CN104630230A - 一组特异识别大田软海绵酸的核酸适配体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一组特异性识别大田软海绵酸的单链DNA核酸适配体，属于食品安全生物技术领域。本发明利用氧化石墨烯辅助分离的指数富集配体系统进化技术，经过13轮反复的孵育、分离、扩增、制备单链的体外筛选，获得了一组核酸适配体，经亲和性和特异性分析，从中选出了一条对大田软海绵酸具有高亲和性和高特异性的适配体OA-27。对去除引物区的OA27-1进行分析，发现OA27-1也具有高亲和性和特异性。该组适配体在水产品中大田软海绵酸的分析检测和临床上大田软海绵酸中毒的诊断和治疗方面具有广泛的应用前景。

Description

一组特异识别大田软海绵酸的核酸适配体

技术领域

本发明属于食品安全生物技术领域，涉及对腹泻性贝类毒素大田软海绵酸具有高亲和性和高特异性的识别元件——单链DNA核酸适配体的序列。

背景技术

大田软海绵酸(Okadaic acid，OA)是一种小分子脂溶性毒素，是由鳍藻属和原甲藻属藻类产生的一种次生代谢产物。贻贝、扇贝、牡蛎等贝类生物滤食这些有毒藻类后使大田软海绵酸在其体内积累。当人误食了这些贝类后，就可能引起中毒，症状为腹泻、恶心、呕吐、腹痛等。由于其主要中毒症状为腹泻，所以将其称为腹泻性贝类毒素(Diarrhetic Shellfish Poisoning，DSP)。腹泻性贝类毒素还有鳍藻毒素(Dinophysistoxin，DTX)、蛤毒素(Pectenotoxin，PTX)、扇贝毒素(Yessotoxin，YTX)等。OA虽然是一种非致命毒素，没有很强烈的毒性，但分布广泛，热稳定性好，在平常的烹饪过程中不能通过高温加热破坏其化学结构和降低其毒性，因此中毒事件时有发生。OA引起中毒的机制是，OA可特异性抑制蛋白磷酸酶PP1和PP2A的活性，导致大量蛋白质的过磷酸化和积累，改变信号传导途径，破坏细胞生物机能，导致细胞凋亡。另外，研究发现OA还是肿瘤促进因子。

目前，检测大田软海绵酸的方法主要有：小鼠生物分析法(MBA)、高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附法(ELISA)、表面等离子共振法(SPR)、蛋白磷酸酶抑制分析法(PPIA)等。MBA根据注射毒素后小鼠的存活时间和中毒症状来评价毒性，结果较为直观，是很多国家检测贝类毒素的标准方法；但该方法受小鼠品系和个体差异的影响较大，重复性差，小鼠购买和饲养费用也较高，且无法确定毒素的具体成分和含量。HPLC和SPR灵敏度高、检出限低，并可实现连续自动检测；但样品前处理要求高，需要昂贵的仪器设备和专业的技术人员，不适合现场快速检测。ELISA等依赖抗原-抗体结合反应的检测方法操作简便，特异性强，灵敏度高，无需昂贵的仪器设备，适用于现场快速检测；然而，制备抗体的过程繁琐耗时，成本昂贵，且OA的相对分子量仅为804.5，无免疫原性，需要偶联大分子载体后才可用于制备抗体，另外，不同批次抗体的重复性和稳定性不如核酸适配体，储存条件也较为严苛。PPIA检测受OA特异性抑制的蛋白磷酸酶的活性，所以特异性较好，检测时间较短，但会受到样品和环境的干扰。

