CN110079300B - 纳米磷光探针及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及酶活检测技术领域，尤其涉及纳米磷光探针及其用途。本发明的纳米磷光探针探针利用铱金属配位化合物、金纳米颗粒分别作为能量共振转移的荧光供体和受体，通过一段能被目的蛋白酶特异性识别和降解的多肽底物连接，并产生FRET现象。与传统的线性荧光探针分子相比，在纳米金的搭载下，实现了探针分子的高局部浓度富集，快速入胞等特有的检测优势，大大提升该酶活检测探针在活细胞水平进行实时酶活监测的适应性。

Description

纳米磷光探针及其用途
技术领域
本发明涉及酶活检测技术领域，尤其涉及纳米磷光探针及其用途。
背景技术
蛋白质是生命活动的主要承担者，在新陈代谢和信号转导的过程中扮演着极其重要的角色。酶，是指具有高效催化功能的有机物，大部分是蛋白质，也有少数是具有生物催化功能的RNA分子。蛋白酶可以水解蛋白质或肽链。在哺乳动物细胞内，运作着复杂的信号通路系统，并以此调控各项生命活动的有序进行。信号通路的激活与抑制，都与处于信号转导过程中关键位点的蛋白酶的产生与活化有着密切的关系。因此，特征蛋白酶的激活可以作为多种疾病的发生和发展进程的关键标志，日益成为病程诊断和药物作用机理研究中的关键检测指标。目前，酶活性检测的方法大多局限于体外实验，须先将待测样本提取后在试管中进行活性测定。对于细胞内部的蛋白酶而言，不但无法对其酶活性进行实时的原位检测，样品的提取过程还有可能会对酶活性造成影响。因此，让酶活性检测突破“试管测试”的限制，让检测探针进入细胞，实现在活细胞水平的酶活性可视化实时检测，是新一代蛋白酶活性检测探针设计与研发的重要课题。
在众多酶活性检测方法中，应用的最为广泛的是基于“荧光分子-淬灭剂”组合的酶活性检测磷光探针。此类磷光探针的设计原理主要基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)。具体来说，是通过化学交联的方法，将一个荧光供体和一个适当的淬灭基团连接在蛋白酶专一的酶切底物(含有酶切位点的多肽序列)的两端。根据FRET原理，当发射光谱(供体)和吸收光谱(受体)相互重叠的两个分子在距离相近时(小于10nm)会发生能量转移。如果受体吸收能量后不再发出荧光，则表现为供体荧光强度的减弱，即荧光的淬灭。在特定蛋白酶的作用下，连接荧光分子和淬灭剂的底物多肽被水解并断裂，二者分离，则供体荧光便会再度出现。然而，对于这类酶活性检测探针而言，线性的分子结构通常具有稳定性较差、荧光信号弱等缺陷，这些缺陷是此类传统的探针在活细胞水平上进行酶活性检测的主要限制因素。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供纳米磷光探针及其用途，本发明提供的纳米磷光探针具有良好的分散性和稳定性。
纳米磷光探针，由金纳米球、功能基团、铱金属配合物和末端含有巯基的聚合物组成；
所述功能基团由巯基丙酸和含有酶反应底物的复合物组成；
所述金纳米球与铱金属配合物通过功能基团连接；
其中金纳米球与所述巯基丙酸以金硫键连接；
所述巯基丙酸与含有酶反应底物的复合物以酰胺键连接；
所述含有酶反应底物的复合物与铱金属配合物配位连接；
所述金纳米球与末端含有巯基的聚合物通过金硫键连接。
作为FRET荧光受体，金纳米球的尺寸为15～25nm，具有520nm特征吸收峰，从而与FRET荧光供体铱金属配位化合物分子的磷光发射特征峰重合，发生FRET现象。一些具体实施例中，所述金纳米球的直径为20nm。
