CN116879540B - 一种神经元蛋白聚集体特异性检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种神经元蛋白聚集体特异性检测试剂盒，属于生物检测技术领域，本发明公开了神经元蛋白聚集体的探测元件，该探测元件以氧化石墨烯为骨架，负载探测抗体‑辣根过氧化物酶复合体；还公开了所述的探测元件在制备神经元蛋白聚集体的检测试剂盒中的应用。本发明先采用捕捉抗体识别待测样本中的单体蛋白，避免单体蛋白的假阳性干扰，后续以探测抗体识别蛋白聚集体，不会对单体产生信号，提高检测特异性；同时还构建探测元件，通过纳米材料负载更多酶实现信号放大，提高检测灵敏度。本发明能在单体和聚集体蛋白共存情况下，高灵敏度、高特异性地检测具有神经毒性的蛋白聚集体，又兼有低成本、高通量和快速检测的优势，具有实际的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种神经元蛋白聚集体特异性检测试剂盒。
背景技术
蛋白质聚集(Protein Aggregation)是蛋白质发生错误折叠、构象改变而形成聚集体的生物学现象，这些错误折叠的蛋白质聚集在一起，进而引起了一系列生理和病理的变化，例如在阿尔茨海默病中，β-淀粉样蛋白发生了错误折叠，导致其聚集在神经元和胶质细胞中，引起神经细胞死亡；帕金森综合征(PD)从病理生理学角度看，α-突触核蛋白(α-synuclein)以路易氏体(Lewy body)的形式堆积，因此PD被视为一种突触核蛋白病变(synucleiopathy)等。可见，蛋白聚集现象在分子病理学中研究非常重要。通过检测具有神经毒性的蛋白聚集体有助于了解疾病的发生发展过程并为治疗提供新的思路。
蛋白错误折叠的循环扩增(protein-misfolding cyclic amplification,PMCA)可以检测蛋白聚集体，但是该技术需要精确的实验条件和操作，包括温度、时间和超声处理等，且所需时间比较长(有时需要长达一周)，特别是PMCA容易出现假阳性。原理上其依赖测定于初始“聚集体种子”经一定时间的指数扩增后得到的产物总量，但单体在经过一段时间处理后也会自发聚合成聚集体从而“无中生有”聚集体种子。因此在样本低丰度情况下精确度不好，信噪比有限。其次，PMCA的读数依赖于蛋白印迹实验(western blotting,WB)，这本身是一种半定量的实验，在此信息转译的过程中进一步降低了信噪比，无法满足临床检验所需的快速即时检测。
实时震动诱导转化(RT-QuIC)采用与PMCA类似的扩增思路，但改进了处理条件(加热·震荡)，所需时间更短。用特异性染料和光电管代替了蛋白印迹实验进行读出。其原理上是测定初始“聚集体种子”以指数关系被扩增后达到指定量级的时间，因而也存在前述PMCA单体自发聚合的缺陷。虽然好于使用WB读出，但受限于光电传感器、计时器、温度控制模块的精度，在初始样本低丰度的条件下，微量的差异难以从指数关系中读出。因而该技术的信噪比依然有限，增加扩增程度或从光电系统一侧放大信号即更容易产生假阳性。因此，PMCA和RT-QuIC检测方法都依赖于扩增，无法做到蛋白聚集体的直接原位检测。
抗体识别特定的蛋白质构象，但由于聚集体表面具有几乎所有单体所具有的构象，抗体很难区分二者，即容易产生假阳性。适体是基于核酸的识别分子，其识别效果与抗体没有本质的区别，故存在类似的缺陷。染料如硫黃素T和硫黃素S，由于其结构易于插入淀粉样分子的间隙，可以识别这些聚集体，但是对单体仍有一定的结合力，即特异性不足，且其本身产生的信号强度非常弱，导致检测灵敏度不高。总之现有的识别分子的共同缺陷是灵敏度非常低，特异性也不足。
发明内容
本发明的目的是提供一种神经元蛋白聚集体特异性检测试剂盒，以解决上述现有技术存在的问题，本发明能在临床样本中单体和聚集体蛋白共存情况下，保证高灵敏度、高特异性地检测具有神经毒性的蛋白聚集体，同时，又兼有低成本、高通量和快速检测的优势，具有实际的应用价值。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种神经元蛋白聚集体的探测元件，所述探测元件以氧化石墨烯为骨架，负载探测抗体-辣根过氧化物酶复合体。
进一步地，所述探测元件的构建方法为：
