CN108660187B - 基于功能化氧化石墨烯的免疫pcr检测方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于功能化氧化石墨烯的免疫PCR检测方法及其应用，包括：根据传统BA‑iPCR技术原理将生物素化羊抗兔标记在氧化石墨烯载体上，先制备功能化氧化石墨烯探针，在此基础上建立基于功能化氧化石墨烯的BA‑iPCR检测系统(GO‑BA‑iPCR)，用生物素化的二抗修饰的氧化石墨烯代替二抗，同时利用生物素‑亲和素结合系统，使得检测信号得到了双倍放大，可增加反应体系中固相载体上的生物素化DNA量，进一步提高检测方法的灵敏度，用于环境介质中痕量污染物的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及功能化氧化石墨烯探针的制备，具体涉及基于功能化氧化石墨烯的免疫PCR检测方法及其应用，用于环境介质中痕量2,4,4'-三溴联苯醚(BDE-28)的检测。
背景技术
实时荧光定量免疫PCR(rt-iPCR)兼具强特异性、超高灵敏度、操作简便快捷、样品前处理步骤简单、测试费用低等众多优点，常被用于生物医学、食品安全等领域中痕量目标分析物的定量检测。生物素-亲和素放大的免疫PCR方法(BA-iPCR)是标记模板DNA的PCR扩增荧光物质作为反应信号，再利用生物素-亲和素结合系统将抗体与模板双链DNA连接起来，通过rt-iPCR实时监测每个扩增循环过程中扩增DNA而得到的荧光信号强度，利用所得的Ct值和待测样品浓度的对数值建立标准曲线，实现未知样品中待测物的定量分析。其中，Ct值是rt-iPCR扩增时所产生的荧光信号达到所设定的荧光阈值时所需经历的循环次数。由于每一个亲和素分子上的4个亚单位都能分别特异性的识别并结合一个生物素分子，因此，该方法可避免复杂繁琐且耗时的抗体-DNA复合物的化学合成、提取及纯化过程。且该免疫分析方法成功利用rt-iPCR过程中DNA的指数扩增来实现将微小信号呈几何倍数的放大，与常用的BA-ELISA方法比较，其检测限明显降低。
氧化石墨烯(GO)是单原子厚度、二维石墨碳结构，拥有超高比表面积，与蛋白质结合容易，且不会破坏蛋白质的活性。氧化石墨烯的表面上大量含氧基团的引入不但使氧化石墨烯具有化学稳定性，而且为合成氧化石墨烯基或者石墨烯基材料提供了较大比表面积和表面修饰活性位置。由于氧化石墨烯易于功能化、可控性高，因此可用于制备功能化石墨烯复合材料的载体。现有技术中常将其用于ELISA的检测中，如陈锋等在一般的ELISA方法中将一抗和二抗分别与纳米金和氧化石墨烯结合，通过纳米的信号放大作用，提高对痕量样本检测的灵敏度，降低检测限。虽然氧化石墨烯在免疫分析检测方法中已有不少应用，但根据文献调研目前尚无氧化石墨烯在BA-iPCR方法中的应用。
发明内容
本发明的发明人经过广泛而深入的研究后发现，根据传统BA-iPCR的技术原理，将生物素化羊抗兔标记在氧化石墨烯载体上，先制备功能化氧化石墨烯探针，在此基础上建立基于功能化氧化石墨烯的BA-iPCR方法(GO-BA-iPCR)，用生物素化的二抗修饰的氧化石墨烯代替二抗，同时利用生物素-亲和素的结合系统，使得检测信号DNA得到了双倍放大，该方法可增加反应体系中固相载体上的生物素化DNA量，进一步提高检测方法的灵敏度，可用于环境介质中痕量污染物的检测。本发明提供了一种基于功能化氧化石墨烯的免疫PCR检测方法，还提供了上述方法在检测环境介质中痕量2,4,4'-三溴联苯醚(BDE-28)的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案实现：
基于功能化氧化石墨烯的免疫PCR检测方法，具体地，包括以下步骤：
步骤1、制备功能化氧化石墨烯探针；
步骤2、构建基于步骤1中所述功能化氧化石墨烯探针的BA-iPCR检测系统，获取达到荧光阈值所需的循环次数，即Ct值；
