CN108004295B - 一种检测氨肽酶n活性的比色方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测氨肽酶N活性的比色方法，通过葫芦[8]脲识别结合多肽探针，以金纳米颗粒作为比色信号报告单元进行比色分析，进行氨肽酶N的活性检测。本发明所述的检测氨肽酶N活性的比色方法，方法简单、合理，基于多肽功能化金纳米颗粒/CB[8]超分子组装体，结合氨肽酶N对于多肽探针N‑末端中性氨基酸的识别切割活性，成功构建了一种新型的检测氨肽酶N活性的比色分析方法。实验结果表明，本发明构建的检测方法具有良好的灵敏度和可重复性，检测限可以达到0.096µg/mL。同时，还具有无需大型昂贵仪器和额外标记等优点，因而在临床分析检测中具有很高的应用前景。

Description

一种检测氨肽酶N活性的比色方法

技术领域

本发明属于生物电化学传感器技术领域，具体地，涉及一种检测氨肽酶N活性的比色方法。

背景技术

氨肽酶N（AminopeptidaseN），又称CD13，隶属于金属蛋白酶M1家族，其活性具有锌离子依赖性。氨肽酶N广泛存在于多种组织、器官和细胞中，它是细胞膜上的II型整合膜蛋白，其通过分子内一段靠近N末端的螺旋跨膜结构域固定于细胞膜上。氨肽酶N拥有广泛的底物选择性，它能够从蛋白质、多肽或酰胺上水解释放N-末端的中性或碱性氨基酸，如丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和亮氨酸等。在生物体内，氨肽酶N能够作用于脑啡肽、血管紧张肽、神经激肽和细胞因子等生物活性分子，从而参与免疫调节、细胞生长和血压调节等诸多重要的生理代谢过程。

癌症是世界范围内严重威胁人类健康的恶性疾病之一。肿瘤细胞的侵袭和转移是癌症的基本生物学特征，也是导致患者复发或死亡的主要原因。尽管肿瘤细胞的转移是一个涉及到细胞粘连、趋化、血管增生等一系列生理事件的复杂过程，但肿瘤细胞和其周围的蛋白水解酶的相互作用对肿瘤的恶化起到了很关键的作用。最近有研究发现，氨肽酶N和肿瘤的发生发展密切相关。例如，氨肽酶N可以促进细胞外基质的降解，这一方面可以释放某些加速肿瘤细胞增殖的生长因子，提高肿瘤细胞的生物利用度；另一方面可以为肿瘤微血管的形成提供空间，从而为肿瘤细胞的侵袭转移奠定有利基础。

由于氨肽酶N与肿瘤发生发展的这种密切关系，其在肿瘤组织或细胞中的表达和活性也得到了深入的研究。1990年，Mechtersheimer和Möller最先采用免疫组化的方法对氨肽酶N在间叶性肿瘤组织中的表达程度进行了分级。1999年，Martínez和他的同事用荧光的方法对乳腺癌组织中的氨肽酶N活性作了检测。通过对比肿瘤细胞和周围未感染的组织细胞，他们发现氨肽酶N的活性在乳腺癌肿瘤细胞中是明显提升的。后续一系列的研究证明，氨肽酶N的活性在卵巢癌、肝癌、肺癌等癌症组织中也存在明显的上升。更为重要的是，在乳腺癌和甲状腺癌患者血清中，氨肽酶N的活性也被发现存在异常上调。因此，氨肽酶N的活性可以作为多种癌症诊断的重要指标。在此背景下，发展高效可靠的生物传感方法，实现对氨肽酶N活性的灵敏检测，有望在癌症诊断过程中发挥重要的作用。

随着超分子化学的快速发展，一系列人工合成的大环主体分子在构建分子器件、药物传输系统和生物传感方法中的应用价值引起研究者越来越多的兴趣。其中，由八个甘脲分子缩合而成的葫芦[8]脲（cucurbit[8]uril，CB[8]）因其能够同时与两分子客体结合形成三元超分子体系的独特性质而备受关注。

发明内容

发明目的：借助CB[8]同时识别结合两分子多肽探针N-末端苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（FGGG）序列的特性，并利用金纳米颗粒作为比色信号报告单元，我们提供了一种检测氨肽酶N活性的比色分析方法。并且该方法能够实现最低0.096μg/mL氨肽酶N的活性检测，具有良好的应用前景。

