CN102453767A - 一种快速定量检测植物乳杆菌st-ⅲ的方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种快速定量检测植物乳杆菌ST-III的方法及其试剂盒。包括以下步骤：1)提取待检样品的总RNA；2)将步骤1)提取的总RNA反转录成cDNA；3)采用特异性扩增植物乳杆菌ST-III的引物对，以步骤2)所得cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增检测；4)通过比较待检样品和定量外标准品的循环阈值而对待检样品中的实际拷贝数进行定量。本发明可以快速的检测样品中的植物乳杆菌ST-III数量，快速、特异性强、灵敏度高，检测限达到2.85x10³CFU/mL。

Description

一种快速定量检测植物乳杆菌ST-Ⅲ的方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，特别涉及一种快速定量检测植物乳杆菌ST-III的方法及其试剂盒。

背景技术

益生菌是“当摄入一定数量后，能对宿主健康起有益作用的微生物活体”。随着生物技术及医学等学科的发展，益生菌对人体健康的有益功效越来越多地得到证实，益生菌制品也因此日益受到人们的追捧，生产及销售量也逐年呈上升趋势。大量研究表明，只有产品中益生菌的活菌数达到1×10⁶个/ML才能够发挥其应有的功效。然而由于我国尚没有系统地研究和制定益生菌制品的标准，特别是市场上对所含益生菌活菌数以及在货架期益生菌存活数没有进行严格限定，导致益生菌及制品市场异常混乱，甚至出现在益生菌制品中检验不出该益生菌的以假乱真现象。如此以来，对其质量的监督管理，尤其对其所含益生菌的种类及其数量的检测就显得尤为重要。

传统方法中对益生菌的定性、定量检测，仍采用生理生化反应和选择性培养基纯培养分离计数的方法。这些方法易受培养条件、菌种特性等因素影响，检测效率有限，特别是很难区分同种的不同的细菌，使得在含有多种细菌的复杂体系中很难检测到目标益生菌的实际数量。随着科技的进步，以PCR为基础分子生物学方法以其较高的准确性及稳定性等优点已成功介入到益生菌的鉴定领域。特别是实时荧光定量PCR(Real-time PCR)的出现更是实现了PCR技术从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，成为了分子生物学和微生物学领域定量检测的重要方法。采用实时荧光定量PCR技术建立简便、快速、准确的益生菌乳制品中益生菌定量检测方法，可以简化益生菌的检测程序、提高检测效率，能提高我国益生菌的定量检测能力、完善保健食品的质量监管，并为益生菌产业的长远发展提供技术保障。

植物乳杆菌ST-III是一种从是从泡菜中分离得到的具有降胆固醇、降血脂、粘附肠道上皮细胞等多种功能的益生菌。该菌株已作为生产发酵剂在光明乳业有限公司正式投产上市，市场反映良好。为了更好地发挥ST-III的益生功能，就必须要保证产品活菌数达到1×10⁶个/ML，这就需要测定ST-III在益生菌产品中的实际数量。因此建立一种快速、简便、特异地检测产品中ST-III实际数量的方法对于实际生产和应用有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前尚不存在植物乳杆菌ST-III菌株分子检测手段的现状，提供一种快速、特异性强、灵敏度高、成本低的定量检测植物乳杆菌ST-III的方法及其试剂盒。

本发明采取的技术方案之一为：一种快速定量检测植物乳杆菌ST-III的方法，包括以下步骤：

1)提取待检样品的总RNA；

2)将步骤1)提取的总RNA反转录成cDNA；

3)采用特异性扩增植物乳杆菌ST-III的引物对，以步骤2)所得cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增检测；

