一种基于二硫化钼的传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种基于二硫化钼的传感器及其制备方法和应用,具体涉及一种基于巯基化的核苷酸适配体(aptamer)共价结合二硫化钼金纳米复合体(MoS2-AuNP)的传感器及其用途,属于生物医学领域中的蛋白质检测方法。
背景技术
人的凝血酶是凝血连锁反应的主要效应蛋白酶,除了能够切割纤维蛋白原外,还发现能够特异性切割人类免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)V3环保守的冠部并促进HIV-1介导的细胞融合;此外,thrombin及细胞表面thrombin受体表达的上调可能与HIV-1相关脑病的发生相关,thrombin在凝血系统的许多疾病中发挥着关键性作用。过量表达thrombin能够导致血栓形成,但是若表达不足则可能导致血友病。因此,准确地监控thrombin对于确定给定病人的合适治疗方法是至关重要的(Liu Song et al.,Single-Molecule Detection ofProteins Using Aptamer-Functionalized Molecular Electronic Devices,Angewandate Chemie International Edition,2011,50:2496-2502.)。目前对于蛋白的检测技术有wester-bloting、双向凝胶电泳法、高效液相色谱法、毛细管电泳法以及生物质谱;这些方法尚存在灵敏度低和蛋白质容易堵塞色谱柱等问题。基于免疫反应的蛋白质分析方法是目前应用比较广泛的技术,但也存在着一些局限性,如抗体制备依赖于细胞或动物免疫,周期长、成本高,而且毒素和低免疫原性的目标物的抗体难以获得。此外,抗体本身稳定性差,对温度敏感(高温易失活),抗体标记难以精确化而且容易造成其活性降低、甚至变性失活,抗体的这些缺点限制了该类蛋白质检测方法的应用。由此可见,发展更加快速、准确、灵敏度高的蛋白质定量分析方法具有重要的意义。
MoS2制备简单,成本比较低,从而在生物检测中得到广泛的应用,而且MoS2在与DNA相互作用时,有一个重要的特点,单链DNA通过π-π效应,能吸附到MoS2表面aptamer是一种单链DNA,能特异性地结合thrombin,当thrombin与aptamer特异结合后,aptamer会脱离MoS2表面,一些研究者基于这个特点,通过荧光标记的aptamer对thrombin进行特异性检测(Xiang,X.,Shi,J.B.,Huang,F.H.,Zheng,M.M.,Deng,Q.C.Xu,J.Q.,MoS2 nanosheet-based fluorescent biosensor for protein detection via terminal protection ofsmall-molecule-linked DNA and exonuclease III-aided DNA recyclingamplification 2015.Biosensors and Bioelectronics 74,227–232.),但这类方法存在一个缺点:aptamer及被检测的thrombin能非特异性地吸附到MoS2表面,从而阻止检测灵敏性的提高。为发展高灵敏、快速、低成本地检测thrombin的方法,本发明利用巯基修饰的aptamer共价结合二硫化钼金纳米粒子复合物(MoS2-AuNP)阻止MoS2表面非特异性吸附,避免假信号的问题;同时采用吐温80(Tween 80)缩短aptamer与MoS2-AuNP的连接时间,去除二硫化钼表面对thrombin的吸附,从而提高检测的灵敏度,发展一种灵敏度较高的thrombin的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷,提供一种基于aptamer共价结合MoS2-AuNP的传感器,以阻止MoS2表面非特异性吸附,避免假信号的问题,同时采用吐温80(Tween 80)缩短MoS2-AuNP的连接时间,减少MoS2表面的非特异吸附,从而高灵敏、快速、低成本对thrombin进行检测。