步骤3、通过步骤2的Ct值构建待测物浓度标准曲线，用于环境中痕量待测物的检测；其中，步骤1中所述功能化氧化石墨烯探针的制备过程为：
步骤1-1、将等质量比的NaOH和ClCH2COONa加入到1mg/mL的氧化石墨烯(GO)水悬浮液中超声裂解1h，再加入稀盐酸发生中和反应，得GO-COOH；然后用超纯水反复清洗、离心，至所述GO-COOH在超纯水中均匀分散后再用超纯水透析不低于48h，得GO-COOH悬浮液；
步骤1-2、将上述制备的GO-COOH悬浮液(1mL)中加入400mM1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、10mMN-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和pH5.20的MES缓冲液，其中，GO-COOH悬浮液与MES缓冲液混合的体积比为1:1。均匀混合，并搅拌反应30min；再将反应混合物高速离心、去上清液，然后用上述MES缓冲液反复冲洗后，将所得产物分散于0.01mol/L、pH7.40的PBS缓冲液中超声处理5min，得均匀分散液；
步骤1-3、再向上述均匀分散液中缓慢加入生物素标记的羊抗兔IgG，其中氧化石墨烯与生物素标记的羊抗兔IgG的体积比为20:1，然后在4℃搅拌12h；然后用0.01mol/L、pH7.40的PBS缓冲液洗涤，在4℃、12000rpm离心5min，重复3次，得沉淀物；再将上述沉淀物复溶于含10mg/mL牛血清白蛋白(BSA)的0.01mol/L、pH7.40的PBS缓冲液中，得生物素-羊抗兔IgG-GO复合物，即为功能化氧化石墨烯探针，4℃下保存。
进一步地，步骤2中，所述GO-BA-iPCR检测系统的构建方法，包括：
步骤2-1、先用质量浓度为0.8％的戊二醛溶液对聚丙烯PCR管进行预处理，50μL/孔，37℃温育6h，超纯水洗涤3次，200μL/孔；
步骤2-2、用0.5mol/L、pH9.60的CBS缓冲液稀释待测物包被原，并加入到戊二醛处理过的PCR小管中(20μL/孔)，4℃过夜后倒掉包被液，PBST洗涤液洗管3次，200μL/孔；
步骤2-3、每管加入200μL封闭液进行封闭，37℃温育1h，PBST洗涤液洗管3次，200μL/孔；
步骤2-4、每管加入10μL待测物标准溶液和10μL稀释的待测物特异性抗体，37℃温育1h，PBST洗涤液洗管3次，200μL/孔；
步骤2-5、每管加入20μL用0.01mol/L、pH7.40的PBS缓冲液稀释后的步骤1中所述生物素-羊抗兔IgG-GO复合物溶液，37℃温育0.5h，PBST洗涤液洗管3次，200μL/孔；
步骤2-6、每管加入20μL稀释的链酶亲和素，37℃温育0.5h，PBST洗涤液洗管3次，200μL/孔；
步骤2-7、每管加入20μL稀释的生物素化DNA，37℃温育0.5h，PBST洗涤液洗管5次，再用超纯水洗涤5次；
步骤2-8、按照上游引物、下游引物、试剂盒和超纯水的体积比为l：1：25：23进行混合，得PCR反应液，在上述处理后的PCR管中加入20μL所述PCR反应液进行Rt-iPCR扩增，获取荧光信号强度；在一些优选的实施方式中，所述试剂盒为SYBR Green染料mixture，来自于生工生物工程有限公司。
更进一步地，步骤2-8中，所述Rt-iPCR扩增程序具体为：94℃变性4min；94℃变性20s，且连续35个循环；55℃退火20s；先72℃延伸20s，再72℃延伸3min，并在72℃延伸阶段读取荧光信号强度值。
进一步地，所述待测物为2,4,4'-三溴联苯醚(BDE-28)；所述待测物包被原液为2,4,4'-三溴联苯醚人工包被抗原液(OVA-BDE-28)；所述待测物特异性抗体为2,4,4'-三溴联苯醚多克隆抗体(pAb-BDE-28)。