在羧基修饰的氧化石墨烯GO-COOH悬浮液中加入含EDC和NHS的混合溶液，混合、离心后，收集活化的氧化石墨烯，之后与辣根过氧化物酶和探测抗体的混合溶液反应，得到HRP-Ab/GO复合物，即为所述探测元件。
进一步地，所述羧基修饰的氧化石墨烯GO-COOH悬浮液的制备方法为：将氧化石墨烯悬浊液超声处理，离心收集沉淀，将收集的沉淀悬浮在NaOH和ClCH2COONa的溶液中，再次超声处理，得到所述羧基修饰的氧化石墨烯GO-COOH悬浮液。
进一步地，所述辣根过氧化物酶和探测抗体的混合溶液中辣根过氧化物酶和探测抗体的体积比为300：1。
本发明还提供一种所述的探测元件在制备神经元蛋白聚集体的检测试剂盒中的应用。
进一步地，所述检测试剂盒以化学发光法检测神经元蛋白聚集体。
进一步地，所述化学发光法检测神经元蛋白聚集体的步骤包括：先定植捕捉抗体进行封闭后，加入待测样品孵育，使待测样品中的单体蛋白与捕捉抗体结合，排除干扰；之后加入所述探测元件孵育，最后加入发光底物或显色底物，根据信号强度检测待测样品中的神经元蛋白聚集体的含量。
进一步地，所述捕捉抗体和所述探测元件中的探测抗体为同一抗体。
本发明公开了以下技术效果：
本发明使用捕捉抗体和探测抗体为同一抗体，先采用捕捉抗体识别待测样本中的单体蛋白，避免单体蛋白的假阳性干扰，后续以探测抗体识别蛋白聚集体，不会对单体产生信号，提高检测特异性；同时本发明还构建探测元件，通过纳米材料负载更多酶实现信号放大，提高检测灵敏度。
本发明的检测方法能在临床样本中单体和聚集体蛋白共存情况下，保证高灵敏度、高特异性地检测具有神经毒性的蛋白聚集体。同时，又兼有低成本、高通量和快速检测的优势，具有实际的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为HRP-Ab@GO的构建流程图；
图2为HRP与抗体antiα-syn mAb比例对探测元件HRP-Ab@GO的信号强度影响；
图3为探测元件HRP-Ab@GO的红外光谱检测结果；
图4为蛋白G磁珠吸附实验示意图和实验结果，其中(a)为HRP-Ab/GO；(b)为Ab-GO；(c)为HRP-GO；(d)为蛋白G磁珠；(e)为GO；(f)为HRP；
图5为检测方法流程图；
图6为标准曲线的建立和α-突触核蛋白聚合物的检测结果。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明的目的是在临床样本中单体和聚集体蛋白共存情况下，保证高灵敏度高特异性地检测具有神经毒性的蛋白聚集体。同时，又兼有低成本和快速检测的优势。本发明的技术原理是捕捉抗体和探测抗体使用同一抗体，对单体蛋白而言，大多数抗体识别的位点在单体该蛋白上是唯一的，单体蛋白的识别位点在捕捉步即会被捕捉抗体占据，从而不会被探测抗体所再次识别。而聚集体由于是许多单体聚集而成，每个聚集体携带不止一个识别位点，从而会再次被同一抗体识别，以此保证探测抗体不会对单体蛋白产生信号，避免出现RT-QuIC和PMCA常见的假阳性结果，提高特异性，还通过纳米材料负载更多酶实现信号放大，具有更微量的检测限，提高检测灵敏度。具体研究如下：
实施例1
1构建探测元件“氧化石墨烯为骨架的抗体-辣根过氧化物酶复合体”(HRP-Ab@GO)：
1.1氧化石墨烯GO悬浊液(约1mg/mL)在室温下超声处理(100W，40Hz)1小时。随后将悬浊液以13,000rpm的速度离心10分钟，收集沉淀物后重新悬浮在含有125mMNaOH和42.9mM ClCH2COONa的溶液中，通过超声处理1小时将酯、羟基和环氧化物转化为羧基。然后加入10mM HCl中和产物，并通过重复用超纯水冲洗和离心(13,000rpm)纯化，得到良好分散的GO-COOH悬浮液。
1.2使用5mMMES缓冲液(pH 5.5)配制50mg/mL EDC、NHS(1：1质量比)溶液，将此混合溶液加入GO-COOH悬浮液中(1：1体积比)，并在室温下旋转混合1小时。通过以13,000rpm的速度离心10分钟，收集活化的GO，与HRP和抗体的混合溶液(HRP和抗体的体积比见图2)以1mg：1mL的比例混合后在暗处于4℃孵育过夜，生成HRP-Ab/GO复合物。最后以13,000rpm的速度离心5分钟，用pH 7.4的PBS洗涤产物三次，去除含有未反应组分的上清液。最终产品HRP-Ab/GO复合物分散在含有1mg/mLBSA的PBS中，并存储在4℃。图1为HRP-Ab@GO的构建流程图，需要注意的是，图中EDC/NHS是把三者偶联到仪器的生化反应的名字，事实上并不是化学药品的名字。
