CN107446929B - 特异识别赭曲霉毒素a的核酸适配体及其制备方法 - Google Patents

特异识别赭曲霉毒素a的核酸适配体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种特异识别赭曲霉毒素A的核酸适配体及其制备方法，该单链DNA适配体的序列为序列1，本发明所述赭曲霉毒素A核酸适配体是通过基于氧化石墨烯分离的指数富集配体系统进化技术，体外筛选获得了高亲和力且特异识别OTA毒素的单链寡核苷酸适配体，具有特异性好，稳定性高，成本低廉，易于合成与修饰，使用方便，无毒等特点，可以研制出基于核酸适配体的生物传感器、固相亲和净化柱以及农产品中快速检测的分析方法等。

Description

特异识别赭曲霉毒素A的核酸适配体及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种赭曲霉毒素A核酸适配体及其制备方法。
背景技术
赭曲霉毒素A(OTA)是曲霉属和青霉属等通过正常的生物代谢而产生的次生代谢产物，在谷物、小麦、大麦等粮食中广泛存在，研究表明，OTA的毒性不单单表现为胚胎毒性、肝脏毒性和肾脏毒性，而且还具有致畸、致癌、致突变和免疫抑制作用。由于OTA具有的强致癌和致病性，国际机构和世界各国对赭曲霉毒素在食品中的限量做了非常严格的规定，欧盟(EC)对谷物和谷物制品中OTA的最大残留量分别是5和3μg/Kg，对酒和葡萄汁中OTA的最大残留限量是2μg/Kg；在国家标准GB 2761-2011中对谷物和豆类及其制品中OTA的限量为5μg/Kg。因此,研究建立灵敏、准确可靠的赭曲霉毒素A检测技术,是控制我国农产品污染、保障农产品安全消费和人民身体健康的迫切需求。
目前，OTA毒素的测定方法主要有两大类：化学分析法和免疫分析法。薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)、液相色谱法(LC)、液相色谱质谱联用法(LC-MS)等这些化学分析方法准确、灵敏，但是样品通常需要复杂的前处理，费时费力；所用检测设备昂贵，且需要专业的操作人员。酶联免疫法(ELISA)是目前常见的真菌毒素的免疫检测方法，该方法的特点是快速、成本较低、操作简单，但是ELISA属于非均相方法，需要多次反复洗涤步骤，除此之外，抗体的制备周期长而且成本昂贵,且制得的抗体批次间差异大，受环境条件如温度、pH值影响很大，因此在储存和使用条件上，抗体的稳定性易受影响。
核苷酸适配体是通过SELEX(Systematic Evolution ofLigands by ExponentialEnrichment)，指数富集的配体系统进化)技术筛选的与靶物质特异性结合的一类单链DNA或RNA片段。与抗体相比具有可体外筛选获得、生产周期短、热稳定性好、易于化学合成和修饰等优点。
基于是否固定文库或靶标，可将筛选方法分成以下三大类:(Ⅰ)固定靶标的核酸适配体筛选方法；(Ⅱ)固定文库的核酸适配体筛选方法；(Ⅲ)免固定的核酸适配体筛选方法。近几年OTA适配体的筛选方法有：固定靶标的亲和层析柱法，固定文库的磁珠法。这两种方法往往需要固定文库或靶标，但经固定的文库或靶标的天然构象在一定程度上可能会受到影响。此外，用于固定的载体还会对文库与靶标的结合产生空间位阻，这些都不利于筛选得到游离态下结合能力强的序列，因此发展非固定的的核酸适配体筛选方法显得尤为重要。本文采用免固定的核酸适配体筛选方法，利用氧化石墨烯能够很好的吸附单链DNA并可经离心去除的特点，将氧化石墨烯引入到筛选的过程中，降低非特异性吸附，有效地去除未结合的单链DNA，并且不影响适配体与靶标的结合。该方法大大地提高了筛选的效率，节约了劳动力和降低了成本。
该寡核苷酸适配体可用于分析检测OTA毒素以丰富实验室检测手段,并可用于开发适配体传感器以实现快速检测,因此该发明可以在OTA毒素检测领域得到广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能与OTA毒素特异性结合的寡核苷酸适配体，为开发OTA毒素的分析检测工具奠定良好基础。