本发明提供一种基于二硫化钼的传感器,所述传感器是经过巯基化的核苷酸适配体(aptamer)共价结合二硫化钼金纳米复合体(MoS2-AuNP),并且采用吐温80修饰。
本发明所述的一种基于二硫化钼的传感器,按照以下方法制备:
(1)制备MoS2:参照Eda的方法制备(Eda,et.al.Photoluminescence fromchemically exfoliated MoS2.Nano Letters,2011,11,5111-5116.):3g天然MoS2晶体浸泡入充满氩气的装有3mL1.6M正丁基锂烧瓶中2天进行锂插入;然后,用正己烷过滤以及冲洗产生的Li x MoS2,除去杂质;Li x MoS2在超纯水中超声1h,得到的悬浮液离心后用水冲洗,然后用混合纤维素酯膜过滤后,获得沉淀物于氩气保护的手套箱内300℃变性1小时,获得的MoS2溶于水,超声2h备用,大批量制备二硫化钼,使用前,在超纯水溶液中超声分散;
(2)制备金纳米:参照Frens的方法(Frens G,Controlled Nucleation for theRegulation of the Particle Size in Monodisperse Gold Suspensions,.Nature PhySci,1973,241,20-22)制备金纳米颗粒,得到的AuNP平均粒径15.7nm,浓度为1.2*1018M-3;
(3)制备MoS2-AuNP:将分散好的MoS2溶液与制备好的AuNP、超纯水混合搅拌均匀,加入乙二醇,在90℃反应5小时,10000r离心15min,然后将沉淀分散于超纯水中,避光保存;
其中,所述的MoS2溶液、AuNP、超纯水与乙二醇的体积比为10:10:10:15,其中,MoS2溶液浓度为2mg/mL,AuNP的浓度为9nM。
(4)合成凝血酶的核苷酸适配体:SH-5’-GG TTG GTG TGG TTG G-3’,3’末端标记羧基荧光素(FAM);
(5)传感器合成:在将核苷酸适配体加入到MoS2-AuNP的水溶液中,加入Tween 80得到混合溶液,将混合溶液在70℃水浴加热2.5h,10000r离心15min,然后将沉淀分散于0.1M PBS中;即制备成为基于核苷酸适配体共价结合MoS2-AuNP检测凝血酶的传感器;MoS2-AuNP能够淬灭核苷酸适配体末端标记的FAM的荧光。
其中,MoS2-AuNP的溶液中含核苷酸适配体的浓度为10nM,MoS2-AuNP的水溶液浓度为60μg/mL;
所述加入核苷酸适配体的MoS2-AuNP的溶液与加入的Tween80的体积比为100:1;其中的Tween80体积百分数为10%;
所述混合溶液中核苷酸适配体的终浓度为5-20nM,优选为10nM;MoS2的终浓度为20-70μg/mL,优选为60μg/mL。
所述的一种基于二硫化钼的传感器用于检测凝血酶。
所述的一种基于二硫化钼的传感器检测凝血酶的方法,具体操作如下:
向所述基于二硫化钼的传感器中加入凝血酶,核苷酸适配体结合凝血酶后,核苷酸适配体的结构发生变化,从MoS2-AuNP表面解吸附,FAM的荧光得到恢复,根据荧光强度的变化,从而对其进行检测。
与现有技术相比较,本发明具有以下优点:
1.本发明中MoS2具有独特的光学性能、可以大规模合成,且能够直接分散于水溶液中,无需添加表面活性剂;并且MoS2-AuNP易于获得,方法简单、成本低,充分利用MoS2-AuNP能淬灭单链DNA末端标记的荧光,当蛋白质结合单链DNA后,荧光能快速恢复的特点,能快速、特异性、高灵敏性对凝血酶进行检测。
2.本发明采用aptamer共价结合MoS2-AuNP,阻止MoS2表面非特异性吸附,避免假信号的问题,采用Tween 80缩短aptamer与MoS2-AuNP的连接时间(由反应16h缩短至2.5h,考文献报道的效果Shengmin Xu,Hang Yuan,An Xu,Jun Wang,and Lijun Wu,RapidSynthesis of Stable and Functional Conjugates of DNA/Gold,Langmuir 2011,27,13629–13634Nanoparticles Mediated by Tween 80),并能去除对蛋白质的非特异吸附。