核酸适配体(Aptamer)是近年来新兴的一种靶标识别分子，它是一条长度为40-100nt的单链寡核苷酸，可形成发卡、假结、凸环、G-四联体等空间构象，通过空间结构的匹配、氢键作用、静电作用等与靶标稳定结合。适配体与靶标结合的亲和性和特异性可与抗体相媲美，同时与抗体相比还具有很多优势：(1)筛选得到的适配体序列可由生物公司合成，既不依赖动物体内免疫，也可减少不同生产批次间的差异；(2)适配体的靶标种类极其广泛，小到氨基酸、核苷酸、金属离子、毒素、有机染料、抗生素、辅因子等小分子物质，大到酶、 生长因子、抗体、核酸等生物大分子，甚至完整的病毒、细菌和细胞等都可作为适配体筛选的靶标；(3)筛选适配体的配体指数富集系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)是一种体外筛选技术，不涉及任何动物和细胞，毒素和没有免疫原性的小分子也可筛选到高亲和力的适配体；(4)核酸适配体稳定性好，可长期保存并可常温运输，也更易于标记或化学修饰。

目前，对于小分子物质的适配体主要是通过把靶标固定在酶标板、磁珠或亲和层析柱上进行SELEX筛选。这种固定法可能由于空间排阻效应使小分子丧失部分适配体识别的位点，有些小分子还需要连接合适的基团或分子进行固定，改变了天然构象，可能影响筛选到的适配体的应用。毛细管电泳的应用使SELEX筛选非固定小分子的适配体成为可能，然而这需要昂贵的毛细管电泳设备和娴熟的操作技术和经验。本发明以水产品中常见的腹泻性贝类毒素OA为靶标，利用氧化石墨烯(Graphene Oxide，GO)辅助分离的非固定SELEX技术(GO-SELEX)筛选得到了对OA具有高亲和性和特异性的单链DNA核酸适配体。该适配体可用于快速、灵敏、特异地检测水产品中的OA，也可为临床上OA中毒的诊断和治疗提供新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种能特异性识别大田软海绵酸、且具有高亲和性的核酸适配体序列，以克服现有的检测大田软海绵酸技术的不足，特别是免疫检测法中，抗体制备必须依赖动物或细胞，过程繁琐耗时，成本昂贵，不同批次抗体间的重复性和稳定性欠佳，储存条件也较为严苛等缺陷，为开发新型的大田软海绵酸分析检测方法奠定基础。

为实现上述目的，本发明采用氧化石墨烯辅助分离的SELEX技术，利用氧化石墨烯通过π-π作用非特异性吸附单链DNA(single strand DNA，ssDNA)的特性，在SELEX的分离步骤中，用氧化石墨烯吸附未与大田软海绵酸结合的游离ssDNA，使其与大田软海绵酸-ssDNA复合物分离，通过多轮筛选的系统进化，获得特异性高、亲和力强的大田软海绵酸核酸适配体，其序列为：

OA-27：5’-CAGCTCAGAA GCTTGATCCT ATTTAGCCAT GCTGAGGGAGATGCGCAGTC ACTACCACCT GACTCGAAGT CGTGCATCTG-3’

OA27-1：5’-ATTTAGCCAT GCTGAGGGAG ATGCGCAGTC ACTACCACCT-3’

本发明的优点是：

1)与抗体相比，适配体可人工合成，不依赖动物和细胞，周期短、成本低、批次间的差异小，便于化学修饰，稳定性也好，可长期保存。

2)筛选小分子物质的核酸适配体，传统的方法是将小分子靶标固定在磁珠、酶标板、亲和层析柱等固相表面，固相表面的空间排阻效应可能使靶标丧失部分适配体的识别位点，有些小分子物质需要通过连接分子偶联到固相表面，这就改变了其天然构象，这些都可能影响适配体在实际检测中对小分子的识别效果。本发明采用氧化石墨烯辅助分离的SELEX技术， 无需固定小分子毒素，可筛选到针对天然状态毒素分子的适配体。

附图说明

图1是不同用量氧化石墨烯吸附ssDNA的试验结果

图2是筛选大田软海绵酸核酸适配体的SELEX技术的流程图

图3是适配体序列的二级结构图，A为OA-27，B为OA27-1

图4是适配体的饱和结合曲线图，A为OA-27，B为OA27-1

图5是适配体的特异性试验结果，A为OA-27，B为OA27-1

表1SELEX筛序过程中每一轮的筛选条件

表2挑选出的8条ssDNA序列的解离常数Kd值

具体实施方式

1、随机ssDNA文库和引物的合成

构建了长度为80nt的随机ssDNA文库，由两端各20nt的引物区和中间40nt的随机区组成，序列为：5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCT-N₄₀-GACTCGAAGTCGTGCATCTG-3’(N₄₀代表40个随机核苷酸)，由美国Integrated DNA Technologies公司合成。

