 포획 프로브(40)는 69개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
포획 프로브(40)는 임의의 올리고뉴클레오타이드 합성 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
포획 프로브(40)의 하나의 말단은 고체 지지체(38)에 부착된 구성원에 결합될 수 있도록 결합 쌍의 다른 구성원에 결합될 수 있다. 예를 들어, 포획 프로브(40)는 고체 지지체(38)의 표면에서 스트렙타비딘과 결합하도록 바이오틴화될 수 있다.
포획 프로브(40)는 포획 프로브(40)를 함유하는 혼합물에서 고체 지지체(38)를 인큐베이션함으로써 고체 지지체(38)에 부착될 수 있다. 포획 프로브(40)는 염 완충액에 혼합될 수 있다. 포획 프로브(40)와 고체 지지체(38) 사이의 반응을 촉진하거나 가능하게 하는 임의의 적합한 염 완충액이 사용될 수 있다. 일례에서, 염 완충액은 바이오틴-스트렙타비딘 반응을 촉진하여 바이오티닐화된 포획 프로브(40)가 고체 지지체(38) 상의 스트렙타비딘에 결합하도록 할 수 있다. 예로서, 염 완충액은 염화나트륨, 시트르산나트륨, 또는 이들의 조합을 포함하는 수용액이다. 하나의 특정 예에서, 염 완충액은 물 중 약 0.75 M의 염화나트륨 및 약 75 mM의 시트르산나트륨을 포함한다. 혼합물 내의 포획 프로브(40)의 수는 혼합물에 첨가될 고체 지지체(38)의 수 및 표적 포획 비드(36)에 대한 원하는 프로브 밀도에 의존할 수 있다. 예에서, 표적 포획 비드(36)의 원하는 프로브 밀도는 고체 지지체당 약 2*105 포획 프로브 내지 고체 지지체당 약 5*106 포획 프로브 범위이다. 표적 포획 비드(36)의 포획 프로브 밀도는 인큐베이션에 사용되는 혼합물에서 포획 프로브의 농도를 조정함으로써 제어될 수 있다.
표적 포획 비드(36)를 형성하기 위한 하나의 예시적인 방법은 각각의 포획 프로브(40)의 말단에 부착된 결합 쌍의 제1 구성원으로 포획 프로브(40)를 합성하는 단계; 및 포획 프로브(40)를 고체 지지체(38)와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하며, 고체 지지체(38)는 결합 쌍의 제2 구성원으로 코팅된다.
유동 셀
표적 포획 비드(36)는 패턴화된 서열분석 표면(14, 14') 또는 비패턴화된 서열분석 표면(12, 12')을 갖는 유동 셀(10)에서 사용될 수 있다. 표적 포획 비드(36)가 본원에 기재된 고체 지지체(38) 및 포획 프로브(40)의 임의의 예를 포함할 수 있음을 이해해야 한다.
유동 셀(10)의 예의 평면도가 도 1a에 도시되어 있다. 도 1b 및 도 1c를 참조하여 논의되는 바와 같이, 유동 셀(10)의 일부 예는 2개의 서열분석 대향 서열분석 표면을 포함한다. 비-패턴화된 서열분석 표면(12, 12')의 예가 도 1b에 도시되어 있고, 패턴화된 서열분석 표면(14, 14')의 예가 도 1c에 도시되어 있다. 각각의 서열분석 표면(12, 12' 또는 14, 14')은 기판(도 1a에서 16으로 일반적으로 도시됨)에 의해 지지되고, 농축 채널(도 1a에서 18로 일반적으로 도시됨)은 서열분석 표면(12, 12' 또는 14, 14') 사이에 마련된다. 다른 예에서, 유동 셀(10)은 기판(16)에 의해 지지되는 하나의 서열분석 표면 및 기판(16)에 부착된 뚜껑을 포함한다. 이들 예에서, 농축 채널(18)은 서열분석 표면(12 또는 14)과 뚜껑 사이에 마련된다.
임의의 예에서, 기판(16)은 단일 층/재료일 수 있다. 단일 층 기판의 예는 도 1b에서 참조 번호 16A 및 16A'로 도시되어 있다. 적합한 단일 층 기판(16A, 16A')의 예는 에폭시 실록산, 유리, 개질 또는 기능화된 유리, 플라스틱(아크릴, 폴리스티렌 및 스티렌 및 기타 물질의 공중합체, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리부틸렌, 폴리우레탄, 폴리테트라플루오로에틸렌(예를 들어, Chemours의 TEFLON®), 환형 올레핀/환형-올레핀 중합체(COP)(Zeon의 ZEONOR® 등), 폴리이미드 등을 포함), 나일론(폴리아마이드), 세라믹/세라믹 옥사이드, 실리카, 융합 실리카, 또는 실리카-기반 물질, 알루미늄 실리케이트, 실리콘 및 변형된 실리콘(예를 들어, 붕소 도핑된 p+ 실리콘), 질화규소(Si3N4), 산화규소(Si02), 탄탈럼 펜톡시드(Ta205) 또는 다른 탄탈럼 옥사이드(들)(TaOx), 하프늄 옥사이드(Hf02), 탄소, 금속, 무기 유리, 등을 포함한다.
기판(16)은 또한 다층 구조일 수 있다. 다층 기판의 예는 도 1c에서 참조 번호 16B 및 16B'에 도시되어 있다. 다층 구조(16B, 16B')의 일부 예는 표면에 탄탈륨 산화물 또는 다른 세라믹 산화물의 코팅층이 있는 유리 또는 실리콘을 포함한다. 도 1c를 구체적으로 참조하면, 다층 구조(16B, 16B')의 다른 예는 그 위에 패턴화된 수지(22, 22')를 갖는 하부 지지체(20, 20')를 포함한다. 다층 기판(16B, 16B')의 다른 예는 SOI(실리콘-온-인슐레이터) 기판을 포함할 수 있다.
예에서, 기판(16)(단일 층 또는 다층)는 약 2㎜ 내지 약 300㎜ 범위의 직경, 또는 최대 약 10피트(~3 미터)의 최대 치수를 갖는 직사각형 시트 또는 패널을 가질 수 있다. 예에서, 기판(16)은 약 200㎜ 내지 약 300㎜ 범위의 직경을 갖는 웨이퍼이다. 다른 예에서, 기판(16)은 약 0.1㎜ 내지 약 10㎜ 범위의 폭을 갖는 다이이다. 예시적인 치수가 제공되었지만, 임의의 적절한 치수를 갖는 기판(16)이 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 다른 예에서, 300㎜ 원형 웨이퍼보다 더 큰 표면적을 갖는 직사각형 지지체인 패널이 사용될 수 있다.
도 1a, 도 1b 및/또는 도 1c에 도시된 예에서, 유동 셀(10)은 농축 채널(18)을 포함한다. 여러 농축 채널(18)이 도시되어 있지만, 임의의 수의 채널(18)이 유동 셀(10)에 포함될 수 있음(예를 들어, 단일 채널(18), 4개의 채널(18) 등)을 이해해야 한다. 본 명세서에 개시된 일부 예에서, 각각의 농축 채널(18)은 2개의 서열분석 표면(예를 들어, 12 및 12' 또는 14 및 14') 사이 및 2개의 부착된 기판(예를 들어, 16A 및 16A' 또는 16B 및 16B')에 의해 정의된 영역이다. 본 명세서에 개시된 다른 예에서, 각각의 농축 채널(18)은 하나의 서열분석 표면(예를 들어, 12 또는 14)과 뚜껑 사이에 마련된 영역이다. 본 명세서에 기재된 유체는 농축 채널(들)(18) 내로 도입 및 제거될 수 있다. 각 농축 채널(18)은 유동 셀(10)의 서로 농축 채널(18)로부터 격리되어, 임의의 특정 농축 채널(18) 내로 도입된 유체가 인접한 농축 채널(18)로 흐르지 않도록 할 수 있다.
농축 채널(18)의 일부는 기판(16)의 물질(들)에 부분적으로 의존하는 임의의 적절한 기술을 사용하여 기판(16)에 마련될 수 있다. 일례에서, 농축 채널(18)의 일부는 유리 기판(16) 내로 에칭된다. 다른 예에서, 농축 채널(18)의 일부는 포토리소그래피, 나노임프린트 리소그래피 등을 사용하여 다층 기판(16B, 16B')의 수지(22, 22')로 패턴화될 수 있다. 또 다른 예에서, 별도의 물질(예를 들어, 도 1b 및 도 1c의 물질(24))가 기판(16)에 도포되어, 별도의 물질이 농축 채널(18)의 벽의 적어도 일부를 정의할 수 있다.
예에서, 농축 채널(18)은 직선 구성을 갖는다. 농축 채널(18)의 길이 및 폭은 각각 기판(16)의 길이 및 폭보다 작아서, 농축 채널(18)을 둘러싸는 기판 표면의 일부가 다른 기판(16)에 부착될 수 있도록 한다. 일부 예에서, 각각의 농축 채널(18)의 폭은 적어도 약 1㎜, 적어도 약 2.5㎜, 적어도 약 5㎜, 적어도 약 7㎜, 적어도 약 10㎜, 또는 그 초과일 수 있다. 일부 예에서, 각 농축 채널(18)의 길이는 적어도 약 10㎜, 적어도 약 25㎜, 적어도 약 50㎜, 적어도 약 100㎜, 또는 그 초과일 수 있다. 각각의 농축 채널(18)의 폭 및/또는 길이는 위에 명시된 값보다 크거나 작거나 사이일 수 있다. 다른 예에서, 농축 채널(18)은 정사각형(예를 들어, 10㎜×10㎜)이다.
각각의 농축 채널(18)의 깊이는, 예를 들어 미세 접촉, 에어로졸 또는 잉크젯 프린팅이 유동 채널 벽을 정의하는 별도의 물질을 증착하는 데 사용되는 경우 몇 개의 단일 층 두께만큼 작을 수 있다. 다른 예에서, 각각의 농축 채널(18)의 깊이는 약 1㎛, 약 10㎛, 약 50㎛, 약 100㎛, 또는 그 초과일 수 있다. 예에서, 깊이는 약 10㎛ 내지 약 100㎛ 범위일 수 있다. 다른 예에서, 깊이는 약 5㎛ 이하이다. 각각의 농축 채널(18)의 깊이는 위에 명시된 값보다 크거나 작거나 사이일 수 있다는 것을 이해해야 한다. 농축 채널(18)의 깊이는 또한 예를 들어 패턴화된 서열분석 표면(14, 14')이 사용될 때 유동 셀(10)의 길이 및 폭을 따라 변할 수 있다.
도 1b는 비-패턴화된 대향 서열분석 표면(12, 12')을 포함하는 유동 셀(10)의 단면도를 도시한다. 예에서, 이들 표면(12, 12') 각각은 기판(16A, 16A') 상에 준비될 수 있고, 이어서 기판(16A, 16A')은 유동 셀(10)의 예를 형성하기 위해 서로 부착될 수 있다. 접착제, 결합을 돕는 방사선 흡수 물질 등과 같은 임의의 적절한 결합 물질(24)가 기판(16A, 16B)을 함께 결합하는 데 사용될 수 있다.
도 1b에 도시된 예에서, 농축 채널(18)의 일부는 단일 층 기판(16A, 16A') 각각에 마련된다. 예를 들어, 각각의 기판(16A, 16A')은 서열분석 표면(12, 12')의 구성요소가 도입될 수 있는 내부에 마련된 오목 영역(26, 26')을 가질 수 있다. 서열분석 표면(12, 12')의 구성요소에 의해 점유되지 않은 오목 영역(26, 26') 내의 임의의 공간이 농축 채널(18)의 일부로 간주될 수 있음을 이해해야 한다.
서열분석 표면(12, 12')은 중합체성 하이드로겔(28, 28'), 중합체성 하이드로겔(28, 28')에 부착된 증폭 프라이머(30, 30'), 및 농축 포획 부위(32, 32')를 포함한다.
중합체성 하이드로겔(28, 28')의 예는 아크릴아마이드 공중합체, 예컨대 폴리(N-(5-아지도아세트아미딜펜틸)아크릴아마이드-코-아크릴아마이드, PAZAM을 포함한다. PAZAM 및 일부 다른 형태의 아크릴아마이드 공중합체는 다음 구조(I)로 제시된다.
Figure pct00001
식 중,
RA는 아지도, 선택적으로 치환된 아미노, 선택적으로 치환된 알케닐, 선택적으로 치환된 알킨, 할로겐, 선택적으로 치환된 하이드라존, 선택적으로 치환된 하이드라진, 카복실, 하이드록시, 선택적으로 치환된 테트라졸, 선택적으로 치환된 테트라진, 니트릴 산화물, 니트론, 설페이트, 및 티올로 이루어진 군으로부터 선택되고;
RB는 H 또는 선택적으로 치환된 알킬이고;
RC, RD, 및 RE는 각각 독립적으로 H 및 선택적으로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
각각의 -(CH2)P-는 선택적으로 치환될 수 있고;
p는 1 내지 50 범위의 정수이고;
n은 1 내지 50,000 범위의 정수이고; 그리고
m은 1 내지 100,000 범위의 정수이다.
당업자는 구조 (I)에서 반복되는 "n" 및 "m" 특징의 배열이 대표적이며, 단량체 서브유닛은 중합체 구조 (예를 들어, 랜덤, 블록, 패턴화, 또는 그의 조합)에서 임의의 순서로 존재할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
PAZAM 및 다른 형태의 아크릴아마이드 공중합체의 분자량은 약 5 kDa 내지 약 1500 kDa 또는 약 10 kDa 내지 약 1000 kDa의 범위일 수 있거나 특정 예에서, 약 312 kDa일 수 있다.