3.二硫化钼表面在Tween 80作用下通过AuNP连接aptamer,制备出一种新型二硫化钼传感器,该传感器能快速、特异性、高灵敏性、低成本对thrombin进行检测,该方法的检测限达到0.4pM。
附图说明
图1:本发明的流程示意图;MoS2表面固定AuNP后,连接凝血酶的核苷酸适配体,制备出MoS2-AuNP-aptamer传感器,MoS2淬灭核苷酸适配体上的荧光,加入凝血酶后,凝血酶使核苷酸适配体远离MoS2表面而使荧光强度增强,从而对凝血酶进行检测。
图2:基于MoS2-AuNP传感器对凝血酶灵敏性检测图;图中曲线由下至上凝血酶的浓度依次为0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、1、10、20nM。
图3:基于MoS2-AuNP传感器对凝血酶选择性检测图;
图4:Tween 80修饰MoS2-AuNP传感器对0.4pM凝血酶检测图,图中曲线由上至下依次为aptamer、aptamer-MoS2-AuNP-Tween80-0.4pM thrombin、aptamer-MoS2-AuNP-Tween80检测结果曲线。
图5:Tween 80修饰MoS2-Au传感器对0.01nM凝血酶检测图,图中曲线由上至下依次为aptamer、aptamer-MoS2-AuNP-Tween80-0.01nM thrombin、aptamer-MoS2-AuNP-Tween80检测结果曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明,实施例是用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。
实施例1:
(1)制备MoS2:参照Eda的方法制备(Eda,et.al.Photoluminescence fromchemically exfoliated MoS2.Nano Letters,2011,11,5111-5116.):
3g天然MoS2晶体浸泡入充满氩气的装有3mL 1.6M正丁基锂烧瓶中2天进行锂插入;然后,用正己烷过滤以及冲洗产生的Li x MoS2除去杂质。Li x MoS2在超纯水中超声1h,得到的悬浮液离心后用水冲洗,然后用混合纤维素酯膜过滤后,获得沉淀物于氩气保护的手套箱内300℃变性1小时,获得的MoS2溶于水,超声2h备用。
(2)制备金纳米:参照Frens的方法(Frens G,Controlled Nucleation for theRegulation of the Particle Size in Monodisperse Gold Suspensions,.Nature PhySci,1973,241,20-22)制备金纳米颗粒,得到的AuNP平均粒径15.7nm,浓度为1.2*1018M-3;
(3)制备MoS2-AuNP:将浓度为2mg/mL的10mL分散好的MoS2溶液与浓度为9nM的10mL制备好的AuNP、超纯水10mL混合搅拌均匀,加入乙二醇12mL,在90℃反应5小时,10000r离心15min,然后将沉淀分散于超纯水中,避光保存;
(4)合成特异的aptamer序列:SH-5’-GG TTG GTG TGG TTG G-3’,5’末端标记荧光FAM,该序列在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
(5)基于MoS2-AuNP传感器对凝血酶进行检测:将核苷酸适配体加入到MoS2-AuNP水溶液中,室温下反应16h,离心去除多余物理吸附的核苷酸适配体,即制备成为基于核苷酸适配体共价结合MoS2-AuNP检测凝血酶的传感器;MoS2-AuNP能够淬灭核苷酸适配体末端标记的FAM的荧光;其中核苷酸适配体的终浓度为10nM;MoS2-AuNP的终浓度为60μg/mL;
(6)对凝血酶的检测:向步骤(5)中加入不同浓度(0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、1、10、20nM)凝血酶后,FAM荧光强度增加,30min后对aptamer上标记的FAM进行扫描,如图2,其中核苷酸适配体的浓度为10nM;MoS2-AuNP的浓度为60μg/mL;检测发现,该传感器的检测灵敏度可达到0.5pM。