所述铱金属配合物组作为FRET的荧光供体，其与所述功能多肽序列的C末端的组氨酸配位连接。本发明中，所述铱金属配合物具有520nm吸收峰。一些具体实施例中，所述铱金属配合物为Bis(2-phenylpyridine-C2,N)-bis(aquo)iridium-(III)trifluoromethanesulfonate。其结构式如式I所示：
Figure BDA0002075101800000021
所述功能基团中，巯基丙酸的作用是功能化，即以巯基丙酸引入功能基团。所述巯基丙酸与含有酶反应底物的复合物以酰胺键连接。含有酶反应底物的复合物由间隔序列1、酶反应底物、间隔序列2组成；所述间隔序列1和间隔序列2为多肽序列，所述酶反应底物为多肽或核酸。
所述间隔序列1用于与巯基丙酸连接，其N端与巯基丙酸中的羧基缩合形成酰胺键。一些具体实施例中，所述间隔序列1的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，即CALNN(Cys-Ala-Leu-Asn-Asn)。所述间隔序列2提供咪唑基团与铱金属配合物配位连接，并利用两个氨基酸间隔酶反应底物和连接区域。具体实施例中，以GG(Gly-Gly)间隔多肽功能区域，目的是让酶反应底物区域与后面用于铱金属配位化合物连接的HH(His-His)区域之间产生一定的空间距离，避免空间位阻产生干扰探针活化；HH为连续两个组氨酸，是供铱金属配位化合物配位结合的，铱金属配位化合物可以通过两个组氨酸的咪唑基团与之配位结合。
本发明中，所述功能多肽中酶反应底物为多肽或核酸。一些实施例中，所述酶反应底物为多肽。所述多肽由2～10个氨基酸残基组成。具体实施例中，所述酶反应底物为蛋白酶体的反应底物，还可以为胰凝乳蛋白酶的反应底物。一个具体实施例中，所述蛋白酶体的酶切底物的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，即LLVY(Leu-Leu-Val-Tyr)。
所述末端含有巯基的聚合物的作用是改善纳米金颗粒在生理溶液中的分散性和稳定性。本发明中，所述末端含有巯基的聚合物为巯基聚乙二醇、巯基聚乳酸、巯基聚醚酰亚胺等具体实施例中，采用的末端含有巯基的聚合物为巯基聚乙二醇，所述聚乙二醇的聚合度为5000。
本发明中，所述功能基团与所述末端含有巯基的聚合物的摩尔比为(1～9.8):(0.2～9)；一些实施例中，所述功能基团与所述末端含有巯基的聚合物的摩尔比为1:9、5:5、9:1、9.8～0.2。当功能基团与所述末端含有巯基的聚合物的摩尔比为9:1时，探针的稳定性较佳且不影响功能的体现。
通过对金球定量以及对其表面多肽定量，每次合成会略有差异，一般所述金纳米球与功能基团的摩尔比为1：(30～40)。一些实施例中，经检测，金纳米球与功能基团的摩尔比为1：36。
本发明所述纳米磷光探针的制备方法，包括：
柠檬酸钠还原法制备金纳米球；
以末端含有巯基的聚合物和巯基丙酸修饰金纳米球，制得中间体A；
EDC/NHS化学交联法连接中间体A和含有酶反应底物的复合物，制得中间体B；
铱金属配合物与中间体B经配位反应，制得所述纳米磷光探针。
所述柠檬酸钠还原法制备金纳米球包括：将25mM的HAuCl4溶液与99倍体积的水混合，回流加热至100℃，加入1.5倍体积1wt％的柠檬酸钠溶液，100℃持续搅拌10min后，结束加热搅拌冷却至室温。
所述中间体A的制备包括：将浓度为0.5mM的聚合物溶液和9倍体积的浓度为0.5mM的MPA溶液混合，加入到纳米金溶液中，搅拌1h后经离心(14800rpm，4℃，10min)，取沉淀用磷酸缓冲液(PBS)清洗3次，制得中间体A。所述聚合物为PEG，聚合度为5000。所述纳米金溶液的体积为聚合物溶液体积的100倍。