일부 예에서, PAZAM 및 다른 형태의 아크릴아마이드 공중합체는 선형 중합체이다. 일부 다른 예에서, PAZAM 및 다른 형태의 아크릴아마이드 공중합체는 가볍게 가교결합된 중합체이다.
다른 예에서, 중합체성 하이드로겔(28, 28')은 구조(I)의 변형일 수 있다. 일례에서, 아크릴아마이드 단위는 N,N-다이메틸아크릴아마이드(
Figure pct00002
)로 대체된다. 이 예에서, 구조 (I) 내의 아크릴아마이드 단위는
Figure pct00003
로 대체될 수 있고, RD, RE, 및 RF는 각각 H 또는 C1-C6 알킬이고, RG 및 RH는 각각 C1-C6 알킬(아크릴아마이드의 경우와 같이 H 대신)이다. 이 예에서, q는 1 내지 100,000 범위의 정수일 수 있다. 다른 예에서, N,N-다이메틸아크릴아마이드는 아크릴아마이드 단위 이외에 사용될 수 있다. 이 예에서, 구조 (I)은 반복되는 "n" 및 "m" 특징 외에
Figure pct00004
을 포함할 수 있으며, RD, RE, 및 RF는 각각 H 또는 C1-C6 알킬이고 RG 및 RH는 각각 C1-C6 알킬이다. 이 예에서, q는 1 내지 100,000 범위의 정수일 수 있다.
또 다른 예로서, 중합체성 하이드로겔(28, 28')은 각각의 구조 (III) 및 (IV)의 반복 단위를 포함할 수 있다:
Figure pct00005
및
Figure pct00006
식 중, 각각의 R1a, R2a, R1b 및 R2b는 수소, 선택적으로 치환된 알킬 또는 선택적으로 치환된 페닐로부터 독립적으로 선택되고; 각각의 R3a 및 R3b는 수소, 선택적으로 치환된 알킬, 선택적으로 치환된 페닐, 또는 선택적으로 치환된 C7-C14 아르알킬로부터 독립적으로 선택되고; 각각의 L1 및 L2는 선택적으로 치환된 알킬렌 링커 또는 선택적으로 치환된 헤테로알킬렌 링커로부터 독립적으로 선택된다.
다른 분자가 올리고뉴클레오타이드 프라이머(30, 30')를 그라프트하도록 기능화되어 있는 한, 다른 분자를 사용하여 중합체성 하이드로겔(28, 28')을 형성할 수 있음을 이해해야 한다. 적합한 중합체 층의 다른 예는 콜로이드성 구조, 예컨대 아가로스를 갖는 것; 또는 중합체 메쉬 구조, 예컨대 젤라틴; 또는 가교결합된 중합체 구조, 예컨대 폴리아크릴아마이드 중합체 및 공중합체, 실란 유리 아크릴아마이드(SFA), 또는 아지돌화된 버전의 SFA를 포함한다. 적합한 폴리아크릴아마이드 중합체의 예는 아크릴아마이드 및 아크릴산 또는 비닐기를 함유하는 아크릴산으로부터, 또는 [2+2] 광 고리첨가 반응을 형성하는 단량체로부터 합성될 수 있다. 적합한 중합체성 하이드로겔(28, 28')의 또 다른 예는 아크릴아마이드와 아크릴레이트의 혼합 공중합체를 포함한다. 아크릴 단량체(예를 들어, 아크릴아마이드, 아크릴레이트 등)를 함유하는 다양한 중합체 구조, 예를 들어 성상 중합체, 별 모양의 또는 스타-블록 중합체, 덴드리머, 등을 포함하는 분지형 중합체가 본 명세서에 개시된 실시예에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 단량체(예를 들어, 아크릴아마이드 등)는 별 모양 중합체의 분지(암)에 무작위로 또는 블록으로 혼입될 수 있다.
중합체성 하이드로겔(28, 28')을 오목 영역(26, 26')에 도입하기 위해, 중합체성 하이드로겔(28, 28')의 혼합물이 생성된 다음, 각각의 기판(16A, 16A')(이는 그 내에 오목 영역(26, 26')을 가짐)에 적용될 수 있다. 일례에서, 중합체성 하이드로겔(28, 28')은 혼합물(예를 들어, 물 또는 에탄올 및 물과 함께)로 존재할 수 있다. 그 다음 혼합물은 스핀 코팅, 딥핑 또는 딥 코팅, 또는 양압 또는 음압 하에서 물질의 흐름, 또는 다른 적절한 기술을 사용하여 (오목 영역(26, 26') 포함) 각각의 기판 표면에 적용될 수 있다. 이러한 유형의 기술은 기판 각각의 기판(16A, 16A')(예를 들어, 오목 영역(26, 26') 및 이에 인접한 간극 영역(34, 34'))에 중합체성 하이드로겔(28, 28')을 전면적으로 증착한다. 다른 선택적 증착 기술(예를 들어, 마스크, 제어된 프린팅 기술 등 수반)을 사용하여 간극 영역(34, 34')이 아닌 오목 영역(26, 26')에 중합체성 하이드로겔(28, 28')을 구체적으로 증착할 수 있다.
일부 예에서, 기판 표면(오목 영역(26, 26') 포함)이 활성화될 수 있고, 이어서 혼합물(중합체성 하이드로겔(28, 28') 포함)이 이에 적용될 수 있다. 일례에서, 실란 또는 실란 유도체(예를 들어, 노보넨 실란)는 기상 증착, 스핀 코팅, 또는 다른 증착 방법을 사용하여 기판 표면 상에 증착될 수 있다. 다른 예에서, 기판 표면은 중합체성 하이드로겔(28, 28')에 부착될 수 있는 표면 활성화제(들)(예를 들어, -OH 기)를 생성하기 위해 플라즈마 애슁에 노출될 수 있다.
중합체성 하이드로겔(28, 28')의 화학에 따라, 적용된 혼합물은 경화 공정에 노출될 수 있다. 예에서, 경화는 실온(예를 들어, 약 25℃) 내지 약 95℃ 범위의 온도에서 약 1 밀리초 내지 약 며칠 범위의 시간 동안 일어날 수 있다.
그 다음 폴리싱을 수행하여 오목 영역(26, 26')의 표면 상의 중합체성 하이드로겔(28, 28')은 적어도 실질적으로 온전하면서도 오목 영역(26, 26')의 주변에 있는 간극 영역(34, 34')으로부터 중합체성 하이드로겔(28, 28')을 제거한다.
서열분석 표면(12, 12')은 또한 중합체성 하이드로겔(28, 28')에 부착된 증폭 프라이머(30, 30')를 포함한다.
오목 영역(26, 26') 내의 중합체성 하이드로겔(28, 28')에 증폭 프라이머(30, 30')를 그래프팅하기 위해 그래프팅 공정이 수행될 수 있다. 예에서, 증폭 프라이머(30, 30')는 프라이머(30, 30')의 5' 말단에서 또는 그 근처에서 단일 지점 공유 부착에 의해 중합체성 하이드로겔(28, 28')에 고정될 수 있다. 이 부착은 i) 프라이머(30, 30')의 어댑터 특이적 부분이 동족 서열분석 준비된 핵산 단편에 어닐링할 수 있도록 하고, 그리고 ii) 3' 하이드록실 기에 프라이머 확장을 허용한다. 이 목적을 위해 적절한 공유 부착은 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 종결된 프라이머의 예는 알킨 종결된 프라이머(예를 들어, 이는 중합체성 하이드로겔(28, 28')의 아자이드 표면 모이어티에 부착될 수 있음), 또는 아자이드 종결된 프라이머 (예를 들어, 이는 중합체성 하이드로겔(28, 28')의 알킨 표면 모이어티에 부착될 수 있음)를 포함한다.
적합한 프라이머(30, 30')의 특정 예는 HISEQTM, HISEQXTM, MISEQTM, MISEQDXTM, MINISEQTM, NEXTSEQTM, NEXTSEQDXTM, NOVASEQTM, GENOME ANALYZERTM, ISEQTM 및 기타 기기 플랫폼에 대해 서열분석하기 위해 lllumina Inc.에 의해 판매되는 상업용 유동 셀의 표면에 사용되는 P5 및 P7 프라이머를 포함한다. P5 및 P7 프라이머 모두는 각각의 중합체성 하이드로겔(28, 28')에 그라프트될 수 있다.
예에서, 그라프팅은 증착 (예를 들어, 일시적으로 결합된 뚜껑 사용), 덩크 코팅, 스프레이 코팅, 퍼들 디스펜싱을 통해 또는 프라이머(들)(30, 30')를 중합체성 하이드로겔(28, 28')에 부착할 또 다른 적합한 방법에 의해 유동을 수반할 수 있다. 이러한 예시적인 기술 각각은 프라이머(들)(30, 30'), 물, 완충액 및 촉매를 포함할 수 있는 프라이머 용액 또는 혼합물을 이용할 수 있다. 임의의 그라프팅 방법으로, 프라이머(30, 30')는 오목 영역(26, 26')에서 중합체성 하이드로겔(28, 28')의 반응성 기와 반응하고 주변 기판(16A, 16A')에 대해 친화력이 없다. 이와 같이 프라이머(30, 30')는 중합체성 하이드로겔(28, 28')에 선택적으로 그라프팅된다.
도 1b에 도시된 예에서, 농축 포획 부위(32, 32')는 중합체성 하이드로겔(28, 28')의 적어도 일부에 부착되거나 적용되는 화학적 포획제를 포함한다. 본 명세서에 개시된 화학적 포획제의 임의의 예가 사용될 수 있다. 일부 예에서, 화학적 포획제는 스트렙타비딘 함유 표적 포획 비드(36)를 유동 셀 서열분석 표면(들)(12, 12' 또는 14, 14')에 부착할 수 있는 바이오틴일 수 있다. 다른 예에서, 화학적 포획제는 (예를 들어, 바이오틴-스트렙타비딘 결합 쌍 이외의) 결합 쌍의 또 다른 구성원일 수 있다. 이들 다른 예 중 일부에서, 표적 포획 비드(36)는 2개의 상이한 결합 쌍 구성원, 예를 들어, i) 스트렙타비딘(포획 프로브(40)를 부착시키기 위해 비오틴에 결합함), 및 ii) 유동 셀(10)의 서열분석 표면(12, 12', 14, 14') 상의 농축 포획 부위(32, 32')의 화학적 포획제에 결합할 수 있는 또 다른 구성원을 포함할 수 있다. 이러한 다른 예에서, 화학적 포획제는 결합 쌍의 비-바이오틴 구성원일 수 있으며, 결합 쌍의 다른 구성원은 스트렙타비딘 외에 고체 지지체(38)에 부착된다.
일부 예에서, 중합체성 하이드로겔(28, 28')의 유리 작용기(예를 들어, 프라이머(30, 30')에 부착되지 않은 작용기)는 여러 농축 포획 부위(32, 32')가 중합체성 하이드로겔(28, 28')의 표면을 가로질러 형성되도록 화학적 포획제로 기능화된다. 예에서, 알킨-PEG-바이오틴 링커 또는 알킨-바이오틴 유리 아자이드 기는 클릭 화학을 사용하여 중합체성 하이드로겔(28, 28')의 유리 아자이드에 공유 부착될 수 있다. 다른 예에서, 증폭 프라이머(30, 30')에 상보적인 프라이머에는 화학적 포획제(예를 들어, 바이오틴 또는 결합 쌍의 다른 구성원)가 부착되어 있을 수 있다. 이러한 상보적 프라이머는 일부 증폭 프라이머(30, 30')에 혼성화되어 농축 포획 부위(32, 32')를 형성할 수 있다.
다른 예에서, 화학 포획제는 미세 접촉 프린팅, 에어로졸 프린팅 등을 사용하여 농축 포획 부위(들)(32, 32')를 형성하는 바람직한 위치에 증착될 수 있다. 또 다른 예에서, 마스크(예를 들어, 포토레지스트)는 화학 포획제가 증착될 공간/위치를 정의하는 데 사용될 수 있으며, 따라서 농축 포획 부위(32, 32')가 형성될 곳이다. 그 다음, 화학적 포획제가 증착될 수 있고 마스크가 제거될 수 있다(예를 들어, 리프트오프, 용해 또는 다른 적절한 기술을 통해). 이 예에서, 농축 포획 부위(32, 32')는 화학적 포획제의 단일 층 또는 박층을 포함할 수 있다.
도 1c는 패턴화된 대향 서열분석 표면(14, 14')을 포함하는 유동 셀(10)의 단면도를 예시한다. 예에서, 이들 표면(14, 14') 각각은 기판(16B, 16B') 상에 준비될 수 있고, 이어서 기판(16B, 16B')은 (예를 들어, 물질(24)를 통해) 서로 부착되어 유동 셀(10)의 예를 형성한다.
도 1c에 도시된 예에서, 유동 셀(10)은 다층 기판(16B, 16B')을 포함하며, 각각은 지지체(20, 20') 및 지지체(20, 20') 상에 위치된 패턴화된 물질(22, 22')를 포함한다. 패턴화된 물질(22, 22')는 간극 영역(34, 34')에 의해 분리된 함몰부(42, 42')를 마련한다.
