CN107271511A - 检测肽酰基精氨酸脱亚氨酶用生物传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

检测肽酰基精氨酸脱亚氨酶用生物传感器及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测肽酰基精氨酸脱亚氨酶用生物传感器及其制备方法和应用。该传感器是在金电极表面修饰多肽链1 ( FGGGRGAC )，该肽链C端的半胱氨酸的巯基通过金硫键把多肽链1固定在电极表面，多肽链2 ( FGGGGC ) 功能化银纳米颗粒通过多肽链2的半胱氨酸的巯基与银纳米颗粒连接。在超分子葫芦脲8 ( CB[8] ) 辅助的主‑客体相互作用帮助下，功能化的银纳米颗粒由于CB[8]可以与多肽链1 N端FGG和多肽链2 N端的FGG识别固定在电极表面。本发明的传感器利用超分子化学辅助的信号标记方法提高该实验的灵敏性，可以检测到PAD4的线性范围为0.005 nM至200 nM，检测限为0.79 nM，特异性也特别强，可以有效地区分靶标与其他对照蛋白，也可以做到在HL‑60细胞裂解物中检测到内源性PAD4的活性。

Description

检测肽酰基精氨酸脱亚氨酶用生物传感器及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及一种检测肽酰基精氨酸脱亚氨酶用生物传感器及其制备方法和应用。
背景技术
肽酰基精氨酸脱亚氨酶是钙离子依赖的翻译后的一种家族酶，可以催化肽酰基精氨酸残基转变为肽酰基瓜氨酸残基。PAD异构体分别为PAD1，PAD2，PAD3，PAD4，和PAD6，其中PAD4是这些同工体中唯一一个位于细胞核中的酶。PAD4可以催化组蛋白H2A，H3和H4中的精氨酸残基发生瓜氨酸化，因此可以调节下游基因的转录，分化和全能性。最近研究发现PAD4的异常表达会导致类风湿关节炎的发生，通过蛋白瓜氨酸化的过程，细胞内高水平的PAD4活性与疾病恶化自身抗体的产生有关。除此之外，在人类癌症中如肺癌，乳腺癌和骨癌中也发现大量过量表达的PAD4。所以对PAD4的检测引起了研究者对其的关注。
超分子化学是根据分子互补的原则来研究两个或更多分子的特定关联。主-客体相互作用是超分子化学的典型例子。该文章是采用具有刚性大环结构的葫芦脲作为主体分子，多肽链作为客体分子，通过主-客体相互作用自组装分子，使信号放大进而实现对靶标蛋白的检测。
虽然研究表明PAD4的异常表达与相关疾病的诊断和治疗相关，但是对PAD4催化蛋白瓜氨酸化的生理机能迄今为止知之甚少。目前为止只有一些分析方法来检测PAD酶，如比色法，SDS-PAEG，和荧光，大部分还是依赖于荧光技术。但是荧光标记过程很复杂和很容易受到外界环境的干扰，这些方法也难操作复杂，检测灵敏度也不高，很难用于实时检测与分析。因此电化学分析方法由于高灵敏性，操作简单和响应快，已经成为一门流行的检测技术。多肽可以作为原件来构建有效的生物传感器，超分子化学辅助的主-客体相互作用可以实现多肽分子自组装，从而实现信号识别与放大。银纳米颗粒通过与多肽链相互作用，在葫芦脲大分子的辅助下把信号连接在体系中。PAD4可以催化多肽链中精氨酸残基瓜氨酸化作用生成瓜氨酸残基，此时也借助胰蛋白酶的引入，该酶可以水解赖氨酸或精氨酸C端的羧基，因此可用于辅助验证精氨酸瓜基化修饰过程。所以，通过该方法技术手段检测PAD4的活性以及抑制剂的作用效果，为检测PAD4提供了一个新颖的电化学方法。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种肽酰基精氨酸脱亚氨酶检测用生物传感器。
本发明的目的之二提供该传感器的制备方法。
本发明的目的之三在于提供采用该传感器检测肽酰基精氨酸脱亚氨酶的方法。
本发明是采用电化学技术对肽酰基精氨酸脱亚氨酶特异性和灵敏性的检测。为实现以上目的，本发明所采用的机理如下：
