JP6917540B2 - コカインアプタマーおよびそれを用いてコカインを検出する方法 - Google Patents
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Description
R−DNA−L−Fc (CI)
ここで、
Rは、R1−PO4−(CH2)n1−を表し、
R1は、炭化水素基およびその誘導体からなる群から選択され、
n1は、自然数を表し、
DNAは、コカインに結合可能な遺伝子配列からなり、
Lは、−L1−(CH2)n2−L2−により表されるリンカーであり、
L1は、なし、または、任意のリンカーであり、
L2は、なし、または、任意のリンカーであり、
n2は、自然数を表し、かつ
Fcはフェロセン基を表す。
本実施形態によるコカインアプタマーは、以下の化学式(CI)により表される。
R−DNA−L−Fc (CI)
ここで、
Rは、R1−PO4−(CH2)n1−を表し、
R1は、炭化水素基およびその誘導体からなる群から選択され、
n1は、自然数を表し、
DNAは、コカインに結合可能な遺伝子配列からなり、
Lは、−L1−(CH2)n2−L2−により表されるリンカーであり、
L1は、なし、または、任意のリンカーであり、
L2は、なし、または、任意のリンカーであり、
n2は、自然数を表し、かつ
Fcはフェロセン基を表す。
−(CH2)n4−PO4− (CII)
ここで、n4は自然数を表す。
この場合でも、L2はアミド結合であることが望ましい。
次に、本実施形態によるコカインアプタマーの製法が説明される。図1Aおよび図1Bは、本実施形態によるコカインアプタマーの第1の合成スキームを示す。第1の合成スキームでは、L1はなしであり、かつL2はアミド結合であるコカインアプタマーが得られる。
Rは、HS−(CH2)n3−PO4−(CH2)n1−を表し、かつ
Lは、−(CH2)n2−L2−により表されるリンカーである。
ここで、n1は12に等しく、n2は6に等しく、n3は6に等しく、かつL2はNHCOにより表されるアミド結合である。
以下、本実施形態によるコカインアプタマーを用いて試料溶液に含有されるコカインを検出する方法が説明される。すなわち、本実施形態によるコカインアプタマーを用いて試料溶液がコカインを含有するかどうかを判定する方法が説明される。
まず、本実施形態によるコカインアプタマーが、試料溶液と混合される。このようにして、混合液が調製される。試料溶液は、水溶液であることが望ましい。本実施形態によるコカインアプタマーは、1本鎖であることが望ましい。そのため、本実施形態によるコカインアプタマーが試料溶液と混合される前に、本実施形態によるコカインアプタマーは熱処理に供されることが望ましい。熱処理の一例として、本実施形態によるコカインアプタマーは、摂氏80度で5分間加熱され、次いで30分間で摂氏25度に冷却される。このようにして、1本鎖のコカインアプタマーが得られる。
工程(b)では、制限酵素エキソヌクレアーゼIIIが、工程(a)において調製された混合液に添加される。制限酵素エキソヌクレアーゼIIIは、2本鎖デオキシリボ核酸に特異的な3′→5′エキソヌクレアーゼであり、二本鎖デオキシリボ核酸の3′−OH
末端から5′−モノヌクレオチドを遊離させる。試料溶液がコカインを含有する場合、コ
カインアプタマーは2本鎖を形成するようにコカインに結合する。従って、制限酵素エキソヌクレアーゼIIIの働きにより、コカインに結合したDNAは分解される。DNAの分解により、フェロセン基Fcを含むコカインアプタマーの一部が混合液中で遊離する。DNAの分解により、R1も混合液中で遊離するが、フェロセン基Fcに影響を与えない。従って、R1は限定されない。同様に、フェロセン基Fcに影響を与えない限り、Lも限定されない。