进一步地，所述PBST洗涤液为0.01mol/L、pH7.40的PBS缓冲液和质量浓度为0.05％的吐温-20按照体积比为20:1组成的混合液。
更进一步地，所述GO-BA-iPCR检测系统的优化检测条件为：
所述封闭液是质量浓度为3％的卵清蛋白(OVA)溶液；
所述OVA-BDE-28浓度为1.32μg/mL；
所述pAb-BDE-28浓度为10.58μg/mL；
所述生物素-羊抗兔IgG-GO复合物用0.01M、pH7.40的PBS缓冲液按体积比为1:1500稀释；
所述链霉亲和素浓度为10μg/mL；
所述生物素化DNA浓度为0.75μg/mL；
所述反应体系中二甲亚砜(DMSO)含量为5％。
进一步地，步骤3中，所述待测物浓度的标准曲线的构建方法，包括：
先用含质量浓度为5％DMSO的0.01M、pH7.40的PBS缓冲液配制一系列浓度的BDE-28标准溶液，再用步骤2中构建的GO-BA-iPCR检测系统检测BDE-28标准溶液；然后在优化反应条件下以6次重复样品的平均Ct值为纵坐标，BDE-28浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，即得。
更进一步地，步骤3中，所述BDE-28标准溶液的浓度分别为1pg/L、5pg/L、50pg/L、500pg/L、5000pg/L、50000pg/L和100000pg/L。
本发明的第二方面，在于，上述基于功能化氧化石墨烯的免疫PCR检测方法在检测环境介质中痕量2,4,4'-三溴联苯醚的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
一、本发明制备功能化氧化石墨烯探针工艺简单、快速；与传统的BA-iPCR方法相比，本发明构建的GO-BA-iPCR检测系统检测限更低，灵敏度更高。
二、本发明通过酰胺键将生物素化羊抗兔标记在氧化石墨烯载体上，用生物素化的二抗修饰的氧化石墨烯代替传统的二抗，同时利用生物素-亲和素的结合系统，使得本发明检测方法的检测信号得到双倍的放大，增加了反应体系中固相载体上的生物素化DNA量，进一步提高了检测方法的灵敏度。通过本发明的GO-BA-iPCR检测系统检测BDE-28污染物，浓度为5pg/L-50000pg/L时，线性相关性较好，检测限LOD可达1.27pg/L，适用于环境介质中痕量污染物的定量分析。
三、通过本发明的检测方法建立的检测BDE-28的标准曲线用于环境样品中BDE-28含量的检测，安全且可靠性强。
附图说明
图1为本发明中氧化石墨烯生物探针的TEM图，其中，(a)为GO，(b)为生物素-羊抗兔IgG-GO；
图2为本发明中GO和生物素-羊抗兔IgG-GO复合物的XPS图；
图3为本发明中GO-BA-iPCR检测系统检测BDE-28标准溶液的扩增曲线；其中，△Rn为PCR检测荧光信号的变化值，ΔRn＝R+n-R-n，计算ΔRn，式中R+n是表示每点测量的荧光强度，R-n表示荧光基线强度；
图4为本发明中GO-BA-iPCR检测系统检测BDE-28的标准曲线；
图5为本发明中GO-BA-iPCR与GC-MS两种方法检测BDE-28结果的比较。
具体实施方式
下面结合附图详细说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。以下实施例中的实验方法如无特殊说明均为常规方法，试剂与材料无特殊说明均市售可得。
实施例1制备氧化石墨烯生物探针
取50mgNaOH和50mgClCH2COONa加到1mL、1mg/mL的GO水悬浮液中，超声波裂解1h，用稀HCl中和母液，得到的GO-COOH反复用去超纯水清洗和离心，至产物在超纯水中均匀分散，用超纯水透析GO-COOH悬浮液48h，以除去所有离子。
