CN105651999B - 一种基于二硫化钼的传感器及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基于二硫化钼的传感器及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于二硫化钼的传感器及其制备方法和应用，属于生物医学领域中的蛋白质检测方法；本发明的技术方案主要包括：首先制备MoS2‑AuNP复合物；再合成凝血酶的核苷酸适配体；将合成的核苷酸适配体加入到MoS2‑AuNP的水溶液中，再加入Tween80得到混合溶液，室温下反应30min后，将混合溶液在70℃水浴加热2.5h，10000r离心15min，然后将沉淀分散于0.1M PBS中；即制备成为本发明所述的传感器；本发明充分利用MoS2‑‑AuNP淬灭荧光的特性，采用FAM标记的核酸适配体序列与凝血酶特异性结合，通过FAM荧光的淬灭与恢复，能高灵敏度、快速、低成本地实现凝血酶的微量检测，通过加入吐温80，将MoS2‑AuNP‑核酸适配体传感器对凝血酶实际检测限提高至0.4pM。

Description

一种基于二硫化钼的传感器及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种基于二硫化钼的传感器及其制备方法和应用，具体涉及一种基于巯基化的核苷酸适配体(aptamer)共价结合二硫化钼金纳米复合体(MoS2-AuNP)的传感器及其用途，属于生物医学领域中的蛋白质检测方法。
背景技术
人的凝血酶是凝血连锁反应的主要效应蛋白酶，除了能够切割纤维蛋白原外，还发现能够特异性切割人类免疫缺陷病毒-1型(HIV-1)V3环保守的冠部并促进HIV-1介导的细胞融合；此外，thrombin及细胞表面thrombin受体表达的上调可能与HIV-1相关脑病的发生相关，thrombin在凝血系统的许多疾病中发挥着关键性作用。过量表达thrombin能够导致血栓形成，但是若表达不足则可能导致血友病。因此，准确地监控thrombin对于确定给定病人的合适治疗方法是至关重要的(Liu Song et al.,Single-Molecule Detection ofProteins Using Aptamer-Functionalized Molecular Electronic Devices,Angewandate Chemie International Edition,2011,50:2496-2502.)。目前对于蛋白的检测技术有wester-bloting、双向凝胶电泳法、高效液相色谱法、毛细管电泳法以及生物质谱；这些方法尚存在灵敏度低和蛋白质容易堵塞色谱柱等问题。基于免疫反应的蛋白质分析方法是目前应用比较广泛的技术，但也存在着一些局限性，如抗体制备依赖于细胞或动物免疫，周期长、成本高，而且毒素和低免疫原性的目标物的抗体难以获得。此外，抗体本身稳定性差，对温度敏感(高温易失活)，抗体标记难以精确化而且容易造成其活性降低、甚至变性失活，抗体的这些缺点限制了该类蛋白质检测方法的应用。由此可见，发展更加快速、准确、灵敏度高的蛋白质定量分析方法具有重要的意义。
MoS2制备简单，成本比较低，从而在生物检测中得到广泛的应用，而且MoS2在与DNA相互作用时，有一个重要的特点，单链DNA通过π－π效应，能吸附到MoS2表面aptamer是一种单链DNA，能特异性地结合thrombin，当thrombin与aptamer特异结合后，aptamer会脱离MoS2表面，一些研究者基于这个特点，通过荧光标记的aptamer对thrombin进行特异性检测(Xiang,X.,Shi,J.B.,Huang,F.H.,Zheng,M.M.,Deng,Q.C.Xu,J.Q.,MoS2 nanosheet-based fluorescent biosensor for protein detection via terminal protection ofsmall-molecule-linked DNA and exonuclease III-aided DNA recyclingamplification 2015.Biosensors and Bioelectronics 74,227–232.)，但这类方法存在一个缺点：aptamer及被检测的thrombin能非特异性地吸附到MoS2表面，从而阻止检测灵敏性的提高。