工程(c)では、工程(b)において遊離したコカインアプタマーの一部に含まれるフェロセン基Fcの還元電流が、ポテンシオスタットを用いたサイクリックボルタンメトリー法により測定される。フェロセン基Fcは還元体であるため、本実施形態によるサイクリックボルタンメトリーにおいては、酸化電位が連続的に変化されながら、フェロセン基Fcの還元電流RC1が測定される。具体的には、酸化電位は、まず、0ボルトから0.6ボルトに増加される。次いで、酸化電位は0.6ボルトから0ボルトに低下される。この期間の還元電位は、0ボルトに設定される。言い換えれば、この期間では、酸化電位の変化に拘わらず、還元電位は0ボルトに設定される。
以下の数式(M1)が充足された場合には、試料溶液がコカインを含有すると判定される。
RC1/RC2 > 1.0 (M1)
ここで、
RC2は、コカインを含有しない試料溶液の所定の酸化電位(例えば、0.5ボルト)に対する予め測定されたフェロセン基Fcの還元電流を表す。
以下、実施例を参照しながら、本発明がより詳細に説明される。以下の実施例においては、DNAは、配列番号:01により表される遺伝子配列からなる。
実施例1は、実施例1A(コカインの濃度:250μM)および実施例1B(コカインの濃度:0μM)から構成される。
5’−HS−(CH2)6−PO4−(CH2)12−DNA−(CH2)6−NH−CO−フェロセン基Fc−3’ (CIc)
コカインが混合溶媒に添加され、混合液を得た。コカインの濃度は、250μMであった。次いで、上記のコカインアプタマー(濃度:10μM)が、混合液に添加された。
実施例1Bにおいては、コカインが混合溶媒に添加されなかったこと以外は、実施例1Aと同様の実験が行われた。言い換えれば、実施例1Bにおいては、コカインの濃度は0μMであった。図4は、実施例1Bによるサイクリックボルタモグラムを示す。図4に示されるように、0.5ボルトの酸化電位に対する還元電流RC2は、およそ4.82ナノアンペアであった。従って、実施例1において、0.5ボルトの酸化電位に対するRC1/RC2の値は、1.96であった。
実施例2においては、化学式(CIc)により表されるコカインアプタマーに代えて、
以下の化学式(CId)により表されるコカインアプタマーが用いられたこと以外は、実施例1と同様の実験が行われた。
5’−HS−(CH2)6−PO4−(CH2)12−DNA−(CH2)12−PO4−(CH2)6−NH−CO−フェロセン基Fc−3’ (CId)
化学式(CId)により表されるコカインアプタマーは、株式会社 日本遺伝子研究所により合成された。
比較例1においては、化学式(CIc)により表されるコカインアプタマーに代えて、
以下の化学式(CIe)により表されるコカインアプタマーが用いられたこと以外は、実施例1と同様の実験が行われた。
5’−HS−(CH2)6−DNA−(CH2)6−NH−CO−フェロセン基Fc−3’ (CIe)
化学式(CIe)により表されるコカインアプタマーは、株式会社 日本遺伝子研究所により合成された。
比較例2においては、以下の事項(I)〜(II)を除き、実施例1と同様の実験が行われた。
(I) 化学式(CIc)により表されるコカインアプタマーに代えて、以下の化学式(CIf)により表されるコカインアプタマーが用いられた。化学式(CIf)により表されるコカインアプタマーは、非特許文献1に開示されたコカインアプタマーと同一であり、かつ非特許文献1の開示内容に従って合成された。
5’−HS−(CH2)11−DNA−(CH2)7−NH−CO−MB−3’ (CIf)
ここで、MBはメチレンブルーを表す。
(II) メチレンブルーは、酸化体であるので、サイクリックボルタンメトリー法においては、還元電流に代えて酸化電流が測定された。
Claims (18)
- 以下の化学式(CI)により表されるコカインアプタマーであって、
R−DNA−L−Fc (CI)
ここで、
Rは、R1−PO4−(CH2)n1−であり、
R1は、炭化水素基およびその誘導体からなる群から選択され、
n1は、1〜20の自然数を表し、
