CN115453106A - 一种大田软海绵酸免疫检测复合探针及制备方法与应用 - Google Patents
一种大田软海绵酸免疫检测复合探针及制备方法与应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115453106A CN115453106A CN202211160991.0A CN202211160991A CN115453106A CN 115453106 A CN115453106 A CN 115453106A CN 202211160991 A CN202211160991 A CN 202211160991A CN 115453106 A CN115453106 A CN 115453106A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- okadaic acid
- compound
- immunodetection
- probe
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- QNDVLZJODHBUFM-WFXQOWMNSA-N okadaic acid Chemical compound C([C@H](O1)[C@H](C)/C=C/[C@H]2CC[C@@]3(CC[C@H]4O[C@@H](C([C@@H](O)[C@@H]4O3)=C)[C@@H](O)C[C@H](C)[C@@H]3[C@@H](CC[C@@]4(OCCCC4)O3)C)O2)C(C)=C[C@]21O[C@H](C[C@@](C)(O)C(O)=O)CC[C@H]2O QNDVLZJODHBUFM-WFXQOWMNSA-N 0.000 title claims abstract description 73
- VEFJHAYOIAAXEU-UHFFFAOYSA-N okadaic acid Natural products CC(CC(O)C1OC2CCC3(CCC(O3)C=CC(C)C4CC(=CC5(OC(CC(C)(O)C(=O)O)CCC5O)O4)C)OC2C(O)C1C)C6OC7(CCCCO7)CCC6C VEFJHAYOIAAXEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 73
- 239000000523 sample Substances 0.000 title claims abstract description 52
- 239000002131 composite material Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 11
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 claims abstract description 25
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims abstract description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 12
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims abstract description 10
- HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(4-chlorophenyl)-2-(4-methylphenyl)sulfonylbutane-1,4-dione Chemical compound C1=CC(C)=CC=C1S(=O)(=O)C(C(=O)C=1C=CC(Cl)=CC=1)CC(=O)C1=CC=C(Cl)C=C1 HTSGKJQDMSTCGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims abstract description 9
- NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N ethyl (e)-3-[3-amino-2-cyano-1-[(e)-3-ethoxy-3-oxoprop-1-enyl]sulfanyl-3-oxoprop-1-enyl]sulfanylprop-2-enoate Chemical compound CCOC(=O)\C=C\SC(=C(C#N)C(N)=O)S\C=C\C(=O)OCC NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 20
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 12
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 12
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 12
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 6
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 6