为发展高灵敏、快速、低成本地检测thrombin的方法，本发明利用巯基修饰的aptamer共价结合二硫化钼金纳米粒子复合物(MoS2-AuNP)阻止MoS2表面非特异性吸附，避免假信号的问题；同时采用吐温80(Tween 80)缩短aptamer与MoS2-AuNP的连接时间，去除二硫化钼表面对thrombin的吸附，从而提高检测的灵敏度，发展一种灵敏度较高的thrombin的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种基于aptamer共价结合MoS2-AuNP的传感器，以阻止MoS2表面非特异性吸附，避免假信号的问题，同时采用吐温80(Tween 80)缩短MoS2-AuNP的连接时间，减少MoS2表面的非特异吸附，从而高灵敏、快速、低成本对thrombin进行检测。
本发明提供一种基于二硫化钼的传感器，所述传感器是经过巯基化的核苷酸适配体(aptamer)共价结合二硫化钼金纳米复合体(MoS2-AuNP)，并且采用吐温80修饰。
本发明所述的一种基于二硫化钼的传感器，按照以下方法制备：
(1)制备MoS2：参照Eda的方法制备(Eda,et.al.Photoluminescence fromchemically exfoliated MoS2.Nano Letters,2011,11,5111-5116.)：3g天然MoS2晶体浸泡入充满氩气的装有3mL1.6M正丁基锂烧瓶中2天进行锂插入；然后，用正己烷过滤以及冲洗产生的Li x MoS2，除去杂质；Li x MoS2在超纯水中超声1h，得到的悬浮液离心后用水冲洗，然后用混合纤维素酯膜过滤后，获得沉淀物于氩气保护的手套箱内300℃变性1小时，获得的MoS2溶于水，超声2h备用，大批量制备二硫化钼，使用前，在超纯水溶液中超声分散；
(2)制备金纳米：参照Frens的方法(Frens G,Controlled Nucleation for theRegulation of the Particle Size in Monodisperse Gold Suspensions,.Nature PhySci,1973,241,20-22)制备金纳米颗粒，得到的AuNP平均粒径15.7nm，浓度为1.2*1018M-3；
(3)制备MoS2-AuNP：将分散好的MoS2溶液与制备好的AuNP、超纯水混合搅拌均匀，加入乙二醇，在90℃反应5小时，10000r离心15min，然后将沉淀分散于超纯水中，避光保存；
其中，所述的MoS2溶液、AuNP、超纯水与乙二醇的体积比为10:10:10:15，其中，MoS2溶液浓度为2mg/mL，AuNP的浓度为9nM。
(4)合成凝血酶的核苷酸适配体：SH-5’-GG TTG GTG TGG TTG G-3’，3’末端标记羧基荧光素(FAM)；
(5)传感器合成：在将核苷酸适配体加入到MoS2-AuNP的水溶液中，加入Tween 80得到混合溶液，将混合溶液在70℃水浴加热2.5h，10000r离心15min，然后将沉淀分散于0.1M PBS中；即制备成为基于核苷酸适配体共价结合MoS2-AuNP检测凝血酶的传感器；MoS2-AuNP能够淬灭核苷酸适配体末端标记的FAM的荧光。
其中，MoS2-AuNP的溶液中含核苷酸适配体的浓度为10nM，MoS2-AuNP的水溶液浓度为60μg/mL；
所述加入核苷酸适配体的MoS2-AuNP的溶液与加入的Tween80的体积比为100：1；其中的Tween80体积百分数为10％；
所述混合溶液中核苷酸适配体的终浓度为5-20nM，优选为10nM；MoS2的终浓度为20-70μg/mL，优选为60μg/mL。
所述的一种基于二硫化钼的传感器用于检测凝血酶。
所述的一种基于二硫化钼的传感器检测凝血酶的方法，具体操作如下：
向所述基于二硫化钼的传感器中加入凝血酶，核苷酸适配体结合凝血酶后，核苷酸适配体的结构发生变化，从MoS2-AuNP表面解吸附，FAM的荧光得到恢复，根据荧光强度的变化，从而对其进行检测。
与现有技术相比较，本发明具有以下优点：
1.本发明中MoS2具有独特的光学性能、可以大规模合成，且能够直接分散于水溶液中，无需添加表面活性剂；并且MoS2-AuNP易于获得，方法简单、成本低，充分利用MoS2-AuNP能淬灭单链DNA末端标记的荧光，当蛋白质结合单链DNA后，荧光能快速恢复的特点，能快速、特异性、高灵敏性对凝血酶进行检测。
2.本发明采用aptamer共价结合MoS2-AuNP，阻止MoS2表面非特异性吸附，避免假信号的问题，采用Tween 80缩短aptamer与MoS2-AuNP的连接时间(由反应16h缩短至2.5h，考文献报道的效果Shengmin Xu,Hang Yuan,An Xu,Jun Wang,and Lijun Wu，RapidSynthesis of Stable and Functional Conjugates of DNA/Gold，Langmuir 2011,27,13629–13634Nanoparticles Mediated by Tween 80)，并能去除对蛋白质的非特异吸附。
3.二硫化钼表面在Tween 80作用下通过AuNP连接aptamer，制备出一种新型二硫化钼传感器，该传感器能快速、特异性、高灵敏性、低成本对thrombin进行检测，该方法的检测限达到0.4pM。
附图说明
图1：本发明的流程示意图；MoS2表面固定AuNP后，连接凝血酶的核苷酸适配体，制备出MoS2-AuNP-aptamer传感器，MoS2淬灭核苷酸适配体上的荧光，加入凝血酶后，凝血酶使核苷酸适配体远离MoS2表面而使荧光强度增强，从而对凝血酶进行检测。
图2：基于MoS2-AuNP传感器对凝血酶灵敏性检测图；图中曲线由下至上凝血酶的浓度依次为0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、1、10、20nM。
图3：基于MoS2-AuNP传感器对凝血酶选择性检测图；
图4：Tween 80修饰MoS2-AuNP传感器对0.4pM凝血酶检测图，图中曲线由上至下依次为aptamer、aptamer-MoS2-AuNP-Tween80-0.4pM thrombin、aptamer-MoS2-AuNP-Tween80检测结果曲线。
图5：Tween 80修饰MoS2-Au传感器对0.01nM凝血酶检测图，图中曲线由上至下依次为aptamer、aptamer-MoS2-AuNP-Tween80-0.01nM thrombin、aptamer-MoS2-AuNP-Tween80检测结果曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明，实施例是用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。
实施例1：
(1)制备MoS2：参照Eda的方法制备(Eda,et.al.Photoluminescence fromchemically exfoliated MoS2.Nano Letters,2011,11,5111-5116.)：
3g天然MoS2晶体浸泡入充满氩气的装有3mL 1.6M正丁基锂烧瓶中2天进行锂插入；然后，用正己烷过滤以及冲洗产生的Li x MoS2除去杂质。Li x MoS2在超纯水中超声1h，得到的悬浮液离心后用水冲洗，然后用混合纤维素酯膜过滤后，获得沉淀物于氩气保护的手套箱内300℃变性1小时，获得的MoS2溶于水，超声2h备用。
(2)制备金纳米：参照Frens的方法(Frens G,Controlled Nucleation for theRegulation of the Particle Size in Monodisperse Gold Suspensions,.Nature PhySci,1973,241,20-22)制备金纳米颗粒，得到的AuNP平均粒径15.7nm，浓度为1.2*1018M-3；
(3)制备MoS2-AuNP：将浓度为2mg/mL的10mL分散好的MoS2溶液与浓度为9nM的10mL制备好的AuNP、超纯水10mL混合搅拌均匀，加入乙二醇12mL，在90℃反应5小时，10000r离心15min，然后将沉淀分散于超纯水中，避光保存；
(4)合成特异的aptamer序列：SH-5’-GG TTG GTG TGG TTG G-3’，5’末端标记荧光FAM，该序列在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
(5)基于MoS2-AuNP传感器对凝血酶进行检测：将核苷酸适配体加入到MoS2-AuNP水溶液中，室温下反应16h，离心去除多余物理吸附的核苷酸适配体，即制备成为基于核苷酸适配体共价结合MoS2-AuNP检测凝血酶的传感器；MoS2-AuNP能够淬灭核苷酸适配体末端标记的FAM的荧光；其中核苷酸适配体的终浓度为10nM；MoS2-AuNP的终浓度为60μg/mL；
(6)对凝血酶的检测：向步骤(5)中加入不同浓度(0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、1、10、20nM)凝血酶后，FAM荧光强度增加，30min后对aptamer上标记的FAM进行扫描，如图2，其中核苷酸适配体的浓度为10nM；MoS2-AuNP的浓度为60μg/mL；检测发现，该传感器的检测灵敏度可达到0.5pM。
其中图1为本发明的流程示意图，MoS2表面固定AuNP后，连接凝血酶的核苷酸适配体，制备出MoS2-AuNP-aptamer传感器，图中与凝血酶结合的核苷酸适配体是G4结构，当G4与MoS2-AuNP吸附后，末端标记的FAM荧光淬灭，当结合凝血酶后，G4脱离MoS2-AuNP表面而使FAM发光。
(7)选取其他与aptamer非特异作用的几个蛋白质lysozyme、BSA、IgG进行选择性检测，在同一实验条件下，发现MoS2-AuNP-aptamer能特异结合thrombin，并能明显区分出与其他几个蛋白的差别，如图3，实验证明该检测方法对thrombin具有良好地选择性。
(8)基于Tween 80修饰的MoS2-AuNP传感器对thrombin进行检测：将核苷酸适配体加入到MoS2-AuNP的溶液中，其中，MoS2-AuNP溶液中核苷酸适配体的浓度为10nM，含有的MoS2-AuNP的浓度为60μg/mL，加入核苷酸适配体的MoS2-AuNP的溶液总体积为1mL；然后加入10μL 10％的Tween80得到混合溶液，(Tween80的制备参照：Hengmin Xu,Hang Yuan,An Xu,Jun Wang,and Lijun Wu，Rapid Synthesis of Stable and Functional Conjugates ofDNA/Gold，|Langmuir 2011,27,13629–13634)混合后，室温下放置30min后，水浴加热70℃2.5h，10000r离心15min，然后将沉淀分散于0.1M PBS中。对0.4pM的凝血酶进行检测，通过Origin 8.0分析核苷酸适配体上标记的FAM强度发生变化，发现经检测Tween 80修饰的传感器的灵敏度实际可以达到0.4pM(图4)。
实施例2：
步骤(1)-(4)同实施例1中。
(5)荧光淬灭：将核苷酸适配体加入到MoS2-AuNP的水溶液中，然后加入Tween80得到混合溶液，室温下放置30min后，将混合溶液在70℃水浴加热2.5h，10000r离心15min，然后将沉淀分散于0.1M PBS中。即制备成为基于核苷酸适配体共价结合MoS2-AuNP检测凝血酶的传感器；MoS2-AuNP能够淬灭核苷酸适配体末端标记的FAM的荧光。
其中，MoS2-AuNP的水溶液中含核苷酸适配体的浓度为10nM，含有的MoS2-AuNP的浓度为60μg/mL；
所述加入核苷酸适配体的MoS2-AuNP的水溶液位1mL，加入的Tween80的体积为10μL；其中Tween80的质量百分数为10％；
所述混合溶液中核苷酸适配体的终浓度为10nM；MoS2的终浓度为60μg/mL。
(6)基于Tween 80修饰的MoS2-AuNP传感器对凝血酶进行检测：向步骤(5)中加入凝血酶，室温下放置30min后，对0.01nM的凝血酶进行检测，通过Origin 8.0分析核苷酸适配体上标记的FAM强度发生变化，发现检测的灵敏度达到0.01nM(图5)。
实施例3：
步骤(1)-(4)同实施例1中。
(5)荧光淬灭：将核苷酸适配体加入到MoS2-AuNP的水溶液中，然后加入Tween80得到混合溶液，室温下放置30min后，将混合溶液在70℃水浴加热2.5h，10000r离心15min，然后将沉淀分散于0.1M PBS中。，即制备成为基于核苷酸适配体共价结合MoS2-AuNP检测凝血酶的传感器；MoS2-AuNP能够淬灭核苷酸适配体末端标记的FAM的荧光。
其中，MoS2-AuNP的水溶液中含核苷酸适配体的浓度为10nM，含有的MoS2-AuNP的浓度为60μg/mL；
所述加入核苷酸适配体的MoS2-AuNP的溶液位1mL，加入的Tween80的体积为10μL；其中Tween80的质量百分数为10％；
所述混合溶液中核苷酸适配体的终浓度为10nM；MoS2的终浓度为60μg/mL。
(6)基于Tween 80修饰的MoS2-AuNP传感器对thrombin进行检测：向步骤(3)中加入凝血酶，室温下放置30min后，室温下放置30min后，对0.1nM的thrombin进行检测，通过Origin 8.0分析aptamer上标记的FAM强度发生变化，发现检测的灵敏度达到0.1nM。

Claims (5)

1.一种基于二硫化钼的用于非诊断目的的获得凝血酶含量信息的传感器，其特征在于，所述传感器的检测限为0.4pM；具体的，所述传感器按照以下步骤制备：