DNAは、コカインに結合可能な遺伝子配列からなり、前記遺伝子配列が、AGACAAGGAAAATCCTTCAATGAAGTGGGTCG(配列番号:01)により表され、
Lは、−L1−(CH2)n2−L2−により表されるリンカーであり、
L1は、なし、または、任意のリンカーであり、
L2は、なし、または、任意のリンカーであり、
n2は、1〜20の自然数を表し、かつ
Fcはフェロセン基を表す、
コカインアプタマー。 - 請求項1に記載のコカインアプタマーであって、
R1は、HS−(CH2)n3−であり、
ここで、
n3は1〜20の自然数である、
コカインアプタマー。 - 請求項1に記載のコカインアプタマーであって、
L1はなし、かつ
L2はアミド結合である、
コカインアプタマー。 - 請求項1に記載のコカインアプタマーであって、
L1は、以下の化学式(CII)を表し、
−(CH2)n4−PO4− (CII)
ここで、
n4は1〜20の自然数を表す、
コカインアプタマー。 - 請求項1に記載のコカインアプタマーであって、
L2はアミド結合である、
コカインアプタマー。 - 試料溶液に含有されるコカインを検出する方法であって、
(a) 請求項1に記載のコカインアプタマーを前記試料溶液と混合して混合液を調製する工程、
(b) 工程(a)において調製された混合液に、エキソヌクレアーゼIIIを添加する工程、および
(c) 工程(b)の後、前記混合液を電気化学的に測定することによって、コカインを検出する工程、
を具備する、方法。 - 請求項6に記載の方法であって、
前記工程(b)において、前記フェロセン基Fcを含むコカインアプタマーの一部が混合液中で遊離する、
方法。 - 請求項6に記載の方法であって、
工程(c)において、工程(b)において遊離したコカインアプタマーの一部に含まれる前記フェロセン基Fcの濃度が測定される、
方法。 - 請求項6に記載の方法であって、
R1は、HS−(CH2)n3−を表し、
ここで、
n3は1〜20の自然数である、
方法。 - 請求項6に記載の方法であって、
L1はなし、かつ
L2はアミド結合である、
方法。 - 請求項6に記載の方法であって、
L1は、以下の化学式(CII)を表し、
−(CH2)n4−PO4− (CII)
ここで、
n4は1〜20の自然数を表す、
方法。 - 請求項11に記載の方法であって、
L2はアミド結合である、
方法。 - 試料溶液がコカインを含有するかどうかを判定する方法であって、以下の工程:
(a) 請求項1に記載のコカインアプタマーおよび前記試料溶液を混合して混合液を調製する工程、
(b) 工程(a)において調製された混合液に、エキソヌクレアーゼIIIを添加する工程、
(c) 工程(b)の後、サイクリックボルタンメトリー法により所定の酸化電位に対する前記フェロセン基Fcの還元電流RC1を測定する工程、および
(d) 以下の数式(M1)が充足された場合には、前記試料溶液がコカインを含有すると判定する工程、
RC1/RC2 > 1.0 (M1)
を具備し、
ここで、
RC2は、コカインを含有しない試料溶液の前記所定の酸化電位に対する予め測定された前記フェロセン基Fcの還元電流を表す、
方法。 - 請求項13に記載の方法であって、
前記工程(b)において、前記フェロセン基Fcを含むコカインアプタマーの一部が混合液中で遊離する、
方法。 - 請求項13に記載の方法であって、
R1は、HS−(CH2)n3−を表し、
ここで、
n3は1〜20の自然数である、
方法。 - 請求項13に記載の方法であって、
L1はなし、かつ
L2はアミド結合である、
方法。 - 請求項13に記載の方法であって、
L1は、以下の化学式(CII)を表し、
−(CH2)n4−PO4− (CII)
ここで、
n4は1〜20の自然数を表す、
方法。 - 請求項13に記載の方法であって、
L2はアミド結合である、
方法。
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