- 238000002493 microarray Methods 0.000 claims description 6
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 claims description 3
- 102000015782 Electron Transport Complex III Human genes 0.000 claims description 3
- 108010024882 Electron Transport Complex III Proteins 0.000 claims description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 13
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 9
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 4
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 abstract 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 2
- 208000004891 Shellfish Poisoning Diseases 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 2
- 238000002371 ultraviolet--visible spectrum Methods 0.000 description 2
- 208000004998 Abdominal Pain Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 206010070863 Toxicity to various agents Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 208000012873 acute gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 208000002173 dizziness Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 238000000707 layer-by-layer assembly Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000722 protumoral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种大田软海绵酸免疫检测复合探针及制备方法与应用。以氧化石墨烯为载体，向氧化石墨烯水溶液中加入生物素标记的二抗，在4℃下孵育过夜，得到复合物I；将复合物I离心去掉上清液，然后加入PBS缓冲液重新进行分散，得到复合物II；然后利用生物素‑链霉亲和素之间的强特异性，向复合物II中加入链霉亲和素标记的辣根过氧化酶，4℃下孵育过夜，得到复合物III；将复合物III离心去掉上清液，然后加入PBS缓冲液重新进行分散，制得大田软海绵酸免疫检测复合探针。本发明中的分子探针可以实现显色信号的双功能多级放大，提高检测灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及一种大田软海绵酸免疫检测复合探针及制备方法与应用，具体涉及一种氧化石墨烯复合探针的制备以及在大田软海绵酸检测中的应用，属于生物分子免疫反应检测分析技术领域。
背景技术
大田软海绵酸(OA)是腹泻性贝类毒素(DSP)的主要致病毒素之一。它是一种脂溶性化合物，易溶于甲醇、乙醇、氯仿和乙醚等有机溶剂。由于OA的熔点高达156-158℃，所以经烹调后毒素仍具有很强的稳定性。OA引起的中毒症状主要有：食入30分钟后出现腹泻、头晕、呕吐、腹痛等症状。因为其中毒症状与急性肠胃炎症状相似，所以很容易与胃肠炎混淆。同时，据报道OA的长期累积效应极其有害，并具有强烈的促肿瘤和致癌作用。因此，高灵敏度、快速检测OA是预防安全事故发生的关键。
免疫分析法具有特异性强、灵敏度高、方法便捷、分析容量大、检测成本低等优点，一般不需要贵重仪器，可简化或省去前处理步骤，并且可以提供商业化的技术产品，具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和很高的灵敏度，非常适宜于复杂基质中痕量组分的分析。
目前免疫分析法已经成为检测大田软海绵酸的重要的技术手段之一，其中最常用的为酶联免疫反应。酶联免疫分析测试法测定具有操作简便，一次处理量大，灵敏度高，检测时间短等优点，已出现商用的检测大田软海绵酸的酶联免疫反应试剂盒。
氧化石墨烯是石墨烯的一种衍生物，其具有较大的比表面积，且具有良好的生物相容性。同时氧化石墨烯具有两亲性，从边缘到中央呈现从亲水到疏水的性质，可以通过非共价作用力，如π-π堆叠、氢键以及范德华作用力等进行功能化修饰，为其在生化分析领域的应用提供了优势。