多肽链1序列为FGGGRGAC通过C端半胱氨酸的巯基以金-硫键的方式结合在金电极的表面上，多肽链2序列为FGGGGC也通过半胱氨酸的巯基与银纳米颗粒结合，在超分子葫芦脲8的辅助下，其可以结合两条多肽链FGG端，进而把多肽链2功能化的银纳米颗粒连接在电极表面上，这样才可以表征电化学信号。胰蛋白酶可以催化赖氨酸或精氨酸C端的羧基，故其可以催化裂解多肽链1中的精氨酸残基中的羧基，此时多肽链FGG片段脱离电极表面，这样葫芦脲8就不能捕捉到FGG序列，修饰多肽链2的银纳米颗粒就不能连接在电极上，得到的电化学响应也很低。精氨酸脱亚氨酶可以催化肽酰精氨酸残基转变为肽酰瓜氨酸残基，故在PAD4存在的条件下可以催化多肽链1中精氨酸发生瓜氨酸化作用。保护了多肽链1中的精氨酸免于胰蛋白酶的催化裂解，进而功能化的银纳米颗粒可以通过葫芦脲8结合两段多肽链上的FGG序列结合在电极上，得到很强的电化学信号。PAD4是一种钙离子依赖的酶，钙离子的结合可以是PAD4的构象发生改变，进而表现出催化活性。酶都有一定的活性，氯脒是一种不可逆的PAD4失活剂。在抑制剂存在的条件下，PAD4失去活性则胰蛋白酶就可以催化裂解精氨酸。不同浓度的PAD4可以根据固定在电极上的银纳米颗粒的多少，采用线性扫描伏安法的方法测定峰电流值的大小，从而实现定量检测PAD4的目的。
根据上述机理，本发明采用如下技术方案：
一种肽酰基精氨酸脱亚氨酶检测用生物传感器，其特征在于该传感器是在金电极表面上修饰一条多肽链1，在银纳米颗粒表面修饰多肽链2，通过葫芦脲[8]介导的超分子作用可以结合芳香族氨基酸，即葫芦脲[8]结合多肽链1和多肽链2 N末端的FGG，进而把两条多肽链连接在电极上。所述的多肽链1序列为FGGGRGAC；多肽链2序列为FGGGGC。
一种制备上述的肽酰基精氨酸脱亚氨酶检测用生物传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：将预处理过的金电极浸没在修饰电极的反应液中，4℃反应16-18h，即得到肽酰基精氨酸脱亚氨酶检测用生物传感器；每100μL所述的修饰反应液由50μL、10μM的多肽1、30μL、10mM的PBS和20μL、50mM的TCEP组成。
上述的金电极的预处理的方法为：将金电极用砂纸和含有颗粒大小为1.0μm、0.3μm和0.05μm的铝粉的麂皮上打磨和抛光之后，将电极分别在无水乙醇和超纯水中超声3min，然后用配置好的水虎鱼，即浓硫酸：过氧化氢=3:1的体积比的混合液，每根电极滴50μL，净化金电极，去除残留的杂质；最后经过0.5M的H2SO4活化。
一种肽酰基精氨酸脱亚氨酶的检测方法，采用三电极检测系统，其中饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝作为对电极，工作电极采用上述的肽酰基精氨酸脱亚氨酶检测用生物传感器，其特征在于该方法的具体步骤为：
a． 每50μL反应体系中含有50mM的Tris-HCl、10mM的CaCl2、0.005nM～200nM的PAD4，pH=7.6，将金电极浸没在该反应体系中，在37℃恒温温育2 h；
b．把步骤a所得金电极浸没在200μL的10mg/ml的胰蛋白缓冲液溶液中，在37℃的条件下反应1 h；所述的胰蛋白酶的缓冲液配方为：50mM的Tris-HCl，20mM的CaCl2，pH 8.4；
c．将步骤b所得的金电极浸没在5μM的葫芦脲8溶液中，室温反应1h；
d．将多肽链2修饰的银纳米颗粒在15000 r，40℃，离心20 min，去除未完全修饰上的多肽。再用修饰多肽的缓冲溶液复溶，将上述电极浸没在复溶液中，反应2.5 h；
e．通过三电极检测体系，采用线性扫描伏安法的电化学方法来表征银纳米颗粒的电化学信号的响应。
上述的多肽链2修饰银纳米颗粒的方法为：取1440uL的制备好的银纳米颗粒，加入60uL浓度为5uM多肽链2，在4℃的冰箱修饰16-18h。
本发明的传感器利用超分子化学辅助的信号标记方法提高该实验的灵敏性，可以检测到PAD4的线性范围为0.005 nM至200 nM，检测限为0.79 nM，特异性也特别强，可以有效地区分靶标与其他对照蛋白，也可以做到在HL-60细胞裂解物中检测到内源性PAD4的活性。