技术方案：本发明提供了一种检测氨肽酶N活性的比色方法，通过葫芦[8]脲识别结合多肽探针，以金纳米颗粒作为比色信号报告单元进行比色分析，进行氨肽酶N的活性检测。本发明所述的检测氨肽酶N活性的比色方法，方法简单、合理，基于多肽功能化金纳米颗粒/CB[8]超分子组装体，结合氨肽酶N对于多肽探针N-末端中性氨基酸的识别切割活性，成功构建了一种新型的检测氨肽酶N活性的比色分析方法。实验结果表明，本发明构建的检测方法具有良好的灵敏度和可重复性，检测限可以达到0.096µg/mL。同时，还具有无需大型昂贵仪器和额外标记等优点，因而在临床分析检测中具有很高的应用前景。

进一步的，上述的检测氨肽酶N活性的比色方法，包括以下步骤：

（1）金纳米颗粒的合成；

（2）多肽功能化金纳米颗粒的制备：多肽探针活化巯基后与金纳米颗粒混合制备得到多肽功能化金纳米颗粒；

（3）氨肽酶N活性的比色检测：向多肽功能化金纳米颗粒中加入氨肽酶N后再加入葫芦[8]脲（CB[8]）反应，比色分析进行氨肽酶N的活性检测。方法合理，应用方便。

进一步的，上述的检测氨肽酶N活性的比色方法，所述金纳米颗粒合成后加入阳离子盐溶液。而当向检测体系的溶液中加入一定浓度的阳离子（如 Na⁺）盐溶液时，由于阳离子能够中和金纳米颗粒表面的负电荷，降低颗粒之间的静电排斥，金纳米颗粒会因而发生聚集。但是，如果金纳米颗粒表面利用生物分子进行了功能化修饰，这些生物分子能够有效的保护金纳米颗粒，提高其对阳离子盐溶液引发聚集的抗性。

进一步的，上述的检测氨肽酶N活性的比色方法，所述多肽探针的近氨基端含有苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（FGGG）片段；所述多肽探针的近羧基端含有谷氨酸-亮氨酸-亮氨酸-半胱氨酸（ELLC）片段。多肽探针主要包括两个多功能片段部分。第一部分是靠近氨基端的苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（FGGG）片段。该部分片段一方面包含氨肽酶N天然底物孤啡肽的核心识别切割序列，另一方面也可以作为CB[8]的结合位点，其通过近氨端（N-末端）的FGGG与CB[8]以2:1的形式发生超分子组装。第二部分是靠近羧基端（C-末端）的谷氨酸-亮氨酸-亮氨酸-半胱氨酸（ELLC）片段。在该部分片段中，C-末端的半胱氨酸可以提供巯基与金纳米颗粒形成Au-S键，从而实现多肽探针的固定。与此同时，由于氨肽酶N的作用底物是N-末端的中性或碱性氨基酸，因此，该部分片段中靠近氨基端的酸性氨基酸谷氨酸可以作为氨肽酶N切割的终点，这也使得该部分片段可以在氨肽酶N切割之后保留在纳米颗粒表面，从而作为保护序列，避免由于CB[8]和金纳米颗粒直接结合所引起的纳米颗粒聚集。

进一步的，上述的检测氨肽酶N活性的比色方法，所述苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸片段可以与葫芦[8]脲（CB[8]）以2:1的形式发生超分子组装。

进一步的，上述的检测氨肽酶N活性的比色方法，当检测体系中存在活性的氨肽酶N时，氨肽酶N能够识别并切割多肽探针近氨基端的苯丙氨酸及甘氨酸，破坏与葫芦[8]脲的结合位点，葫芦[8]脲无法与多肽功能化金纳米颗粒发生相互作用，金纳米颗粒在检测体系中处于分散的状态；

当检测体系中不存在有活性的氨肽酶N时，葫芦[8]脲识别多肽功能化金纳米颗粒表面修饰的多肽探针的苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸片段，并进行组装，形成多肽功能化金纳米颗粒/葫芦[8]脲超分子组装体，金纳米颗粒之间的距离被拉近，在检测体系中处于聚集状态。