本发明利用氧化石墨烯比表面积大、生物相容性高等特点，结合传统酶联免疫反应中常用的生物素-链霉亲和素信号放大系统，通过层层组装，制备得大田软海绵酸免疫检测复合探针。制备得到的大田软海绵酸免疫检测复合探针表面可以负载大量的辣根过氧化酶，同时结合氧化石墨烯自身也具有的类过氧化酶性质，使制备得到的大田软海绵酸免疫检测复合探针相较于常规的酶联免疫反应，可以实现信号双重放大，检测灵敏度提高两个数量级。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，而提供一种大田软海绵酸免疫检测复合探针及制备方法与应用，该分子探针可以实现显色信号的双功能多级放大，提高检测灵敏度。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的目的之一是提供一种大田软海绵酸免疫检测复合探针的制备方法，包括以下步骤：
(1)向氧化石墨烯水溶液中加入生物素标记的二抗，在4℃下孵育过夜，得到复合物I；
(2)将步骤(1)中得到的复合物I离心去掉上清液，然后加入PBS缓冲液重新进行分散，得到复合物II；
(3)向步骤(2)中得到的复合物II中加入链霉亲和素标记的辣根过氧化酶，4℃下孵育过夜，得到复合物III；
(4)将步骤(3)中得到的复合物III离心去掉上清液，然后加入PBS缓冲液重新进行分散，制得大田软海绵酸免疫检测复合探针。
上述技术方案中，步骤(1)中，向20μL的0.1mg/mL氧化石墨烯水溶液中加入6μL生物素标记二抗，4℃下孵育过夜。
上述技术方案中，步骤(1)中，所述的生物素标记二抗，优选为生物素结合多克隆山羊抗小鼠IgG(H+L)。
上述技术方案中，步骤(2)中，将复合物I在6000r/min的条件下进行离心，离心15min后去掉上清液，然后加入20μL 0.1moL/L PBS缓冲液重新进行分散，得到复合物II。
上述技术方案中，步骤(3)中，向复合物II中加入9μL链霉亲和素标记的辣根过氧化酶，4℃下孵育过夜，得到复合物III。
上述技术方案中，步骤(4)中，将复合物III在6000r/min的条件下进行离心，离心15min去掉上清液，加入加入20μL 0.1moL/L PBS缓冲液重新进行分散，制得大田软海绵酸免疫检测复合探针。
本发明的目的之二是提供一种经过上述制备方法制备后得到的大田软海绵酸免疫检测复合探针。本发明利用氧化石墨烯比表面积大、生物相容性高等特点，结合生物素-链霉亲和素，通过层层组装，实现辣根过氧化酶在氧化石墨烯表面的固定。此外，氧化石墨烯自身具有的类过氧化酶的性质使得氧化石墨烯复合探针可以实现信号的双重放大，将其用于大田软海绵酸的检测时特异性好，灵敏度高。
本发明的目的之三是提供一种上述的大田软海绵酸免疫检测复合探针在对大田软海绵酸进行检测方面的应用。
上述技术方案中，所述的大田软海绵酸免疫检测复合探针在对大田软海绵酸进行检测时，包括以下步骤：
(a)在微阵列芯片的每个微孔中加入30μL 50ng/mL的大田软海绵酸包被抗原，37℃下孵育2小时，去除多余的大田软海绵酸包被抗原，然后用PBST清洗微孔3次；
(b)在每个微孔中加入40μL质量浓度5％的BSA封闭液，37℃下孵育2小时以封闭活性位点，去掉多余的BSA封闭液，然后用PBST清洗微孔3次；
(c)在不同的微孔中分别加入15μL不同浓度的大田软海绵酸标准品，然后在每个微孔中分别加入15μL大田软海绵酸的单克隆抗体(1：80000稀释)进行竞争反应，混匀后37℃下孵育2小时，然后用PBST清洗微孔3次；
(d)在每个微孔中加入30μL大田软海绵酸免疫检测复合探针水溶液(1：600稀释)，37℃下孵育2小时，然后用PBST清洗微孔3次；
(e)在每个微孔中加入30μL TMB显色液，用智能手机拍照收集色度信号，根据各显色强度和样品浓度之间的线性关系，计算样品的浓度。
上述技术方案中，步骤(a)～步骤(d)中，所述的PBST，指的是含0.05％Tween-20的0.1M pH＝7.4PBS缓冲液。
上述技术方案中，步骤(b)中，所述的BSA封闭液，指的是质量浓度为5％的牛血清蛋白溶液，是将BSA溶解在0.1M PBS缓冲液中得到的。
上述技术方案中，步骤(c)中，所述的不同浓度的大田软海绵酸标准品，是通过pH＝7.4的0.01mol/L PBS溶液稀释而成，浓度分别为0.02、0.1、0.5、2.1、4.2、16.8、33.6ng/mL。
上述技术方案中，步骤(e)中，智能手机获取的各显色强度通过软件Image J识别分析而得。
与现有技术相比，具有以下特点：
本发明成功的构建了一种基于大田软海绵酸免疫检测复合探针的免疫传感器，结合智能手机和微阵列芯片对大田软海绵酸进行检测。当通入抗原样品和单抗后，抗原样品会和微阵列芯片上的包被抗原竞争性结合单抗，然后加入大田软海绵酸免疫检测复合探针与单抗结合，最后加入TMB，大田软海绵酸免疫检测复合探针能够催化TMB产生颜色变化。利用智能手机的摄像头对颜色强度进行捕捉，然后利用Image J软件对颜色强度进行分析。根据颜色强度与抗原样品浓度之间的线性关系，确定抗原样品的浓度。相比较于常规的间接竞争酶联免疫反应，本方法可以缩短检测时间，降低检测成本，提高检测灵敏度。
附图说明
图1为大田软海绵酸免疫检测复合探针的制作原理示意图。
图2为大田软海绵酸免疫检测复合探针的紫外-可见光谱表征图(其中■代表GO；●代表SA-HRP；▲代表B-anti-lgG；★代表GO-B-anti-lgG；◆代表GO composite)。
图3为氧化石墨烯复合探针的免疫传感器手机成像示意图(其中1指智能手机；2指拍摄盒；3指微阵列芯片；4指发光板)。
图4为大田软海绵酸标准样品的浓度与显色强度的曲线(Y＝0.10128x+0.23032R2＝0.99623)。大田软海绵酸的浓度(自下至上)：0.02、0.1、0.5、2.1、4.2、16.8、33.6ng/mL