其中图1为本发明的流程示意图,MoS2表面固定AuNP后,连接凝血酶的核苷酸适配体,制备出MoS2-AuNP-aptamer传感器,图中与凝血酶结合的核苷酸适配体是G4结构,当G4与MoS2-AuNP吸附后,末端标记的FAM荧光淬灭,当结合凝血酶后,G4脱离MoS2-AuNP表面而使FAM发光。
(7)选取其他与aptamer非特异作用的几个蛋白质lysozyme、BSA、IgG进行选择性检测,在同一实验条件下,发现MoS2-AuNP-aptamer能特异结合thrombin,并能明显区分出与其他几个蛋白的差别,如图3,实验证明该检测方法对thrombin具有良好地选择性。
(8)基于Tween 80修饰的MoS2-AuNP传感器对thrombin进行检测:将核苷酸适配体加入到MoS2-AuNP的溶液中,其中,MoS2-AuNP溶液中核苷酸适配体的浓度为10nM,含有的MoS2-AuNP的浓度为60μg/mL,加入核苷酸适配体的MoS2-AuNP的溶液总体积为1mL;然后加入10μL 10%的Tween80得到混合溶液,(Tween80的制备参照:Hengmin Xu,Hang Yuan,An Xu,Jun Wang,and Lijun Wu,Rapid Synthesis of Stable and Functional Conjugates ofDNA/Gold,|Langmuir 2011,27,13629–13634)混合后,室温下放置30min后,水浴加热70℃2.5h,10000r离心15min,然后将沉淀分散于0.1M PBS中。对0.4pM的凝血酶进行检测,通过Origin 8.0分析核苷酸适配体上标记的FAM强度发生变化,发现经检测Tween 80修饰的传感器的灵敏度实际可以达到0.4pM(图4)。
实施例2:
步骤(1)-(4)同实施例1中。
(5)荧光淬灭:将核苷酸适配体加入到MoS2-AuNP的水溶液中,然后加入Tween80得到混合溶液,室温下放置30min后,将混合溶液在70℃水浴加热2.5h,10000r离心15min,然后将沉淀分散于0.1M PBS中。即制备成为基于核苷酸适配体共价结合MoS2-AuNP检测凝血酶的传感器;MoS2-AuNP能够淬灭核苷酸适配体末端标记的FAM的荧光。
其中,MoS2-AuNP的水溶液中含核苷酸适配体的浓度为10nM,含有的MoS2-AuNP的浓度为60μg/mL;
所述加入核苷酸适配体的MoS2-AuNP的水溶液位1mL,加入的Tween80的体积为10μL;其中Tween80的质量百分数为10%;
所述混合溶液中核苷酸适配体的终浓度为10nM;MoS2的终浓度为60μg/mL。
(6)基于Tween 80修饰的MoS2-AuNP传感器对凝血酶进行检测:向步骤(5)中加入凝血酶,室温下放置30min后,对0.01nM的凝血酶进行检测,通过Origin 8.0分析核苷酸适配体上标记的FAM强度发生变化,发现检测的灵敏度达到0.01nM(图5)。
实施例3:
步骤(1)-(4)同实施例1中。
(5)荧光淬灭:将核苷酸适配体加入到MoS2-AuNP的水溶液中,然后加入Tween80得到混合溶液,室温下放置30min后,将混合溶液在70℃水浴加热2.5h,10000r离心15min,然后将沉淀分散于0.1M PBS中。,即制备成为基于核苷酸适配体共价结合MoS2-AuNP检测凝血酶的传感器;MoS2-AuNP能够淬灭核苷酸适配体末端标记的FAM的荧光。
其中,MoS2-AuNP的水溶液中含核苷酸适配体的浓度为10nM,含有的MoS2-AuNP的浓度为60μg/mL;
所述加入核苷酸适配体的MoS2-AuNP的溶液位1mL,加入的Tween80的体积为10μL;其中Tween80的质量百分数为10%;
所述混合溶液中核苷酸适配体的终浓度为10nM;MoS2的终浓度为60μg/mL。
(6)基于Tween 80修饰的MoS2-AuNP传感器对thrombin进行检测:向步骤(3)中加入凝血酶,室温下放置30min后,室温下放置30min后,对0.1nM的thrombin进行检测,通过Origin 8.0分析aptamer上标记的FAM强度发生变化,发现检测的灵敏度达到0.1nM。