进一步的，上述的检测氨肽酶N活性的比色方法，所述比色分析为紫外-可见吸收光谱分析，波长为400-800nm。应用方便，应用成本低。

进一步的，上述的检测氨肽酶N活性的比色方法，所述阳离子盐溶液包括氯化钠溶液。氯化钠溶液的应用成本低，使用方便，原料来源广。

进一步的，上述的检测氨肽酶N活性的比色方法，所述氯化钠溶液为25µM的氯化钠溶液。25µM的氯化钠溶液效果好且性价比高。

进一步的，上述的检测氨肽酶N活性的比色方法，所述葫芦[8]脲的浓度为100μM，多肽功能化金纳米颗粒与葫芦[8]脲（CB[8]）的反应时间为60分钟。上述条件下效果佳，准确度高。

有益效果：本发明具有以下优点：本发明所述的检测氨肽酶N活性的比色方法，方法简单、合理，并具有良好的灵敏度和可重复性，检测限可以达到0.096µg/mL，具有良好的检测灵敏性。同时，还具有无需大型昂贵仪器和额外标记等优点，因而在临床分析检测中具有很高的应用前景。

附图说明

附图1：（A）实验中所使用的多肽探针的序列；（B）基于多肽功能化金纳米颗粒/CB[8]超分子组装体比色检测氨肽酶N活性的原理示意图；

附图2：多肽功能化金纳米颗粒分别与相同体积的（a）双蒸水或（b）CB[8]作用后的（A）透射电子显微镜图和（B）紫外-可见吸收光谱；

附图3：金纳米颗粒功能化修饰所需的多肽探针浓度的探索：90μL使用不同浓度的多肽探针修饰后的金纳米颗粒与10μL1.25MNaCl反应5分钟后的紫外-可见吸收光谱，Control曲线对应于90μL未修饰的金纳米颗粒经10μL双蒸水稀释后的紫外-可见吸收光谱；

附图4：CB[8]浓度的优化：70µL多肽功能化金纳米颗粒分别和20µL不同浓度的CB[8]反应1小时后得到的混合溶液的A600/A521值。所使用的CB[8]的浓度分别为：0、25、50、75、100、125和150μM；

附图5：CB[8]作用时间的优化：70µL多肽功能化金纳米颗粒和20µL100μM的CB[8]反应不同时间（0、15、30、45、60、75分钟）后得到的混合溶液的A600/A521值；

附图6：检测20µg/mL活性氨肽酶N及空白对照实验中所得到的紫外-可见吸收光谱。（a）实验组，体系中含有20µg/mL活性氨肽酶N；（b）对照组，体系中不含氨肽酶N；

附图7：检测20µg/mL活性氨肽酶N及空白对照实验中所得到的透射电子显微镜图：（b）实验组，体系中含有20µg/mL活性氨肽酶N；（c）对照组，体系中不含氨肽酶N；图a为多肽功能化金纳米颗粒的透射电子显微镜图；

附图8：检测20µg/mL活性氨肽酶N及对照实验中所得到的A600/A521值；

附图9：检测不同浓度氨肽酶N的活性时得到的紫外-可见吸收光谱。从a到l，氨肽酶N的浓度分别为0.5、1、2.5、5、6、7、9、10、15、20、25、30、µg/mL；

附图10：检测溶液A600/A521值和氨肽酶N浓度之间的关系；插入图为当氨肽酶N浓度在5-15µg/mL范围内，A600/A521值与氨肽酶N浓度之间的线性关系。

具体实施方式

下面将通过几个具体实施例，进一步阐明本发明，这些实施例只是为了说明问题，并不是一种限制。

实施例1

多肽探针和工作原理

本发明所述的一种检测氨肽酶N活性的比色方法，其工作原理如下：本发明所述的多肽探针（Pep），如图1A所示，主要包括两个多功能片段部分。第一部分是靠近氨基端的苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（FGGG）片段。该部分片段一方面包含氨肽酶N天然底物孤啡肽的核心识别切割序列，另一方面也可以作为CB[8]的结合位点，其通过N-末端的FGGG与CB[8]以2:1的形式发生超分子组装。第二部分是靠近羧基端的谷氨酸-亮氨酸-亮氨酸-半胱氨酸（ELLC）片段。在该部分片段中，C-末端的半胱氨酸可以提供巯基与金纳米颗粒形成Au-S键，从而实现多肽探针的固定。与此同时，由于氨肽酶N的作用底物是N-末端的中性或碱性氨基酸，因此，该部分片段中靠近氨基端的酸性氨基酸谷氨酸可以作为氨肽酶N切割的终点，这也使得该部分片段可以在氨肽酶N切割之后保留在纳米颗粒表面，从而作为保护序列，避免由于CB[8]和金纳米颗粒直接结合所引起的纳米颗粒聚集。