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述,有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
下面结合具体的实施例对本发明进行阐述：
实施例1：
基于氧化石墨烯比表面积大，生物相容性高的特点，以氧化石墨烯作为载体，将生物素标记二抗固定在氧化石墨烯的表面，同时，利用生物素-链霉亲和素之间具有强的特异性，将链霉亲和素标记的辣根过氧化酶固定在氧化石墨烯表面，使得一个氧化石墨烯上可以负载大量的辣根过氧化酶，实验原理如图1所示。
一种大田软海绵酸免疫检测复合探针，是通过下述制备方法制备后得到的：
(1)向20μL的0.1mg/mL氧化石墨烯水溶液中加入6μL生物素结合多克隆山羊抗小鼠IgG(H+L)，4℃下孵育过夜，得到复合物I；
(2)将复合物I在6000r/min的条件下进行离心，离心15min后去掉上清液，然后加入20μL 0.1moL/L PBS缓冲液重新进行分散，得到复合物II；
(3)向复合物II中加入9μL链霉亲和素标记的辣根过氧化酶(SA-HRP)，4℃下孵育过夜，得到复合物III；
(4)将复合物III在6000r/min的条件下进行离心，离心15min去掉上清液，加入加入20μL 0.1moL/L PBS缓冲液重新进行分散，得到浓度为0.1mg/mL的大田软海绵酸免疫检测复合探针,大田软海绵酸免疫检测复合探针的紫外-可见光谱表征图如图2所示。
实施例2：
将实施例1得到的大田软海绵酸免疫检测复合探针作为免疫传感器进行大田软海绵酸的检测，包括以下步骤：
(a)：在透明的微阵列芯片的每个微孔(高2mm，直径5mm)中加入30μL 50ng/mL的大田软海绵酸的包被抗原，37℃下孵育2小时，去掉剩下的大田软海绵酸的包被抗原，然后用PBST(0.05％Tween-20的0.1M pH＝7.4PBS缓冲液中)清洗微孔3次；
(b):在每个微孔中加入40μL质量浓度5％的牛血清蛋白溶液作为封闭液(BSA溶解在0.1M PBS缓冲液中)37℃下孵育2小时以封闭活性位点，然后去掉多余的牛血清蛋白封闭液，再用PBST清洗微孔3次；
(c)：在不同的微孔中分别加入15μL不同浓度的大田软海绵酸标准品(浓度分别为0.02、0.1、0.5、2.1、4.2、16.8、33.6ng/mL)，然后在每个微孔中加入15μL大田软海绵酸的单克隆抗体(1：80000稀释)，混匀后在37℃下孵育2小时，游离的大田软海绵酸会与微孔上提前固定的包被抗原竞争性结合大田软海绵酸抗体，竞争反应完成后，用PBST清洗微孔3次；本步中，不同浓度的大田软海绵酸标准品是通过pH＝7.4的0.01mol/L PBS溶液稀释而成；
(d)向每个微孔中加30μL的实施例1制得的大田软海绵酸免疫检测复合探针(1：600稀释)，37℃下孵育2小时后PBST清洗微孔3次去除未结合的氧化石墨烯复合探针；
(e)：向每个微孔中加入30μL TMB显色液(微孔下方设置有发光板)，用智能手机后置摄像头进行拍照。图3为氧化石墨烯复合探针的免疫传感器手机成像示意图。收集色度信号，将收集到的色度照片输入到Image J软件，在每个微孔中心取固定直径的圆形，利用灰度值来计算每个点的显色强度。其中，图4为根据各标准样品浓度和其对应的显色强度拟合的标准曲线，通过该标准曲线，根据未知样品的显色强度可以确定各未知浓度的样品的浓度。
本发明所提出的大田软海绵酸免疫检测方法的线性范围在0.02-33.6ng/mL，检出限为0.02ng/mL，相较于传统的大田软海绵酸的免疫检测方法，检出限更低，灵敏度大幅度提高。同时，为了考察本发明所构建的免疫传感器的准确性与实际应用价值，选择了三种标准浓度的大田软海绵酸样品，进行了加标回收实验，所得结果与标准加入量进行了对比。如表1，经过测定，三种标准样品进行的回收实验所得回收率分别为80％、94％、103.5％，显示出与标准加入良好的一致性。说明了基于大田软海绵酸免疫检测复合探针所构建的间接竞争免疫系统具有可接受的实际样品检测能力。
表1 大田软海绵酸的加标回收实验测定
上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种大田软海绵酸免疫检测复合探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向氧化石墨烯水溶液中加入生物素标记的二抗，在4℃下孵育过夜，得到复合物I；
(2)将步骤(1)中得到的复合物I离心去掉上清液，然后加入PBS缓冲液重新进行分散，得到复合物II；
(3)向步骤(2)中得到的复合物II中加入链霉亲和素标记的辣根过氧化酶，4℃下孵育过夜，得到复合物III；
(4)将步骤(3)中得到的复合物III离心去掉上清液，然后加入PBS缓冲液重新进行分散，制得大田软海绵酸免疫检测复合探针。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)中，向20μL的0.1mg/mL氧化石墨烯水溶液中加入6μL生物素标记二抗，4℃下孵育过夜；所述的生物素标记二抗，为生物素结合多克隆山羊抗小鼠IgG(H+L)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(2)中，将复合物I在6000r/min的条件下进行离心，离心15min后去掉上清液，然后加入20μL 0.1moL/L PBS缓冲液重新进行分散，得到复合物II。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(3)中，向复合物II中加入9μL链霉亲和素标记的辣根过氧化酶，4℃下孵育过夜，得到复合物III。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(4)中，将复合物III在6000r/min的条件下进行离心，离心15min去掉上清液，加入加入20μL 0.1moL/L PBS缓冲液重新进行分散，制得大田软海绵酸免疫检测复合探针。
