CN109116040B - 一种基于双巯基核酸适配体检测可卡因的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物分子检测方法领域，具体涉及一种基于双巯基核酸适配体检测可卡因的方法。本发明检测可卡因的方法具体为：将DNA序列1溶液与DNA序列2溶液混合，水浴培养，得到双巯基核酸适配体1溶液；MoS2@AuNPs表面固定双巯基核酸适配体1；加入可卡因溶液，得到可卡因溶液1；加入核酸适配体2，得到可卡因溶液2；测定步骤可卡因溶液2的荧光强度，计算其荧光增长率，建立荧光增长率与可卡因浓度之间的线性回归方程；测定待测可卡因溶液的浓度。本发明采用MoS2@AuNPs‑双巯基核酸适配体1、核酸适配体2与可卡因形成一个类似于三明治的结构，可放大荧光信号，便于检测体系捕捉并检测，达到快速、准确、特异性检测待测物可卡因的效果。

Description

一种基于双巯基核酸适配体检测可卡因的方法
技术领域
本发明属于生物分子检测方法领域，具体涉及一种基于双巯基核酸适配体检测可卡因的方法。
背景技术
目前为止，实验室分析可卡因主要通过色谱、光谱以及质谱等技术，如液相色谱-双质谱系统（LC/MS/MS）。传统的药物分析方法还包括电化学方法、表面等离子共振法、石英微天平法、纳米孔法、酶联免疫法。但是，这些方法仍存在一些弊端，如电化学方法选择性较差，对待测物质的组成形态和成分含量的分析不精准，易产生极化，使有电流流过电极时的电极电位值与平衡电极电位产生偏差，致使检测结果误差较大；表面等离子共振法主要依靠物理光折射原理，存在能量衰减现象，设备昂贵，便携性差，系统稳定性较弱，对分子量小于1000的物质检测结果还未达到理想水平，灵敏度有待提高；石英晶体微天平法中的电极不易制备，其对石英晶振电极的处理和保存，实验室环境条件尤其温度等具有严格的要求；纳米孔法并不产生可观的直流信号，而会产生较大的无可避免的噪音扰动，对检测结果具有一定的影响；酶联免疫吸附法操作过程繁琐，不能一蹴而就，只是检测的辅助手段，特异性和灵敏性有待提高。
基于二硫化钼-核酸适配体的方法有效地避免了以上这些问题，简单的二硫化钼传感器易受到核酸适配体的结合状态影响，假阳性信号较高。有研究表明，AuNPs（金纳米颗粒）修饰会显著增强二硫化钼电子转移能力。有学者利用DNA功能化的MoS2@AuNPs（二硫化钼金纳米复合材料）高灵敏检测了人体血小板源生长因子BB (PDGF-BB），其检测限达到1.1fM。Shuai等利用AuNPs覆盖的二硫化钼微立方体构建传感器，分析microRNA，检测限为0.086 fM。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中成本高，便携性差，系统稳定性弱，灵敏性较低，操作过程繁琐等缺陷，本发明提供了一种基于双巯基核酸适配体检测可卡因的方法。
具体的，本发明包括以下步骤：
（1）制备双巯基核酸适配体1：
将DNA1与DNA2混合，得到DNA混合液，水浴反应后，再置于室温下培养，得到双巯基核酸适配体1溶液；
（2）MoS2@AuNPs表面固定双巯基核酸适配体1：
向PBS缓冲液中加入步骤（1）中所制备的双巯基核酸适配体1溶液与MoS2@AuNPs溶液，进行培养，得到含有MoS2@AuNPs-双巯基核酸适配体1复合物的培养液，离心，向得到的沉淀物中加入PBS缓冲液，混匀后，得到MoS2@AuNPs-双巯基核酸适配体1溶液；
（3）结合可卡因：
将步骤（2）得到的MoS2@AuNPs-双巯基核酸适配体1溶液中，加入不同浓度梯度的可卡因溶液，培育，分别得到不同可卡因浓度的混合液1；
（4）加入核酸适配体2：
分别向步骤（3）的不同可卡因浓度的混合液1中，加入核酸适配体2，得到混合液2，培养，离心，向得到的沉淀物中加入PBS缓冲液，混匀，分别得到不同可卡因浓度的混合液3；
（5）建立荧光增长率与可卡因浓度之间的线性回归方程：
采集MoS2@AuNPs表面固定双巯基核酸适配体1后的背景荧光强度F0，分别测定步骤（4）不同可卡因浓度的混合液3的荧光强度F，计算混合液3中各可卡因浓度的荧光增长率F/F0-1；然后建立荧光增长率F/F0-1与可卡因浓度x之间的线性回归方程y=ax+b，其中y表示荧光增长率F/F0-1，a、b为线性回归系数；