4)通过比较待检样品和定量外标准品的循环阈值而对待检样品中的实际拷贝数进行定量。

本发明步骤3)所述的引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列相同，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是23bp；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列互补，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是27bp；该引物对的扩增片段为200-867bp，优选242bp；所述的植物乳杆菌ST-III遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III KilA结构域蛋白的基因；优选的是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第1位至第867位所示序列的核苷酸中连续的200-867个，优选242个核苷酸片段；更优选的，是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第360位至第601位所示序列的核苷酸；最优选的其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第360位至第601位所示。最优选的，所述的引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明步骤3)所述的PCR反应体系为常规，只要能够扩增出特异性产物即可。PCR反应体系优选包括上游引物，下游引物，dNTP，PCR buffer，Mg²⁺，Taq DNA聚合酶，cDNA模板和

Green I。其中，上游引物或者下游引物优选的终浓度为0.1-1.0μM，更优选0.2μM；cDNA模板的终浓度优选为0.5-2ng/μL，更优选的1ng/μL。而其他组分的浓度如常规，一般是0.2mmol/L dNTP，1×PCR buffer，1.0mmol/L Mg²⁺，0.02U/μL Taq DNA聚合酶。步骤3)所述的PCR反应参数为常规，只要能够扩增出特异性产物即可。较佳的为：95℃30S；95℃5S，60℃25S，72℃30S，40个循环；4℃保存。

本发明步骤4)所述的定量外标准品优选植物乳杆菌ST-III的总RNA反转录后的总cDNA。优选的，采用定量外标准品的10倍梯度水稀释液，稀释度从10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，进行在荧光定量PCR，根据梯度稀释的定量标准品的不同Ct值定量待检样品中的cDNA分子数量。

本发明采取的技术方案之二为：一种检测植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR试剂盒，包括特异性扩增植物乳杆菌ST-III遗传标记分子的的引物对。该引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列相同，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是23bp；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列互补，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是27bp；该引物对的扩增片段为200-867bp，优选242bp；所述的植物乳杆菌ST-III遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III KilA结构域蛋白的基因；优选的是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第1位至第867位所示序列的核苷酸中连续的200-867个，优选242个核苷酸片段；更优选的，是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第360位至第601位所示序列的核苷酸；最优选的其核苷酸序列如SEQ IDNO.1的第360位至第601位所示。最优选的，所述的引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明所述的检测植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR试剂盒，还包括SYBR Green I荧光定量检测试剂。

本发明所述SYBR Green I荧光定量检测试剂一较佳方式含有荧光定量反应液，其中包括SYBR Green I荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs溶液、TaqDNA聚合酶、无菌双蒸水、MgCl₂溶液等组分，使用时只需加入引物和模板即可进行PCR反应。

本发明所述SYBR Green I荧光定量检测试剂另一较佳方式含有荧光定量总反应液，其中包含了SYBR Green I荧光染料、引物、PCR缓冲液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水、MgCl₂溶液等所有组份，使用时只需加入模板即可进行PCR反应，操作非常快捷简单。

本发明所述的检测植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR试剂盒，还包括定量外标准品。所述的定量外标准品是植物乳杆菌ST-III的总RNA反转录后的总cDNA。

本发明所述的检测植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR试剂盒，还包括RNA提取试剂和/或反转录试剂。所述的RNA提取试剂较佳的含有Trizol、RNA酶抑制剂。所述的反转录试剂较佳的含有逆转录酶(AMV)、AMV缓冲液。AMV缓冲液含有dNTPs、随机引物、RNA酶抑制剂、无菌双蒸水。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

本发明中，植物乳杆菌ST-III是现有技术，为CGMCC No.0847。

本发明提供了一种快速检测植物乳杆菌ST-III菌株数量的方法及试剂盒，具有如下优点：

1、检测速度快、特异性强

对于微生物的普通生化鉴定一般需要2-3天，PCR鉴定只需要2-3小时；且普通生化鉴定无法鉴定同种植物乳杆菌之间的不同菌株，本发明设计的PCR引物对根据编码植物乳杆菌ST-III菌株的KilA结构域蛋白基因的特异性标志片段设计，该引物对可以在植物乳杆菌ST-III菌株中扩增出相应的DNA片段，并且只特异性的扩增植物乳杆菌ST-III的基因，而不能在其他相关植物乳杆菌中扩增出相应片段，包括NCBI已报道的经过全基因组测序的三种植物乳杆菌菌株，说明以该基因片段为基础设计的PCR反应系统具有良好的特异性。