（1）制备MoS2-AuNP：将MoS2溶液、金纳米颗粒 AuNP、超纯水混合搅拌均匀，加入乙二醇，在90℃反应5小时，离心后将沉淀分散于超纯水中，避光保存；所述的MoS2溶液、金纳米颗粒AuNP、超纯水、乙二醇的体积比为10:10:10：12；其中MoS2溶液的浓度为2mg/mL；金纳米颗粒AuNP的浓度为9nM；
（2）合成凝血酶的核苷酸适配体：SH-5’- GG TTG GTG TGG TTG G -3’，3’末端标记羧基荧光素（FAM）；
（3）传感器合成：将核苷酸适配体加入到MoS2-AuNP水溶液中，同时加入Tween80，室温反应30min后，将混合溶液在70℃水浴加热2.5 h ，离心，然后将沉淀分散于PBS缓冲液中；即制备成为基于核苷酸适配体共价结合MoS2-AuN检测凝血酶的传感器；
步骤（3）中所述的加入核苷酸适配体的MoS2-AuNP的水溶液与加入的Tween80的体积比为100：1；其中Tween80的质量百分数为10%；
步骤（3）中所述的混合溶液中核苷酸适配体的终浓度为5-20 nM；MoS2的终浓度为20-70µg/mL。
2.根据权利要求1所述的一种基于二硫化钼的用于非诊断目的的获得凝血酶含量信息的传感器，其特征在于，步骤（3）中所述的MoS2-AuNP的水溶液中含核苷酸适配体的浓度为10nM，含有的MoS2-AuNP的浓度为 60µg/ mL。
3.根据权利要求1所述的一种基于二硫化钼的用于非诊断目的的获得凝血酶含量信息的传感器，其特征在于，步骤（3）中所述的PBS缓冲液的浓度为0.1M。
4.如权利要求1所述的一种基于二硫化钼的传感器用于非诊断目的的获得凝血酶含量信息。
5.如权利要求1所述的一种基于二硫化钼的传感器非诊断目的的获得凝血酶含量信息的方法，具体操作如下：
向所述基于二硫化钼的传感器中加入凝血酶，核苷酸适配体结合凝血酶后，核苷酸适配体的结构发生变化，从MoS2-AuNP表面解吸附，FAM的荧光得到恢复，根据荧光强度的变化，从而对其进行检测。
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Fabrication of electrochemiluminescence aptasensor based on in situ growth of gold nanoparticles on layered molybdenum disulfide for sensitive detection of platelet-derived growth factor-BB;Yan-Ming Liu et al;《RSC Advances》;20140529;第4卷;摘要，第22889页左栏第2-4段，右栏第3段，Scheme 1 *
Highly Sensitive and Selective Determination of Dopamine in the Presence of Ascorbic Acid Using Gold Nanoparticles-Decorated MoS2 Nanosheets Modified Electrode;Shao Su et al;《Electroanalysis》;20131009;第25卷(第11期);第2523-2529页 *
Rapid Synthesis of Stable and Functional Conjugates of DNA/Gold Nanoparticles Mediated by Tween80;Shengmin Xu ，et al;《langmuir》;20110930;第27卷;摘要，第13630页左栏第3段，图1 *
Shape-controlled gold nanoparticles supported on MoS2 nanosheets:synergistic effect of thionine and MoS2 and their application for electrochemical label-free immunosensing;Shao Su et al;《Nanoscale》;20151020;第7卷;第19129-19135页 *
Single-Layer MoS2‑Based Nanoprobes for Homogeneous Detection of Biomolecules;Changfeng Zhu et al;《JACS》;20130409;第135卷;第5998-6001页 *

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