（6）测定待测可卡因溶液的浓度：
重复步骤（1）-（2）的操作，制备MoS2@AuNPs-双巯基核酸适配体1溶液，加入待测可卡因溶液、核酸适配体2，培养，离心，向得到的沉淀物中加入PBS缓冲液，混匀，得到待测混合液，测定待测混合液的荧光强度F待测，并采集MoS2@AuNPs表面固定双巯基核酸适配体1后的背景荧光强度F0，计算待测混合液的荧光增长率F待测/F0-1，根据建立的线性回归方程，计算出待测可卡因溶液的浓度。
步骤（1）中，所述DNA 1的核苷酸序列（SEQ.ID.NO.1）为：5’-SH-CCATAGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’；
所述DNA 2的核苷酸序列（SEQ.ID.NO.2）为：3’-SH-GGTATCCCT-5’；
所述双巯基核酸适配体1的核苷酸序列为：
5’-SH-CCATAGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’ (SEQ.ID.NO.3)
3’-SH-GGTATCCCT-5’(SEQ.ID.NO.4)；
步骤（1）中，所述DNA混合液中，所述DNA 1与DNA2的摩尔浓度比为1：1；所述水浴反应的条件为95℃水浴5分钟，或者所述水浴反应的条件为4℃水浴半小时；所述室温下培养的时间为1h；
所述PBS缓冲液的浓度为10mM，PH为7.4；
步骤（2）中，双巯基核酸适配体1溶液与MoS2@AuNPs溶液的摩尔浓度为1：2；所述培养的条件为4℃过夜；
步骤（3）中，所述培育的温度为37℃，所述培育的时间为半小时；
步骤（4）中，所述混合液2中，核酸适配体2的浓度为10 nM；所述培养的温度为37℃，所述培养的时间为半小时；
步骤（4）中，所述核酸适配体2的核苷酸序列（SEQ.ID.NO.5）为：5’-CCATAGGGAGACAAGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-FAM-3’；
步骤（5）中，步骤（1）所使用水浴条件为95℃水浴5分钟时，所述线性回归方程y=12.28497x+0.58782，R2=0.96752；步骤（1）所使用水浴条件为4℃水浴半小时时，所述线性回归方程y=11.78529x+0.89573，R2=0.97846。
与现有技术相比较，本发明的有益效果体现如下：
（1）本发明所使用设备简单，所用试剂携带方便，系统较稳定，操作过程简便，对实验室环境条件无严格要求，常温下即可对可卡因进行检测。
（2）本发明所用的二硫化钼金纳米粒子复合物（MoS2@AuNPs）—双巯基核酸适配体1是将Au-S键固定化到二硫化钼的表面，结合DNA的能力大大增强，此外本发明中使用的MoS2@AuNPs纳米复合材料易于制取，且AuNPs（金纳米颗粒）不会明显改变二硫化钼的化学结构，方法简单、成本低，可高效固定双巯基修饰的DNA序列。
（3）本发明固定在MoS2@AuNPs纳米复合材料表面的无荧光的双巯基核酸适配体1，信号检测背景较低，加入可卡因以及荧光修饰的核酸适配体2后，能特异性、高灵敏检测可卡因，信号噪音较高。
（4）本发明采用二硫化钼金纳米粒子复合物（MoS2@AuNPs）—双巯基核酸适配体1、核酸适配体2对可卡因进行检测，检测限达到了0.54pM，远低于国家标准检测限10ng/mL。双巯基能较大程度增强双巯基核酸适配体1与MoS2@AuNPs复合材料的结合能力，有效地增强实验的灵敏性。
（5）本发明使用MoS2@AuNPs-双巯基核酸适配体1、核酸适配体2与可卡因形成一个类似于三明治的结构，可放大荧光信号，便于检测体系捕捉并检测，达到快速、准确检测待测物可卡因的效果。本发明中的二硫化钼金纳米粒子复合物（MoS2@AuNPs）—双巯基核酸适配体1、核酸适配体2，有效地解决了简单的二硫化钼检测体系易受到核酸适配体的结合状态影响，假阳性信号较高的问题。
附图说明
图1为本发明的低背景信号检测原理图，图中mins代表分钟；
图2为本发明不同浓度MoS2@AuNPs对10nM可卡因的选择性；
图3为本发明不同浓度的可卡因引起的荧光光谱图；
图4为本发明不同浓度的可卡因引起的荧光增长率；插图为0-0.1nM的可卡因引起的荧光增长率；