6.一种经过权利要求1-5任一项所述的制备方法制备后得到的大田软海绵酸免疫检测复合探针。
7.一种权利要求6中所述的大田软海绵酸免疫检测复合探针在对大田软海绵酸进行检测方面的应用。
8.根据权利要求7中所述的应用，其特征在于，所述的大田软海绵酸免疫检测复合探针在对大田软海绵酸进行检测时，包括以下步骤：
(a)在微阵列芯片的每个微孔中加入30μL 50ng/mL的大田软海绵酸包被抗原，37℃下孵育2小时，去除多余的大田软海绵酸包被抗原，然后用PBST清洗微孔3次；
(b)在每个微孔中加入40μL质量浓度5％的BSA封闭液，37℃下孵育2小时以封闭活性位点，去掉多余的BSA封闭液，然后用PBST清洗微孔3次；
(c)在不同的微孔中分别加入15μL不同浓度的大田软海绵酸标准品，然后在每个微孔中分别加入15μL大田软海绵酸的单克隆抗体(1：80000稀释)进行竞争反应，混匀后37℃下孵育2小时，然后用PBST清洗微孔3次；
(d)在每个微孔中加入30μL大田软海绵酸免疫检测复合探针水溶液(1：600稀释)，37℃下孵育2小时，然后用PBST清洗微孔3次；
(e)在每个微孔中加入30μL TMB显色液，用智能手机拍照收集色度信号，根据各显色强度和样品浓度之间的线性关系，计算样品的浓度。
9.根据权利要求8中所述的应用，其特征在于，步骤(a)～步骤(d)中，所述的PBST，指的是含0.05％Tween-20的0.1M pH＝7.4PBS缓冲液；步骤(b)中，所述的BSA封闭液，指的是质量浓度为5％的牛血清蛋白溶液，是将BSA溶解在0.1M PBS缓冲液中得到的。
10.根据权利要求8中所述的应用，其特征在于，步骤(c)中，所述的不同浓度的大田软海绵酸标准品，是通过pH＝7.4的0.01mol/L PBS溶液稀释而成，浓度分别为0.02、0.1、0.5、2.1、4.2、16.8、33.6ng/mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211160991.0A CN115453106A (zh) | 2022-09-22 | 2022-09-22 | 一种大田软海绵酸免疫检测复合探针及制备方法与应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211160991.0A CN115453106A (zh) | 2022-09-22 | 2022-09-22 | 一种大田软海绵酸免疫检测复合探针及制备方法与应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115453106A true CN115453106A (zh) | 2022-12-09 |
Family
ID=84307011
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211160991.0A Pending CN115453106A (zh) | 2022-09-22 | 2022-09-22 | 一种大田软海绵酸免疫检测复合探针及制备方法与应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115453106A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015055708A1 (en) * | 2013-10-15 | 2015-04-23 | Fundació Institut Català De Nanociència I Nanotecnologia | Sensitive qualitative bioassay using graphene oxide as analyte revealing agent |
| CN104630230A (zh) * | 2015-01-06 | 2015-05-20 | 江南大学 | 一组特异识别大田软海绵酸的核酸适配体 |
| CN108660187A (zh) * | 2018-05-10 | 2018-10-16 | 上海交通大学 | 基于功能化氧化石墨烯的免疫pcr检测方法及其应用 |
| CN111537483A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-08-14 | 青岛农业大学 | 检测冈田酸的荧光核酸适配体传感器、其制备方法与使用该传感器检测冈田酸的方法 |
-
2022
- 2022-09-22 CN CN202211160991.0A patent/CN115453106A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2015055708A1 (en) * | 2013-10-15 | 2015-04-23 | Fundació Institut Català De Nanociència I Nanotecnologia | Sensitive qualitative bioassay using graphene oxide as analyte revealing agent |