本发明的另一目的是提供一种制备OTA毒素寡核苷酸适配体的方法，它可以方便、准确地获取OTA毒素的高亲和力单链DNA适配体，效果显著。
本发明实现目的的技术方案如下：
一种特异识别赭曲霉毒素A的核酸适配体，所述核酸适配体为单链DNA寡核苷酸适配子，序列为序列1。
一种特异识别赭曲霉毒素A的核酸适配体的制备方法，包括以下步骤：
⑴构建随机单链DNA寡核苷酸文库
5'-TGAGAGGAGCAGATGGACAT-N40-ACAGCATGACACACCCGTAA-3'，40N代表40个随机核苷酸，两端为序列固定的引物序列，
引物P1为5'-TGAGAGGAGCAGATGGACAT-3'，
引物P2为5'-TTACGGGTGTGTCATGCTGT-3'，
库容量为1014以上，将随机ssDNA文库和引物均用TE缓冲液配制成100uM贮存液存于-20℃备用；
⑵将上述随机单链DNA寡核苷酸文库与OTA在结合缓冲液BB孵育后进行氧化石墨烯(GO)-SELEX筛选，共进行10轮筛选；
⑶将第10轮筛选得到的单链DNA寡核苷酸文库用引物Pl和引物P2进行扩增，产物进行克隆、测序，并采用DNAMAN软件进行结构分析；
⑷经结构分析后，选择候选单链DNA寡核苷酸适配子序列进行亲和性测定，筛选出与OTA具有最高亲和力的适配子，并对其进行识别特异性验证测定。
而且，步骤⑵中所述结合缓冲液BB为10mM Tris-HCl，120mM NaCl，5mM KCl，1mMMgCl2、20mM CaCl2，pH 7.4。
而且，步骤⑷中选择候选序列进行亲和性测定，所述亲和性测定具体如下:配制一系列浓度的5'FAM-标记核酸序列溶液，进行加热立即冰浴的折叠处理；随后，不同浓度的核酸适配体5,10,25,50,100,200,300nM，各自与固定浓度的OTA毒素2uM，37℃避光孵育2h，反应总体积为500uL；同时设置不加入OTA毒素的阴性对照组；孵育结束后，加入与适配体浓度成比例的GO，继续避光孵30min；离心后，用日立F-7000荧光分光光度计测定上清液的荧光值Ex＝494nm，Em＝516nm；利用Origin 8.5软件非线性拟合确定序列的解离常数Kd值，Kd值越小表示亲和力越高。
而且，步骤⑷中所述识别特异性验证测定具体如下:5'FAM标记的序列(100nM)，分别与靶标OTA或OTB,NAP，Warfarin混合，37℃下避光孵育2h后，加入与适配体量成比例的GO吸附未结合的ssDNA，37℃孵育30min。随后，将孵育混合物在13000r/min转速下离心l0min,收集上清液，用日立F-7000荧光分光光度计测定上清液的荧光值(Ex＝494nm，Em＝516nm)，另外设置适配体的阴性对照。
而且，序列1的5'端或3'端可以进行FITC、氨基、生物素或地高辛化学修饰。
如权利要求1中所述的寡核苷酸适配体在分离富集及分析检测OTA中的应用。
本发明的优点和积极效果如下：
1、本发明在结合缓冲液中加入了一定量的甲醇，既能增加OTA的溶解性，又能使筛选的适配体能够更加适应后续实际应用的环境。
2、本发明提供的适配体避免了靶标或文库的固定，更有利于获得自由靶标的核酸适配体。
3、本发明提供的适配体对OTA显示出高特异性和亲和力，易于体外合成，重复性好，且化学性质稳定，保存时间较长。
附图说明
图1是本发明适配体的模拟二级结构图。
图2是本发明适配体的饱和结合曲线图。
图3是本发明适配体的特异性试验结果。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明方法利用基于氧化石墨烯分离的SELEX技术，以OTA毒素为靶标，无需将小分子靶标固定在载体上，通过10轮的SELEX反复筛选后，对富集文库进行克隆测序，并分析代表序列的亲和力和特异性，最终获得与OTA毒素高亲和性特异结合的最佳寡核苷酸适配体。
本发明中OTA毒素特异性结合寡核苷酸适配体的GO-SELEX筛选，步骤如下：
1、体外化学合成初始随机单链DNA(ssDNA)文库及引物(由上海生工公司合成)，序列如下:
5'-TGAGAGGAGCAGATGGACAT-N40-ACAGCATGACACACCCGTAA-3'(N40代表40个随机核苷酸)；
上游引物P1:5'-TGAGAGGAGCAGATGGACAT-3'
下游引物P2:5'-TTACGGGTGTGTCATGCTGT-3'
5'磷酸化下游引物P3:5'-P-TTACGGGTGTGTCATGCTGT-3'
将随机ssDNA文库和引物均用TE缓冲液配制成100uM贮存液存于-20℃备用。
2、PCR扩增条件及λ核酸外切酶消化制备单链次库的条件
将合成的随机单链文库(ssDNA)稀释作为PCR模板扩增出磷酸化的双链DNA(dsDNA)产物，研究λ核酸外切酶消化磷酸化反义链制备单链次库的影响因素，最终确定制备单链次库的最佳条件。
PCR反应体系为：
稀释随机文库作为模板DNA 1uL(2ng/μL)，P1及P3引物(20uM)各1uL,dNTPmix(each2.5mM)4uL,10×PCR扩增缓冲液5uL，Mgcl2(25mM)3uL,Taq酶(5U/μL)0.5uL，灭菌超纯水34.5uL,总体积为50uL。
PCR扩增程序:
94℃预变性5min；94℃变性30s；64℃退火30s；72℃延伸30s；循环15～20次；最后72℃延伸5min。
用垂直8％非变性PAGE分析结果进行监测扩增的DNA片段是否具有正确的分子量。
将电泳条带位置正确且单一的PCR扩增产物转移于同1.5mL灭菌离心管内，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(V:V:V＝25:24:1)，漩涡震荡充分混匀30s使混合物呈乳状，2000r/min离心5min、8000r/min离心1min，4℃，将上层液体小心移入另一离心管，弃去两相界面和有机相。重复操作一次，直至两相界面上见不到蛋白质为止。向含样品的离心管中加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)溶液及2倍体积的无水乙醇(-20℃保存)，充分混匀后放-20℃冰箱内过夜。翌日取出，12000r/min,4℃离心15min。弃去上清，适量70％乙醇溶液(4℃预冷)洗涤沉淀，12000r/min,4℃离心15min，弃去上清，将沉淀置于通风处晾干。重溶于适当体积的灭菌超纯水中，通过NanoDrop2000超微量分光光度计测定dsDNA浓度。按照λ核酸外切酶(5U/uL)定义计算用于5'-磷酸化序列的消解需要的酶使用量和10×λ核酸外切酶反应缓冲液体积，与定量的纯化PCR产物混合在37℃温育30min，75℃灭酶10min。酶切产物用含有7M尿素的8％变性PAGE验证。将酶切产物汇集在一个1.5mL离心管中，采用上述饱和酚提纯、乙醇沉淀法对制备的单链核酸文库纯化，复溶后，通过NanoDrop2000超微量分光光度计测定ssDNA浓度。
3、体外GO-SELEX筛选:
每一轮孵育开始前，先将溶解于BB结合缓冲液的ssDNA文库，于95℃加热10min后立即冰浴10min，随后室温放置10min平衡，以使文库中大量的ssDNA折叠形成复杂多样的三维结构。第1-5轮筛选为正筛选，将处理过的文库(第1轮文库为2nmol，第2-10轮文库减少为200pmol)与OTA毒素均匀混合，在300uL特殊的结合缓冲液(含1.0％甲醇)中，37℃条件下孵育2h。孵育结束后，将上述孵育混合液转移至GO沉淀中，37℃孵育30min。4℃，13000r/min离心l0min，收集含有OTA/ssDNA结合物的上清液。将此上清液作为模板进行PCR扩增，其纯化产物用λ核酸外切酶消化磷酸化反义链制备获得单链次级文库。经NanoDrop2000超微量分光光度计测定纯化后的ssDNA浓度，以此计算下一轮文库投入体积。
第6-10轮采用反筛选。首先将处理过的ssDNA文库与OTB,NAP，Warfarin的混合物37℃孵育60min，然后加入至GO沉淀中，孵育30min。与反筛靶标结合的ssDNA被保留在溶液中,而不与反筛靶标结合的被吸附到GO表面。离心分离，弃上清，用BB离心洗涤得到的GO-ssDNA沉淀物。往GO-ssDNA复合物沉淀中加入游离靶标OTA，37℃孵育2h，从GO表面解离恢复适配体。离心收集上清液，随后进行PCR扩增、λ核酸外切酶消化制备ssDNA并纯化。