本发明方法可以达到灵敏检测PAD4，并能够有效地区分其他对照蛋白，以及可以在细胞中检测内源性PAD4。该方法具有简单、易操作、灵敏高效和高选择性的检测方法，为以后进一步研究PAD4提供了一种想法思路，也有望将来可以为诊断和治疗相关疾病提供一种检测手段。
附图说明
图1为本发明的原理图。
图2为在不同修饰条件下的电化学的线性扫描伏安图。a为多肽1修饰的电极，b为葫芦脲8辅助的主客体反应使信号放大，c和d分别为胰蛋白催化裂解多肽链1中的精氨酸在无PAD4存在和有PAD4存在的条件下得到的实验结果。
图3为不同浓度的PAD4存在情况下得到的电化学信号变化图，由a至k分别为PAD4的浓度为0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 50, 100, 200 nM，随着PAD4浓度的增加，峰电流值也随着增加。内嵌图为PAD4在0.005 nM到200 nM范围内与电化学变化值之间的线性关系图。
图4为不同蛋白作为对照得到的电化学信号响应柱状图。
图5为在抑制剂氯脒不同浓度存在的情况下得到的电化学信号变化图，从a至f为0, 2.5, 5, 10, 25 and 50 μM，随着抑制剂浓度的增加，抑制PAD4的活性增强，得到的峰电流值降低。嵌入图为抑制剂浓度与抑制率的关系图。
图6为在人急性早幼粒白血病细胞(HL-60)细胞核提取物中检测到PAD4的活性，以及在细胞质提取物和抑制剂存在的情况下得到的电化学信号柱状图。
具体实施方式
实施例一：不同修饰条件下的反应
首先，金电极用1 μm, 0.3 μm and 0.05 μm 的铝粉抛光。然后，金电极在乙醇和双蒸水中各超声5分钟。再用水虎鱼（H2SO4︰H2O2=3︰1）净化5分钟，双蒸水冲去后用0.5 M H2SO4的电化学净化以去除任何剩余的杂质。在氮气吹干后，金电极用来修饰多肽链1。4℃反应16-18h；每100μL修饰反应液由50μL、10μM的多肽1，30μL、10mM的PBS和20μL、50mM的TCEP，混合均匀把电极浸没在溶液中。此时多肽链2也与银纳米颗粒进行活化修饰。4反应16-18h。60μL的5μM的多肽链2加入到1440μL的制备好的银纳米颗粒溶液中。
葫芦脲8可以通过结合FGG把两条多肽链连接起来，这样就可得到很高的银纳米颗粒的电化学信号。胰蛋白酶催化裂解多肽链1中的精氨酸，这样使FGGGR片段脱离电极表面，此时获得的电化学信号就很低。在PAD4存在的情况下，PAD4可以催化精氨酸发生瓜氨酸化作用。这样就可以使多肽链1免于胰蛋白酶的催化裂解，也可以得到一个很强的电化学信号响应。
实施例二：不同浓度的PAD4的检测
将不同浓度的PAD4加到反应体系中 (0.005nM, 0.01nM, 0.05nM, 0.1nM, 0.5nM,1nM, 5nM, 10nM, 50nM, 100nM, 200nM ) 结果如图3所示。PAD4的催化精氨酸发生瓜氨酸化的活性随着其浓度增加得到的峰电流值也随着增加。图3内嵌图进一步说明了PAD4在0.005nM到200nM范围内的线性关系。线性方程为I(10-5A)=2.94233+1.12126lgCPAD4(nM)，R2=0.993。在三倍噪声比下得到的检测限为0.79 pM。
实施例三：PAD4抑制剂的作用的研究
对于PAD4抑制剂的研究，目前普遍是氯脒对其抑制剂的作用机理的研究。氯脒是一种不可逆的PAD4失活剂，抑制剂的结合会破坏PAD4活性位点的结构，进而使PAD4的活性大大降低。图4显示了不同浓度的抑制剂对PAD4活性的影响。随着抑制剂浓度的增加PAD4的活性大大降低。嵌入图表示抑制剂氯脒的浓度与抑制率的关系。
实施例四：生物传感器特异性的研究