基于多肽功能化金纳米颗粒/CB[8]超分子组装体比色检测氨肽酶N活性的实验原理如附图1B所示。当检测体系中不存在有活性的氨肽酶N时，CB[8]能够识别金纳米颗粒表面修饰的多肽探针N-末端的FGGG序列，并以1:2的比例进行组装，形成多肽功能化金纳米颗粒/CB[8]超分子组装体；此时，金纳米颗粒之间的距离被拉近，因而发生明显的聚集。而在借助紫外-可见吸收光谱，我们可以很方便地表征出金纳米颗粒的分散和聚集状态，进而实现氨肽酶N活性的检测。

实施例2

金纳米颗粒的合成

金纳米颗粒（AuNPs）由柠檬酸三钠加热还原法制备而成。具体过程如下：制备金纳米颗粒所用到的玻璃仪器（如三颈烧瓶、量筒、冷凝管等）均先用王水（硝酸:盐酸=1:3）浸泡30分钟，再用大量自来水和双蒸水分别清洗后烘干备用。在制备时，首先向250mL容量的三颈烧瓶中加入100mL的氯金酸溶液（w/v，0.01%），在避光且剧烈搅拌的条件下加热至沸腾；随后，向其中迅速加入3.5mL浓度为1%（w/v）的柠檬酸三钠溶液，继续加热搅拌。在该过程中，可以观察到溶液颜色逐渐转变为酒红色，说明金纳米颗粒逐渐形成。15分钟后，停止加热，继续搅拌30分钟。最后，停止搅拌，待金纳米颗粒溶液冷却至室温后转移至棕色瓶中4˚C储存备用。以上制备的金纳米颗粒浓度约为3.5nM，直粒径约为13nm。

实施例3

多肽功能化金纳米颗粒的制备

合成的多肽探针预先溶解于10mM的PBS缓冲液中（pH7.4），得到浓度为500µM的母液，保存备用。具体而言，首先取一定体积的多肽探针母液用含有1%TECP的10mMPBS缓冲液稀释至25µM，室温下孵育1小时以活化巯基；随后，取20µL活化的多肽探针转移至480µL金纳米颗粒溶液中，4˚C避光反应；16小时后，将所得到的多肽探针/金纳米颗粒混合溶液于4˚C条件下12000rpm离心20分钟；最后，弃去离心上清液，将底部固体复溶于500µL10mMPBS缓冲液中（pH7.4），即制备得到多肽功能化金纳米颗粒。

实施例4

氨肽酶N活性的比色检测

氨肽酶N活性的比色检测过程的具体步骤如下：首先向70µL多肽功能化金纳米颗粒溶液中加入10µL含有不同浓度氨肽酶N的样品溶液，充分混合后在37˚C恒温金属浴中反应30分钟；随后，向上述溶液中加入20µL100µM的CB[8]，室温下反应1小时。反应完毕后，使用UV-2450紫外-可见分光光度计测定反应混合溶液的紫外-可见吸收光谱，波长扫描范围为400-800nm。

实施例5

多肽功能化金纳米颗粒/CB[8]超分子组装体的制备和表征

如图2所示，是多肽功能化金纳米颗粒分别与相同体积的双蒸水或CB[8]作用前后的透射电子显微镜图和紫外-可见吸收光谱。如图所示，制备得到的多肽功能化金纳米颗粒分散性良好（附图2A-a），且在紫外-可见吸收光谱521nm处存在一个特征吸收峰（附图2B-a）。而引入CB[8]作用1小时后，金纳米颗粒发生明显的聚集（附图2A-b），且在紫外-可见吸收光谱中的吸收峰波长由521nm大幅度地红移到了600nm（附图2A-b）；这表明，借助CB[8]与金纳米颗粒表面修饰的多肽探针N-末端的FGGG序列之间的识别和组装，多肽功能化金纳米颗粒/CB[8]超分子组装体得以形成。同时，基于以上实验结果，本发明选择反应溶液在600nm和521nm处吸光度值间的比值（A600/A521）作为CB[8]引起的金纳米颗粒聚集程度的表征指标。