图5 为本发明的检测方法的选择性分析结果图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步说明，实施例是用于说明本发明，而不是用于限制本发明的范围。
本发明中的DNA 1、DNA 2、核苷酸适配体2皆来源于上海生物工程有限公司。MoS2(二硫化钼)以及金纳米粒子的制备方法参考经典的Frens方法。本发明中DNA 1、DNA 2、二硫化钼金纳米复合材料（MoS2@AuNPs）混合液、核酸适配体2均由PBS缓冲液（10mM，PH 7.4）配制。此外，可卡因溶液由超纯水配制。
图1 为本发明低背景信号检测原理图；图中mins代表分钟。DNA 1与DNA 2部分互补杂交形成双巯基核酸适配体1，双巯基核酸适配体1中的双巯基与MoS2@AuNPs复合材料形成Au-S键，进而使双巯基核酸适配体1被固定在复合材料表面；加入可卡因后，双巯基核酸适配体1与可卡因具有特异性相互结合作用，可卡因被结合到双巯基核酸适配体1上；之后再加入带有荧光的核酸适配体2，其与可卡因也具有特异性相互结合作用，进而核酸适配体2会被结合到可卡因上，该过程会产生荧光信号变化，可凭借荧光信号的计算统计来检测可卡因。
实施例1：
（1）合成的特异DNA序列：
DNA 1、DNA 2、核酸适配体2利用指数富集筛选系统得到，由上海生物工程有限公司制备，DNA1、DNA2、核酸适配体2的核苷酸序列具体如下：
DNA1的核苷酸序列（SEQ.ID.NO.1）为：5’-SH-CCATAGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’；
DNA 2的核苷酸序列（SEQ.ID.NO.2）为：3’-SH-GGTATCCCT-5’；
核酸适配体2的核苷酸序列（SEQ.ID.NO.5）为：5’-CCATAGGGAGACAAGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-FAM-3’；
其中DNA1无荧光，5’端修饰一个巯基；DNA 2无荧光，3’端修饰一个巯基，与DNA 1部分互补；核酸适配体2中FAM为羧基荧光素，是一种荧光修饰基团，荧光基团修饰在3’端，无巯基修饰，除了序列两端修饰之外，其他结构组成和碱基顺序与DNA 1相同。
此外，双巯基核酸适配体1是在本发明的实验过程中由DNA 1和DNA 2杂交获得；双巯基核酸适配体1无荧光，DNA 1与DNA 2互补杂交形成的部分双链DNA结构，两个巯基在一端；双巯基核酸适配体1的核苷酸序列为：
5’-SH-CCATAGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’ (SEQ.ID.NO.3)
3’-SH-GGTATCCCT-5’ (SEQ.ID.NO.4)。
（2）制备双巯基核酸适配体1：
将500µL 40 nM DNA 1与500µL 40 nM DNA 2，进行等物质的量混合，于95℃下水浴反应5分钟，使得DNA 1与DNA 2在高温环境中杂交成部分互补的双巯基核酸适配体1；再置于室温下培养1小时，使得双巯基核酸适配体1的半双链更加稳定，得到1mL20nM双巯基核酸适配体1溶液。
（3）MoS2@AuNPs表面固定双巯基核酸适配体1：
向600 µL的PBS缓冲液（10mM，PH 7.4）中，加入2.4µL步骤（2）制备的20 nM双巯基核酸适配体1溶液和现有2mg/mL的MoS2@AuNPs溶液，使MoS2@AuNPs的终浓度分别为5µg/mL，10µg/mL，20µg/mL，30µg/mL，40µg/mL，50µg/mL，55µg/mL，相对应加入的体积分别为1.5µL，3µL，6µL，9µL，12µL，15µL，16.5µL，之后将得到混合液分别放置于4℃过夜，得到含有MoS2@AuNPs-双巯基核酸适配体1复合物的培养液，12000 rpm离心15分钟，去除上清液，向得到的沉淀物中加入600 µL的PBS缓冲液，混匀后，得到MoS2@AuNPs-双巯基核酸适配体1溶液。
测定MoS2@AuNPs的浓度对可卡因的选择性：