2、灵敏度高、成本低

荧光定量PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克级的起始待测模板扩增到微克水平，即使待测样品中只含有3个目标细菌，PCR也可以检出，因此灵敏度高。本发明检测限达到2.85x10³CFU/mL。普通生化鉴定方法所用试剂种类多，步骤复杂，而PCR鉴定试剂种类少，操作简单，成本较低。此外，与通过全基因组序列测序区分同类细菌间不同菌株的方法相比，费用大为降低、实验周期也大为缩短，可以很方便地投入实际应用。

3、本发明的独特之处在于，特异引物的设计使得该方法只对ST-III的特征片段进行扩增，排除了其他细菌特别是其他植物乳杆菌的干扰；以RNA为基础的荧光定量PCR可以排除已死亡的ST-III，只检测产品的活菌数量。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1是植物乳杆菌的荧光定量PCR标准曲线。

具体实施方式

本发明人经过深入而广泛的研究，从植物乳杆菌ST-III(lactobacillusplantarum ST-III)的KilA结构域蛋白基因中发现较合适的扩增序列。其中，KilA结构域蛋白为一类DNA结合蛋白。该蛋白对于为DNA复制、重组和修复至关重要。选择KilA结构域蛋白基因序列作为引物，具有很好的特征性。

本发明根据NCBI已报道的三株植物乳杆菌Lactobacillus plantarumWCFS1(Genebank number：AL935263.1)，Lactobacillus plantarum14917(Genebank number：ACGZ00000000)，Lactobacillus plantarumJDM1(Genebank number：CP001617.1)的全基因组序列，运用blast程序找出ST-III所独有的核苷酸序列，根据这些核苷酸序列设计相应引物。经过对这些引物的筛选和验证，得到了能够用于鉴定植物乳杆菌ST-III的特异性引物。由此，本发明提供了使用该引物的荧光定量PCR检测试剂盒和检测方法。本发明对植物乳杆菌ST-III的检测具有快速、特异性强、灵敏度高、成本较低的特点。

本发明发现一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ST-III菌株的遗传标记分子，其是编码植物乳杆菌ST-III KilA结构域蛋白的基因。KilA结构域蛋白(KilA domain protein)是一类DNA结合蛋白。编码植物乳杆菌ST-III KilA结构域蛋白的基因的核苷酸序列较佳的是GenBank AccessionNo.为YP_003924036.1。优选的，所述的遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第1位至第867位所示序列的核苷酸中连续的200-867个，优选242个核苷酸片段。更优选的，所述的遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第360位至第601位所示序列的核苷酸。所述的遗传标记分子最优选的其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第360位至第601位所示。

本发明还发明了一种检测植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)ST-III菌株的引物对。该引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列相同，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是23bp；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列互补，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是27bp。该引物对的扩增片段为200-867bp，优选242bp。优选的，所述的引物对中，一条引物的序列如SEQID NO.2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明所述的特异性扩增植物乳杆菌ST-III菌株的引物，根据本发明的遗传标记物的序列(SEQ ID NO.1)进行设计，并通过常规的DNA合成方法获得，例如可以用商业化的DNA自动合成仪合成。

定量检测方法

将本发明的引物与荧光染料技术结合，便得到了本发明的植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR检测方法及其试剂盒。这种方法不仅克服了常规PCT方法中的误差，而且分析所需的样品量少，检出极限低，灵敏度高。

为了实现对植物乳杆菌ST-III定量的功能，使用荧光定量PCR。优选采用嵌合荧光染料法，采用荧光染料SYBR Green I。SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，与双链DNA非特异性结合。在游离状态下，SYBR Green I发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合，其荧光增加1000倍。所以，一个反应发出的全部荧光信号与出现的双链DNA量呈比列，且会随扩增产物的增加而增加。在PCR反应过程中，当SYBR Green I与扩增产生的双链DNA结合，通过测定荧光强度，即可确定双链DNA的含量。SYBR Green I特别是能用于所有PCR反应体系，无需荧光探针，使检测方法变得简便，同时也降低了检测的成本。并且在PCR结束后可直接进行融解曲线反应分析。通过融解曲线的分析，能判断是否存在着变异或非特异性的扩增。SYBR Green I的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。

本发明提供一种快速定量检测植物乳杆菌ST-III的方法，包括以下步骤：

1)提取待检样品的总RNA；

2)将步骤1)提取的总RNA反转录成cDNA；

3)采用特异性扩增植物乳杆菌ST-III的引物对，以步骤2)所得cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增检测；

4)通过比较待检样品和定量外标准品的循环阈值而对待检样品中的实际拷贝数进行定量。

本发明的待测样品为任何可能含有植物乳杆菌ST-III菌株的物质，较佳的比如益生菌类发酵乳制品，包括酸奶，也包括发酵豆奶等。

本发明中，步骤1)提取待检样品的总RNA的方法是常规技术，如Trizol提取法，为本领域技术人员所熟知。

本发明中，步骤2)将总RNA反转录成cDNA的方法也是常规技术，一般用反转录酶进行反应，一般在PCR仪上在反转录酶适宜的温度下反应一段时间即可，这也是为本领域技术人员所熟悉的方法。

本发明中，步骤3)采用本发明的特异性引物进行荧光定量PCR扩增，较佳的在实时荧光PCR仪中进行。所用的引物为本发明所特别提供的特异性扩增植物乳杆菌ST-III遗传标记分子的的引物对。该引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列相同，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是23bp；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列互补，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是27bp。该引物对的扩增片段为200-867bp，优选242bp。所述的植物乳杆菌ST-III遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III KilA结构域蛋白的基因；优选的是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第1位至第867位所示序列的核苷酸中连续的200-867个，优选242个核苷酸片段；更优选的，是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第360位至第601位所示序列的核苷酸；最优选的其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第360位至第601位所示。最优选的，所述的引物对中，一条引物的序列如SEQ IDNO.2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.3所示。它们的扩增片段长度为242bp。

其中，所述的PCR反应体系为常规，只要能够扩增出特异性产物即可。PCR反应体系优选包括上游引物，下游引物，dNTP，PCR buffer，Mg²⁺，TaqDNA聚合酶，cDNA模板和

Green I。其中，上游引物或者下游引物的终浓度为0.1-1.0μM，优选0.2μM；cDNA模板的终浓度为0.5-2ng/μL，优选的1ng/μL。而其他组分的浓度如常规，一般是0.2mmol/L dNTP，1×PCRbuffer，1.0mmol/L Mg²⁺，0.02U/μL Taq DNA聚合酶。步骤3)所述的PCR反应参数为常规，只要能够扩增出特异性产物即可。较佳的为：95℃30S；95℃5S，60℃25S，72℃30S，40个循环；4℃保存。

步骤4)通过比较待检样品和定量外标准品的循环阈值而对待检样品中的实际拷贝数进行定量。所述的定量外标准品是植物乳杆菌ST-III的总RNA反转录后的总cDNA。采用定量外标准品的10倍梯度水稀释液，稀释度从10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8，进行在荧光定量PCR，由于每个稀释度中cDNA分子不同，得到的Ct值就不同，根据梯度稀释的定量标准品的不同Ct值定量待检样品中的cDNA分子数量如拷贝数。

荧光定量PCR试剂盒

本试剂盒采用了SYBR Green I嵌合荧光法进行Real Time PCR的专用试剂，可快速对目的基因进行定量检测。在一优选例中，本发明提供快速检测植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括特异性扩增植物乳杆菌ST-III遗传标记分子的引物对。该引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列相同，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是23bp；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列互补，引物长度为15-40bp，更佳的是20-30bp，最佳的是27bp。该引物对的扩增片段为200-867bp，优选242bp。所述的植物乳杆菌ST-III遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III KilA结构域蛋白的基因；优选的是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第1位至第867位所示序列的核苷酸中连续的200-867个，优选242个核苷酸片段；更优选的，是编码植物乳杆菌ST-III的KilA结构域蛋白基因的第360位至第601位所示序列的核苷酸；最优选的其核苷酸序列如SEQ ID NO.1的第360位至第601位所示。最优选的，所述的引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

在另一优选例中，本发明的快速定量检测植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR试剂盒包括SYBR Green I荧光定量检测试剂。所述SYBR Green I荧光定量检测试剂的一较佳方式是含有荧光定量反应液，其中包括SYBR Green I荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水、MgCl₂溶液等组分，使用时只需加入引物和模板即可进行PCR反应。所述SYBRGreen I荧光定量检测试剂的另一较佳方式是含有荧光定量总反应液，其中包含了SYBR Green I荧光染料、引物、PCR缓冲液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水、MgCl₂溶液等所有组份，使用时只需加入模板即可进行PCR反应，操作非常快捷简单。

荧光可以被定量PCR仪内的荧光信号采集系统检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量成正比例关系。对植物乳杆菌ST-III的定量可以通过与定量标准品的循环阈值(Ct，Threshold Cycle)相比较得出。Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环数。Ct值与起始模板数成一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多；相反，Ct值越大，起始模板数越少。利用梯度稀释标准品的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可以准确测出该样品的起始拷贝数。

本发明提供的快速定量检测植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR试剂盒较佳的还包括定量外标准品。所述的定量外标准品是植物乳杆菌ST-III的总RNA经过测量260nm的吸光度计算得到其实际的拷贝数，后反转录后的总cDNA，定量时采用10倍梯度水稀释液，稀释度从10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8。在荧光定量PCR中，由于每个稀释度中cDNA分子不同，得到的Ct值就不同，根据定量标准品(梯度稀释的定量外标准品)Ct值定量样品中的cDNA分子。

本试剂盒较佳的还包括常规的两步法RT-PCR SYBR Green I荧光定量检测试剂盒所包含的成分，如可以包括RNA提取试剂、反转录试剂。其中较佳的RNA提取试剂含有Trizol、RNA酶抑制剂。反转录试剂含有逆转录酶(AMV)、AMV缓冲液。AMV缓冲液含有dNTPs、随机引物、RNA酶抑制剂、无菌双蒸水。

本发明的检测植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR试剂盒，通过对各组分，如引物浓度、Mg²⁺浓度、退火温度等的优化，反复实验，试剂盒完全可以满足快速特异检测植物乳杆菌ST-III的实际需求。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1益生菌乳制品中植物乳杆菌的定量检测方法

a.样品总RNA的制备

采用Trizol法提取：将市场上购买的含有植物乳杆菌ST-III发酵乳饮料(光明畅优植物乳酸菌饮品)做为实施样品，分别是距离生产日期为19天，15天和13天的三个样品，置于盛有液氮的研钵中研磨，然后迅速加入1mLTrizol试剂，按Trizol试剂盒说明书(