도 1c에 도시된 예에서, 패턴화된 물질(22, 22')는 지지체(20, 20') 상에 각각 위치된다. 함몰부(42, 42') 및 간극 영역(34, 34')을 형성하기 위해 선택적으로 증착되거나 증착 및 패턴화될 수 있는 임의의 물질이 패턴화된 물질(22, 22')에 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
일례로서, 무기 산화물은 기상 증착, 에어로졸 프린팅 또는 잉크젯 프린팅을 통해 지지체(20, 20')에 선택적으로 적용될 수 있다. 적합한 무기 산화물의 예는 탄탈륨 산화물(예를 들어, Ta205), 알루미늄 산화물(예를 들어, Al203), 실리콘 산화물(예를 들어, Si02), 하프늄 산화물(예를 들어, Hf02) 등을 포함한다.
다른 예로서, 수지가 지지체(20, 20')에 도포된 후 패턴화될 수 있다. 적합한 증착 기술에는 화학적 기상 증착, 딥 코팅, 덩크 코팅, 스핀 코팅, 스프레이 코팅, 퍼들 디스펜싱, 초음파 스프레이 코팅, 닥터 블레이드 코팅, 에어로졸 프린팅, 스크린 프린팅, 미세접촉 프린팅, 등을 포함한다. 적합한 패턴화 기술에는 포토리쏘그래피, 나노임프린트 리쏘그래피 (NIL), 스탬핑 기술, 엠보싱 기술, 성형 기술, 마이크로에칭 기술, 프린팅 기술, 등을 포함한다. 적합한 수지의 일부 예는 다면체 올리고머성 실세스퀴옥산 수지 (Hybrid Plastics의 상표명 POSS® 로부터 상업적으로 입수 가능) 기반 수지, 비-다면체 올리고머성 실세스퀴옥산 에폭시 수지, 폴리(에틸렌 글라이콜) 수지, 폴리에테르 수지 (예를 들어, 개환 에폭시), 아크릴 수지, 아크릴레이트 수지, 메타크릴레이트 수지, 비정질 플루오로폴리머 수지 (예를 들어, CYTOP® from Bellex), 및 그의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "다면체 올리고머성 실세스퀴옥산"은 실리카(SiO2)와 실리콘(R2SiO) 사이의 하이브리드 중간체(예를 들어, RSiO1.5)인 화학 조성물을 지칭한다. 다면체 올리고머성 실세스퀴옥산의 예는 그 전체가 참고로 포함되는 문헌[Kehagias 등, Microelectronic Engineering 86 (2009), pp. 776-778]에 기재된 것일 수 있다. 예에서, 조성물은 화학식 [RSi03/2]n을 갖는 유기규소 화합물이며, R 기는 동일하거나 상이할 수 있다. 다면체 올리고머 실세스퀴옥산에 대한 예시적인 R 기는 에폭시, 아자이드/아지도, 티올, 폴리(에틸렌 글라이콜), 노르보르넨, 테트라진, 아크릴레이트, 및/또는 메타크릴레이트, 또는 또한, 예를 들어, 알킬, 아릴, 알콕시, 및/또는 할로알킬 기를 포함한다. 본 명세서에 개시된 수지 조성물은 단량체 단위로서 하나 이상의 상이한 케이지 또는 코어 구조를 포함할 수 있다.
도 1c에 도시된 바와 같이, 패턴화된 물질(22, 22')는 그 안에 각각 정의된 함몰부(42, 42') 및 인접한 함몰부(42, 42')를 분리하는 간극 영역(34, 34')을 포함한다. 규칙적, 반복적 및 비-규칙적 패턴을 포함하는 함몰부(42, 42')의 많은 상이한 레이아웃이 예상될 수 있다. 예에서, 함몰부(42, 42')는 밀집 패킹 및 개선된 밀도를 위해 육각형 그리드에 배치된다. 다른 레이아웃은 예를 들어, 직선상(직사각형) 레이아웃, 삼각형 레이아웃 등을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 행 및 열에 있는 함몰부(42, 42')의 x-y 형식일 수 있다. 일부 다른 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 함몰부(42, 42') 및/또는 간극 영역(34, 34')의 반복 배열일 수 있다. 또 다른 예에서, 레이아웃 또는 패턴은 함몰부(42, 42') 및/또는 간극 영역(34, 34')의 랜덤 배열일 수 있다. 패턴은 웰, 줄무늬, 소용돌이, 선, 삼각형, 직사각형, 원, 호, 체크, 격자무늬, 대각선, 화살표, 정사각형 및/또는 크로스해칭을 포함할 수 있다.
함몰부(42, 42')의 레이아웃 또는 패턴은 정의된 영역에서 함몰부(42, 42')의 밀도(함몰부(42, 42')의 수)와 관련하여 특성화될 수 있다. 예를 들어, 함몰부(42, 42')는 ㎟당 대략 2백만의 밀도로 존재할 수 있다. 밀도는 예를 들어 ㎟당 약 100, ㎟당 약 1,000, ㎟당 약 10만, ㎟당 약 100만, ㎟당 약 200만, ㎟당 약 500만, ㎟당 약 1000만, ㎟당 약 5000만, 또는 그 초과 또는 그 미만을 포함하는 상이한 밀도로 조정될 수 있다. 패턴화된 물질(22, 22')에서 함몰부(42, 42')의 밀도는 위의 범위로부터 선택되는 더 낮은 값 중 하나와 상위 값 중 하나 사이일 수 있다는 것이 추가로 이해되어야 한다. 예로서, 고밀도 어레이는 약 100㎚ 미만으로 분리된 함몰부(42, 42')를 갖는 것으로 특성화될 수 있고, 중간 밀도 어레이는 약 400㎚ 내지 약 1㎛만큼 분리된 함몰부(42, 42')를 갖는 것으로 특징지어질 수 있으며, 저밀도 어레이는 약 1㎛보다 크게 분리된 함몰부(42, 42')를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 예시적인 밀도가 제공되었지만, 임의의 적절한 밀도가 사용될 수 있음을 이해해야 한다. 함몰부(42, 42')의 밀도는 부분적으로 함몰부(42, 42')의 깊이에 의존할 수 있다. 일부 경우에, 함몰부(42, 42') 사이의 간격이 본원에 열거된 예보다 훨씬 더 큰 것이 바람직할 수 있다.
함몰부(42, 42')의 레이아웃 또는 패턴은 또한 또는 대안적으로 평균 피치, 또는 함몰부(42, 42')의 중심으로부터 인접한 함몰부(42, 42')의 중심까지의 간격(중심 대 중심 간격), 또는 하나의 함몰부(42, 42')의 우측 모서리로부터 인접 함몰부(42, 42')의 좌측 모서리로의 간격(모서리 대 모서리 간격)을 특징으로 할 수 있다. 패턴은 평균 피치 주변의 변동 계수가 작도록 규칙적일 수 있고, 패턴은 변동 계수가 상대적으로 클 수 있는 비규칙적일 수 있다. 어느 경우든, 평균 피치는 예를 들어 약 50㎚, 약 0.1㎛, 약 0.5㎛, 약 1㎛, 약 5㎛, 약 10㎛, 약 100㎛, 또는 그 초과 또는 그 미만일 수 있다. 오목부(42, 42')의 특정 패턴에 대한 평균 피치는 위의 범위에서 선택된 더 낮은 값 중 하나와 상위 값 중 하나 사이일 수 있다. 예에서, 함몰부(42, 42')는 약 1.5㎛의 피치(중심간 간격)를 갖는다. 예시적인 평균 피치 값이 제공되었지만, 다른 평균 피치 값이 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
각각의 함몰부(42, 42')의 크기는 그 부피, 개구 면적, 깊이 및/또는 직경에 의해 특성화될 수 있다.
각 함몰부(42, 42')는 유동 셀(10) 내로 도입되는 적어도 일부 유체를 한정할 수 있는 임의의 부피를 가질 수 있다. 최소 또는 최대 부피는 예를 들어 유동 셀(10)의 다운스트림 사용에 대해 예상되는 처리량(예를 들어, 다중성), 분해능, 뉴클레오타이드 또는 분석물 반응성을 수용하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 부피는 적어도 약 1×10-3㎛3, 적어도 약 1×10-2㎛3, 적어도 약 0.1㎛3, 적어도 약 1㎛3, 적어도 약 10㎛3, 적어도 약 100㎛3, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 부피는 많아야 약 1×104㎛3, 많아야 약 1×103㎛3, 많아야 약 100㎛3, 많아야 약 10㎛3, 많아야 약 1㎛3, 많아야 약 0.1㎛3, 또는 그 미만일 수 있다.
각각의 함몰 개구에 의해 점유되는 면적은 부피에 대해 위에서 설명된 것과 유사한 기준에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들어, 각각의 함몰 개구에 대한 면적은 적어도 약 1×10-3㎛2, 적어도 약 1×10-2㎛2, 적어도 약 0.1㎛2, 적어도 약 1㎛2, 적어도 약 10㎛2, 적어도 약 100㎛2, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 면적은 많아야 약 1×103㎛2, 많아야 약 100㎛2, 많아야 약 10㎛2, 많아야 약 1㎛2, 많아야 약 0.1㎛2, 많아야 약 1×10-2㎛2, 또는 그 미만일 수 있다. 각 함몰 개구가 차지하는 면적은 위에 지정된 값보다 크거나 작거나 사이일 수 있다.
각각의 함몰부(42, 42')의 깊이는 중합체성 하이드로겔(28, 28')의 일부를 수용하기에 충분히 클 수 있다. 예에서, 깊이는 적어도 약 0.1㎛, 적어도 약 0.5㎛, 적어도 약 1㎛, 적어도 약 10㎛, 적어도 약 100㎛, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 깊이는 최대 약 1×103㎛, 최대 약 100㎛, 최대 약 10㎛ 또는 그 이하일 수 있다. 일부 예에서, 깊이는 약 0.4㎛이다. 각각의 함몰부(42, 42')의 깊이는 위에 명시된 값보다 크거나 작거나 사이일 수 있다.
일부 예에서, 각각의 함몰부(42, 42')의 직경 또는 길이 및 폭은 적어도 약 50㎚, 적어도 약 0.1㎛, 적어도 약 0.5㎛, 적어도 약 1㎛, 적어도 약 10㎛, 적어도 약 100㎛, 또는 그 초과일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 직경 또는 길이 및 폭은 많아야 약 1×103㎛, 많아야 약 100㎛, 많아야 약 10㎛, 많아야 약 1㎛, 많아야 약 0.5㎛, 많아야 약 0.1㎛, 또는 그 미만 (예를 들어, 약 50㎚)일 수 있다. 일부 예에서, 직경은 이거나 길이 및 폭 각각은 약 0.4㎛이다. 각각의 함몰부(42, 42')의 직경 또는 길이 및 폭은 상기 명시된 값보다 크거나 작거나 사이일 수 있다.
이 예에서, 서열분석 표면(14, 14')의 구성요소 중 적어도 일부는 함몰부(42, 42') 내로 도입될 수 있다. 서열분석 표면(14, 14')의 구성요소에 의해 점유되지 않은 함몰부(42, 42') 내의 임의의 공간은 농축 채널(18)의 일부로 간주될 수 있음을 이해해야 한다.
도 1c에 도시된 예에서, 중합체성 하이드로겔(28, 28')은 각각의 함몰부(42, 42') 내에 위치된다. 중합체성 하이드로겔(28, 28')은 도 1b를 참조하여 기재된 바와 같이 적용될 수 있어서, 중합체성 하이드로겔(28, 28')은 함몰부(42, 42')에 존재하고 주위 간극 영역(34, 34') 또는 농축 포획 부위(들)(32, 32') 상에 존재하지 않는다.
도 1c에 도시된 예에서, 프라이머(30, 30')는 각각의 함몰부(42, 42') 내의 중합체성 하이드로겔(28, 28')에 그라프트될 수 있다. 프라이머(30, 30')는 도 1b를 참조하여 기재된 바와 같이 적용될 수 있으며, 따라서 중합체성 하이드로겔(28, 28')에 그라프팅되고 주변 간극 영역(34, 34') 또는 농축 포획 부위(들)(32, 32')에는 그라프팅되지 않을 것이다.
도 1c에 도시된 예에서, 농축 포획 부위(32, 32')는 간극 영역(34, 34')의 적어도 일부에 적용되는 화학적 포획제이다. 예를 들어, 화학 포획제는 미세 접촉 프린팅, 에어로졸 프린팅 등을 사용하여 간극 영역(34, 34') 중 적어도 일부에 증착되어 농축 포집 부위(들)(32, 32')를 형성할 수 있다. 또 다른 예에서, 마스크(예를 들어, 포토레지스트)는 화학 포획제가 증착될 공간/위치를 정의하는 데 사용될 수 있으며, 따라서 농축 포획 부위(32, 32')가 형성될 곳이다. 그 다음, 화학적 포획제가 증착될 수 있고 마스크가 제거될 수 있다(예를 들어, 리프트오프, 용해 또는 다른 적절한 기술을 통해).
다른 예에서, 농축 포획 부위(32, 32')는 중합체성 하이드로겔(28, 28')의 자유 작용기(예를 들어, 프라이머(30, 30')에 부착되지 않은 작용기)에 부착된 화학적 포획제이다. 또 다른 예에서, 농축 포획 부위(32, 32')는 증폭 프라이머(30, 30') 중 일부에 혼성화된 프라이머에 부착된 화학적 포획제이다. 이들 예에서, 농축 포획 부위(32, 32')는 간극 영역(34, 34')이 아닌 함몰부(42, 42')에 존재할 것이다.
본 명세서에 개시된 화학적 포획제의 임의 예는 도 1c에 도시된 예에서 사용될 수 있다. 화학적 포획제는 부분적으로 표적 포획 비드(36)의 고체 지지체(38)가 기능화되는 방식에 따라 바이오틴 또는 결합 쌍의 다른 구성원일 수 있다.
도 1b 및 도 1c에 도시된 바와 같이, 기판(16A 및 16A' 또는 16B 및 16B')은 서열분석 표면(12 및 12' 또는 14 및 14')이 사이에 마련된 농축 채널(18)과 서로 마주하도록 서로 부착된다.
기판(16A 및 16A' 또는 16B 및 16B')은 모든 간극 영역(34, 34')의 일부에서 서로 결합될 수 있다. 기판(16A 및 16A 또는 16B 및 16B') 사이에 형성되는 결합은 화학적 결합 또는 기계적 결합(예를 들어, 패스너 등을 사용)일 수 있다.
임의의 적합한 기술, 예컨대 레이저 결합, 확산 결합, 애노드 결합, 공융 결합, 플라즈마 활성화 결합, 유리 프릿 결합, 또는 다른 당해 분야에서 알려진 방법을 사용하여 기판(16A 및 16A' 또는 16B 및 16B')를 함께 결합할 수 있다. 예에서, 스페이서 층(예를 들어, 물질(24))은 기판(16A 및 16A' 또는 16B 및 16B')을 결합하기 위해 사용될 수 있다. 스페이서 층은 기판(16A 및 16A' 또는 16B 및 16B')의 적어도 일부를 함께 밀봉할 임의의 물질(24)일 수 있다. 일부 예에서, 스페이서 층은 결합을 돕는 방사선 흡수 물질일 수 있다.
도시되지는 않았지만, 뚜껑은 기판(16A 또는 16A') 중 하나에 결합되어 유동 셀(10)이 하나의 서열분석 표면(12 또는 14)을 가질 수 있음을 이해해야 한다.
유동 셀에서 라이브러리 제조
도 1a, 도 1b 및 도 1c에 도시된 유동 셀(10)의 경우, 라이브러리 단편의 제조는 유동 셀(10) 외부에서 발생할 수 있다. 라이브러리 제조가 유동 셀(10) 외부에서 발생하는 경우, 더 긴 유전 물질 조각을 단편화하고 단편의 말단에 원하는 어댑터를 통합하는 임의의 적절한 라이브러리 제조 기술이 사용될 수 있다.
DNA 라이브러리 제조 기술의 한 예는 고체 지지체에 대한 태그부착을 포함한다. 이 예에서, 고체 지지체는 표적 포획 비드(36)에 대해 본 명세서에 기재된 임의의 예일 수 있고, 태깅된 라이브러리 단편은 고체 지지체의 표면에 고정된다.
이 라이브러리 제조 예에서, 고체 지지체는 그 위에 고정화된 트랜스포솜 복합체를 가지며, 각각의 트랜스포솜 복합체는 제1 폴리뉴클레오타이드에 결합된 트랜스포사제를 포함하고, 제1 폴리뉴클레오타이드는 (i) 트랜스포손 말단 서열을 포함하는 3' 부분, 및 (ii) 제1 태그(어댑터)를 포함한다. DNA 샘플은, DNA 샘플이 트랜스포솜 복합체에 의해 단편화되고 제1 폴리뉴클레오타이드의 3' 트랜스포손 말단 서열이 단편의 한 가닥의 5' 말단으로 전달되는 조건에서 고체 지지체에 노출된다. 이것은 적어도 하나의 가닥이 제1 태그로 5'-태깅된 이중 가닥 단편의 고정화된 라이브러리를 생성한다.
도 2는 일반적으로 이 라이브러리 제조 방법을 도시한다. 이 예에서, 고체 지지체(38')는 표면 결합된 트랜스포솜 복합체(44)를 포함한다. 트랜스포솜 복합체(44)는 올리고뉴클레오타이드(고체 지지체(38')에 그라프팅되고 일부는 ME 서열을 포함함) 및 올리고뉴클레오타이드에 비공유적으로 결합된 트랜스포사제 효소를 포함한다. 이러한 표면 결합된 트랜스포솜(44)의 밀도는 ME 서열을 함유하는 그라프팅된 올리고뉴클레오타이드의 밀도를 변화시키거나 고체 지지체(38')에 첨가된 트랜스포사제의 양에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 트랜스포솜 복합체(44)는 ㎟당 적어도 103, 104, 105 또는 적어도 106개의 복합체의 밀도로 고체 지지체(38') 상에 존재한다.
이중 가닥 DNA 샘플(37)이 고체 지지체(38')에 추가될 때, 트랜스포솜 복합체 (44)는 첨가된 DNA를 태그화하여, (예를 들어, 삽입된 태그를 통해) 양쪽 말단에서 고체 지지체 (38')의 표면에 커플링된 이중 가닥 단편 (46)을 생성할 것이다. 일부 예에서, 브릿징된 단편(46)의 길이는 표면 상의 트랜스포솜 복합체(44)의 밀도를 변화시킴으로써 변할 수 있다. 일부 예에서, 생성된 브릿징된 단편의 길이는 100 염기쌍(bp), 200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 600 bp, 700 bp, 800 bp, 900 bp, 1,000 bp, 1,100 bp, 1,200 bp, 1,300 bp, 1,400 bp, 1,500 bp, 1,600 bp, 1,700 bp, 1,800 bp, 1,900 bp, 2,000 bp, 2,100 bp, 2,200 bp, 2,300 bp, 2,400 bp, 2,500 bp, 2,600 bp, 2,700 bp, 2,800 bp, 2,900 bp, 3,000 bp, 3,100 bp, 3,200 bp, 3,300 bp, 3,400 bp, 3,500 bp, 3,600 bp, 3,700 bp, 3,800 bp, 3,900 bp, 4,000 bp, 4,100 bp, 4,200 bp, 4,300 bp, 4,400 bp, 4,500 bp, 4,600 bp, 4,700 bp, 4,800 bp, 4,900 bp, 5,000 bp, 10,000 bp, 30,000 bp 미만 또는 100,000 bp 미만이다. 다른 예에서, 생성된 브릿지 단편(46)의 길이는 더 길다. 특정 구현예에서, 생성된 브릿징된 단편(46)의 길이는 위에서 예시된 것들로부터 선택된 상한 및 하한에 의해 정의된 범위 내에 있을 수 있다.
이중 가닥 DNA 샘플(37)의 적용은 생물학적 샘플을 고체 지지체(38')에 추가하는 것을 수반할 수 있다. 생물학적 샘플은 DNA를 함유하고 태그부착을 위해 고체 표면(38')에 증착될 수 있는 모든 유형일 수 있다. 예를 들어, 샘플은 정제된 DNA를 포함하여 다양한 정제 상태의 DNA를 함유할 수 있다. 그러나 샘플은 완전히 정제될 필요는 없으며, 예를 들어 단백질, 기타 핵산 종, 기타 셀 성분 및/또는 기타 오염 물질과 혼합된 DNA를 함유할 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 DNA, 단백질, 기타 핵산 종, 기타 셀 성분 및/또는 생체 내에서 발견되는 것과 거의 동일한 비율로 존재하는 기타 오염 물질의 혼합물을 함유할 수 있다. 구성요소는 온전한 세포에서 발견되는 것과 동일한 비율로 있을 수 있다. 일부 예에서, 생물학적 샘플은 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7 미만, 또는 0.60 미만의 260/280 비율을 갖는다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 적어도 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5, 1.4, 1.3, 1.2, 1.1, 1.0, 0.9, 0.8, 0.7, 또는 적어도 0.60의 260/280 비율을 갖는다. 본 명세서에 제공된 방법을 통해 DNA가 고체 지지체(38')에 결합할 수 있기 때문에, 표면 결합 태그부착이 발생한 후 고체 지지체를 세척하는 것만으로 다른 오염 물질을 제거할 수 있다. 생물학적 샘플은 예를 들어 조 셀 용해물 또는 전체 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이 예시적인 라이브러리 제조 방법에서 고체 지지체(38')에 적용되는 조 셀 용해물은 다른 셀 구성요소로부터 핵산을 분리하는 데 전통적으로 사용되는 하나 이상의 분리 단계를 거칠 필요가 없다.
따라서, 일부 예에서, 생물학적 샘플는 예를 들어 혈액, 혈장, 혈청, 림프, 점액, 가래, 소변, 정액, 뇌척수액, 기관지 흡인물, 대변, 침식된 조직, 또는 이의 용해물 또는 DNA를 포함하는 다른 생물학적 표본을 포함할 수 있다.
도 3a 및 3b는 일례에 따른 태그부착 반응을 도시한다. 도 3a에 도시된 바와 같이, 트랜스포솜(44)은 이중 가닥 분자, 예를 들어 ME 어댑터에 결합하는 각 단량체(50)와 함께 Tn5의 이량체를 포함한다. ME 어댑터의 한 가닥(48)은 고체 지지체(38')의 표면에 공유적으로 부착된다. 트랜스포솜(44)는 샘플 DNA에 결합하고 DNA 골격에 2개의 닉을 생성하여 단편(46)을 생성한다. 도 3b에 도시된 예에서, 닉(nick)은 각 가닥에서 9개 염기 떨어져 있다. 트랜스포솜 복합체(44)는 닉 사이에 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12bp의 갭을 생성할 수 있음을 이해해야 한다. 각 ME 어댑터의 2개의 가닥(예를 들어, 가닥(48)) 중 하나는 각 닉 위치에서 각 단편(46)의 5' 말단에 결찰된다. 이 가닥(48)는 "전달된 가닥"이라고 하며 5' 말단을 통해 고체 지지체(38')의 표면에 그라프팅된다. 도 3a의 표면 태그부착의 생성된 브릿지는 생성된 브릿지의 특성을 명확히 하기 위해 도 3b에서 다시 그려진다.
전달된 가닥(48)은 제1 서열분석 프라이머 서열(예를 들어, 판독 1 서열분석 프라이머 서열) 및 유동 셀 서열분석 표면(12, 14) 상의 증폭 프라이머들 중 하나(예를 들어, P5)의 적어도 일부에 상보적인 제1 서열 (P5')을 포함할 수 있다. 이와 같이 태그부착은 각 DNA 단편(46)에 하나의 어댑터(또는 태그)를 도입한다.
태그부착 후, 트랜스포사제 효소는 나트륨 도데실 설페이트(SDS) 처리 또는 열 또는 프로테이나제 K 분해를 통해 제거될 수 있다. 트랜스포사제 효소를 제거하면 고체 지지체(38')에 부착된 단편(46)이 남는다.
ME 어댑터의 비-전달된 가닥(48)'은 태그부착 동안 DNA 단편(46)에 혼입되지 않고, 오히려 각각의 단편(46)의 다른 말단에 후속적으로 결찰될 수 있는 어댑터이다. 태그부착 동안, 비-전달 가닥(48')은 염기쌍을 통해 전달된 가닥(48)에 부착될 수 있다. 일부 예에서, 비-전달된 가닥(48')은 유동 셀 서열분석 표면(12, 14) 상의 증폭 프라이머 (P7)의 또 다른 것의 적어도 일부분과 동일한 제2 서열분석 프라이머 서열(예를 들어, 판독물 2 서열분석 프라이머 서열) 및 제2 서열(P7)을 포함하는 어댑터(또는 태그)이다. 증폭하는 동안, 동일한 서열은 유동 셀 서열분석 표면(12, 14)에서 증폭 프라이머(예를 들어, P7) 중 하나의 적어도 일부에 상보적 카피의 형성을 가능하게 한다. 도 3b에 도시된 바와 같이, 결찰 L은 전달된 가닥(48)이 혼입된 반대쪽 말단에서 각각의 DNA 단편(46) 내로 비-전달된 가닥(48')을 혼입하도록 수행될 수 있다.
하나의 라이브러리 제조 기술이 상세하게 설명되었지만, 다른 라이브러리 제조 기술도 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
다른 라이브러리 제조 예에서, 어댑터 중 하나(예를 들어, 유동 셀 서열분석 표면(12, 14) 상의 증폭 프라이머 중 하나(예를 들어, P5)의 적어도 일부에 상보적인 제1 서열(P5') 및 제1 서열분석 프라이머 서열을 포함함)는 고체 지지체(38')의 표면에 결합될 수 있다.
이 예에서, 트랜스포솜 복합체는 또한 고체 지지체(38')에 결합될 수 있다. 고체 지지체(16) 상에 트랜스포솜 복합체를 로딩하기 전에, 부분 Y-어댑터가 트랜스포솜 복합체의 예를 형성하기 위해 트랜스포사제 효소(예를 들어, 2개의 Tn5 분자 포함)와 혼합될 수 있다. 부분 Y-어댑터는 서로 혼성화된 2개의 모자이크 말단 서열을 포함할 수 있다. 모자이크 말단 서열 중 하나는 태그부착 동안 단편화된 DNA 가닥(46)에 부착할 수 있는 자유 말단을 가지며, 따라서 도 3a 및 도 3b의 전달된 가닥(48)과 유사하다. 모자이크 말단 서열 중 다른 하나는 이의 카피가 증폭 프라이머(P7)에 상보적이도록(예를 들어, P7'), 유동 셀 서열분석 표면(12, 14) 상의 증폭 프라이머(P7) 중 또 다른 것의 적어도 일부와 동일한 서열을 갖는 제2 서열분석 프라이머 서열(예를 들면, 판독 2 서열분석 프라이머 서열), 및 제2 서열(P7)에 부착될 수 있다. 이 예에서, 모자이크 말단 서열 중 다른 것, 제2 서열분석 프라이머 서열 및 제2 서열은 태그부착 동안 단편화된 DNA 가닥에 부착되지 않은 어댑터 서열을 구성하며, 따라서 도 3a 및 도 3b에서의 비-전달된 가닥(48')과 유사하다.
트랜스포솜 복합체를 고체 지지체(38') 상에 적재하는 것은 트랜스포좀 복합체를 고체 지지체(38')와 혼합하는 것, 및 혼합물을 부분 Y-어댑터의 모자이크 말단을 고체 지지체(38') 상의 어댑터 서열의 3'-말단에 연결시키기에 적합한 조건에 노출시키는 것을 포함할 수 있다.
이 예에서, 태그부착 프로세스가 수행될 수 있다. 태그부착 동안, DNA 샘플(37)은 고체 지지체(38')에 적용될 수 있다. 샘플이 트랜스포솜 복합체와 접촉함에 따라 더 긴 핵산 샘플(37)에 태깅된다. 태그부착의 이 예 동안에, 샘플(36)은 단편(64)으로 단편화되고 단편(64) 각각은 5' 말단에서 부분 Y-어댑터의 모자이크 단부의 자유 단부로 태깅화된다. 더 긴 핵산 샘플(37)의 연속적인 태깅은 트랜스포솜 복합체 사이에 복수의 브릿징된 분자를 생성한다. 브릿징된 분자는 고체 지지체(38')를 감싼다. 트랜스포사제 효소가 제거될 수 있고, 샘플 단편이 부착되지 않은 어댑터 서열 부분 Y-어댑터에 부착되도록 보장하기 위해 추가 확장 및 결찰이 수행된다.
또 다른 라이브러리 제조 예에서, 어댑터가 부착된 튜브에서 뉴클레오타이드 라이브러리가 생성된 다음, 고체 지지체(38') 상의 프라이머에 대한 어댑터의 혼성화를 통해 라이브러리가 고체 지지체(38')에 부착된다. 또 다른 라이브러리 제조 예에서, 결합 쌍의 한 구성원을 갖는 어댑터 서열이 튜브의 라이브러리 단편에 추가될 수 있으며, 그런 다음 서열분석 준비된 라이브러리 단편이 튜브의 고체 지지체(38')에 결합된다.
유동 셀에서 발생하는 라이브러리 제조에는 리보핵산(RNA) 샘플도 포함될 수 있다.
이들 예에서, RNA 샘플은 먼저 상보적 데옥시리보핵산(cDNA) 샘플로 전환된다. 이것은 역전사 효소를 사용하는 역전사를 사용하여 수행할 수 있다. 일부 예에서, 역전사 및 제2 가닥 합성을 위한 키트가 사용된다. 이러한 예에서, ThermoFisher Scientific의 고용량 cDNA 역전사 키트를 사용할 수 있다. 다른 예에서, 역전사 및 템플릿 스위치(제2 가닥용)용 키트가 사용된다. 이러한 예에서, New EnglandBiolabs의 템플릿 전환 RT 효소 믹스를 사용할 수 있다.
일단 이중 가닥 DNA가 RNA 샘플에서 생성되면, 본원에 기재된 것을 포함하는 임의의 DNA 라이브러리 제조 방법을 사용하여 어댑터/태그를 단편(46)에 추가하여 고체 지지체(38')에 부착된 서열분석 준비된 핵산 단편을 생성할 수 있다.
유동 셀에 대한 라이브러리 제조
도 1a, 도 1b, 및 도 1c에 도시된 유동 셀(10)의 예는 또한 결합된 라이브러리 제조 및 분석 시스템(52)에 포함될 수 있다. 이 시스템(52) 및 그 안에 포함된 유동 셀(10')이 도 4에 개략적으로 도시되어 있다. 유동 셀(10')은 농축 채널(18)의 상류에 하나 이상의 제조 채널(54, 54')을 포함한다. 농축 채널(18)은 서열분석 표면(12 또는 14) 및 농축 포획 부위(32, 32')를 포함하는 유동 셀(10)에 대해 본 명세서에 개시된 임의의 예일 수 있다.
도 4에 도시된 바와 같이, 시스템(52)은 적어도 농축 채널(18)과 선택적 유체 연통하는 유동 셀 시약 시스템(56)을 포함한다. 유동 셀 시약 시스템(56)은 저장소(58, 60, 62), 유체 채널(예를 들어, 수송 채널(64)), 펌프, 밸브 및 유동 셀(10')의 다른 채널(18, 54, 54')로 들어오고 나가는 시약의 흐름을 제어할 수 있는 기타 유체 장치 구성요소를 포함할 수 있다.
제조 채널(54, 54')은 온-플로우 셀 라이브러리 제조에 사용된다. DNA가 분석되어야 하는 경우, 유동 셀(10')은 농축 채널(18)의 상류에 그리고 선택적인 유체 연통에 있는 DNA 라이브러리 제조 채널(54)을 포함할 수 있다. RNA가 분석될 때 유동 셀(10')은 RNA 라이브러리 제조 채널(54')과 DNA 라이브러리 제조 채널(54)(서로 유체 연통됨)을 모두 포함할 수 있다. 이 예에서, DNA 라이브러리 제조 채널(54)은 농축 채널(18)의 업스트림에 있으며 선택적 유체 연통 상태에 있고; RNA 라이브러리 제조 채널(54')은 DNA 라이브러리 제조 채널(54)의 업스트림에 있으며 선택적으로 유체 연통한다.
유동 셀(10')은 기판(16)의 임의의 예를 포함할 수 있으며, 제조 채널(들)(54, 54')은 제1 영역에 마련되고 농축 채널(18)은 제2 영역에 마련된다. 그것들은 기판(16)의 다른 영역에 마련되기 때문에, 채널(54, 54' 및/또는 18) 내의 구조 및 구성요소(들)는 다를 수 있다.
농축 채널(18)과 유사하게, DNA 라이브러리 제조 채널(54)은 두 개의 기판(16) 사이, 또는 하나의 기판(16)과 뚜껑 사이에 마련될 수 있다. DNA 라이브러리 제조 채널(들)(54)을 마련하는 기판(들)(16)의 영역은 패턴화되지 않을 수 있고(기판(16B, 16B')와 유사), 라이브러리 제조에 사용되는 고체 지지체(38')를 일시적으로 부착하는 제조 포획 부위(도시되지 않음)를 포함하도록 기능화될 수 있다.
일례에서, DNA 라이브러리 제조 채널(54)을 정의하는 기판 영역(들)의 표면(들)은 결합 쌍 구성원(예를 들어, 아비딘, 스트렙타비딘, 바이오틴, 렉틴, 탄수화물, 핵산 결합 단백질, 에피토프, 항체 등)으로 코팅되고, 이는 라이브러리 제조에 사용되는 고체 지지체(38')에 위치한 다른 결합 쌍 구성원에 결합할 수 있다. 각각의 결합 쌍 구성원은 하나의 제조 포획 부위이다. 다른 예에서, DNA 라이브러리 제조 채널(54)을 마련하는 기판 영역(들)의 표면(들)은 그것에 혼성화된 바이오티닐화된 올리고를 갖는 올리고뉴클레오타이드(올리고)로 코팅된다. 이 예에서, 바이오티닐화된 올리고는 라이브러리 제조에 사용되는 고체 지지체(38')를 일시적으로 부착할 수 있는 제조 포획 부위이다. 다른 예에서, 제조 포획 부위는 DNA 라이브러리 제조 채널(54)의 표면(들)에 고체 지지체(38')를 부착할 수 있는 임의의 다른 형태의 화학적 커플링이 가능할 수 있다.
DNA 라이브러리 제조는 DNA 라이브러리 제조 채널(54)에서 수행될 수 있으므로 DNA 라이브러리 제조 채널(54)은 증폭 프라이머(30, 30')를 포함하지 않는다.
저장소(58)는 DNA 라이브러리 제조 채널(54)과 선택적 유체 연통하는 것으로 표시된다. 이 저장소(58)는 DNA 샘플(37) 및 라이브러리 제조 유체를 DNA 라이브러리 제조 채널(54)에 선택적으로 전달하여 라이브러리 제조가 채널(54) 내에서 일어날 수 있도록 하는 다른 챔버를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 라이브러리 제조 유체는 라이브러리 제조 비드(도 2 및 3A를 참조하여 기재된 바와 같이 고체 지지체(38') 및 그에 부착된 트랜스포솜(44) 포함)를 포함할 수 있다. DNA 샘플(37) 및 라이브러리 제조 유체가 DNA 라이브러리 제조 채널(54) 내로 도입될 때, 고체 지지체(38')는 제조 포획 부위에 결합할 수 있고, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 태그부착 방법을 사용하여 DNA 라이브러리 제조가 일어날 수 있다.
저장소(58)는 또한 사용될 라이브러리 제조 방법에 따라 DNA 라이브러리 제조 채널(54)에 다른 유체를 전달할 수 있음을 이해해야 한다.
유동 셀(10')의 일부 예는 DNA 라이브러리 제조 채널(54)의 상류에 있는 RNA 라이브러리 제조 채널(54')를 포함한다.
농축 채널(18) 및 DNA 라이브러리 제조 채널(54)과 유사하게, RNA 라이브러리 제조 채널(54')은 2개의 기판(16) 사이 또는 하나의 기판(16)과 뚜껑 사이에 마련될 수 있다. RNA 라이브러리 제조 채널(들)(54')을 마련하는 기판(들)(16)의 영역은 패턴화되지 않을 수 있다(기판(16B, 16B')와 유사). RNA 라이브러리 제조 채널(54')은 RNA 샘플의 초기 제조에 사용될 수 있으므로, RNA 라이브러리 제조 채널(54')에는 증폭 프라이머(30, 30')가 포함되지 않는다.
RNA 라이브러리 제조의 초기 프로세스는 RNA 라이브러리 제조 채널(54')에서 수행될 수 있다. 저장소(60)는 RNA 라이브러리 제조 채널(54')과 선택적 유체 연통하는 것으로 도시되어 있다. 이 저장소(60)는 RNA 샘플 및 라이브러리 제조 유체를 RNA 라이브러리 제조 채널(54')로 선택적으로 전달하여 RNA가 채널(54') 내에서 cDNA로 전환될 수 있도록 다른 챔버를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 라이브러리 제조 유체는 제2 가닥 합성을 위한 역전사효소 및 시약(들)을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 라이브러리 제조 유체는 역전사효소 및 (제2 가닥을 위한) 템플릿 전환용 시약(들)을 포함할 수 있다.
RNA 라이브러리 제조 채널(54')에서 제조된 cDNA는 그런 다음 (예를 들어, 수송 채널을 통해) DNA 라이브러리 제조 채널(54)로 전달될 수 있다. DNA 라이브러리 제조 채널(54) 내에서, cDNA는 어댑터(태그)를 통합하고 DNA 라이브러리 제조 채널(54) 내의 고체 지지체(38)에 부착된 서열분석 준비된 핵산 단편을 생성하도록 태그부착될 수 있다. 대안적으로, 임의의 다른 적절한 DNA 라이브러리 제조 기술이 DNA 라이브러리 제조 채널(54)의 cDNA에 대해 수행될 수 있다.
DNA 라이브러리 제조 채널(54)은 농축 채널(18)과 선택적 유체 연통한다. 일례에서, 수송 채널(64)은 제조 채널(54)과 농축 채널(18)을 선택적이고 유체적으로 연결하여, 서열분석 준비된 핵산 단편이 포획, 증폭 및 서열분석을 위해 농축 채널(18)로 전달될 수 있도록 한다.
농축 방법
예시적인 농축 방법은 게놈 데옥시리보핵산 또는 상보적 데옥시리보핵산으로부터 라이브러리 단편을 제조하는 단계; 농축 채널(18)에 라이브러리 단편을 도입하는 단계; 및 미리 결정된 온도에서 농축 채널(18)을 인큐베이션하여 표적화 영역을 포함하는 라이브러리 단편 중 적어도 일부가 포획 프로브(40)에 혼성화하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 개시된 표적 포획 비드(36)는 유동 셀(10, 10')의 농축 포획 부위(32, 32')에 사전 부착될 수 있거나 (예를 들어, 유동 셀(10, 10) 사용자에 의해) 농축 및 서열분석 작업흐름의 일부로 농축 채널(18)로 도입될 수 있다.
서열분석 작업흐름의 일부로 도입될 때, 표적 포획 비드(36)는 농축 유체(예를 들어, 표적 포획 비드(36)를 포함하는 염 완충액)의 농축 채널(18)에 포함될 수 있다. 도 4에 도시된 예에서, 농축 유체는 농축 채널(18)과 선택적으로 유체 연통하는 저장소(62) 내에 함유될 수 있다.
농축 유체는 저장소(62)에서 농축 채널(18)로 전달될 수 있다. 농축 포획 부위(32, 32')는 농축 채널(18)의 서열분석 표면(12, 12' 또는 14, 14')에서 표적 포획 비드(36)의 일부를 고정화한다. 일부 표적 포획 비드(36)는 농축 포획 부위(32, 32')에 부착되지 않을 수 있으며, 이러한 표적 포획 비드(36)는 추가 처리 전에 농축 채널(18)로부터 제거될 것임을 이해해야 한다. 농축 채널(18)에서 농축 유체 및 고정되지 않은 임의의 표적 포획 비드(36)를 제거하기 전에 미리 결정된 시간이 지나도록 허용될 수 있다. 예에서, 바람직한 수의 고정화된 표적 포획 비드(36)를 얻기 위해 미리 결정된 시간은 약 5분 내지 약 30분의 범위일 수 있다. 더 긴 배양 시간도 사용할 수 있다.
이 예시적인 방법은 농축 채널(18)로부터 농축 유체 및 포획되지 않은 표적 포획 비드(36)를 세척하는 것을 포함한다. 세척은 농축 채널(18)에 세척 유체를 도입하는 것을 수반할 수 있다. 흐름은 농축 채널(18)의 배출구 포트를 통해 농축 포획 부위(32, 32')에서 고정되지 않은 임의의 표적 포획 비드(36)를 밀어낼 수 있다. 표적 포획 비드(36)와 농축 포획 부위(32, 32') 사이의 고정화 메커니즘(예를 들어, 결합 쌍, 혼성화, 공유 결합 등)은 임의의 고정화된 표적 포획 비드(36)가 배출구 흐름의 일부가 되는 것을 방지할 수 있다.
오프-플로우 또는 온-플로우 셀 라이브러리 제조 기술이 사용되든 상관없이, 서열분석 준비된 핵산 단편은 농축 채널(18)에 도입되기 전에 고체 지지체(38')로부터 방출될 수 있다.
오프-플로우 셀 라이브러리 제조 기술을 사용하여, 고체 지지체(38')에서 서열분석 준비된 핵산 단편의 방출은 임의의 적합한 기술을 사용하여 유동 셀(10, 10') 외부에서 시작될 수 있다. 일례에서, 절단제가 도입될 수 있고, 고체 지지체(38')로부터 서열분석 준비된 핵산 단편을 방출하도록 절단제가 촉발되도록 자극이 적용될 수 있다. 다른 예에서, 서열분석 준비된 핵산 단편의 방출은 서열분석 준비된 핵산 단편에 혼성화되는 프라이머의 용융 온도 초과에서 고체 지지체(38')를 가열하는 것을 포함할 수 있다. 서열분석 준비된 핵산 단편이 이중 가닥인 경우(예를 들어, 도 2 및 3B에 도시된 바와 같이), 가열을 사용하여 단편을 서로 해리할 수 있다. 방출된 서열분석 준비된 핵산 단편은 고체 지지체(38')에서 분리될 수 있다.
온-플로우 셀 라이브러리 제조 기술을 사용하여, 고체 지지체(38')로부터 서열분석 준비된 핵산 단편의 방출은 임의의 적합한 기술(예를 들어, 절단제 및 자극, 가열 등)을 사용하여 DNA 라이브러리 제조 채널(54)에서 시작될 수 있다. 고체 지지체(38')는 DNA 라이브러리 제조 채널(54)의 제조 포획 부위에 부착된 채로 남아 있을 수 있으며, 따라서 방출된 서열분석 준비된 핵산 단편은 DNA 라이브러리 제조 채널(54)에서 농축 채널(18)로 수송될 수 있다.
농축 채널(18)에 도입되기 전에, 단일 가닥 서열분석 준비된 핵산 단편은 각 말단에서 어댑터에 부착된 차단제를 가질 수 있다. 차단제는 어댑터-대-프라이머 혼성화를 줄이기 위해 선택될 수 있다. 이와 같이, 차단제는 유동 셀 프라이머(30, 30')에 대한 서열분석 준비된 핵산 단편의 혼성화를 적어도 감소시킬 수 있다. 일례에서, 차단제는 Integrated DNA Technologies에서 입수할 수 있는 XGEN® Universal Blockers이다.
도 5는 농축 포획 부위(32)에 고정화된 표적 포획 비드(36)를 갖는 농축 채널(18)에 말단 차단된 서열분석-준비 핵산 단편(66, 66')의 도입을 개략적으로 도시한다. 말단 차단된 서열분석 준비된 핵산 단편(66') 중 일부는 표적 라이브러리 단편을 포함하는 반면, 말단 차단된 서열분석 준비된 핵산 단편(66)의 다른 부분은 비-표적 라이브러리 단편(예를 들어, 특정 분석에 관심이 없는 DNA 샘플의 단편)을 포함한다. 포획 프로브(40)는 표적 라이브러리 단편 말단 차단된 서열분석-준비 핵산 단편(66')에 상보적인 서열을 갖기 때문에, 말단 차단된 서열분석 준비 핵산 단편(66') 중 적어도 일부는 각각 포획 프로브(40)에 혼성화한다. 대조적으로, 다른 말단 차단된 서열분석 준비된 핵산 단편(66)은 비-표적 라이브러리 단편의 서열이 포획 프로브(40)에 상보적이지 않기 때문에 포획 프로브(40)에 혼성화하지 않을 것이다. 또한, 차단제는 말단 차단된 서열분석 준비된 핵산 단편(66, 66')이 유동 셀 프라이머(30)에 혼성화되는 것을 방지할 수 있다.
말단 차단된 서열분석 준비된 핵산 단편(66, 66')은 표적 라이브러리 단편과 포획 프로브(40) 사이에 혼성화가 일어나도록 하는 시간 및 온도에서 농축 채널(18)에서 인큐베이션되도록 할 수 있다. 인큐베이션 시간은 약 5분 내지 약 2시간의 범위일 수 있다. 예에서, 인큐베이션 시간은 약 1.5시간이다. 인큐베이션 온도는 약 50℃ 내지 약 55℃의 범위일 수 있다. 예에서, 인큐베이션 온도는 약 50℃이다.
일부 예에서, 크라우딩 시약은 서열분석 준비된 핵산 단편(66, 66')와 함께 도입될 수 있다. 크라우딩 시약의 예는 덱스트란 설페이트 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 이러한 크라우딩 시약은 서열분석 준비된 핵산 단편(66, 66')을 표적 포획 비드(36)로 크라우딩하는 데 도움이 될 수 있다.
다른 예에서, 전기장은 서열분석 준비된 핵산 단편(66, 66')의 인큐베이션 동안 농축 채널(18)에 적용될 수 있다. 전기장은 유동 셀(10, 10')에 통합된 전극을 사용하거나 외부 전극을 사용하여 인가될 수 있다. 전기장은 서열분석 준비된 핵산 단편(66, 66')을 표적 포획 비드(36)로 이동시키는 데 도움이 될 수 있다.
또 다른 예에서, 방법은 인큐베이션 동안 서열분석 준비된 핵산 단편(66, 66')을 포함하는 유체의 이동을 유도하는 단계를 포함할 수 있다. 일례에서, 농축 채널(18)은 브러시, 기둥 또는 유체 움직임을 용이하게 할 수 있는 표면 상의 기타 3차원 구조를 포함할 수 있다.
또 다른 예에서, 전기영동은 농축 채널(18)에서 서열분석 준비된 핵산 단편(66, 66')을 사전 농축하는 데 사용될 수 있다. 일례에서, 등속전기이동 (ITP)는 혼성화 속도를 높이는 데 사용될 수 있다. ITP는 서열분석 준비된 핵산 단편(66, 66')을 좁은 대역 폭, 예를 들어 ITP를 사용한 농도보다 1000배 더 높은 농도로 농축하는 데 사용할 수 있다. 이것은 혼성화 동역학을 상당히 유도할 것이고, 따라서 혼성화 시간(예를 들어, 약 1.5시간 내지 약 15분)을 유도할 것이다.
서열분석 준비된 핵산 단편(66')의 혼성화 효율을 증가시키기 위한 다른 공지된 방법(예를 들어, 완충액 조건 조정, 높은 표면 음전하 조건 등)이 또한 사용될 수 있다.
방법의 모든 예는 농축 채널(18)에서 말단 차단된 서열분석 준비된 핵산 단편(66)을 세척하는 것을 포함할 수 있다. 세척은 농축 채널(18)에 세척 유체를 도입하는 것을 수반할 수 있다. 흐름은 농축 채널(18)의 배출구 포트를 통해 포획 프로브(40)에 혼성화되지 않은 임의의 단편(66 또는 66 및 66')을 밀어낼 수 있다. 말단 차단된 서열분석 준비된 핵산 단편(66')과 표적 포획 비드(36)의 포획 프로브(40) 사이의 고정화 메커니즘(예를 들어, 혼성화)은 임의의 고정화 말단 차단 서열분석 준비된 핵산 단편(66')이 배출구 흐름의 일부가 되는 것을 방지할 수 있다.
본 명세서에 개시된 농축 방법 전반에 걸쳐, 유량(들) 및/또는 온도(들)는 i) 포획 프로브(40)-표적 라이브러리 단편 혼성화 효율 및 ii) 비-표적 라이브러리 단편을 포함하는 단편(66)의 결합을 최소화하기 위한 세척 과정을 향상시키기 위해 프로그래밍될 수 있다.
라이브러리 단편 방출 및 서열분석
고정화된 말단 차단된 서열분석 준비된 핵산 단편(66')은 포획 프로브(40)로부터 변성될 수 있다. 변성은 씨딩 시약(예를 들어, 염 완충액) 및 적절한 변성 온도에서 달성될 수 있다. 변성 온도는 사용되는 씨딩 시약에 따라 약 70℃ 내지 약 92℃ 범위일 수 있다. 예에서, 변성 온도는 약 92℃이다. 변성 온도는 차단제를 제거하는 데 필요한 온도보다 높을 수 있다. 이와 같이, 변성은 차단제를 제거할 수 있으며 추가 제거 과정이 이용되지 않는다. 또한, 말단 차단된 서열분석 준비된 핵산 단편(66')이 농축 채널(18)에서 방출되기 때문에, 방출된 단편(66')의 손실이 최소화되거나 전혀 없다. 따라서, 농축 후 PCR은 이용되지 않는다.
용리된 단편(66')(각각 표적 라이브러리 단편을 포함함)은 서열분석 표면(들)(12, 12' 또는 14, 14')에 걸쳐 씨딩된다. 씨딩은 단편(66')의 어댑터/태그의 서열과 프라이머(30, 30') 중 상보적인 서열 간의 혼성화를 통해 달성된다. 씨딩은 단편(66') 및 프라이머(들)(30, 30')에 적합한 혼성화 온도에서 수행될 수 있다.
유동 셀(10) 내에서 서열분석 준비된 핵산 단편(66')이 씨딩되는 위치는 부분적으로 프라이머(30, 30')가 부착되는 방식에 따라 다르다. 비-패턴화된 서열분석 표면(12, 12')을 갖는 유동 셀(10)의 예에서, 방출된 서열분석 준비된 핵산 단편(66')은 오목 영역(26, 26')에서 중합체성 하이드로겔(28, 28')을 가로질러 씨딩될 것이다. 패턴화된 서열분석 표면(14, 14')을 갖는 유동 셀(10)의 예에서, 방출된 서열분석 준비된 핵산 단편(66')은 각각의 함몰부(42, 42') 내의 중합체성 하이드로겔(28, 28')을 가로질러 씨딩될 것이다.
표적 포획 비드(36)의 고체 지지체(38)는 이후 농축 채널(18)로부터 제거될 수 있다. 고체 지지체(38)의 제거는 표적 포획 비드(36)를 농축 포획 부위(32, 32')에 부착하는데 사용되는 메커니즘에 의존하는 임의의 적절한 기술을 포함할 수 있다. 예를 들어, 변성, 결합 절단 등이 사용될 수 있다.
그 다음, 씨딩된 서열분석 준비된 핵산 단편(66')은 클러스터 생성을 사용하여 증폭될 수 있다.
클러스터 생성의 예에서, 서열분석 준비된 핵산 단편(66')은 고충실도 DNA 중합효소를 사용하여 혼성화된 프라이머(30, 30')에서 3' 확장으로 카피된다. 원래의 서열분석 준비된 핵산 단편(66')은 변성되어, 카피가 서열분석 표면(12, 12' 또는 14, 14')에 고정화된 상태로 남는다. 카피는 표적 라이브러리 단편의 서열을 포함한다. 등온 브릿지 증폭 또는 다른 형태의 증폭은 고정화된 카피를 증폭하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 카피된 템플릿은 인접한 상보적인 프라이머(30, 30')에 혼성화하기 위해 루프를 만들고, 중합효소는 카피된 템플릿을 카피하여 이중 가닥 브릿지를 형성하고, 이는 변성되어 두 개의 단일 가닥 가닥을 형성한다. 이 2개의 가닥은 반복되어 인접하고 상보적인 프라이머(30, 30')에 혼성화되고 다시 확장되어 두 개의 새로운 이중 가닥 루프를 형성한다. 조밀한 클론 클러스터를 생성하기 위해 등온 변성 및 증폭 주기에 의해 각 템플릿 카피에서 프로세스가 반복된다. 이중 가닥 브릿지의 각 클러스터는 변성된다. 예에서, 역방향 가닥은 특이적 염기 절단에 의해 제거되어 정방향 템플릿 폴리뉴클레오타이드 가닥(표적 라이브러리 단편의 서열을 가짐)을 남긴다. 클러스터링은 서열분석 표면(들)(12, 12' 또는 14, 14')를 따라 여러 템플릿 폴리뉴클레오타이드 가닥을 형성한다. 클러스터링의 이 예는 등온 브릿지 증폭이며 수행될 수 있는 증폭의 한 예이다. 배제 증폭(Examp) 작업흐름(lllumina Inc.)와 같은 다른 증폭 기술이 사용될 수 있음을 이해해야 한다.
템플릿 폴리뉴클레오타이드 가닥의 상보적 서열에 혼성화하는 서열분석 프라이머가 도입될 수 있다. 이 서열분석 프라이머는 템플릿 폴리뉴클레오타이드 가닥을 서열분석할 준비가 되도록 한다. 템플릿의 3'-말단 및 유동 셀 결합 프라이머(30, 30') (카피에 부착되지 않음)은 서열분석 반응의 간섭을 방지하고 특히 바람직하지 않은 프라이밍을 방지하기 위해 차단될 수 있다.
서열분석을 시작하기 위해 통합 믹스가 농축 채널(18)에 추가될 수 있다. 일례에서, 혼입 혼합물은 액체 담체, 중합효소, 및 형광 표지된 뉴클레오타이드를 포함한다. 형광 표지된 뉴클레오타이드는 3' OH 차단 기를 포함할 수 있다. 통합 믹스가 농축 채널(18)에 도입되면 유체는 채널(18)로 들어가고 일부 예에서는 함몰부(42, 42')(템플릿 폴리뉴클레오타이드 가닥이 존재하는 곳)로 들어간다.
형광 표지된 뉴클레오타이드는 서열분석 프라이머에 첨가된 뉴클레오타이드의 순서 및 유형의 검출이 템플릿의 서열을 결정하는 데 사용될 수 있도록 템플릿 의존적 방식으로 서열분석 프라이머에 첨가된다(따라서 서열분석 프라이머를 확장함). 보다 구체적으로, 뉴클레오타이드 중 하나는 각각의 중합효소에 의해 서열분석 프라이머를 확장하고 템플릿 폴리뉴클레오타이드 가닥에 상보적인 초기 가닥 내로 혼입된다. 다시 말해서, 농축 채널(18)을 가로지르는 템플릿 폴리뉴클레오타이드 가닥의 적어도 일부에서, 각각의 중합효소는 통합 믹스의 뉴클레오타이드 중 하나에 의해 혼성화된 서열분석 프라이머를 확장한다.
뉴클레오타이드의 혼입은 이미징 이벤트를 통해 검출될 수 있다. 이미징 이벤트 동안, 조명 시스템(도시되지 않음)은 여기 광을 각각의 서열분석 표면(12, 12' 또는 14, 14')에 제공할 수 있다.
일부 예에서, 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드는 서열분석 프라이머에 추가되면 추가 프라이머 확장을 종결시키는 가역적 종결 특성(예를 들어, 3' OH 차단 기)을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 가역적 종결자 모이어티를 갖는 뉴클레오타이드 유사체를 서열분석 프라이머에 첨가하여, 탈블록킹제가 모이어티를 제거하기 위해 전달될 때까지 후속 확장이 일어날 수 없도록 할 수 있다. 따라서, 가역적 종결을 사용하는 예의 경우, 탈블록킹화 시약은 검출이 발생한 후 농축 채널(18)로 전달될 수 있다.
세척(들)은 다양한 유체 전달 단계 사이에 발생할 수 있다. 그런 다음 SBS 주기를 n번 반복하여 서열분석 프라이머를 n개의 뉴클레오타이드만큼 확장함으로써 길이가 n인 서열을 검출할 수 있다.
일부 예에서, 정방향 가닥은 서열분석되고 제거될 수 있고, 그 다음 역방향 가닥은 본원에 기재된 바와 같이 구축되고 서열분석될 수 있다.
SBS가 자세히 설명되었지만, 본원에 기재된 유동 셀(10, 10')은 유전자형분석을 위해 또는 다른 화학적 및/또는 생물학적 적용을 위해 다른 서열분석 프로토콜과 함께 이용될 수 있음을 이해해야 한다.
키트
본 명세서에 개시된 일부 예는 키트이다. 키트는 본 명세서에 개시된 온-플로우 셀 표적 농축을 수행하는 데 사용될 수 있다.
키트의 한 예는 하기를 포함한다: 라이브러리 제조 비드를 포함하는 라이브러리 제조 유체로서, 각각의 라이브러리 제조 비드는 제1 고체 지지체(38'); 및 제1 고체 지지체(38')에 부착된 트랜스포솜(44)을 포함하는 라이브러리 제조 유체; 게놈 데옥시리보핵산 서열을 포함하는 샘플 유체; 및 표적 포획 비드(36)를 포함하는 농축 유체로서, 각각의 표적 포획 비드(36)는 제2 고체 지지체(38); 및 제2 고체 지지체(38)에 부착된 포획 프로브(40)를 포함하고, 각각의 포획 프로브(40)는 샘플 유체에서 게놈 데옥시리보핵산의 표적화 영역에 상보적인 단일 가닥 데옥시리보핵산 서열을 포함하는 농축 유체.
이 예시적인 키트에서, 제1 고체 지지체(38') 및 제2 고체 지지체(38)는 자기 반응성 물질, 유리, 폴리머 및 금속으로 구성된 그룹에서 개별적으로 선택된다.
이 예시적인 키트에서, 포획 프로브(40)는 결합 쌍을 통해 제2 고체 지지체(38)에 부착될 수 있다. 본 명세서에 개시된 임의의 결합 쌍이 사용될 수 있다.
이 키트의 일부 예는 데옥시리보핵산 서열을 차단하는 것을 포함하는 차단 유체도 포함된다. 차단 유체는 유동 셀(10, 10')의 농축 채널(18) 내로 도입되기 전에 서열분석 준비된 핵산 단편(66, 66')을 차단하는 데 사용될 수 있다.
키트의 또 다른 예는 하기를 포함한다: RNA에서 cDNA로의 전환 하위-키트; 및 표적 포획 비드(36)를 포함하는 농축 유체로서, 각각의 표적 포획 비드(36)는 고체 지지체(38) 및 고체 지지체(38)에 부착된 포획 프로브(40)를 포함하고, 각각의 포획 프로브(40)는 RNA에서 cDNA로의 전환 하위-키트를 사용하여 생성된 cDNA의 표적화 영역에 상보적인 단일 가닥 데옥시리보핵산 서열을 포함하는 농축 유체.
이 예시적인 키트는 또한 라이브러리 제조 비드를 포함하는 라이브러리 제조 유체를 포함할 수 있으며, 각 라이브러리 제조 비드는 제1 고체 지지체(38') 및 제1 고체 지지체(38')에 부착된 트랜스포솜(44)을 포함한다.
이 예시적인 키트에서, 포획 프로브(40)는 결합 쌍을 통해 고체 지지체(38)에 부착될 수 있다. 본 명세서에 개시된 임의의 결합 쌍이 사용될 수 있다.
본 개시내용을 추가로 예시하기 위해, 예가 본 명세서에 제공된다. 이들 예는 예시의 목적으로 제공되며 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다.
비제한적인 작업 예
실시예 1
이 실시예에서, 비교 농축 방법 및 예시적인 농축이 수행되었다.
PhiX 게놈의 표적 영역을 선택하고 표적 영역에 상보적인 서열을 갖는 단일 가닥 포획 프로브를 제조하였다. 표적 영역은 게놈 좌표 3194를 포함하고, 포획 프로브 크기는 69개 뉴클레오타이드였다. 포획 프로브는 하나의 말단에서 바이오틴화되었다.
NEXTERATM PhiX 라이브러리(lllumina Inc.)를 준비하고 차단제(Integrated DNA Technologies)를 라이브러리에 추가하였다. 차단된 라이브러리의 최종 농도는 약 2pM이었다. 이 라이브러리는 두 개의 튜브로 분할되었다.
비교 농축 방법의 경우, 바이오티닐화된 포획 프로브(0.02 μM/1.5 μL/총 1.8E+10 프로브)를 튜브 중 하나에서 라이브러리 단편과 함께 약 1.5시간 동안 인큐베이션하여 표적화 영역 및 바이오티닐화된 포획 프로브를 포함하는 라이브러리 단편 간의 혼성화를 허용하였다. 그런 다음 튜브 내용물을 스트렙타비딘 비드(M280, 6E+06 비드)에 노출시켰고, 혼성화된 프로브/단편은 포획 프로브의 바이오틴 표지를 통해 비드에 결합되었다. 그런 다음 비드(포획된 라이브러리 단편 포함)를 자기력을 사용하여 포획되지 않은 라이브러리 단편으로부터 분리하였다. 그런 다음, 비드(포획된 혼성화된 프로브/단편 포함)를 알킨 PEG-바이오틴 및 P5/P7 프라이머로 기능화된 비패턴화된 유동 셀에 로딩하였다. 비드(포획된 혼성화된 프로브/단편 포함)를 비드 상의 유리 스트렙타비딘 부위를 통해 알킨 PEG-바이오틴 부위에 고정시켰다. 라이브러리 단편을 약 2분 동안 약 92℃에서 나트륨 도데실 설페이트와 함께 염수 시트르산나트륨 완충액에서 비드로부터 용리시킨 다음, 씨딩을 위해 온도를 약 5분 동안 약 40℃로 떨어뜨렸다.
예시적인 농축 방법의 경우, 바이오티닐화된 포획 프로브(0.02 μM/1.5 μL/총 1.8E+10 프로브)를 스트렙타비딘 비드(M280, 6E+06 비드)와 함께 약 1시간 동안 인큐베이션하였다. 바이오티닐화된 포획 프로브는 바이오틴 표지를 통해 비드에 결합되었다. 그런 다음 비드(포획된 바이오티닐화된 포획 프로브 포함)를 알킨 PEG-바이오틴 및 P5/P7 프라이머로 기능화된 비패턴화된 유동 셀에 로딩하였다. 비드(포획된 바이오티닐화된 포획 프로브 포함)를 비드 상의 유리 스트렙타비딘 부위를 통해 알킨 PEG-바이오틴 부위에 고정시켰다. 다른 튜브의 라이브러리 단편을 유동 셀에 로딩하고 약 1.5시간 동안 인큐베이션하여 표적화 영역을 포함하는 라이브러리 단편과 비드 표면 상의 바이오티닐화된 포획 프로브 사이의 혼성화를 허용하였다. 결합되지 않은 라이브러리 단편을 제거하기 위해 세척 과정을 수행하였다. 결합된 라이브러리 단편을 약 2분 동안 약 92℃에서 나트륨 도데실 설페이트와 함께 염수 시트르산나트륨 완충액에서 비드로부터 용리시킨 다음, 씨딩을 위해 온도를 약 5분 동안 약 40℃로 떨어뜨렸다.
비교 및 실시예 방법 모두에서, 유동 셀을 세척하여 비드를 제거하였다.
비교 및 실시예 방법 모두에서, 등온 증폭을 사용하여 클러스터링을 수행한 다음, 서열분석을 수행하였다. 비교 방법과 예시적인 방법 모두 PhiX 게놈의 표적 영역에서 매우 많은 수의 판독 결과를 얻었다(라이브러리 크기에 따라 정의된 +/-500 bp 윈도우 내에서 95% 판독).
도 6은 비교 농축 방법이 사용될 때 유동 셀 표면 및 예시적인 농축 방법이 사용되었을 때 유동 셀 표면에서 클러스터링된 표적 라이브러리 단편의 상대적 적용범위 플롯을 도시한다. 상대 적용범위 플롯은 유전자 좌표에 대한 유전자좌(%, Y 축)에서의 상대 판독 깊이이다. 상대 적용범위 플롯은 포획 프로브는 비교 방법 및 예시 방법 모두에서 표적화 영역을 포함하는 라이브러리 단편을 효과적으로 혼성화함을 나타낸다. 예시적인 방법은 작업 흐름을 단순화하고(비교 방법에 비해) 목표 농축도 달성한다.
실시예 2
이 예에서, 표적 영역은 TRUSIGHTTM Tumor 170 패널(lllumina Inc.로부터)에서 유래하였다. 표적 영역에 상보적인 서열을 갖는 단일 가닥 포획 프로브를 제조하였다. 포획 프로브는 하나의 말단에서 바이오틴화되었다.
바이오티닐화된 포획 프로브를 스트렙타비딘 비드(M280)와 함께 약 1시간 동안 인큐베이션하여 약 3.13E+05 포획 프로브/비드의 프로브 밀도를 달성하였다. 바이오티닐화된 포획 프로브는 바이오틴 표지를 통해 비드에 결합되었다. 그런 다음 비드(포획된 바이오티닐화된 포획 프로브 포함)를 알킨 PEG-바이오틴 및 P5/P7 프라이머로 기능화된 비패턴화된 유동 셀에 로딩하였다. 비드(포획된 바이오티닐화된 포획 프로브 포함)를 비드 상의 유리 스트렙타비딘 부위를 통해 알킨 PEG-바이오틴 부위에 고정시켰다.
NEXTERATM Flex 라이브러리 제조 키트(lllumina Inc.)를 Human-NA 12878 샘플(Coriell Life Sciences로부터)과 함께 사용하여 라이브러리를 제조하고 차단제(Integrated DNA Technologies로부터)를 라이브러리에 추가하였다. 라이브러리 단편을 유동 셀에 로딩하고 약 50℃에서 약 2시간 동안 인큐베이션하여 표적화 영역을 포함하는 라이브러리 단편과 고정된 비드 표면 상의 바이오티닐화된 포획 프로브 사이의 혼성화를 허용하였다.
결합되지 않은 라이브러리 단편을 제거하기 위해 세척 과정을 수행하였다. 결합된 라이브러리 단편을 약 2분 동안 약 92℃에서 나트륨 도데실 설페이트와 함께 염수 시트르산나트륨 완충액에서 비드로부터 용리시킨 다음, 씨딩을 위해 온도를 약 5분 동안 약 40℃로 떨어뜨렸다.
유동 셀을 세척하여 비드를 제거하고, 등온 증폭을 사용하여 클러스터링을 수행하였다. 그런 다음 서열분석을 수행하고 서열분석 판독을 수득하였다. 표적 클러스터 수는 판독 수를 2로 나누어 결정되었다. 농축 계수는 표적 영역에 정렬된 총 판독의 백분율을 결정하여 결정되었다. 이러한 결과는 샘플 단일 라이브러리 전달 하에 표 1에 도시된다.