所述中间体B的制备包括：在中间体A的溶液中加入浓度为1mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)溶液，反应40min后，再加入浓度为1mg/mL的含有酶反应底物的复合物溶液，37℃继续反应2h，然后0～4℃反应8～12h，所得溶液经离心(14800rpm，4℃，10min)，沉淀以PBS缓冲液清洗3次，制得中间体B。所述中间体A的溶液与EDC溶液的体积比为1000:15；所述中间体A的溶液与Sulfo-NHS溶液的体积比为1000:15；所述中间体A的溶液与酶反应底物溶液的体积比为1000:10。
铱金属配合物与中间体B经配位反应包括：在中间体B的溶液中加入浓度为1mM的铱金属配合物溶液，37℃反应2h后，离心(14800rpm，4℃，10min)，取沉淀以PBS缓冲液清洗3次，制得纳米磷光探针。所述中间体B的溶液与铱金属配合物溶液的体积比为。
本发明提供的纳米磷光探针，通过一段能被待测的酶特异性识别和被进一步降解的底物连接纳米金和铱金属配位化合物，使二者产生荧光共振能量转移(FRET)现象。在检测的过程中，纳米磷光探针中的上述底物被对应的酶特异性识别和降解，FRET荧光供体铱金属配位化合物和FRET荧光受体纳米金之间断裂分离，导致FRET现象消失，则铱金属配位化合物的绿色磷光出现。根据磷光信号的变化情况，可以对待测的液体样品以及活细胞中酶的活性进行定量表征，从而实现简便、快速、准确的酶活检测。
基于本发明提供的纳米磷光探针，其可在中间体A的基础上，连接酶反应底物再与铱金属配合物配位反应制备纳米磷光探针。
本发明还提供了中间体A，其由金纳米球、巯基丙酸和末端含有巯基的聚合物组成；
其中金纳米球与所述巯基丙酸以金硫键连接；
所述金纳米球与末端含有巯基的聚合物通过金硫键连接。
中间体中，所述金纳米球的直径为15～25nm；
作为FRET荧光受体，金纳米球的尺寸为15～25nm，具有520nm特征吸收峰，从而与FRET荧光供体铱金属配位化合物分子的磷光发射特征峰重合，发生FRET现象。一些具体实施例中，所述金纳米球的直径为20nm。
所述末端含有巯基的聚合物的作用是改善纳米金颗粒在生理溶液中的分散性和稳定性。本发明中，所述末端含有巯基的聚合物为巯基聚乙二醇、巯基聚乳酸、巯基聚醚酰亚胺。具体实施例中，采用的末端含有巯基的聚合物为巯基聚乙二醇，所述聚乙二醇的聚合度为5000。
本发明中，所述功能基团与所述末端含有巯基的聚合物的摩尔比为(1～9.8):(0.2～9)；一些实施例中，所述功能基团与所述末端含有巯基的聚合物的摩尔比为1:9、5:5、9:1、9.8～0.2。当功能基团与所述末端含有巯基的聚合物的摩尔比为9:1时，探针的稳定性较佳且不影响功能的体现。
本发明所述中间体A的制备方法，包括：
柠檬酸钠还原法制备金纳米球；
以末端含有巯基的聚合物和巯基丙酸修饰金纳米球，制得中间体A。
所述柠檬酸钠还原法制备金纳米球包括：将25mM的HAuCl4溶液与99倍体积的水混合，回流加热至100℃，加入1.5倍体积1wt％的柠檬酸钠溶液，100℃持续搅拌10min后，结束加热搅拌冷却至室温。
所述中间体A的制备包括：将浓度为0.5mM的聚合物溶液和9倍体积的浓度为0.5mM的MPA溶液混合，加入到纳米金溶液中，搅拌1h后经离心(14800rpm，4℃，10min)，取沉淀用磷酸缓冲液(PBS)清洗3次，制得中间体A。所述聚合物为PEG，聚合度为5000。所述纳米金溶液的体积为聚合物溶液体积的100倍。
本发明所述的探针，其利用铱金属配位化合物、金纳米颗粒分别作为能量共振转移的荧光供体和受体，通过一段能被目的酶特异性识别和降解的底物连接，并产生FRET现象。在检测的过程中，探针中的上述底物被相应的酶特异性识别和降解，FRET荧光供体和受体失去连接，相互分离，FRET现象消失，荧光恢复。根据荧光信号的变化，可以测得样品中对应酶的含量，从而实现目的酶活性的快速检测。
并且，本发明所述的探针，针对不同的酶活性检测具有普遍适用性，即可以通过设计替换底物序列，从而简便快速地获得不同的酶活性检测的纳米磷光探针。同时，与传统的线性荧光探针分子相比，在纳米金的搭载下，实现了探针分子的高局部浓度富集，快速入胞等特有的检测优势，大大提升该酶活检测探针在活细胞水平进行实时酶活监测的适应性。
本发明所述纳米磷光探针或中间体A在制备酶活检测的试剂中的应用。
本发明还提供了一种酶活检测的试剂，其包括本发明所述纳米磷光探针。
相应的，本发明提供了一种酶活检测的方法，其为将本发明所述纳米磷光探针与待测物共同孵育，根据荧光强度判断酶活力。
所述待测物为细胞、生物组织切片，细胞裂解液，或血液、体液样品。所述待测样品为活细胞，所述共同孵育的时间为6h。所述待测样品为生物组织切片，细胞裂解液，或血液、体液样品，则所述共同孵育的时间为2h。
所述荧光强度为波长520nm的荧光强度，所述判断采用标准曲线法。
通过中间体A制备本发明所述纳米磷光探针的过程可根据待测酶来合成。因此，本发明还提供了另一种酶活检测的试剂，其包括中间体A和铱金属配合物。
该试剂中还包括中间体A与酶反应底物的复合物连接的试剂，具体为EDC溶液和Sulfo-NHS溶液。所述EDC溶液的浓度为1mg/mL；所述Sulfo-NHS溶液的浓度为1mg/mL。还包括PBS缓冲液。
所述试剂中还包括间隔序列1、间隔序列2，以及多肽偶联试剂。根据需要制备特异性酶底物后，将间隔序列1、酶底物、间隔序列2连接，制成酶反应底物的复合物。
相应的，本发明提供了一种酶活检测的方法，将中间体A与含有酶反应底物的复合物连接后，再与铱金属配合物配位反应，制得的纳米磷光探针与待测物共同孵育，根据荧光强度判断酶活力。
所述待测物为细胞、生物组织切片，细胞裂解液，或血液、体液样品。所述待测样品为活细胞，所述共同孵育的时间为6h。所述待测样品为生物组织切片，细胞裂解液，或血液、体液样品，则所述共同孵育的时间为2h。
所述荧光强度为波长520nm的荧光强度，所述判断采用标准曲线法。
本发明中，体外检测中，孵育时间相同的情况下，酶浓度不同，探针产生荧光强度不同，因此可以通过标准曲线，来对未知的酶活待检测溶液的活性进行定量。
而对于细胞成像实验，只能根据荧光强度变化的倍数，对细胞在药物作用下发生的蛋白酶体活性变化做一个半定量或者定性的判断。具体荧光强度变化倍数可以通过荧光图像分析软件进行分析。
本发明的纳米磷光探针探针利用铱金属配位化合物、金纳米颗粒分别作为能量共振转移的荧光供体和受体，通过一段能被目的蛋白酶特异性识别和降解的多肽底物连接，并产生FRET现象。在检测的过程中，探针中的上述多肽底物被相应的蛋白酶特异性识别和降解，FRET荧光供体和受体失去连接，相互分离，FRET现象消失，荧光恢复。根据荧光信号的变化，可以测得样品中对应蛋白酶的含量，从而实现目的蛋白酶活性的快速检测。本发明的上述探针，针对不同的酶活性检测具有普遍适用性，即可以通过设计替换多肽底物序列，从而简便快速地获得不同蛋白质酶活性检测的纳米磷光探针。同时，与传统的线性荧光探针分子相比，在纳米金的搭载下，实现了探针分子的高局部浓度富集，快速入胞等特有的检测优势，大大提升该酶活检测探针在活细胞水平进行实时酶活监测的适应性。