Plus RNA Purification System，美国invitrogen公司，货号12183-555)提取样品RNA，然后用DNaseI处理两次，确保完全消除RNA中的DNA污染，得到纯化的RNA样本，测浓度，RNA完整性通过1％琼脂糖凝胶电泳检测。

b.反转录扩增

依据反转录试剂盒(M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit，大连宝生物工程有限公司，货号D6130)说明书进行RNA反转录扩增。

c.实时荧光定量PCR

荧光定量PCR按照

PrimeScript^TM RT-PCR Kit(大连宝生物工程有限公司，货号DRR063A)说明书进行。反应体系25.0μL：Ex Taq^TM(2×)12.5μL，10μmol/L上、下游引物(分别是SEQ ID NO.2和SEQID NO.3)各0.5μL，cDNA模板2.0μL(反应浓度1ng/μL)，ddH₂O 9.5μL。

荧光定量PCR反应参数：95℃30S；95℃5S，60℃25S，72℃30S，40个循环；4℃保存。

d.定量外标准品的制备和标准曲线的绘制

提取植物乳杆菌ST-III的总RNA，紫外分光光度计测定吸光度值(260nm)后，根据ST-III的基因组大小计算出拷贝数。反转录得到cDNA，做10倍系列稀释，以此作为模版进行如上荧光定量PCR反应。以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数(Ct)为纵坐标得到植物乳杆菌ST-III的标准曲线，见图1。

稀释的最低浓度是2.85x10³CFU/mL，低于此浓度，荧光信号杂乱，因而该方法的检测限为2.85x10³CFU/mL。

e.结果及判断

以待测样品的cDNA为模板，用植物乳杆菌ST-III的菌株特异性引物，以相同的体系进行植物乳杆菌特征片段的荧光定量PCR扩增，结果见表1。

依据公式：Y＝-3.369lgX+39.84和待测样品的Ct值，可以计算出样品中植物乳杆菌ST-III的数量，见表1。

表1.产品中ST-III含量的定量结果

应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种快速定量检测植物乳杆菌ST-III的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待检样品的总RNA；

2)将步骤1)提取的总RNA反转录成cDNA；

3)采用特异性扩增植物乳杆菌ST-III的引物对，以步骤2)所得cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增检测；

4)通过比较待检样品和定量外标准品的循环阈值而对待检样品中的实际拷贝数进行定量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列相同，引物长度为15-40bp；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列互补，引物长度为15-40bp，该引物对的扩增片段为200-867bp，所述的植物乳杆菌ST-III遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III KilA结构域蛋白的基因。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示，另一条引物的序列如SEQ ID NO.3所示。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的定量外标准品是植物乳杆菌ST-III的总RNA反转录后的总cDNA，采用定量外标准品的10倍梯度水稀释液进行在荧光定量PCR，根据梯度稀释的定量标准品的不同Ct值定量待检样品中的cDNA分子数量如拷贝数。

5.一种检测植物乳杆菌ST-III的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括特异性扩增植物乳杆菌ST-III遗传标记分子的的引物对，该引物对中，一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列相同，引物长度为15-40bp；另一条引物和植物乳杆菌ST-III菌株的遗传标记分子的序列互补，引物长度为15-40bp；该引物对的扩增片段为200-867bp；所述的植物乳杆菌ST-III遗传标记分子是编码植物乳杆菌ST-III KilA结构域蛋白的基因。

6.如权利要求5所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的引物对中，一条引物的序列如SEQ ID NO.2所示，另一条引物的序列如SEQ IDNO.3所示。

7.如权利要求5所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的荧光定量PCR试剂盒中还包括荧光定量反应液，其中包括SYBR Green I荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水和MgCl2溶液。

8.如权利要求5所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的荧光定量PCR试剂盒中包括荧光定量总反应液，其中包含了SYBR Green I荧光染料、引物、PCR缓冲液、dNTPs溶液、Taq DNA聚合酶、无菌双蒸水和MgCl2溶液，所述的引物一条的序列如SEQ ID NO.2所示，另一条的序列如SEQ ID NO.3所示。

9.如权利要求5所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的荧光定量PCR试剂盒还包括定量外标准品。

10.如权利要求5所述的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，所述的荧光定量PCR试剂盒还包括RNA提取试剂和/或反转录试剂。

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