上游引物：5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCT-3’

下游引物：5’-CAGATGCACGACTTCGAGTC-3’

5’磷酸化的下游引物：5’-P-CAGATGCACGACTTCGAGTC-3’

引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

将随机ssDNA文库和引物用1×TE缓冲液(pH 7.4)配制成100μM贮存液-20℃保存备用。

2、氧化石墨烯吸附ssDNA最佳用量的确定

取6支2mL离心管，各加入10μM羧基荧光素标记的80nt ssDNA 8μL，质量约为2μg，按GO/ssDNA质量比为500、400、300、200、100、0在各支离心管中分别加入不同量的GO溶液，再加入Binding buffer(50mM Tris，150mM NaCl，2mM MgCl2，pH 7.4)补足体积至200μL，37℃振荡孵育1h，然后12000r/min离心15min，取上清，用OneDrop OD-1000超微量分光光度计测定核酸浓度，用日立F-7000荧光分光光度计测定荧光强度。从图1可以看出，当GO/ssDNA质量比为200时，核酸浓度和荧光强度都已达到基线水平，说明GO已完全吸附了ssDNA。在GO-SELEX的分离过程中，为确保GO能完全吸附未与大田软海绵酸结合的游离ssDNA，使用的GO/ssDNA质量比为300。

3、三种筛选模式

模式一：取初始ssDNA文库或上一轮筛选得到的ssDNA文库(每一轮的具体用量见表1)， 加入适量Binding buffer混匀后，95℃水浴5min，冰浴15min。然后，按毒素和ssDNA摩尔比为1:1加入OA混合均匀，37℃孵育(每一轮的孵育时间见表1)。结束后，按GO/ssDNA质量比为300加入GO，37℃孵育(每一轮的孵育时间见表1)，此时，与靶标OA结合的ssDNA仍保留在上清液中，而未结合的游离ssDNA序列被GO吸附。通过13000r/min离心15min，沉淀GO，收集上清液，得到能与OA结合的ssDNA文库。将此上清作为模板进行PCR扩增，纯化PCR产物。经λ核酸外切酶消化磷酸化的反义链制备单链，纯化酶切产物，获得次级ssDNA文库。用OneDrop OD-1000超微量分光光度计测定ssDNA浓度，计算下一轮筛选中需要加入的ssDNA文库体积。

模式二：随着筛选轮数的增加，文库中能与OA特异结合的ssDNA的比率增加，为增强筛选压力，提高适配体的亲和力和特异性，可先加入GO吸附所有ssDNA，再加入OA，诱导具有特异性的ssDNA发生构象变化，从GO表面解吸附后与OA结合。取上一轮筛选得到的次级ssDNA文库(具体用量见表1)，加入适量Binding buffer混匀后，95℃水浴5min，冰浴15min。然后，按GO/ssDNA质量比为300加入GO，37℃孵育(孵育时间见表1)，使所有ssDNA均被GO吸附。13000r/min离心15min，收集沉淀的GO，并用Binding buffer反复洗涤GO数次。再按毒素和ssDNA摩尔比为1:1在GO沉淀中加入OA混合均匀，37℃孵育(孵育时间见表1)。通过13000r/min离心15min，沉淀GO，收集上清液，得到与OA结合的ssDNA文库。将此上清作为模板进行PCR扩增，纯化PCR产物。经λ核酸外切酶消化磷酸化的反义链制备单链，纯化酶切产物，获得次级ssDNA文库。用OneDrop OD-1000超微量分光光度计测定ssDNA浓度，计算下一轮筛选中需要加入的ssDNA文库体积。