附图说明
图1为本发明实施用于检测蛋白酶活性的FRET纳米磷光探针结构示意图；
图2示95μL磷光探针(150μg/mL)与5μL蛋白酶体(500nM)混合孵育，利用酶标仪在不同时间点(0-120分钟)检测混合溶液的荧光光谱变化；
图3示95μL磷光探针(浓度150μg/mL)与5μL不同浓度(381.25-12200U)蛋白酶体混合孵育，利用酶标仪在60分钟检测混合溶液的荧光光谱；
图4示PC12细胞接种于玻璃底共聚焦培养皿内，105个细胞每皿，培养24小时后，实验组去除培养基，换成含有5mM MPP+的新鲜培养基；对照组更换新鲜不含MPP+的培养基，继续孵育6小时后，加入50μL磷光探针(浓度600μg/mL)，孵育1小时后，用共聚焦显微镜进行磷光成像；左：正常PC12细胞，蛋白酶体活性正常，探针活化，可见较强绿色荧光；右：5mM 1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)孵育6小时后的PC12细胞，蛋白酶体活性受到抑制，可见绿色荧光变弱；
图5示不同纳米金表面修饰方案对其在磷酸缓冲液中分散性的影响。
具体实施方式
本发明提供了纳米磷光探针及其用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
制备中间体A：
(1)利用经典的柠檬酸钠还原法合成20nm的金纳米球，具体方法如下：在49.5mLH2O(水)中加入0.5mL，25mM的氯金酸(HAuCl4)溶液，在回流条件下加热至100℃，然后迅速加入0.75mL，1％的柠檬酸钠溶液，整个过程在充分搅拌下进行。持续加热搅拌10min后，溶液变为酒红色，反应结束，撤去热源继续搅拌至溶液温度降至室温。
(2)用巯基聚乙二醇(SH-PEG)和巯基丙酸(MPA)双配体对金纳米球进行表面修饰，具体方法如下：将10μL浓度为0.5mM的SH-PEG和90μL浓度为0.5mM的MPA，加入到1mL的纳米金溶液中，搅拌1h使其充分混合。混合溶液离心(14800rpm，4℃，10min)，弃上清，取沉淀用磷酸缓冲液(PBS)重悬，再次离心并用PBS重悬，如此反复三次后，制得中间体A，储存至4℃备用。
实施例2
制备中间体A：
(1)利用经典的柠檬酸钠还原法合成20nm的金纳米球，具体方法如下：在49.5mLH2O(水)中加入0.5mL，25mM的氯金酸(HAuCl4)溶液，在回流条件下加热至100℃，然后迅速加入0.75mL，1％的柠檬酸钠溶液，整个过程在充分搅拌下进行。持续加热搅拌10min后，溶液变为酒红色，反应结束，撤去热源继续搅拌至溶液温度降至室温。
(2)用巯基聚乙二醇(SH-PEG)和巯基丙酸(MPA)双配体对金纳米球进行表面修饰，具体方法如下：将90μL浓度为0.5mM的SH-PEG和10μL浓度为0.5mM的MPA，加入到1mL的纳米金溶液中，搅拌1h使其充分混合。混合溶液离心(14800rpm，4℃，10min)，弃上清，取沉淀用磷酸缓冲液(PBS)重悬，再次离心并用PBS重悬，如此反复三次后，制得中间体A，储存至4℃备用。
实施例3
制备中间体A：
(1)利用经典的柠檬酸钠还原法合成20nm的金纳米球，具体方法如下：在49.5mLH2O(水)中加入0.5mL，25mM的氯金酸(HAuCl4)溶液，在回流条件下加热至100℃，然后迅速加入0.75mL，1％的柠檬酸钠溶液，整个过程在充分搅拌下进行。持续加热搅拌10min后，溶液变为酒红色，反应结束，撤去热源继续搅拌至溶液温度降至室温。