以普通HRP-Ab偶联抗体为对照，采用下述3检测方法检测HRP与抗体antiα-synmAb比例对探测元件的信号强度影响，结果如图2所示，HRP与抗体antiα-syn mAb以300：1比例构建的HRP-Ab@GO复合物实现信号放大，进而提高检测灵敏度，因此，下述实验中选择优选的HRP-Ab@GO复合物开展研究。
2HRP-Ab/GO复合物的鉴定
通过傅里叶变换衰减全反射红外光谱仪(ATR-FTIR)或蛋白G磁珠吸附实验检验抗体和HRP是否有被正确装载到石墨烯骨架上。
ATR-FTIR：在与HRP和Ab结合之前，使用ClCH2COONa-NaOH进行了羧化，之后进行EDC/NHS偶联反应。红外光谱检测证实了HRP-Ab/GO复合物的成功形成。如图3所示，存在于3400、1700和1580cm–1处的特征吸收峰表明GO上存在羟基、环氧和酯基的伸缩振动，分别表示了-OH、C＝O和C＝C的存在。氯乙酸活化后，产生的GO衍生物显示了在1630cm–1处更强的吸收带，表明羧酸酯基团COO–的形成。在将肽与GO结合后，出现了一个强烈的特征带1650cm–1(–CO–NH–的伸缩振动)，并在2900cm–1附近出现了一个增加的小峰(–CH2的伸缩振动)，这表明成功形成了GO-生物分子共轭物。
蛋白G磁珠吸附实验：
成功制备HRP-mAb/GO复合物的进一步确认是通过简单的比色测量完成的。将10μL的蛋白G磁珠与20μL的HRP-Ab/GO复合物混合，在室温下轻轻摇动30分钟。将混合物用PBS洗涤两次，利用磁性辅助去除任何未结合的成分。然后，加入50μL的TMB底物并轻轻摇动。将试管放置在磁架上进行比色反应，同时使用Ab-GO、HRP-GO和单独的GO作为对照。
原理上，由于蛋白G对免疫球蛋白具有亲和力，Ab可以被蛋白G磁珠捕获，而HRP可以催化和触发TMB-H2O2反应生成蓝色产物。建立了一种比色测定方法，进一步证明了HRP和Ab同时结合到GO界面上。如图4所示，只有(a)和(f)在3秒内出现了有色产物，而(b)-(e)在30分钟后保持无色。具体而言，HRP-GO(c)和GO(e)不能与蛋白G磁珠结合，因此在洗涤步骤中被去除，导致没有酶催化形成有色产物。蛋白G磁珠单独也没有明显的催化反应性(d)。虽然Ab-GO(b)可以附着在蛋白G磁珠上，但由于没有酶的结合，所得溶液保持无色。与这些对照相比，HRP-Ab/GO试管(a)在加入蛋白G磁珠、洗涤、底物加入、磁化步骤后，与仅有HRP的试管(f)呈现相同的强烈蓝色，表明成功装饰了Ab和HRP到GO表面，分别实现了蛋白G磁珠的结合和TMB的催化反应。
3检测方法
以下是测定操作步骤，注意每步之间用缓冲液(任何适用于酶联免疫吸附实验中清洗操作的缓冲液)清洗数次。以检测α-突触核蛋白聚合物为例。检测方法的流程图如图5所示。
所使用的待测样本为细胞裂解物，采用如下方式处理：
首先使用三步顺序离心法(300g，10分钟；2000g，20分钟；10,000g，30分钟)去除血清中的细胞碎片、蛋白质聚集物和脂质杂质。取适量上清液转移至低结合蛋白质管(Eppendorf 90410)中待用。使用预先偶联了anti-L1CAM抗体的磁珠进行免疫捕获(利用主流方法，如Invitrogen 10608D所提供之解决方案，制备获得该种偶联磁珠)，将偶联磁珠和前述上清样本在4℃的旋转混合器上孵育过夜，通过磁力分离收集珠子-外泌体复合物，并依次用PBST(含0.05％Tween-20的PBS)中进行洗涤2次，最后用PBS洗涤1次。此时磁珠所携带着的就是所需要的外泌体。将分离的外泌体在含有1％TritonX-100和4％蛋白酶抑制剂的PBS中裂解，得到细胞裂解物待测样本。