模式三(反筛)：为提高适配体的特异性，用鳍藻毒素-1(Dinophysistoxin-1，DTX-1)、鳍藻毒素-2(Dinophysistoxin-2，DTX-2)、石房蛤毒素(Saxitoxin，STX)、软骨藻酸(Domoic acid，DA)进行反筛，以去除能与这些毒素分子发生交叉反应的ssDNA。这些毒素中，DTX-1和DTX-2同属于腹泻性贝类毒素，是OA的结构类似物，STX和DA则是最主要的麻痹性贝类毒素和记忆缺失性贝类毒素。首先，取上一轮筛选得到的ssDNA文库经热变性和冷却处理后，与DTX-1、DTX-2、STX和DA的混合物混合(每种毒素与ssDNA的摩尔比均为1:1)，37℃孵育2h，接着加入GO，继续37℃孵育(孵育时间见表1)。在此过程中，与反筛靶标结合的ssDNA留在上清中，而未结合的ssDNA被GO吸附。离心分离后，取沉淀的GO用Binding buffer反复洗涤数次。然后，加入OA于37℃孵育(孵育时间见表1)，OA可诱导与其有特异性的ssDNA从GO表面解吸附。再次离心分离后，收集上清液进行PCR扩增，纯化后酶切制备单链，纯化后的酶切产物定量作为下一轮筛选的文库。

表1 SELEX筛序过程中每一轮的筛选条件

4、PCR扩增

采用不对称PCR的方法进行扩增，对模板用量、dNTP浓度、引物浓度、退火温度进行了优化。PCR扩增体系为：灭菌超纯水32.5μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP(5mM each)1μL，上游引物(20μM)0.5μL，5’磷酸化的下游引物(10μM)0.5μL，模板10μL，Taq酶0.5μL，总体积为50μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环20次；最后72℃延伸5min。同时扩增20管，利用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增结果，然后将20管PCR产物混合，纯化并制备单链。

5、制备单链 

通过不对称PCR扩增，可得到大量的ssDNA，少量的dsDNA则可用λ核酸外切酶消化处理。λ核酸外切酶能特异性识别并切割5’磷酸化的反义链，对酶的用量和酶切时间进行了优化。酶切反应体系为：10×λ核酸外切酶buffer 90μL，纯化的PCR产物800μL，λ核酸外切酶(5U/μL)10μL，总体积为900μL。酶切条件为：37℃水浴1h，然后75℃水浴10min灭活酶，终止反应。利用含7M尿素的8％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切结果。

6、DNA纯化

将PCR产物或酶切产物汇集在一个1.5mL离心管中，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(V:V:V＝25:24:1)，涡旋混匀后，10000r/min 4℃离心5min，小心吸取上层清液转入另一离心 管中。再加入等体积的氯仿:异戊醇(V:V＝24:1)，涡旋混匀后，10000r/min 4℃离心5min，将上清转移至另一离心管中。加入1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2倍体积的无水乙醇，混匀后置于-20℃冰箱内沉淀DNA过夜。13000r/min 4℃离心15min，弃上清。用4℃预冷的70％乙醇洗涤DNA沉淀后，13000r/min 4℃离心15min，弃上清，将离心管置于50℃干燥箱中去除残留的乙醇。随后，用一定体积1×TE缓冲液(pH 7.4)溶解DNA沉淀，并用OneDrop OD-1000超微量分光光度计测定ssDNA浓度。

7、克隆测序和序列分析

将最后一轮筛选得到的ssDNA富集库用无修饰的引物进行对称PCR扩增。PCR扩增体系为：灭菌超纯水32.5μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP(5mM each)1μL，上游引物(20μM)0.5μL，下游引物(20μM)0.5μL，模板10μL，Taq酶0.5μL，总体积为50μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，循环20次；最后72℃延伸5min。利用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增结果。PCR产物经纯化后送生工生物工程(上海)股份有限公司进行克隆测序，得到34条80nt的ssDNA序列。分别采用DNAMAN V6和RNAstructure V5.6对这些序列的一级结构和二级结构进行分析，根据一级结构的序列同源性和二级结构的相似性，将34条序列分为8组。从每组中选择一条自由能较低、结构较稳定的序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成5’末端标记FAM荧光基团的8条ssDNA序列进行亲和力和特异性分析。