将上述GO-COOH悬浮液、400mM的EDC、100mM的NHS和1mL、pH5.20的MES缓冲液混合，搅拌反应30min，混合物于12000rpm下离心分离5min，除去上清液，然后用MES缓冲液反复冲洗去除多余的EDC和NHS，得到的产物分散于1.0mL0.01M、pH7.40的PBS缓冲液中超声处理5min，得均匀分散液；然后缓慢加入50μL生物素标记的羊抗兔IgG，4℃搅拌过夜，0.01M、pH7.40的PBS缓冲液洗涤后，4℃、12000rpm离心分离5min，重复3次；沉淀复溶于1.0mL含10g/L的BSA缓冲液的0.01M、pH7.40的PBS缓冲液中，即得。
将GO和制备的生物素-羊抗兔IgG-GO复合物进行透射电镜表征，比较GO与生物素化羊抗兔结合前后的性状变化，验证是否有生物素化羊抗兔结合在氧化石墨烯表面，结果见附图1所示，氧化石墨烯在与生物素化羊抗兔结合前后其透射电镜图有较明显的变化，可以推测在图1(b)中的黑色斑点为偶联的生物素化抗体。
为了进一步证明GO与抗体结合后的黑色斑点来自于多克隆抗体，而不是其他非特异性杂质，对GO和生物素-羊抗兔IgG-GO复合物进行X射线光电子能谱检测，对两者进行N元素检测，结果见附图2所示，可以看出GO因不含N元素，所以在399.5eV(N-H的特征峰)处没有任何峰出现，而生物素-羊抗兔IgG-GO复合物则在399.5eV处(氮在有机胺中的键结合能)出现明显的峰，说明该结合物中确实含有N元素，而在从GO到生物素-羊抗兔IgG-GO复合物的过程中，除了生物素-羊抗兔IgG之外，没有其他含N元素的试剂引入到处理后的GO结构中，所以，可以确定该N元素只能来自于二抗，进一步证明GO与二抗结合后的黑色斑点来自于生物素标记的羊抗兔。
实施例2 GO-BA-iPCR检测系统检测BDE-28标准曲线
用质量浓度为0.8％的戊二醛溶液对聚丙烯PCR管进行预处理，50μL/孔，37℃温育6h，超纯水重复洗涤3次，200μL/孔。再用0.5M、pH9.60的CBS缓冲液适当稀释BDE-28包被原溶液，加入到戊二醛处理过的PCR小管中，20μL/孔，4℃过夜，次日倒掉上述包被液，用PBST洗涤液重复洗管3次，200μL/孔，每管加200μL3％的OVA对PCR管进行封闭，37℃温育1h，用PBST洗涤液重复洗管3次，200μL/孔，再加入10μLBDE-28标准溶液和10μL适当稀释的pAb-BDE-28于PCR管中，37℃温育1h，用PBST洗涤液重复洗管3次，200μL/孔；每管加入20μL用PBS适当稀释的生物素-羊抗兔IgG-GO复合物，37℃温育0.5h，用PBST洗涤液重复洗管3次，200μL/孔；每管加入20μL适当稀释的链酶亲和素，37℃温育0.5h，用PBST洗涤液重复洗管3次，200μL/孔；每管加入20μL适当稀释的生物素化DNA，37℃温育0.5h，先用PBST洗涤5次，再用超纯水洗涤5次。
最后按照上游引物、下游引物、SYBR Green染料mixture(购自于生工生物工程有限公司)和超纯水的体积比为l：1：25：23进行混合，得PCR反应液，在上述处理后的PCR管中加入20μLPCR反应液进行Rt-iPCR扩增，其中，Rt-iPCR扩增程序具体为：先在94℃变性4min，再在94℃变性20s，且连续35个循环；然后在55℃退火20s后，先在72℃延伸20s，再在72℃延伸3min，并在72℃延伸阶段读取荧光值(Ct值)。
用含质量浓度为5％DMSO的0.01M、pH7.40的PBS缓冲液配制一系列BDE-28标准溶液，其中，BDE-28标准溶液的浓度分别为1pg/L、5pg/L、50pg/L、500pg/L、5000pg/L、50000pg/L、100000pg/L，通过GO-BA-iPCR检测系统检测BDE-28标准溶液。最优反应条件下，以6次重复样品的平均Ct值为纵坐标，BDE-28浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线，并用于环境样品中痕量BDE-28含量的检测。