| CN104630230A (zh) * | 2015-01-06 | 2015-05-20 | 江南大学 | 一组特异识别大田软海绵酸的核酸适配体 |
| CN108660187A (zh) * | 2018-05-10 | 2018-10-16 | 上海交通大学 | 基于功能化氧化石墨烯的免疫pcr检测方法及其应用 |
| CN111537483A (zh) * | 2020-05-08 | 2020-08-14 | 青岛农业大学 | 检测冈田酸的荧光核酸适配体传感器、其制备方法与使用该传感器检测冈田酸的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LI XIAOTONG 等: "A smartphone-assisted microarray immunosensor coupled with GO-based multi-stage signal amplification strategy for high-sensitivity detection of okadaic acid", 《TALANTA》, vol. 247, 21 May 2022 (2022-05-21), pages 1 - 8, XP087099794, DOI: 10.1016/j.talanta.2022.123567 * |
| 关大顺 等: "《现代代谢病与营养性疾病》", 31 January 2008, 天津科技翻译出版公司, pages: 120 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN105548565B (zh) | 一种用于检测克氏锥虫抗体的试剂盒及其制备和应用 | |
| US20190219569A1 (en) | Fluorescence immunochromatographic detection card and a preparation method therefor and use thereof | |
| WO2019148753A1 (zh) | 一种thsd7a抗体的检测试纸条及检测方法 | |
| CN1700009A (zh) | 用单一捕获剂定量检测特异性分析物的方法及其试剂盒 | |
| RU2006145450A (ru) | Анализ на антитела | |
| CN109444434B (zh) | 双抗原夹心检测抗体的方法 | |
| CN112285353A (zh) | 一种提高链霉亲和素-生物素反应体系的化学发光试剂盒抗生物素干扰能力和灵敏度的方法 | |
| CN112649601B (zh) | 一种酶标偶联二抗及其制备方法 | |
| CN110007073A (zh) | 一种多指标联检化学发光试剂盒及其制备方法和应用 | |
| CN101377496A (zh) | 一种检测甲状腺过氧化物酶自身抗体的化学发光免疫分析测定试剂盒 | |
| CN111781346B (zh) | 一种用于全血的酶联免疫稀释液及其制备方法和使用方法 | |
| KR20140145121A (ko) | 면역분석 방법 및 시약 | |
| CN115453106A (zh) | 一种大田软海绵酸免疫检测复合探针及制备方法与应用 | |
| CN102401832A (zh) | 黄曲霉毒素b1、玉米赤霉烯酮液相芯片检测试剂盒及其制法 | |
| CN116106559A (zh) | 一种生物素与抗体偶联比检测试剂盒及其应用 | |
| CN115032398A (zh) | 一种定量检测生物样品中抗体含量的方法 | |
| CN111781371B (zh) | 一种基于磁珠载体双抗夹心elisa的考古现场快速检测痕量丝素蛋白的方法 | |
| Chen et al. | Porous silicon affinity chips for biomarker detection by MALDI-TOF–MS | |
| JP2002228660A (ja) | ダイオキシン類の検出方法 | |
| CN110922476A (zh) | 一种生物素偶联抗体及其制备方法和应用 | |
| CN111879920A (zh) | 一种基于单金属Cu-MOF模拟酶的多组分无标记的免疫传感器 | |
| Presnova et al. | Multianalysis of thyroid tumor markers on the surface of a porous membrane and semiconductor substrates using gold nanoparticles as a label | |
| CN113125729A (zh) | 一种检测橘青霉素的酶联免疫试剂盒及其检测方法 | |
| US20230221309A1 (en) | Method, use of the method and kit for detecting bioindicators in a sample | |
| CN116930485B (zh) | 一种基于免疫生物反应的痕量污染物红外信号增强及原位快速检测方法及检测系统 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |