CN110317855A - 基于细胞的鉴定ido1酶活性及筛选ido1酶抑制剂的荧光检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明建立了一种在细胞层面鉴定吲哚胺2,3‑双加氧酶1活性及筛选吲哚胺2,3‑双加氧酶1酶抑制剂的荧光检测方法。本发明可供三种仪器检测IDO1酶酶活性：1、无需对样本进行任何形式的前期处理，直接取出培养基上清使用酶标仪检测，检测对象为色氨酸。2、将细胞用混合荧光体系孵育后荧光显微镜检测。3、将细胞用混合荧光体系孵育后流式细胞仪检测。本发明提供的方法不仅缩短了检测时间，还降低了操作复杂性，可在细胞水平检测IDO1酶活性并筛选IDO1酶抑制剂。
Description
技术领域
本发明涉及荧光检测方法，尤其涉及本发明涉及基于细胞的鉴定IDO1酶活性及筛选IDO1酶抑制剂的荧光检测方法
背景技术
色氨酸是人体必需的一种氨基酸，参与多种蛋白的合成与代谢网络调节。在人体中，色氨酸的代谢主要通过犬尿氨酸途径进行代谢。
在犬尿氨酸代谢途径中，吲哚胺2,3-双加氧酶，即indoleamine 2,3-dioxygenase,缩写为IDO1，吲哚胺2,3-双加氧酶2，即indoleamine 2,3-dioxygenase，缩写为IDO2，色氨酸2,3-双加氧酶，tryptophan 2,3-dioxygnease，缩写为TDO，催化色氨酸吡咯环上C-2与C-3间键的裂解，这是整个反应途径的第一步，也是限速步。相比于IDO2和TDO，IDO1主要在哺乳动物细胞和真菌中发现，广泛分布于人体肝脏外的多种组织。
研究发现，IDO1的过表达与乳腺癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肝细胞癌和结肠腺癌等多种癌症的发生发展及转移相关。通过过表IDO1，肿瘤可以创造一个免疫抑制的微环境来阻止抗肿瘤的免疫反应。首先，IDO1高表耗竭色氨酸，导致T淋巴细胞、NK细胞不能有效完成增殖分化；其次，色氨酸代谢犬尿氨酸途径的中间产物如3-羟基邻氨苯甲酸、喹啉酸等具有抑制T细胞的功能；此外，IDO1还可以诱导调节性T细胞，即Tregs的增殖，而抑制效应T细胞的增殖。另一方面，色氨酸及其代谢产物在合成神经递质如5-羟色胺，即5-HT中也发挥重要作用，因此，IDO1的过表达也会导致一些神经疾病如阿尔兹海默症、抑郁症等的发生。
以IDO1作为靶点研发抑制剂一直是国内外研究的热点。根据化学结构，IDO1抑制剂目前可以分为五大类：1、吲哚和[5,6]稠杂环芳烃。这类抑制剂以D-1MT、NLG919为代表，具有吲哚或者[5,6]稠杂环，其中PF-06840003是一种可口服，半衰期16-19h的临床候选药，其在脑癌治疗上的应用正处于一期临床研究。2、羟酰胺类，如：INCB024360。INCB024360由Incyte公司首先发现，目前在临床三期试验，有望与PD-1/L1抑制剂联合用于黑色素瘤、肺癌等癌症治疗。3、4-苯基咪唑类，包括GDC-0919。罗氏、恒瑞医药、默克等医药公司都相继报道过该类型IDO1抑制剂。4、1,2-二氨基-和1-羟基-2-氨基-取代的芳烃，如：KHK2455。KHK2455是一类2-烷氧基-3-氨基喹喔啉的衍生物，具体结构还未公开。目前处于一期临床试验中。5、其他类，如：BMS-986205。BMS-986205是一类高效，选择性作用于IDO1的抑制剂，它的发现将IDO1抑制剂的范围扩展到了单芳基-1,2-二胺，目前处于二期临床试验中。
现在，主要通过检测色氨酸或其代谢产物如甲酰犬尿氨酸、犬尿氨酸来检测IDO1活性。常用的手段主要有以下几种：1、高效液相法，即HPLC。高效液相法在1990年由Beal MF等人首次提出，通过检测由色氨酸及降解产生的犬尿氨酸的含量来测定IDO1酶的活性。该法准确度高，进样量少，特异性好，不受其他物质的干扰，但是在不同的样本中需要设置不同的实验条件以减少拖尾峰，改善峰形。通常来说，检测色氨酸使用荧光检测器，检测犬尿氨酸使用紫外检测器，而生物样品中，质谱检测器的使用可以大大提高准确度。2、吸光度测定。基于Takikawa的理论，Tamantha等人提出了吸光度检测法。该法需要临时配制混合IDO1酶反应体系，通过用酶标板检测产物犬尿氨酸与对二甲氨基苯，即p-DMAB反应生成的络合物的吸光度来确定IDO1酶的活性。这种方法简便容易操作，但反应溶液需要新鲜配制，尤其是抗坏血酸和过氧化氢酶，为实际应用带来了不便。3、荧光检测。荧光检测的对象既可以是水解后的犬尿氨酸，也可以直接是甲酰犬尿氨酸。甲酰犬尿氨酸是色氨酸直接由IDO1酶催化产生的，具有更高的选择性，但由于甲酰犬尿氨酸本身激发波长短，容易猝灭，常常需要用哌啶进行衍生化，生成激发波长为400nm的荧光团。荧光法灵敏度高，用量少，可用于酶标进行高通量筛选IDO1酶抑制剂，但该法需要用到pH＝1的强酸和pH＝11的强碱，另外，哌啶有刺激性气味，限制了其在临床上广泛应用。
发明内容
发明目的：本发明目的在于提供操作简单、条件温和的基于细胞水平的筛选IDO1酶抑制剂以及鉴定IDO1酶活性的荧光检测方法。
技术方案：本发明提供一种一种基于细胞的筛选IDO1酶抑制剂及鉴定IDO1酶活性的荧光检测方法，包括以下步骤：
1)提供重组表达IDO1的细胞，用DMEM培养基培养；
2)使步骤1)的培养基上清与色氨酸感受器接触；
3)测量步骤2)的混合物的荧光读数，其中在IDO1酶存在下与不加IFN-γ诱导的细胞相比改变的荧光读数指示IDO1酶活性，在IDO1酶和IDO1酶抑制剂存在下与IFN-γ诱导的细胞相比较，通过荧光读数的差异指示IDO1酶抑制剂的活性。
其中，所述步骤1)中用DMEM培养基培养的步骤及条件为均为常规培养条件。优选地，所述DMEM培养基含9％胎牛血清蛋白，5％青霉素-链霉素溶液；在37℃，95％湿润，5％CO2细胞培养箱中培养。测试前将细胞以3*105细胞/孔接种在细胞板中，加入50ng/mL IFN-γ作为阳性组，未诱导的细胞用作100％阴性抑制对照。筛选IDO1抑制剂组同时加入50ng/mL IFN-γ与不同抑制剂；反应24小时后，分别取上清待测。
其中，所述步骤2)中所述色氨酸感受器是将摩尔比为1：1的葫芦脲8和甲基化氮杂苝胺溶解在水中形成的二元复合物体系；所述接触为涡旋2～3秒。
其中，葫芦脲8缩写为CB[8]，甲基化氮杂苝胺为MDDP染料分子。
优选地，上述涡旋的具体方式为：取15μL培养基加入700μL色氨酸感受器，涡旋2-3秒，加入96孔板，平行三次，每孔200μL。
进一步地，步骤3)中所述荧光读数在激发波长为441nm、发射波长为510nm下检测荧光信号。
进一步地，所述步骤3)中所述通过荧光读数的差异指示IDO1酶抑制剂活性为：与IFN-γ诱导的细胞相比，在IFN-γ和目标化合物存在下荧光读数降低指示IDO1酶抑制剂的活性结果为IDO1酶抑制剂；
所述步骤3)中所述指示IDO1酶活性为：与未诱导的细胞相比，在IFN-γ存在下荧光读数升高指示IDO1酶抑制剂的活性结果为显示具有IDO1酶活性。
优选地，所述IDO1酶是由IFN-γ诱导的IDO1酶；所述重组表达IDO1的细胞是HeLa或HepG2细胞，由IFN-γ刺激诱导表达。
本发明还提供一种基于细胞的鉴定IDO1酶活性的荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提供重组表达IDO1的细胞，用DMEM培养基培养；
2)步骤1)中的细胞洗涤后，用三元荧光体系孵育细胞，洗涤后用甲醛固定；
3)通过在IDO1酶存在下与不加IFN-γ诱导的细胞相比，比较荧光强度，指示IDO1酶活性。
其中，步骤2)所述三元荧光体系为甲基化氮杂苝胺：葫芦脲：色氨酸的初始浓度的摩尔比为5：5：(0.1～1)的三元荧光体系，孵育细胞的时间为30分钟。
优选地，步骤3)所述比较荧光强度，指示IDO1酶活性为通过激发波长均为488nm的荧光显微镜或流式细胞仪进行荧光比较，荧光显微镜结果为加入IFN-γ表达IDO1显示的细胞亮度高于不加IFN-γ诱导的细胞亮度，则表明IDO1酶活性高；流式细胞仪结果为加入IFN-γ表达IDO1显示的颗粒被染上的荧光数量，即FL值高于不加IFN-γ诱导的IDO1的颗粒被染上的荧光数量，则表明IDO1酶活性高。
进一步地，所述IDO1酶是由IFN-γ诱导的IDO1酶；所述重组表达IDO1的细胞是HeLa或HepG2细胞，由IFN-γ刺激诱导表达。
优选地，上述鉴定方法为将诱导与未诱导的Hela细胞，将诱导与未诱导的HepG2细胞做平行试验，即将IFN-γ诱导的HeLa细胞与空白HeLa细胞比较，IFN-γ诱导的HepG2细胞与空白HepG2细胞比较。
有益效果：本发明可供三种仪器检测IDO1酶酶活性：1、无需对样本进行任何形式的前期处理，直接取出培养基上清使用酶标仪检测，检测对象为色氨酸。2、将细胞用混合荧光体系孵育后荧光显微镜检测。3、将细胞用混合荧光体系孵育后流式细胞仪检测。
超分子葫芦脲8与荧光染料MDDP组装形成二元系统消除了MDDP聚集诱导猝灭，即ACQ现象，在激发波长441nm处得到很高的荧光强度，而IDO1酶的底物色氨酸会进入葫芦脲8的空腔形成三元系统导致荧光猝灭。当IDO1酶存在时，IDO1催化氧化色氨酸生成的甲酰犬尿氨酸，无法进入葫芦脲8空腔使荧光猝灭，从而表现为高强度荧光；IDO1酶不存在时，色氨酸进入葫芦脲8空腔使得荧光猝灭。
通过对比荧光强度，可以快速鉴定IDO1酶活性，并且操作简单、所用试剂温和，能够高效筛选高表达IDO1酶细胞，并用于IDO1酶抑制剂的筛选。
附图说明
图1为本发明基于细胞鉴定IDO1酶活性及筛选IDO1酶抑制剂的荧光检测方法的示意图；
图2为HeLa细胞IDO1的剂量依赖性诱导与时间依赖性诱导曲线图，即分别用0、3、10、30ng/mL的IFN-γ分别处理细胞24、48、72、96小时；图中上方为用小鼠抗IDO1mAb免疫印迹来自HeLa细胞总裂解物的结果；
图3为HepG2细胞IDO1的剂量依赖性诱导与时间依赖性诱导曲线图，用0、3、10、30ng/mL的IFN-γ处理细胞24，48，72，96小时；图中上方为用小鼠抗IDO1mAb免疫印迹来自HepG2细胞总裂解物的结果；
图4为荧光显微镜与流式细胞仪检测HeLa细胞表达IDO1酶的结果图，上方是荧光显微镜成像图，下图是流式细胞仪结果图；
图5为荧光显微镜与流式细胞仪检测HepG2细胞表达IDO1酶的结果图，上方是荧光显微镜成像图，下图是流式细胞仪结果图；
图6为HepG2细胞中加入两种IDO1抑制剂后的抑制效果图，图中曲线由上到下依次为IFN-γ诱导细胞组、25nM NLG-919组、未诱导细胞组和25nMBMS-986205组；其中未诱导细胞为100％阴性抑制对照组；IFN-γ诱导细胞组为阳性对照；25nM BMS-986205组和25nMNLG-919组为筛选IDO1抑制剂组，两者均为同时加入50ng/mL IFN-γ的情况下，分别通过25nM的不同抑制剂抑制细胞。
具体实施方式
实施例1
本发明荧光体系的配制
酶标仪检测中色氨酸感受器配制：将MDDP：CB[8]＝1：1，终浓度5μM CB[8]，5μMMDDP溶解在纯水中，混合均匀，使其形成5μM MDDP@CB[8]的色氨酸感受器。
荧光显微镜与流式细胞仪检测中使用的三元荧光体系配制：将MDDP：CB[8]：色氨酸＝5：5：1，即终浓度50μM MDDP，50μM CB[8]，10μM色氨酸溶解在Hanks'平衡盐溶液即HBSS中，形成三元荧光体系。
实施例2
荧光显微镜与流式细胞仪检测中使用的三元荧光体系配制：将MDDP：CB[8]：色氨酸＝5：5：0.1，即终浓度50μM MDDP，50μM CB[8]，1μM色氨酸溶解在Hanks'平衡盐溶液即HBSS中，形成三元荧光体系。
实施例3
荧光显微镜与流式细胞仪检测中使用的三元荧光体系配制：将MDDP：CB[8]：色氨酸＝5：5：0.5，终浓度50μM MDDP，50μM CB[8]，5μM色氨酸溶解在Hanks'平衡盐溶液即HBSS中，形成三元荧光体系。
实施例4
色氨酸感受器检测IDO1酶活性
将细胞以3*105细胞/孔接种在细胞板中，并在95％湿润的细胞培养箱中在37℃和5％CO2下温育。然后分别用0、3、10、30ng/mL IFN-γ诱导细胞24、48、72以及96小时以实现IDO1的表达。分别取上述加入不同量诱导剂，不同诱导时间上清培养基15μL加入700μL 5μM实施例1中制得的色氨酸感受器体系，涡旋2-3秒混匀后平行三次，每孔200μL，加入96孔板，酶标仪在激发波长441nm，检测波长510nm处读取荧光值。
蛋白免疫印迹：将细胞以3*105细胞/孔接种在细胞板中，并在95％湿润的细胞培养箱中在37℃和5％CO2下温育。然后分别用0、3、10、30ng/mL IFN-γ诱导细胞24小时以实现IDO1的表达。将表达IDO1的细胞用1％NP-40裂解液裂解后，10000g离心取上清进行SDS-PAGE分离。转膜后用小鼠抗IDO1mAb免疫印迹。
实验结果：如图2所示，HeLa细胞的IDO1的剂量依赖性诱导与时间依赖性诱导的折线图横向结果显示：随着IFN-γ诱导时间增加，荧光值越高，说明IDO1表达的量增加；纵向结果显示随着加入IFN-γ浓度增加，荧光值越高，说明IDO1表达的量增加，这与免疫印迹得到的结果一致，证明了本发明方法的可靠性。
如图3所示，HepG2细胞的IDO1的剂量依赖性诱导与时间依赖性诱导的折线图横向结果显示随着IFN-γ诱导时间增加，荧光值越高，说明IDO1表达的量增加；纵向结果显示随着加入IFN-γ浓度增加，荧光值越高，说明IDO1表达的量增加，这与免疫印迹得到的结果一致，证明了本发明方法的可靠性。
实施例5
三元荧光体系检测IDO1酶活性
将Hela细胞以3*105细胞/孔接种在细胞板中，并在95％湿润的细胞培养箱中在37℃和5％CO2下温育。然后用50ng/mL IFN-γ诱导细胞以实现IDO1的完全表达作为阳性对照。未诱导的细胞用作阴性对照。培养24小时后，洗涤细胞，加入实施例1制得的终浓度为50μM MDDP，50μM CB[8]，10μM色氨酸的HBSS溶液三元荧光体系，孵育细胞的时间为30分钟。洗涤细胞后甲醛固定，用荧光显微镜以激发波长488nm进行检测。
将HepG2细胞以3*105细胞/孔接种在细胞板中，并在95％湿润的细胞培养箱中在37℃和5％CO2下温育。然后用50ng/mL IFN-γ诱导细胞以实现IDO1的完全表达作为阳性对照。未诱导的细胞用作阴性对照。培养24小时后，消化细胞置于1.5mL离心管，洗涤细胞，加入终浓度为50μM MDDP，50μM CB[8]，10μM色氨酸的HBSS溶液三元荧光体系，孵育细胞的时间为30分钟。洗涤细胞后甲醛固定，用流式细胞仪以激发波长488nm检测。
实验结果：如图4所示，荧光显微镜与流式细胞仪检测HeLa细胞表达IDO1酶的结果为加入IFN-γ诱导的HeLa细胞荧光高于未诱导HeLa细胞；说明加入IFN-γ诱导表达了IDO1；证明了本发明方法准确地显示了IDO酶的活性；
如图5所示，荧光显微镜与流式细胞仪检测HepG2细胞表达IDO1酶的结果为加入IFN-γ诱导的细胞荧光高于未诱导细胞；说明加入IFN-γ诱导表达了IDO1；证明了本发明方法准确地显示了IDO酶的活性。
实施例6
三元荧光体系检测IDO1酶活性
将Hela细胞以3*105细胞/孔接种在细胞板中，并在95％湿润的细胞培养箱中在37℃和5％CO2下温育。然后用50ng/mL IFN-γ诱导细胞以实现IDO1的完全表达作为阳性对照。未诱导的细胞用作阴性对照。培养24小时后，洗涤细胞，加入实施例2制得的三元荧光体系，孵育细胞的时间为30分钟。洗涤细胞后甲醛固定，用荧光显微镜以激发波长488nm检测。
将HepG2细胞以3*105细胞/孔接种在细胞板中，并在95％湿润的细胞培养箱中在37℃和5％CO2下温育。然后用50ng/mL IFN-γ诱导细胞以实现IDO1的完全表达作为阳性对照。未诱导的细胞用作阴性对照。培养24小时后，消化细胞置于1.5mL离心管，洗涤细胞，加入实施例2制得的三元荧光体系，孵育细胞的时间为30分钟。洗涤细胞后甲醛固定，用流式细胞仪以激发波长488nm检测。
实验结果：荧光显微镜与流式细胞仪检测HeLa细胞表达IDO1酶的结果为加入IFN-γ诱导的HeLa细胞荧光高于未诱导HeLa细胞；说明加入IFN-γ诱导表达了IDO1；证明了本发明方法准确地显示了IDO酶的活性；
荧光显微镜与流式细胞仪检测HepG2细胞表达IDO1酶的结果为加入IFN-γ诱导的细胞荧光高于未诱导细胞；说明加入IFN-γ诱导表达了IDO1；证明了本发明方法准确地显示了IDO酶的活性。
实施例7
三元荧光体系检测IDO1酶活性
将Hela细胞以3*105细胞/孔接种在细胞板中，并在95％湿润的细胞培养箱中在37℃和5％CO2下温育。然后用50ng/mL IFN-γ诱导细胞以实现IDO1的完全表达作为阳性对照。未诱导的细胞用作阴性对照。培养24小时后，洗涤细胞，加入实施例3制得的三元荧光体系，孵育细胞的时间为30分钟。洗涤细胞后甲醛固定，用荧光显微镜以激发波长488nm检测。
将HepG2细胞以3*105细胞/孔接种在细胞板中，并在95％湿润的细胞培养箱中在37℃和5％CO2下温育。然后用50ng/mL IFN-γ诱导细胞以实现IDO1的完全表达作为阳性对照。未诱导的细胞用作阴性对照。培养24小时后，消化细胞置于1.5mL离心管，洗涤细胞，加入实施例3制得的三元荧光体系，孵育细胞的时间为30分钟。洗涤细胞后甲醛固定，用流式细胞仪以激发波长488nm检测。
实验结果：荧光显微镜与流式细胞仪检测HeLa细胞表达IDO1酶的结果为加入IFN-γ诱导的HeLa细胞荧光高于未诱导HeLa细胞；说明加入IFN-γ诱导表达了IDO1；证明了本发明方法准确地显示了IDO酶的活性；
荧光显微镜与流式细胞仪检测HepG2细胞表达IDO1酶的结果为加入IFN-γ诱导的细胞荧光高于未诱导细胞；说明加入IFN-γ诱导表达了IDO1；证明了本发明方法准确地显示了IDO酶的活性。
实施例8
色氨酸感受器筛选IDO1抑制剂
将HepG2细胞以3*105细胞/孔接种在细胞板中，并在95％湿润的细胞培养箱中在37℃和5％CO2下温育。然后用50ng/mL IFN-γ诱导细胞以实现IDO1的完全表达作为阳性对照。未诱导的细胞用作阴性对照。筛选IDO1抑制剂组同时加入50ng/mL IFN-γ与不同抑制剂25nM。分别取培养24小时后的IDO1完全表达阳性对照组，100％阴性抑制对照组，筛选IDO1抑制剂组上清培养基15μL加入700μL 5μM实施例1制得的色氨酸感受器体系，涡旋2-3秒混匀后平行三次，每孔200μL，加入96孔板，酶标仪在激发波长441nm，检测波长480-580nm处读取荧光值。
如图6所示，结果显示阳性对照组荧光远高于阴性对照组，表明阳性组IDO1表达完全。与阳性对照组相比，加入抑制剂后，荧光值下降，显示了抑制剂对IDO1的抑制作用，BMS-986205组荧光值比NLG-919更低，显示了BMS-986205抑制IDO1效果强于NLG-919，验证了本发明方法准确性。
Claims (9)
1.一种基于细胞的筛选IDO1酶抑制剂及鉴定IDO1酶活性的荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提供重组表达IDO1的细胞，用DMEM培养基培养；
2)使步骤1)的培养基上清与色氨酸感受器接触；
3)测量步骤2)的混合物的荧光读数，其中在IDO1酶存在下与不加IFN-γ诱导的细胞相比改变的荧光读数指示IDO1酶活性，在IDO1酶和IDO1酶抑制剂存在下与IFN-γ诱导的细胞相比较，通过荧光读数的差异指示IDO1酶抑制剂的活性及IDO1酶活性。
2.根据权利要求1所述基于细胞的筛选IDO1酶抑制剂的荧光检测方法，其特征在于：步骤2)中所述色氨酸感受器是将摩尔比为1：1的葫芦脲8和甲基化氮杂苝胺溶解在水中形成的二元复合物体系；所述接触为涡旋2～3秒。
3.根据权利要求1所述的基于细胞的筛选IDO1酶抑制剂的荧光检测方法，其特征在于：步骤3)中所述荧光读数在激发波长为441nm、发射波长为510nm下检测荧光信号。
4.根据权利要求1所述的基于细胞的筛选IDO1酶抑制剂的荧光检测方法，其特征在于，所述步骤3)中所述通过荧光读数的差异指示IDO1酶抑制剂活性为：与IFN-γ诱导的细胞相比，在IFN-γ和目标化合物存在下荧光读数降低指示IDO1酶抑制剂的活性结果为IDO1酶抑制剂；
所述步骤3)中所述指示IDO1酶活性为：与未诱导的细胞相比，在IFN-γ存在下荧光读数升高指示IDO1酶抑制剂的活性结果为显示具有IDO1酶活性。
5.根据权利要求1所述的基于细胞的筛选IDO1酶抑制剂的荧光检测方法，其特征在于：所述IDO1酶是由IFN-γ诱导的IDO1酶；所述重组表达IDO1的细胞是HeLa或HepG2细胞，由IFN-γ刺激诱导表达。
6.一种基于细胞的鉴定IDO1酶活性的荧光检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)提供重组表达IDO1的细胞，用DMEM培养基培养；
2)步骤1)中的细胞洗涤后，用三元荧光体系孵育细胞，洗涤后用甲醛固定；
3)通过在IDO1酶存在下与不加IFN-γ诱导的细胞相比，比较荧光强度，指示IDO1酶活性。
7.根据权利要求6所述的基于细胞的鉴定IDO1酶活性的荧光检测方法，其特征在于：步骤2)所述的三元荧光体系为甲基化氮杂苝胺：葫芦脲：色氨酸的初始浓度的摩尔比为5：5：(0.1～1)的三元荧光体系，孵育细胞的时间为30分钟。
8.根据权利要求6所述的基于细胞的鉴定IDO1酶活性的荧光检测方法，其特征在于：步骤3)所述比较荧光强度，指示IDO1酶活性为通过激发波长均为488nm的荧光显微镜或流式细胞仪进行荧光比较，荧光显微镜结果为加入IFN-γ表达IDO1显示的细胞亮度高于不加IFN-γ诱导的细胞亮度，则表明IDO1酶活性高；流式细胞仪结果为加入IFN-γ表达IDO1显示的颗粒被染上的荧光数量高于不加IFN-γ诱导的IDO1的颗粒被染上的荧光数量，则表明IDO1酶活性高。
9.根据权利要求6所述的基于细胞的鉴定IDO1酶活性的荧光检测方法，其特征在于：所述IDO1酶是由IFN-γ诱导的IDO1酶；所述重组表达IDO1的细胞是HeLa或HepG2细胞，由IFN-γ刺激诱导表达。
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