实施例6

多肽功能化金纳米颗粒/CB[8]超分子组装体的优化

由于无修饰的金纳米颗粒具有良好的分散性；而当向其溶液中加入一定浓度的阳离子（如Na⁺）盐溶液时，由于阳离子能够中和金纳米颗粒表面的负电荷，降低颗粒之间的静电排斥，金纳米颗粒会因而发生聚集。但是，如果金纳米颗粒表面利用生物分子进行了功能化修饰，这些生物分子能够有效的保护金纳米颗粒，提高其对阳离子盐溶液引发聚集的抗性。基于这一原理，本发明首先采用耐盐性实验研究了金纳米颗粒表面修饰所需的多肽探针的浓度。

耐盐性实验结果如附图3所示。从图中可以看出，当向90μL未修饰有多肽探针的金纳米颗粒溶液中加入10μL 1.25M的NaCl后，溶液发生了极其明显的颜色变化，其在紫外-可见吸收光谱521nm处的吸收峰明显下降，而在700nm处出现了一个新的吸收峰；这说明，在没有多肽探针保护的情况下，金纳米颗粒耐盐性较差，很容易发生聚集。反观修饰有多肽探针的金纳米颗粒，随着所使用的多肽探针浓度的升高，金纳米颗粒的耐盐性逐渐提高，其在紫外-可见吸收光谱521nm处的吸收峰也在不断的上升。当多肽探针浓度提高到25µM时，金纳米颗粒经1.25M的NaCl处理后的紫外-可见吸收光谱与新鲜制备的金纳米颗粒十分相似。因此本发明以25µM为最适的多肽探针修饰浓度。

CB[8]与金纳米颗粒表面修饰的多肽探针N-末端的FGGG序列之间的识别和组装是多肽功能化金纳米颗粒/CB[8]超分子组装体得以形成的基础，因此本发明对CB[8]的浓度和作用时间分别进行了优化。附图4显示了多肽功能化金纳米颗粒分别和不同浓度CB[8]反应1小时后得到的混合溶液的A600/A521值。从图中可以看出，随着CB[8]浓度的提升，A600/A521值在不断的升高，这表明金纳米颗粒的聚集程度在不断的增加，即所形成的多肽功能化金纳米颗粒/CB[8]超分子组装体逐渐增多。当CB[8]的浓度提升到100μM的时候，A600/A521值基本达到了峰值。因此本发明以100μM作为实验中使用的CB[8]的浓度。附图5则显示了多肽功能化金纳米颗粒和100μM的CB[8]作用后得到的混合溶液的A600/A521值随作用时间的变化情况。如图所示，随着作用时间的延长，A600/A521值也在随之提高，并在45分钟后基本保持不变。为了保证超分子组装体的充分形成，在后续实验中，本发明以60分钟作为CB[8]的作用时间。

实施例7

氨肽酶N活性检测的可行性

如附图6所示，当检测体系中存在20μg/mL活性氨肽酶N时，检测溶液在紫外-可见吸收光谱521nm处存在典型吸收峰（曲线a），说明金纳米颗粒未发生明显的聚集。这一结果表明氨肽酶N可以识别并切割多肽探针N-末端的中性氨基酸，从而导致多肽功能化金纳米颗粒/CB[8]超分子组装体无法形成，金纳米颗粒保持良好的分散状态。而在空白对照组，检测溶液在紫外-可见吸收光谱521nm处的吸光度明显降低，600nm处的吸光度明显上升，说明金纳米颗粒发生了聚集。随后，进一步使用透射电子显微镜对不同情况下金纳米颗粒的聚集分散状态进行了直观的表征（附图7）。从图中可以看出，在CB[8]作用一定时间后，经由氨肽酶N作用的多肽功能化金纳米颗粒保持了比较良好的分散状态（附图7b），而空白对照组中的多肽功能化金纳米颗粒发生了很严重的聚集（附图7c）。以上实验结果强有力地证明了本方法构建的比色分析方法用于氨肽酶N活性检测的可行性。