3.1首先，用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)将抗体吸附于96孔板表面：取无叠氮抗体(antiα-syn mAb)，用磷酸缓冲液溶液(PBS，pH≈7.4)配制2微克每毫升的抗体溶液，加入1％体积比的APTES混匀。迅速将此混匀的溶液加入96孔板底使之均匀覆盖(需要30～50微升)，室温孵育30分钟。需要注意的是，目标物的抗体必须采用无叠氮抗体，前期研究中发现，添加叠氮化物的抗体会导致实验失败。
3.2定植抗体后进行封闭：使用常规的ELISA封闭方法(选择1％胎牛血清，同样Synblock无蛋白封闭缓冲液或其他合理方法也适用)室温下封闭(即孵育)30分钟。
3.396孔板准备完成后建立参考系并捕捉待测样品中的聚集体目标物：制备一系列浓度(0-16pg/mL)的目标物标准溶液(α-突触核蛋白聚合物(ab218819))加入一系列孔中(每孔约50微升)，以制备标准曲线。在其他空闲孔中加入待测样品(细胞裂解物)。加样完毕后在室温孵育30分钟使之结合。
3.4加载探测元件：使探测元件(“氧化石墨烯为骨架的抗体-辣根过氧化物酶复合体”，HRP-Ab@GO)结合到聚集体上：HRP-Ab@GO加入所有标准孔和待测孔中，室温孵育1小时。
3.5检测：加入发光底物或显色底物(此处实际选择的thermofisher，货号34577的化学发光底物，其他市售的化学发光底物、显色底物也适用)，用酶标仪测定信号强度。实验结果如图6所示，建立的标准曲线的线性回归方程为：Y＝2338*X+27221。依照标准曲线提供的函数关系，根据待测物产生的信号强度计算聚集体含量。以α-突触核蛋白单体标准品(ab51189)为对照样本，以普通HRP-Ab偶联抗体为对照组。从图6中可以看出，HRP-Ab/GO复合物相比于普通HRP-Ab偶联抗体，能实现信号放大，提高检测灵敏度。并且HRP-Ab/GO复合物不会对单体产生信号，避免RT-QuIC和PMCA常见的假阳性结果，提高检测特异性。最终获得检测范围为2-1000pg/mL，最低检测限为1.85pg/mL(见表1)。从表1中可以得知，其他检测方法的最低检测限大概为30-250pg/mL，灵敏性不佳，远远不及本发明的检测方法。
表1不同检测方法的比较
为了解决分析时间长，反应条件苛刻(需要长时间精确控制温度震动等)的问题，本发明的检测分析耗时只需要1.5～2小时，分析速度快。本发明只需要普通的实验室条件，不需要加热、震动、超声等激烈的操作条件，操作简便硬件需求小。
本发明降低使用成本。现有技术成本较高：1，物料上，需要消耗大量的蛋白质单体，这些单体的制备成本(需要真核细胞表达系统生产，且需要经过复杂的纯化)和保存成本(-80℃)都很高。2，操作上，需要复杂的专用仪器，使用成本较高。本发明仅消耗少量的石墨烯、抗体、标准品，且仪器较为普适。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (2)
1.一种神经元蛋白聚集体的探测元件在制备神经元蛋白聚集体的检测试剂盒中的应用，其特征在于，所述探测元件以氧化石墨烯为骨架，负载探测抗体-辣根过氧化物酶复合体；
所述探测元件的构建方法为：
在羧基修饰的氧化石墨烯GO-COOH悬浮液中加入含EDC和NHS的混合溶液，混合、离心后，收集活化的氧化石墨烯，之后与辣根过氧化物酶和探测抗体的混合溶液反应，得到HRP-Ab/GO复合物，即为所述探测元件；
所述辣根过氧化物酶和探测抗体的混合溶液中辣根过氧化物酶和探测抗体的体积比为300：1；
所述检测试剂盒以化学发光法检测神经元蛋白聚集体；所述化学发光法检测神经元蛋白聚集体的步骤包括：先定植捕捉抗体进行封闭后，加入待测样品孵育，使待测样品中的单体蛋白与捕捉抗体结合，排除干扰；之后加入所述探测元件孵育，最后加入发光底物或显色底物，根据信号强度检测待测样品中的神经元蛋白聚集体的含量；
所述捕捉抗体和所述探测元件中的探测抗体为同一抗体，且同一抗体均为无叠氮抗体。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述羧基修饰的氧化石墨烯GO-COOH悬浮液的制备方法为：将氧化石墨烯悬浊液超声处理，离心收集沉淀，将收集的沉淀悬浮在NaOH和ClCH2COONa的溶液中，再次超声处理，得到所述羧基修饰的氧化石墨烯GO-COOH悬浮液。
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