对不同浓度MoS2@AuNPs对10nM可卡因溶液的选择性进行测定，结果见图2。由图2所示，在10nM待测物可卡因存在的情况下，40μg/mL的MoS2@AuNPs对应的检测体系的荧光增长量最大，故而，浓度为40μg/mL的 MoS2@AuNPs对可卡因的选择性最高；因此，本发明在检测待测可卡因浓度时选用MoS2@AuNPs的浓度为40μg/mL。
核酸适配体1虽然是半双链构造形式，但性质上仍是单链。其由DNA 1和DNA2共同互补构成，形成稳定的氢键，再者DNA 1和DNA2在一端都修饰了巯基，与二硫化钼的金原子反应形成Au-S键，加强了核酸适配体1与MoS2的结合，进一步稳定了检测体系，但DNA 2只是由几个脱氧核苷酸组成，其序列长度远低于DNA 1，所以核酸适配体1仍体现的是单链DNA的性质。
（4）结合可卡因：
向600µL MoS2@AuNPs-双巯基核酸适配体1溶液（MoS2@AuNPs浓度为40μg/mL）中，加入不同量的可卡因溶液，使可卡因的终浓度分别为2nM、4nM、6nM、8nM与10nM，37℃培育半小时，分别得到可卡因浓度为2nM、4nM、6nM、8nM与10nM的混合液1。
（5）加入核酸适配体2：
向步骤（4）中600µL2nM、4nM、6nM、8nM与10nM的混合液1中，加入0.6µL100nM的核酸适配体2，使核酸适配体2的终浓度为10 nM，得到混合液2，并于37℃培育30分钟，6000 rpm离心15分钟，去除上清液，向得到的沉淀物中加入600 µL的PBS缓冲液，混匀，分别得到可卡因浓度为2nM、4nM、6nM、8nM与10nM的混合液3。
（6）建立荧光增长率与可卡因浓度之间的线性回归方程：
分别测定步骤（5）中可卡因浓度为2nM、4nM、6nM、8nM与10nM的混合液3的荧光强度，所用FAM荧光基团的激发波长是488 nm，荧光发射开始于508nm，结束于650 nm，步幅3nm，最大发射波长为520 nm，具体是测定混合液3特征峰520nm处的荧光强度F，计算可卡因各浓度下的荧光增长率F/F0-1，其中，F表示加入核酸适配体2后得到最终可卡因溶液2的荧光强度，F0表示MoS2@AuNPs表面固定双巯基核酸适配体1后的背景荧光强度；然后建立荧光增长率F/F0-1与可卡因浓度x之间的线性回归方程。
经计算得知，可卡因浓度在0-0.1 nM时，其荧光增长率F/F0-1与可卡因浓度x存在非常强的线性关系，其线性回归方程可表达为：y=12.28497x+0.58782，R2=0.96752，其中y表示荧光增长率F/F0-1。根据3S/N原则，算出的可卡因检测限约为0.54pM。
图3为本发明不同浓度的可卡因引起的荧光光谱图。图3中显示了加入0-50nM的可卡因而对应的荧光强度的变化，随着加入的可卡因的浓度的增加，所对应的荧光强度也相应增强，50nM的可卡因引起的特征峰值荧光强度达到2500（a.u）以上。
图4 为本发明的不同浓度可卡因引起的荧光增长率；图4中表明，加入不同浓度的可卡因（0-100nM），得到的荧光增长率不同。加入0-0.1nM低浓度可卡因时，荧光增长率呈直线型上升，在加入10nM可卡因后增幅越来越小，直至平缓，最高增长率达3.5左右，线性增长区间在0-0.1nM。
（7）特异性验证实验：
使用相同浓度100nM的可卡因和其类似物腺苷、尿苷、尿酸投入到步骤（3）中MoS2@AuNPs-双巯基核酸适配体1溶液（MoS2@AuNPs浓度为40µg/mL），之后加入10 nM的核酸适配体2，来验证本发明的检测方法是否对可卡因检测具有特异性，操作步骤同步骤（3）-（5），结果见图5。
如图5所示，图中显示分别加入10nM的可卡因、腺苷、尿苷、尿酸，测得的各组荧光强度；其中三种可卡因类似物荧光强度增幅不高，而可卡因具有较高的荧光强度，呈现出明显差别；说明只有可卡因能引起本发明荧光显著增强，也表明本发明设计的检测可卡因的方法具有明显地选择性。
（8）测定人体血清中可卡因的浓度：
为了检验该发明实际应用价值，分别采用0.01nM，0.1nM，10nM三种浓度的可卡因溶液加入到人体血清中，在人体血清中进行检测实验。每组实验重复3次，得到的结果是相对标准偏差控制在3.290%-5.145%（相对标准偏差≦10%均为可靠数据），回收率为97.620%-106.098%，我国规定人体血液或唾液中的可卡因含量阈值是10ng/mL(约33nM)，本发明得到的检测限远低于国家标准含量，所以可得出以下结论：本发明对可卡因的检测具有高度灵敏性，并在实际检测中具有重要的分析意义。
实施例2：
本实施例将实施例1中步骤（7）特异性验证实验中可卡因和其类似物腺苷、尿苷、尿酸的浓度改为200nM，并将步骤（8）中加入到人体血清中可卡因的浓度改为0.05nM，0.5nM，50nM；其他步骤同实施例1。
本实施例的实验结果为：
（1）建立的荧光增长率F/F0-1与可卡因浓度x之间的线性回归方程仍同实施例1为y=12.28497x+0.58782，R2=0.96752，其中y表示荧光增长率F/F0-1。根据3S/N原则，计算出的可卡因检测限约为0.54pM。
（2）特异性验证实验中可卡因的荧光信号最高，说明只有可卡因能引起该检测体系的荧光显著增强，也说明本发明设计的检测方法具有明显的选择性。
（3）人体血清中实际检测到的可卡因浓度与检测前加入使用的浓度0.05nM，0.5nM，50nM接近，得到的结果是相对标准偏差控制在3.462%-4.127%（相对标准偏差≦10%均为可靠数据），回收率为97.651%-105.589%。
实验结论：本发明设计的检测方法对可卡因的检测具有高度灵敏性和明显地选择性，并在实际检测中具有重要的分析意义。
实施例3：
本实施例只是将实施例1步骤（2）中的水浴条件改为4℃下处理半小时，其他方法与步骤同实施例1。
实验结果：
（1）建立的荧光增长率F/F0-1与可卡因浓度x之间的线性回归方程为y=11.78529x+0.89573，R2=0.97846，其中y表示荧光增长率F/F0-1，计算出的可卡因检测限约为0.54pM。
（2）特异性验证实验中可卡因的荧光信号最高，说明只有可卡因能引起该检测体系的荧光显著增强，也说明本发明设计的检测方法具有明显的选择性。
（3）人体血清中实际检测到的可卡因浓度与检测前加入使用的浓度0.01nM，0.1nM，10nM接近，得到的结果是相对标准偏差控制在2.157%-4.323%（相对标准偏差≦10%均为可靠数据），回收率为98.532%-104.673%。
本发明设计的检测方法对可卡因的检测具有高度灵敏性和明显地选择性，并在实际检测中具有重要的分析意义。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种基于双巯基核酸适配体检测可卡因的方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccatagggag acaaggataa atccttcaat gaagtgggtc tccc 44
<210> 2
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtatccct 9
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccatagggag acaaggataa atccttcaat gaagtgggtc tccc 44
<210> 4
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtatccct 9
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccatagggag acaagataaa tccttcaatg aagtgggtct ccc 43

Claims (10)

1.一种基于双巯基核酸适配体检测可卡因的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备双巯基核酸适配体1：
将DNA 1与DNA 2混合，得到DNA混合液，水浴反应后，再置于室温下培养，得到双巯基核酸适配体1溶液；
（2）MoS2@AuNPs表面固定双巯基核酸适配体1：
向PBS缓冲液中加入步骤（1）中所制备的双巯基核酸适配体1溶液与MoS2@AuNPs溶液，进行培养，得到含有MoS2@AuNPs-双巯基核酸适配体1复合物的培养液，离心，向得到的沉淀物中加入PBS缓冲液，混匀后，得到MoS2@AuNPs-双巯基核酸适配体1溶液；
（3）结合可卡因：
将步骤（2）得到的MoS2@AuNPs-双巯基核酸适配体1溶液中，加入不同浓度梯度的可卡因溶液，培育，得到不同可卡因浓度的混合液1；
（4）加入核酸适配体2：