라이브러리 단편을 회전 밸브를 사용하여 2개의 셔틀로 유동 셀 상에 로딩하고, 각각의 셔틀을 약 50℃에서 약 2시간 동안 인큐베이션하여 표적 영역을 포함하는 라이브러리 단편과 고정화된 비드의 표면 상의 바이오티닐화된 포획 프로브 사이의 혼성화를 허용하는 것을 제외하고는, 상기 방법을 반복하였다. 약 50℃에서 세척은 각 셔틀 전달과 혼성화 사이에 수행되었다.
라이브러리 단편을 약 2분 동안 92℃에서 나트륨 도데실 설페이트와 함께 염수 시트르산나트륨 완충액에서 비드로부터 용리시킨 다음, 씨딩을 위해 온도를 약 5분 동안 약 40℃로 떨어뜨렸다.
유동 셀을 세척하여 비드를 제거하고, 등온 증폭을 사용하여 클러스터링을 수행하였다. 그런 다음 서열분석을 수행하고 서열분석 판독을 수득하였다. 표적 클러스터 수 및 농축 계수가 결정되었다. 이러한 결과는 샘플 다중 라이브러리 전달 하에 표 1에 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00007
표 1에 나타난 바와 같이, 두 방법 모두 표적화 영역에서 원하는 수의 클러스터를 생성했지만, 다중 전달 방법은 농축 계수를 증가시켰다.
실시예 3
이 예에서, 표적 영역은 TRUSIGHTTM Tumor 170 패널(lllumina Inc.로부터)에서 유래하였다. 표적 영역에 상보적인 서열을 갖는 단일 가닥 포획 프로브를 제조하였다. 포획 프로브는 하나의 말단에서 바이오틴화되었다.
비오티닐화된 포획 프로브를 각각 스트렙타비딘 비드(M280)와 함께 약 1시간 동안 인큐베이션하여 상이한 프로브 밀도를 갖는 3개의 상이한 샘플을 달성하였다 - 샘플 1 = 약 5.78E+04 포획 프로브/비드, 샘플 2 = 약 2.98E+05 포획 프로브/비드 및 샘플 3 = 약 1.16E+06 포획 프로브/비드. 각 샘플에 대해, 바이오티닐화된 포획 프로브는 바이오틴 라벨을 통해 비드에 결합되었다. 비드 샘플(포획된 바이오티닐화된 포획 프로브 포함)은 알킨 PEG-바이오틴 및 P5/P7 프라이머로 기능화된 3개의 상이한 비패턴화된 유동 셀에 각각 로딩되었다. 각 샘플에 대해, 비드(포획된 바이오티닐화된 포획 프로브 포함)를 비드 상의 유리 스트렙타비딘 부위를 통해 알킨 PEG-바이오틴 부위에 고정시켰다.
NEXTERATM Flex 라이브러리 제조 키트(lllumina Inc.)를 Human-NA 12878 샘플(Coriell Life Sciences로부터)과 함께 사용하여 라이브러리를 제조하고 차단제(Integrated DNA Technologies로부터)를 라이브러리에 추가하였다. 라이브러리 단편을 상이한 유동 셀에 로딩하고 약 50℃에서 약 2시간 동안 인큐베이션하여 표적화 영역을 포함하는 라이브러리 단편과 고정된 비드 표면 상의 바이오티닐화된 포획 프로브 사이의 혼성화를 허용하였다.
결합되지 않은 라이브러리 단편을 제거하기 위해 세척 과정을 수행하였다. 결합된 라이브러리 단편을 약 2분 동안 약 92℃에서 나트륨 도데실 설페이트와 함께 염수 시트르산나트륨 완충액에서 비드로부터 용리시킨 다음, 씨딩을 위해 온도를 약 5분 동안 약 40℃로 떨어뜨렸다.
유동 셀을 세척하여 비드를 제거하고, 등온 증폭을 사용하여 클러스터링을 수행하였다. 그런 다음 서열분석을 수행하고 서열분석 판독을 수득하였다. 표적 클러스터 수는 판독 수를 2로 나누어 결정되었다.
각 샘플에 대한 클러스터 수는 도 7에 도시된다. 도시된 바와 같이, 비드 상의 프로브 밀도가 증가될 때 표적 영역을 갖는 더 많은 라이브러리 단편이 농축되었다.
추가 참고 사항
또한, 본 명세서에 제공된 범위는 명시된 범위 및 명시된 범위 내의 임의의 값 또는 하위범위를, 이들이 명백하게 인용된 것처럼 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 약 2㎜ 내지 약 300㎜로 표현되는 범위는 약 2㎜ 내지 약 300㎜의 명시적으로 언급된 한계뿐만 아니라 약 15㎜, 22.5㎜, 245㎜ 등과 같은 개별 값, 및 약 20㎜ 내지 약 225㎜ 등과 같은 하위 범위를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
하기에 보다 상세히 논의되는 상기 개념 및 추가의 개념의 모든 조합 (단, 이러한 개념은 상호 불일치하지 않음)이 본 명세서에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려된다는 것을 인지해야 한다. 특히, 본 개시내용의 마지막에 나타나는 청구된 주제의 모든 조합은 본 명세서에 개시된 본 발명의 주제의 일부인 것으로 고려된다. 또한, 본원에 참조로 포함된 임의의 개시내용에서 또한 나타날 수 있는 본원에 명시적으로 사용된 용어는 본 명세서에 개시된 특정 개념과 가장 일치하는 의미를 부여해야 한다는 것을 인지해야 한다.
여러 예가 상세하게 설명되었지만, 개시된 예는 수정될 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 전술한 설명은 비제한적인 것으로 간주되어야 한다.

Claims (27)

  1. 키트로서,
    라이브러리 제조 비드를 포함하는 라이브러리 제조 유체로서, 각 라이브러리 제조 비드는,
    제1 고체 지지체; 및
    제1 고체 지지체에 부착된 트랜스포솜
    을 포함하는, 상기 라이브러리 제조 유체;
    게놈 데옥시리보핵산 서열을 포함하는 샘플 유체; 및
    표적 포획 비드를 포함하는 농축(enrichment) 유체
    를 포함하되, 각 표적 포획 비드는
    제2 고체 지지체; 및
    제2 고체 지지체에 부착된 포획 프로브
    를 포함하고, 각각의 포획 프로브는 샘플 유체에서 게놈 데옥시리보핵산의 표적화 영역에 상보적인 단일 가닥 데옥시리보핵산 서열을 포함하는, 키트.
  2. 제1항에 있어서, 제1 고체 지지체 및 상기 제2 고체 지지체는 자기 반응성 물질, 유리, 폴리머 및 금속으로 이루어진 군에서 개별적으로 선택되는, 키트.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 포획 프로브는 결합 쌍을 통해 상기 제2 고체 지지체에 부착되는, 키트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 차단 데옥시리보핵산 서열을 포함하는 차단 유체를 추가로 포함하는, 키트.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 포획 비드의 프로브 밀도는 고체 지지체당 약 2*105 개의 포획 프로브 내지 고체 지지체당 약 5*106 개의 포획 프로브 범위인, 키트.
  6. 키트로서,
    RNA에서 cDNA로의 전환 하위-키트; 및
    표적 포획 비드를 포함하는 농축 유체
    를 포함하되, 각각의 표적 포획 비드는,
    고체 지지체; 및
    고체 지지체에 부착된 포획 프로브
    를 포함하고, 각각의 포획 프로브는 RNA에서 cDNA로의 전환 하위-키트를 사용하여 생성된 cDNA의 표적화 영역에 상보적인 단일 가닥 데옥시리보핵산 서열을 포함하는, 키트.
  7. 제6항에 있어서, 포획 프로브는 결합 쌍을 통해 상기 고체 지지체에 부착되는, 키트.
  8. 시스템으로서:
    기질;
    기질 상의 제1 영역에 마련된 제조 채널로서, 라이브러리 제조 비드를 고정하기 위한 제조 포획 부위를 포함하는, 상기 제조 채널;
    제조 채널의 하류의 기판 상의 제2 영역에 마련된 농축 채널로서,
    증폭 프라이머; 및
    표적 포획 비드를 고정시키기 위한 농축 포획 부위
    를 포함하는, 상기 농축 채널; 및
    제조 채널과 농축 채널을 선택적으로 그리고 유체적으로 연결하는 수송 채널
    을 포함하는, 시스템.
  9. 제8항에 있어서, 제조 채널은 증폭 프라이머를 포함하지 않는, 시스템.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 기판에 부착된 제2 기판을 추가로 포함하고, 상기 제2 기판은
    제2 제조 포획 부위를 포함하는 제2 제조 채널; 및
    제2 증폭 프라이머 및 제2 농축 포획 부위를 포함하는 제2 농축 채널
    을 포함하는, 시스템.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 농축 채널과 선택적 유체 연통하는 유동 셀 시약 시스템을 추가로 포함하는, 시스템.
  12. 제11항에 있어서, 시약 시스템은,
    저장소; 및
    저장소에 포함된 농축 유체
    를 포함하되, 상기 농축 유체는 표적 포획 비드를 포함하고, 각각의 표적 포획 비드는,
    고체 지지체; 및
    고체 지지체에 부착된 포획 프로브
    를 포함하고, 각각의 포획 프로브는 게놈 데옥시리보핵산 또는 상보적 데옥시리보핵산의 표적화 영역에 상보적인 단일 가닥 데옥시리보핵산 서열을 포함하는, 시스템.
  13. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 농축 포획 부위에 고정화된 표적 포획 비드를 추가로 포함하고, 각각의 표적 포획 비드는,
    고체 지지체; 및
    고체 지지체에 부착된 포획 프로브
    를 포함하고, 각각의 포획 프로브는 게놈 데옥시리보핵산 또는 상보적 데옥시리보핵산의 표적화 영역에 상보적인 단일 가닥 데옥시리보핵산 서열을 포함하는, 시스템.
  14. 제13항에 있어서, 농축 포획 부위는 결합 쌍의 제1 구성원을 포함하고, 고체 지지체는 결합 쌍의 제2 구성원으로 코팅되는, 시스템.
  15. 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 농축 채널은 간극 영역에 의해 분리된 함몰부를 포함하고, 증폭 프라이머 및 농축 포획 부위는 각각의 함몰부 내에 위치하는, 시스템.
  16. 유동 셀로서,
    두 표면 사이에 마련된 농축 채널을 포함하되, 상기 농축 채널은,
    2개의 표면 중 적어도 하나에 부착된 증폭 프라이머; 및
    2개의 표면 중 적어도 하나에 고정화된 표적 포획 비드
    를 포함하고, 각각의 표적 포획 비드는,
    고체 지지체; 및
    고체 지지체에 부착된 포획 프로브
    를 포함하고, 각각의 포획 프로브는 게놈 데옥시리보핵산 또는 상보적 데옥시리보핵산의 표적화 영역에 상보적인 단일 가닥 핵산 서열을 포함하는, 유동 셀.
  17. 제16항에 있어서, 포획 프로브는 결합 쌍을 통해 고체 지지체에 부착되는, 유동 셀.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 2개의 표면 각각은 간극 영역에 의해 분리된 함몰부를 포함하고, 증폭 프라이머 및 표적 포획 비드는 각각의 함몰부 내에 위치하는, 유동 셀.
  19. 방법으로서,
    증폭 프라이머 및 농축 포획 부위를 함유하는 적어도 하나의 표면을 포함하는 농축 채널 내로 표적 포획 비드를 도입함으로써, 표적 포획 비드의 적어도 일부가 농축 포획 부위에 고정되는 단계를 포함하되,
    각각의 표적 포획 비드는
    고체 지지체; 및
    고체 지지체에 부착된 포획 프로브
    를 포함하고, 각각의 포획 프로브는 게놈 데옥시리보핵산 또는 상보적 데옥시리보핵산의 표적화 영역에 상보적인 단일 가닥 핵산 서열을 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 표적 포획 비드를 도입하기 전에,
    각각의 포획 프로브의 말단에 부착된 결합 쌍의 제1 구성원으로 포획 프로브를 합성하는 것; 및
    포획 프로브를 결합 쌍의 제2 구성원으로 코팅되는 고체 지지체와 함께 인큐베이션하는 것
    에 의해서 표적 포획 비드를 제조하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 인큐베이션에 사용되는 혼합물에서 포획 프로브의 농도를 조정하여 표적 포획 비드의 포획 프로브 밀도를 제어하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    게놈 데옥시리보핵산 또는 상보적 데옥시리보핵산으로부터 라이브러리 단편을 제조하는 단계;
    농축 채널에 라이브러리 단편을 도입하는 단계; 및
    미리 결정된 온도에서 농축 채널을 인큐베이션하는 단계
    를 추가로 포함하되, 이로써 표적화 영역을 포함하는 라이브러리 단편 중 적어도 일부가 포획 프로브에 혼성화되는, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 라이브러리 단편을 농축 채널 내로 도입하기 전에 차단 올리고뉴클레오타이드로 라이브러리 단편의 말단을 차단하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 라이브러리 단편과 함께 크라우딩 시약을 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, 인큐베이션 동안 전기장을 인가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  26. 제22항 또는 제23항에 있어서, 인큐베이션 동안 라이브러리 단편을 함유하는 유체의 이동을 유도하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  27. 제22항 또는 제23항에 있어서, 농축 채널에서 라이브러리 단편을 사전 농축하기 위해 전기영동을 사용하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
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