实施例8

氨肽酶N活性检测的选择性。

本发明开展多组对照实验，实验结果如附图8所示。同样的实验条件下，检测20μg/mL活性氨肽酶N时所得到的A600/A521值较低，仅约为0.4；而对于相同浓度的失活氨肽酶N，最终检测溶液的A600/A521值高达1.5，与空白对照组的数值基本相同。这进一步证明了金纳米颗粒聚集状态的差异来源于氨肽酶N的催化活性。此外，当利用50倍浓度的肽酰基精氨酸脱氨酶4（PAD4）或胰蛋白酶（trypsin）替代氨肽酶N进行检测时，最终检测溶液的A600/A521值也与空白对照组相当。上述结果表明，本发明所述的方法中建立的比色分析方法可以用于氨肽酶N活性的检测，且具有良好的选择性，而这是由于本发明所述的多肽探针包含氨肽酶N天然底物孤啡肽的核心识别切割序列。

实施例9

氨肽酶N活性的定量检测

附图9显示了本发明利用所建立的比色分析方法检测一系列不同浓度氨肽酶N的活性的实验结果。从图中可以看出，随着氨肽酶N浓度（即活性）的增加，检测溶液在紫外-可见吸收光谱520nm处的吸光度在不断上升，而600nm处的吸光度却在不断下降。这表明，随着氨肽酶N浓度的提高，越来越多的多肽探针被识别切割，导致越来越少的多肽功能化金纳米颗粒/CB[8]超分子组装体得以形成。

实施例10

检测溶液的A600/A521值随待测氨肽酶N浓度的变化情况

从图10中可以看出，当氨肽酶N浓度在0.5-30μg/mL范围内变化时，随着氨肽酶N浓度的增加，A600/A521值逐渐降低。针对每一个浓度，本发明在实验中均至少进行了三次重复独立实验，从而计算出所建立的比色分析方法用于检测不同浓度氨肽酶N活性的相对标准偏差均低于3%，证明该方法具有良好的可重复性。

如附图10的插入图所示，当氨肽酶N浓度在5-15µg/mL之间时，A600/A521值与氨肽酶N浓度之间呈现良好的线性关系。线性回归方程为y=-0.0785x+1.6453，其中y为检测溶液的A600/A521值，x为氨肽酶N的浓度（µg/mL），r=0.993。基于以上方程，推算出该方法用于氨肽酶N活性检测的最低检测限为0.096µg/mL，体现出良好的检测灵敏性。

以上所述仅是发明的几个实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种非疾病诊断目的的检测氨肽酶N活性的比色方法，其特征在于：通过葫芦[8]脲识别结合多肽探针，以金纳米颗粒作为比色信号报告单元进行比色分析，进行氨肽酶N的活性检测；所述多肽探针的近氨基端含有苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸片段；所述多肽探针的近羧基端含有谷氨酸-亮氨酸-亮氨酸-半胱氨酸片段；

所述的非疾病诊断目的的检测氨肽酶N活性的比色方法，包括以下步骤：

（1）金纳米颗粒的合成；所述金纳米颗粒合成后加入阳离子盐溶液，所述阳离子盐溶液为25 µM的氯化钠溶液；

（2）多肽功能化金纳米颗粒的制备：多肽探针活化巯基后与金纳米颗粒混合制备得到多肽功能化金纳米颗粒；

（3）氨肽酶 N 活性的比色检测：向多肽功能化金纳米颗粒中加入氨肽酶 N后再加入葫芦[8]脲反应，所述葫芦[8]脲的浓度为100 μM，多肽功能化金纳米颗粒与葫芦[8]脲的反应时间为60分钟；

所述苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸片段可以与葫芦[8]脲以2:1的形式发生超分子组装；

当检测体系中存在活性的氨肽酶N时，氨肽酶 N 能够识别并切割多肽探针近氨基端的苯丙氨酸及甘氨酸，破坏与葫芦[8]脲的结合位点，葫芦[8]脲无法与多肽功能化金纳米颗粒发生相互作用，金纳米颗粒在检测体系中处于分散的状态；

当检测体系中不存在有活性的氨肽酶N时，葫芦[8]脲识别多肽功能化金纳米颗粒表面修饰的多肽探针的苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸片段，并进行组装，形成多肽功能化金纳米颗粒/葫芦[8]脲超分子组装体，金纳米颗粒之间的距离被拉近，在检测体系中处于聚集状态；

比色分析进行氨肽酶N的活性检测，所述比色分析为紫外-可见吸收光谱分析，波长为400-800 nm；

所述方法用于氨肽酶N活性检测的最低检测限为0 .096μg/mL。

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