参见附图3和4，在GO-BA-iPCR检测过程中，抗原抗体反应阶段，将一般的二抗(羊抗兔)更换为所制备的生物素-羊抗兔IgG-GO复合物探针，其他步骤与BA-iPCR方法基本一致；可以看出BDE-28浓度为5pg/L-50000pg/L时，线性相关性较好，线性方程为Ct＝0.32logC0+12.626(R2＝0.9756)，检测限LOD为1.27pg/L。
实施例3 GO-BA-iPCR检测系统检测环境样品中的BDE-28
利用本发明构建的GO-BA-iPCR检测系统检测PM2.5中的BDE-28，其中，PM2.5样品分别采自于上海市市区(S1-S4)、郊区(U1-U4)和农业区(C1-C4)，结果如表1所示。BDE-28实际样品同样用GC-MS方法进行检测加以对比，比较两种方法的检测结果，参见附图5所示，可以看出BDE-28的检测值具有较好的一致性，相关系数R2＝0.9868，GO-BA-iPCR检测系统准确、可靠。
表1不同环境样品中BDE-28的浓度
实施例4样品回收率的检测
向上述部分PM2.5样品(C3、S1、U2)中定量加入不同浓度的BDE-28标准样品，充分混合处理后，得加标样品，用GO-BA-iPCR检测系统检测加标样品并计算回收率以评价该免疫分析方法的准确性，检测结果如表2所示，GO-BA-iPCR检测系统的加标回收率和变异系数(CV)分别为91.83％-107.74％和3.65％-7.73％，进一步表明所建立的GO-BA-iPCR检测系统具有较高的准确度和精密度。
表2 GO-BA-iPCR检测系统检测加标样品中BDE-28的回收率
以上所述为本发明的较佳实施例而已，但本发明不应该局限于该实施例所公开的内容。所以凡是不脱离本发明所公开的精神下完成的等效或修改，都落入本发明保护的范围。
Claims (8)
1.基于功能化氧化石墨烯的免疫PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、制备功能化氧化石墨烯探针；
步骤2、构建基于步骤1中所述功能化氧化石墨烯探针的BA-iPCR检测系统，即GO-BA-iPCR检测系统，检测DNA扩增过程中的荧光信号强度，获取达到荧光阈值所需的循环次数，即Ct值；
步骤3、通过步骤2中获得的循环次数构建待测物浓度标准曲线，检测环境中痕量待测物；
步骤1中，所述功能化氧化石墨烯探针的制备过程为：
步骤1-1、将等质量比的NaOH和ClCH2COONa加入到1mg/mL的氧化石墨烯水悬浮液中超声裂解1h，再加入稀盐酸发生中和反应，得GO-COOH；用超纯水反复清洗、离心，至所述GO-COOH在超纯水中均匀分散后，用超纯水透析不低于48h，得GO-COOH悬浮液；
步骤1-2、向上述制备的GO-COOH悬浮液中加入400mM的EDC、100mM的NHS和pH5.20的MES缓冲液，混合均匀并搅拌反应，其中所述GO-COOH悬浮液与所述MES缓冲液的体积比为1:1；反应混合物高速离心、去上清液，用上述MES缓冲液反复冲洗，所得产物分散于0.01mol/L、pH7.40的PBS缓冲液中超声，得均匀分散液；
步骤1-3、向上述均匀分散液中缓慢加入生物素标记的羊抗兔IgG，在4℃搅拌12h，其中所述氧化石墨烯与所述生物素标记的羊抗兔IgG体积比为20:1；用0.01mol/L、pH7.40的PBS缓冲液洗涤，在4℃、12000rpm离心5min，重复3次，得沉淀物；上述沉淀物复溶于含10mg/mL牛血清白蛋白的0.01mol/L、pH7.40的PBS缓冲液中，得生物素-羊抗兔IgG-GO复合物，即为功能化氧化石墨烯探针，4℃下保存。
2.如权利要求1所述的基于功能化氧化石墨烯的免疫PCR检测方法，其特征在于，步骤2中，所述GO-BA-iPCR检测系统的构建方法，包括：
步骤2-1、用质量浓度为0.8%的戊二醛溶液对聚丙烯PCR管预处理，50µL/孔，37℃温育6h，超纯水洗涤3次，200µL/孔；
步骤2-2、用0.5mol/L、pH9.60的CBS缓冲液稀释待测物包被原，并加入到戊二醛处理过的PCR小管中，20µL/孔，4℃过夜后倒掉包被液，PBST洗涤液洗管3次，200µL/孔；
步骤2-3、每管加入200µL封闭液进行封闭，37℃温育1h，PBST洗涤液洗管3次，200µL/孔；
步骤2-4、每管加入10µL待测物标准溶液和10µL稀释的待测物特异性抗体，37℃温育1h，PBST洗涤液洗管3次，200µL/孔；
步骤2-5、每管加入20µL用0.01mol/L、pH7.40的PBS缓冲液稀释后的步骤1中所述生物素-羊抗兔IgG-GO复合物溶液，37℃温育0.5h，PBST洗涤液洗管3次，200µL/孔；
步骤2-6、每管加入20µL稀释的链酶亲和素，37℃温育0.5h，PBST洗涤液洗管3次，200µL/孔；
步骤2-7、每管加入20µL稀释的生物素化DNA，37℃温育0.5h，PBST洗涤液洗管5次，再用超纯水洗涤5次；
步骤2-8、按照上游引物、下游引物、SYBR Green染料mixture和超纯水的体积比为l：1：25：23进行混合得PCR反应液，在上述处理后的PCR管中加入20µL所述PCR反应液进行Rt-iPCR扩增，获取荧光信号强度。
3.如权利要求2所述的基于功能化氧化石墨烯的免疫PCR检测方法，其特征在于，步骤2-8中，所述Rt-iPCR扩增程序具体为：94℃变性4min，94℃变性20s，连续35个循环；55℃退火20s；先72℃延伸20s，再72℃延伸3min，并在72℃延伸阶段读取荧光信号强度值。
4.如权利要求2所述的基于功能化氧化石墨烯的免疫PCR检测方法，其特征在于，
所述待测物为2,4,4'-三溴联苯醚；
所述待测物包被原为2,4,4'-三溴联苯醚人工包被抗原；
所述待测物特异性抗体为2,4,4'-三溴联苯醚多克隆抗体；
所述GO-BA-iPCR检测系统的优化检测条件为：封闭液是质量浓度为3%的卵清蛋白溶液；2,4,4'-三溴联苯醚人工包被抗原的浓度为1.32μg/mL；2,4,4'-三溴联苯醚多克隆抗体的浓度为10.58μg/mL；生物素-羊抗兔IgG-GO复合物用0.01M、pH7.40的PBS缓冲液按体积比为1:1500进行稀释，链霉亲和素浓度为10µg/mL，生物素化DNA浓度为0.75μg/mL。
5.如权利要求2所述的基于功能化氧化石墨烯的免疫PCR检测方法，其特征在于，所述PBST洗涤液为0.01mol/L、pH7.40的PBS缓冲液和质量浓度为0.05%的吐温-20按照体积比为20:1组成的混合液。
6.如权利要求1所述的基于功能化氧化石墨烯的免疫PCR检测方法，其特征在于，步骤3中，所述待测物浓度的标准曲线的构建方法包括：用含质量浓度为5%DMSO的0.01M、pH7.40的PBS缓冲液配制不同浓度的BDE-28标准溶液，用步骤2中构建的GO-BA-iPCR检测系统检测BDE-28标准溶液，在优化检测条件下以6次重复样品的平均Ct值为纵坐标，BDE-28浓度的对数值为横坐标绘制标准曲线。
7.如权利要求6所述的基于功能化氧化石墨烯的免疫PCR检测方法，其特征在于，步骤3中，所述BDE-28标准溶液的浓度分别为1pg/L、5pg/L、50pg/L、500pg/L、5000pg/L、50000pg/L和100000pg/L。
8.如权利要求1-7任一项所述的基于功能化氧化石墨烯的免疫PCR检测方法在检测环境介质中痕量2,4,4'-三溴联苯醚的应用。
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