(2)用巯基聚乙二醇(SH-PEG)和巯基丙酸(MPA)双配体对金纳米球进行表面修饰，具体方法如下：将50μL浓度为0.5mM的SH-PEG和50μL浓度为0.5mM的MPA，加入到1mL的纳米金溶液中，搅拌1h使其充分混合。混合溶液离心(14800rpm，4℃，10min)，弃上清，取沉淀用磷酸缓冲液(PBS)重悬，再次离心并用PBS重悬，如此反复三次后，制得中间体A，储存至4℃备用。
实施例4
制备中间体A：
(1)利用经典的柠檬酸钠还原法合成20nm的金纳米球，具体方法如下：在49.5mLH2O(水)中加入0.5mL，25mM的氯金酸(HAuCl4)溶液，在回流条件下加热至100℃，然后迅速加入0.75mL，1％的柠檬酸钠溶液，整个过程在充分搅拌下进行。持续加热搅拌10min后，溶液变为酒红色，反应结束，撤去热源继续搅拌至溶液温度降至室温。
(2)用巯基聚乙二醇(SH-PEG)和巯基丙酸(MPA)双配体对金纳米球进行表面修饰，具体方法如下：将2μL浓度为0.5mM的SH-PEG和98μL浓度为0.5mM的MPA，加入到1mL的纳米金溶液中，搅拌1h使其充分混合。混合溶液离心(14800rpm，4℃，10min)，弃上清，取沉淀用磷酸缓冲液(PBS)重悬，再次离心并用PBS重悬，如此反复三次后，制得中间体A，储存至4℃备用。
实施例5
制备纳米磷光探针：
(1)纳米金与多肽连接，具体方法如下：在1mL经表面双配体(SH-PEG与MPA)修饰的纳米金溶液(实施例1制备的中间体A溶液)中加入浓度为1mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)各15μL，反应40min后，再加入10μL浓度为1mg/mL的多肽(CALNNLLVYGGHH)，置于37℃下继续反应2h，然后置于4℃冰箱中过夜。将溶液离心(14800rpm，4℃，10min)，弃上清，取沉淀用磷酸缓冲液(PBS)重悬，再次离心并用PBS重悬，如此反复三次后，制得中间体B，储存至4℃备用。
(2)铱金属配位化合物的配位反应，具体方法如下：在1mL经底物序列多肽连接的纳米金溶液中加入浓度为1mM的铱金属配位化合物(Bis(2-phenylpyridine-C2,N)-bis(aquo)iridium-(III)trifluoromethanesulfonate)溶液，置于37℃下继续反应2h，将溶液离心(14800rpm，4℃，10min)，弃上清，取沉淀用磷酸缓冲液(PBS)重悬，再次离心并用PBS重悬，如此反复三次后，制得纳米磷光探针，储存至4℃备用。
实施例6
制备纳米磷光探针：
(1)纳米金与多肽连接，具体方法如下：在1mL经表面双配体(SH-PEG与MPA)修饰的纳米金溶液(实施例2制备的中间体A溶液)中加入浓度为1mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)各15μL，反应40min后，再加入10μL浓度为1mg/mL的多肽(CALNNLLVYGGHH)，置于37℃下继续反应2h，然后置于4℃冰箱中过夜。将溶液离心(14800rpm，4℃，10min)，弃上清，取沉淀用磷酸缓冲液(PBS)重悬，再次离心并用PBS重悬，如此反复三次后，制得中间体B，储存至4℃备用。