8、亲和力分析 

将1μM的OA毒素分别与梯度浓度(5,25,50,75,100,125,150,175,200nM)的ssDNA混合，避光孵育2h。然后，按相同的GO/ssDNA质量比分别加入相应质量的GO，继续避光孵育30min。13000r/min 4℃离心15min，取上清。同时，设置不加OA毒素的阴性对照以排除GO对ssDNA的不完全吸附。用日立F-7000荧光分光光度计在490nm激发光下检测520nm处实验组和对照组的荧光发射值。采用GraphPad Prism 5软件，以ssDNA浓度为横坐标，实验组和对照组的荧光差值(ΔF)为纵坐标进行非线性拟合，计算各ssDNA与OA的解离常数Kd值(见表2)。图4A是OA-27的饱和结合曲线图，其Kd值最小，表明与OA的亲和力最强。

表2 挑选出的8条ssDNA序列的解离常数Kd值

9、特异性分析 

根据亲和力分析的结果，选择Kd值小于100nM的四条ssDNA(OA-08，OA-17，OA-22，OA-27)进行特异性分析。每条ssDNA分别与OA、DTX-1、DTX-2、STX、DA、红藻氨酸(Kainic acid，KA)、微囊藻毒素LR(Microcystin-LR，MC-LR)、微囊藻毒素RR(Microcystin-RR，MC-RR)，微囊藻毒素YR(Microcystin-YR，MC-YR)混合，避光孵育2h。然后加入GO，继续避光孵育30min。13000r/min 4℃离心15min，取上清。同时，设置不加毒素的阴性对照以排除GO对ssDNA的不完全吸附。用日立F-7000荧光分光光度计在490nm激发光下检测520nm处实验组和对照组的荧光发射值。结果显示OA-17、OA-22、OA-27与OA的结合能力均强于其他八种毒素，其中OA-27的特异性最好(见图5A)。

10、适配体序列的截短和分析

比较适配体OA-27和其随机区序列OA27-1的二级结构，发现在去除引物区后，随机区的两个茎环结构保持不变，表明OA27-1与毒素OA也可能具有较好的亲和性和特异性。由生工生物工程(上海)股份有限公司合成5’末端标记FAM荧光基团的OA27-1进行亲和力和特异性分析。结果显示，OA27-1具有和OA-27相近的亲和力，Kd值为38.99nM(见图4B)；特异性虽然略差于OA-27，但好于OA-22和OA-17(见图5B)。

本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或局部改进，都将视为在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.特异识别大田软海绵酸的单链DNA核酸适配体，具有序列表1、2所示的核苷酸序列。

2.按权利要求1中所述的适配体，其特征在于，所述序列为人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列。

3.特异性识别大田软海绵酸的核酸适配体，包括对权利要求1所述适配体序列经替换、缺失和/或插入一个或几个核苷酸形成的具有相同功能的序列。

4.特异性识别大田软海绵酸的核酸适配体，包括以权利要求1所述适配体序列为核心序列并在两边或任一单边延伸的序列。

5.特异性识别大田软海绵酸的核酸适配体，包括对权利要求1所述适配体序列的5’端或3’端连接或标记其他功能基团或分子，并与权利要求1所述适配体具有相同功能的适配体序列，所述其他功能基团或分子包括：生物素、氨基、巯基、荧光素、地高辛、放射性同位素、酶标记、纳米发光材料等。

6.特异性识别大田软海绵酸的核酸适配体，包括对权利要求1所述适配体序列进行化合物修饰的序列，以增强其半衰期、提高其稳定性、防止核酸内切酶或外切酶切割。

7.按权利要求1-6中任一项所述的适配体，其特征在于，所述序列单独或联合使用均能用于大田软海绵酸的分析检测。

8.按权利要求1-6中任一项所述的适配体，其特征在于，所述序列在分离富集或分析检测大田软海绵酸中的应用。

9.按权利要求1-6中任一项所述的适配体，其特征在于，所述序列在大田软海绵酸中毒诊断中的用途。