所述GO-SELEX筛选包括如下步骤:
(1)文库预处理:
每一轮孵育开始前，先将溶解于结合缓冲液的ssDNA文库，于95℃加热10min后立即冰浴10min，随后室温放置10min平衡，以使文库中大量的ssDNA折叠形成复杂多样的三维结构
(2)与OTA结合:
第1-5轮为正筛选：将处理过的文库与OTA毒素均匀混合，在300uL特殊的结合缓冲液(含1.0％甲醇)中，37℃条件下孵育2h。孵育结束后，将上述孵育混合液转移至GO沉淀中，37℃孵育30min。4℃，13000r/min离心l0min，收集含有OTA/ssDNA结合物的上清液；
第6-10为反筛选:首先将处理过的ssDNA文库与赭曲霉毒素B(OTB),N-乙酰-L-苯丙氨酸(NAP)，华法令(Warfarin)的混合物37℃孵育60min，然后加入至GO沉淀中，孵育30min。离心分离，弃上清，用BB离心洗涤得到的GO-ssDNA沉淀物。往GO-ssDNA复合物沉淀中加入游离靶标OTA，37℃孵育2h，从GO表面解离恢复适配体，离心收集上清液；
(3)PCR扩增ssDNA:
以分离得到的ssDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为:稀释随机文库作为模板DNA 1uL(2ng/μL)，上游引物P1及磷酸化下游引物P3(20uM)各1uL,dNTPmix(each2.5mM)4uL,10×PCR扩增缓冲液5uL，Mgcl2(25mM)3uL,Taq酶(5U/μL)0.5uL，灭菌超纯水34.5uL,总体积为50uL。PCR扩增程序:94℃预变性5min；94℃变性30s；64℃退火30s；72℃延伸30s；循环15～20次；最后72℃延伸5min。用垂直8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析结果进行监测扩增的DNA片段是否具有正确的分子量；
(4)λ核酸外切酶消化制备单链次级文库
将电泳条带位置正确且单一的PCR扩增产物转移于同1.5mL灭菌离心管内，加入等体积的酚:氯仿:异戊醇(V:V:V＝25:24:1)，漩涡震荡充分混匀30s使混合物呈乳状，2000r/min离心5min、8000r/min离心1min，4℃，将上层液体小心移入另一离心管，弃去两相界面和有机相。重复操作一次，直至两相界面上见不到蛋白质为止。向含样品的离心管中加入1/10体积的3M醋酸钠(pH5.2)溶液及2倍体积的无水乙醇(-20℃保存)，充分混匀后放-20℃冰箱内过夜。翌日取出，12000r/min,4℃离心15min。弃去上清，适量70％乙醇溶液(4℃预冷)洗涤沉淀，12000r/min,4℃离心15min，弃去上清，将沉淀置于通风处晾干。重溶于适当体积的灭菌超纯水中，通过NanoDrop2000超微量分光光度计测定dsDNA浓度。按照λ核酸外切酶(5U/uL)定义计算用于5'-磷酸化序列的消解需要的酶使用量和10×λ核酸外切酶反应缓冲液体积，与定量的纯化PCR产物混合在37℃温育30min，75℃灭酶10min。酶切产物用含有7M尿素的8％变性PAGE验证。将酶切产物汇集在一个1.5mL离心管中，采用上述饱和酚提纯、乙醇沉淀法对制备的单链核酸文库纯化，复溶后，通过NanoDrop2000超微量分光光度计测定ssDNA浓度；
(5)重复筛选：
将制备得到的单链次级文库直接作为下一轮的筛选文库，重复上述GO-SELEX筛选步骤1-4，共进行10轮筛选；
4、克隆测序及序列分析
将第10轮筛选得到的ssDNA用不带标记的引物进行PCR扩增，切胶回收纯化后连接到pMD-19克隆载体上，并将连接产物转入到新鲜制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞中；在含5-溴-4-氯-3-吲哚-哚-D-半乳糖苷(X-Gal)和异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)的氨苄青霉素(Amp)-LB平板(Amp浓度100μg/m L)上涂布转化菌液，37℃培养16-18h；通过“蓝白斑筛选”，随机挑选36个白斑，经菌落PCR验证目标DNA片段的克隆成功后，用灭菌枪头挑选克隆成功的白斑，然后将枪头置于LB液体培养基中培养，菌液送至金唯智公司测序。对测序得到的多条适配体候选序列，采用DNAMAN软件分析其一级结构同源性信息，并用RNA Structure4.6软件对其二级结构进行分析。根据OTA毒素寡核苷酸适配体的一、二级结构特征，选出能级较低、结构稳定的序列为代表合成并标记5'FAM基团以作进一步的亲和力和特异性分析。
得到本发明的序列：
5'-TGAGAGGAGCAGATGGACATGGGTGTGGGCGTACCCAGCGCCAGTCGTCAGCGTACGATCACAGCATGACACACCCGTAA-3'，空间结构如图1所示。
5、OTA适配体的亲和力和特异性分析
5.1亲和力分析
配制一系列浓度的5'FAM-标记核酸序列溶液，进行加热立即冰浴的折叠处理；随后，不同浓度的核酸适配体(5,10,25,50,100,200,300nM)，各自与固定浓度的OTA毒素(2uM)，37℃避光孵育2h，反应总体积为500uL；同时设置不加入OTA毒素的阴性对照组。孵育结束后，加入与适配体浓度成比例的GO，继续避光孵育30min。离心后，用日立F-7000荧光分光光度计测定上清液的荧光值(Ex＝494nm，Em＝516nm)。利用Origin 8.5软件非线性拟合确定序列的解离常数Kd值(见表1)。
表1.寡核苷酸适配体的解离常数Kd值
Figure BDA0001395194370000081
5.2特异性分析
根据亲和力实验分析结果，挑选Seq.14序列进行特异性分析。5'FAM标记的序列(100nM)，分别与靶标OTA或OTB，NAP，Warfarin混合，37℃下避光孵育2h后，加入与适配体量成比例的GO吸附未结合的ssDNA，37℃孵育30min。随后，将孵育混合物在13000r/min转速下离心l0min,收集上清液，用日立F-7000荧光分光光度计测定上清液的荧光值(Ex＝494nm，Em＝516nm)。另外设置适配体的阴性对照。特异性试验结果如图3所示。
本发明包括但不限于以上实施例，凡是在本发明的精神和原则下进行的任何等同替换或局部该进，都将视为在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 特异识别赭曲霉毒素A 的核酸适配体及其制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 80
<212> DNA
<213> 特异识别赭曲霉毒素A的核酸适配体(Unknown)
<400> 1
tgagaggagc agatggacat gggtgtgggc gtacccagcg ccagtcgtca gcgtacgatc 60
acagcatgac acacccgtaa 80
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物P1(Unknown)
<400> 2
tgagaggagc agatggacat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物P2(Unknown)
<400> 3
ttacgggtgt gtcatgctgt 20

Claims (2)

1.一种特异识别赭曲霉毒素A的核酸适配体，其特征在于：所述核酸适配体为单链DNA寡核苷酸适配子，序列为序列1，序列1的5'端或3'端进行FITC、氨基、生物素或地高辛化学修饰。
2.如权利要求1中所述的核酸适配体在分离富集及分析检测OTA中的应用。
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