(2)铱金属配位化合物的配位反应，具体方法如下：在1mL经底物序列多肽连接的纳米金溶液中加入浓度为1mM的铱金属配位化合物(Bis(2-phenylpyridine-C2,N)-bis(aquo)iridium-(III)trifluoromethanesulfonate)溶液，置于37℃下继续反应2h，将溶液离心(14800rpm，4℃，10min)，弃上清，取沉淀用磷酸缓冲液(PBS)重悬，再次离心并用PBS重悬，如此反复三次后，制得纳米磷光探针，储存至4℃备用。
实施例7
制备纳米磷光探针：
(1)纳米金与多肽连接，具体方法如下：在1mL经表面双配体(SH-PEG与MPA)修饰的纳米金溶液(实施例3制备的中间体A溶液)中加入浓度为1mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)各15μL，反应40min后，再加入10μL浓度为1mg/mL的多肽(CALNNLLVYGGHH)，置于37℃下继续反应2h，然后置于4℃冰箱中过夜。将溶液离心(14800rpm，4℃，10min)，弃上清，取沉淀用磷酸缓冲液(PBS)重悬，再次离心并用PBS重悬，如此反复三次后，制得中间体B，储存至4℃备用。
(2)铱金属配位化合物的配位反应，具体方法如下：在1mL经底物序列多肽连接的纳米金溶液中加入浓度为1mM的铱金属配位化合物(Bis(2-phenylpyridine-C2,N)-bis(aquo)iridium-(III)trifluoromethanesulfonate)溶液，置于37℃下继续反应2h，将溶液离心(14800rpm，4℃，10min)，弃上清，取沉淀用磷酸缓冲液(PBS)重悬，再次离心并用PBS重悬，如此反复三次后，制得纳米磷光探针，储存至4℃备用。
实施例8
制备纳米磷光探针：
(1)纳米金与多肽连接，具体方法如下：在1mL经表面双配体(SH-PEG与MPA)修饰的纳米金溶液(实施例4制备的中间体A溶液)中加入浓度为1mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)各15μL，反应40min后，再加入10μL浓度为1mg/mL的多肽(CALNNLLVYGGHH)，置于37℃下继续反应2h，然后置于4℃冰箱中过夜。将溶液离心(14800rpm，4℃，10min)，弃上清，取沉淀用磷酸缓冲液(PBS)重悬，再次离心并用PBS重悬，如此反复三次后，制得中间体B，储存至4℃备用。
(2)铱金属配位化合物的配位反应，具体方法如下：在1mL经底物序列多肽连接的纳米金溶液中加入浓度为1mM的铱金属配位化合物(Bis(2-phenylpyridine-C2,N)-bis(aquo)iridium-(III)trifluoromethanesulfonate)溶液，置于37℃下继续反应2h，将溶液离心(14800rpm，4℃，10min)，弃上清，取沉淀用磷酸缓冲液(PBS)重悬，再次离心并用PBS重悬，如此反复三次后，制得纳米磷光探针，储存至4℃备用。
效果检测
1、95μL磷光探针(150μg/mL)与5uL蛋白酶体(500nM)混合孵育，利用酶标仪在不同时间点(0-120分钟)检测混合溶液的荧光光谱变化。结果显示(图2)磷光探针与蛋白酶体孵育后，随着时间的延长，荧光强度逐步增强，120分钟后逐渐稳定。
2、95μL磷光探针(浓度150μg/mL)与5μL不同浓度(381.25-12200U)蛋白酶体混合孵育，利用酶标仪在60分钟检测混合溶液的荧光光谱。结果如图3显示磷光探针与不同浓度的蛋白酶体孵育后，荧光强度随着加入蛋白酶浓度的升高而升高。证明该磷光探针可用于溶液样品在试管水平的蛋白酶体活性检测。