分别向步骤（3）的不同可卡因浓度的混合液1中，加入核酸适配体2，得到混合液2，培养，离心，向得到的沉淀物中加入PBS缓冲液，混匀，分别得到不同可卡因浓度的混合液3；
（5）建立荧光增长率与可卡因浓度之间的线性回归方程：
采集MoS2@AuNPs表面固定双巯基核酸适配体1后的背景荧光强度F0，分别测定步骤（4）的不同可卡因浓度的混合液3的荧光强度F，计算混合液3中各可卡因浓度的荧光增长率F/F0-1；然后建立荧光增长率F/F0-1与可卡因浓度x之间的线性回归方程y=ax+b，其中，y表示荧光增长率F/F0-1，a、b为线性回归系数；
（6）测定待测可卡因溶液的浓度：
重复步骤（1）-（2）的操作，制备MoS2@AuNPs-双巯基核酸适配体1溶液，加入待测可卡因溶液、核酸适配体2，培养，离心，向得到的沉淀物中加入PBS缓冲液，混匀，得到待测混合液，测定待测混合液的荧光强度F待测，并采集MoS2@AuNPs表面固定双巯基核酸适配体1后的背景荧光强度F0，计算待测混合液的荧光增长率F待测/F0-1，根据建立的线性回归方程，计算出待测可卡因溶液的浓度；
所述DNA 1的核苷酸序列为：
5’-SH-CCATAGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’；
所述DNA 2的核苷酸序列为：3’-SH-GGTATCCCT-5’；
所述核酸适配体2的核苷酸序列为：
5’-CCATAGGGAGACAAGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-FAM-3’；步骤（2）中，双巯基核酸适配体1溶液与MoS2@AuNPs溶液的摩尔浓度为1：2。
2.根据权利要求1所述的基于双巯基核酸适配体检测可卡因的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述DNA混合液中，所述DNA 1与DNA 2的摩尔浓度比为1：1；所述室温下培养的时间为1h；所述水浴反应的条件为95℃水浴5分钟。
3.根据权利要求1所述的基于双巯基核酸适配体检测可卡因的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述DNA混合液中，所述DNA 1与DNA 2的摩尔浓度比为1：1；所述室温下培养的时间为1h；所述水浴反应的条件为4℃水浴半小时。
4.根据权利要求1所述的基于双巯基核酸适配体检测可卡因的方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的浓度为10mM，pH为7.4。
5.根据权利要求1所述的基于双巯基核酸适配体检测可卡因的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述培养的条件为4℃过夜。
6.根据权利要求1所述的基于双巯基核酸适配体检测可卡因的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述培育的温度为37℃，所述培育的时间为半小时。
7.根据权利要求1所述的基于双巯基核酸适配体检测可卡因的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述混合液2中，核酸适配体2的浓度为10 nM；所述培养的温度为37℃，所述培养的时间为半小时。
8.根据权利要求2所述的基于双巯基核酸适配体检测可卡因的方法，其特征在于，所述线性回归方程为y=12.28497x+0.58782，R2=0.96752。
9.根据权利要求3所述的基于双巯基核酸适配体检测可卡因的方法，其特征在于，所述线性回归方程为y=11.78529x+0.89573，R2=0.97846。
10.根据权利要求1所述的基于双巯基核酸适配体检测可卡因的方法，其特征在于，
所述双巯基核酸适配体1的核苷酸序列为：
5’-SH-CCATAGGGAGACAAGGATAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCTCCC-3’
3’-SH-GGTATCCCT-5’。
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