对照实验表明了我们检测方法的特异性。如图5所示，在PAD4存在的条件下获得较高的峰电流值，而当对照蛋白(牛血清白蛋白，肌红蛋白，血红蛋白，卵清蛋白，凝血酶)存在的情况下，仅仅获得很低的峰电流值。即使对照蛋白的浓度1μM远远大于PAD4的浓度50nM的浓度，由此可见我们的方法具有很好的特异性。
实施例五：在细胞提取物中检测内源性PAD4的活性
在之前的报道中发现PAD4是在细胞核中发现的，故我们也研究了该酶在细胞里的活性。我们选用的是人急性早幼粒白血病细胞，分离出该细胞的细胞核提取物和细胞质提取物，由图6可见，在细胞核提取物有表达PAD4的活性。PAD4是一种钙离子依赖的酶，在有无钙离子对照PAD4的活性，由图可知钙离子对PAD4活性的重要性。最后也研究了抑制剂氯脒和二甲胺四环素对PAD4活性的影响。因此，在细胞中的研究表明了我们的方法有望用于相关疾病的诊断和治疗。
<110> 上海大学
<120> 检测肽酰基精氨酸脱亚氨酶用生物传感器及其制备方法和应用
<160> 2
<210> 1
<211> 8
<212> 多肽
<213> 人工序列
<400> 1
FGGGR GAC 8
<210> 2
<211> 6
<212> 多肽
<213> 人工序列
<400> 1
FGGGG C 6

Claims (5)

1.一种肽酰基精氨酸脱亚氨酶检测用生物传感器，其特征在于该传感器是在金电极表面上修饰一条多肽链1，在银纳米颗粒表面修饰多肽链2，通过葫芦脲[8]介导的超分子作用可以结合芳香族氨基酸，即葫芦脲[8]结合多肽链1和多肽链2 N末端的FGG，进而把两条多肽链连接在电极上；所述的多肽链1序列为FGGGRGAC；多肽链2序列为FGGGGC。
2.一种制备根据权利要求1所述的肽酰基精氨酸脱亚氨酶检测用生物传感器的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：将预处理过的金电极浸没在修饰电极的反应液中，4℃反应16-18h，即得到肽酰基精氨酸脱亚氨酶检测用生物传感器；每100μL所述的修饰反应液由50μL、10μM的多肽1、30μL、10mM的PBS和20μL、50mM的TCEP组成。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的金电极的预处理的方法为：将金电极用砂纸和含有颗粒大小为1.0μm、0.3μm和0.05μm的铝粉的麂皮上打磨和抛光之后，将电极分别在无水乙醇和超纯水中超声3min，然后用配置好的水虎鱼，即浓硫酸：过氧化氢=3:1的体积比的混合液，每根电极滴50μL，净化金电极，去除残留的杂质；最后经过0.5M的H2SO4活化。
4.一种肽酰基精氨酸脱亚氨酶的检测方法，采用三电极检测系统，其中饱和甘汞电极作为参比电极，铂丝作为对电极，工作电极采用根据权利要求1所述的肽酰基精氨酸脱亚氨酶检测用生物传感器，其特征在于该方法的具体步骤为：
a． 每50μL反应体系中含有50mM的Tris-HCl、10mM的CaCl2、0.005nM～200nM的PAD4，pH=7.6，将金电极浸没在该反应体系中，在37℃恒温温育2 h；
b．把步骤a所得金电极浸没在200μL的10mg/ml的胰蛋白缓冲液溶液中，在37℃的条件下反应1 h；所述的胰蛋白酶的缓冲液配方为：50mM的Tris-HCl，20mM的CaCl2，pH 8.4；
c．将步骤b所得的金电极浸没在5μM的葫芦脲8溶液中，室温反应1h；
d．将多肽链2修饰的银纳米颗粒在15000 r，4℃，离心20 min，去除未完全修饰上的多肽，再用修饰多肽的缓冲溶液复溶，将上述电极浸没在复溶液中，反应2.5 h；
e．通过三电极检测体系，采用线性扫描伏安法的电化学方法来表征银纳米颗粒的电化学信号的响应。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的多肽链2修饰银纳米颗粒的方法为：取1440uL的制备好的银纳米颗粒，加入60uL浓度为5uM多肽链2，在4℃的冰箱修饰16-18h。
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