3、PC12细胞接种于玻璃底共聚焦培养皿内，105个细胞每皿，培养24小时后，实验组去除培养基，换成含有5mM MPP+的新鲜培养基；对照组更换新鲜不含MPP+的培养基，继续孵育6小时后，加入50μL磷光探针(浓度600μg/mL)，孵育1小时后，用共聚焦显微镜进行磷光成像。结果如图4：磷光探针与PC12细胞孵育后观察不同的荧光强度。左：正常PC12细胞，蛋白酶体活性正常，探针活化，可见较强绿色荧光；右：5mM 1-甲基-4-苯基吡啶(MPP+)孵育6小时后的PC12细胞，蛋白酶体活性被显著抑制，探针活化程度明显下降，可见微弱绿色荧光。证明该磷光探针可用于活细胞水平的蛋白酶体活性检测。
4、不同纳米金表面修饰方案对其在磷酸缓冲液中分散性的影响。如图5所示，纳米金在磷酸缓冲液中会发生聚集，520nm特征吸收峰会消失。利用双配体修饰法对其分散性和稳定性进行改良，发现随着巯基聚乙二醇比例增加，其稳定性得到显著优化。试验结果表明，当巯基聚乙二醇：巯基丙酸>＝1：9时，可以保证其在磷酸缓冲液中稳定存在。考虑到最大化用于后续连接功能化分子的巯基丙酸的包裹比例，因此，最终选用了巯基聚乙二醇：巯基丙酸＝1：9的包裹条件。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州大学
<120> 纳米磷光探针及其用途
<130> MP1908067
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Ala Leu Asn Asn
1 5
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu Leu Val Tyr
1

Claims (6)

1.一种纳米磷光探针，其特征在于，由金纳米球、功能基团、铱金属配合物和末端含有巯基的聚合物组成；
所述金纳米球和铱金属配合物之间产生荧光共振能量转移；
所述功能基团由巯基丙酸和含有酶反应底物的复合物组成；
所述金纳米球与铱金属配合物通过功能基团连接；
其中金纳米球与所述巯基丙酸以金硫键连接；
所述巯基丙酸与含有酶反应底物的复合物以酰胺键连接；
所述含有酶反应底物的复合物与铱金属配合物配位连接；所述含有酶反应底物的复合物由间隔序列1、酶反应底物、间隔序列2组成；所述间隔序列1和间隔序列2为多肽序列，所述酶反应底物为多肽或核酸；
所述金纳米球与末端含有巯基的聚合物通过金硫键连接，所述末端含有巯基的聚合物为巯基聚乙二醇、巯基聚乳酸或巯基聚醚酰亚胺。
2.根据权利要求1所述的纳米磷光探针，其特征在于，
所述金纳米球的直径为15~25nm；所述铱金属配合物具有520nm吸收峰。
3.根据权利要求1或2所述的纳米磷光探针，其特征在于，
所述功能基团与所述末端含有巯基的聚合物的摩尔比为（1~9）:（1~9）；
所述金纳米球与功能基团的摩尔比为1：（30~40）。
4.一种权利要求1~3任一项所述纳米磷光探针的制备方法，其特征在于，包括：
柠檬酸钠还原法制备金纳米球；
以末端含有巯基的聚合物和巯基丙酸修饰金纳米球，制得中间体A；
EDC/NHS化学交联法连接中间体A和含有酶反应底物的复合物，制得中间体B；
铱金属配合物与中间体B经配位反应，制得所述纳米磷光探针。
5.权利要求1~3任一项所述纳米磷光探针在制备酶活检测的试剂中的应用。
6.一种酶活检测的方法，其特征在于，
将权利要求1~3任一项所述纳米磷光探针与待测物共同孵育，根据荧光强度判断酶活力。
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